ρ０細胞を生成させる方法
ミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼを用いた、ρ０細胞の生成方法を記載する。この方法は、（ａ）適したプロモータに作動可能となるように連結されている、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクタで細胞を形質転換するステップ、（ｂ）該形質転換細胞を十分な時間培養するステップ、及び（ｃ）ρ０細胞を、例えば、ＦＡＣＳ分析を介して選択するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアを標的とする制限エンドヌクレアーゼを用いたρ０細胞の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞に見られる細胞小器官である。ミトコンドリアは、細胞のクレブス回路又は好気的エネルギー供給等、極めて重要な生物化学プロセスの場となっている。しかし、最近、それらが加齢プロセス及びプログラム細胞死における中心的存在であることが示された。これらの全ての機能に密接に結びついている１つの因子が、この細胞小器官のゲノム、すなわちミトコンドリアＤＮＡである。様々な症状を示す多数の神経疾患及び神経筋疾患が、ミトコンドリアゲノムの変異と関連づけられてきている（Ｗａｌｌａｃｅ（２００１）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２３５、２４７−２６３）。例えば、ミトコンドリア脳症は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化系（ＯＸＰＨＯＳ）の機能障害から生じる疾患の一種である。普通の状態では、この系は細胞呼吸及びエネルギー生産の役割を担っている。関連する疾患では、好気的代謝の要求が高い組織（例えば、脳、骨格筋、心臓）において障害が現れる。酸化的リン酸化系には、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）及びミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）によってコードされたサブユニットが集合してなる５つの酵素複合体が関与している。ミトコンドリアゲノムは、環状に構成され、１６５６９ｂｐを包含し、ＯＸＰＨＯＳに関与する１３のポリペプチド、１セットの２２の必須ｔＲＮＡ、並びにミトコンドリア翻訳に必要なラージリボソームＲＮＡ（１６Ｓ）及びスモールリボソームＲＮＡ（１２Ｓ）をコードしている。ｍｔＤＮＡは完全に配列決定された最初のゲノムであるにも拘らず、核とミトコンドリアとの相互作用、ｍｔＤＮＡ遺伝子とｎＤＮＡ遺伝子との発現の連携、又はｍｔＤＮＡの細胞内における維持プロセス（核因子によって厳密に決定されるプロセス）についてはほとんど何も知られていない。このように知見が不足していることから、ｍｔＤＮＡの損傷によってヒト疾患を生じる分子機序についてはほとんど知られていない。これは一部には、実験条件下でミトコンドリアの調節及び発生プロセスを研究することができないことによるものである。
【０００３】
このような問題を克服する１つの試みが、Ｋｉｎｇ及びＡｔｔａｒｄｉ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、５００−５０３によって行われた実験であり、酵母遺伝学において知られる実験と同様の実験において、ヒト骨肉腫細胞系（骨肉腫由来の１４３Ｂ．ＴＫ−）を４〜６週間にわたって少用量のエチジウムブロマイドで処置している。この試薬は、ｍｔＤＮＡと相互作用して、ＤＮＡ複製を妨げる複合体を形成することが知られている。一連の細胞分裂の後、内因性ｍｔＤＮＡは失われ、一方、核ＤＮＡは維持される。ｍｔＤＮＡの欠失は、数日後に酸化的リン酸化系を消失させるため、内因性ｍｔＤＮＡを欠いた細胞（いわゆる、ρ０（ロー０）細胞）の生存を維持するために栄養素の補給が必要となる。増殖培地にピルビン酸及びウリジンを添加することにより、呼吸鎖電子移動が失われ、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）が阻害されていても、ピリミジンを生成し、細胞のエネルギー要求を満たすことができる。
【０００４】
また、ｍｔＤＮＡ複製を妨げる他の試薬（ジテルカリニウム、ｄｄＣ等）によるρ０細胞の生成が調べられている。しかし、用いられた全ての化学物質は、変異原性効果、又はｍｄｒ（多薬物耐性）ファミリー遺伝子発現の誘導等、重大な欠点を示し、ｍｔＤＮＡ複製の阻害作用が失われている。更に、これらの方法の一番の制限は、異なる細胞株に適用できないことである。例えば、多くの試みについて事例証拠があるにもかかわらず、これらの方法で産生されたラットρ０細胞株に関する報告は公表されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、本発明の根底にある技術的課題は、従来技術の方法における問題を克服するρ０細胞の生成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の技術的課題を解決するため、特許請求の範囲に記載された態様を提供する。本発明者らは、全ての内因性ｍｔＤＮＡの破壊を可能にする、ミトコンドリアマトリックスを標的とする制限エンドヌクレアーゼに基づく方法を開発した。制限エンドヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを切断し、内因性のヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを完全に分解する。この方法は、ヒトｍｔＤＮＡを約３〜５回切断することが知られている制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ遺伝子を選択することによって実現した。ＥｃｏＲＩ遺伝子は、ヒトチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）遺伝子に由来するミトコンドリアターゲッティング配列、及び、光学マーカであるＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）遺伝子に融合させて、ミトコンドリアに局在化させた。形質転換し、ジェネテシン又はＦＡＣＳ分析のいずれかにより選択して、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名された細胞クローンを増殖させた。その後、代謝試験、ＰＣＲ及びサザンブロット分析によって、全ての内因性ミトコンドリアＤＮＡが失われていることを確認した。これらの細胞がρ０状態となったことによる、増殖、代謝及び形態変化を特徴づけるため、追加の比較試験を行った。
【０００７】
ρ０クローン１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７誘導後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質のＥＧＦＰ蛍光は検出されなかった。よって、ｍｔＤＮＡの破壊後に制限エンドヌクレアーゼ構築物の遺伝子を細胞が欠失しているか、又は、一部の遺伝子部分が核ゲノムの中に組み込まれて、微量の制限エンドヌクレアーゼが連続的に発現され、当該細胞株を、細胞質体融合試験におけるアクセプター細胞株として使えないものとなっているかどうかをＰＣＲによって確認した。ＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する様々なプライマ対を用いた分析の結果、増幅産物は観察されなかった。明らかに、ＥｃｏＲＩの遺伝子は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていなかった。この結果は、ミトコンドリアゲノムを完全に、非可逆的に、かつ安定的に破壊するには、ミトコンドリアを標的とする制限エンドヌクレアーゼの一時的な発現のみで十分であることを示し、かつ、ミトコンドリア内のＤＮＡ修復系にはこのＤＮＡ損傷に十分対応するだけの効力はないことを示す。
【０００８】
最後に、低用量のエチジウムブロマイドと共に培養することによって生成された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞株、及び新しく生成した１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞クローンと野生型とを、増殖速度、グルコース消費量、並びに乳酸及びプロトン生産率について比較した。
【０００９】
ｍｔＤＮＡが欠失している全ての生成された培養細胞が、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化が欠けているにもかかわらず増殖する。しかし、ρ０遺伝子型を有する１４３Ｂ．ＴＫ−細胞は、野生型と比べて増殖速度が低減する。この特徴は、新規に確立されたρ０細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７では、解糖を介した嫌気性エネルギー生産に限定されることにから、明らかに見られた。よって、全てのρ０細胞株がピルビン酸及びウリジンの補給に依存する。また、それらは、乳酸により培養培地の酸性化を増強する（Ｊａｋｏｂｓら（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２１１、３７−４３）。本研究において、ピルビン酸及びウリジンの補給への依存、及び、乳酸発酵による培養培地の酸性化は、正常増殖条件下において、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞で明らかであった。
【００１０】
培養培地の検査の結果、野生型の培地と比べて、ρ０細胞のｐＨ値が実質的に低下していた。高細胞密度によって引き起こされた細胞死により、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞の６２時間後の値を決定することはできなかったが、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞では、ｐＨ６．７〜６．８まで更に低下した。１０６細胞に標準化した場合、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞のグルコース消費量、並びに乳酸及びプロトン生産は増加した。これは、野生型細胞とは対照的に、ρ０細胞が解糖に完全に依存してＡＴＰを生産し、それゆえ、乳酸発酵の促進によって酸性化したことによるものである。ＭＯＬＴ−４細胞では、野生型と比べて、乳酸生産が４倍増加したことが示されている（Ａｒｍａｎｄら（２００４）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９６、６８−７９）。しかし、本研究では、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞の乳酸生産は、野生型と対比して１．５〜２倍に増加しただけであった。
【００１１】
細胞内及び細胞間における乳酸及び他のモノカルボン酸は、１ファミリーのモノカルボン酸輸送タンパク質（ＭＣＴ）が輸送する。ミトコンドリアの乳酸／ピルビン酸交換体は、活性な呼吸細胞内の乳酸の酸化を可能とするミトコンドリア乳酸デヒドロゲナーゼと協働すると思われる（Ｂｒｏｏｋｓ（２００２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３０、２５８−２６４）。この経路は、ρ０細胞では働くことができないことから、生産された乳酸の全量が周囲の培地中に放出されなければならない。乳酸はプロトンと共に原形質膜を通過して共輸送され（Ｐｏｏｌｅ及びＨａｌｅｓｔｒａｐ（１９９３）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６４、Ｃ７６１−Ｃ７８２）、ρ０細胞の培養培地のｐＨ値の低下の原因となる。
【００１２】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓを用いて細胞小器官を染色し、上記細胞株におけるミトコンドリアの形態を共焦点顕微鏡で観察した。ρ０細胞ではのミトコンドリアは腫脹しているように見えることの多い点状であるのに対し、野生型細胞で広範なミトコンドリアネットワークが観察され、ミトコンドリアゲノムの欠失による、ミトコンドリア形態の典型的な変化を表している。また、全ミトコンドリア量は、正常細胞とρ０細胞との間で変化が見られなかった。ρ０ミトコンドリアの更なる形態変化が、超微細構造検査によって検出された。正常な１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア網状構造が、高電子密度のマトリックスで、規則的に配列されたクリステ構造を完全に有するのとは対照的に、ρ０細胞のＴＥＭイメージは、ミトコンドリア形態の明白な変化を示す。ネットワークは、腫脹した外観であることが多く、おそらく水分の流入が増大して希釈されたことにより電子が空となったマトリックスを有する単体ミトコンドリアユニットに分解されている。ほとんどのクリステが、マトリックス中の同心円の輪状である２枚の膜からなる「ぼやけたタマネギ（ｆｕｚｚｙ ｏｎｉｏｎ）」様の構造（Ｈａｌｅｓ及びＦｕｌｌｅｒ（１９９７）、Ｃｅｌｌ．、９０、１２１−１２９）として存在する。また、これらの膜の輪は、ミトコンドリア境界膜とわずかな接触部位しかもたなかった。これらの二重膜が、２枚の内膜からなるのか、１枚の外膜及び１枚の内膜からなるかは明確でない。
【００１３】
膜の包含及び複数の同心円状のクリステを有する腫脹したミトコンドリアと同様のρ０表現型は、細胞を逆転写阻害剤ジドブジンと共に培養した後に観察されている（Ｓｅｍｉｎｏ−Ｍｏｒａら（１９９４）、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、７１、７７３−７８１）。しかし、Ｌ−カルニチンを添加することにより、これらの変化を避けることができた。これは、これらの形態変化において、脂肪酸経路の欠陥が関与している可能性があることを示す。
【００１４】
本願に記載した新規方法を用いることによって、化学物質（例えば、エチジウムブロマイド）の変異原性作用を回避した、極めて制御された穏和な条件下で新規のρ０細胞株を生成することを初めて可能とした。よって、ミトコンドリア表現型に関連する疾患を研究する今後の実験において、様々な核バックグラウンドを示すρ０細胞株を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ミトコンドリアを標的とするＥｃｏＲＩの構築及び発現を示す図である。ＣＯＸ ＶＩＩＩ標的化配列（ＭＴＳ）をコードするＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ＥｃｏＲＩの５’末端に付加し、「光学」マーカとして、強化緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子を３’末端に融合させた。この構築物を、ｐＴＲＥ２ｈｙｇベクタにサブクローニングし、ＡｇｅＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏに再クローニングし、その結果、構成的ＣＭＶプロモータを有するｐＭＥＥ−ｃｏｎベクタを得た（Ａ）。最終構築物で１４３Ｂ．ＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ細胞を形質転換した。形質転換の２４時間後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質が点状にミトコンドリアに局在化していること（白い矢尻）を、共焦点蛍光顕微鏡を用いてＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏとの共局在によって確認した（Ｂ）。目盛は１０μｍに相当する。
