アシラートの用途
【課題】ビタミンＡアシラートの製造。
【解決手段】有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩ：
で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、懸濁液中に存在する酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のリパーゼによって選択的にモノアシル化することを含む方法により得られる式Ｉ：
〔式中、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの、ビタミンＡアシラートを製造するための使用。
【解決手段】有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩ：
で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、懸濁液中に存在する酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のリパーゼによって選択的にモノアシル化することを含む方法により得られる式Ｉ：
〔式中、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの、ビタミンＡアシラートを製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉ：
【０００２】
【化１】
【０００３】
〔式中、Ｒは、（より詳しく以下に定義されるとおりの）（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基または（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−カルボン酸３，７−ジメチル−６−ヒドロキシ−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエニルエステル〕の新規な製造方法であって、式ＩＩ：
【０００４】
【化２】
【０００５】
の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−３，７−ジメチル−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエン−１，６−ジオール〕を、酵素で触媒される選択的なモノアシル化に付すことによって製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートは、対応するビタミンＡアシラートの製造、すなわち、それ自体公知である方式で実施され得る、水の開裂と、同時になされるシス−トランス異性化とによる製造の出発材料である。常用の標準的エステル化法、例えば（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアセチル化によると、所望の、かつ特に重要な（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートが得られるだけでなく、副生物である式ＩＩＩ：
【０００７】
【化３】
【０００８】
の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタート〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−酢酸６−アセトキシ−３，７−ジメチル−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエニルエステル〕も様々な量で生じる。
【０００９】
式ＩＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタートは、接触脱水反応の条件下では不活性であり、そのため、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート（Ｒがメチルを表す式Ｉの化合物）の形成だけでなく、ビタミンＡアセタートの形成も困難になる。したがって、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの選択的モノアセチル化だけでなく、一般的には選択的モノアシル化の方法も、工業的観点からは多大な関心が持たれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来より公知の方法の短所（例えば、望ましくない式ＩＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタートの形成）をもたらさない、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのエステル化による、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの製造法を提供することである。このためには、酵素で触媒される反応が、極めて選択的にかつ高収率で進行することと、酵素が、小量であっても触媒活性を示し、容易に分離でき、そして再び何回か使用できることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の範囲内で、この目的は、リパーゼ（酵素分類群ＥＣ３．１．１．３）の存在下、極めて特異的な反応前および反応時の条件下で、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアシル化を実施することによって達成される。
【００１２】
したがって、本発明は、上記式Ｉで示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート〔ここで、式ＩのＲは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕の製造法であって、有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、上記したように懸濁液中に存在するリパーゼによって選択的にモノアシル化する段階を含む方法に関する。
【００１３】
リパーゼの存在下での第一級ヒドロキシル基の選択的アシル化は、第二級のそれに加えて文献から公知である。すなわち、例えばJ. Org. Chem. 55: 2,366-2,369 (1990)によれば、Pseudomonas cyclopium から単離されたリパーゼを用いて、トリフルオロエチルアシラートまたは環状無水物でエステル化することによる、アンフェニコール類、すなわちフェニル置換短鎖脂肪族ジオールのアシル化が実施され、それぞれ８３％および６４％の収率が得られているが、純度は示されていない。
【００１４】
固定化されたリパーゼＰＳの存在下、酢酸ビニルでエステル化することによる２−メチル−５−（４−メトキシフェニル）ペンタン−１，３−ジオールのラセミ体分割は、Tetrahedron: Asymmetry 4, 757-760 (1993)に記載され、モノアシル化生成物の収率が６６％であって、光学純度は４２％e.e.であった。
【００１５】
Appl. Biochem. Biotechnol. 11, 401-407 (1985) では、ブタ膵臓からのリパーゼによって、一連の１，２−および１，３−ジオール類（エチルアシラート類に溶解）が９７％以下の収率でアシル化されている。
【００１６】
J. Chem.Soc., Chem. Commun., 1989:1535-1536 によれば、ブタ膵臓からのリパーゼによって、２−エチルヘキサン−１，３−ジオールが６０％の収率でアシル化されている。
【００１７】
Tetrahedron Lett. 31, 3405-3408 (1990)は、ブタ膵臓からのリパーゼの存在下での、無水物による脂肪族１，ｎ−ジオール類の選択的アシル化を記載しており、選択率が９８％以下、収率は９５％以下であった。
【００１８】
Chromobacterium viscosumからのリパーゼを用いる、１，５−ヘキサンジオールのｎ−デカン酸による選択的アシル化（９８％の選択率）は、Ind. J. Chem.32, 30-34 (1993)に記載されている。
【００１９】
従来より公知のこれらの方法はすべて、一定の短所を有する。すなわち、これらの方法はすべて、望みの生成物を生じるが、選択率、ならびにその純度および／または収率には、解決すべきことが多々残っている。その上、これらの参考文献は、用いたリパーゼの反復的使用、すなわち、基質の同時精製はもちろんのこと、リパーゼの安定性に言及するものが皆無である。
【００２０】
式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアシル化は、前述のとおり、有機溶媒（好ましくはほぼ無水である）中、アシル化剤の存在下で、懸濁液中に存在するリパーゼによって実施する。
【００２１】
本発明の目的に適したリパーゼは、優れた活性および選択率を示す酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のものであって、特に、Alcaligenes 属からのリパーゼＰＬ、その固定化形態であるリパーゼＰＬＣおよびリパーゼＰＬＧ、ならびにCandida cylindracea （改名されたCandida rugosa）からのリパーゼＭＹ−３０（名糖産業、東京）、Mucor miehei（改名されたRhizomucor miehei)からのLipozyme（登録商標名）ＩＭ−２０（Novo Nordisk、デンマーク国Bagsvaerd)、Humicola lanuginosa からのリパーゼＣＥ−５、そしてPenicillium cyclopium からのリパーゼＧ（両者とも天野製薬株式会社、名古屋）、更にはCandida antarcticaからのChirazyme （登録商標名）Ｌ−２（Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ国；以前はNovo NordiskからのNovozym （登録商標名）ＳＰ４３５）である。リパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧ、 Lipozyme ＩＭ−２０およびChirazyme Ｌ−２が特に好ましく、リパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧおよびChirazyme Ｌ−２がとりわけ好ましい。
