β−アミロイドペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体
本出願は、β−アミロイドペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体、および該抗体のアルツハイマー病の分野における使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アミロイドペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体に関する。また、本発明は特に、神経変性障害および／またはアミロイド斑の沈着に関する疾患、ならびにとりわけアルツハイマー病の誘導および進行に関連する、これらの治療、診断および／または抗体の予防上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高い割合で高齢者に影響を及ぼす進行性の神経変性疾患である。この疾患は、記憶力低下および認知機能の衰えにより臨床的に特徴付けられ、神経病理学的には、細胞内神経原線維の沈着物およびアミロイド斑を形成するβ−アミロイドペプチド（Ａ−β）の細胞外沈着物が、脳内にあることにより特徴付けられる。（Ｙａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．８（１９９６））。これらの兆候に加えて、酸化ストレスの増加、アポトーシスの機構の活性化および最終的には細胞死をもたらす、免疫系および炎症系の低下ならびにミトコンドリアの機能の低下などの多くの他の異常な変化が存在する。
【０００３】
アミロイド斑は、主に４０または４２残基を有するＡ−βペプチドから構成され、これらはβ−アミロイドペプチド前駆体（ＡＰＰ）タンパク質のタンパク質分解工程の間に産生される。Ａ−βペプチドの細胞外沈着物は、家族型（ＦＡＤ）を含めたＡＤの全ての型の、不変の初期の特徴を示す。ＦＡＤは比較的初期（４０から６０歳の間）に現れ、６つの一重または二重のミスセンス変異を有するＦＡＤの症例のうち５％（＞２０家族）においてＡＰＰの遺伝子の変異に起因し、今日までに同定された８０超の異なる変異を有するＦＡＤの５０から７０％の症例（＞２００家族）においてプレセニリン１（ＰＳ１）の遺伝子における変異に起因し、８家族において特徴付けられた２つのミスセンス変異を有するＦＡＤのより少ない症例において、プレセニリン２（ＰＳ２）の遺伝子における変異に起因する。これらの３つの遺伝子における変異は、Ａ−βの過剰産生をもたらし、ＡＤの散発性形態の病態および症候と同様の病態および症候の早期の発現をもたらす、ＡＰＰのタンパク質分解の変化を誘導することが示されてきた。
【０００４】
アミロイド斑の神経毒性は、最初は可溶性であり（プロトフィブリル体とも呼ばれる。）次いでアミロイド斑に配合された不溶性形態に転換されるフィブリル体中の可溶性Ａ−βペプチドの凝集により形成される高分子量のフィブリルに存在し得る。つまり、可溶性Ａ−βペプチドは、次第に凝集して高分子量（＞２００ｋＤａ）のフィブリル体（即ち、これは、ペプチド／タンパク質のβシート三次構造を認識するコンゴレッドまたはチオフラビンＳなどの試薬で標識することができる。）になるが、なお可溶性であることがインビトロで示された。この形態は可溶性なので、しばしばプロトフィブリル体と呼ばれるが、より大きな凝集から生じるフィブリルは、可溶性の損失をもたらす。プロトフィブリルの一時的な形態は、アミロイド線維の前駆体であり、アルツハイマー病およびタンパク質の凝集に関連する他の疾患における細胞の機能異常および神経の損失に関与し得ると通常考えられている。
【０００５】
老人性アミロイド斑（即ち、凝集物であり、成熟斑とも呼ばれる。）は、非罹患者においても広く存在するＡ−βペプチドのびまん性沈着物とは対照的に、アルツハイマー病患者の認知状態と相関することが示されてきた。（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １９９７；１８：３３−４２およびＪｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；５４：７７−９５）。特にこれらの老人性アミロイド斑を標的とすることにより、アルツハイマー病をより具体的で効率的に治療することが可能である。
【０００６】
Ａ−βペプチドの形成を防止するために、例えば、ＡＰＰのタンパク質分解工程の阻害剤などの非常に多くの治療が試みられてきた。
斑の大きさおよび密度を低減するため、抗Ａ−β抗体の投与（アミロイド沈着物を低減するため）またはＡ−βペプチドの抗原での免疫付与（液性応答反応を促進するため）などの免疫療法的戦略が試験されてきた。
【０００７】
例えば、Ａ−βペプチドをコードする領域においてアークティック変異を示すプロトフィブリルに対して指向された抗体を投与することからなる、アルツハイマー病に対する治療方法が記載されている（ＵＳ７１７９４６３）。
抗体の例は実際には記載されていない。さらに、これらのペプチドの分子量の関数としての、抗体のペプチドへの親和性の比較は行われていない。他の特許（ＵＳ６７６１８８８およびＵＳ６７５０３２４）は、ペプチドＡ−β４２のアミノ酸配列に沿って種々のエピトープを認識する抗体に言及している。国際出願（ＷＯ２００７／１０８７５６）は、プロトフィブリルに特異的な抗体に関して出願されたが、記載されている抗体は、高分子量Ａ−βペプチドおよび中程度の重量のオリゴマーの両方を認識する。さらに、びまん性斑への抗体の親和性に対する、成熟斑への抗体の親和性についての言及はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，１７９，４６３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７６１，８８８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７５０，３２４号明細書
【特許文献４】国際公開第２００７／１０８７５６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．８（１９９６）
【非特許文献２】Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １９９７；１８：３３−４２
【非特許文献３】Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；５４：７７−９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アルツハイマー病に関する知識の現在の発展にもかかわらず、二次的な影響を最大限に制限する、この病態を治療および／または予防する組成物および方法がなお必要とされている。本出願に記載されるような、ヒト化され、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的な抗体は、この課題を解決することを目的とする。本発明の抗体は、老人性アミロイド斑の認識を許容するがびまん性斑の認識は許容しないので、主にびまん性沈着物に結合するか、またはモノマーもしくは低分子量のＡ−βペプチドの可溶性形態に結合するＡｂｅｔａの全ての形態を認識する抗体よりも、ずっと効率的に病理学的斑を認識する。
【００１１】
さらに、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体のみが認識され、アルツハイマー病に関連しない他のタンパク質のプロトフィブリル体は認識されないという事実は、この疾患に対して有効な抗体の濃度を低減し得る不要な結合を回避する。
【００１２】
本出願全体を通して、ヒト化されたマウス抗体を、抗体１３Ｃ３と呼ぶ。
本発明のヒト化抗体をコードまたは構成することができる配列を、表２に示す。
【００１３】
本発明は、Ａ−βペプチド、即ち、高分子量ペプチドのプロトフィブリル体に特異的に結合するヒト化抗体に関する。
より有利な実施形態では、抗体は、２００、３００、４００または５００ｋＤａより大きい分子量を有するＡ−βペプチドに結合する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、老人斑中に凝集したＡ−βペプチドには結合するが、Ａ−βペプチドのびまん性沈着物には結合しない。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的に結合するが、アミロイド構造の他のタンパク質（例えば、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドポリペプチド））には特異的に結合しない。
本発明はまた、微小出血および血管原性浮腫の発生などの悪影響を制限することを可能にする、低減されたエフェクター機能を有するヒト化抗体に関する。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、もはやエフェクター機能を有しない。
【００１４】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、半分子の産生を低減する、Ｆｃドメインが変異を受けた免疫グロブリンＧ４である。
さらにより有利な実施形態では、抗体は、エフェクター活性を低減する、Ｆｃドメインが変異を受けた免疫グロブリンＧ４である。
【００１５】
本発明は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９の配列の１つと同一の配列を有するヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを少なくとも１つ含む、ヒト化抗体に関する。
【００１６】
本発明はまた、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに同一な配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むヒト化抗体に関する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０および３２の１つに対して１から２アミノ酸異なる配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むが、前記抗体は、前記抗体の結合特異性を維持する。
【００１８】
有利な実施形態では、抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含む。
【００１９】
他の有利な実施形態では、抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列のＣＤＲを含む。
【００２０】
本発明の抗体はまた、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことができる。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含む。
【００２１】
本発明の１つの目的は、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含む、ヒト化抗体である。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むヒト化抗体に関する。
【００２３】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５の配列または配列番号２７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる前記抗体の重鎖（ＶＨ）の可変部分を含む。
【００２４】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６の配列または配列番号２８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む前記抗体の重鎖（ＶＨ）の可変部分を含む。
【００２５】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７の配列または配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる前記抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変部分を含む。
【００２６】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号８の配列または配列番号２４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む前記抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変部分を含む。
【００２７】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、配列番号５および配列番号２７のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分（ＶＨ）を含む重鎖を含む。
【００２８】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、配列番号６または配列番号２８のポリペプチド配列の可変部分（ＶＨ）を含む重鎖を含む。
【００２９】
別の実施形態では、抗体は、配列番号７および配列番号２３のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含む。
【００３０】
他の実施形態では、抗体は、配列番号８または配列番号２４のポリペプチド配列の可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含む。
【００３１】
有利な実施形態では、抗体は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
有利な実施形態では、抗体は、配列番号６および８のポリペプチド配列を含む。
【００３２】
別の実施形態では、抗体は、配列番号５および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
