アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの使用
アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（Extended Freeze Drying）（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis：ウシ型結核菌）ＢＣＧの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は、数十年かけて進行する複雑な慢性の炎症プロセスである。アテローム性動脈硬化は、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の蓄積、細胞死の増大、及び動脈壁の肥大性の変性を特徴とし、チャネルの狭窄を引き起こすことにより血流が損なわれる。アテローム性動脈硬化は、身体のいずれの領域においても発症する可能性があるが、心臓、脳又は脳に通じる血管において発症する場合、最も重要である。狭窄は、動脈の内壁における粥腫（盛り上がった斑部）の形成に起因する。これらの粥腫は、低密度リポタンパク質、崩壊する筋肉細胞、線維組織、血小板の凝集物、コレステロール、マクロファージ、Ｔリンパ球、及び時としてカルシウムからなる。粥腫は、乱流の血流の領域において形成される傾向があり、血流中に高濃度のコレステロールを有する者において見出されることが最も多い。粥腫の数及び厚みは年齢とともに増大し、血管内面の円滑さの喪失を引き起こし、血栓（血餅）の形成を促進する。時には、血栓の断片が裂けて塞栓を形成し、これが血流中を移動し、より小さな血管を封鎖する。
【０００３】
アテローム性動脈硬化及びその臨床病態は、男性及び女性の両方において罹患及び死亡の主因である。冠動脈（冠動脈心疾患）を含むアテローム硬化性心疾患は、全ての死の３分の１を占める最も一般的な死因である。脳への血液供給に対するアテローム硬化性の障害（脳卒中）は、がんに続く３番目に一般的な死因である。血管不全は、他の主幹動脈（例えば腎臓、下肢及び腸への）における血液の流れを低減させることにより多数の重度の疾病を引き起こすアテローム性動脈硬化の別の臨床病態である。
【０００４】
残念なことに、アテローム性動脈硬化は、動脈に対する損傷が血流を制限するほどに重篤となるまで症状を生じない。アテローム性動脈硬化に起因する心筋への血流の制限により、狭心症又は心筋梗塞（心発作）が引き起こされる可能性がある。下肢の筋肉への血流の制限により、間欠性跛行（歩行により引き起こされ、休息により軽減される下肢の疼痛）が引き起こされる。脳に血液を供給する動脈の狭窄により、一過性の虚血性発作（２４時間未満持続する脳卒中の症状及び徴候）及び眩暈のエピソード、又は最終的には脳卒中それ自体が引き起こされる可能性がある。
【０００５】
アテローム性動脈硬化に関する現在の薬剤的処置としては、幾つかの薬剤、例えばスタチン系薬剤（ロスバスタチン）及びフィブラート系薬剤の使用が挙げられる。二次的な凝固及び塞栓形成を最小限に抑えようとする際に使用される抗凝血薬以外では、血管拡張薬は症状軽減をもたらすが、治癒的な価値はない。薬剤的処置に応答しないものに対して、又は或る特定の高リスク状況においては外科的処置が利用可能である。バルーン血管形成術は、狭くなった血管を拡張し、血液供給の改善を促進することができる。心臓への血液供給を冠動脈バイパス外科処置により回復させることもできる。大型アテローム性閉塞及び石灰化動脈閉塞を、動脈内膜切除術により除去することができ、疾患状態にある末梢血管部分全体を、織ったプラスチック管の移植片に置き換えることができる。
【０００６】
アテローム性動脈硬化の発病は、炎症、自己免疫及び組織特異的変性の複雑な相互作用を伴う。
【０００７】
アテローム性動脈硬化に関する多数のリスク因子としては、高血圧、喫煙、真性糖尿病、脂質異常症（高コレステロール血症）、メタボリック・シンドローム、肥満、虚血、男性であること、年齢、心疾患の家族歴、及びセデンタリー・ライフスタイルが挙げられる。
【０００８】
因子が何であっても、結果として起こる動脈内膜の慢性炎症が、アテローム性動脈硬化の発症の主要な原動力である。アテローム性動脈硬化に関与する主要な細胞プロセスは、ケモカインを放出する内皮細胞の活性化を含む。酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、炎症細胞の動員及び浸潤を助ける糖タンパク質接着分子（血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、細胞内細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）及びＥ−セレクチン）を発現する内皮細胞の活性化を誘導する。内皮との結合後、白血球が内膜中に浸潤する。そこで、単球がマクロファージに分化し、マクロファージが酸化ＬＤＬからコレステロールを捕捉することにより泡沫細胞となる。結果として起こる動脈壁上への脂肪線条の蓄積の後に、進行性アテローム硬化性病変の形成が起こる。血管平滑筋細胞は増殖し、病変に向かって移動する。それらの動員の際、血管平滑筋細胞は、脂質アテローム上に線維性粥腫を形成する細胞外マトリクスを分泌する。最終的に、不安定な粥腫が、進行する慢性炎症の結果として崩壊することがある。結果として生じる血栓は、急性の冠動脈事象、例えば心筋梗塞及び脳卒中に関与する。
【０００９】
ＮＦ−κＢはアテローム硬化性病変における炎症応答の活性化と関連する関連マーカーであり（非特許文献１）、ＰＰＡＲ−γシグナル伝達は炎症性サイトカインの産生を阻害する（非特許文献２）。Ｉ−κＢのリン酸化により、この疾患プロセスにおいて一定の役割を果たすＮＦ−κＢが活性化される。しかしながら、ＮＦ−κＢの活性化がアテローム性動脈硬化に必要であるという直接的な証拠は存在しない（非特許文献３）。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路はレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）をリン酸化するが、非リン酸化型のＲＸＲαは、ＰＰＡＲγとともにヘテロ二量体を形成し、炎症を相乗的に低減させる（非特許文献４）。
【００１０】
炎症を標的にすることは、アテローム性動脈硬化に対する治療を開発するためのアプローチである。抗炎症薬の中には、アテローム形成の主要段階における心保護効果を発揮することが示されたものがある。チアゾリンジオンは、２型糖尿病の治療のために臨床的に使用されているペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γアゴニストである。ＰＰＡＲγは、アテローム性動脈硬化に寄与する多数の細胞プロセスを調節する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの動物モデル及び臨床研究により、チアゾリンジオンが、内皮の機能不全を是正し、慢性の炎症プロセスを抑制し、脂肪線条形成を低減させ、粥腫発生及び血管壁肥厚化を遅延させ、粥腫安定化を増強することが示されている。したがってチアゾリンジオンは、２型糖尿病を有する患者においてアテローム性動脈硬化に関連するグルコースレベル及び長期的な心血管リスクの両方を改善させることができる抗炎症性抗トロンビン（antithrombic）剤としての可能性を示す（非特許文献５）。しかしながら、ＰＰＡＲ−γアゴニスト（心血管疾患のリスクが高い糖尿病患者においてインスリン増感剤として使用される）とＰＰＡＲ−αアゴニスト（脂質異常症を治療するために使用される）との組合せにより、ＡｐｏＥ−／−においてアテローム性動脈硬化が増強され（非特許文献６）、ヒトにおいて主要な心血管の有害事象が誘導された（非特許文献７）。
【００１１】
最近になって、免疫系がアテローム形成プロセスを変調させる主要な因子であることを示唆する証拠が増大している（概説に関しては、非特許文献８を参照されたい）。アテローム硬化性病変におけるほとんどの炎症細胞がマクロファージであるが、該細胞の多くて２０％がＴリンパ球である（非特許文献９）。この疾患プロセスは、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方により標的化される修飾型自己抗原（酸化ＬＤＬ、ＨＳＰ、アポトーシス性断片）の局所的な形成と関連する。これらの自己免疫応答は、酸化ＬＤＬ及び死滅する細胞由来の潜在的に有害な残りの産物の除去を容易にする有益な効果を有する可能性がある。しかしながら、保護的な自己免疫と疾患促進性の自己免疫との間の均衡が失われると、自己免疫系は破壊的な炎症促進性プロセスに向かって加速することになり、粥腫の成長及び不安定化が引き起こされる。これらの観察結果は、粥腫抗原に対する免疫応答の変調に基づく、アテローム性動脈硬化に対する新たな治療の開発の可能性を指摘している。
【００１２】
動物研究により、酸化ＬＤＬに存在する抗原に基づくワクチンにより粥腫抗原に対する免疫応答を変調させることによってアテローム性動脈硬化の発症を阻止することが可能であるという原理の証明の裏付けが提示された。しかしながら、酸化ＬＤＬは、標準化するのが困難な抗原組成物を有する複雑な粒子であるため、また、酸化ＬＤＬは潜在的に、有害な抗原を含有する可能性もあるため、酸化ＬＤＬそれ自体は理想的なワクチン成分ではない。したがって、ここ数年にわたり、相当な努力が、アテローム保護性免疫を誘導する酸化ＬＤＬ中の正確な抗原を特徴付けることに費やされてきた。酸化ＬＤＬにおいて以下の２つの抗原が同定された：酸化リン脂質（ホスホリルコリン）及びアポＢ−１００ペプチド（非特許文献１０）。ホスホリルコリンに基づくワクチン及びアポＢペプチドに基づくワクチンの両方に伴う制約は、作用メカニズムがあまり理解されていないことである。酸化リン脂質は、その発現の調節があまり理解されておらず、老化細胞及び細胞屑と関連する自己抗原と交差反応する、自然抗体と称されるＩｇＭのサブクラスにより認識される。高い特異性及び標準化したワクチン調製物を産生する可能性は、アポＢペプチドに基づくワクチンの幾つかの利点であり、現在ヒトワクチンが前臨床開発中である。このアプローチに伴う欠点としては、治療前に患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子型判定を行う必要があること、及びＨＬＡ型に応じてワクチンを個人に合わせる必要があるというリスクが挙げられる。
【００１３】
しかしながらこれまで、アポＢペプチドに基づくワクチンの他には、免疫系を標的にする他の治療的アプローチは、アテローム性動脈硬化の治療に対しては開発されていない。
【００１４】
身体が自己免疫応答の活性を制御するためには複数の方法が存在し、そのうち重要な方法の１つは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。Ｔｒｅｇの複数のサブタイプが同定されている。天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、胸腺において発生し、その後末梢組織に入り、該組織において該Ｔｒｅｇは全Ｔ細胞の５％〜１０％を構成する。天然Ｔｒｅｇとは対照的に、ＩＬ−１０を産生する１型調節性Ｔ細胞（Ｔｒ１）及びＴＧＦ−βを産生する３型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ３）は、樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示及び活性化の後に、末梢においてナイーブＴ細胞から生成される。複数の証拠が、Ｔｒｅｇの機能の調節不全がアテローム性動脈硬化に関係するとしている。アテローム性動脈硬化におけるＴｒｅｇの保護的役割に関する機能的な証拠も蓄積されている。ＣＤ８０／８６、ＣＤ２８又はＩＣＯＳの欠失、及び抗ＣＤ２５抗体処理を介した天然Ｔｒｅｇの除去により、粥腫形成が顕著に増大する（非特許文献１１、非特許文献１２）。同様に、ＴＧＦ−βに関するＴ細胞受容体の欠失を介したＴｈ３細胞の阻害により、疾患の進行が顕著に増強される（非特許文献１３）が、その同種（cognate）抗原とともにオボアルブミン特異的なＴｒ１細胞のクローンを投与することにより、アポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウスにおいて粥腫の発達が阻害された（非特許文献１４）。しかしながら、アテローム性動脈硬化における調節性Ｔ細胞の役割の理解は、依然として非常に不完全である。
【００１５】
これらの知見は、免疫調節経路が誘起されて、炎症を低減させ、アテローム性動脈硬化を治療又は予防し得る可能性を提起した。興味深いことに、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）ワクチン接種が乳児におけるアトピーの発症を防ぐことが示され、ＢＣＧが免疫応答の調節不全を予防することができることが示唆された（非特許文献１５）。抗炎症治療としての生きたＢＣＧの実現不可能な送達を回避するために、ＢＣＧを長期凍結乾燥により死滅させ（ＥＦＤ ＢＣＧ又はＥＦＤ）、それがアレルギー（喘息、ＰＣＴの国際出願の特許文献１、非特許文献１６、非特許文献１７）及び腸の炎症性疾患（炎症性腸疾患、ＰＣＴの国際出願の特許文献２）に関する複数の動物モデルにおいて強力な抗炎症剤であることが示された。ＥＦＤは、生きたＢＣＧ又は熱により死滅したＢＣＧと関連する毒性の副作用を引き起こさず、ＤＴＨ皮膚試験による結核の診断を妨害しない。ＥＦＤは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴ−ｂｅｔが関連するＴｈ１シグナル伝達経路だけでなく、ＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＧＡＴＡ−３が関連するＴｈ２シグナル伝達経路、並びにＩＬ−１７及びＰＰＡＲ−γが関連すると考えられる新たなシグナル伝達経路にも作用するという独自の特性を有する（ＰＣＴの国際出願の特許文献２）。アレルギー及び腸の炎症性疾患の症状に対するＥＦＤの保護／治癒効果は、ＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性細胞の刺激と関連する（ＰＣＴの国際出願の特許文献１及び特許文献２）。
【００１６】
しかしながら、アテローム性動脈硬化等の自己免疫疾患を治療するための調節性Ｔ細胞刺激因子の使用と関連し得る主要な副作用が存在する（非特許文献８）。調節性Ｔ細胞が過度に抑制的であり、免疫抑制が罹患した組織に限定されない場合、感染に対する防御、及びＣＤ８ Ｔ細胞依存性の腫瘍細胞サーベイランスが損なわれるというリスクが存在する。例えば、週１回注射した場合、麻疹ウイルス由来のウイルスの核タンパク質が、マウスにおいてアテローム性動脈硬化を低減させることが示されている（非特許文献１８）。しかしながら、この核タンパク質により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激に対してＩＬ−１０を分泌する抑制性Ｔｒｅｇの発生が誘起され、マウスへのその投与により、Ｔ細胞によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γの産生が低減し、この麻疹核タンパク質処理が免疫抑制的である可能性があることが示唆された。
【００１７】
本発明者らにより、以下の３つの相異なるマウスモデルにおいてＥＦＤ ＢＣＧがアテローム性動脈硬化を低減させることが実証された：１）３０週で進行性のアテローム性動脈硬化病変を自発的に発症するアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウス、２）高脂肪食（hyperlipidemic diet）によりアテローム性動脈硬化を発症する低密度リポタンパク質受容体欠損（Ｌｄｌｒ−／−）マウス、及び３）Ｔ細胞上に機能的ＴＧＦ−β受容体を欠き、１２週でアテローム性動脈硬化病変を自発的に発症するＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。
【００１８】
ＥＦＤ ＢＣＧにより、標的化された遺伝子及びＴＧＦ−βシグナル伝達とは関係なく、３つのアテローム性動脈硬化誘発性（prone）マウスモデルにおいてアテローム硬化性病変の大きさが有意に低減した。
【００１９】
ＥＦＤ ＢＣＧにより、以下のことが同時に誘発された：１）ＩＬ−１０産生及びＴｒｅｇの増殖を介した免疫調節効果、２）ＮＦ−κＢ活性化の阻害、並びに３）ＰＰＡＲ−αレベルの変化を伴わないＰＰＡＲ−γの増大。
【００２０】
このＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−α活性化を誘導しないが、これは１つの利点であり、臨床的使用に関するその可能性を裏付ける。
【００２１】
予期せぬことに、その免疫調節活性にもかかわらず、ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔｈ１免疫応答及びＴｈ２免疫応答を起こすワクチン（ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）、ＢＣＧ）によりもたらされる保護を弱力化せず、病原体感染（ウイルス（インフルエンザウイルス）、細菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（M. tuberculosis：ヒト型結核菌））又は寄生虫（リーシュマニア・メジャー（Leishmania major）））の経過も悪化させなかった。宿主の効率的な免疫能の維持により、ＥＦＤ ＢＣＧがヒトにおいて耐容性を有する治療剤であることが示唆される。
【００２２】
ＥＦＤ ＢＣＧに応答して、免疫抑制の徴候を有しない免疫調節プロファイルが誘導される。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおける全身的炎症プロファイルの変調は、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、粥腫におけるＭＯＭＡ＋マクロファージの局所的な蓄積の低減とも関連した。
【００２３】
さらに、ＥＦＤ ＢＣＧは本研究において、測定可能な程度の副作用を有しなかった。
【００２４】
これらの結果により、ＥＦＤがアテローム性動脈硬化の予防及び治療のための新たな治療アプローチであることが示される。ＥＦＤは、長い活性持続時間（少なくとも２ヶ月）を有すると予想される。したがって、ＥＦＤは、１日１回の繰り返しの投与を必要とする現在使用されている薬剤と比較して、投与の回数が非常に限られるという利点を有する。加えて、ＥＦＤ治療は、免疫抑制を誘導しないため、安全である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第０３／０４９７５２号
【特許文献２】国際公開第２００７／０７２２３０号