【図２】１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７（点線）、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０（実線）及び１４３Ｂ．ＴＫ−（破線）細胞株の増殖速度の培養経時変化を示すグラフである。表示されている値は、４回の個々の測定の平均値である。標準偏差はエラーバとして示す。野生型と比べて、ρ０細胞は増殖速度が低下していた。
【図３】ミトコンドリアを標的とするＥｃｏＲＩの発現後における１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株でのｍｔＤＮＡの欠失を示す図である。核ＤＮＡのヒストンＨ１を増幅するプライマ、及びｍｔＤＮＡのＤループ領域に対応するプライマを用いたＰＣＲによって、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０コントロール、及び単離された１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞を分析した。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株では、該ｍｔＤＮＡ領域を増幅することができず、これらの細胞におけるミトコンドリアゲノムの欠失を確認した。ヒストンＨ１の陽性増幅は、全てのプローブにおいてゲノムＤＮＡの量が十分であったことを示す（Ａ）。これらの細胞をＢａｍＨＩ又はＰｖｕＩＩで消化後、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド４８３１〜５６５１をコードするプローブを用いてサザンブロット分析することにより、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のｍｔＤＮＡが存在しないことが示された（Ｂ）。
【図４】ＥｃｏＲＩをコードする遺伝子が１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていないことを示すＰＣＲ分析の図である。ＰＣＲ分析は、表示されたようにＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する様々なプライマ対を用いて、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞株において行った。陽性コントロールとして５０ｐｇ ｐＭＥＥ−ｃｏｎを用いた。結果は、ゲノムへの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の組み込みがないことを示す。
【図５】１０６細胞に標準化された、純粋な培養培地（一点短鎖線）、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株（点線）、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞株（実線）、及び１４３Ｂ．ＴＫ−細胞株（破線）の培養培地中のグルコース消費量（Ａ）、乳酸生産率（Ｂ）及びプロトン生産率（Ｃ）の培養経時変化を示すグラフである。表示されている値はそれぞれ４回の個々の測定、８回の独立した測定（ρ０細胞のｐＨ値）の平均値である。標準偏差はエラーバとして示す。１０６細胞に標準化すると、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞のグルコース消費量並びに乳酸及びプロトン生産量は、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型の量を超える。しかし、測定された全ての細胞株における培養培地のｐＨ値はほぼ同様であった。細胞を添加していない純粋な培地のｐＨ値は、培地がＣＯ２で飽和することによりわずかな低下を示す。プロトン生産率の分析では、値が最初低下しその後増大する特有の曲線的経過が観察できた。野生型の細胞における６２時間培養における値は、アポトーシスをもたらす高細胞密度のため測定できなかった。
【図６】野生型細胞及びρ０１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア組織を示す図である。細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで染色した。Ａ１は、野生型細胞における、主として桿状形態の細胞小器官である、大部分が網状組織であるミトコンドリアを示す。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで染色された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞（Ａ２）及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（Ａ３）では、ミトコンドリア網が破壊されて、高頻度で腫脹しているように見える単体ユニットになっていることを示されている。目盛は１０μｍに相当する。
【図７】ＴＥＭによる野生型及びρ０ミトコンドリアの超微細構造観察を示す図である。超薄切片の電子顕微鏡写真を示す。１４３Ｂ．ＴＫ−野生型ミトコンドリアは、多数の規則的に配列されたクリステを有し、相互に連結した網構造を示す（Ａ１）。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞（Ａ２）及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（Ａ３）のミトコンドリアは、歪んだクリステを有する単体小胞性細胞小器官となっており、マトリックス中で同心二重膜円を形成している。挿入図は、四角で囲まれた領域をより高倍率で示す。バー（Ａ１〜Ａ３）は、１μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
したがって、本発明は、ρ０細胞を生成させる方法であって、（ａ）適したプロモータに作動可能となるように連結されている、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクタでｍｔＤＮＡ含有細胞を形質転換させるステップと、（ｂ）形質転換させた細胞を十分な時間培養するステップと、（ｃ）ρ０細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
例えば、リン酸カルシウムによる形質転換等、原核細胞又は真核細胞内に外来ＤＮＡを導入する様々な当業者に周知の方法が利用可能である。形質転換の他の方法には、エレクトロポレーション、ヒートショック、マグネトフェクション、又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）又はＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）等の独占的権利で守られている形質転換試薬の使用に基づく方法が含まれる。組換（発現）ベクタ（及び融合タンパク質をコードする遺伝子）は、当業者によく知られた方法に従って構築でき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎ．Ｙ．を参照することができる。様々な発現ベクタ、好ましくは安定的発現用の発現ベクタを本発明の融合タンパク質をコードする配列を含有及び発現させるために利用してもよい。これには、組換バクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクタ、例えば、酵母発現ベクタ、ウイルス発現ベクタ（例えば、バキュロウイルス）；植物細胞発現ベクタ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、細菌発現ベクタ（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物発現ベクタ、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベースのベクタが含まれる。また、形質転換用のナノ工学物質を使用してもよい。
【００１８】
細胞培養の方法及び適切な培地は当業者に知られており、培養される細胞の種類に依存する。「十分な時間形質転換細胞を培養する」という用語は、ｍｔＤＮＡの完全な破壊、すなわち外来遺伝子の発現、すなわち融合タンパク質の合成、該融合タンパク質のミトコンドリア内への送達、及び融合タンパク質の一部である制限酵素によるｍｔＤＮＡの切断を可能にする培養を意味する。この目的を達成するために十分な時間は、様々な因子、例えば、使用されるベクタ及びプロモータの種類、特定の培養条件及び細胞の種類に依存するが、確立されているアッセイ、例えば、下記の実施例に記載のアッセイを用いて当業者が容易に決定することができる。動物細胞用には、「十分な時間」は、１２時間から２０日間の範囲内であってもよい。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、上記制限エンドヌクレアーゼは、ｍｔＤＮＡを１から１０回、好ましくは３から７回、切断するいわゆる「レアカッター」である。そのような制限酵素は、当業者にはよく知られており、これらの酵素をコードする遺伝子は公開されているため、ミトコンドリア標的配列を追加して含む融合タンパク質を構築するのに使用できる。好ましい制限酵素としては、ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ及びＳｐｅＩが挙げられる。
【００２０】
本発明の方法は、通常、ミトコンドリアを含有するいかなる細胞にも、すなわちいかなる真核細胞にも適用できる。好ましい真核細胞は動物細胞である。哺乳動物細胞、例えば、サル、ラット、モルモット、ブタ又はヒト細胞が特に好ましい。
【００２１】
適したプロモータに作動可能となるように連結された、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする挿入遺伝子を発現させるため、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、ジオキサン応答エレメントを有するマウス乳癌ウイルスプロモータ、β−アクチン遺伝子プロモータ；ＮＲＥ又はＧＲＥエレメントを有するメタロチオニン（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモータ、及びＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等、強力な真核細胞プロモータを用いることが好ましい。ＣＭＶ ＩＥプロモータは、ヒトプロモータ（ＨＣＭＶ ＩＥ）、マウスプロモータ（ＭＣＭＶ ＩＥ）又は代わりに別の起源、例えばサル、ラット、モルモット又はブタ起源のＣＭＶ ＩＥプロモータであってもよい。一般に、構成的発現用のプロモータが好ましい。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施形態では、発現ベクタは動物細胞用のベクタである。適したベクタは当業者によく知られており、そのようなベクタの例は前述の通りである。特に特に好ましい動物ベクタは、ヒトパポーバウイルスベースベクタ（ＢＫＶ）、ＳＶ４０由来ベクタ、ワクシニア由来ベクタ、アデノウイルス由来ベクタ、バキュロウイルスベクタ又はレトロウイルス由来ベクタである。代わりに、ＴＲＥ２ｈｙｇ等の非ウイルス性哺乳類ベクタを利用することができる。
【００２３】
タンパク質は、複数のシグナル及びいくつかの経路によって、亜ミトコンドリアコンパートメント（外膜、膜間スペース、膜及びマトリックス内）へと標的化される。ほとんどのミトコンドリアタンパク質が、取込みペプチドシグナルを含有するサイトゾル前駆体として合成される。サイトゾルシャペロンは、プレタンパク質をミトコンドリア膜中のチャネル結合型受容体に送達する。ミトコンドリアへと標的化されたプレ配列を有するプレタンパク質は、外膜で、受容体及びジェネラルインポート孔（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｐｏｒｔ Ｐｏｒｅ）（ＧＩＰ）（受容体及びＧＩＰは集合的に外膜トランスロカーゼ、すなわちＴＯＭとして知られている）によって結合する。プレタンパク質は、ＴＯＭを通って、ヘアピンループとして移行する。プレタンパク質は、小さいＴＩＭ（これらも分子シャペロンとして働く）によって膜間スペースを通り、内膜のＴＩＭ２３又は２２（内膜トランスロカーゼ）へと輸送される。マトリックス中で、標的化された配列はｍｔＨｓｐ７０により切除される。３つのミトコンドリア外膜受容体である、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ２２及びＴＯＭ７０が知られている。ＴＯＭ７０は、内部標的化ペプチドに結合して、サイトゾルシャペロンの結合部位として働く。ＴＯＭ２０はプレ配列と結合し、ＴＯＭ２２は、プレ配列及び内部標的化ペプチドの両方と結合する。ＴＯＭチャネルは、４１０ｋＤａの分子量及び２１Åの孔径を有する陽イオン特異的な高伝導性チャネルである。プレ配列トランスロカーゼ２３（ＴＩＭ２３）は、ミトコンドリア内膜に局在しており、そのＮ末端で前駆体タンパク質と結合する孔形成タンパク質として働く。ＴＩＭ２３は、ミトコンドリアマトリックス、ミトコンドリア内膜、及び膜間スペースのプレタンパク質の輸送体として働く。ＴＩＭ５０は、ミトコンドリアの内側でＴＩＭ２３に結合しており、プレ配列と結合することが見出されている。ＴＩＭ４４は、マトリックス側に結合しており、ｍｔＨｓｐ７０に結合することが見出されている。プレ配列トランスロカーゼ２２（ＴＩＭ２２）は、ミトコンドリア内膜に向けて移動するプレタンパク質にのみ結合する。ミトコンドリアマトリックスを標的とする配列は、正電荷のアミノ酸及びヒドロキシル化されたアミノ酸に富んでいる。
【００２４】
本発明の方法に適したミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）は当業者によく知られている。ミトコンドリアマトリックスへのＭＴＳが好ましく、そのようなＭＴＳとして好ましくは、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット４（ＣＯＸ ＩＶ）又はサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）からの標的化ペプチドである。原則的には、核にコードされたあらゆるミトコンドリアマトリックス酵素又は内膜酵素に由来するあらゆる標的配列、あるいは、融合タンパク質をミトコンドリアに導入することができる人工配列（５．５以上の疎水性モーメント、少なくとも２つの塩基性残基、両親媒性αヘリックスコンフォメーション；Ｂｅｄｗｅｌｌら（１９８９）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９（３）、１０１４−１０３５を参照）を、本発明の目的で使用することができる。
【００２５】
本発明の方法の更に好ましい実施形態では、前記融合タンパク質は、検出可能なポリペプチド、好ましくは蛍光タンパク質を含み、（ａ）細胞内における融合タンパク質をコードした遺伝子の発現をモニターすることを可能とし、かつ／又は（ｂ）ロー０細胞のための形質転換細胞を選択するためのＦＡＣＳ分析を可能とする。適した蛍光タンパク質は、造礁サンゴ蛍光タンパク質、ＡｍＣｙａｎ蛍光タンパク質、ＡｓＲｅｄ蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質、ＨｃＲｅｄ蛍光タンパク質、ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質、ＺｓＹｅｌｌｏｗ蛍光タンパク質、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ等、当技術分野で知られている。