他の実施形態では、抗体は、配列番号６および２４のポリペプチド配列を含む。
【００３３】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
別の実施形態では、抗体は、配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、配列番号１および配列番号２５のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる重鎖を含む抗体に関する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド配列または配列番号２６のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する重鎖を含む抗体に関する。
【００３６】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３および配列番号２１のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる軽鎖を含む。
別の実施形態では、抗体は、配列番号４および配列番号２２のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含む。
【００３７】
本発明の１つの目的は、配列番号１および３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２および４のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００３８】
本発明の１つの目的は、配列番号１および２１のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２および２２のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００３９】
本発明の１つの目的は、配列番号２５および２１のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２６および２２のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００４０】
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体であって、ペプチドＡβのプロトフィブリル体に対する親和性が、前記抗体のこのペプチドの他の形態に対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい、抗体である。
本発明の他の目的は、抗体であって、前記抗体が、アミロイド斑の低減を誘導することを特徴とする、抗体である。
【００４１】
本発明の他の目的は、神経変性障害に関連する疾患の治療、特にアルツハイマー病の治療における、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体の使用である。
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体および賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を患者に投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法である。
【００４２】
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を産生する細胞、およびこれらの細胞を培養することを含む、この抗体の製造方法である。前記細胞は、有利には、１つの細胞株に由来する。
【００４３】
本発明の１つの目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を含む、医薬品である。
【００４４】
本発明の１つの目的は、配列番号２、４、６、８、２２、２４、２６または２８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の配列の１つを有する核酸を含む組換えベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞である。
【００４５】
定義
特異的結合とは、１つの受容体への結合の強度と他の受容体への結合の強度との間の、本明細書ではＡ−βペプチドのプロトフィブリル体への結合の強度とペプチドの他の形態への結合の強度との間の、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０または１００の係数の差異であると理解される。
【００４６】
「エピトープ」とは、抗体が結合する、抗原の部位を意味する。抗原がタンパク質または多糖などのポリマーである場合、エピトープは、連続したまたは非連続の残基により形成することができる。本明細書では、エピトープは、立体配座的である、即ち、プロトフィブリルＡ−βペプチドの三次元構造に関連する。
【００４７】
「プロトフィブリル体」とは、インビトロで可溶性であり、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａまたは５００ｋＤａより大きい分子量の実体として単離することができ、チオフラビンＳまたはコンゴレッドなどの試薬を固定することができる、Ａ−βペプチドのオリゴマー体を意味する。
【００４８】
「老人斑」とは、変性神経突起およびグリア細胞の反応に囲まれたアミロイドコア（チオフラビンＳまたはコンゴレッドを固定する。）から構成される斑を意味する。ずっと多数であるがアルツハイマー病とは関連しないびまん性のアミロイド沈着物（チオフラビンＳまたはコンゴレッドを固定しない。）とは対照的に、老人斑は、アルツハイマー病を有する患者において特に見出される。
【００４９】
免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、ジスルフィド架橋で接合された２つの同一の重鎖（「ＣＨ」）および２つの同一の軽鎖（「ＣＬ」）から構成される。各鎖は、定常領域および可変領域を含む。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含み、これらは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。
【００５０】
用語「ＶＨ」は、抗体の免疫グロブリンの重鎖の可変領域を指し、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’の重鎖を含む。
【００５１】
用語「ＶＬ」は、抗体の免疫グロブリンの軽鎖の可変領域を指し、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’の軽鎖を含む。
【００５２】
「抗体」はまた、抗体の任意の機能的フラグメントを意味する：Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、Ｆｃ（フラグメント、結晶化可能）。好ましくは、これらの機能的フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型のフラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体（とりわけ二重特異性である。）、１つ以上のＣＤＲの配列を含む合成ポリペプチドであり、これらは、通常、これらが由来するヒト化抗体と同様の固定化の特異性を有する。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化により、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、ヒト化抗体から得ることができる。
ナノ抗体もまた、この定義に含まれる。
【００５３】
「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．により定義される、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を表す。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１，ａｎｄ ｌａｔｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎｓ）。３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲ（単数または複数）の用語は、本明細書中では、必要に応じて、抗体の前記抗体が認識する抗原またはエピトープへの親和性結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つ以上または全てを表すのに用いられる。可変ドメインの最も保存された領域は、「フレームワーク領域」であるため、ＦＲ領域または配列と呼ばれる。
【００５４】
本発明は、ヒト化抗体に関する。
【００５５】
「ヒト化抗体」とは、主にヒト免疫グロブリン配列を含む抗体を意味する。この用語は、通常、ヒト配列またはヒト配列において見出される残基を組み込むことにより修飾された非ヒト免疫グロブリンを意味する。
【００５６】
一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てもしくは一部が非ヒト親配列由来の部分に対応するかまたはＦＲ領域の全てもしくは一部がヒト免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを、１つもしくは代表的には２つ含む。従って、ヒト化抗体は、免疫グロブリン（Ｆｃ）の定常領域の少なくとも１つの部分、特に、選択された参照ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも１つの部分を含むことができる。
従って、本発明者らは、ヒトにおいて最も免疫原性が小さい抗体を得ることを試みる。従って、抗体の高分子量のＡ−βペプチドへの結合特異性を実質的に低減することなく、１つ以上のＣＤＲの１つまたは２つのアミノ酸を、ヒト宿主に対する免疫原性が小さいアミノ酸により修飾することが可能である。さらに、フレームワーク領域の残基はヒトである必要はなく、前記残基は抗体の免疫原性潜在性に寄与しないので、修飾されないことも可能である。
【００５７】
非ヒト患者抗体をヒトにおいてより免疫原性が低い抗体へと修飾するためのヒト化の幾つかの方法が、当業者に公知である。配列のヒト抗体との完全な同一性は、必須ではない。つまり、完全な配列同一性は、必ずしも、低減された免疫原性の予測指標ではなく、限られた数の残基の修飾は、ヒトにおいて非常に弱められた免疫原性潜在性を示すヒト化抗体をもたらすことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）４４，１９８６−１９９８）。
【００５８】
幾つかの方法は、例えば、ＣＤＲの配合（グラフト化）（ＥＰＯ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５３０，１０１および５，５８５，０８９）、再舗装（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰＯ０５９２１０６；ＥＰＯ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍ ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ７（６）：８０５−８１４；およびＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３）または鎖混合（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５６５，３３２）である。
【００５９】
本発明は、特に、ヒト化抗体であって、前記抗体の可変部分が国際特許出願ＷＯ２００９／０３２６６１に説明された技術により修飾される、ヒト化抗体に関する。
この技術は、抗体の三次元モデルに基づく動的分子シミュレーションを多く用い、前記モデルは、ホモロジーにより構築されている。
【００６０】
本発明はまた、免疫系の受容体への親和性を低減するＦｃドメインの変異を有する免疫グロブリン、またはナノ抗体などの、減少したエフェクター機能を有する任意の形態の抗体に関する。
【００６１】
「エフェクター機能」とは、免疫応答を誘導する受容体またはタンパク質への、抗体のＦｃドメインの任意の固定を意味する。これらのエフェクター機能を低減することにより、微小出血の誘導などの悪影響を減少させることが可能になる（Ｒａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００５，２５：６２９）。
【００６２】
親和性は、当業者に公知の任意の技術により測定することができる。親和性は、有利には、Ｒａｔｋｏｖｓｋ ＤＡおよびＲｅｅｄｙ ＴＪ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９８６，４２，５７５−８２）により記載されたアルゴリズムに基づいて開発されたＢｉｏｓｔａｔ Ｓｐｅｅｄ技術により測定される。
【００６３】
本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を許容するために、前記鎖をコードするポリヌクレオチドが発現ベクター中に挿入される。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来のエピソーム、および当業者が前記鎖の発現に適切であると判断し得る全てのベクターであることができる。
【００６４】
これらのベクターは、有利には１つの細胞株に由来する形質転換細胞に用いることができる。前記細胞株は、さらにより有利には、哺乳動物に由来する。
この細胞株は、有利には、ＣＨＯ株もしくはこの株に由来する株、またはＨＥＫ２９３株もしくはこの株に由来する株である。
【００６５】
細胞の形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法により行うことができる。前記方法は、デキストランによる形質転換、リン酸カルシウムによる沈殿、ポリブレンによる形質移入、原形質体融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションであることができる。