【００２２】
（Ｒ）の定義において、用語「（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基」または「１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基」は、炭素原子数に応じて直鎖だけでなく分枝鎖のアルキルまたはアルケニル基であると理解されるものとする。（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ペンチル、ヘプチル、ウンデシル、ペンタデシルおよびヘプタデシルであり、（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基の例は、８−ヘプタデセニルおよびヘプタデカ−８，１１−ジエニルである。対応するアルカノイルおよびアルケノイル基（ＲＣＯ）は、それぞれ、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ラウリル、カプロイル、カプリル、パルミトイルおよびステアロイル、ならびにオレオイルおよびリノリルである。Ｒについての特に好適な意味はメチルであり、本発明による方法は、この場合、酵素で触媒される選択的モノアセチル化である。
【００２３】
回分法では、商業的に入手できる形態のリパーゼは、粉末、顆粒または小ビーズ粒として存在し、２０重量％〔（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを基準とする重量比で〕まで用いられるが、好ましくは、リパーゼの量は約０．１〜約１０重量％、とりわけ約１〜５重量％である。
【００２４】
本発明の目的に適した有機溶媒としては、５〜８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、例えばｎ−ヘキサンおよびヘプタン；６〜１０個の炭素原子を有する脂環族炭化水素、例えばシクロヘキサン、メチルシクロヘキサンおよびデカリン；塩素化脂肪族炭化水素、例えば塩化メチレン、クロロホルムおよび四塩化炭素；ニトロ置換脂肪族炭化水素、例えばニトロメタン；芳香族炭化水素、例えばトルエンおよびキシレン；脂肪族エーテル、例えば１，２−ジメトキシエタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびtert−ブチルメチルエーテル；環状エーテル、例えばテトラヒドロフラン、メチルフランおよび１，４−ジオキサン；脂肪族エステル、例えばオルトギ酸トリメチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルおよび酢酸イソプロペニル；脂肪族ケトン、例えばアセトン；脂肪族ニトリル、例えばアセトニトリル；脂肪族アミン、例えばトリエチルアミン；脂肪族アセタール、例えばホルムアルデヒドジメチルアセタール；ならびにそのような溶媒の混合物を挙げることができる。好ましいのは、ヘキサン、シクロヘキサン、塩化メチレン、四塩化炭素、トルエン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、テトラヒドロフラン、メチルフランおよびホルムアルデヒドジメチルアセタール、特に、塩化メチレン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、テトラヒドロフラン、ホルムアルデヒドジメチルアセタール、およびこれらの溶媒の混合物である。
【００２５】
慣用の様々なアルキルアシラートやアルケニルアシラート、例えば酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ビニル、酢酸アリル、酢酸イソプロペニル、プロピオン酸エチル、酪酸エチルおよびプロピオン酸ビニルならびに長鎖脂肪酸のエステル、例えばラウリン酸ビニルも、アシル化剤として使用できる。好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチルまたは酢酸ビニル、とりわけ酢酸ビニルをアセチル化に用いる。プロピオン酸ビニルは、プロピオン酸エステル（Ｒ＝エチル）の製造に好適であり、長鎖アシラートの製造には対応する脂肪酸のビニルエステルも好適である。用いるアシル化剤の量は、１モル当量ないしそれより数倍多い量とすることができるが、アシル化剤を同時に溶媒として役立てるときは特に過剰に用い、これは、アルキルおよびアルケニルアシラートの場合について該当し得る。
【００２６】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの濃度は、好都合には１０〜５０％、好ましくは２０〜４５％〔重量／体積（w/v)で示す〕である。遊離体の溶解度は、溶媒もしくは溶媒混合物および／または温度の選択によって制御される。したがって、反応温度は、好都合には、１０℃ないし反応混合物の還流温度、好ましくは室温〜約９０℃、特に好ましくは室温〜約６０℃である。回分法では、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは、反応の開始時には溶液である必要はなく、反応の開始時にはむしろ懸濁液で存在してよい。
【００２７】
リパーゼに対する接触手段、およびその再利用性を改善するために、それを様々な担体材料に固定化することができる。この固定化は、大きな表面積を有する適切な担体材料上への単なる吸着によって、共有結合的または非共有結合的に、好ましくは非共有結合的に実施することができる。リパーゼや担体材料は有機溶媒に不溶性であるから、反応の際には測定可能ないかなる脱離も生じない。適切な担体材料は、常用の安価な濾過助剤、吸着剤、イオン交換剤およびクロマトグラフィー材の多く、例えばFlorisil（登録商標名）、ケイ藻土、ベントナイト、セルロース、分子ふるい、Amberlite （登録商標名）、Amberlyst （登録商標名）、シリカゲルまたは酸化アルミニウムなど、ならびに大きな表面積を有するその他の安価な材料、例えば砂、焼結ガラスまたは中空繊維などである。ケイ藻土および海砂の使用が好適である。これに代えて、商業的に入手できる、既に固定化されたリパーゼ製剤、例えば、名糖産業やBoehringer Mannheim GmbHからの下記のリパーゼ製剤も使用できる：
【００２８】
・リパーゼＰＬＣ：ケイ藻土に固定化したリパーゼＰＬ；
・リパーゼＰＬＧ：顆粒化ケイ藻土に固定化したリパーゼＰＬ；
・Chirazyme Ｌ−２（以前のNovozyme ＳＰ４３５）：マクロ多孔質ポリアクリル上に固定化した、Candida antarcticaからのリパーゼ。
【００２９】
所望であれば、リパーゼの固定化は、「コラン酸の塩」の存在下で実施することもでき（同時固定化）、それによって活性が部分的に制御できる（活性剤）。適切なコラン酸の塩は、例えばコラン酸ナトリウムやデオキシコラン酸ナトリウムである。
【００３０】
化学的な副反応の危険を実際上初めから排除するために、リパーゼとの反応は、好都合には、不活性ガス雰囲気、例えば窒素もしくはアルゴン下で、かつ光を排除し、および／またはラジカル捕捉剤、例えばヒドロキノンもしくは２，６−ジ（tert−ブチル）−ｐ−クレゾールの存在下で実施する。
【００３１】
回分法では、触媒は、１回分の実施後に濾取し、再利用することができる。反応液の、したがってリパーゼの含水量は、リパーゼの安定性および活性に関して格別の役割を果たす。小量の水（反応液の０．２％未満）の添加は、リパーゼ活性に対してプラスの影響を有し、弱塩基性溶液、例えば重炭酸アンモニウムもしくは水酸化アンモニウム溶液、または有機塩基、例えばトリエチルアミンもしくはエチルジイソプロピルアミンは、一層優れた効果を有する。水の添加は、定期的にか、または平衡化工程の意味でも実施できる。少量（０．２％未満）の水または弱塩基性溶液を、反応液に加えるのが好ましい。
【００３２】
本方法の経済性に極めて重要である、リパーゼの効率的な再利用にとって、遊離体の純度も重大であり、とりわけ有毒な重金属を初期段階から既に含有する遊離体の適切な精製によって、リパーゼ製剤の長期安定性を著しく改善することができる。様々な助剤、例えばケイ藻土、シリカゲル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、および酸化アルミニウム上での濾過、および約８のｐＨ値を有するＥＤＴＡ水溶液での洗浄が、簡単で効果的な精製手順であって、それを用いて、とりわけ、遊離体の重金属含量を低下させることができ、リパーゼ製剤の効果を改善できることが判明している。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、上記の濾過助剤上での濾過により、あるいはｐＨ約８のＥＤＴＡ水溶液で洗浄することにより、有害な不純物が除かれる。
【００３３】
本発明による方法は、反復回分法として、または連続法として、すなわち、例えば固定床反応器、円筒反応器、繊維反応器、回転反応器、流動床反応器（上げ底を有する）、またはスラリー反応器のような慣用の形式の反応器を用いて実施することができる。
【００３４】