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Bank et al., J. Clin. Invest., 1996, 97, 1715-1722
【非特許文献２】Jiang et al., Nature, 1998, 391, 82-86
【非特許文献３】T. Collins and M.I Cybulsky, J. Clinical Investigation, 2001, 107, 255-262
【非特許文献４】Yamazaki et al., Gut, 2007, 56, 1557-1563
【非特許文献５】B. Staels, Current Medical Research and Opinion, 2005, 21, suppl 1, S13-S20
【非特許文献６】Calkin et al., Atherosclerosis, 2007, 195, 17-22
【非特許文献７】Nissen et al., JAMA, 2005, 294, 2581-2586
【非特許文献８】Nilsson, J. and G.K. Hanson, Journal of Internal Medecine, 2008, 263, 464-478
【非特許文献９】Hansson, G.K., N. Engl. J. Med., 2005, 352, 1685-1695
【非特許文献１０】Klingenberg et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2010, 30, 946-952
【非特許文献１１】Ait-Oufella et al., Nat. Med., 2006, 12, 178-180
【非特許文献１２】Gotsman et al., Circulation, 2006, 114, 2047-2055
【非特許文献１３】Roberson et al., J. Clin. Invest., 2003, 112, 1342-1350
【非特許文献１４】Mallat et al., Circulation, 2003, 108, 1232-1237
【非特許文献１５】Shirakawa et al., Science, 1997, 275, 77-79
【非特許文献１６】Lagranderie et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2008, 121, 471-478
【非特許文献１７】Lagranderie et al., The Journal of Immunology, 2010, 184, 1062-1070
【非特許文献１８】Ait-Oufella et al., Circulation, 2007, 116, 1707-1713
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌の使用に関する。
【００２８】
本発明との関連で使用される場合、「ＥＦＤ」、「ＥＦＤ ＢＣＧ」又は「長期凍結乾燥したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ」という表現は、換言すれば、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を表す。本発明との関連では、「変性していない」は、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌分子の構造、特に高分子（タンパク質、多糖、脂質）の一次構造が保存されていることを意味する。好ましくは、タンパク質の一次構造が保存されている。ＥＦＤ中で保存されているタンパク質の一例は、Ａｐａであり、これは、生きたＢＣＧから抽出されるタンパク質と同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の移動特徴を有する（Laqueyrerie et al., Infect. Immun., 1995, 63, 4003-4010）。ＥＦＤは、長期凍結乾燥、又はその高分子成分の構造を保存しながら細菌を死滅させる任意の他のプロセスにより調製することができる。好ましくは、かかるプロセスにより、細菌細胞由来の高分子の一次構造が保存される。ＥＦＤを調製するのに使用することができるこれらのプロセスは、当業者に既知であり、物理的手段、例えば長期凍結乾燥、シリカ又はジルコニウムビーズの存在下での粉砕等の使用、いわゆる「フレンチプレス」及び超音波処理の使用を含む。
【００２９】
上で記載されるようなＥＦＤの画分は、本発明の「ＥＦＤ」という表現に包含される。この画分は、以下からなる群において選択される：グリコシダーゼによるＥＦＤの処理の残留物（脱グリコシル化残留物）、ＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅによるＥＦＤの消化の残留物、プロテアーゼによるＥＦＤの処理の残留物、順番にグリコシダーゼ、ＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅ並びに最後にプロテアーゼによるＥＦＤの処理の残留物、並びにプロテアーゼ（例えばスブチリシン（subtilisin）等）及びＤＮａｓｅによる上記ＥＦＤの処理の残留物。
【００３０】
本発明の好ましい１つの実施の形態によれば、ＥＦＤは、１．５％未満の水、好ましくは１％未満の水、より好ましくは０．５％未満の水を含有する、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌からなる。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施の形態によれば、ＥＦＤを、参照により本明細書に援用されるＰＣＴの国際出願の特許文献１に記載されるような方法であって、（ｉ）生きた細菌細胞の培養物を回収する工程と、（ｉｉ）水中で又は塩の水溶液中で該細菌細胞を凍結する工程と、（ｉｉｉ）該凍結した細菌細胞を、凍結乾燥器中で少なくとも９８．５％の水、好ましくは少なくとも９９％の水、より好ましくは少なくとも９９．５％の水を除去するのに十分な時間該細胞を乾燥させることによりを死滅させる工程と、（ｉｖ）長期凍結乾燥した死滅した細菌細胞を回収する工程とを含む、方法により調製する。必要に応じて、水中で又は塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄する工程を、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間に導入することができる。
【００３２】
ＥＦＤの全ての画分が、水又は任意の親水性溶媒中に長期凍結乾燥した細菌を再懸濁すること、及び処理を適用することにより得られる。貯蔵を容易にするために、古典的な凍結乾燥を、画分に対して後で適用することもできる。
【００３３】
本発明の別の有利な実施の形態によれば、上記ＥＦＤが、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤及び／又は免疫刺激剤及び／又はアジュバントを更に含む、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための医薬品組成物中に含まれる。
【００３４】
当業者に既知の任意の好適な担体を、本発明の医薬品組成物に利用することができ、該担体の種類は投与様式に応じて異なる。非経口投与、例えば皮下注射に関しては、担体は好ましくは、水、食塩水緩衝剤、ラクトース、マンニトール、グルタメート、脂肪又はワックスを含み、注射可能な医薬品組成物は好ましくは等張溶液（およそ３００ミリオスモル〜３２０ミリオスモル）である。経口投与に関しては、上記の担体、又は固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（talcum）、セルロース、グルコース、スクロース及び炭酸マグネシウムのいずれかを、利用することができる。生分解性の微粒子（例えばポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））を、本発明の医薬品組成物のための担体として利用することもできる。例えば米国特許第４，８９７，２６８号及び同第５，０７５，１０９号において、好適な生分解性の微粒子が開示されている。抗凝集剤、抗酸化剤、色素、香味増強剤、又は平滑化剤、集合化（assembling）剤若しくは分離（isolating）剤の中から、包括的には薬学産業において従来から使用されている任意の添加物の中から添加剤を選択することができる。様々なアジュバント／免疫刺激剤のいずれかを、免疫応答を増強するために本発明の組成物において利用することができる。ほとんどのアジュバントが、急速な異化から抗原を保護するように又は制御された炎症反応を生み出すように設計された物質、例えば水酸化アルミニウム、及び免疫応答の非特異的な刺激因子を含有する。ヒト投与のための好適なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、生分解性の微粒子、モノホスホリルＡ及びＱｕｉｌ Ａとして市販されている。
【００３５】
医薬品組成物は、経口投与に好適な形態であり得る。例えば、組成物は、経口投与のための錠剤、通常のカプセル、ゼラチンカプセル又はシロップの形態である。これらのゼラチンカプセル、通常のカプセル、及び錠剤形態は、医薬品製剤中において従来から使用されている添加物、例えばアジュバント、又は結着剤、例えばデンプン、ガム及びゼラチン、アジュバント、例えばリン酸カルシウム、崩壊剤、例えばコーンスターチ若しくはアルギン酸（alginic acids）、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、甘味料、又は香料を含有していてもよい。溶液又は懸濁液を、薬理学的に適合性を有する溶媒の添加により、水性媒体又は非水性媒体中で調製することができる。これらは、グリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリグリコールエーテル、ＤＭＳＯ及びエタノールを含む。
【００３６】
一般的に、組成物を、非経口注射（例えば皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射又は皮下注射）により、鼻腔内に（例えば吸引又は噴霧により）、経口的に、舌下に、又は局所的に、皮膚を介して、又は直腸上皮を介して投与することができる。
【００３７】
本発明の組成物中に存在するＥＦＤの量は、治療上の有効量である。ＥＦＤの治療上の有効量は、ＥＦＤが、組成物が投与される被験体において過度の負の効果を引き起こすことなくアテローム性動脈硬化の徴候を低減させるその役割を果たすために必要な量である。使用されるＥＦＤ及び投与される組成物の正確な量は、治療対象の種（ヒト、動物）、被験体の種類（アテローム性動脈硬化のリスクを有する被験体、例えば脂質異常症の被験体、メタボリック・シンドロームの被験体、２型糖尿病の被験体）、投与様式、投与頻度、並びに組成物中の他の成分等の因子に応じて変化する。
【００３８】
好ましくは、組成物は、約１０μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１００μｇ〜約１ｍｇのＥＦＤを含む。「約」は、僅かに低い又は高い量のＥＦＤを使用することができることを意味する。
【００３９】
例えば、非経口投与、例えば皮下注射に関しては、治療対象の個体を、１週間毎、１ヶ月毎又は３ヶ月毎〜６ヶ月毎に約１０μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１００μｇ〜約１ｍｇ、例えば１００μｇのＥＦＤという１用量スケジュール（a 1 dose schedule）に供することができる。
【００４０】
組成物を、アテローム性動脈硬化と過去に診断された患者、アテローム性動脈硬化のリスクが高い患者、若しくは黄色腫を呈する患者、特に黄色板腫を呈する患者においてアテローム性動脈硬化を予防するために、又はアテローム性動脈硬化のエピソードの開始時の患者においてアテローム性動脈硬化を治癒させるために使用することができる。
【００４１】
本発明は、アテローム性動脈硬化の予防及び／又は治療における同時、別々又は連続の使用のための組合せ調製物としての、本発明に規定されるようなＥＦＤ又はその画分と、該第１の製品と異なる第２の製品であって、抗炎症薬及び免疫変調薬（例えばアセチルサリチル酸又はチアゾリジンジオン（グリタゾン））からなる群から選択される、第２の製品とを含有する製品にも関する。
【００４２】
本発明は、上で規定されるような、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための薬物の製造のための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌の使用にも関する。
【００４３】
本発明は、上で規定されるような、アテローム性動脈硬化に罹患している又はそれにかかりやすい患者に対する有効量のＥＦＤ含有組成物の投与を含む、アテローム性動脈硬化を予防又は治療する方法にも関する。
【００４４】
マウスのアテローム性動脈硬化の３つの実験モデルにおけるＥＦＤ処理によるアテローム性動脈硬化の予防及び治療を例示する実施例に言及する以下の更なる記載及び図面により、本発明を更に例示する。しかしながら、これらの実施例が本発明の例示の目的でのみ提示され、その限定を決して構成しないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図３】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカイン及びケモカインを示す図である。
【図４】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳで処理したマウスと比較した、皮下注射（ＳＣ）による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓細胞核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ（白色のバー）及びＰＰＡＲ−γ（ストライプを付したバー）の結合。１群当たりのマウス数ｎ＝６。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後のＮＦκＢの転位の減少、及びＰＰＡＲγの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有する。
【図５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図６】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図７】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカインを示す図である。
【図８】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３及びＦｏｘｐ３に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の２つの脾細胞抽出物に関する３つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇのシグネチャー）を増大させること、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３（それぞれＴｈ１７及びＴｈ２のシグネチャー）を減少させることにより、免疫調節応答を開始する。
【図９】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳで処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較した、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓細胞核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ（白色のバー）及びＰＰＡＲ−γ（ストライプを付したバー）の結合。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後のＮＦκＢの転位の減少により証明されるように、抗炎症効果を有する。
【図１０】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて免疫調節プロファイルが誘導されたことを示す図である。マウスに６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。（Ａ）３０週齢でのＰＢＳで処理したマウス（ｎ＝６）又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス（ｎ＝６）の脾臓中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋リンパ球の絶対数（フローサイトメトリーにより解析した）。（Ｂ）個々のＰＢＳで処理したマウス（ｎ＝６）又はＥＦＤで処理したマウス（ｎ＝６）の脾臓核抽出物中におけるＳＰ−１の結合。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＳＰ−１転写因子のより高い発現は、ＥＦＤで処理したマウスの血清中に見出されるＩＬ−１０のより高い産生（図５）と相関する。これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１を活性化することにより免疫調節応答を開始することが示される。ＥＦＤで処理したマウスは、ＰＢＳで処理したマウスより有意に多数のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を有していた。
【図１１】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。ＴＧＦ−βが、ＰＢＳで処理したマウス（黒色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（灰色のバー）の個々の血清試料中で増大した。＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１３】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清中の炎症性サイトカイン及び炎症性ケモカインのレベルが変化することを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減する。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊：Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１４】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカイン及びケモカインを示す図である。