【００６６】
本発明の抗体は、局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または他の経路による投与を目的として、医薬組成物中に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は、注射用製剤用の医薬的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、無菌の等張性の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウム、または前記塩の混合物）、または乾燥組成物であることができ、乾燥組成物は、とりわけ、凍結乾燥され、必要に応じて無菌水または生理学的血清を添加することにより注射用溶質を構成することが可能である。
例として、医薬組成物は、（１）場合により１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝液（ｐＨ約７．４）（２）０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）のデキストロースを含む。医薬組成物はまた、トリプタミンなどの酸化防止剤およびＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤を含むことができる。
【００６７】
問題とする病態は、アミロイド斑の沈着に関連するあらゆる疾患であることができる。特に、問題とする病態は、アルツハイマー病である。
【００６８】
投与量は、所望される効果、治療の期間および用いる投与経路に依存するが、通常、成人１人につき１日当たり抗体５ｍｇおよび１０００ｍｇである。通常、医師は、疾患の段階、患者の年齢および体重、または任意の他の考慮すべき患者関連因子に関連して、適切な投与量を決定する。
【００６９】
本発明は、以下に示す実施例により例示されるが、これらにより限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】抗Ａｂｅｔａ抗体１３Ｃ３−ＶＨ１ＶＬ１の軽鎖ＬＣ１の発現を許容するプラスミドｐＸＬ４９７３のマップ。
【図１Ｂ】抗Ａｂｅｔａ抗体１３Ｃ３−ＶＨ１ＶＬ１の重鎖ＨＣ１の発現を許容するプラスミドｐＸＬ４９７９のマップ。
【図２Ａ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのゲル濾過によるプロトフィブリルおよび低分子量オリゴマーの分離（ｔ＝０）。
【図２Ｂ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのゲル濾過によるプロトフィブリルおよび低分子量オリゴマーの分離（ｔ＝１６ｈ）。
【図３】プロトフィブリルの分子量の決定。
【図４Ａ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２７（４Ａ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図４Ｂ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２６（４Ｂ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図４Ｃ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２８（４Ｃ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図５】ヒト化抗体ＬＰ０９０２７のＡβのフィブリルに対する特異性。
【図６Ａ】ヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）のマウスの前頭皮質（６Ａ）の成熟老人斑への特異性。矢印は、老人斑を示す。
【図６Ｂ】ヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）のマウスの海馬（６Ｂ）の成熟老人斑への特異性。矢印は、老人斑を示す。
【００７１】
（実施例）
【実施例１】
【００７２】
ヒト化抗体の取得
マウス抗体１３Ｃ３をヒト化した。
【００７３】
本実施例は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体ＶＨ１ＶＬ１（ＬＰ０９０２７）の配列および前記抗体のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆと命名された哺乳動物株ＨＥＫ２９３における一過性の発現による産生による産生を記載する。
【００７４】
ヒト可変鎖ＶＬ１およびＶＨ１をコードするｃＤＮＡを、ヒト定常領域ＣｋａｐｐａおよびＩｇＧ４をそれぞれコードするｃＤＮＡと融合させる。半分子の産生（Ａｎｇｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５−１０８）およびエフェクター機能（ＷＯ９７／０９３５１）の顕著な低減のため、定常領域ＩｇＧ４の配列は、Ｋａｂａｔの命名法におけるＳ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅの置換を有する変異体の配列である。
【００７５】
ＣＨ１（配列番号１）およびＣＬ１（配列番号３）をコードする核酸配列を独立に発現ベクター中でクローン化して、プラスミドｐＸＬ４９７３（図１Ａ）およびｐＸＬ４９７９（図１Ｂ）をそれぞれ産生した。
【００７６】
抗体のバッチを、プラスミドｐＸＬ４９７３およびｐＸＬ４９７９のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載されるプロトコル（カタログ参照番号Ｋ９０００−０１）に従った同時形質移入の後の、株ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内での一過性の発現による産生により、産生する。次いで、バッチ（ＬＰ０９０２７）をＭａｂＳｅｌｅｃｔゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーにより、供給元の推奨に従って精製し、次いで、ＰＢＳ緩衝液（参照番号Ｄｕｌｂｅｃｃｏ１４１９０−０９４）中に配合し、無菌濾過（０．２μｍ）に供する。１Ｌの培養物から開始して、変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび立体排除クロマトグラフィーにより、３３ｍｇの抗体を９７％の純度で得る。変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳで得られた質量は、主要なアミノ酸配列およびＦｃドメイン上のＮ−グリカンの存在と一致する（即ち、Ｇ０Ｆ体中のＮ−グリカンを考慮して、ＬＣ１について２３９６９ＤａおよびＨＣ１について４９６５０Ｄａの質量）。非変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより得られる質量は、１５０ｋＤａの抗体のヘテロ四量体構造と一致する（図４Ａ）。
【００７７】
同様の方法により、ヒト化抗体ＬＰ０９０２６およびＬＰ０９０２８のバッチを、ＬＰ０９０２６については配列番号２５および配列番号２１のヌクレオチド配列から（図４Ｂ）ならびにＬＰ０９０２８については配列番号１および配列番号２１のヌクレオチド配列から（図４Ｃ）出発して産生した。
【実施例２】
【００７８】
ペプチドＡβ（１−４２）からのプロトフィブリルの調製
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ，２００６，２６１８−２６３０）に記載の方法に従って、合成ペプチドＡβ（１−４２）からプロトフィブリルを調製した。凍結乾燥ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ参照番号２４２２４）を、１００μＭの濃度で１０ｍＭ ＮａＯＨ中に溶解し、次いで、１分間攪拌し、氷上で１０分間インキュベートする。次いで、ペプチドの溶液を１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の緩衝液中で５０μＭの濃度に希釈し、次いで、１分間攪拌する。プロトフィブリルの形成のために、調製物を３７℃で一晩インキュベートし、次いで、１７９００ｇで１５分間、１６℃で遠心分離して、不溶性の凝集物を除去する。低分子量のＡβのオリゴマー体からプロトフィブリルを分離するため、上清を、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．５）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過カラム上に装填する。プロトフィブリルに対応する画分および低分子量オリゴマーに対応する画分を回収し、４℃で保存する。図２は、プロトフィブリルの分離の代表的なプロファイルを示す。プロトフィブリルの分子量は、Ｂｉｏｒａｄキャリブレーションキット（参照番号１５０−１９０１）を分子量のマーカーとして用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過により決定する。図３は、プロトフィブリルの分子量が２００ｋＤａより大きいことを示す。
【実施例３】
【００７９】
ヒト化抗体のプロトフィブリルに対する特異性および親和性
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号７００１１）中の５０μｌのプロトフィブリルおよび１μｇ／ｍｌの濃度の低分子量オリゴマーを、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、参照番号４４２４０４）のウェルに配置し、４℃で一晩インキュベートする。過剰な抗原を除去した後、２００μｌの緩衝液ＰＢＳ＋５％粉乳（重量／容積）を、各ウェルに配置して、非特異性吸着物を除去し、室温で２時間インキュベートする。次いで、ウェルを、３００μｌの緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％で４回洗浄する。５０μｌの一次抗体溶液（オリゴマーについては１００μｇ／ｍｌの濃度から、プロトフィブリルについては２５μｇ／ｍｌの濃度から出発して、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で３対３の希釈物）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ウェルを、３００μｌの緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ（複合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ペルオキシダーゼ、Ｐｉｅｒｃｅ、参照番号３１４１３）に結合させた二次抗Ｆｃヒト抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。３００μｌのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、参照番号ＵＰ６６４７８２）を各ウェルに添加し、約１０分間インキュベートし、次いで、反応を１Ｍ ＨＣｌの溶液（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、参照番号ＵＰＳ２９５９０）で停止し、プレートを、４５０ｎｍの波長で測定したＯＤにおいて読み取る。ＥＣ５０値を、ＢｉｏＳｔａｔ Ｓｐｅｅｄにより決定する。得られた結果を表１および図４に示すが、これらは、低分子量オリゴマー（１８４の係数）に対する、抗体のプロトフィブリルへの非常に高い特異性を示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
凍結乾燥ペプチドＡβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ参照番号２４２２４）を、供給元の推奨に従って溶解する。即ち、４０μｌの１％ＮＨ４ＯＨを５００μｇのＡβ１−４２に添加する。完全な溶解の後、４６０μｌのＰＢＳを添加して、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。１０μｌのアリコートを調製し、−８０℃で保存する。
炭酸緩衝液（ＮａＨＣＯ３ ０．０２５ Ｍ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、参照番号２１７１２００１０）、Ｎａ２ＣＯ３ ０．０２５ Ｍ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、参照番号２０７８１００１０）中１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡβ１−４２の溶液５０μｌ（ｐＨ ９．７）を、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに配置し、室温で一晩インキュベートする。前述のように、ウェルを緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで洗浄し、緩衝液ＰＢＳ＋５％粉乳（重量／容積）の存在下でインキュベートし、緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで洗浄する。０．０２μｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、前述のように調製したペプチドＡβ１−２８（Ｂａｃｈｅｍ、参照番号Ｈ７８６５）、Ａβ１−１６（Ａｎａｓｐｅｃ、参照番号２４２２５）、Ａβ２５−３５（Ａｎａｓｐｅｃ、参照番号２４２２７）、低分子量オリゴマーまたはプロトフィブリルの濃度範囲（１μｇ／ｍｌから出発）で、１時間、室温でインキュベートする。次いで、抗体／抗原混合物を各ウェルに配置し、マイクロタイトレーションプレートを室温で１時間インキュベートする。遊離の未複合体化抗体を、前述したのと同様のＥＬＩＳＡプロトコルに従って決定する。これらの競合実験は、低分子量オリゴマーよりもずっと高い親和性を有するプロトフィブリルのみが、ヒト化抗体がペプチドＡβ１−４２と相互作用することを防ぐことによりヒト化抗体を中和することが可能であり、どのペプチドも抗体を中和できないことを示す。