本発明に従って得られる、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート、好ましくはアセタートの、それぞれ対応するビタミンＡアシラートまたはビタミンＡアセタートを製造するための前述の用途は、本発明のもう一つの態様を表す。
【実施例】
【００３５】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの、酵素で触媒される選択的モノアシル化による、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルの様々なアシラート製造のための下記の実施例は、本発明による方法の有利な実施態様を例示しているが、いかなる意味においてもそれを限定するものではない。温度はすべて、摂氏度で示されている。
【００３６】
実施例１
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１０．０ｇ（３２．８ミリモル）および２，６−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）１０ｍｇを、トルエン３０ｍｌと酢酸ビニル５ｍｌ（５４．１ミリモル）との混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）５００ｍｇの添加によって反応を開始し、懸濁液を室温で１７時間、ローラー上で静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発させた。高真空下で１日乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート１１．４ｇ（３３ミリモル）を、１００．６％の収率および９９％を超える純度〔超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）での面積％による〕で得た。
【００３７】
実施例２
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１０．０ｇ（３２．８ミリモル）を、トルエン６．８mlと酢酸ビニル３．２ml（３４．６ミリモル）との混合物に取り込んだ。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）５００mgの添加によって反応を開始し、反応混合物を室温で１６時間静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発によって濃縮した。高真空下で、１日攪拌しつつ乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート１１．２３ｇ（３２．４ミリモル）を、９８．８％の収率および９７．２％の純度（ＳＦＣ面積％）で得た。
【００３８】
実施例３
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール２０．０ｇ（６５．７ミリモル）およびＢＨＴ２０ｍｇを、トルエン５６ｍｌ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）５６mlおよび酢酸ビニル７．５ml（８１．２ミリモル）の混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）１．０ｇの添加によって反応を開始し、懸濁液を４０℃で１６時間静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発させた。高真空下で１日乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート２３．１ｇ（６６．７ミリモル）を、１０１．５％の収率および９９％を超える純度（ＳＦＣ面積％）で得た。
【００３９】
実施例４
（Ａ）様々な担体材料上での固定化：リパーゼＰＬ溶液２．０ml（二回蒸留した水に２５mg/ml)を担体材料２．５mlに加え、得られた懸濁液を室温で注意深く攪拌した。均等に湿った担体を、次第に、かつ注意深く真空度を増大させる（泡状物の形成）ことによって乾燥した。最後に、担体を高真空中で２日間乾燥し、下記のとおりに用いた。
【００４０】
（Ｂ）多孔質ガラスビーズへの固定化：リパーゼＰＬ溶液２．０ml（二回蒸留した水に２０mg/ml)をSiran Carrier Sikug 041/02/120/A〔Schott Glaswerke（ドイツ国マインツ）の多孔質焼結ガラス〕２．０ｇに加え、懸濁液を（Ａ）に記載したとおりに乾燥した。
【００４１】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇを含有する、ヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）および酢酸ビニルの２：２：１混合物のアリコート８．０ｍｌを、上記のとおりにして得られた各乾燥リパーゼ製剤に加え、反応液を室温で、ローラー上で静かに攪拌した。ＨＰＬＣ分析のため、６時間および２７時間後に試料２５μｌを取り出した。結果を下記の表１に示すが、ここで、Ａは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、Ｂは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
実施例５
ヘキサン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物中の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇの溶液８．０mlを、リパーゼＰＬＣ３０mgまたはリパーゼＰＬＧ３０mgで処理し、懸濁液を、アルゴン下、暗所で室温にてローラー上で静かに攪拌した。２４時間後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの残留含量は、１％未満であった（ＨＰＬＣ）。リパーゼＰＬＣ５１mgまたはリパーゼＰＬＧ５１mgを用いたとき、２４時間後には（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは、もはや検出されなかった。
【００４４】
実施例６
リパーゼＰＬ２５mg、およびコラン酸の塩（コラン酸ナトリウム、デオキシコラン酸ナトリウム）０．５mgを、二回蒸留した水２．０mlに溶解し、二回蒸留した水６mlに懸濁させたDICALITE（登録商標名）Speedex または海砂２．５ｇに加えた。懸濁液を、実施例４で行ったとおりに注意深く乾燥し、必要であれば、乾燥した材料を微粉末化した。
【００４５】
生成したリパーゼ製剤を、実施例５に記載のとおり、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール溶液８mlで試験した。それぞれの場合に、２４時間後にＨＰＬＣ分析を実施した。結果を下記の表２に示したが、ここで、Ａは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを意味する。
【００４６】
【表２】
【００４７】
実施例７
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール５０．０ｇ（１６４．２ミリモル）を、ヘキサン１４０ｍｌ、ＴＢＭＥ１４０ｍｌ、酢酸ビニル７０ｍｌおよびＢＨＴ５０ｍｇの混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ２．５ｇを加え、懸濁液を、アルゴン下、暗所で室温にて２４時間、ローラー上で静かに攪拌した。次いで、リパーゼ触媒を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、再利用のために乾燥した。次いで、濾液を洗液とともに蒸発によって濃縮し、その後、初めはヘキサンの３００ｍｌ部とともに２回、次いでペンタン３００ｍｌとともに１回、この順序で蒸発によって濃縮して、形成された痕跡量の酢酸を共沸的に除去した。高真空中、３５℃で約１６時間乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート５６．７３ｇ（１６３．７ミリモル、９９％）を淡黄色の油状物として得た。
【００４８】
分析：純度、＞９９％（ＳＦＣ面積％）；２５０ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ３４６）、ＩＲ（液膜）および下記の微量分析によって確認：計算値：Ｃ＝７６．２６％；Ｈ＝９．８９％；
実測値：Ｃ＝７６．０７％；Ｈ＝９．７３％。
【００４９】
実施例８
ヘキサン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物中の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇおよびＢＨＴ１ｍｇの溶液の８．０ｍｌのアリコートをそれぞれ、以前に既に同じ条件下で４回（単一回分として）用い、個々の回分の間にヘキサンとＴＢＭＥとの１：１混合物で洗浄しただけのリパーゼＰＬＣ５０ｍｇに加えた。次いで、種々の水溶液を個々の試料に加え、反応懸濁液をローラー上で１７時間静かに攪拌し、次いでＨＰＬＣによって分析した。結果を下記の表３に示したが、ここで、Ｂは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例９
Ａ． （１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１ｋｇを酢酸エチル８リットルに溶解し、８．０のｐＨ値を有する５０ミリモルのＥＤＴＡ溶液３リットル部で２回、室温で洗浄した。その後、有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発によって濃縮し、残渣を高真空中で乾燥した。