【図１５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。ＴＧＦ−βレベルが、ＰＢＳで処理したマウス（黒色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（灰色のバー）の個々の血清試料中で僅かに増大した。
【図１６】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳ（白色のバー）又はＥＦＤ ＢＣＧ（ストライプを付したバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）で月１回、計６回処理したマウスの、３匹のマウスの２つのプール由来の血管組織（Ａ）及び個々の脾臓（Ｂ）の核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ及びＰＰＡＲ−γの結合。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後の両方の器官におけるＮＦκＢの転位の減少、及びＰＰＡＲγの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有する。（Ｂ）にＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊：Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ≦０．０１。３つの試料の２つのプールを（Ａ）に示したが、統計解析は行わなかった。
【図１７】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。非リン酸化型及びリン酸化型のＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−５ｂ及びＳＴＡＴ−６に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の３つの脾細胞抽出物の２つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＳＴＡＴのリン酸化はその活性化を反映するものであった。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４及びＳＴＡＴ−６のリン酸化の減少により証明されるように、抗炎症効果を有する。ＥＦＤ ＢＣＧは、ｐ−ＳＴＡＴ−５ｂの活性化により証明されるように、免疫調節応答を開始する。
【図１８】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。非リン酸化型及びリン酸化型のＲＸＲ−α；ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３及びＦｏｘｐ３に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の３つの脾細胞抽出物の２つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇのシグネチャー）を増大させること、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３（それぞれＴｈ１７及びＴｈ２のシグネチャー）を減少させることにより、免疫調節応答を開始する。ＥＦＤ ＢＣＧはまた、ＲＸＲ−αのリン酸化の減少により証明されるように抗炎症効果を有する。
【図１９】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳ（白色のバー）又はＥＦＤ ＢＣＧ（ストライプを付したバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）で月１回、計６回処理したマウス由来の個々の脾臓核抽出物中のその特定のＤＮＡモチーフとのＳＰ−１の結合。ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１が、ＥＦＤ処理後に非常に有意に増強される。これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧがＳＰ−１を活性化することにより免疫調節応答を開始することが示される。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図２０】ＥＦＤ処理が形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の動員を誘導したことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧ（１００μｇ）の１回目の注射の４日後における、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）へと動員された細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ１１ｃ＋集団内における、ＣＤ１１ｃｈｉＢ２２０ｎｅｇ ｃＤＣ（右下の細区画）及びＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉ ｐＤＣ（左上の細区画））。ＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＰＢＳを注射したマウスと比較して、より多くのｐＤＣ（ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉｇｈ）が、ＥＦＤ ＢＣＧマウスにおいて検出された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち０．３％に対して１５％）。対照的に、ＰＢＳと比較して、より少ない従来型ＤＣ（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＢ２２０ｎｅｇ）が、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後にＤＬＮにおいて観察された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち８３％に対して３２％）。
【図２１】形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）が、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を促進したことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧ（１００μｇ）の１回目の注射の４日後における、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）へと動員された細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ４＋集団内における、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ）。ＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスのＤＬＮにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、対照マウスと比較して上昇した（ゲーティングされたＣＤ４＋細胞のうち５．５％に対して１３．２％）。
【図２２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて免疫調節プロファイルが誘導されたことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧの１回目の注射の４日後における、鼠径ＤＬＮへと動員された細胞のフローサイトメトリー解析。（Ａ）両方の鼠径ＤＬＮにおけるＩＣＯＳ−Ｌを発現するｐＤＣの数。（Ｂ）両方の鼠径ＤＬＮにおけるＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２３】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて病変の大きさ及び炎症が低減することを示す図である。マウスに６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。ＰＢＳ及びＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）大動脈洞におけるマクロファージ染色（ＭＯＭＡ−２＋細胞）の代表的な顕微鏡写真。ＥＦＤ ＢＣＧ処理後において、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の平均横断面積は、マクロファージ蓄積と同様に、対照と比較して有意に低かった。
【図２４】ＥＦＤで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの大動脈弓、並びにヘマトキシリン・エオシンスライド上でアテローム粥腫の面積を半定量した種々の部位（ａ、ｂ、ｃ）を表す図である。
【図２５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤを（皮下に）投与した。マウスを３０週齢で屠殺し、病変の厚み及び大動脈の厚みの平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。病変の厚みを、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、病変の厚み／大動脈の厚みの比率として表す。
【図２６】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤを（皮下に）投与した。マウスを３０週齢で屠殺し、病変面積及び総大動脈面積の平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。病変面積を、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、病変面積／大動脈面積の比率として表す。
【図２７】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）スーダンＩＶで染色した大動脈の代表的な顕微鏡写真。（Ｃ）病変横断面積に対する染色された面積のパーセンテージとして表したマクロファージ染色（ＭＯＭＡ−２＋細胞）。（Ｄ）ＰＢＳ処理又はＥＦＤ ＢＣＧ処理の後の大動脈病変中の大動脈ＭＯＭＡ−２＋細胞の代表的な顕微鏡写真。元の倍率：×４００。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２８】ＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスにおいて病変の大きさが低減し、免疫調節応答が誘導されることを示す図である。マウスに６週齢及び９週齢で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ｎ＝９）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝８）を皮下注射し、大動脈、脾臓及び血清を１２週で回収した。（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）オイルレッドＯ染色後における大動脈洞の代表的な顕微鏡写真。（Ｃ）Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘによる個々の血清中のＩＬ−１０及びＴＮＦ−αの測定。（Ｄ）脾細胞抽出物中のウェスタンブロットによるＦｏｘｐ３の検出。各バンドが、３匹のマウス由来の脾細胞抽出物のプールを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２９】漸増用量のＥＦＤ ＢＣＧがＯＦ１非近交系スイスマウスにおいて副作用を誘導しないことを示す図である。様々な用量のＥＦＤ（０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ及び１ｍｇ）及び１００μｌのＰＢＳを、ＯＦ１マウスに１日１回１４日間皮下投与した（１群当たりｎ＝６）。（Ａ）直腸温度を各注射の２４時間後にモニタリングした。（Ｂ）各日のマウスの重量。（Ｃ）実験の終了時（１５日目）における脾臓核抽出物中のその特定のＤＮＡモチーフとのＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−αの結合。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３０】ＥＦＤ処理がマイコバクテリウム・ツベルクローシス感染又はＢＣＧワクチン接種を妨害しないことを示す図である。モルモットを、ＢＣＧ注射の前若しくは後に、又はＢＣＧ注射を行うことなく、ＥＦＤで処理した。それから、モルモットをマイコバクテリウム・ツベルクローシスに感染させ、脾臓中の病原性細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。１群当たりのモルモット数ｎ＝６。
【図３１】ＥＦＤ処理が、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のワクチン接種を妨害しないことを示す図である。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＥＦＤ又はＰＢＳで処理した後、ナイセリア・メニンジティディスのワクチン接種を行った。最後のワクチン注射の２週間後、ワクチン接種した及びワクチン接種していないマウスに、１０７ＣＦＵの病原性ナイセリア・メニンジティディスを（ｉｐ）負荷し、負荷の２時間後、６時間後及び２４時間後に血中の細菌（bacteriemia）を測定した。１群当たりのマウス数ｎ＝６。（◆）ＥＦＤ １００μｇ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）＋不活性化型ナイセリアワクチン接種（ｄ１、ｄ８、ｄ１５）。（●）ＰＢＳ １００μｌ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）＋不活性化型ナイセリアワクチン接種（ｄ１、ｄ８、ｄ１５）。（■）ＰＢＳ １００μｌ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）（ナイセリアワクチン接種なし）。
【図３２】ＥＦＤ処理により、インフルエンザウイルス感染の経過が変化しないことを示す図である。（◆）ＢＡＬＢ／ＣマウスをＥＦＤ（１００μｌ中１００μｇ）で皮下的に（ｓ．ｃ．）処理した（ｄ−２１）。（●）ＢＡＬＢ／ＣマウスをＰＢＳ（１００μｌ）で皮下的に（ｓ．ｃ．）処理した（ｄ−２１）。２１日後、両方の群をインフルエンザウイルススコットランドＡ株（５０００ｐｆｕ）に鼻腔内感染させ、マウスの臨床症状及び生存しているマウスの数を１４日目まで１日１回記録した。
【図３３】脂質分析結果を示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清中の総コレステロール及びトリグリセリドのレベルを測定した。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。値を、平均値±ＳＤ（１群当たりのマウス数ｎ＝４）として表す。ｎ．ｓ．＝有意でない。
【図３４】コレステロールリポタンパク質プロファイルを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清由来のリポタンパク質プロファイルの大きさの分析。簡潔に述べると、マウス由来の血漿試料（５０μｌ）を、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣシステム（株式会社島津製作所）に接続し、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したＨＲ１０／３０ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（GE HEALTHCARE）及びプレカラムとしてのＤｉｓｏｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ ＧＦＣ−５００（５ｃｍ×７．８ｉ．ｄ．；Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；SIGMA-ALDRICH）により分画した。２００μｌの画分をＦｏｘｙ Ｊｒ（登録商標）（TELEDYNE ISCO INC.）により回収し、各画分中の総コレステロールを、酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。各画分中のコレステロール濃度（ｙ軸）を、保持画分番号（ｘ軸）に対してプロットする。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。曲線は、ＥＦＤ ＢＣＧ免疫化マウス（暗灰色の線）及びＰＢＳ免疫化マウス（明灰色の線）に関する平均値±ＳＤを示す。１群当たりのマウス数ｎ＝４。ＣＲ、カイロミクロンレムナント。
【図３５】ＥＦＤ ＢＣＧ処理後のｏｘＬＤＬに対する抗体力価を示す図である。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血清中のｏｘＬＤＬに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより測定した。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。曲線は、ＥＦＤ ＢＣＧ免疫化マウス（暗灰色の線）及びＰＢＳ免疫化マウス（明灰色の線）に関する平均値±ＳＤを示す。１群当たりのマウス数ｎ＝６。簡潔に述べると、５０μＬの抗原（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で終夜インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％ゼラチン（GIBCO INVITROGEN）で室温で１時間ブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、マウス血漿とともに更に２時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）／ゼラチン０．１％で希釈した。洗浄工程の後、総ＩｇＧレベルを、酵素結合型抗マウス抗体（BD BIOSCIENCES）を使用して測定した。プレートを洗浄し、比色分析反応物をＴＭＢ（BD BIOSCIENCES）により発色させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、MOLECULAR DEVICES）により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