【００２６】
好ましい蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ及びＥＧＦＰを挙げることができる。広範な用途の可能性及び研究者の要求の進化により、今のところＧＦＰの多くの異なる変異体が利用可能である。最初の主要な改良は、ＧＦＰの分光特性を劇的に改善し、蛍光の増強、光安定性、及びピーク発光を５０９ｎｍに保ったまま主要励起ピークを４８８ｎｍへシフトさせた単一点変異（Ｓ６５Ｔ）であった。このＧＦＰに、３７℃フォールディング効率点変異（Ｆ６４Ｌ）を追加することにより強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を得た。スーパーフォルダＧＦＰ、すなわちあまりフォールディングされていないペプチドに融合された場合でもＧＦＰが迅速にフォールディングし、かつ成熟することを可能にする一連の変異が２００６年に報告された。色変異体を含めた他の多くの変異、特に、青色蛍光タンパク質誘導体（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ）、シアン蛍光タンパク質誘導体（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、及び黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）も作成されている。ＢＦＰ誘導体はＹ６６Ｈ置換を含む。シアン誘導体における重要な変異は、Ｙ６６Ｗ置換であり、これによって、フェノール成分ではなくインドール成分で発色団が形成される。ＹＦＰ誘導体の波長はＴ２０３Ｙ変異によって赤方にシフトする。これらの蛍光タンパク質の全てを本発明の方法に使用することができる。
【００２７】
ρ０細胞を分析する方法及びρ−又はρ＋細胞からρ０細胞を分離する方法も当業者に知られている。本発明の方法の更に好ましい実施形態では、ロー０細胞は、ＦＡＣＳ分析、組織培養クローン化技術（クローニングリング法、細胞希釈法等）、代謝試験（ウリジン／ピルビン酸を補完した培地で増殖し、一方、ウリジン／ピルビン酸が枯渇した増殖培地では死滅する）、遺伝的試験、例えばＰＣＲ又はサザンブロット分析によって選択される。下記の実施例は本発明を更に詳細に説明するものである。
【００２８】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）クローニング
クローニングは、標準的手順に従って行い、全てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物は配列決定によって確認した。ＰＣＲでは、ＥｃｏＲＩ遺伝子をコードするプラスミドｐＡＮ４（Ｐ．Ｍｏｄｒｉｃｈらにより構築され、Ａ．Ｋｉｓｓから提供を受けた、Ｎｅｗｍａｎら（１９８１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２１３１−２１３９）を鋳型として使用し、以下のプライマ：ＥＧＦＰ遺伝子の３’末端に相補的な短い配列を付加する、ＥｃｏＲＩＲ−００１−ＦＯＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、４５７−４６５）５’−ｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇａｔｇｔｃｔａａｔａａａａａａｃ−３’、及び、ＮｏｔＩ制限部位を生成する、ＥｃｏＲＩＲ−８３４−ＲＥＶ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、４５７−４６５）５’−ｇｇｃｃａａａｔｃａｃｔｔａｇａｔｇｔａａｇｃｔｇｔｔｃａａａｃ−３’を用いた。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ（クロンテック ヨーロッパ、サンジェルマン・アン・レ、フランス）から得たＥＧＦＰ遺伝子は、ＮｏｔＩ制限部位を生じさせるプライマｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ−０５９７−ＦＯＲ ５’−ｇｇｃｃａａａｔｇｔｃｃｇｔｃｃｔｇａｃｇ−３’、及び終止コドンのないＥＧＦＰを増幅するｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ−１４２１−ＲＥＶ ５’−ｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇ−３’で増幅した。両方の断片を組換ＰＣＲで使用し、そのリン酸化産物を、ＰｖｕＩＩで線状化されたベクタｐＴＲＥ２ｈｙｇ（クロンテック ヨーロッパ、サンジェルマン・アン・レ、フランス）内にサブクローニングした。ＥＧＦＰ遺伝子及びＥｃｏＲＩ遺伝子からなる融合遺伝子産物をＡｇｅＩ及びＮｏｔＩでｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ内にクローニングし、ベクタｐＭＥＥ−ｃｏｎを得た。
【００２９】
（Ｂ）細胞培養、形質転換及びミトコンドリア染色
ヒト骨肉腫細胞１４３Ｂ．ＴＫ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０３）は、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（インビトロゲン、カルルスルーエ、ドイツ）を含み、１０％ウシ胎児血清、１％ブロモデオキシウリジン、１００ユニットのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）中で、標準条件下で培養した。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０と命名したρ０細胞株は、低用量のエチジウムブロマイド存在下で１４３Ｂ．ＴＫ−を培養することにより生成した。親１４３Ｂ．ＴＫ−のρ０細胞株、及び形質転換操作後の細胞は、１００μｇ／ｍｌピルビン酸及び５０μｇ／ｍｌウリジンを追加で添加して示す通りに維持した。
【００３０】
１４３Ｂ．ＴＫ−及び１４３Ｂ．ＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ（ｐＭＥＥ−ｃｏｎとの共局在検出のため、ミトコンドリアを標的とするＤｓＲｅｄ１を安定的に発現する１４３Ｂ．ＴＫ−細胞）の一過性形質転換は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の条件に従って行った。７００μｇ／ｍｌのジェネテシンによる選択を、形質転換の２４時間後に５日間行った。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名した単離されたクローンをアリコートに分け、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ、１０％透析ＦＣＳ、１％ブロモデオキシウリジン、１００ユニットのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含み、ピルビン酸及びウリジンを含まないＤＭＥＭ（高グルコース）で３０日間、存在する酸化的リン酸化について代謝試験を行った。
【００３１】
このアプローチの適用可能性を齧歯動物細胞まで拡張するため、２つの他の細胞株：マウス株ＬＭＴＫ−（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．３）及びラット株ＮＲＫ５２Ｅ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７１）を用いた。ミトコンドリアを標識するのに、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸＲｏｓ（インビトロゲン、カルルスルーエ、ドイツ）を製造者のプロトコールに従って１００ｎＭの濃度で用いた。
【００３２】
（Ｃ）ＦＡＣＳ分析
形質転換細胞の試料（０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２×１０６細胞／ｍｌ）を、フローサイトメータ及びそのソフトウェア（ＦＡＣＳＣＡＮ、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データの取得は、ＥＧＦＰに融合し、ミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼを発現する１００．０００個以上の細胞を、フローサイトメータでゲーティングすることによって行った。
【００３３】
（Ｄ）ＰＣＲによるクローンの特徴づけ
得られた１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞クローン内の全ての内因性ｍｔＤＮＡが失われていることを確かめるため、ゲノムＤＮＡを単離して、ＰＣＲの鋳型として用いた。対照には、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型、及び前述の通りエチジウムブロマイドと共に培養して生成された対応するρ０細胞株から単離されたゲノムＤＮＡを用いた。ｍｔＤＮＡ領域で結合する以下のプライマ：１５５０１−ＦＯＲ ５’−ａｃｃｃａｇａｃａａｔｔａｔａｃｃｃｔａｇｃ−３’及び６３０ＲＥＶ ５’−ｇａｇｃｃｃｇｔｃｔａａａｃａｔｔｔｔｃａａｔｇ−３’を使用した。対照ＰＣＲは、ヒトヒストンＨ１遺伝子を増幅するプライマ（Ｈｉｓｔｏｎ Ｈ１ ５’ ５’−ａｔｇａｇｃｔｃａｔｇａｃｃｇａｇａａｔｔｃｃａｃｇｔｃｃｇ−３’及びＨｉｓｔｏｎ Ｈ１ ３’ ５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｃａａａｃｔｔｃｔｔｃｔｔｇｃｃ−３’）を用いて行った。アニーリング温度は５５℃で、３５サイクル行い、伸長時間を１分間とした。
【００３４】
１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のゲノム内へのＥｃｏＲＩ遺伝子の潜在的な組込みを調べるため、ＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する以下に列挙するいくつかのプライマセット：ＥｃｏＲＩ−００１−ＦＯＲ（Ｗａｌｌａｃｅ（２００１）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２３５、２４７−２６３）５’−ａａｔｔｃｃｃｇｇａｔｃｃｃａｃｃａｔｇｔｃｔａａｔａａａａａａｃａｇｔｃａａａ−３’、ＥｃｏＲＩ−２２０−ＦＯＲ ５’−ｇａｃｃｃｔｇａｔｃｔｔｇｇｃｇｇｔａｃｔｔｔａｔｔｔｇ−３’、ＥｃｏＲＩ−３９２−ＦＯＲ ５’−ｇａｇｇａｇａｔｃａａｇａｔｔｔａａｔｇｇｃｔｇｃｔｇ−３’、ＥｃｏＲＩ−６５３−ＲＥＶ ５’−ｃａｔａｇａｔｔａｃｔａｔｔｔａｔａｇｇｃａｔｔｃｃａｔａａｔｔａｇｃｔｇｃ−３’、ＥｃｏＲＩ−８１９−ＲＥＶ ５’−ｃｔｇｔｔｃａａａｃａａｇｔｃａｃｇｃｃ−３’、ＥｃｏＲＩ−８３４−ＲＥＶ（Ｋｉｎｇ及びＡｔｔａｒｄｉ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２４６、５００−５０３）５’−ａｔｔｃｃｃｃｃｇｇｇｔｃａｃｔｔａｇａｔｇｔａａｇｃｔｇｔｔｃａ−３’を用いてＰＣＲを行った。最初の５サイクルのアニーリング温度は４５℃とし、その後、３０サイクルは５５℃で伸長時間を２分間とした。
【００３５】
（Ｅ）サザンブロット分析
細胞から抽出した全ＤＮＡ（１５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ又はＰｖｕＩＩで消化した。制限断片を０．６％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜上に転写して、ヌクレオチド４８３１〜４８４６（Ｆｏｒ）及び５６２８〜５６５１（Ｒｅｖ）にアニーリングするｍｔＤＮＡプライマで増幅されたジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識ヒトｍｔＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。膜を洗浄し、断片をＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、マンハイム、ドイツ）を用いて、製造者の指示に従って検出した。断片の化学発光は、バイオイメージングシステム（Ａｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｉｏｚｙｍ、ヘッシシュ オルデンドルフ、ドイツ）で分析した。
【００３６】
（Ｆ）培養培地の代謝物分析
４×１０５細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１００μｇ／ｍｌピルビン酸及び５０μｇ／ｍｌウリジンを添加した２．５ｍｌ培養培地中で、標準条件下で培養した。培養２４、４０、４８及び６２時間後、細胞数を定量化し、ｐＨ値を分析し、グルコース濃度及び乳酸濃度をＨｉｔａｃｈｉ９１７臨床化学分析装置（ロシュ・ダイアゴニスティックス）で測定した。ｐＨ値は、水素イオン濃度（ｍｏｌ／ｌ）＝１０−ＰＨの式によって、培地中水素イオン濃度に変換し、更に、他の全てのデータを１０６細胞に標準化し、グラフで分析した。表示されている値は、それぞれ、４回の個々の測定又は８回の独立した測定（ρ０細胞のｐＨ値）の平均値である。標準偏差はエラーバとして示した。
【００３７】
（Ｇ）共焦点顕微鏡法
ガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アシュランド、米国）上で培養した生細胞を、逆位共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ５（ライカ・マイクロシステムズ）で観察した。染色された複数の化合物の励起によるクロストークを避けるために、共焦点顕微鏡で順次走査モードのみを用いた。画像を光電子増倍管で取得し、顕微鏡写真の処理及び分析を、ライカ・アプリケーション・スーツ・アドバンスト・フルオレッセンス１．５．１ソフトウェア及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳで行った。
【００３８】
（Ｈ）電子顕微鏡観察
カバーガラス上で培養した細胞を２．５％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド（パラホルムアルデヒドから作られたもの）を含むｐＨ７．４の１００ｍＭカコジル酸緩衝液中、４℃で１．５時間固定し、カコジル酸緩衝液で２回洗浄し、その後、２％四酸化オスミウムを含む５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）で固定した。標本を蒸留水で２回洗浄し、水性０．５％酢酸ウラニルを用いて、４℃で一晩染色した。細胞を脱水して、Ｅｐｏｎ８１２中に平板包埋した。超薄切片をＺｅｉｓｓ ＥＭ１０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）で分析した。陰画を走査によってデジタル化し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳで処理した。
【００３９】
実施例２．ミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼを使用したρ０細胞の生成及びρ０状態の確認