【００５２】
Ｂ． （１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの５０ｍｌのアリコートを酢酸エチル４００ｍｌに溶解し、それぞれの場合に、塩基性酸化アルミニウム、DICALITE Speedexまたはシリカゲル５ｇ上で濾過した。濾液を蒸発によって濃縮し、高真空中で乾燥した。
【００５３】
Ｃ． ＡまたはＢに従って精製した（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの試料３．５ｇを、トルエン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物２５ｍｌに溶解した。各溶液から８．０ｍｌの試料３個を取り出し（三重実験）、それぞれ、リパーゼＰＬＣ２．５ｍｇで処理した。反応懸濁液を室温で２４時間、ローラー上で静かに攪拌し、次いでＳＦＣによって分析した。結果を下記の表４に示したが、ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールおよび（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例１０
ガラスフリットを有する２リットル容クロマトグラフィーカラムに、リパーゼＰＬＣ５．０ｇを充填した。次いで、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１００．０ｇ、ヘキサン２８０ｍｌ、ＴＢＭＥ２８０ｍｌ、場合により０．１モル重炭酸アンモニウム溶液５００μｌまたは１％水酸化アンモニウム溶液５００μｌ を含有する酢酸ビニル１４０ｍｌ、およびＢＨＴ１００ｍｇをこの順に加え、カラムを、フリットが溶液に接触しないように出口を上に傾けつつ、回転によって静かに攪拌した（電動式攪拌器）。室温で１７時間インキュベートした後、反応液を流出させ、ＳＦＣによって分析した。残留リパーゼ製剤を、初めヘキサンとＴＢＭＥの１：１混合物各回１００ｍｌで３回（洗浄１回につき約１５分間）、その後ヘキサン５０ｍｌで洗浄し、次いでこれを、新たな循環（Ｃｙｃｌｅ）に再利用した。結果を下記の表５に示したが、ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールおよび（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５６】
【表５】
【００５７】
実施例１１
実施例９Ａに記載のとおりにして（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを精製し、その後、実施例１０に記載のとおりに反復回分法に用いたが、リパーゼＰＬＣは３．０ｇ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは９０．０ｇ、トルエン２５０ｍｌ、ＴＢＭＥ２５０ｍｌ、および１％水酸化アンモニウム溶液４５０μｌ を含む酢酸ビニル１２５ｍｌを用いた。反応時間は２３時間であった。各循環の間に、リパーゼ製剤を、１％（ｖ／ｖ）の１％水酸化アンモニウム溶液を含有する、トルエンとＴＢＭＥとの１：１混合物１００ｍｌで２回洗浄し、４循環終わるごとに、トルエン中に室温で３日間放置した。結果を図１のグラフに示した。
【００５８】
実施例１２
手順は、実施例１１に記載のとおりであったが、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、DICALITE Speedexを用いて、実施例９Ｂに記載のとおりに精製した。結果を図２のグラフに示した。
【００５９】
実施例１３
反応に対する温度の影響を、連続法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１８．０ｇ（５９．１ミリモル、１４．４％ｗ／ｖ）を、３００ｐｐｍ の水を含有するトルエン１００ｍｌと酢酸ビニル２５ｍｌとの混合物に溶解した。均質な混合物をメンブランフィルター〔ＲＣ６０、１μｍ、Schleicher & Schuell AG （Ｓ＆Ｓ）、ドイツ国Dassel〕上で濾過し、その後、DICALITE Speedex７ｇおよびリパーゼＰＬＣ（名糖産業）６００ｍｇを逐次充填した直径１０ｍｍのカラムを通して、０．５ｍｌ／分の処理速度で圧送した。温度は２０〜５０℃間で変化させた。反応試料を取り出し、ＳＦＣおよびＨＰＬＣによって分析した。結果を図３のグラフに示した。
【００６０】
実施例１４
反応に対する温度の影響を、回分法を用いても調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸ビニルを含有する充分量のトルエンに、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表６、および図４のグラフに示した。
【００６１】
【表６】
【００６２】
実施例１５
反応に対する溶媒の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸ビニルを含有する充分量の溶媒に、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表７に示した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
実施例１６
反応に対する各アセチル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸エステルを含有する充分量の溶媒に、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表８、および図５のグラフに示した。
【００６５】
【表８】
【００６６】
実施例１７
反応に対する各アシル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール０．５ｇ（１．６４ミリモル）をビニルエステル５ｍｌに溶解するか、または懸濁させた。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）１２．５ｍｇの添加によって、反応を開始させ、混合物を室温で１７時間攪拌し（ローラー攪拌機）、次いで反応物をＨＰＬＣに付した。結果を下記の表９に示した。
【００６７】
【表９】
【００６８】
実施例１８
反応に対する各アシル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール０．５ｇ（１．６４ミリモル）をビニルエステル５ｍｌに溶解するか、または懸濁させた。Chirazyme Ｌ２（Boehringer Mannheim GmbH、以前はNovo NordiskからのNovozym ４３５）１２．５ｍｇの添加によって、反応を開始し、混合物を室温で１７時間攪拌し（ローラー攪拌機）、次いで反応物をＨＰＬＣに付した。結果を下記の表１０に示した。
【００６９】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例９Ａの方法で精製した化合物Ａ（（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール）を、反復回分法に付した場合の結果を示す図である。
【図２】実施例９Ｂの方法で精製した化合物Ａを反復回分法に付した場合の結果を示す図である。
【図３】反応に対する温度の影響を連続法において検討した結果を示す図である。
【図４】反応に対する温度の影響を回分法において検討した結果を示す図である。
【図５】反応に対する各アセチル化剤の影響を検討した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉ：
【０００２】
【化１】
【０００３】
〔式中、Ｒは、（より詳しく以下に定義されるとおりの）（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基または（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−カルボン酸３，７−ジメチル−６−ヒドロキシ−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエニルエステル〕の新規な製造方法であって、式ＩＩ：
【０００４】
【化２】
【０００５】
の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−３，７−ジメチル−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエン−１，６−ジオール〕を、酵素で触媒される選択的なモノアシル化に付すことによって製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートは、対応するビタミンＡアシラートの製造、すなわち、それ自体公知である方式で実施され得る、水の開裂と、同時になされるシス−トランス異性化とによる製造の出発材料である。常用の標準的エステル化法、例えば（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアセチル化によると、所望の、かつ特に重要な（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートが得られるだけでなく、副生物である式ＩＩＩ：
【０００７】
【化３】
【０００８】
の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタート〔（２Ｚ，４Ｚ，７Ｅ）−酢酸６−アセトキシ−３，７−ジメチル−９−〔２’，２’，６’−トリメチルシクロヘキサ−６’−エン−１’−イル〕ノナ−２，４，７−トリエニルエステル〕も様々な量で生じる。