実施例１：ＥＦＤの調製
長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧパスツール株（１１７３Ｐ２）を、ＰＣＴの国際出願の特許文献１に以前に記載されたように調製した。ＥＦＤ調製物は、カール・フィッシャー法を使用することによる電量計（METROHM）で決定されるように、手順の終了時に１．５％未満の水を含有していた。２０ミリグラムのＥＦＤをＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０（DIFCO）寒天プレート上で培養して、生きた細菌が存在しないことを確認した。
【００４７】
ＥＦＤを、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度でマンニトール（５％）中に再懸濁し、０．０４０ｍＢａｒの圧力下で７２時間凍結乾燥させ（この工程では、凍結乾燥の目的は乾燥組成物を得ることのみである）、最後に、蒸留水（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した後、マウスに注射した。
実施例２：ＡｐｏＥ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデル及びＬｄｌｒ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化の発症に関するＥＦＤ処理の評価
１）材料及び方法
ａ）アテローム性動脈硬化の誘導／予防の実験モデル
雄性ＡｐｏＥ−／−及びＬｄｌｒ−／−マウスを、２つの長期処理モデルとして使用した。アポリポタンパク質Ｅ欠損型（ＡｐｏＥ−／−）及び低密度リポタンパク質受容体欠損型（Ｌｄｌｒ−／−）雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Jouy en JosasにあるＩＮＲＡのキャンパスの動物飼育施設で繁殖させた。実験開始時に６匹〜７匹のマウス（５週齢〜６週齢）の群を分配した：
１）群１のＡｐｏＥ−／−マウスには、１０週間毎に（２ヶ月に１回）、計３回１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し、最後の注射の２ヶ月後（３４週齢）に屠殺した。
【００４８】
２）群２のＡｐｏＥ−／−マウスには、群１と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、３回目のＥＦＤ注射の２ヶ月後（３４週齢）に屠殺した。
【００４９】
３）群３のＡｐｏＥ−／−マウスには、４週間毎に１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し（６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で計６回の注射）、最後の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５０】
４）群４のＡｐｏＥ−／−マウスには、群３と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、６回目の注射の１ヶ月後に屠殺した。
【００５１】
５）群５のＬｄｌｒ−／−マウスには、４週間毎に１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し（６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で計６回の注射）、最後の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５２】
６）群６のＬｄｌｒ−／−マウスには、群５と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、６回目の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５３】
ＥＦＤの１回目の注射（５週齢〜６週齢）から実験終了時まで、ＡｐｏＥ−／−マウスには従来の食餌を与えたが、Ｌｄｌｒ−／−マウスには脂質（１５％豚脂）及び０．５％コレステロール（Genestil）を添加した食餌を投与した。
ｂ）リンパ器官細胞のフローサイトメトリー解析
Ｔｒｅｇ及び樹状細胞（ＤＣ）を同定するために、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）を、１回目のＥＦＤ ＢＣＧ又はＰＢＳの注射の４日後に回収した。コラゲナーゼ−Ｄｎａｓｅ消化の後、流入領域リンパ節（ＤＬＮ）をｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒにより粉砕し、細胞を抽出した後、製造業者の推奨に従って、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体、Ｂ２２０に対する抗体（BD PHARMINGEN）、Ｆｏｘｐ３に対する抗体（EBIOSCIENCES）、ＩＣＯＳに対する抗体、ＩＣＯＳ−Ｌに対する抗体（EBIOSCIENCES）及びＰＤＣＡ−１に対する抗体（MILTENYI BIOTEC）を用いて染色した。
【００５４】
ＡｐｏＥ−／−マウス由来の脾細胞を、３０週目に脾臓の半分から単離し、ＣＤ４に対する抗体（BD PHARMINGEN）及びＦｏｘｐ３に対する抗体（EBIOSCIENCES）で染色した。全ての試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD BIOSCIENCES）を使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより解析した。
ｃ）脾臓細胞抽出物及び大動脈抽出物中の転写因子の検出
脾臓のもう一方の半分（２匹のマウスのプール）を−２５℃で凍結して、数日間貯蔵した。タンパク質を、脾臓から抽出し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ニトロセルロースシートに移したタンパク質バンドを、マウスモノクローナル抗ＦＯＸＰ３、抗Ｔ−ｂｅｔ、抗ＧＡＴＡ−３、抗ＲＯＲγｔ、抗ＲＸＲα、抗ｐ−ＲＸＲα、抗ＳＴＡＴ−１、抗ｐＳＴＡＴ−１、抗ＳＴＡＴ−４、抗ｐ−ＳＴＡＴ−４、抗ＳＴＡＴ−５ｂ、抗ｐ−ＳＴＡＴ−５ｂ、抗ＳＴＡＴ−６、抗ｐ−ＳＴＡＴ−６（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）、又はβ−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ａｃ−１５、ABCAM）を用いて調べた。ポリクローナルヤギ抗ウサギ（DAKO CYTOMATION）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）（両方ともＨＲＰ結合型）を二次抗体として使用した。免疫複合体を、増強型化学発光検出システム（AMERSHAM）を用いて可視化し、走査解析した。
【００５５】
核タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤処理後に脾臓又は大動脈のホモジネート（３匹のマウスのプール）から抽出し、製造業者の推奨に従ってＴｒａｎｓＡＭ（商標）転写因子アッセイキット（ACTIVE MOTIF）を用いて、ＮＦκＢｐ６５、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲ−α又はＳＰ−１で処理した。簡潔に述べると、１０μｇの核抽出物を９６ウェルプレート（各プレートは、それぞれの転写因子のコンセンサス結合部位を含有する特定のオリゴヌクレオチドでコーティングされている）に添加した。結合を光学密度（ＯＤ）として表した。各実験における処理した試料又はプールの数を、図の説明文において報告する。
ｄ）血清学的分析
血清を、３０週目にＬｄｌｒ−／−マウスから、及び３０週目又は３４週目にＡｐｏＥ−／−マウスから回収した。血清中の炎症促進性サイトカイン及びケモカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＫＣ（ＩＬ−８）、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β、エオタキシン）並びに抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）のレベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘサイトカインアッセイ（BIO-RAD）を使用して測定した。ＴＧＦ−βを、ＥＬＩＳＡキット（EBIOSCIENCE）により測定した。
【００５６】
ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血漿中のコレステロール及びトリグリセリドのレベルを、製造業者のプロトコルに従って酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。血漿コレステロールリポタンパク質プロファイルを、Okazaki et al., J. Biochem., 1981, 89,879-887の変更した方法を使用して検証した。簡潔に述べると、マウス由来の血漿試料（５０μｌ）を、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣシステム（株式会社島津製作所）に接続し、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したＨＲ１０／３０ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（GE HEALTHCARE）及びプレカラムとしてのＤｉｓｏｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ ＧＦＣ−５００（５ｃｍ×７．８ｉ．ｄ．；Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；SIGMA-ALDRICH）により分画した。２００μｌの画分をＦｏｘｙ Ｊｒ（登録商標）（TELEDYNE）により回収し、各画分中の総コレステロールを、酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。
【００５７】
ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血清中のｏｘＬＤＬに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、５０μＬの抗原（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で終夜インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ゼラチン（GIBCO INVITROGEN）で室温で１時間ブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、マウス血漿とともに更に２時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）／ゼラチン０．１％で希釈した。洗浄工程の後、総ＩｇＧレベルを、酵素結合型抗マウス抗体（BD BIOSCIENCES）を使用して測定した。プレートを洗浄し、比色分析反応物をＴＭＢ（BD BIOSCIENCES）により発色させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、MOLECULAR DEVICE）により測定した。
ｅ）アテローム硬化性病変の組織学的解析及び免疫染色
心臓及び大動脈を、ＥＦＤで処理したＡｐｏＥ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＡｐｏＥ−／−マウス、並びにＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＬｄｌｒ−／−マウスから回収し、最適切断温度（ＯＣＴ；サクラファインテックジャパン株式会社）において凍結した。凍結したブロックを、低温切開するまで−８０℃に維持した。
【００５８】
ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスの心臓及び上行大動脈を、以前に記載されたように低温切開した（Nicoletti et al., J. Clin. Invest. 1998, 102, 910-918）。１０ミクロン厚の切片を、大動脈弁の開始部分から１００μｍから始めて１００μｍ間隔で回収した。切片を風乾させ、それぞれ組織学的解析及び免疫組織化学的解析のためにＰＢＳ及び氷冷アセトン中で４％ホルムアルデヒドで固定した。ホルムアルデヒドで固定した切片を、ヘマトキシリン及びオイルレッド−Ｏ又はヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色し、光学顕微鏡下で可視化した。病変及び大動脈の横断面の面積を、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ（LEICA）及びＡｔｈｅｒｏｓｅ（商標）画像解析ソフトウェアプログラム（MICROVISION INSTRUMENTS）を使用して定量化した。病変の横断面の絶対面積を、１００μｍ間隔の大動脈根の８個の切片に関して算出した。群間の比較を、３つの最も大きい切片の平均値を使用して行った。Ｌｄｌｒ−／−マウスの大動脈弓を低温切開した。切片を風乾させ、氷冷アセトンで固定し、それからヘマトキシリン・エオシン染色を行った。大動脈弓の３つの異なる部位（ａ、ｂ、ｃ）における病変の面積及び厚みを、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、各部位に関するスコア（病変面積）として表した。加えて、病変の厚み及び表面積の平均値、並びに大動脈の厚み及び表面積の平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。結果を、病変の厚み／大動脈の厚み、病変面積／大動脈面積の比率として、及び病変面積として表した。
【００５９】
大動脈弓を、４％ホルムアルデヒドで固定し、縦方向に開き、スーダンＩＶ（MERCK）で染色した。脂質病変は赤色で示された。
【００６０】
免疫細胞を、ＭＯＭＡ−２（マクロファージ）に対する抗体を使用する従来の免疫染色により検出した。
ｆ）統計解析
データを、平均値±ＳＤとして表す。Ｇｒａｐｈ ＰａｄソフトウェアのＩｎｓｔａｔパッケージを、ウェルチの補正を用いるｔ検定を使用してデータを解析するために使用した。
２）結果
ａ）血清中のサイトカイン及びケモカイン
３回又は６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウス（群２及び群４）では、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の血清レベルが有意に増大した（８倍；図１、図５及び図１１）。同時に、炎症性サイトカイン及びケモカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＫＣ（ＩＬ−８）、ＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αの血清レベルは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して有意に減少したが、ＩＦＮ−γの血清レベルは有意に減少しなかった（図１、図２、図５、図６及び図１１）。ＴＧＦ−βの血清レベルは、群４のＥＦＤで処理したＡｐｏＥ−／−マウスでは有意には増大しなかった（２．６倍）（図１１）。試験した他のサイトカイン及びケモカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳ）は、ＥＦＤ処理後、変化しないままであった（図３及び図７）。
【００６１】
６回のＥＦＤ注射を行ったＬｄｌｒ−／−マウス（群６）では、ＩＬ−１０の血清レベルが、ＡｐｏＥ−／−に関して観察された結果と同様に増大した（図１２及び図１５）。試験した「炎症促進性の」サイトカイン及びケモカインの中では、非処理マウスと比較して、ＩＬ１−β、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−１３、ＫＣ（ＩＬ−８）及びＴＮＦ−αが有意に低減し、ＩＦＮ−γがやや増大した（図１３及び図１５）。ＴＧＦ−βレベルは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウスの血清中で１．９倍（しかし有意でなく）増大した（図１５）。Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてはＥＦＤ処理によりＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７及びエオタキシンは有意に低減しなかったが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいては３回又は６回のＥＦＤ処理後にこれらのサイトカイン及びケモカインが有意に低減したことに留意しなければならない。他のサイトカイン及びケモカインは変化しないままであった（ＩＬ−５、ＭＩＰ−１α、ＭＩＧ；図１４）。
【００６２】
これらのデータにより、ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により全身的な（systemic）ＩＬ−１０産生が増大し、炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γを除く）のレベルが減少することが示される。
ｂ）脾臓細胞抽出物及び大動脈抽出物中の転写因子
３回又は６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウスの脾細胞核抽出物では、ＮＦκＢｐ６５は有意に減少し、ＰＰＡＲγの発現は増強又は安定化された（図４及び図９）。
【００６３】