本実験の目的は、エチジウムブロマイド、ジテルカリナム（ｄｉｔｅｒｃａｌｉｎｕｍ）又は２’３’−ジデオキシシチジン等の変異誘発物質を使用せずに、全ての内因性ミトコンドリアＤＮＡを欠いた細胞を生成する系を開発することである。当該系の基本となるのは、細胞内への形質転換の後に、機能単位として制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを構成的に発現するベクタｐＭＥＥ−ｃｏｎである。ＥｃｏＲＩは、ヒトｍｔＤＮＡを、細胞の民族的背景に応じて、３〜５回切断することが知られている。実験マウスｍｔＤＮＡは３箇所の、ＮＲＫ５２Ｅ細胞株の元であるラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）は７箇所のＥｃｏＲＩ部位を有する。ヒトチトクロームｃオキシダーゼサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）に由来するミトコンドリア標的化ペプチドにＥｃｏＲＩを融合させた。更に、一つには細胞内の発現を観察し（図１Ｂ）、もう一つにはＦＡＣＳ分析に適した選択マーカを持たせて、それによって、純粋になるまで形質転換細胞を選択できるようにするために、生成した構築物に強化緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを融合させた（図１Ａ）。共焦点蛍光顕微鏡により、このポリペプチドが発現され、おそらく核様体のｍｔＤＮＡと密接に接触して、ミトコンドリアに点状に局在していることが示された（図１Ｂ）。抗生物質ジェネテシンの存在下で５日間、一過性形質転換細胞を選択することにより、又は代わりにＦＡＣＳ選択することにより、１４３Ｂ．ＴＫ−クローンを単離することができた。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名したこの細胞クローンのピルビン酸及びウリジンへの依存について代謝試験を行った。これらの細胞は、ピルビン酸及びウリジンを含まない培地で培養中は弱い増殖しか示さず、最終的には死滅した。このことは、該細胞株がρ０状態であることを強く示唆している。
【００４０】
６２時間の培養時間の間の細胞増殖の分析（図２）により、野生型（破線）とは対照的に、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（点線）の増殖速度が明白に低下していることが示された。これは、低用量のエチジウムブロマイドで培養することにより生成された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０と呼ぶρ０細胞株（実線）で観察された結果と一致している。両方のρ０細胞株は類似した遺伝的背景を示すが、図は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞は、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞よりわずかに遅い増殖速度を有することを示している。
【００４１】
ｍｔＤＮＡが失われていることを更に確認するため、Ｄループ内に位置する１６９８ｂｐ領域を増幅するプライマを用いて、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析を行った（図３Ａ）。増幅の陽性対照は、野生型のゲノムＤＮＡで行い、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞を陰性対照とした。試料中の鋳型ＤＮＡが十分な量であることを示すため、核遺伝子ヒストンＨ１の領域を増幅するプライマで追加の実験を行った。野生型細胞株とは対照的に、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞では増幅産物を観察することができなかった。更に、これらの結果は、サザンブロット試験によっても確認され、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞における、ｍｔＤＮＡの完全な欠失を示した（図３Ｂ）。ＬＭＴＫ−及びＮＲＫ５２Ｅ細胞株の複数の独立したクローンでも同様の結果が得られた（データは非図示）。
【００４２】
実施例３．ゲノム内への制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の組込みの分析
安定的なρ０クローン１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７を継代させた後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質発現のＥＧＦＰ蛍光は検出できず、細胞がプラスミドを失ったことが示された。その後、細胞が制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をそのゲノム内に組み込んでいたかどうかをＥｃｏＲＩ遺伝子の様々な領域を増幅するＰＣＲによって試験した。様々なプライマ対を用いた分析を、ゲノムＤＮＡについて行った（図４）。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞及び対照において、増幅産物は観察されず、ＥｃｏＲＩの遺伝子が１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていないことを示した。更に、これらの結果は、ミトコンドリアゲノムを完全に破壊するためには、短時間の一時的なミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼの発現のみで十分であることを示した。１年を超える培養の間、ＰＣＲ並びにピルビン酸及びウリジンの代謝依存性による試験で、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞内のｍｔＤＮＡは回復していなかった。
【００４３】
実施例４．培養培地の比較分析
ρ０細胞のエネルギー生産は、嫌気性解糖に完全に依存している。加えて、今まで知られている全てのρ０細胞株が、ピルビン酸及びウリジンの補給に依存し、かつ過度の乳酸生産による培養培地の酸性化を示す。両方の特性が、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞並びにマウス及びラットのρ０クローンで観察することができた。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞を２４、４０、４８及び６２時間培養後、細胞数の測定に加えて、培養培地中のグルコース濃度、乳酸濃度及びｐＨ値を分析した。グルコース及び乳酸濃度、並びに水素イオン濃度は、１０６細胞に標準化してグラフ表示した。基準値は、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞の測定によって得た。１０６細胞に標準化した場合、ρ０細胞のグルコース消費量（図５Ａ）（７．５〜８．５ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）は、野生型細胞の量（５ｇ／ｌ、破線）を超えていた。更に、グルコース消費量は、培養時間中に明らかに低下した（ρ０細胞で約８８％、野生型細胞で７５％）。
【００４４】
１０６の細胞に標準化された乳酸生産のグラフ（図５Ｂ）は、野生型よりρ０細胞（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）の乳酸生産率が高いことを示す。これらの値は最初、培養２４時間から４０時間までの間は増大するが、曲線の経過はその後、飽和に似た状態となり、その後ほぼ一定のレベルに留まる（１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７：１７ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０：１５ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−：１１ｇ／ｌ）。
【００４５】
細胞が添加されていない純粋な培地のｐＨ値は、ＣＯ２で培地が飽和することにより、ｐＨ８．０からｐＨ７．７への若干低下するだけである（図５Ｃ、一点短鎖線）。一方、測定した細胞株の培地のｐＨ値は、４８時間の培養後、野生型細胞（破線）で７．８から、ρ０細胞（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）で７．５から、全ての細胞株でｐＨ７．３まで変化する（図５Ｃ）。１４３Ｂ．ＴＫ−細胞の６２時間後の値は、高細胞密度によって生じた細胞死のため決定することができなかったが、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞では、ｐＨ値は更に６．７〜６．８まで低下した。
【００４６】
様々な培養時間における、細胞数で標準化した水素イオン濃度（図５Ｄ）は、ρ０細胞の培地中への水素イオン放出率（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）が、野生型細胞（２．５〜３．５×１０−８ｍｏｌ／ｌ、破線）の要求をはるかに超えることを示す。その上、ρ０細胞において、値が最初に７×１０−８から６×１０−８ｍｏｌ／ｌに低下し、その後１．０〜１．５×１０−７ｍｏｌ／ｌまで増大する特別な曲線経過が観察された。
【００４７】
実施例５．共焦点顕微鏡を用いた形態比較試験
表示された細胞株におけるミトコンドリアの形態は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓを用いて細胞小器官を染色し、共焦点顕微鏡で検査して試験した（図６）。１４３Ｂ．ＴＫ−野生型細胞（図６Ａ１）のミトコンドリアは、細胞内で均等に分布した網状ネットワークとして存在する。多くみられるミトコンドリアの構造は、細長く、桿状形態であった。これらの細胞のρ０形態（図６Ａ２、Ａ３）では、ネットワーク構造が破壊されているようであり、小さな個別のミトコンドリアユニットの分布を生じている。この断片化は、より高倍率の画像で強調表示されている。更に、これらの単体細胞小器官の一部は、腫脹しているように見えた。この結果は、野生型では観察できなかった。
【００４８】
野生型細胞における相互に連結したミトコンドリアネットワークと、対照的なρ０細胞における点状ミトコンドリアは、ミトコンドリアＤＮＡが失われていることによる、ミトコンドリア形態の典型的な変化である（Ｇｉｌｋｅｒｓｏｎら（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４７４、１−４；Ｒｉｚｚｕｔｏら（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８０、１７６３−１７６６）。
【００４９】
実施例６．透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた形態比較試験
ρ０ミトコンドリアの、更に多くの形態変化が超微細構造検査により検出された（図７）。図７Ａ１は、野生型における高度に相互連結されたミトコンドリアネットワーク構造の詳細を示す。正常な１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア網を通る横断切片は、高電子密度のマトリックス、規則的に配列された完全なクリステ構造を有する明確な外膜及び内膜を示した。対照的に、ρ０細胞（図７Ａ２、Ａ３）のＴＥＭ画像は、ミトコンドリア形態の明らかな変化を示す。ネットワークは、腫脹した外観を有することの多い単体ミトコンドリア単位に分解されている。マトリックスは、おそらく水の流入の増加によるマトリックスの希釈により電子が疎らに見え、これは腫脹した外観についての説明にもなる。ρ０細胞内のミトコンドリアは依然として、正常細胞内で見られる明確な外膜及び内膜を示すが、クリステは全体的な構造変化を示した。ほとんどのクリステが曲がっているか、密接に接触した２枚の膜からなる同心円状の輪、すなわち「ぼやけたタマネギ」（Ｈａｌｅｓ及びＦｕｌｌｅｒ（１９９７）、Ｃｅｌｌ．、９０、１２１−１２９；Ｈａｌｅｓｔｒａｐ（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、９７３、３５５−３８２）と呼ばれる外観に見える。加えて、これらの膜の輪は、ミトコンドリア境界膜との接触部位をわずかに示すのみであった。これらの二重膜が、２枚の内膜からなるものであるか、１枚の外膜及び１枚の内膜からなるものであるかは識別できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアを標的とする制限エンドヌクレアーゼを用いたρ０細胞の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞に見られる細胞小器官である。ミトコンドリアは、細胞のクレブス回路又は好気的エネルギー供給等、極めて重要な生物化学プロセスの場となっている。しかし、最近、それらが加齢プロセス及びプログラム細胞死における中心的存在であることが示された。これらの全ての機能に密接に結びついている１つの因子が、この細胞小器官のゲノム、すなわちミトコンドリアＤＮＡである。様々な症状を示す多数の神経疾患及び神経筋疾患が、ミトコンドリアゲノムの変異と関連づけられてきている（Ｗａｌｌａｃｅ（２００１）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２３５、２４７−２６３）。例えば、ミトコンドリア脳症は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化系（ＯＸＰＨＯＳ）の機能障害から生じる疾患の一種である。普通の状態では、この系は細胞呼吸及びエネルギー生産の役割を担っている。関連する疾患では、好気的代謝の要求が高い組織（例えば、脳、骨格筋、心臓）において障害が現れる。酸化的リン酸化系には、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）及びミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）によってコードされたサブユニットが集合してなる５つの酵素複合体が関与している。ミトコンドリアゲノムは、環状に構成され、１６５６９ｂｐを包含し、ＯＸＰＨＯＳに関与する１３のポリペプチド、１セットの２２の必須ｔＲＮＡ、並びにミトコンドリア翻訳に必要なラージリボソームＲＮＡ（１６Ｓ）及びスモールリボソームＲＮＡ（１２Ｓ）をコードしている。ｍｔＤＮＡは完全に配列決定された最初のゲノムであるにも拘らず、核とミトコンドリアとの相互作用、ｍｔＤＮＡ遺伝子とｎＤＮＡ遺伝子との発現の連携、又はｍｔＤＮＡの細胞内における維持プロセス（核因子によって厳密に決定されるプロセス）についてはほとんど何も知られていない。このように知見が不足していることから、ｍｔＤＮＡの損傷によってヒト疾患を生じる分子機序についてはほとんど知られていない。これは一部には、実験条件下でミトコンドリアの調節及び発生プロセスを研究することができないことによるものである。
【０００３】
このような問題を克服する１つの試みが、Ｋｉｎｇ及びＡｔｔａｒｄｉ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、５００−５０３によって行われた実験であり、酵母遺伝学において知られる実験と同様の実験において、ヒト骨肉腫細胞系（骨肉腫由来の１４３Ｂ．ＴＫ−）を４〜６週間にわたって少用量のエチジウムブロマイドで処置している。この試薬は、ｍｔＤＮＡと相互作用して、ＤＮＡ複製を妨げる複合体を形成することが知られている。一連の細胞分裂の後、内因性ｍｔＤＮＡは失われ、一方、核ＤＮＡは維持される。ｍｔＤＮＡの欠失は、数日後に酸化的リン酸化系を消失させるため、内因性ｍｔＤＮＡを欠いた細胞（いわゆる、ρ０（ロー０）細胞）の生存を維持するために栄養素の補給が必要となる。増殖培地にピルビン酸及びウリジンを添加することにより、呼吸鎖電子移動が失われ、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）が阻害されていても、ピリミジンを生成し、細胞のエネルギー要求を満たすことができる。