【０００９】
式ＩＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタートは、接触脱水反応の条件下では不活性であり、そのため、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート（Ｒがメチルを表す式Ｉの化合物）の形成だけでなく、ビタミンＡアセタートの形成も困難になる。したがって、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの選択的モノアセチル化だけでなく、一般的には選択的モノアシル化の方法も、工業的観点からは多大な関心が持たれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来より公知の方法の短所（例えば、望ましくない式ＩＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−アセトキシレチニルアセタートの形成）をもたらさない、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのエステル化による、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの製造法を提供することである。このためには、酵素で触媒される反応が、極めて選択的にかつ高収率で進行することと、酵素が、小量であっても触媒活性を示し、容易に分離でき、そして再び何回か使用できることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の範囲内で、この目的は、リパーゼ（酵素分類群ＥＣ３．１．１．３）の存在下、極めて特異的な反応前および反応時の条件下で、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアシル化を実施することによって達成される。
【００１２】
したがって、本発明は、上記式Ｉで示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート〔ここで、式ＩのＲは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕の製造法であって、有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、上記したように懸濁液中に存在するリパーゼによって選択的にモノアシル化する段階を含む方法に関する。
【００１３】
リパーゼの存在下での第一級ヒドロキシル基の選択的アシル化は、第二級のそれに加えて文献から公知である。すなわち、例えばJ. Org. Chem. 55: 2,366-2,369 (1990)によれば、Pseudomonas cyclopium から単離されたリパーゼを用いて、トリフルオロエチルアシラートまたは環状無水物でエステル化することによる、アンフェニコール類、すなわちフェニル置換短鎖脂肪族ジオールのアシル化が実施され、それぞれ８３％および６４％の収率が得られているが、純度は示されていない。
【００１４】
固定化されたリパーゼＰＳの存在下、酢酸ビニルでエステル化することによる２−メチル−５−（４−メトキシフェニル）ペンタン−１，３−ジオールのラセミ体分割は、Tetrahedron: Asymmetry 4, 757-760 (1993)に記載され、モノアシル化生成物の収率が６６％であって、光学純度は４２％e.e.であった。
【００１５】
Appl. Biochem. Biotechnol. 11, 401-407 (1985) では、ブタ膵臓からのリパーゼによって、一連の１，２−および１，３−ジオール類（エチルアシラート類に溶解）が９７％以下の収率でアシル化されている。
【００１６】
J. Chem.Soc., Chem. Commun., 1989:1535-1536 によれば、ブタ膵臓からのリパーゼによって、２−エチルヘキサン−１，３−ジオールが６０％の収率でアシル化されている。
【００１７】
Tetrahedron Lett. 31, 3405-3408 (1990)は、ブタ膵臓からのリパーゼの存在下での、無水物による脂肪族１，ｎ−ジオール類の選択的アシル化を記載しており、選択率が９８％以下、収率は９５％以下であった。
【００１８】
Chromobacterium viscosumからのリパーゼを用いる、１，５−ヘキサンジオールのｎ−デカン酸による選択的アシル化（９８％の選択率）は、Ind. J. Chem.32, 30-34 (1993)に記載されている。
【００１９】
従来より公知のこれらの方法はすべて、一定の短所を有する。すなわち、これらの方法はすべて、望みの生成物を生じるが、選択率、ならびにその純度および／または収率には、解決すべきことが多々残っている。その上、これらの参考文献は、用いたリパーゼの反復的使用、すなわち、基質の同時精製はもちろんのこと、リパーゼの安定性に言及するものが皆無である。
【００２０】
式ＩＩの（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールのアシル化は、前述のとおり、有機溶媒（好ましくはほぼ無水である）中、アシル化剤の存在下で、懸濁液中に存在するリパーゼによって実施する。
【００２１】
本発明の目的に適したリパーゼは、優れた活性および選択率を示す酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のものであって、特に、Alcaligenes 属からのリパーゼＰＬ、その固定化形態であるリパーゼＰＬＣおよびリパーゼＰＬＧ、ならびにCandida cylindracea （改名されたCandida rugosa）からのリパーゼＭＹ−３０（名糖産業、東京）、Mucor miehei（改名されたRhizomucor miehei)からのLipozyme（登録商標名）ＩＭ−２０（Novo Nordisk、デンマーク国Bagsvaerd)、Humicola lanuginosa からのリパーゼＣＥ−５、そしてPenicillium cyclopium からのリパーゼＧ（両者とも天野製薬株式会社、名古屋）、更にはCandida antarcticaからのChirazyme （登録商標名）Ｌ−２（Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ国；以前はNovo NordiskからのNovozym （登録商標名）ＳＰ４３５）である。リパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧ、 Lipozyme ＩＭ−２０およびChirazyme Ｌ−２が特に好ましく、リパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧおよびChirazyme Ｌ−２がとりわけ好ましい。
【００２２】
（Ｒ）の定義において、用語「（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基」または「１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基」は、炭素原子数に応じて直鎖だけでなく分枝鎖のアルキルまたはアルケニル基であると理解されるものとする。（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ペンチル、ヘプチル、ウンデシル、ペンタデシルおよびヘプタデシルであり、（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基の例は、８−ヘプタデセニルおよびヘプタデカ−８，１１−ジエニルである。対応するアルカノイルおよびアルケノイル基（ＲＣＯ）は、それぞれ、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ラウリル、カプロイル、カプリル、パルミトイルおよびステアロイル、ならびにオレオイルおよびリノリルである。Ｒについての特に好適な意味はメチルであり、本発明による方法は、この場合、酵素で触媒される選択的モノアセチル化である。
【００２３】
回分法では、商業的に入手できる形態のリパーゼは、粉末、顆粒または小ビーズ粒として存在し、２０重量％〔（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを基準とする重量比で〕まで用いられるが、好ましくは、リパーゼの量は約０．１〜約１０重量％、とりわけ約１〜５重量％である。
【００２４】
本発明の目的に適した有機溶媒としては、５〜８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、例えばｎ−ヘキサンおよびヘプタン；６〜１０個の炭素原子を有する脂環族炭化水素、例えばシクロヘキサン、メチルシクロヘキサンおよびデカリン；塩素化脂肪族炭化水素、例えば塩化メチレン、クロロホルムおよび四塩化炭素；ニトロ置換脂肪族炭化水素、例えばニトロメタン；芳香族炭化水素、例えばトルエンおよびキシレン；脂肪族エーテル、例えば１，２−ジメトキシエタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびtert−ブチルメチルエーテル；環状エーテル、例えばテトラヒドロフラン、メチルフランおよび１，４−ジオキサン；脂肪族エステル、例えばオルトギ酸トリメチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルおよび酢酸イソプロペニル；脂肪族ケトン、例えばアセトン；脂肪族ニトリル、例えばアセトニトリル；脂肪族アミン、例えばトリエチルアミン；脂肪族アセタール、例えばホルムアルデヒドジメチルアセタール；ならびにそのような溶媒の混合物を挙げることができる。好ましいのは、ヘキサン、シクロヘキサン、塩化メチレン、四塩化炭素、トルエン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、テトラヒドロフラン、メチルフランおよびホルムアルデヒドジメチルアセタール、特に、塩化メチレン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、テトラヒドロフラン、ホルムアルデヒドジメチルアセタール、およびこれらの溶媒の混合物である。