【実施例４】
【００８２】
ヒト化抗体ＬＰ０９０２７のＡβ１−４２のフィブリルに対する特異性
ペプチドＡβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ、２０２７６）を、２００μｌの１０ｍＭ ＮａＯＨに溶解し、５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。ペプチドＩＡＰＰ（Ａｎａｓｐｅｃ、６０８０４）を２００μｌの５０％ＤＭＳＯ中で希釈して、５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。１００μｌの各調製物を、４００μｌのＰＢＳ １．２５Ｘ中で希釈する。ペプチドの最終濃度は、５００μｌ中１ｍｇ／ｍｌである。試料を７２時間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、試料を１７９００ｇで３０分間、４℃で遠心分離する。上清を除去し、ペレットをＰＢＳ １Ｘで３回洗浄する。最終の洗浄後、フィブリルのペレットを１５０μｌのＰＢＳ中に取る。アミロイド型のフィブリルの存在を確認するため、チオフラビンＴ蛍光試験（Ａｎａｓｐｅｃ、８８３０６）を行う。２０μｌのチオフラビンＴ（最終２０μＭ）、１０μｌの試料および７０μｌのＰＢＳ １Ｘ（最終容積１００μｌ）を黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９２）のウェル中で混合する。アミロイド型の構造の存在下、チオフラビンＴを４５０ｎｍで励起させると、４８２ｎｍで蛍光を発する。５０μｌの１μｇ／ｍｌのＡβ１−４２のフィブリルおよび０．５μｇ／ｍｌのＩＡＰＰを、マイクロタイトレーションプレートの各ウェルに配置する。ＥＬＩＳＡプロトコルを、１０μｇ／ｍｌから出発するヒト化抗体の連続希釈を用いて適用する。図５は、ヒト化抗体ＬＰ０９０２７が、Ａβ１−４２のフィブリルを特異的に認識するがＩＡＰＰのフィブリルは特異的に認識しないことを示す。
【実施例５】
【００８３】
ヒト化抗体ＬＰ０９０２７の、成熟老人斑に対するがびまん性斑に対するものではない特異性
ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル：Ｒｏｃｈｅ １１３３３０５４００１；１１４１８１６５００１）と複合体化したヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）を、マウスＡＰＰ ＰＳ１（Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，２００４，１６４，１４９５−１５０２により記載されるアルツハイマーモデル）由来の脳切片およびアルツハイマー病患者由来のヒト脳切片（大脳皮質）における免疫組織化学（Ｖｅｎｔａｎａ Ｒｏｂｏｔ）に用いた。事前に、試料をホルマリン中で定着させ、パラフィン中に埋め込んだ。
マウスにおいて得られた結果（図６Ａおよび６Ｂ）は、ヒト化抗体が、高密度な成熟老人斑のみを認識するが、ペプチドＡβのびまん性沈着物は認識しないことを明らかに示す。
【００８４】
これらのデータは、この抗体がプロトフィブリルＡｂｅｔａ型に特異的であるので、このペプチドの可溶性のモノマーまたはオリゴマー体を認識しないというこの抗体の性質と相関する。
【００８５】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アミロイドペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体に関する。また、本発明は特に、神経変性障害および／またはアミロイド斑の沈着に関する疾患、ならびにとりわけアルツハイマー病の誘導および進行に関連する、これらの治療、診断および／または抗体の予防上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高い割合で高齢者に影響を及ぼす進行性の神経変性疾患である。この疾患は、記憶力低下および認知機能の衰えにより臨床的に特徴付けられ、神経病理学的には、細胞内神経原線維の沈着物およびアミロイド斑を形成するβ−アミロイドペプチド（Ａ−β）の細胞外沈着物が、脳内にあることにより特徴付けられる。（Ｙａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．８（１９９６））。これらの兆候に加えて、酸化ストレスの増加、アポトーシスの機構の活性化および最終的には細胞死をもたらす、免疫系および炎症系の低下ならびにミトコンドリアの機能の低下などの多くの他の異常な変化が存在する。
【０００３】
アミロイド斑は、主に４０または４２残基を有するＡ−βペプチドから構成され、これらはβ−アミロイドペプチド前駆体（ＡＰＰ）タンパク質のタンパク質分解工程の間に産生される。Ａ−βペプチドの細胞外沈着物は、家族型（ＦＡＤ）を含めたＡＤの全ての型の、不変の初期の特徴を示す。ＦＡＤは比較的初期（４０から６０歳の間）に現れ、６つの一重または二重のミスセンス変異を有するＦＡＤの症例のうち５％（＞２０家族）においてＡＰＰの遺伝子の変異に起因し、今日までに同定された８０超の異なる変異を有するＦＡＤの５０から７０％の症例（＞２００家族）においてプレセニリン１（ＰＳ１）の遺伝子における変異に起因し、８家族において特徴付けられた２つのミスセンス変異を有するＦＡＤのより少ない症例において、プレセニリン２（ＰＳ２）の遺伝子における変異に起因する。これらの３つの遺伝子における変異は、Ａ−βの過剰産生をもたらし、ＡＤの散発性形態の病態および症候と同様の病態および症候の早期の発現をもたらす、ＡＰＰのタンパク質分解の変化を誘導することが示されてきた。
【０００４】
アミロイド斑の神経毒性は、最初は可溶性であり（プロトフィブリル体とも呼ばれる。）次いでアミロイド斑に配合された不溶性形態に転換されるフィブリル体中の可溶性Ａ−βペプチドの凝集により形成される高分子量のフィブリルに存在し得る。つまり、可溶性Ａ−βペプチドは、次第に凝集して高分子量（＞２００ｋＤａ）のフィブリル体（即ち、これは、ペプチド／タンパク質のβシート三次構造を認識するコンゴレッドまたはチオフラビンＳなどの試薬で標識することができる。）になるが、なお可溶性であることがインビトロで示された。この形態は可溶性なので、しばしばプロトフィブリル体と呼ばれるが、より大きな凝集から生じるフィブリルは、可溶性の損失をもたらす。プロトフィブリルの一時的な形態は、アミロイド線維の前駆体であり、アルツハイマー病およびタンパク質の凝集に関連する他の疾患における細胞の機能異常および神経の損失に関与し得ると通常考えられている。
【０００５】
老人性アミロイド斑（即ち、凝集物であり、成熟斑とも呼ばれる。）は、非罹患者においても広く存在するＡ−βペプチドのびまん性沈着物とは対照的に、アルツハイマー病患者の認知状態と相関することが示されてきた。（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １９９７；１８：３３−４２およびＪｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；５４：７７−９５）。特にこれらの老人性アミロイド斑を標的とすることにより、アルツハイマー病をより具体的で効率的に治療することが可能である。
【０００６】
Ａ−βペプチドの形成を防止するために、例えば、ＡＰＰのタンパク質分解工程の阻害剤などの非常に多くの治療が試みられてきた。
斑の大きさおよび密度を低減するため、抗Ａ−β抗体の投与（アミロイド沈着物を低減するため）またはＡ−βペプチドの抗原での免疫付与（液性応答反応を促進するため）などの免疫療法的戦略が試験されてきた。
【０００７】
例えば、Ａ−βペプチドをコードする領域においてアークティック変異を示すプロトフィブリルに対して指向された抗体を投与することからなる、アルツハイマー病に対する治療方法が記載されている（ＵＳ７１７９４６３）。
抗体の例は実際には記載されていない。さらに、これらのペプチドの分子量の関数としての、抗体のペプチドへの親和性の比較は行われていない。他の特許（ＵＳ６７６１８８８およびＵＳ６７５０３２４）は、ペプチドＡ−β４２のアミノ酸配列に沿って種々のエピトープを認識する抗体に言及している。国際出願（ＷＯ２００７／１０８７５６）は、プロトフィブリルに特異的な抗体に関して出願されたが、記載されている抗体は、高分子量Ａ−βペプチドおよび中程度の重量のオリゴマーの両方を認識する。さらに、びまん性斑への抗体の親和性に対する、成熟斑への抗体の親和性についての言及はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，１７９，４６３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７６１，８８８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７５０，３２４号明細書
【特許文献４】国際公開第２００７／１０８７５６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．８（１９９６）
【非特許文献２】Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １９９７；１８：３３−４２
【非特許文献３】Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；５４：７７−９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アルツハイマー病に関する知識の現在の発展にもかかわらず、二次的な影響を最大限に制限する、この病態を治療および／または予防する組成物および方法がなお必要とされている。本出願に記載されるような、ヒト化され、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的な抗体は、この課題を解決することを目的とする。本発明の抗体は、老人性アミロイド斑の認識を許容するがびまん性斑の認識は許容しないので、主にびまん性沈着物に結合するか、またはモノマーもしくは低分子量のＡ−βペプチドの可溶性形態に結合するＡｂｅｔａの全ての形態を認識する抗体よりも、ずっと効率的に病理学的斑を認識する。
【００１１】
さらに、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体のみが認識され、アルツハイマー病に関連しない他のタンパク質のプロトフィブリル体は認識されないという事実は、この疾患に対して有効な抗体の濃度を低減し得る不要な結合を回避する。
【００１２】
本出願全体を通して、ヒト化されたマウス抗体を、抗体１３Ｃ３と呼ぶ。
本発明のヒト化抗体をコードまたは構成することができる配列を、表２に示す。
【００１３】
本発明は、Ａ−βペプチド、即ち、高分子量ペプチドのプロトフィブリル体に特異的に結合するヒト化抗体に関する。
より有利な実施形態では、抗体は、２００、３００、４００または５００ｋＤａより大きい分子量を有するＡ−βペプチドに結合する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、老人斑中に凝集したＡ−βペプチドには結合するが、Ａ−βペプチドのびまん性沈着物には結合しない。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的に結合するが、アミロイド構造の他のタンパク質（例えば、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドポリペプチド））には特異的に結合しない。
本発明はまた、微小出血および血管原性浮腫の発生などの悪影響を制限することを可能にする、低減されたエフェクター機能を有するヒト化抗体に関する。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、もはやエフェクター機能を有しない。
【００１４】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、半分子の産生を低減する、Ｆｃドメインが変異を受けた免疫グロブリンＧ４である。
さらにより有利な実施形態では、抗体は、エフェクター活性を低減する、Ｆｃドメインが変異を受けた免疫グロブリンＧ４である。
【００１５】
本発明は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９の配列の１つと同一の配列を有するヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを少なくとも１つ含む、ヒト化抗体に関する。
【００１６】
本発明はまた、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに同一な配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むヒト化抗体に関する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０および３２の１つに対して１から２アミノ酸異なる配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むが、前記抗体は、前記抗体の結合特異性を維持する。
【００１８】
有利な実施形態では、抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含む。
【００１９】
他の有利な実施形態では、抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列のＣＤＲを含む。
【００２０】
本発明の抗体はまた、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことができる。
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含む。
【００２１】