【０００４】
また、ｍｔＤＮＡ複製を妨げる他の試薬（ジテルカリニウム、ｄｄＣ等）によるρ０細胞の生成が調べられている。しかし、用いられた全ての化学物質は、変異原性効果、又はｍｄｒ（多薬物耐性）ファミリー遺伝子発現の誘導等、重大な欠点を示し、ｍｔＤＮＡ複製の阻害作用が失われている。更に、これらの方法の一番の制限は、異なる細胞株に適用できないことである。例えば、多くの試みについて事例証拠があるにもかかわらず、これらの方法で産生されたラットρ０細胞株に関する報告は公表されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、本発明の根底にある技術的課題は、従来技術の方法における問題を克服するρ０細胞の生成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の技術的課題を解決するため、特許請求の範囲に記載された態様を提供する。本発明者らは、全ての内因性ｍｔＤＮＡの破壊を可能にする、ミトコンドリアマトリックスを標的とする制限エンドヌクレアーゼに基づく方法を開発した。制限エンドヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを切断し、内因性のヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを完全に分解する。この方法は、ヒトｍｔＤＮＡを約３〜５回切断することが知られている制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ遺伝子を選択することによって実現した。ＥｃｏＲＩ遺伝子は、ヒトチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）遺伝子に由来するミトコンドリアターゲッティング配列、及び、光学マーカであるＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）遺伝子に融合させて、ミトコンドリアに局在化させた。形質転換し、ジェネテシン又はＦＡＣＳ分析のいずれかにより選択して、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名された細胞クローンを増殖させた。その後、代謝試験、ＰＣＲ及びサザンブロット分析によって、全ての内因性ミトコンドリアＤＮＡが失われていることを確認した。これらの細胞がρ０状態となったことによる、増殖、代謝及び形態変化を特徴づけるため、追加の比較試験を行った。
【０００７】
ρ０クローン１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７誘導後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質のＥＧＦＰ蛍光は検出されなかった。よって、ｍｔＤＮＡの破壊後に制限エンドヌクレアーゼ構築物の遺伝子を細胞が欠失しているか、又は、一部の遺伝子部分が核ゲノムの中に組み込まれて、微量の制限エンドヌクレアーゼが連続的に発現され、当該細胞株を、細胞質体融合試験におけるアクセプター細胞株として使えないものとなっているかどうかをＰＣＲによって確認した。ＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する様々なプライマ対を用いた分析の結果、増幅産物は観察されなかった。明らかに、ＥｃｏＲＩの遺伝子は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていなかった。この結果は、ミトコンドリアゲノムを完全に、非可逆的に、かつ安定的に破壊するには、ミトコンドリアを標的とする制限エンドヌクレアーゼの一時的な発現のみで十分であることを示し、かつ、ミトコンドリア内のＤＮＡ修復系にはこのＤＮＡ損傷に十分対応するだけの効力はないことを示す。
【０００８】
最後に、低用量のエチジウムブロマイドと共に培養することによって生成された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞株、及び新しく生成した１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞クローンと野生型とを、増殖速度、グルコース消費量、並びに乳酸及びプロトン生産率について比較した。
【０００９】
ｍｔＤＮＡが欠失している全ての生成された培養細胞が、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化が欠けているにもかかわらず増殖する。しかし、ρ０遺伝子型を有する１４３Ｂ．ＴＫ−細胞は、野生型と比べて増殖速度が低減する。この特徴は、新規に確立されたρ０細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７では、解糖を介した嫌気性エネルギー生産に限定されることにから、明らかに見られた。よって、全てのρ０細胞株がピルビン酸及びウリジンの補給に依存する。また、それらは、乳酸により培養培地の酸性化を増強する（Ｊａｋｏｂｓら（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２１１、３７−４３）。本研究において、ピルビン酸及びウリジンの補給への依存、及び、乳酸発酵による培養培地の酸性化は、正常増殖条件下において、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞で明らかであった。
【００１０】
培養培地の検査の結果、野生型の培地と比べて、ρ０細胞のｐＨ値が実質的に低下していた。高細胞密度によって引き起こされた細胞死により、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞の６２時間後の値を決定することはできなかったが、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞では、ｐＨ６．７〜６．８まで更に低下した。１０６細胞に標準化した場合、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞のグルコース消費量、並びに乳酸及びプロトン生産は増加した。これは、野生型細胞とは対照的に、ρ０細胞が解糖に完全に依存してＡＴＰを生産し、それゆえ、乳酸発酵の促進によって酸性化したことによるものである。ＭＯＬＴ−４細胞では、野生型と比べて、乳酸生産が４倍増加したことが示されている（Ａｒｍａｎｄら（２００４）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９６、６８−７９）。しかし、本研究では、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞の乳酸生産は、野生型と対比して１．５〜２倍に増加しただけであった。
【００１１】
細胞内及び細胞間における乳酸及び他のモノカルボン酸は、１ファミリーのモノカルボン酸輸送タンパク質（ＭＣＴ）が輸送する。ミトコンドリアの乳酸／ピルビン酸交換体は、活性な呼吸細胞内の乳酸の酸化を可能とするミトコンドリア乳酸デヒドロゲナーゼと協働すると思われる（Ｂｒｏｏｋｓ（２００２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３０、２５８−２６４）。この経路は、ρ０細胞では働くことができないことから、生産された乳酸の全量が周囲の培地中に放出されなければならない。乳酸はプロトンと共に原形質膜を通過して共輸送され（Ｐｏｏｌｅ及びＨａｌｅｓｔｒａｐ（１９９３）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６４、Ｃ７６１−Ｃ７８２）、ρ０細胞の培養培地のｐＨ値の低下の原因となる。
【００１２】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓを用いて細胞小器官を染色し、上記細胞株におけるミトコンドリアの形態を共焦点顕微鏡で観察した。ρ０細胞ではのミトコンドリアは腫脹しているように見えることの多い点状であるのに対し、野生型細胞で広範なミトコンドリアネットワークが観察され、ミトコンドリアゲノムの欠失による、ミトコンドリア形態の典型的な変化を表している。また、全ミトコンドリア量は、正常細胞とρ０細胞との間で変化が見られなかった。ρ０ミトコンドリアの更なる形態変化が、超微細構造検査によって検出された。正常な１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア網状構造が、高電子密度のマトリックスで、規則的に配列されたクリステ構造を完全に有するのとは対照的に、ρ０細胞のＴＥＭイメージは、ミトコンドリア形態の明白な変化を示す。ネットワークは、腫脹した外観であることが多く、おそらく水分の流入が増大して希釈されたことにより電子が空となったマトリックスを有する単体ミトコンドリアユニットに分解されている。ほとんどのクリステが、マトリックス中の同心円の輪状である２枚の膜からなる「ぼやけたタマネギ（ｆｕｚｚｙ ｏｎｉｏｎ）」様の構造（Ｈａｌｅｓ及びＦｕｌｌｅｒ（１９９７）、Ｃｅｌｌ．、９０、１２１−１２９）として存在する。また、これらの膜の輪は、ミトコンドリア境界膜とわずかな接触部位しかもたなかった。これらの二重膜が、２枚の内膜からなるのか、１枚の外膜及び１枚の内膜からなるかは明確でない。
【００１３】
膜の包含及び複数の同心円状のクリステを有する腫脹したミトコンドリアと同様のρ０表現型は、細胞を逆転写阻害剤ジドブジンと共に培養した後に観察されている（Ｓｅｍｉｎｏ−Ｍｏｒａら（１９９４）、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、７１、７７３−７８１）。しかし、Ｌ−カルニチンを添加することにより、これらの変化を避けることができた。これは、これらの形態変化において、脂肪酸経路の欠陥が関与している可能性があることを示す。
【００１４】
本願に記載した新規方法を用いることによって、化学物質（例えば、エチジウムブロマイド）の変異原性作用を回避した、極めて制御された穏和な条件下で新規のρ０細胞株を生成することを初めて可能とした。よって、ミトコンドリア表現型に関連する疾患を研究する今後の実験において、様々な核バックグラウンドを示すρ０細胞株を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ミトコンドリアを標的とするＥｃｏＲＩの構築及び発現を示す図である。ＣＯＸ ＶＩＩＩ標的化配列（ＭＴＳ）をコードするＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ＥｃｏＲＩの５’末端に付加し、「光学」マーカとして、強化緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子を３’末端に融合させた。この構築物を、ｐＴＲＥ２ｈｙｇベクタにサブクローニングし、ＡｇｅＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏに再クローニングし、その結果、構成的ＣＭＶプロモータを有するｐＭＥＥ−ｃｏｎベクタを得た（Ａ）。最終構築物で１４３Ｂ．ＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ細胞を形質転換した。形質転換の２４時間後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質が点状にミトコンドリアに局在化していること（白い矢尻）を、共焦点蛍光顕微鏡を用いてＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏとの共局在によって確認した（Ｂ）。目盛は１０μｍに相当する。
【図２】１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７（点線）、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０（実線）及び１４３Ｂ．ＴＫ−（破線）細胞株の増殖速度の培養経時変化を示すグラフである。表示されている値は、４回の個々の測定の平均値である。標準偏差はエラーバとして示す。野生型と比べて、ρ０細胞は増殖速度が低下していた。
【図３】ミトコンドリアを標的とするＥｃｏＲＩの発現後における１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株でのｍｔＤＮＡの欠失を示す図である。核ＤＮＡのヒストンＨ１を増幅するプライマ、及びｍｔＤＮＡのＤループ領域に対応するプライマを用いたＰＣＲによって、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０コントロール、及び単離された１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞を分析した。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株では、該ｍｔＤＮＡ領域を増幅することができず、これらの細胞におけるミトコンドリアゲノムの欠失を確認した。ヒストンＨ１の陽性増幅は、全てのプローブにおいてゲノムＤＮＡの量が十分であったことを示す（Ａ）。これらの細胞をＢａｍＨＩ又はＰｖｕＩＩで消化後、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド４８３１〜５６５１をコードするプローブを用いてサザンブロット分析することにより、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のｍｔＤＮＡが存在しないことが示された（Ｂ）。
【図４】ＥｃｏＲＩをコードする遺伝子が１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていないことを示すＰＣＲ分析の図である。ＰＣＲ分析は、表示されたようにＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する様々なプライマ対を用いて、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞株において行った。陽性コントロールとして５０ｐｇ ｐＭＥＥ−ｃｏｎを用いた。結果は、ゲノムへの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の組み込みがないことを示す。
【図５】１０６細胞に標準化された、純粋な培養培地（一点短鎖線）、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞株（点線）、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞株（実線）、及び１４３Ｂ．ＴＫ−細胞株（破線）の培養培地中のグルコース消費量（Ａ）、乳酸生産率（Ｂ）及びプロトン生産率（Ｃ）の培養経時変化を示すグラフである。表示されている値はそれぞれ４回の個々の測定、８回の独立した測定（ρ０細胞のｐＨ値）の平均値である。標準偏差はエラーバとして示す。１０６細胞に標準化すると、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞のグルコース消費量並びに乳酸及びプロトン生産量は、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型の量を超える。しかし、測定された全ての細胞株における培養培地のｐＨ値はほぼ同様であった。細胞を添加していない純粋な培地のｐＨ値は、培地がＣＯ２で飽和することによりわずかな低下を示す。プロトン生産率の分析では、値が最初低下しその後増大する特有の曲線的経過が観察できた。野生型の細胞における６２時間培養における値は、アポトーシスをもたらす高細胞密度のため測定できなかった。