６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓抽出物では、ＰＢＳで処理したＡｐｏＥ−／−マウスと比較して、ＲＯＲγｔ（Ｔｈ１７の発生を統制する転写因子（Ivanov et al., Cell, 2006, 126, 1121-1133）；炎症性Ｔｈ１７細胞のシグネチャー）及びＧＡＴＡ−３（Ｔｈ２細胞のシグネチャー）の発現は減少し、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１の発生に重要な転写因子（Szabo et al., Cell, 2000, 100, 655-669）；Ｔｈ１細胞のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇ細胞）の発現は強く増強された（図８）。ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１転写因子（Chanteux et al., Respiratory Research, 2007, 8, 71-80）が、ＥＦＤで処理したマウスの血清において見出された高レベルのＩＬ−１０と相関して、脾臓核抽出物中で有意に増強された（図１０）。脾臓細胞のＦＡＣＳ分析により、ＰＢＳで処理したマウス（６回の注射）よりＥＦＤで処理したマウスにおいて、有意に多数のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞が示された（図１０）。
【００６４】
Ｌｄｌｒ−／−マウスでは、６回のＥＦＤ注射により、６匹のマウス由来の脾細胞核抽出物においてＮＦκＢ活性化が有意に低減し、ＰＰＡＲγの発現が増強された（図１６Ｂ）。３匹のマウスのプールの血管樹状（tree）組織の２つの抽出物から、同様の結果が得られた（プールの数が低すぎるため統計解析を行うことができなかった）（図１６Ａ）。
【００６５】
転写を活性化するために、ＰＰＡＲγはレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）とのヘテロ二量体化を必要とするが、リン酸化型ＲＸＲα及びｐ−ＲＸＲα−ＰＰＡＲγ複合体は不活性である。ＥＦＤで処理したマウスの脾細胞核抽出物中のＰＰＡＲγの発現の増強と相関して、そのリン酸化の遮断と関連してＥＦＤ処理後にＲＸＲαの発現が増強されるが、ＰＢＳで処理したマウスにおいてはｐ−ＲＸＲαの不活性形態が発現された（図１８）。さらに、ＩＬ−１０産生と相関する転写因子であるＳＰ−１のより高い発現が、ＡｐｏＥ−／−マウスに関して先に報告された（図１０）のと同様に、Ｌｄｌｒ−／−マウスのＥＦＤ処理後に観察された（図１９）。
【００６６】
それから、Ｔ細胞のコミットメントを調節する転写因子に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を決定した。ＥＦＤ処理は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいても見出された（図８）のと同様に、Ｌｄｌｒ−／−マウスの脾細胞抽出物におけるＴ−ｂｅｔ及びＦＯＸＰ３の増大、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３の減少と関連した（図１８）。ＥＦＤ処理は、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−６（全て、Ｔｈ１及びＴｈ２炎症応答のシグネチャー）のより低いリン酸化と相関した。加えて、ＳＴＡＴ−４はＴｈ１細胞の発生を調節する重要な因子であり（Thieu et al., Immunity, 2008, 29, 679-690）、ｐ−ＳＴＡＴ−４は近年、Ｔｒｅｇの発生を損なうことが示されている（O'Malley JT et al., Immunology, 2009, 127, 587-5953）。対照的に、Ｔｒｅｇの応答及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の成長を活性化することが報告されている転写因子であるｐ−ＳＴＡＴ−５ｂが増大した（図１７）。
【００６７】
したがって、これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＳＰ−１及びｐ−ＳＴＡＴ−５ｂを活性化することにより、Ｔｈ２及びＴｈ１７の分化を調節する転写因子の発現を低下させることにより、並びにＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団を増大させることにより、免疫調節応答を開始することが示される。これらの知見により、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＲＸＲα、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４及びＳＴＡＴ−６のリン酸化の減少、ＮＦ−κＢの活性化の障害、並びにＰＰＡＲ−γの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有することも示唆される。
ｃ）形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
樹状細胞（ＤＣ）の様々な発生段階及びサブセットが他の免疫Ｔ細胞を調節又は抑制するＴ細胞の増殖及び分化に寄与する（Steinman RM et al., Annu. Rev. Immunol., 2003, 21, 685-711）ため、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径ＤＬＮにおけるＤＣサブセット及びＴｒｅｇの解析を行った。ＥＦＤ処理により、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の動員が誘導された。１００μｇのＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＰＢＳを注射したマウスと比較して、より多くの形質細胞様（plasmacytoid）ＤＣ（ｐＤＣ；ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉｇｈ）が、ＥＦＤ ＢＣＧを注射したマウスの流入領域リンパ節において検出された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち０．３％に対して１５％；図２０）。対照的に、ＰＢＳと比較して、より少ない従来型ＤＣ（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＢ２２０ｎｅｇ）が、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後にＤＬＮにおいて観察された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち８３％に対して３２％；図２０）。さらに、ＥＦＤ ＢＣＧ又はＰＢＳの注射後に鼠径ＤＬＮに存在するｐＤＣ（ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉ）のうち９９％〜１００％が、マウスｐＤＣのマーカーであるＰＤＣＡ−１を発現した（Asselin et al., J. Immunol., 2003, 171, 6466-6477）。
【００６８】
成熟（Maturing）ｐＤＣは、高レベルの誘導性同時刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）を発現することによりＴｒｅｇを生成することができる（Ito T, et al., J. Exp. Med., 2007, 204, 105-115）。Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径ＤＬＮ中において、ＰＢＳ処理後よりＥＦＤ ＢＣＧ注射後に、ＩＣＯＳ−Ｌを発現するｐＤＣをより多く検出した（ゲーティングされたＣＤ１１ｃのうち０．７％に対して８％、絶対数では４１５±４８に対して３８５２９±１９０６、Ｐ＜０．００１；図２２Ａ）。同時に、対照マウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの鼠径ＤＬＮ中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、増大した（ゲーティングされたＣＤ４＋細胞のうち５．５％に対して１３．２％；図２１）。ＩＣＯＳの発現はアテローム性動脈硬化の低減に関与する（非特許文献１２）ため、ＥＦＤ−ＢＣＧにより誘導されるＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの数を測定した。鼠径リンパ節中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＩＣＯＳ＋細胞は、ＰＢＳ注射後よりＥＦＤ−ＢＣＧ注射後ではるかに多かった（２２８１４±２６２６に対して１１９０９１±５８９０、Ｐ＜０．００１；図２２Ｂ）。
ｄ）アテローム硬化性病変
ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を決定した。
【００６９】
ＡｐｏＥ−／−マウスのＥＦＤ ＢＣＧ処理（６回の注射）後、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の平均横断面積は、マクロファージ蓄積（ＭＯＭＡ−２＋細胞）（図２３Ｂ）と同様に、対照と比較して有意に低かった（９２５０２±４３６０７μｍ２に対して５９４４２±２４６９５μｍ２；図２３Ａ）。
【００７０】
Ｌｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により、アテローム硬化性病変の大きさが低減した（表Ｉ、図２４、図２５及び図２６）。
【００７１】
表Ｉは、ＰＢＳ処理群の各Ｌｄｌｒ−／−マウス（６匹のマウス）及びＥＦＤ処理群の各Ｌｄｌｒ−／−マウス（６匹マウス）に関する、大動脈弓の３つの異なる部位（ａ、ｂ又はｃ）（図２４）におけるアテローム硬化性病変面積の半定量結果を示す。ＰＢＳ処理群及びＥＦＤ処理群に関する各部位の平均値も示す（表Ｉ）。
【００７２】
【表１】
【００７３】
ＥＦＤで処理したマウスでは、病変は部位ｂにおいて統計的に小さかった（ｐ＝０．０１５；マン・ホイットニー検定）。
【００７４】
６匹のＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおける病変の面積及び厚みの定量（図２５及び図２６）により、ＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおいて病変の面積及び厚みが有意に低減することが実証された。
【００７５】
Ｌｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、大動脈根における病変の横断面積が低減し（２０４０５１±７３６２３μｍ２に対して８７０７２±２８０７９μｍ２、Ｐ＜０．０１；図２７Ａ）、図２７Ｂに示されるように、表面の（en face）大動脈標本における脂質病変面積が減少した。
【００７６】
免疫組織化学的検査により、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおいて、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、アテローム硬化性病変の横断面におけるＭＯＭＡ２＋マクロファージの浸潤がより少ないことが示された（Ｐ＜０．０１；図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。
ｅ）脂質プロファイル、及び酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）に対する抗体力価
血清コレステロール、トリグリセリド及びコレステロール脂質プロファイルは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理後に変化しなかった（図３３及び図３４）。
【００７７】
加えて、血清ｏｘＬＤＬに対する抗体のレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスとＰＢＳで処理したマウスとの間で異なっておらず、ＥＦＤ ＢＣＧによる保護がアテローム性動脈硬化特異的抗原と無関係であることが示唆された（図３５）。
実施例３：ＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対するＥＦＤ ＢＣＧ処理の評価
１）材料及び方法
ＣＤ４プロモーター下でドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体ＩＩを発現するＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドの雌性ＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス（非特許文献１３）を、アテローム性動脈硬化の短期間モデルとして使用した。マウスは、ストックホルム州地域倫理委員会の許可を得て、カロリンスカ大学病院の繁殖施設で作製及び飼育した。これらのマウスに、６週齢及び９週齢で、尾の根元に１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧの２回の皮下注射を行った。これらのマウスに標準的な飼料を与え、１２週齢で屠殺した。サイトカイン及び転写因子の分析、並びに免疫組織化学的研究を、実施例２に記載されるように行った。
２）結果
ＴＧＦ−βは、Ｔｒｅｇが産生することができるものであり、Ｔ細胞の活性化を阻止することによりアテローム性動脈硬化の発症を低減させる（Gojova et al., Blood, 2003, 102, 4052-4058；非特許文献１３；非特許文献１１）。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清中でＴＧＦ−βのレベルの増大の傾向が観察された（図１１及び図１５）ため、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスにおけるＥＦＤ ＢＣＧの効果が検証された。
【００７８】
ＥＦＤ ＢＣＧによる短期の処理にもかかわらず、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の大きさは、ＰＢＳと比較して３０％低減した（２７８０８６±８７０８９μｍ２に対して１９３６００±８５９４８μｍ２、Ｐ＜０．０５；図２８Ａ、図２８Ｂ）。
【００７９】
アテローム性動脈硬化の従来のモデル（Ｌｄｌｒ−／−及びＡｐｏｅ−／−）では、ＥＦＤ ＢＣＧにより、それぞれ、ＩＬ−１０産生が４倍〜８倍増大し、ＥＦＤ ＢＣＧ処理したＡｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスでは、非処理マウスに対して１６倍増大した（Ｐ＜０．００１；図２８Ｃ）。血清ＴＮＦ−αレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスではＰＢＳで処理したマウスと比較して僅かに減少した（図２８Ｃ）が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１７の血清レベルは２群間で異ならなかった。特に、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスの脾細胞抽出物中におけるＦｏｘｐ３タンパク質の発現が増強された（図２８Ｄ）。
【００８０】
これらの結果により、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＴＧＦ−βシグナル伝達の非存在下でＴｒｅｇの増殖及びＩＬ−１０の産生を促進することによりアテローム性動脈硬化を低減させることが示唆される。
実施例４：ＥＦＤ ＢＣＧ処理は、測定可能な毒性学的副作用を有しない
１）材料及び方法
毒性学研究に通常使用される雌性ＯＦ１スイスマウスを、パスツール研究所の動物実験部で飼育し、１００μｌのＰＢＳ又は０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ若しくは１ｍｇのＥＦＤ ＢＣＧを１４日間連続して注射した（１群当たりのマウス数１０）。体重及び直腸温度を、以前に記載されたように、１日毎に、各注射の２４時間後に測定した（非特許文献１６）。実施例２に記載されるように、最後の注射の２４時間後、マウスを屠殺し、核内のＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−αの測定のために脾臓を回収した。
２）結果
複数回のＥＦＤ注射は、測定可能な副作用を誘導しない
ＥＦＤ ＢＣＧによる処理の繰り返しの副作用を、集団レベルでの多様性が高く毒性学的研究に使用されることが多いＯＦ１非近交系スイスマウスにおいて評価した。様々な用量のＥＦＤ ＢＣＧ（０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ）の１４回の連続注射の後、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、直腸温度の変化は観察されなかった（図２９Ａ）。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの体重は、０日目から１４日目までに同程度（６％〜７％）増大した（図２９Ｂ）。
【００８１】
最後に、本発明者らは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理によりＰＰＡＲαの発現に影響を及ぼすことなくＰＰＡＲγの発現が増強されることも示した。実際に、ＰＰＡＲ−γアゴニスト（心血管疾患のリスクが高い糖尿病患者においてインスリン増感剤として使用される）及びＰＰＡＲ−αアゴニスト（脂質異常症を治療するために使用される）の組合せにより、ＡｐｏＥ−／−においてアテローム性動脈硬化が増強され（非特許文献６）、ヒトにおいて主要な心血管の有害事象が誘導された（非特許文献７）。
【００８２】
したがって、漸増用量のＥＦＤ ＢＣＧを１４日間連続して投与したＯＦ１スイスマウス由来の脾細胞抽出物中における２つのＰＰＡＲアイソフォーム（α及びγ）の発現を測定した。ＰＢＳを注射したマウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後に、ＰＰＡＲ−γの発現は用量依存的に増大したが、ＰＰＡＲ−αレベルは、最高用量のＥＦＤ ＢＣＧであっても同一のままであった（図２９Ｃ）。ＥＦＤ ＢＣＧがＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−αの活性化を誘導しないことは利点であり、ヒトにおける臨床的な使用のためのその可能性を支持する。
実施例５：ＥＦＤ処理は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、リーシュマニア・メジャー若しくはインフルエンザウイルスの感染を妨害せず、又はＢＣＧ若しくはナイセリアのワクチン接種を損なわない。
【００８３】
最後に、宿主の防御能に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を評価した。
ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染、及びＢＣＧワクチン接種
マウスよりマイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する感受性の高い種であるモルモットに、以下のものを注射した：
群１：０日目にＰＢＳ（１００μｌ）（対照）
群２：０日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群３：４２日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群４：０日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））
群５：０日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））、及び４２日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群６：０日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））、及び４２日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））。
【００８４】
８０日目に、全ての群（１群当たりのモルモット数ｎ＝６）にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｈ３７Ｒｖ；５×１０５ＣＦＵ）を負荷した。モルモットを１２２日目に屠殺した。脾臓を回収し、ホモジナイズした。ホモジナイズした脾臓の適当な希釈物を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天培地（DIFCO）上で平板培養した。プレートを、３７℃で１ヶ月間インキュベートし、病原性細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
【００８５】
ＢＣＧワクチン接種の前若しくは後の、又はＢＣＧワクチン接種を伴わないＥＦＤ処理は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染に対して感作させず、又はＢＣＧワクチン接種を損なわなかった（図３０）。
ｂ）リーシュマニア・メジャー感染アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ノンヒーラー（non healer）マウス）及びＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）（１群当たり８匹）の尾の根元に、１００μｌのＰＢＳ又は１００μｌのＰＢＳ中１００μｇのＥＦＤを注射した（０日目）。４５日目に、マウスの右耳に、１０μｌ中１０個〜２０個の生きたリーシュマニア・メジャー寄生虫を投与した。
【００８６】
局所的な炎症を６ヶ月間観察し、測定した。ＰＢＳ処理群とＥＦＤ処理群との間で差異は観察されなかった。
【００８７】
転移性の病変が、１６０日目に記録された。
【００８８】
ＰＢＳ処理群では、全てのマウス（１匹を除く）が、小〜中程度の局所的な病変を有していた。５匹は正常な尾を有しており、１匹は尾の根元に小さい病変を有しており、２匹は尾を失くしてしまっており、後足底（rear footpads）に病変を有していた。
【００８９】
ＥＦＤ処理群では、全てのマウスが小〜中程度の局所的な病変を有していた。７匹は尾を有しており、２匹は尾の根元に小さい病変を有しており、１匹は尾を失くしてしまっており、両方の後足底に病変を有していた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ノンヒーラーマウス）のＰＢＳ処理群とＥＦＤ処理群との間で差異は観察されなかった（同様の病変）。ＰＢＳを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）及びＥＦＤを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）の間で差異は観察されなかった（全てのマウスで病変なし）。
【００９０】
ＥＦＤ処理がマウスをリーシュマニア・メジャー感染に対して感作させないことを示すこれらの結果により、ＥＦＤが病原体感染を妨害しないことが示される。
ｃ）ナイセリアワクチン接種
１つの群のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｌ中１００μｇのＥＦＤで皮下的に処理し、２つの他の群には１００μｌのＰＢＳを投与した（１群当たりのマウス数ｎ＝６）。２１日後、ＥＦＤ処理群及びＰＢＳ処理群のうちの１群に、熱により死滅したナイセリア・メニンジティディス（Nesseiria meningitidis）をワクチン接種した（１週間間隔で３回投与）。ＰＢＳを注射したマウスの２つ目の群にはワクチン接種しなかった（対照）。最後のワクチン注射の２週間後、ワクチン接種したマウス及びワクチン接種していないマウスに１０７ＣＦＵの病原性ナイセリア・メニンジティディスを負荷（ｉｐ）し、負荷の２時間後、６時間後及び２４時間後に血中の細菌を測定した。ＥＦＤ処理により、ワクチン接種の保護効果は変化しなかった（図３１）。
ｄ）インフルエンザウイルス感染
１つの群のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｌ中１００μｇのＥＦＤで皮下的に処理し、他の群には、１００μｌのＰＢＳを投与した。２１日後、両方の群をインフルエンザウイルススコットランドＡ株（５０００ｐｆｕ）に鼻腔内感染させ、マウスの臨床症状及び生存しているマウスの数を１４日間１日１回記録した。ＥＦＤ処理群とＰＢＳ処理群との間で差異は見出されず（図３２）、ＥＦＤ処理によりインフルエンザウイルス感染の経過が変化しないことが示された。
【００９１】
これらのデータにより、その免疫調節効果にもかかわらず、ＥＦＤ ＢＣＧが、モルモットにおいてマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マウスにおいてナイセリア・メニンジティディスに対するワクチン（それぞれ、Ｔｈ１に媒介される免疫応答及びＴｈ２に媒介される免疫応答を誘導する感染）によりもたらされる保護を弱力化することもなく、モルモットにおけるマイコバクテリウム・ツベルクローシス感染、及びマウスにおけるインフルエンザウイルス感染又はリーシュマニア・メジャー感染を悪化させることもなかったことが実証される。したがって、ＥＦＤ ＢＣＧは、２つの動物種において、種々のマウス株において、及び高用量で投与した場合に、測定可能な程度の有害作用を何ら引き起こさない。
実施例１〜実施例５からの結論
本研究により、ＥＦＤ ＢＣＧが３つの相異なるマウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化の発症に対する保護効果を発揮することが実証される。ＥＦＤ ＢＣＧにより、以下のことが同時に誘発された：１）ＩＬ−１０産生及びＴｒｅｇの増殖を介した免疫調節効果、２）ＮＦ−κＢ活性化の阻害、並びに３）ＰＰＡＲ−αレベルの変化を伴わないＰＰＡＲ−γの増大。ＥＦＤ ＢＣＧは、本研究において測定可能な程度の副作用を有さず、また、その免疫調節活性にもかかわらず、Ｔｈ１免疫応答及びＴｈ２免疫応答を生じるワクチンによりもたらされる保護を弱力化することもなく、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染を悪化させることもなかった。
【００９２】
全てのモデルにおいて、ＥＦＤ ＢＣＧにより、アテローム硬化性病変の大きさが有意に低減し、ＩＬ−１０産生が有意に誘導された。さらに、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて、ＥＦＤ ＢＣＧ処理により、注射直後に、流入領域リンパ節における形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及びＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの数が増大した。実験の終了時に、脾臓におけるＴｒｅｇの蓄積、炎症促進性サイトカインの血清レベルの減少、ＮＦ−κＢの低減、並びに脾臓核抽出物及び血管核抽出物におけるＰＰＡＲ−γの発現の増大が、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて観察された。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおけるＩＬ−１０の血清レベルの上昇は、ＩＬ−１０の活性化を統制する転写因子（ＳＰ−１及びｐ−ＳＴＡＴ５ｂ）の脾臓抽出物における発現の増大を伴い、ＩＬ−１０がアテローム保護（atheroprotection）を媒介するという考えを支持した。ＩＬ−１０シグナル伝達を増強することに加えて、Ｌｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＥＦＤ ＢＣＧでの長期的処理は、本発明者らが試験した炎症性サイトカインのほとんど（ＩＦＮ−γを除く）を減少させた。Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて同時に起こる核内ＮＦ−κＢの低減、及びリン酸化型ＲＸＲ−αレベルの低減を伴うＰＰＡＲγの増大により、ＥＦＤ ＢＣＧが炎症状態を強く阻止することが示唆される。転写因子及びサイトカインの発現プロファイルは、ＩＬ−１３のより低い血清レベル、及び脾臓中のＧＡＴＡ３及びｐ−ＳＴＡＴ−６の減少により証明されるように、ＥＦＤ ＢＣＧによるＴｈ２分化の下方調節を反映していた。Ｔｈ１系列（arm）に関しては、パターンはあまり明らかではなかった。実際、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ｌｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏＥ−／−マウスの血清中においてＴｈ１サイトカインのシグネチャーであるＩＦＮ−γのより高いレベルが誘起され、脾臓細胞抽出物中において、Ｔｈ１の発生の重要な転写因子であるＴ−ｂｅｔの発現が増強された。しかしながら、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ｔｈ１細胞の発生を調節する別の重要な因子であるＳＴＡＴ−４のリン酸化が低下した。ｐ−ＳＴＡＴ−４は近年、Ｔｒｅｇの発生を損なうことが示されているため、ＥＦＤ ＢＣＧにより誘導されるｐ−ＳＴＡＴ−４の低減は、本研究において、Ｔｒｅｇの増殖に利益をもたらした可能性がある。最後に、Ｔｈ１７細胞の役割を、Ｔｈ１７細胞の発生を統制する転写因子であるＲＯＲγｔを研究することにより検証した。ＲＯＲγｔのレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理後にＬｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏｅ−／−マウスにおいてより低く、Ａｐｏｅ−／−マウスモデルではＩＬ−１７のレベルの減少を伴っていた。Ｔｈ１７の低減及びより強いＴｒｅｇプロファイルと関連する、免疫のＴｈ１系列の部分的な変調は、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおいてマイコバクテリウム・ツベルクローシス及びナイセリア・メニンジティディスに対する免疫防御が変化しなかったことにより裏付けられるように、宿主の効率的な免疫能を維持しながらアテローム性動脈硬化を防ぐのに十分なものであり得る。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおける全身的炎症プロファイルの変調は、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、病変におけるＭＯＭＡ＋マクロファージの局所的な蓄積の低減とも関連していた（図２３Ｂ、図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。ＥＦＤ ＢＣＧによる免疫化後には、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する反応性（Ｔｈ１に媒介される保護）又はナイセリア・メニンジティディスに対する反応性（Ｔｈ２に媒介される保護）により評価されたように、免疫抑制の痕跡は観察されなかった。ＥＦＤ ＢＣＧ処理後における感染に対する免疫能の維持により、ＥＦＤ ＢＣＧがヒトにおいて耐容性を有する治療剤であることが示唆された。最後に、ＥＦＤ ＢＣＧはＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−αの活性化を誘導しないが、これは１つの利点であり、臨床的使用に関するその可能性を裏付ける。結論として、ＥＦＤ ＢＣＧは、アテローム性動脈硬化の予防及び治療のための、免疫治療用調製物としての有望な候補である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（Extended Freeze Drying）（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis：ウシ型結核菌）ＢＣＧの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は、数十年かけて進行する複雑な慢性の炎症プロセスである。アテローム性動脈硬化は、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の蓄積、細胞死の増大、及び動脈壁の肥大性の変性を特徴とし、チャネルの狭窄を引き起こすことにより血流が損なわれる。アテローム性動脈硬化は、身体のいずれの領域においても発症する可能性があるが、心臓、脳又は脳に通じる血管において発症する場合、最も重要である。狭窄は、動脈の内壁における粥腫（盛り上がった斑部）の形成に起因する。これらの粥腫は、低密度リポタンパク質、崩壊する筋肉細胞、線維組織、血小板の凝集物、コレステロール、マクロファージ、Ｔリンパ球、及び時としてカルシウムからなる。粥腫は、乱流の血流の領域において形成される傾向があり、血流中に高濃度のコレステロールを有する者において見出されることが最も多い。粥腫の数及び厚みは年齢とともに増大し、血管内面の円滑さの喪失を引き起こし、血栓（血餅）の形成を促進する。時には、血栓の断片が裂けて塞栓を形成し、これが血流中を移動し、より小さな血管を封鎖する。
【０００３】
アテローム性動脈硬化及びその臨床病態は、男性及び女性の両方において罹患及び死亡の主因である。冠動脈（冠動脈心疾患）を含むアテローム硬化性心疾患は、全ての死の３分の１を占める最も一般的な死因である。脳への血液供給に対するアテローム硬化性の障害（脳卒中）は、がんに続く３番目に一般的な死因である。血管不全は、他の主幹動脈（例えば腎臓、下肢及び腸への）における血液の流れを低減させることにより多数の重度の疾病を引き起こすアテローム性動脈硬化の別の臨床病態である。
【０００４】
残念なことに、アテローム性動脈硬化は、動脈に対する損傷が血流を制限するほどに重篤となるまで症状を生じない。アテローム性動脈硬化に起因する心筋への血流の制限により、狭心症又は心筋梗塞（心発作）が引き起こされる可能性がある。下肢の筋肉への血流の制限により、間欠性跛行（歩行により引き起こされ、休息により軽減される下肢の疼痛）が引き起こされる。脳に血液を供給する動脈の狭窄により、一過性の虚血性発作（２４時間未満持続する脳卒中の症状及び徴候）及び眩暈のエピソード、又は最終的には脳卒中それ自体が引き起こされる可能性がある。
【０００５】
アテローム性動脈硬化に関する現在の薬剤的処置としては、幾つかの薬剤、例えばスタチン系薬剤（ロスバスタチン）及びフィブラート系薬剤の使用が挙げられる。二次的な凝固及び塞栓形成を最小限に抑えようとする際に使用される抗凝血薬以外では、血管拡張薬は症状軽減をもたらすが、治癒的な価値はない。薬剤的処置に応答しないものに対して、又は或る特定の高リスク状況においては外科的処置が利用可能である。バルーン血管形成術は、狭くなった血管を拡張し、血液供給の改善を促進することができる。心臓への血液供給を冠動脈バイパス外科処置により回復させることもできる。大型アテローム性閉塞及び石灰化動脈閉塞を、動脈内膜切除術により除去することができ、疾患状態にある末梢血管部分全体を、織ったプラスチック管の移植片に置き換えることができる。
【０００６】
アテローム性動脈硬化の発病は、炎症、自己免疫及び組織特異的変性の複雑な相互作用を伴う。
【０００７】
アテローム性動脈硬化に関する多数のリスク因子としては、高血圧、喫煙、真性糖尿病、脂質異常症（高コレステロール血症）、メタボリック・シンドローム、肥満、虚血、男性であること、年齢、心疾患の家族歴、及びセデンタリー・ライフスタイルが挙げられる。
【０００８】
因子が何であっても、結果として起こる動脈内膜の慢性炎症が、アテローム性動脈硬化の発症の主要な原動力である。アテローム性動脈硬化に関与する主要な細胞プロセスは、ケモカインを放出する内皮細胞の活性化を含む。酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、炎症細胞の動員及び浸潤を助ける糖タンパク質接着分子（血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、細胞内細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）及びＥ−セレクチン）を発現する内皮細胞の活性化を誘導する。内皮との結合後、白血球が内膜中に浸潤する。そこで、単球がマクロファージに分化し、マクロファージが酸化ＬＤＬからコレステロールを捕捉することにより泡沫細胞となる。結果として起こる動脈壁上への脂肪線条の蓄積の後に、進行性アテローム硬化性病変の形成が起こる。血管平滑筋細胞は増殖し、病変に向かって移動する。それらの動員の際、血管平滑筋細胞は、脂質アテローム上に線維性粥腫を形成する細胞外マトリクスを分泌する。最終的に、不安定な粥腫が、進行する慢性炎症の結果として崩壊することがある。結果として生じる血栓は、急性の冠動脈事象、例えば心筋梗塞及び脳卒中に関与する。
【０００９】
ＮＦ−κＢはアテローム硬化性病変における炎症応答の活性化と関連する関連マーカーであり（非特許文献１）、ＰＰＡＲ−γシグナル伝達は炎症性サイトカインの産生を阻害する（非特許文献２）。Ｉ−κＢのリン酸化により、この疾患プロセスにおいて一定の役割を果たすＮＦ−κＢが活性化される。しかしながら、ＮＦ−κＢの活性化がアテローム性動脈硬化に必要であるという直接的な証拠は存在しない（非特許文献３）。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路はレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）をリン酸化するが、非リン酸化型のＲＸＲαは、ＰＰＡＲγとともにヘテロ二量体を形成し、炎症を相乗的に低減させる（非特許文献４）。