本発明の１つの目的は、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含む、ヒト化抗体である。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むヒト化抗体に関する。
【００２３】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５の配列または配列番号２７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる前記抗体の重鎖（ＶＨ）の可変部分を含む。
【００２４】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６の配列または配列番号２８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む前記抗体の重鎖（ＶＨ）の可変部分を含む。
【００２５】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７の配列または配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる前記抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変部分を含む。
【００２６】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号８の配列または配列番号２４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む前記抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変部分を含む。
【００２７】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、配列番号５および配列番号２７のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分（ＶＨ）を含む重鎖を含む。
【００２８】
さらにより有利な実施形態では、抗体は、配列番号６または配列番号２８のポリペプチド配列の可変部分（ＶＨ）を含む重鎖を含む。
【００２９】
別の実施形態では、抗体は、配列番号７および配列番号２３のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含む。
【００３０】
他の実施形態では、抗体は、配列番号８または配列番号２４のポリペプチド配列の可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含む。
【００３１】
有利な実施形態では、抗体は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
有利な実施形態では、抗体は、配列番号６および８のポリペプチド配列を含む。
【００３２】
別の実施形態では、抗体は、配列番号５および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
他の実施形態では、抗体は、配列番号６および２４のポリペプチド配列を含む。
【００３３】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む。
別の実施形態では、抗体は、配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、配列番号１および配列番号２５のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる重鎖を含む抗体に関する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド配列または配列番号２６のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する重鎖を含む抗体に関する。
【００３６】
有利な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３および配列番号２１のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列によりコードされる軽鎖を含む。
別の実施形態では、抗体は、配列番号４および配列番号２２のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含む。
【００３７】
本発明の１つの目的は、配列番号１および３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２および４のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００３８】
本発明の１つの目的は、配列番号１および２１のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２および２２のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００３９】
本発明の１つの目的は、配列番号２５および２１のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む抗体である。
本発明の他の目的は、抗体の配列が配列番号２６および２２のポリペプチド配列を含む、抗体である。
【００４０】
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体であって、ペプチドＡβのプロトフィブリル体に対する親和性が、前記抗体のこのペプチドの他の形態に対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい、抗体である。
本発明の他の目的は、抗体であって、前記抗体が、アミロイド斑の低減を誘導することを特徴とする、抗体である。
【００４１】
本発明の他の目的は、神経変性障害に関連する疾患の治療、特にアルツハイマー病の治療における、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体の使用である。
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体および賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を患者に投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法である。
【００４２】
本発明の他の目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を産生する細胞、およびこれらの細胞を培養することを含む、この抗体の製造方法である。前記細胞は、有利には、１つの細胞株に由来する。
【００４３】
本発明の１つの目的は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体を含む、医薬品である。
【００４４】
本発明の１つの目的は、配列番号２、４、６、８、２２、２４、２６または２８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の配列の１つを有する核酸を含む組換えベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞である。
【００４５】
定義
特異的結合とは、１つの受容体への結合の強度と他の受容体への結合の強度との間の、本明細書ではＡ−βペプチドのプロトフィブリル体への結合の強度とペプチドの他の形態への結合の強度との間の、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０または１００の係数の差異であると理解される。
【００４６】
「エピトープ」とは、抗体が結合する、抗原の部位を意味する。抗原がタンパク質または多糖などのポリマーである場合、エピトープは、連続したまたは非連続の残基により形成することができる。本明細書では、エピトープは、立体配座的である、即ち、プロトフィブリルＡ−βペプチドの三次元構造に関連する。
【００４７】
「プロトフィブリル体」とは、インビトロで可溶性であり、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａまたは５００ｋＤａより大きい分子量の実体として単離することができ、チオフラビンＳまたはコンゴレッドなどの試薬を固定することができる、Ａ−βペプチドのオリゴマー体を意味する。
【００４８】
「老人斑」とは、変性神経突起およびグリア細胞の反応に囲まれたアミロイドコア（チオフラビンＳまたはコンゴレッドを固定する。）から構成される斑を意味する。ずっと多数であるがアルツハイマー病とは関連しないびまん性のアミロイド沈着物（チオフラビンＳまたはコンゴレッドを固定しない。）とは対照的に、老人斑は、アルツハイマー病を有する患者において特に見出される。
【００４９】
免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、ジスルフィド架橋で接合された２つの同一の重鎖（「ＣＨ」）および２つの同一の軽鎖（「ＣＬ」）から構成される。各鎖は、定常領域および可変領域を含む。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含み、これらは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。
【００５０】
用語「ＶＨ」は、抗体の免疫グロブリンの重鎖の可変領域を指し、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’の重鎖を含む。
【００５１】
用語「ＶＬ」は、抗体の免疫グロブリンの軽鎖の可変領域を指し、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’の軽鎖を含む。
【００５２】
「抗体」はまた、抗体の任意の機能的フラグメントを意味する：Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、Ｆｃ（フラグメント、結晶化可能）。好ましくは、これらの機能的フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型のフラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体（とりわけ二重特異性である。）、１つ以上のＣＤＲの配列を含む合成ポリペプチドであり、これらは、通常、これらが由来するヒト化抗体と同様の固定化の特異性を有する。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化により、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、ヒト化抗体から得ることができる。
ナノ抗体もまた、この定義に含まれる。
【００５３】
「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．により定義される、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を表す。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１，ａｎｄ ｌａｔｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎｓ）。３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲ（単数または複数）の用語は、本明細書中では、必要に応じて、抗体の前記抗体が認識する抗原またはエピトープへの親和性結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つ以上または全てを表すのに用いられる。可変ドメインの最も保存された領域は、「フレームワーク領域」であるため、ＦＲ領域または配列と呼ばれる。
【００５４】
本発明は、ヒト化抗体に関する。
【００５５】
「ヒト化抗体」とは、主にヒト免疫グロブリン配列を含む抗体を意味する。この用語は、通常、ヒト配列またはヒト配列において見出される残基を組み込むことにより修飾された非ヒト免疫グロブリンを意味する。
【００５６】
一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てもしくは一部が非ヒト親配列由来の部分に対応するかまたはＦＲ領域の全てもしくは一部がヒト免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを、１つもしくは代表的には２つ含む。従って、ヒト化抗体は、免疫グロブリン（Ｆｃ）の定常領域の少なくとも１つの部分、特に、選択された参照ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも１つの部分を含むことができる。
従って、本発明者らは、ヒトにおいて最も免疫原性が小さい抗体を得ることを試みる。従って、抗体の高分子量のＡ−βペプチドへの結合特異性を実質的に低減することなく、１つ以上のＣＤＲの１つまたは２つのアミノ酸を、ヒト宿主に対する免疫原性が小さいアミノ酸により修飾することが可能である。さらに、フレームワーク領域の残基はヒトである必要はなく、前記残基は抗体の免疫原性潜在性に寄与しないので、修飾されないことも可能である。
【００５７】
非ヒト患者抗体をヒトにおいてより免疫原性が低い抗体へと修飾するためのヒト化の幾つかの方法が、当業者に公知である。配列のヒト抗体との完全な同一性は、必須ではない。つまり、完全な配列同一性は、必ずしも、低減された免疫原性の予測指標ではなく、限られた数の残基の修飾は、ヒトにおいて非常に弱められた免疫原性潜在性を示すヒト化抗体をもたらすことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）４４，１９８６−１９９８）。
【００５８】