【図６】野生型細胞及びρ０１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア組織を示す図である。細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで染色した。Ａ１は、野生型細胞における、主として桿状形態の細胞小器官である、大部分が網状組織であるミトコンドリアを示す。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで染色された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞（Ａ２）及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（Ａ３）では、ミトコンドリア網が破壊されて、高頻度で腫脹しているように見える単体ユニットになっていることを示されている。目盛は１０μｍに相当する。
【図７】ＴＥＭによる野生型及びρ０ミトコンドリアの超微細構造観察を示す図である。超薄切片の電子顕微鏡写真を示す。１４３Ｂ．ＴＫ−野生型ミトコンドリアは、多数の規則的に配列されたクリステを有し、相互に連結した網構造を示す（Ａ１）。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞（Ａ２）及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（Ａ３）のミトコンドリアは、歪んだクリステを有する単体小胞性細胞小器官となっており、マトリックス中で同心二重膜円を形成している。挿入図は、四角で囲まれた領域をより高倍率で示す。バー（Ａ１〜Ａ３）は、１μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
したがって、本発明は、ρ０細胞を生成させる方法であって、（ａ）適したプロモータに作動可能となるように連結されている、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクタでｍｔＤＮＡ含有細胞を形質転換させるステップと、（ｂ）形質転換させた細胞を十分な時間培養するステップと、（ｃ）ρ０細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
例えば、リン酸カルシウムによる形質転換等、原核細胞又は真核細胞内に外来ＤＮＡを導入する様々な当業者に周知の方法が利用可能である。形質転換の他の方法には、エレクトロポレーション、ヒートショック、マグネトフェクション、又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）又はＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）等の独占的権利で守られている形質転換試薬の使用に基づく方法が含まれる。組換（発現）ベクタ（及び融合タンパク質をコードする遺伝子）は、当業者によく知られた方法に従って構築でき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎ．Ｙ．を参照することができる。様々な発現ベクタ、好ましくは安定的発現用の発現ベクタを本発明の融合タンパク質をコードする配列を含有及び発現させるために利用してもよい。これには、組換バクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクタ、例えば、酵母発現ベクタ、ウイルス発現ベクタ（例えば、バキュロウイルス）；植物細胞発現ベクタ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、細菌発現ベクタ（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物発現ベクタ、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベースのベクタが含まれる。また、形質転換用のナノ工学物質を使用してもよい。
【００１８】
細胞培養の方法及び適切な培地は当業者に知られており、培養される細胞の種類に依存する。「十分な時間形質転換細胞を培養する」という用語は、ｍｔＤＮＡの完全な破壊、すなわち外来遺伝子の発現、すなわち融合タンパク質の合成、該融合タンパク質のミトコンドリア内への送達、及び融合タンパク質の一部である制限酵素によるｍｔＤＮＡの切断を可能にする培養を意味する。この目的を達成するために十分な時間は、様々な因子、例えば、使用されるベクタ及びプロモータの種類、特定の培養条件及び細胞の種類に依存するが、確立されているアッセイ、例えば、下記の実施例に記載のアッセイを用いて当業者が容易に決定することができる。動物細胞用には、「十分な時間」は、１２時間から２０日間の範囲内であってもよい。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、上記制限エンドヌクレアーゼは、ｍｔＤＮＡを１から１０回、好ましくは３から７回、切断するいわゆる「レアカッター」である。そのような制限酵素は、当業者にはよく知られており、これらの酵素をコードする遺伝子は公開されているため、ミトコンドリア標的配列を追加して含む融合タンパク質を構築するのに使用できる。好ましい制限酵素としては、ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ及びＳｐｅＩが挙げられる。
【００２０】
本発明の方法は、通常、ミトコンドリアを含有するいかなる細胞にも、すなわちいかなる真核細胞にも適用できる。好ましい真核細胞は動物細胞である。哺乳動物細胞、例えば、サル、ラット、モルモット、ブタ又はヒト細胞が特に好ましい。
【００２１】
適したプロモータに作動可能となるように連結された、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする挿入遺伝子を発現させるため、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、ジオキサン応答エレメントを有するマウス乳癌ウイルスプロモータ、β−アクチン遺伝子プロモータ；ＮＲＥ又はＧＲＥエレメントを有するメタロチオニン（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモータ、及びＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等、強力な真核細胞プロモータを用いることが好ましい。ＣＭＶ ＩＥプロモータは、ヒトプロモータ（ＨＣＭＶ ＩＥ）、マウスプロモータ（ＭＣＭＶ ＩＥ）又は代わりに別の起源、例えばサル、ラット、モルモット又はブタ起源のＣＭＶ ＩＥプロモータであってもよい。一般に、構成的発現用のプロモータが好ましい。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施形態では、発現ベクタは動物細胞用のベクタである。適したベクタは当業者によく知られており、そのようなベクタの例は前述の通りである。特に特に好ましい動物ベクタは、ヒトパポーバウイルスベースベクタ（ＢＫＶ）、ＳＶ４０由来ベクタ、ワクシニア由来ベクタ、アデノウイルス由来ベクタ、バキュロウイルスベクタ又はレトロウイルス由来ベクタである。代わりに、ＴＲＥ２ｈｙｇ等の非ウイルス性哺乳類ベクタを利用することができる。
【００２３】
タンパク質は、複数のシグナル及びいくつかの経路によって、亜ミトコンドリアコンパートメント（外膜、膜間スペース、膜及びマトリックス内）へと標的化される。ほとんどのミトコンドリアタンパク質が、取込みペプチドシグナルを含有するサイトゾル前駆体として合成される。サイトゾルシャペロンは、プレタンパク質をミトコンドリア膜中のチャネル結合型受容体に送達する。ミトコンドリアへと標的化されたプレ配列を有するプレタンパク質は、外膜で、受容体及びジェネラルインポート孔（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｐｏｒｔ Ｐｏｒｅ）（ＧＩＰ）（受容体及びＧＩＰは集合的に外膜トランスロカーゼ、すなわちＴＯＭとして知られている）によって結合する。プレタンパク質は、ＴＯＭを通って、ヘアピンループとして移行する。プレタンパク質は、小さいＴＩＭ（これらも分子シャペロンとして働く）によって膜間スペースを通り、内膜のＴＩＭ２３又は２２（内膜トランスロカーゼ）へと輸送される。マトリックス中で、標的化された配列はｍｔＨｓｐ７０により切除される。３つのミトコンドリア外膜受容体である、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ２２及びＴＯＭ７０が知られている。ＴＯＭ７０は、内部標的化ペプチドに結合して、サイトゾルシャペロンの結合部位として働く。ＴＯＭ２０はプレ配列と結合し、ＴＯＭ２２は、プレ配列及び内部標的化ペプチドの両方と結合する。ＴＯＭチャネルは、４１０ｋＤａの分子量及び２１Åの孔径を有する陽イオン特異的な高伝導性チャネルである。プレ配列トランスロカーゼ２３（ＴＩＭ２３）は、ミトコンドリア内膜に局在しており、そのＮ末端で前駆体タンパク質と結合する孔形成タンパク質として働く。ＴＩＭ２３は、ミトコンドリアマトリックス、ミトコンドリア内膜、及び膜間スペースのプレタンパク質の輸送体として働く。ＴＩＭ５０は、ミトコンドリアの内側でＴＩＭ２３に結合しており、プレ配列と結合することが見出されている。ＴＩＭ４４は、マトリックス側に結合しており、ｍｔＨｓｐ７０に結合することが見出されている。プレ配列トランスロカーゼ２２（ＴＩＭ２２）は、ミトコンドリア内膜に向けて移動するプレタンパク質にのみ結合する。ミトコンドリアマトリックスを標的とする配列は、正電荷のアミノ酸及びヒドロキシル化されたアミノ酸に富んでいる。
【００２４】
本発明の方法に適したミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）は当業者によく知られている。ミトコンドリアマトリックスへのＭＴＳが好ましく、そのようなＭＴＳとして好ましくは、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット４（ＣＯＸ ＩＶ）又はサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）からの標的化ペプチドである。原則的には、核にコードされたあらゆるミトコンドリアマトリックス酵素又は内膜酵素に由来するあらゆる標的配列、あるいは、融合タンパク質をミトコンドリアに導入することができる人工配列（５．５以上の疎水性モーメント、少なくとも２つの塩基性残基、両親媒性αヘリックスコンフォメーション；Ｂｅｄｗｅｌｌら（１９８９）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９（３）、１０１４−１０３５を参照）を、本発明の目的で使用することができる。
【００２５】
本発明の方法の更に好ましい実施形態では、前記融合タンパク質は、検出可能なポリペプチド、好ましくは蛍光タンパク質を含み、（ａ）細胞内における融合タンパク質をコードした遺伝子の発現をモニターすることを可能とし、かつ／又は（ｂ）ロー０細胞のための形質転換細胞を選択するためのＦＡＣＳ分析を可能とする。適した蛍光タンパク質は、造礁サンゴ蛍光タンパク質、ＡｍＣｙａｎ蛍光タンパク質、ＡｓＲｅｄ蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質、ＨｃＲｅｄ蛍光タンパク質、ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質、ＺｓＹｅｌｌｏｗ蛍光タンパク質、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ等、当技術分野で知られている。
【００２６】
好ましい蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ及びＥＧＦＰを挙げることができる。広範な用途の可能性及び研究者の要求の進化により、今のところＧＦＰの多くの異なる変異体が利用可能である。最初の主要な改良は、ＧＦＰの分光特性を劇的に改善し、蛍光の増強、光安定性、及びピーク発光を５０９ｎｍに保ったまま主要励起ピークを４８８ｎｍへシフトさせた単一点変異（Ｓ６５Ｔ）であった。このＧＦＰに、３７℃フォールディング効率点変異（Ｆ６４Ｌ）を追加することにより強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を得た。スーパーフォルダＧＦＰ、すなわちあまりフォールディングされていないペプチドに融合された場合でもＧＦＰが迅速にフォールディングし、かつ成熟することを可能にする一連の変異が２００６年に報告された。色変異体を含めた他の多くの変異、特に、青色蛍光タンパク質誘導体（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ）、シアン蛍光タンパク質誘導体（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、及び黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）も作成されている。ＢＦＰ誘導体はＹ６６Ｈ置換を含む。シアン誘導体における重要な変異は、Ｙ６６Ｗ置換であり、これによって、フェノール成分ではなくインドール成分で発色団が形成される。ＹＦＰ誘導体の波長はＴ２０３Ｙ変異によって赤方にシフトする。これらの蛍光タンパク質の全てを本発明の方法に使用することができる。
【００２７】
ρ０細胞を分析する方法及びρ−又はρ＋細胞からρ０細胞を分離する方法も当業者に知られている。本発明の方法の更に好ましい実施形態では、ロー０細胞は、ＦＡＣＳ分析、組織培養クローン化技術（クローニングリング法、細胞希釈法等）、代謝試験（ウリジン／ピルビン酸を補完した培地で増殖し、一方、ウリジン／ピルビン酸が枯渇した増殖培地では死滅する）、遺伝的試験、例えばＰＣＲ又はサザンブロット分析によって選択される。下記の実施例は本発明を更に詳細に説明するものである。
【００２８】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）クローニング