【００２５】
慣用の様々なアルキルアシラートやアルケニルアシラート、例えば酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ビニル、酢酸アリル、酢酸イソプロペニル、プロピオン酸エチル、酪酸エチルおよびプロピオン酸ビニルならびに長鎖脂肪酸のエステル、例えばラウリン酸ビニルも、アシル化剤として使用できる。好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチルまたは酢酸ビニル、とりわけ酢酸ビニルをアセチル化に用いる。プロピオン酸ビニルは、プロピオン酸エステル（Ｒ＝エチル）の製造に好適であり、長鎖アシラートの製造には対応する脂肪酸のビニルエステルも好適である。用いるアシル化剤の量は、１モル当量ないしそれより数倍多い量とすることができるが、アシル化剤を同時に溶媒として役立てるときは特に過剰に用い、これは、アルキルおよびアルケニルアシラートの場合について該当し得る。
【００２６】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの濃度は、好都合には１０〜５０％、好ましくは２０〜４５％〔重量／体積（w/v)で示す〕である。遊離体の溶解度は、溶媒もしくは溶媒混合物および／または温度の選択によって制御される。したがって、反応温度は、好都合には、１０℃ないし反応混合物の還流温度、好ましくは室温〜約９０℃、特に好ましくは室温〜約６０℃である。回分法では、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは、反応の開始時には溶液である必要はなく、反応の開始時にはむしろ懸濁液で存在してよい。
【００２７】
リパーゼに対する接触手段、およびその再利用性を改善するために、それを様々な担体材料に固定化することができる。この固定化は、大きな表面積を有する適切な担体材料上への単なる吸着によって、共有結合的または非共有結合的に、好ましくは非共有結合的に実施することができる。リパーゼや担体材料は有機溶媒に不溶性であるから、反応の際には測定可能ないかなる脱離も生じない。適切な担体材料は、常用の安価な濾過助剤、吸着剤、イオン交換剤およびクロマトグラフィー材の多く、例えばFlorisil（登録商標名）、ケイ藻土、ベントナイト、セルロース、分子ふるい、Amberlite （登録商標名）、Amberlyst （登録商標名）、シリカゲルまたは酸化アルミニウムなど、ならびに大きな表面積を有するその他の安価な材料、例えば砂、焼結ガラスまたは中空繊維などである。ケイ藻土および海砂の使用が好適である。これに代えて、商業的に入手できる、既に固定化されたリパーゼ製剤、例えば、名糖産業やBoehringer Mannheim GmbHからの下記のリパーゼ製剤も使用できる：
【００２８】
・リパーゼＰＬＣ：ケイ藻土に固定化したリパーゼＰＬ；
・リパーゼＰＬＧ：顆粒化ケイ藻土に固定化したリパーゼＰＬ；
・Chirazyme Ｌ−２（以前のNovozyme ＳＰ４３５）：マクロ多孔質ポリアクリル上に固定化した、Candida antarcticaからのリパーゼ。
【００２９】
所望であれば、リパーゼの固定化は、「コラン酸の塩」の存在下で実施することもでき（同時固定化）、それによって活性が部分的に制御できる（活性剤）。適切なコラン酸の塩は、例えばコラン酸ナトリウムやデオキシコラン酸ナトリウムである。
【００３０】
化学的な副反応の危険を実際上初めから排除するために、リパーゼとの反応は、好都合には、不活性ガス雰囲気、例えば窒素もしくはアルゴン下で、かつ光を排除し、および／またはラジカル捕捉剤、例えばヒドロキノンもしくは２，６−ジ（tert−ブチル）−ｐ−クレゾールの存在下で実施する。
【００３１】
回分法では、触媒は、１回分の実施後に濾取し、再利用することができる。反応液の、したがってリパーゼの含水量は、リパーゼの安定性および活性に関して格別の役割を果たす。小量の水（反応液の０．２％未満）の添加は、リパーゼ活性に対してプラスの影響を有し、弱塩基性溶液、例えば重炭酸アンモニウムもしくは水酸化アンモニウム溶液、または有機塩基、例えばトリエチルアミンもしくはエチルジイソプロピルアミンは、一層優れた効果を有する。水の添加は、定期的にか、または平衡化工程の意味でも実施できる。少量（０．２％未満）の水または弱塩基性溶液を、反応液に加えるのが好ましい。
【００３２】
本方法の経済性に極めて重要である、リパーゼの効率的な再利用にとって、遊離体の純度も重大であり、とりわけ有毒な重金属を初期段階から既に含有する遊離体の適切な精製によって、リパーゼ製剤の長期安定性を著しく改善することができる。様々な助剤、例えばケイ藻土、シリカゲル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、および酸化アルミニウム上での濾過、および約８のｐＨ値を有するＥＤＴＡ水溶液での洗浄が、簡単で効果的な精製手順であって、それを用いて、とりわけ、遊離体の重金属含量を低下させることができ、リパーゼ製剤の効果を改善できることが判明している。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、上記の濾過助剤上での濾過により、あるいはｐＨ約８のＥＤＴＡ水溶液で洗浄することにより、有害な不純物が除かれる。
【００３３】
本発明による方法は、反復回分法として、または連続法として、すなわち、例えば固定床反応器、円筒反応器、繊維反応器、回転反応器、流動床反応器（上げ底を有する）、またはスラリー反応器のような慣用の形式の反応器を用いて実施することができる。
【００３４】
本発明に従って得られる、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラート、好ましくはアセタートの、それぞれ対応するビタミンＡアシラートまたはビタミンＡアセタートを製造するための前述の用途は、本発明のもう一つの態様を表す。
【実施例】
【００３５】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの、酵素で触媒される選択的モノアシル化による、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルの様々なアシラート製造のための下記の実施例は、本発明による方法の有利な実施態様を例示しているが、いかなる意味においてもそれを限定するものではない。温度はすべて、摂氏度で示されている。
【００３６】
実施例１
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１０．０ｇ（３２．８ミリモル）および２，６−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）１０ｍｇを、トルエン３０ｍｌと酢酸ビニル５ｍｌ（５４．１ミリモル）との混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）５００ｍｇの添加によって反応を開始し、懸濁液を室温で１７時間、ローラー上で静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発させた。高真空下で１日乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート１１．４ｇ（３３ミリモル）を、１００．６％の収率および９９％を超える純度〔超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）での面積％による〕で得た。
【００３７】
実施例２
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１０．０ｇ（３２．８ミリモル）を、トルエン６．８mlと酢酸ビニル３．２ml（３４．６ミリモル）との混合物に取り込んだ。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）５００mgの添加によって反応を開始し、反応混合物を室温で１６時間静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発によって濃縮した。高真空下で、１日攪拌しつつ乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート１１．２３ｇ（３２．４ミリモル）を、９８．８％の収率および９７．２％の純度（ＳＦＣ面積％）で得た。
【００３８】
実施例３
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール２０．０ｇ（６５．７ミリモル）およびＢＨＴ２０ｍｇを、トルエン５６ｍｌ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）５６mlおよび酢酸ビニル７．５ml（８１．２ミリモル）の混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）１．０ｇの添加によって反応を開始し、懸濁液を４０℃で１６時間静かに攪拌した。その後、リパーゼを濾取し、トルエンで洗浄し、濾液を蒸発させた。高真空下で１日乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート２３．１ｇ（６６．７ミリモル）を、１０１．５％の収率および９９％を超える純度（ＳＦＣ面積％）で得た。