幾つかの方法は、例えば、ＣＤＲの配合（グラフト化）（ＥＰＯ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５３０，１０１および５，５８５，０８９）、再舗装（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰＯ０５９２１０６；ＥＰＯ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍ ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ７（６）：８０５−８１４；およびＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３）または鎖混合（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５６５，３３２）である。
【００５９】
本発明は、特に、ヒト化抗体であって、前記抗体の可変部分が国際特許出願ＷＯ２００９／０３２６６１に説明された技術により修飾される、ヒト化抗体に関する。
この技術は、抗体の三次元モデルに基づく動的分子シミュレーションを多く用い、前記モデルは、ホモロジーにより構築されている。
【００６０】
本発明はまた、免疫系の受容体への親和性を低減するＦｃドメインの変異を有する免疫グロブリン、またはナノ抗体などの、減少したエフェクター機能を有する任意の形態の抗体に関する。
【００６１】
「エフェクター機能」とは、免疫応答を誘導する受容体またはタンパク質への、抗体のＦｃドメインの任意の固定を意味する。これらのエフェクター機能を低減することにより、微小出血の誘導などの悪影響を減少させることが可能になる（Ｒａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００５，２５：６２９）。
【００６２】
親和性は、当業者に公知の任意の技術により測定することができる。親和性は、有利には、Ｒａｔｋｏｖｓｋ ＤＡおよびＲｅｅｄｙ ＴＪ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９８６，４２，５７５−８２）により記載されたアルゴリズムに基づいて開発されたＢｉｏｓｔａｔ Ｓｐｅｅｄ技術により測定される。
【００６３】
本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を許容するために、前記鎖をコードするポリヌクレオチドが発現ベクター中に挿入される。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来のエピソーム、および当業者が前記鎖の発現に適切であると判断し得る全てのベクターであることができる。
【００６４】
これらのベクターは、有利には１つの細胞株に由来する形質転換細胞に用いることができる。前記細胞株は、さらにより有利には、哺乳動物に由来する。
この細胞株は、有利には、ＣＨＯ株もしくはこの株に由来する株、またはＨＥＫ２９３株もしくはこの株に由来する株である。
【００６５】
細胞の形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法により行うことができる。前記方法は、デキストランによる形質転換、リン酸カルシウムによる沈殿、ポリブレンによる形質移入、原形質体融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションであることができる。
【００６６】
本発明の抗体は、局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または他の経路による投与を目的として、医薬組成物中に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は、注射用製剤用の医薬的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、無菌の等張性の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウム、または前記塩の混合物）、または乾燥組成物であることができ、乾燥組成物は、とりわけ、凍結乾燥され、必要に応じて無菌水または生理学的血清を添加することにより注射用溶質を構成することが可能である。
例として、医薬組成物は、（１）場合により１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝液（ｐＨ約７．４）（２）０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）のデキストロースを含む。医薬組成物はまた、トリプタミンなどの酸化防止剤およびＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤を含むことができる。
【００６７】
問題とする病態は、アミロイド斑の沈着に関連するあらゆる疾患であることができる。特に、問題とする病態は、アルツハイマー病である。
【００６８】
投与量は、所望される効果、治療の期間および用いる投与経路に依存するが、通常、成人１人につき１日当たり抗体５ｍｇおよび１０００ｍｇである。通常、医師は、疾患の段階、患者の年齢および体重、または任意の他の考慮すべき患者関連因子に関連して、適切な投与量を決定する。
【００６９】
本発明は、以下に示す実施例により例示されるが、これらにより限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】抗Ａｂｅｔａ抗体１３Ｃ３−ＶＨ１ＶＬ１の軽鎖ＬＣ１の発現を許容するプラスミドｐＸＬ４９７３のマップ。
【図１Ｂ】抗Ａｂｅｔａ抗体１３Ｃ３−ＶＨ１ＶＬ１の重鎖ＨＣ１の発現を許容するプラスミドｐＸＬ４９７９のマップ。
【図２Ａ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのゲル濾過によるプロトフィブリルおよび低分子量オリゴマーの分離（ｔ＝０）。
【図２Ｂ】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのゲル濾過によるプロトフィブリルおよび低分子量オリゴマーの分離（ｔ＝１６ｈ）。
【図３】プロトフィブリルの分子量の決定。
【図４Ａ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２７（４Ａ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図４Ｂ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２６（４Ｂ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図４Ｃ】プロトフィブリルへのヒト化抗体（抗体ＬＰ０９０２８（４Ｃ））の親和性の決定（３実験の平均値±標準誤差）。
【図５】ヒト化抗体ＬＰ０９０２７のＡβのフィブリルに対する特異性。
【図６Ａ】ヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）のマウスの前頭皮質（６Ａ）の成熟老人斑への特異性。矢印は、老人斑を示す。
【図６Ｂ】ヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）のマウスの海馬（６Ｂ）の成熟老人斑への特異性。矢印は、老人斑を示す。
【００７１】
（実施例）
【実施例１】
【００７２】
ヒト化抗体の取得
マウス抗体１３Ｃ３をヒト化した。
【００７３】
本実施例は、ヒト化抗ペプチドＡβ抗体ＶＨ１ＶＬ１（ＬＰ０９０２７）の配列および前記抗体のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆと命名された哺乳動物株ＨＥＫ２９３における一過性の発現による産生による産生を記載する。
【００７４】
ヒト可変鎖ＶＬ１およびＶＨ１をコードするｃＤＮＡを、ヒト定常領域ＣｋａｐｐａおよびＩｇＧ４をそれぞれコードするｃＤＮＡと融合させる。半分子の産生（Ａｎｇｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５−１０８）およびエフェクター機能（ＷＯ９７／０９３５１）の顕著な低減のため、定常領域ＩｇＧ４の配列は、Ｋａｂａｔの命名法におけるＳ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅの置換を有する変異体の配列である。
【００７５】
ＣＨ１（配列番号１）およびＣＬ１（配列番号３）をコードする核酸配列を独立に発現ベクター中でクローン化して、プラスミドｐＸＬ４９７３（図１Ａ）およびｐＸＬ４９７９（図１Ｂ）をそれぞれ産生した。
【００７６】
抗体のバッチを、プラスミドｐＸＬ４９７３およびｐＸＬ４９７９のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載されるプロトコル（カタログ参照番号Ｋ９０００−０１）に従った同時形質移入の後の、株ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内での一過性の発現による産生により、産生する。次いで、バッチ（ＬＰ０９０２７）をＭａｂＳｅｌｅｃｔゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーにより、供給元の推奨に従って精製し、次いで、ＰＢＳ緩衝液（参照番号Ｄｕｌｂｅｃｃｏ１４１９０−０９４）中に配合し、無菌濾過（０．２μｍ）に供する。１Ｌの培養物から開始して、変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび立体排除クロマトグラフィーにより、３３ｍｇの抗体を９７％の純度で得る。変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳで得られた質量は、主要なアミノ酸配列およびＦｃドメイン上のＮ−グリカンの存在と一致する（即ち、Ｇ０Ｆ体中のＮ−グリカンを考慮して、ＬＣ１について２３９６９ＤａおよびＨＣ１について４９６５０Ｄａの質量）。非変性条件におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより得られる質量は、１５０ｋＤａの抗体のヘテロ四量体構造と一致する（図４Ａ）。
【００７７】
同様の方法により、ヒト化抗体ＬＰ０９０２６およびＬＰ０９０２８のバッチを、ＬＰ０９０２６については配列番号２５および配列番号２１のヌクレオチド配列から（図４Ｂ）ならびにＬＰ０９０２８については配列番号１および配列番号２１のヌクレオチド配列から（図４Ｃ）出発して産生した。
【実施例２】
【００７８】
ペプチドＡβ（１−４２）からのプロトフィブリルの調製
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ，２００６，２６１８−２６３０）に記載の方法に従って、合成ペプチドＡβ（１−４２）からプロトフィブリルを調製した。凍結乾燥ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ参照番号２４２２４）を、１００μＭの濃度で１０ｍＭ ＮａＯＨ中に溶解し、次いで、１分間攪拌し、氷上で１０分間インキュベートする。次いで、ペプチドの溶液を１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の緩衝液中で５０μＭの濃度に希釈し、次いで、１分間攪拌する。プロトフィブリルの形成のために、調製物を３７℃で一晩インキュベートし、次いで、１７９００ｇで１５分間、１６℃で遠心分離して、不溶性の凝集物を除去する。低分子量のＡβのオリゴマー体からプロトフィブリルを分離するため、上清を、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．５）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過カラム上に装填する。プロトフィブリルに対応する画分および低分子量オリゴマーに対応する画分を回収し、４℃で保存する。図２は、プロトフィブリルの分離の代表的なプロファイルを示す。プロトフィブリルの分子量は、Ｂｉｏｒａｄキャリブレーションキット（参照番号１５０−１９０１）を分子量のマーカーとして用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過により決定する。図３は、プロトフィブリルの分子量が２００ｋＤａより大きいことを示す。
【実施例３】
【００７９】
ヒト化抗体のプロトフィブリルに対する特異性および親和性
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号７００１１）中の５０μｌのプロトフィブリルおよび１μｇ／ｍｌの濃度の低分子量オリゴマーを、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、参照番号４４２４０４）のウェルに配置し、４℃で一晩インキュベートする。過剰な抗原を除去した後、２００μｌの緩衝液ＰＢＳ＋５％粉乳（重量／容積）を、各ウェルに配置して、非特異性吸着物を除去し、室温で２時間インキュベートする。次いで、ウェルを、３００μｌの緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％で４回洗浄する。５０μｌの一次抗体溶液（オリゴマーについては１００μｇ／ｍｌの濃度から、プロトフィブリルについては２５μｇ／ｍｌの濃度から出発して、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で３対３の希釈物）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ウェルを、３００μｌの緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ（複合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ペルオキシダーゼ、Ｐｉｅｒｃｅ、参照番号３１４１３）に結合させた二次抗Ｆｃヒト抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。３００μｌのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、参照番号ＵＰ６６４７８２）を各ウェルに添加し、約１０分間インキュベートし、次いで、反応を１Ｍ ＨＣｌの溶液（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、参照番号ＵＰＳ２９５９０）で停止し、プレートを、４５０ｎｍの波長で測定したＯＤにおいて読み取る。ＥＣ５０値を、ＢｉｏＳｔａｔ Ｓｐｅｅｄにより決定する。得られた結果を表１および図４に示すが、これらは、低分子量オリゴマー（１８４の係数）に対する、抗体のプロトフィブリルへの非常に高い特異性を示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