クローニングは、標準的手順に従って行い、全てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物は配列決定によって確認した。ＰＣＲでは、ＥｃｏＲＩ遺伝子をコードするプラスミドｐＡＮ４（Ｐ．Ｍｏｄｒｉｃｈらにより構築され、Ａ．Ｋｉｓｓから提供を受けた、Ｎｅｗｍａｎら（１９８１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２１３１−２１３９）を鋳型として使用し、以下のプライマ：ＥＧＦＰ遺伝子の３’末端に相補的な短い配列を付加する、ＥｃｏＲＩＲ−００１−ＦＯＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、４５７−４６５）５’−ｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇａｔｇｔｃｔａａｔａａａａａａｃ−３’、及び、ＮｏｔＩ制限部位を生成する、ＥｃｏＲＩＲ−８３４−ＲＥＶ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、４５７−４６５）５’−ｇｇｃｃａａａｔｃａｃｔｔａｇａｔｇｔａａｇｃｔｇｔｔｃａａａｃ−３’を用いた。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ（クロンテック ヨーロッパ、サンジェルマン・アン・レ、フランス）から得たＥＧＦＰ遺伝子は、ＮｏｔＩ制限部位を生じさせるプライマｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ−０５９７−ＦＯＲ ５’−ｇｇｃｃａａａｔｇｔｃｃｇｔｃｃｔｇａｃｇ−３’、及び終止コドンのないＥＧＦＰを増幅するｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ−１４２１−ＲＥＶ ５’−ｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇ−３’で増幅した。両方の断片を組換ＰＣＲで使用し、そのリン酸化産物を、ＰｖｕＩＩで線状化されたベクタｐＴＲＥ２ｈｙｇ（クロンテック ヨーロッパ、サンジェルマン・アン・レ、フランス）内にサブクローニングした。ＥＧＦＰ遺伝子及びＥｃｏＲＩ遺伝子からなる融合遺伝子産物をＡｇｅＩ及びＮｏｔＩでｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ内にクローニングし、ベクタｐＭＥＥ−ｃｏｎを得た。
【００２９】
（Ｂ）細胞培養、形質転換及びミトコンドリア染色
ヒト骨肉腫細胞１４３Ｂ．ＴＫ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０３）は、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（インビトロゲン、カルルスルーエ、ドイツ）を含み、１０％ウシ胎児血清、１％ブロモデオキシウリジン、１００ユニットのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）中で、標準条件下で培養した。１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０と命名したρ０細胞株は、低用量のエチジウムブロマイド存在下で１４３Ｂ．ＴＫ−を培養することにより生成した。親１４３Ｂ．ＴＫ−のρ０細胞株、及び形質転換操作後の細胞は、１００μｇ／ｍｌピルビン酸及び５０μｇ／ｍｌウリジンを追加で添加して示す通りに維持した。
【００３０】
１４３Ｂ．ＴＫ−及び１４３Ｂ．ＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ（ｐＭＥＥ−ｃｏｎとの共局在検出のため、ミトコンドリアを標的とするＤｓＲｅｄ１を安定的に発現する１４３Ｂ．ＴＫ−細胞）の一過性形質転換は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の条件に従って行った。７００μｇ／ｍｌのジェネテシンによる選択を、形質転換の２４時間後に５日間行った。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名した単離されたクローンをアリコートに分け、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ、１０％透析ＦＣＳ、１％ブロモデオキシウリジン、１００ユニットのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含み、ピルビン酸及びウリジンを含まないＤＭＥＭ（高グルコース）で３０日間、存在する酸化的リン酸化について代謝試験を行った。
【００３１】
このアプローチの適用可能性を齧歯動物細胞まで拡張するため、２つの他の細胞株：マウス株ＬＭＴＫ−（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．３）及びラット株ＮＲＫ５２Ｅ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７１）を用いた。ミトコンドリアを標識するのに、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸＲｏｓ（インビトロゲン、カルルスルーエ、ドイツ）を製造者のプロトコールに従って１００ｎＭの濃度で用いた。
【００３２】
（Ｃ）ＦＡＣＳ分析
形質転換細胞の試料（０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２×１０６細胞／ｍｌ）を、フローサイトメータ及びそのソフトウェア（ＦＡＣＳＣＡＮ、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データの取得は、ＥＧＦＰに融合し、ミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼを発現する１００．０００個以上の細胞を、フローサイトメータでゲーティングすることによって行った。
【００３３】
（Ｄ）ＰＣＲによるクローンの特徴づけ
得られた１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞クローン内の全ての内因性ｍｔＤＮＡが失われていることを確かめるため、ゲノムＤＮＡを単離して、ＰＣＲの鋳型として用いた。対照には、１４３Ｂ．ＴＫ−野生型、及び前述の通りエチジウムブロマイドと共に培養して生成された対応するρ０細胞株から単離されたゲノムＤＮＡを用いた。ｍｔＤＮＡ領域で結合する以下のプライマ：１５５０１−ＦＯＲ ５’−ａｃｃｃａｇａｃａａｔｔａｔａｃｃｃｔａｇｃ−３’及び６３０ＲＥＶ ５’−ｇａｇｃｃｃｇｔｃｔａａａｃａｔｔｔｔｃａａｔｇ−３’を使用した。対照ＰＣＲは、ヒトヒストンＨ１遺伝子を増幅するプライマ（Ｈｉｓｔｏｎ Ｈ１ ５’ ５’−ａｔｇａｇｃｔｃａｔｇａｃｃｇａｇａａｔｔｃｃａｃｇｔｃｃｇ−３’及びＨｉｓｔｏｎ Ｈ１ ３’ ５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｃａａａｃｔｔｃｔｔｃｔｔｇｃｃ−３’）を用いて行った。アニーリング温度は５５℃で、３５サイクル行い、伸長時間を１分間とした。
【００３４】
１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のゲノム内へのＥｃｏＲＩ遺伝子の潜在的な組込みを調べるため、ＥｃｏＲＩ遺伝子の異なる領域を増幅する以下に列挙するいくつかのプライマセット：ＥｃｏＲＩ−００１−ＦＯＲ（Ｗａｌｌａｃｅ（２００１）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２３５、２４７−２６３）５’−ａａｔｔｃｃｃｇｇａｔｃｃｃａｃｃａｔｇｔｃｔａａｔａａａａａａｃａｇｔｃａａａ−３’、ＥｃｏＲＩ−２２０−ＦＯＲ ５’−ｇａｃｃｃｔｇａｔｃｔｔｇｇｃｇｇｔａｃｔｔｔａｔｔｔｇ−３’、ＥｃｏＲＩ−３９２−ＦＯＲ ５’−ｇａｇｇａｇａｔｃａａｇａｔｔｔａａｔｇｇｃｔｇｃｔｇ−３’、ＥｃｏＲＩ−６５３−ＲＥＶ ５’−ｃａｔａｇａｔｔａｃｔａｔｔｔａｔａｇｇｃａｔｔｃｃａｔａａｔｔａｇｃｔｇｃ−３’、ＥｃｏＲＩ−８１９−ＲＥＶ ５’−ｃｔｇｔｔｃａａａｃａａｇｔｃａｃｇｃｃ−３’、ＥｃｏＲＩ−８３４−ＲＥＶ（Ｋｉｎｇ及びＡｔｔａｒｄｉ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２４６、５００−５０３）５’−ａｔｔｃｃｃｃｃｇｇｇｔｃａｃｔｔａｇａｔｇｔａａｇｃｔｇｔｔｃａ−３’を用いてＰＣＲを行った。最初の５サイクルのアニーリング温度は４５℃とし、その後、３０サイクルは５５℃で伸長時間を２分間とした。
【００３５】
（Ｅ）サザンブロット分析
細胞から抽出した全ＤＮＡ（１５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ又はＰｖｕＩＩで消化した。制限断片を０．６％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜上に転写して、ヌクレオチド４８３１〜４８４６（Ｆｏｒ）及び５６２８〜５６５１（Ｒｅｖ）にアニーリングするｍｔＤＮＡプライマで増幅されたジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識ヒトｍｔＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。膜を洗浄し、断片をＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、マンハイム、ドイツ）を用いて、製造者の指示に従って検出した。断片の化学発光は、バイオイメージングシステム（Ａｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｉｏｚｙｍ、ヘッシシュ オルデンドルフ、ドイツ）で分析した。
【００３６】
（Ｆ）培養培地の代謝物分析
４×１０５細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１００μｇ／ｍｌピルビン酸及び５０μｇ／ｍｌウリジンを添加した２．５ｍｌ培養培地中で、標準条件下で培養した。培養２４、４０、４８及び６２時間後、細胞数を定量化し、ｐＨ値を分析し、グルコース濃度及び乳酸濃度をＨｉｔａｃｈｉ９１７臨床化学分析装置（ロシュ・ダイアゴニスティックス）で測定した。ｐＨ値は、水素イオン濃度（ｍｏｌ／ｌ）＝１０−ＰＨの式によって、培地中水素イオン濃度に変換し、更に、他の全てのデータを１０６細胞に標準化し、グラフで分析した。表示されている値は、それぞれ、４回の個々の測定又は８回の独立した測定（ρ０細胞のｐＨ値）の平均値である。標準偏差はエラーバとして示した。
【００３７】
（Ｇ）共焦点顕微鏡法
ガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アシュランド、米国）上で培養した生細胞を、逆位共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ５（ライカ・マイクロシステムズ）で観察した。染色された複数の化合物の励起によるクロストークを避けるために、共焦点顕微鏡で順次走査モードのみを用いた。画像を光電子増倍管で取得し、顕微鏡写真の処理及び分析を、ライカ・アプリケーション・スーツ・アドバンスト・フルオレッセンス１．５．１ソフトウェア及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳで行った。
【００３８】
（Ｈ）電子顕微鏡観察
カバーガラス上で培養した細胞を２．５％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド（パラホルムアルデヒドから作られたもの）を含むｐＨ７．４の１００ｍＭカコジル酸緩衝液中、４℃で１．５時間固定し、カコジル酸緩衝液で２回洗浄し、その後、２％四酸化オスミウムを含む５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）で固定した。標本を蒸留水で２回洗浄し、水性０．５％酢酸ウラニルを用いて、４℃で一晩染色した。細胞を脱水して、Ｅｐｏｎ８１２中に平板包埋した。超薄切片をＺｅｉｓｓ ＥＭ１０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）で分析した。陰画を走査によってデジタル化し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳで処理した。
【００３９】
実施例２．ミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼを使用したρ０細胞の生成及びρ０状態の確認
本実験の目的は、エチジウムブロマイド、ジテルカリナム（ｄｉｔｅｒｃａｌｉｎｕｍ）又は２’３’−ジデオキシシチジン等の変異誘発物質を使用せずに、全ての内因性ミトコンドリアＤＮＡを欠いた細胞を生成する系を開発することである。当該系の基本となるのは、細胞内への形質転換の後に、機能単位として制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを構成的に発現するベクタｐＭＥＥ−ｃｏｎである。ＥｃｏＲＩは、ヒトｍｔＤＮＡを、細胞の民族的背景に応じて、３〜５回切断することが知られている。実験マウスｍｔＤＮＡは３箇所の、ＮＲＫ５２Ｅ細胞株の元であるラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）は７箇所のＥｃｏＲＩ部位を有する。ヒトチトクロームｃオキシダーゼサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）に由来するミトコンドリア標的化ペプチドにＥｃｏＲＩを融合させた。更に、一つには細胞内の発現を観察し（図１Ｂ）、もう一つにはＦＡＣＳ分析に適した選択マーカを持たせて、それによって、純粋になるまで形質転換細胞を選択できるようにするために、生成した構築物に強化緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを融合させた（図１Ａ）。共焦点蛍光顕微鏡により、このポリペプチドが発現され、おそらく核様体のｍｔＤＮＡと密接に接触して、ミトコンドリアに点状に局在していることが示された（図１Ｂ）。抗生物質ジェネテシンの存在下で５日間、一過性形質転換細胞を選択することにより、又は代わりにＦＡＣＳ選択することにより、１４３Ｂ．ＴＫ−クローンを単離することができた。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７と命名したこの細胞クローンのピルビン酸及びウリジンへの依存について代謝試験を行った。これらの細胞は、ピルビン酸及びウリジンを含まない培地で培養中は弱い増殖しか示さず、最終的には死滅した。このことは、該細胞株がρ０状態であることを強く示唆している。
【００４０】
６２時間の培養時間の間の細胞増殖の分析（図２）により、野生型（破線）とは対照的に、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞（点線）の増殖速度が明白に低下していることが示された。これは、低用量のエチジウムブロマイドで培養することにより生成された１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０と呼ぶρ０細胞株（実線）で観察された結果と一致している。両方のρ０細胞株は類似した遺伝的背景を示すが、図は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞は、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞よりわずかに遅い増殖速度を有することを示している。
【００４１】
ｍｔＤＮＡが失われていることを更に確認するため、Ｄループ内に位置する１６９８ｂｐ領域を増幅するプライマを用いて、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析を行った（図３Ａ）。増幅の陽性対照は、野生型のゲノムＤＮＡで行い、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞を陰性対照とした。試料中の鋳型ＤＮＡが十分な量であることを示すため、核遺伝子ヒストンＨ１の領域を増幅するプライマで追加の実験を行った。野生型細胞株とは対照的に、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞では増幅産物を観察することができなかった。更に、これらの結果は、サザンブロット試験によっても確認され、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞における、ｍｔＤＮＡの完全な欠失を示した（図３Ｂ）。ＬＭＴＫ−及びＮＲＫ５２Ｅ細胞株の複数の独立したクローンでも同様の結果が得られた（データは非図示）。