【００３９】
実施例４
（Ａ）様々な担体材料上での固定化：リパーゼＰＬ溶液２．０ml（二回蒸留した水に２５mg/ml)を担体材料２．５mlに加え、得られた懸濁液を室温で注意深く攪拌した。均等に湿った担体を、次第に、かつ注意深く真空度を増大させる（泡状物の形成）ことによって乾燥した。最後に、担体を高真空中で２日間乾燥し、下記のとおりに用いた。
【００４０】
（Ｂ）多孔質ガラスビーズへの固定化：リパーゼＰＬ溶液２．０ml（二回蒸留した水に２０mg/ml)をSiran Carrier Sikug 041/02/120/A〔Schott Glaswerke（ドイツ国マインツ）の多孔質焼結ガラス〕２．０ｇに加え、懸濁液を（Ａ）に記載したとおりに乾燥した。
【００４１】
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇを含有する、ヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）および酢酸ビニルの２：２：１混合物のアリコート８．０ｍｌを、上記のとおりにして得られた各乾燥リパーゼ製剤に加え、反応液を室温で、ローラー上で静かに攪拌した。ＨＰＬＣ分析のため、６時間および２７時間後に試料２５μｌを取り出した。結果を下記の表１に示すが、ここで、Ａは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、Ｂは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
実施例５
ヘキサン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物中の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇの溶液８．０mlを、リパーゼＰＬＣ３０mgまたはリパーゼＰＬＧ３０mgで処理し、懸濁液を、アルゴン下、暗所で室温にてローラー上で静かに攪拌した。２４時間後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの残留含量は、１％未満であった（ＨＰＬＣ）。リパーゼＰＬＣ５１mgまたはリパーゼＰＬＧ５１mgを用いたとき、２４時間後には（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは、もはや検出されなかった。
【００４４】
実施例６
リパーゼＰＬ２５mg、およびコラン酸の塩（コラン酸ナトリウム、デオキシコラン酸ナトリウム）０．５mgを、二回蒸留した水２．０mlに溶解し、二回蒸留した水６mlに懸濁させたDICALITE（登録商標名）Speedex または海砂２．５ｇに加えた。懸濁液を、実施例４で行ったとおりに注意深く乾燥し、必要であれば、乾燥した材料を微粉末化した。
【００４５】
生成したリパーゼ製剤を、実施例５に記載のとおり、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール溶液８mlで試験した。それぞれの場合に、２４時間後にＨＰＬＣ分析を実施した。結果を下記の表２に示したが、ここで、Ａは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを意味する。
【００４６】
【表２】
【００４７】
実施例７
（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール５０．０ｇ（１６４．２ミリモル）を、ヘキサン１４０ｍｌ、ＴＢＭＥ１４０ｍｌ、酢酸ビニル７０ｍｌおよびＢＨＴ５０ｍｇの混合物に溶解した。リパーゼＰＬＣ２．５ｇを加え、懸濁液を、アルゴン下、暗所で室温にて２４時間、ローラー上で静かに攪拌した。次いで、リパーゼ触媒を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、再利用のために乾燥した。次いで、濾液を洗液とともに蒸発によって濃縮し、その後、初めはヘキサンの３００ｍｌ部とともに２回、次いでペンタン３００ｍｌとともに１回、この順序で蒸発によって濃縮して、形成された痕跡量の酢酸を共沸的に除去した。高真空中、３５℃で約１６時間乾燥した後、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタート５６．７３ｇ（１６３．７ミリモル、９９％）を淡黄色の油状物として得た。
【００４８】
分析：純度、＞９９％（ＳＦＣ面積％）；２５０ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ３４６）、ＩＲ（液膜）および下記の微量分析によって確認：計算値：Ｃ＝７６．２６％；Ｈ＝９．８９％；
実測値：Ｃ＝７６．０７％；Ｈ＝９．７３％。
【００４９】
実施例８
ヘキサン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物中の（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１．０ｇおよびＢＨＴ１ｍｇの溶液の８．０ｍｌのアリコートをそれぞれ、以前に既に同じ条件下で４回（単一回分として）用い、個々の回分の間にヘキサンとＴＢＭＥとの１：１混合物で洗浄しただけのリパーゼＰＬＣ５０ｍｇに加えた。次いで、種々の水溶液を個々の試料に加え、反応懸濁液をローラー上で１７時間静かに攪拌し、次いでＨＰＬＣによって分析した。結果を下記の表３に示したが、ここで、Ｂは（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例９
Ａ． （１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１ｋｇを酢酸エチル８リットルに溶解し、８．０のｐＨ値を有する５０ミリモルのＥＤＴＡ溶液３リットル部で２回、室温で洗浄した。その後、有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発によって濃縮し、残渣を高真空中で乾燥した。
【００５２】
Ｂ． （１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの５０ｍｌのアリコートを酢酸エチル４００ｍｌに溶解し、それぞれの場合に、塩基性酸化アルミニウム、DICALITE Speedexまたはシリカゲル５ｇ上で濾過した。濾液を蒸発によって濃縮し、高真空中で乾燥した。
【００５３】
Ｃ． ＡまたはＢに従って精製した（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールの試料３．５ｇを、トルエン、ＴＢＭＥおよび酢酸ビニルの２：２：１混合物２５ｍｌに溶解した。各溶液から８．０ｍｌの試料３個を取り出し（三重実験）、それぞれ、リパーゼＰＬＣ２．５ｍｇで処理した。反応懸濁液を室温で２４時間、ローラー上で静かに攪拌し、次いでＳＦＣによって分析した。結果を下記の表４に示したが、ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールおよび（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例１０
ガラスフリットを有する２リットル容クロマトグラフィーカラムに、リパーゼＰＬＣ５．０ｇを充填した。次いで、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１００．０ｇ、ヘキサン２８０ｍｌ、ＴＢＭＥ２８０ｍｌ、場合により０．１モル重炭酸アンモニウム溶液５００μｌまたは１％水酸化アンモニウム溶液５００μｌ を含有する酢酸ビニル１４０ｍｌ、およびＢＨＴ１００ｍｇをこの順に加え、カラムを、フリットが溶液に接触しないように出口を上に傾けつつ、回転によって静かに攪拌した（電動式攪拌器）。室温で１７時間インキュベートした後、反応液を流出させ、ＳＦＣによって分析した。残留リパーゼ製剤を、初めヘキサンとＴＢＭＥの１：１混合物各回１００ｍｌで３回（洗浄１回につき約１５分間）、その後ヘキサン５０ｍｌで洗浄し、次いでこれを、新たな循環（Ｃｙｃｌｅ）に再利用した。結果を下記の表５に示したが、ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールおよび（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアセタートを意味する。
【００５６】
【表５】
【００５７】
実施例１１
実施例９Ａに記載のとおりにして（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを精製し、その後、実施例１０に記載のとおりに反復回分法に用いたが、リパーゼＰＬＣは３．０ｇ、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールは９０．０ｇ、トルエン２５０ｍｌ、ＴＢＭＥ２５０ｍｌ、および１％水酸化アンモニウム溶液４５０μｌ を含む酢酸ビニル１２５ｍｌを用いた。反応時間は２３時間であった。各循環の間に、リパーゼ製剤を、１％（ｖ／ｖ）の１％水酸化アンモニウム溶液を含有する、トルエンとＴＢＭＥとの１：１混合物１００ｍｌで２回洗浄し、４循環終わるごとに、トルエン中に室温で３日間放置した。結果を図１のグラフに示した。
【００５８】
実施例１２
手順は、実施例１１に記載のとおりであったが、（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、DICALITE Speedexを用いて、実施例９Ｂに記載のとおりに精製した。結果を図２のグラフに示した。