凍結乾燥ペプチドＡβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ参照番号２４２２４）を、供給元の推奨に従って溶解する。即ち、４０μｌの１％ＮＨ４ＯＨを５００μｇのＡβ１−４２に添加する。完全な溶解の後、４６０μｌのＰＢＳを添加して、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。１０μｌのアリコートを調製し、−８０℃で保存する。
炭酸緩衝液（ＮａＨＣＯ３ ０．０２５ Ｍ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、参照番号２１７１２００１０）、Ｎａ２ＣＯ３ ０．０２５ Ｍ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、参照番号２０７８１００１０）中１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡβ１−４２の溶液５０μｌ（ｐＨ ９．７）を、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに配置し、室温で一晩インキュベートする。前述のように、ウェルを緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで洗浄し、緩衝液ＰＢＳ＋５％粉乳（重量／容積）の存在下でインキュベートし、緩衝液ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで洗浄する。０．０２μｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、前述のように調製したペプチドＡβ１−２８（Ｂａｃｈｅｍ、参照番号Ｈ７８６５）、Ａβ１−１６（Ａｎａｓｐｅｃ、参照番号２４２２５）、Ａβ２５−３５（Ａｎａｓｐｅｃ、参照番号２４２２７）、低分子量オリゴマーまたはプロトフィブリルの濃度範囲（１μｇ／ｍｌから出発）で、１時間、室温でインキュベートする。次いで、抗体／抗原混合物を各ウェルに配置し、マイクロタイトレーションプレートを室温で１時間インキュベートする。遊離の未複合体化抗体を、前述したのと同様のＥＬＩＳＡプロトコルに従って決定する。これらの競合実験は、低分子量オリゴマーよりもずっと高い親和性を有するプロトフィブリルのみが、ヒト化抗体がペプチドＡβ１−４２と相互作用することを防ぐことによりヒト化抗体を中和することが可能であり、どのペプチドも抗体を中和できないことを示す。
【実施例４】
【００８２】
ヒト化抗体ＬＰ０９０２７のＡβ１−４２のフィブリルに対する特異性
ペプチドＡβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ、２０２７６）を、２００μｌの１０ｍＭ ＮａＯＨに溶解し、５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。ペプチドＩＡＰＰ（Ａｎａｓｐｅｃ、６０８０４）を２００μｌの５０％ＤＭＳＯ中で希釈して、５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。１００μｌの各調製物を、４００μｌのＰＢＳ １．２５Ｘ中で希釈する。ペプチドの最終濃度は、５００μｌ中１ｍｇ／ｍｌである。試料を７２時間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、試料を１７９００ｇで３０分間、４℃で遠心分離する。上清を除去し、ペレットをＰＢＳ １Ｘで３回洗浄する。最終の洗浄後、フィブリルのペレットを１５０μｌのＰＢＳ中に取る。アミロイド型のフィブリルの存在を確認するため、チオフラビンＴ蛍光試験（Ａｎａｓｐｅｃ、８８３０６）を行う。２０μｌのチオフラビンＴ（最終２０μＭ）、１０μｌの試料および７０μｌのＰＢＳ １Ｘ（最終容積１００μｌ）を黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９２）のウェル中で混合する。アミロイド型の構造の存在下、チオフラビンＴを４５０ｎｍで励起させると、４８２ｎｍで蛍光を発する。５０μｌの１μｇ／ｍｌのＡβ１−４２のフィブリルおよび０．５μｇ／ｍｌのＩＡＰＰを、マイクロタイトレーションプレートの各ウェルに配置する。ＥＬＩＳＡプロトコルを、１０μｇ／ｍｌから出発するヒト化抗体の連続希釈を用いて適用する。図５は、ヒト化抗体ＬＰ０９０２７が、Ａβ１−４２のフィブリルを特異的に認識するがＩＡＰＰのフィブリルは特異的に認識しないことを示す。
【実施例５】
【００８３】
ヒト化抗体ＬＰ０９０２７の、成熟老人斑に対するがびまん性斑に対するものではない特異性
ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル：Ｒｏｃｈｅ １１３３３０５４００１；１１４１８１６５００１）と複合体化したヒト化抗体（ＬＰ０９０２７）を、マウスＡＰＰ ＰＳ１（Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，２００４，１６４，１４９５−１５０２により記載されるアルツハイマーモデル）由来の脳切片およびアルツハイマー病患者由来のヒト脳切片（大脳皮質）における免疫組織化学（Ｖｅｎｔａｎａ Ｒｏｂｏｔ）に用いた。事前に、試料をホルマリン中で定着させ、パラフィン中に埋め込んだ。
マウスにおいて得られた結果（図６Ａおよび６Ｂ）は、ヒト化抗体が、高密度な成熟老人斑のみを認識するが、ペプチドＡβのびまん性沈着物は認識しないことを明らかに示す。
【００８４】
これらのデータは、この抗体がプロトフィブリルＡｂｅｔａ型に特異的であるので、このペプチドの可溶性のモノマーまたはオリゴマー体を認識しないというこの抗体の性質と相関する。
【００８５】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体。
【請求項２】
抗体が、老人斑中で凝集したＡ−βペプチドには結合するが、Ａ−βペプチドのびまん性沈着物には結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９の配列の１つと同一の配列を有するヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から２の一項に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに同一な配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から３の一項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに対して１から２アミノ酸異なる配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むが、該抗体の結合特異性を維持することを特徴とする、請求項１から４の一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から５の一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から７の一項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から８の一項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から９の一項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から１０の一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体の重鎖の可変部分が、配列番号５および配列番号２７の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされることを特徴とする、請求項１から１１の一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体の重鎖の可変部分が、配列番号６および配列番号２８の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号７および配列番号２３の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされることを特徴とする、請求項１から１３の一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号８および配列番号２４の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１から１４の一項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が、配列番号５および配列番号２７のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分を含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１５の一項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が、配列番号６または配列番号２８のポリペプチド配列の可変部分を含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１６の一項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が、配列番号７および配列番号２３のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分を含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１７の一項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、配列番号８または配列番号２４のポリペプチド配列の可変部分を含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１８の一項に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が、配列番号５および７のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から１９の一項に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体の配列が、配列番号６および８のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２０の一項に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体が、配列番号１および配列番号２５のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされる重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２１の一項に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体が、配列番号２および配列番号２６のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２２の一項に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体が、配列番号３および配列番号２１のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされる軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２３の一項に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体が、配列番号４および配列番号２２のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖配列を含むことを特徴とする、請求項１から２４の一項に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体が、配列番号１および３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２５の一項に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体の配列が、配列番号２および４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２６の一項に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が、配列番号５および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２７の一項に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体の配列が、配列番号６および２４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２８の一項に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が、配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２９の一項に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体の配列が、配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から３０の一項に記載の抗体。