【００１０】
炎症を標的にすることは、アテローム性動脈硬化に対する治療を開発するためのアプローチである。抗炎症薬の中には、アテローム形成の主要段階における心保護効果を発揮することが示されたものがある。チアゾリンジオンは、２型糖尿病の治療のために臨床的に使用されているペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γアゴニストである。ＰＰＡＲγは、アテローム性動脈硬化に寄与する多数の細胞プロセスを調節する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの動物モデル及び臨床研究により、チアゾリンジオンが、内皮の機能不全を是正し、慢性の炎症プロセスを抑制し、脂肪線条形成を低減させ、粥腫発生及び血管壁肥厚化を遅延させ、粥腫安定化を増強することが示されている。したがってチアゾリンジオンは、２型糖尿病を有する患者においてアテローム性動脈硬化に関連するグルコースレベル及び長期的な心血管リスクの両方を改善させることができる抗炎症性抗トロンビン（antithrombic）剤としての可能性を示す（非特許文献５）。しかしながら、ＰＰＡＲ−γアゴニスト（心血管疾患のリスクが高い糖尿病患者においてインスリン増感剤として使用される）とＰＰＡＲ−αアゴニスト（脂質異常症を治療するために使用される）との組合せにより、ＡｐｏＥ−／−においてアテローム性動脈硬化が増強され（非特許文献６）、ヒトにおいて主要な心血管の有害事象が誘導された（非特許文献７）。
【００１１】
最近になって、免疫系がアテローム形成プロセスを変調させる主要な因子であることを示唆する証拠が増大している（概説に関しては、非特許文献８を参照されたい）。アテローム硬化性病変におけるほとんどの炎症細胞がマクロファージであるが、該細胞の多くて２０％がＴリンパ球である（非特許文献９）。この疾患プロセスは、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方により標的化される修飾型自己抗原（酸化ＬＤＬ、ＨＳＰ、アポトーシス性断片）の局所的な形成と関連する。これらの自己免疫応答は、酸化ＬＤＬ及び死滅する細胞由来の潜在的に有害な残りの産物の除去を容易にする有益な効果を有する可能性がある。しかしながら、保護的な自己免疫と疾患促進性の自己免疫との間の均衡が失われると、自己免疫系は破壊的な炎症促進性プロセスに向かって加速することになり、粥腫の成長及び不安定化が引き起こされる。これらの観察結果は、粥腫抗原に対する免疫応答の変調に基づく、アテローム性動脈硬化に対する新たな治療の開発の可能性を指摘している。
【００１２】
動物研究により、酸化ＬＤＬに存在する抗原に基づくワクチンにより粥腫抗原に対する免疫応答を変調させることによってアテローム性動脈硬化の発症を阻止することが可能であるという原理の証明の裏付けが提示された。しかしながら、酸化ＬＤＬは、標準化するのが困難な抗原組成物を有する複雑な粒子であるため、また、酸化ＬＤＬは潜在的に、有害な抗原を含有する可能性もあるため、酸化ＬＤＬそれ自体は理想的なワクチン成分ではない。したがって、ここ数年にわたり、相当な努力が、アテローム保護性免疫を誘導する酸化ＬＤＬ中の正確な抗原を特徴付けることに費やされてきた。酸化ＬＤＬにおいて以下の２つの抗原が同定された：酸化リン脂質（ホスホリルコリン）及びアポＢ−１００ペプチド（非特許文献１０）。ホスホリルコリンに基づくワクチン及びアポＢペプチドに基づくワクチンの両方に伴う制約は、作用メカニズムがあまり理解されていないことである。酸化リン脂質は、その発現の調節があまり理解されておらず、老化細胞及び細胞屑と関連する自己抗原と交差反応する、自然抗体と称されるＩｇＭのサブクラスにより認識される。高い特異性及び標準化したワクチン調製物を産生する可能性は、アポＢペプチドに基づくワクチンの幾つかの利点であり、現在ヒトワクチンが前臨床開発中である。このアプローチに伴う欠点としては、治療前に患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子型判定を行う必要があること、及びＨＬＡ型に応じてワクチンを個人に合わせる必要があるというリスクが挙げられる。
【００１３】
しかしながらこれまで、アポＢペプチドに基づくワクチンの他には、免疫系を標的にする他の治療的アプローチは、アテローム性動脈硬化の治療に対しては開発されていない。
【００１４】
身体が自己免疫応答の活性を制御するためには複数の方法が存在し、そのうち重要な方法の１つは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。Ｔｒｅｇの複数のサブタイプが同定されている。天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、胸腺において発生し、その後末梢組織に入り、該組織において該Ｔｒｅｇは全Ｔ細胞の５％〜１０％を構成する。天然Ｔｒｅｇとは対照的に、ＩＬ−１０を産生する１型調節性Ｔ細胞（Ｔｒ１）及びＴＧＦ−βを産生する３型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ３）は、樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示及び活性化の後に、末梢においてナイーブＴ細胞から生成される。複数の証拠が、Ｔｒｅｇの機能の調節不全がアテローム性動脈硬化に関係するとしている。アテローム性動脈硬化におけるＴｒｅｇの保護的役割に関する機能的な証拠も蓄積されている。ＣＤ８０／８６、ＣＤ２８又はＩＣＯＳの欠失、及び抗ＣＤ２５抗体処理を介した天然Ｔｒｅｇの除去により、粥腫形成が顕著に増大する（非特許文献１１、非特許文献１２）。同様に、ＴＧＦ−βに関するＴ細胞受容体の欠失を介したＴｈ３細胞の阻害により、疾患の進行が顕著に増強される（非特許文献１３）が、その同種（cognate）抗原とともにオボアルブミン特異的なＴｒ１細胞のクローンを投与することにより、アポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウスにおいて粥腫の発達が阻害された（非特許文献１４）。しかしながら、アテローム性動脈硬化における調節性Ｔ細胞の役割の理解は、依然として非常に不完全である。
【００１５】
これらの知見は、免疫調節経路が誘起されて、炎症を低減させ、アテローム性動脈硬化を治療又は予防し得る可能性を提起した。興味深いことに、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）ワクチン接種が乳児におけるアトピーの発症を防ぐことが示され、ＢＣＧが免疫応答の調節不全を予防することができることが示唆された（非特許文献１５）。抗炎症治療としての生きたＢＣＧの実現不可能な送達を回避するために、ＢＣＧを長期凍結乾燥により死滅させ（ＥＦＤ ＢＣＧ又はＥＦＤ）、それがアレルギー（喘息、ＰＣＴの国際出願の特許文献１、非特許文献１６、非特許文献１７）及び腸の炎症性疾患（炎症性腸疾患、ＰＣＴの国際出願の特許文献２）に関する複数の動物モデルにおいて強力な抗炎症剤であることが示された。ＥＦＤは、生きたＢＣＧ又は熱により死滅したＢＣＧと関連する毒性の副作用を引き起こさず、ＤＴＨ皮膚試験による結核の診断を妨害しない。ＥＦＤは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴ−ｂｅｔが関連するＴｈ１シグナル伝達経路だけでなく、ＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＧＡＴＡ−３が関連するＴｈ２シグナル伝達経路、並びにＩＬ−１７及びＰＰＡＲ−γが関連すると考えられる新たなシグナル伝達経路にも作用するという独自の特性を有する（ＰＣＴの国際出願の特許文献２）。アレルギー及び腸の炎症性疾患の症状に対するＥＦＤの保護／治癒効果は、ＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性細胞の刺激と関連する（ＰＣＴの国際出願の特許文献１及び特許文献２）。
【００１６】
しかしながら、アテローム性動脈硬化等の自己免疫疾患を治療するための調節性Ｔ細胞刺激因子の使用と関連し得る主要な副作用が存在する（非特許文献８）。調節性Ｔ細胞が過度に抑制的であり、免疫抑制が罹患した組織に限定されない場合、感染に対する防御、及びＣＤ８ Ｔ細胞依存性の腫瘍細胞サーベイランスが損なわれるというリスクが存在する。例えば、週１回注射した場合、麻疹ウイルス由来のウイルスの核タンパク質が、マウスにおいてアテローム性動脈硬化を低減させることが示されている（非特許文献１８）。しかしながら、この核タンパク質により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激に対してＩＬ−１０を分泌する抑制性Ｔｒｅｇの発生が誘起され、マウスへのその投与により、Ｔ細胞によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γの産生が低減し、この麻疹核タンパク質処理が免疫抑制的である可能性があることが示唆された。
【００１７】
本発明者らにより、以下の３つの相異なるマウスモデルにおいてＥＦＤ ＢＣＧがアテローム性動脈硬化を低減させることが実証された：１）３０週で進行性のアテローム性動脈硬化病変を自発的に発症するアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウス、２）高脂肪食（hyperlipidemic diet）によりアテローム性動脈硬化を発症する低密度リポタンパク質受容体欠損（Ｌｄｌｒ−／−）マウス、及び３）Ｔ細胞上に機能的ＴＧＦ−β受容体を欠き、１２週でアテローム性動脈硬化病変を自発的に発症するＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。
【００１８】
ＥＦＤ ＢＣＧにより、標的化された遺伝子及びＴＧＦ−βシグナル伝達とは関係なく、３つのアテローム性動脈硬化誘発性（prone）マウスモデルにおいてアテローム硬化性病変の大きさが有意に低減した。
【００１９】
ＥＦＤ ＢＣＧにより、以下のことが同時に誘発された：１）ＩＬ−１０産生及びＴｒｅｇの増殖を介した免疫調節効果、２）ＮＦ−κＢ活性化の阻害、並びに３）ＰＰＡＲ−αレベルの変化を伴わないＰＰＡＲ−γの増大。
【００２０】
このＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−α活性化を誘導しないが、これは１つの利点であり、臨床的使用に関するその可能性を裏付ける。
【００２１】
予期せぬことに、その免疫調節活性にもかかわらず、ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔｈ１免疫応答及びＴｈ２免疫応答を起こすワクチン（ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）、ＢＣＧ）によりもたらされる保護を弱力化せず、病原体感染（ウイルス（インフルエンザウイルス）、細菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（M. tuberculosis：ヒト型結核菌））又は寄生虫（リーシュマニア・メジャー（Leishmania major）））の経過も悪化させなかった。宿主の効率的な免疫能の維持により、ＥＦＤ ＢＣＧがヒトにおいて耐容性を有する治療剤であることが示唆される。
【００２２】
ＥＦＤ ＢＣＧに応答して、免疫抑制の徴候を有しない免疫調節プロファイルが誘導される。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおける全身的炎症プロファイルの変調は、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、粥腫におけるＭＯＭＡ＋マクロファージの局所的な蓄積の低減とも関連した。
【００２３】
さらに、ＥＦＤ ＢＣＧは本研究において、測定可能な程度の副作用を有しなかった。
【００２４】
これらの結果により、ＥＦＤがアテローム性動脈硬化の予防及び治療のための新たな治療アプローチであることが示される。ＥＦＤは、長い活性持続時間（少なくとも２ヶ月）を有すると予想される。したがって、ＥＦＤは、１日１回の繰り返しの投与を必要とする現在使用されている薬剤と比較して、投与の回数が非常に限られるという利点を有する。加えて、ＥＦＤ治療は、免疫抑制を誘導しないため、安全である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第０３／０４９７５２号
【特許文献２】国際公開第２００７／０７２２３０号
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Bank et al., J. Clin. Invest., 1996, 97, 1715-1722
【非特許文献２】Jiang et al., Nature, 1998, 391, 82-86
【非特許文献３】T. Collins and M.I Cybulsky, J. Clinical Investigation, 2001, 107, 255-262
【非特許文献４】Yamazaki et al., Gut, 2007, 56, 1557-1563
【非特許文献５】B. Staels, Current Medical Research and Opinion, 2005, 21, suppl 1, S13-S20
【非特許文献６】Calkin et al., Atherosclerosis, 2007, 195, 17-22
【非特許文献７】Nissen et al., JAMA, 2005, 294, 2581-2586
【非特許文献８】Nilsson, J. and G.K. Hanson, Journal of Internal Medecine, 2008, 263, 464-478
【非特許文献９】Hansson, G.K., N. Engl. J. Med., 2005, 352, 1685-1695
【非特許文献１０】Klingenberg et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2010, 30, 946-952
【非特許文献１１】Ait-Oufella et al., Nat. Med., 2006, 12, 178-180
【非特許文献１２】Gotsman et al., Circulation, 2006, 114, 2047-2055
【非特許文献１３】Roberson et al., J. Clin. Invest., 2003, 112, 1342-1350
【非特許文献１４】Mallat et al., Circulation, 2003, 108, 1232-1237
【非特許文献１５】Shirakawa et al., Science, 1997, 275, 77-79
【非特許文献１６】Lagranderie et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2008, 121, 471-478
【非特許文献１７】Lagranderie et al., The Journal of Immunology, 2010, 184, 1062-1070
【非特許文献１８】Ait-Oufella et al., Circulation, 2007, 116, 1707-1713
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌の使用に関する。
【００２８】
本発明との関連で使用される場合、「ＥＦＤ」、「ＥＦＤ ＢＣＧ」又は「長期凍結乾燥したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ」という表現は、換言すれば、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を表す。本発明との関連では、「変性していない」は、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌分子の構造、特に高分子（タンパク質、多糖、脂質）の一次構造が保存されていることを意味する。好ましくは、タンパク質の一次構造が保存されている。ＥＦＤ中で保存されているタンパク質の一例は、Ａｐａであり、これは、生きたＢＣＧから抽出されるタンパク質と同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の移動特徴を有する（Laqueyrerie et al., Infect. Immun., 1995, 63, 4003-4010）。ＥＦＤは、長期凍結乾燥、又はその高分子成分の構造を保存しながら細菌を死滅させる任意の他のプロセスにより調製することができる。好ましくは、かかるプロセスにより、細菌細胞由来の高分子の一次構造が保存される。ＥＦＤを調製するのに使用することができるこれらのプロセスは、当業者に既知であり、物理的手段、例えば長期凍結乾燥、シリカ又はジルコニウムビーズの存在下での粉砕等の使用、いわゆる「フレンチプレス」及び超音波処理の使用を含む。
【００２９】
上で記載されるようなＥＦＤの画分は、本発明の「ＥＦＤ」という表現に包含される。この画分は、以下からなる群において選択される：グリコシダーゼによるＥＦＤの処理の残留物（脱グリコシル化残留物）、ＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅによるＥＦＤの消化の残留物、プロテアーゼによるＥＦＤの処理の残留物、順番にグリコシダーゼ、ＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅ並びに最後にプロテアーゼによるＥＦＤの処理の残留物、並びにプロテアーゼ（例えばスブチリシン（subtilisin）等）及びＤＮａｓｅによる上記ＥＦＤの処理の残留物。
【００３０】
本発明の好ましい１つの実施の形態によれば、ＥＦＤは、１．５％未満の水、好ましくは１％未満の水、より好ましくは０．５％未満の水を含有する、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌からなる。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施の形態によれば、ＥＦＤを、参照により本明細書に援用されるＰＣＴの国際出願の特許文献１に記載されるような方法であって、（ｉ）生きた細菌細胞の培養物を回収する工程と、（ｉｉ）水中で又は塩の水溶液中で該細菌細胞を凍結する工程と、（ｉｉｉ）該凍結した細菌細胞を、凍結乾燥器中で少なくとも９８．５％の水、好ましくは少なくとも９９％の水、より好ましくは少なくとも９９．５％の水を除去するのに十分な時間該細胞を乾燥させることによりを死滅させる工程と、（ｉｖ）長期凍結乾燥した死滅した細菌細胞を回収する工程とを含む、方法により調製する。必要に応じて、水中で又は塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄する工程を、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間に導入することができる。