【００５９】
実施例１３
反応に対する温度の影響を、連続法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール１８．０ｇ（５９．１ミリモル、１４．４％ｗ／ｖ）を、３００ｐｐｍ の水を含有するトルエン１００ｍｌと酢酸ビニル２５ｍｌとの混合物に溶解した。均質な混合物をメンブランフィルター〔ＲＣ６０、１μｍ、Schleicher & Schuell AG （Ｓ＆Ｓ）、ドイツ国Dassel〕上で濾過し、その後、DICALITE Speedex７ｇおよびリパーゼＰＬＣ（名糖産業）６００ｍｇを逐次充填した直径１０ｍｍのカラムを通して、０．５ｍｌ／分の処理速度で圧送した。温度は２０〜５０℃間で変化させた。反応試料を取り出し、ＳＦＣおよびＨＰＬＣによって分析した。結果を図３のグラフに示した。
【００６０】
実施例１４
反応に対する温度の影響を、回分法を用いても調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸ビニルを含有する充分量のトルエンに、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表６、および図４のグラフに示した。
【００６１】
【表６】
【００６２】
実施例１５
反応に対する溶媒の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸ビニルを含有する充分量の溶媒に、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表７に示した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
実施例１６
反応に対する各アセチル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール４８．０ｇ（１５７．６ミリモル）を、２０％（ｗ／ｖ）の酢酸エステルを含有する充分量の溶媒に、得られる混合物が容量２４０ｍｌとなるように溶解した。次いで、均質な混合物をメンブランフィルター（ＲＣ６０、１μｍ、Ｓ＆Ｓ）上で濾過し、攪拌しつつ（１００〜１１０ｒｐｍ）５０℃に保った。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）３．０ｇの添加によって反応を開始し、次いでＨＰＬＣに付した。結果を下記の表８、および図５のグラフに示した。
【００６５】
【表８】
【００６６】
実施例１７
反応に対する各アシル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール０．５ｇ（１．６４ミリモル）をビニルエステル５ｍｌに溶解するか、または懸濁させた。リパーゼＰＬＣ（名糖産業）１２．５ｍｇの添加によって、反応を開始させ、混合物を室温で１７時間攪拌し（ローラー攪拌機）、次いで反応物をＨＰＬＣに付した。結果を下記の表９に示した。
【００６７】
【表９】
【００６８】
実施例１８
反応に対する各アシル化剤の影響を、回分法を用いて調べた。（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール０．５ｇ（１．６４ミリモル）をビニルエステル５ｍｌに溶解するか、または懸濁させた。Chirazyme Ｌ２（Boehringer Mannheim GmbH、以前はNovo NordiskからのNovozym ４３５）１２．５ｍｇの添加によって、反応を開始し、混合物を室温で１７時間攪拌し（ローラー攪拌機）、次いで反応物をＨＰＬＣに付した。結果を下記の表１０に示した。
【００６９】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例９Ａの方法で精製した化合物Ａ（（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノール）を、反復回分法に付した場合の結果を示す図である。
【図２】実施例９Ｂの方法で精製した化合物Ａを反復回分法に付した場合の結果を示す図である。
【図３】反応に対する温度の影響を連続法において検討した結果を示す図である。
【図４】反応に対する温度の影響を回分法において検討した結果を示す図である。
【図５】反応に対する各アセチル化剤の影響を検討した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩ：
【化１】
で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、懸濁液中に存在する酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のリパーゼによって選択的にモノアシル化することを含む方法により得られる式Ｉ：
【化２】
〔式中、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの、ビタミンＡアシラートを製造するための使用。
【請求項２】
リパーゼが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属の種からのリパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ （Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）からのリパーゼＭＹ−３０、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）からのＬｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標名）ＩＭ−２０、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａからのリパーゼＣＥ−５、またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ からのリパーゼＧである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
リパーゼが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａからのＣｈｉｒａｚｙｍｅ（登録商標名）Ｌ−２である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
Ｒがメチルを表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１】
有機溶媒中、アシル化剤の存在下で、式ＩＩ：
【化１】
で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチノールを、懸濁液中に存在する酵素分類群ＥＣ３．１．１．３のリパーゼによって選択的にモノアシル化することを含む方法により得られる式Ｉ：
【化２】
〔式中、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ２３）アルキル基、または１〜３個の二重結合を有する（Ｃ２〜Ｃ２３）アルケニル基を表す〕で示される（１１Ｚ，１３Ｚ）−７，１０−ジヒドロ−１０−ヒドロキシレチニルアシラートの、ビタミンＡアシラートを製造するための使用。
【請求項２】
リパーゼが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属の種からのリパーゼＰＬ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ （Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）からのリパーゼＭＹ−３０、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）からのＬｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標名）ＩＭ−２０、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａからのリパーゼＣＥ−５、またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ からのリパーゼＧである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
リパーゼが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａからのＣｈｉｒａｚｙｍｅ（登録商標名）Ｌ−２である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
Ｒがメチルを表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−１４３５６１（Ｐ２００７−１４３５６１Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４７２７（Ｐ２００７−５４７２７）
【出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【分割の表示】特願平９−９２０７０の分割
【原出願日】平成９年４月１０日（１９９７．４．１０）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【分割の表示】特願平９−９２０７０の分割
【原出願日】平成９年４月１０日（１９９７．４．１０）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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