【請求項３２】
抗体が、アミロイド斑の低減を誘導することを特徴とする、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体のペプチドＡβのプロトフィブリル体に対する親和性が、該抗体のこのペプチドの他の形態に対する親和性よりも少なくとも１００倍の大きさであることを特徴とする、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
神経変性障害に関連する疾患の治療における、請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
アルツハイマー病の治療における、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体および賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体を患者に投与することを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の治療方法。
【請求項３８】
請求項１から３４の抗体を産生する、細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体の製造方法。
【請求項４０】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬品。
【請求項４１】
配列番号２、４、６、８、２２、２４、２６または２８の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を有することを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４１および４２のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換えベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１】
Ａ−βペプチドのプロトフィブリル体に特異的なヒト化抗体。
【請求項２】
抗体が、老人斑中で凝集したＡ−βペプチドには結合するが、Ａ−βペプチドのびまん性沈着物には結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９の配列の１つと同一の配列を有するヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から２の一項に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに同一な配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から３の一項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の１つに対して１から２アミノ酸異なる配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むが、該抗体の結合特異性を維持することを特徴とする、請求項１から４の一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から５の一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から７の一項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から８の一項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列により、またはこれらの配列とそれぞれ１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド異なる配列によりコードされるＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から９の一項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０の配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から１０の一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体の重鎖の可変部分が、配列番号５および配列番号２７の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされることを特徴とする、請求項１から１１の一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体の重鎖の可変部分が、配列番号６および配列番号２８の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号７および配列番号２３の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされることを特徴とする、請求項１から１３の一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号８および配列番号２４の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１から１４の一項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が、配列番号５および配列番号２７のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分を含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１５の一項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が、配列番号６または配列番号２８のポリペプチド配列の可変部分を含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１６の一項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が、配列番号７および配列番号２３のヌクレオチド配列の１つによりコードされる可変部分を含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１７の一項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、配列番号８または配列番号２４のポリペプチド配列の可変部分を含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から１８の一項に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が、配列番号５および７のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から１９の一項に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体の配列が、配列番号６および８のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２０の一項に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体が、配列番号１および配列番号２５のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされる重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２１の一項に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体が、配列番号２および配列番号２６のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２２の一項に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体が、配列番号３および配列番号２１のヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされる軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１から２３の一項に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体が、配列番号４および配列番号２２のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖配列を含むことを特徴とする、請求項１から２４の一項に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体が、配列番号１および３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２５の一項に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体の配列が、配列番号２および４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２６の一項に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が、配列番号５および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２７の一項に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体の配列が、配列番号６および２４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から２８の一項に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が、配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むことを特徴とする、請求項１から２９の一項に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体の配列が、配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から３０の一項に記載の抗体。
【請求項３２】
抗体が、アミロイド斑の低減を誘導することを特徴とする、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体のペプチドＡβのプロトフィブリル体に対する親和性が、該抗体のこのペプチドの他の形態に対する親和性よりも少なくとも１００倍の大きさであることを特徴とする、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
神経変性障害に関連する疾患の治療における、請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
アルツハイマー病の治療における、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体および賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体を患者に投与することを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の治療方法。
【請求項３８】
請求項１から３４の抗体を産生する、細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体の製造方法。
【請求項４０】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬品。
【請求項４１】
配列番号２、４、６、８、２２、２４、２６または２８の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号１、３、５、７、２１、２３、２５または２７の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を有することを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４１および４２のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換えベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２６５４１（Ｐ２０１２−５２６５４１Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１０３４３（Ｐ２０１２−５１０３４３）
【出願日】平成２２年５月１１日（２０１０．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０９１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３０９４６
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１１日（２０１０．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０９１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３０９４６
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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