【００４２】
実施例３．ゲノム内への制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の組込みの分析
安定的なρ０クローン１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７を継代させた後、ＥｃｏＲＩ融合タンパク質発現のＥＧＦＰ蛍光は検出できず、細胞がプラスミドを失ったことが示された。その後、細胞が制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をそのゲノム内に組み込んでいたかどうかをＥｃｏＲＩ遺伝子の様々な領域を増幅するＰＣＲによって試験した。様々なプライマ対を用いた分析を、ゲノムＤＮＡについて行った（図４）。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞及び対照において、増幅産物は観察されず、ＥｃｏＲＩの遺伝子が１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の核ゲノム内に組み込まれていないことを示した。更に、これらの結果は、ミトコンドリアゲノムを完全に破壊するためには、短時間の一時的なミトコンドリアに標的化された制限エンドヌクレアーゼの発現のみで十分であることを示した。１年を超える培養の間、ＰＣＲ並びにピルビン酸及びウリジンの代謝依存性による試験で、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞内のｍｔＤＮＡは回復していなかった。
【００４３】
実施例４．培養培地の比較分析
ρ０細胞のエネルギー生産は、嫌気性解糖に完全に依存している。加えて、今まで知られている全てのρ０細胞株が、ピルビン酸及びウリジンの補給に依存し、かつ過度の乳酸生産による培養培地の酸性化を示す。両方の特性が、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞並びにマウス及びラットのρ０クローンで観察することができた。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞を２４、４０、４８及び６２時間培養後、細胞数の測定に加えて、培養培地中のグルコース濃度、乳酸濃度及びｐＨ値を分析した。グルコース及び乳酸濃度、並びに水素イオン濃度は、１０６細胞に標準化してグラフ表示した。基準値は、１４３Ｂ．ＴＫ−細胞及び１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞の測定によって得た。１０６細胞に標準化した場合、ρ０細胞のグルコース消費量（図５Ａ）（７．５〜８．５ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）は、野生型細胞の量（５ｇ／ｌ、破線）を超えていた。更に、グルコース消費量は、培養時間中に明らかに低下した（ρ０細胞で約８８％、野生型細胞で７５％）。
【００４４】
１０６の細胞に標準化された乳酸生産のグラフ（図５Ｂ）は、野生型よりρ０細胞（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）の乳酸生産率が高いことを示す。これらの値は最初、培養２４時間から４０時間までの間は増大するが、曲線の経過はその後、飽和に似た状態となり、その後ほぼ一定のレベルに留まる（１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７：１７ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０：１５ｇ／ｌ、１４３Ｂ．ＴＫ−：１１ｇ／ｌ）。
【００４５】
細胞が添加されていない純粋な培地のｐＨ値は、ＣＯ２で培地が飽和することにより、ｐＨ８．０からｐＨ７．７への若干低下するだけである（図５Ｃ、一点短鎖線）。一方、測定した細胞株の培地のｐＨ値は、４８時間の培養後、野生型細胞（破線）で７．８から、ρ０細胞（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）で７．５から、全ての細胞株でｐＨ７．３まで変化する（図５Ｃ）。１４３Ｂ．ＴＫ−細胞の６２時間後の値は、高細胞密度によって生じた細胞死のため決定することができなかったが、ｍｔＤＮＡが欠失している細胞では、ｐＨ値は更に６．７〜６．８まで低下した。
【００４６】
様々な培養時間における、細胞数で標準化した水素イオン濃度（図５Ｄ）は、ρ０細胞の培地中への水素イオン放出率（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０、実線、及び１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、点線）が、野生型細胞（２．５〜３．５×１０−８ｍｏｌ／ｌ、破線）の要求をはるかに超えることを示す。その上、ρ０細胞において、値が最初に７×１０−８から６×１０−８ｍｏｌ／ｌに低下し、その後１．０〜１．５×１０−７ｍｏｌ／ｌまで増大する特別な曲線経過が観察された。
【００４７】
実施例５．共焦点顕微鏡を用いた形態比較試験
表示された細胞株におけるミトコンドリアの形態は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓを用いて細胞小器官を染色し、共焦点顕微鏡で検査して試験した（図６）。１４３Ｂ．ＴＫ−野生型細胞（図６Ａ１）のミトコンドリアは、細胞内で均等に分布した網状ネットワークとして存在する。多くみられるミトコンドリアの構造は、細長く、桿状形態であった。これらの細胞のρ０形態（図６Ａ２、Ａ３）では、ネットワーク構造が破壊されているようであり、小さな個別のミトコンドリアユニットの分布を生じている。この断片化は、より高倍率の画像で強調表示されている。更に、これらの単体細胞小器官の一部は、腫脹しているように見えた。この結果は、野生型では観察できなかった。
【００４８】
野生型細胞における相互に連結したミトコンドリアネットワークと、対照的なρ０細胞における点状ミトコンドリアは、ミトコンドリアＤＮＡが失われていることによる、ミトコンドリア形態の典型的な変化である（Ｇｉｌｋｅｒｓｏｎら（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４７４、１−４；Ｒｉｚｚｕｔｏら（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８０、１７６３−１７６６）。
【００４９】
実施例６．透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた形態比較試験
ρ０ミトコンドリアの、更に多くの形態変化が超微細構造検査により検出された（図７）。図７Ａ１は、野生型における高度に相互連結されたミトコンドリアネットワーク構造の詳細を示す。正常な１４３Ｂ．ＴＫ−細胞におけるミトコンドリア網を通る横断切片は、高電子密度のマトリックス、規則的に配列された完全なクリステ構造を有する明確な外膜及び内膜を示した。対照的に、ρ０細胞（図７Ａ２、Ａ３）のＴＥＭ画像は、ミトコンドリア形態の明らかな変化を示す。ネットワークは、腫脹した外観を有することの多い単体ミトコンドリア単位に分解されている。マトリックスは、おそらく水の流入の増加によるマトリックスの希釈により電子が疎らに見え、これは腫脹した外観についての説明にもなる。ρ０細胞内のミトコンドリアは依然として、正常細胞内で見られる明確な外膜及び内膜を示すが、クリステは全体的な構造変化を示した。ほとんどのクリステが曲がっているか、密接に接触した２枚の膜からなる同心円状の輪、すなわち「ぼやけたタマネギ」（Ｈａｌｅｓ及びＦｕｌｌｅｒ（１９９７）、Ｃｅｌｌ．、９０、１２１−１２９；Ｈａｌｅｓｔｒａｐ（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、９７３、３５５−３８２）と呼ばれる外観に見える。加えて、これらの膜の輪は、ミトコンドリア境界膜との接触部位をわずかに示すのみであった。これらの二重膜が、２枚の内膜からなるものであるか、１枚の外膜及び１枚の内膜からなるものであるかは識別できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ρ０細胞を生成させるインビトロの方法であって、
（ａ）適したプロモータに作動可能となるように連結されている、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクタでｍｔＤＮＡ含有細胞を形質転換するステップ、
（ｂ）該形質転換細胞を十分な時間培養するステップ、及び
（ｃ）ρ０細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記制限エンドヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを１から１０回切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、又はＳｐｅIである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が動物細胞である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモータが、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、又はＳＶ４０ウイルス初期プロモータである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現ベクタが動物細胞用のベクタである、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクタが、ヒトパポーバウイルスベースのベクタ（ＢＫＶ）、ＳＶ４０由来ベクタ、ワクシニア由来ベクタ、アデノウイルス由来ベクタ、バキュロウイルスベクタ、又はレトロウイルス由来ベクタである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＴＳがミトコンドリアマトリックスを標的とする、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＴＳが、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）由来の標的化ペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、検出可能なポリペプチドを更に含む、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能なポリペプチドが蛍光タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰ又はＥＧＦＰである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ρ０細胞が、ＦＡＣＳ分析、代謝試験、及び／又は遺伝子試験によって選択される、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子試験がＰＣＲ又はサザンブロット分析である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
ρ０細胞を生成させるインビトロの方法であって、
（ａ）適したプロモータに作動可能となるように連結されている、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）及び制限エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクタでｍｔＤＮＡ含有細胞を形質転換するステップ、
（ｂ）該形質転換細胞を十分な時間培養するステップ、及び
（ｃ）ρ０細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記制限エンドヌクレアーゼがｍｔＤＮＡを１から１０回切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、又はＳｐｅIである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が動物細胞である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモータが、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、又はＳＶ４０ウイルス初期プロモータである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現ベクタが動物細胞用のベクタである、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクタが、ヒトパポーバウイルスベースのベクタ（ＢＫＶ）、ＳＶ４０由来ベクタ、ワクシニア由来ベクタ、アデノウイルス由来ベクタ、バキュロウイルスベクタ、又はレトロウイルス由来ベクタである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＴＳがミトコンドリアマトリックスを標的とする、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＴＳが、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット８（ＣＯＸ ＶＩＩＩ）由来の標的化ペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、検出可能なポリペプチドを更に含む、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能なポリペプチドが蛍光タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰ又はＥＧＦＰである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ρ０細胞が、ＦＡＣＳ分析、代謝試験、及び／又は遺伝子試験によって選択される、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子試験がＰＣＲ又はサザンブロット分析である、請求項１４に記載の方法。
【図２】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０５８１３（Ｐ２０１１−５０５８１３Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７３２３（Ｐ２０１０−５３７３２３）
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０５８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７４３３７
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７３８１０１９）ウニベルジテート・ライプツィヒ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０５８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７４３３７
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７３８１０１９）ウニベルジテート・ライプツィヒ (4)
【Ｆターム（参考）】
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