【００３２】
ＥＦＤの全ての画分が、水又は任意の親水性溶媒中に長期凍結乾燥した細菌を再懸濁すること、及び処理を適用することにより得られる。貯蔵を容易にするために、古典的な凍結乾燥を、画分に対して後で適用することもできる。
【００３３】
本発明の別の有利な実施の形態によれば、上記ＥＦＤが、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤及び／又は免疫刺激剤及び／又はアジュバントを更に含む、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための医薬品組成物中に含まれる。
【００３４】
当業者に既知の任意の好適な担体を、本発明の医薬品組成物に利用することができ、該担体の種類は投与様式に応じて異なる。非経口投与、例えば皮下注射に関しては、担体は好ましくは、水、食塩水緩衝剤、ラクトース、マンニトール、グルタメート、脂肪又はワックスを含み、注射可能な医薬品組成物は好ましくは等張溶液（およそ３００ミリオスモル〜３２０ミリオスモル）である。経口投与に関しては、上記の担体、又は固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（talcum）、セルロース、グルコース、スクロース及び炭酸マグネシウムのいずれかを、利用することができる。生分解性の微粒子（例えばポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））を、本発明の医薬品組成物のための担体として利用することもできる。例えば米国特許第４，８９７，２６８号及び同第５，０７５，１０９号において、好適な生分解性の微粒子が開示されている。抗凝集剤、抗酸化剤、色素、香味増強剤、又は平滑化剤、集合化（assembling）剤若しくは分離（isolating）剤の中から、包括的には薬学産業において従来から使用されている任意の添加物の中から添加剤を選択することができる。様々なアジュバント／免疫刺激剤のいずれかを、免疫応答を増強するために本発明の組成物において利用することができる。ほとんどのアジュバントが、急速な異化から抗原を保護するように又は制御された炎症反応を生み出すように設計された物質、例えば水酸化アルミニウム、及び免疫応答の非特異的な刺激因子を含有する。ヒト投与のための好適なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、生分解性の微粒子、モノホスホリルＡ及びＱｕｉｌ Ａとして市販されている。
【００３５】
医薬品組成物は、経口投与に好適な形態であり得る。例えば、組成物は、経口投与のための錠剤、通常のカプセル、ゼラチンカプセル又はシロップの形態である。これらのゼラチンカプセル、通常のカプセル、及び錠剤形態は、医薬品製剤中において従来から使用されている添加物、例えばアジュバント、又は結着剤、例えばデンプン、ガム及びゼラチン、アジュバント、例えばリン酸カルシウム、崩壊剤、例えばコーンスターチ若しくはアルギン酸（alginic acids）、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、甘味料、又は香料を含有していてもよい。溶液又は懸濁液を、薬理学的に適合性を有する溶媒の添加により、水性媒体又は非水性媒体中で調製することができる。これらは、グリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリグリコールエーテル、ＤＭＳＯ及びエタノールを含む。
【００３６】
一般的に、組成物を、非経口注射（例えば皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射又は皮下注射）により、鼻腔内に（例えば吸引又は噴霧により）、経口的に、舌下に、又は局所的に、皮膚を介して、又は直腸上皮を介して投与することができる。
【００３７】
本発明の組成物中に存在するＥＦＤの量は、治療上の有効量である。ＥＦＤの治療上の有効量は、ＥＦＤが、組成物が投与される被験体において過度の負の効果を引き起こすことなくアテローム性動脈硬化の徴候を低減させるその役割を果たすために必要な量である。使用されるＥＦＤ及び投与される組成物の正確な量は、治療対象の種（ヒト、動物）、被験体の種類（アテローム性動脈硬化のリスクを有する被験体、例えば脂質異常症の被験体、メタボリック・シンドロームの被験体、２型糖尿病の被験体）、投与様式、投与頻度、並びに組成物中の他の成分等の因子に応じて変化する。
【００３８】
好ましくは、組成物は、約１０μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１００μｇ〜約１ｍｇのＥＦＤを含む。「約」は、僅かに低い又は高い量のＥＦＤを使用することができることを意味する。
【００３９】
例えば、非経口投与、例えば皮下注射に関しては、治療対象の個体を、１週間毎、１ヶ月毎又は３ヶ月毎〜６ヶ月毎に約１０μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１００μｇ〜約１ｍｇ、例えば１００μｇのＥＦＤという１用量スケジュール（a 1 dose schedule）に供することができる。
【００４０】
組成物を、アテローム性動脈硬化と過去に診断された患者、アテローム性動脈硬化のリスクが高い患者、若しくは黄色腫を呈する患者、特に黄色板腫を呈する患者においてアテローム性動脈硬化を予防するために、又はアテローム性動脈硬化のエピソードの開始時の患者においてアテローム性動脈硬化を治癒させるために使用することができる。
【００４１】
本発明は、アテローム性動脈硬化の予防及び／又は治療における同時、別々又は連続の使用のための組合せ調製物としての、本発明に規定されるようなＥＦＤ又はその画分と、該第１の製品と異なる第２の製品であって、抗炎症薬及び免疫変調薬（例えばアセチルサリチル酸又はチアゾリジンジオン（グリタゾン））からなる群から選択される、第２の製品とを含有する製品にも関する。
【００４２】
本発明は、上で規定されるような、アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための薬物の製造のための、長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌の使用にも関する。
【００４３】
本発明は、上で規定されるような、アテローム性動脈硬化に罹患している又はそれにかかりやすい患者に対する有効量のＥＦＤ含有組成物の投与を含む、アテローム性動脈硬化を予防又は治療する方法にも関する。
【００４４】
マウスのアテローム性動脈硬化の３つの実験モデルにおけるＥＦＤ処理によるアテローム性動脈硬化の予防及び治療を例示する実施例に言及する以下の更なる記載及び図面により、本発明を更に例示する。しかしながら、これらの実施例が本発明の例示の目的でのみ提示され、その限定を決して構成しないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図３】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ＳＣ；ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカイン及びケモカインを示す図である。
【図４】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳで処理したマウスと比較した、皮下注射（ＳＣ）による１００μｇのＥＦＤで２ヶ月に１回、計３回処理したＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓細胞核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ（白色のバー）及びＰＰＡＲ−γ（ストライプを付したバー）の結合。１群当たりのマウス数ｎ＝６。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後のＮＦκＢの転位の減少、及びＰＰＡＲγの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有する。
【図５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図６】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図７】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカインを示す図である。
【図８】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３及びＦｏｘｐ３に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の２つの脾細胞抽出物に関する３つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇのシグネチャー）を増大させること、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３（それぞれＴｈ１７及びＴｈ２のシグネチャー）を減少させることにより、免疫調節応答を開始する。
【図９】ＥＦＤ ＢＣＧが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳで処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較した、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓細胞核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ（白色のバー）及びＰＰＡＲ−γ（ストライプを付したバー）の結合。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後のＮＦκＢの転位の減少により証明されるように、抗炎症効果を有する。
【図１０】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて免疫調節プロファイルが誘導されたことを示す図である。マウスに６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。（Ａ）３０週齢でのＰＢＳで処理したマウス（ｎ＝６）又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス（ｎ＝６）の脾臓中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋リンパ球の絶対数（フローサイトメトリーにより解析した）。（Ｂ）個々のＰＢＳで処理したマウス（ｎ＝６）又はＥＦＤで処理したマウス（ｎ＝６）の脾臓核抽出物中におけるＳＰ−１の結合。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。ＳＰ−１転写因子のより高い発現は、ＥＦＤで処理したマウスの血清中に見出されるＩＬ−１０のより高い産生（図５）と相関する。これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１を活性化することにより免疫調節応答を開始することが示される。ＥＦＤで処理したマウスは、ＰＢＳで処理したマウスより有意に多数のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を有していた。
【図１１】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。ＴＧＦ−βが、ＰＢＳで処理したマウス（黒色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したＡｐｏＥ−／−マウス（灰色のバー）の個々の血清試料中で増大した。＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。サイトカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で増大した。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１３】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清中の炎症性サイトカイン及び炎症性ケモカインのレベルが変化することを示す図である。サイトカイン及びケモカインが、ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で低減する。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊：Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ≦０．０１、＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図１４】ＰＢＳで処理したマウス（白色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（ストライプを付したバー）の個々の血清試料中で変化しないままであるサイトカイン及びケモカインを示す図である。
【図１５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて血清サイトカインレベルが変化し、免疫変調プロファイルが誘導されることを示す図である。ＴＧＦ−βレベルが、ＰＢＳで処理したマウス（黒色のバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）と比較して、皮下注射による１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したＬｄｌｒ−／−マウス（灰色のバー）の個々の血清試料中で僅かに増大した。
【図１６】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳ（白色のバー）又はＥＦＤ ＢＣＧ（ストライプを付したバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）で月１回、計６回処理したマウスの、３匹のマウスの２つのプール由来の血管組織（Ａ）及び個々の脾臓（Ｂ）の核抽出物中の特定のＤＮＡモチーフとのＮＦ−κＢ及びＰＰＡＲ−γの結合。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＰＢＳと比較したＥＦＤ ＢＣＧ処理後の両方の器官におけるＮＦκＢの転位の減少、及びＰＰＡＲγの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有する。（Ｂ）にＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊：Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ≦０．０１。３つの試料の２つのプールを（Ａ）に示したが、統計解析は行わなかった。
【図１７】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。非リン酸化型及びリン酸化型のＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−５ｂ及びＳＴＡＴ−６に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の３つの脾細胞抽出物の２つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＳＴＡＴのリン酸化はその活性化を反映するものであった。ＥＦＤ ＢＣＧは、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４及びＳＴＡＴ−６のリン酸化の減少により証明されるように、抗炎症効果を有する。ＥＦＤ ＢＣＧは、ｐ−ＳＴＡＴ−５ｂの活性化により証明されるように、免疫調節応答を開始する。
【図１８】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける炎症及び免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。非リン酸化型及びリン酸化型のＲＸＲ−α；ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３及びＦｏｘｐ３に関してウェスタンブロットにより解析した、ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで月１回、計６回処理したマウス（１群当たりのマウス数ｎ＝６）由来の３つの脾細胞抽出物の２つのプール。β−アクチンを内部対照として使用した。ＥＦＤ ＢＣＧは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇのシグネチャー）を増大させること、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３（それぞれＴｈ１７及びＴｈ２のシグネチャー）を減少させることにより、免疫調節応答を開始する。ＥＦＤ ＢＣＧはまた、ＲＸＲ−αのリン酸化の減少により証明されるように抗炎症効果を有する。
【図１９】ＥＦＤ ＢＣＧが、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける免疫調節と関連する主要な転写因子の活性化に影響を及ぼすことを示す図である。ＰＢＳ（白色のバー）又はＥＦＤ ＢＣＧ（ストライプを付したバー；１群当たりのマウス数ｎ＝６）で月１回、計６回処理したマウス由来の個々の脾臓核抽出物中のその特定のＤＮＡモチーフとのＳＰ−１の結合。ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１が、ＥＦＤ処理後に非常に有意に増強される。これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧがＳＰ−１を活性化することにより免疫調節応答を開始することが示される。ＰＢＳで処理したマウスとの統計的差異を示す：＊＊＊：Ｐ≦０．００１。
【図２０】ＥＦＤ処理が形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の動員を誘導したことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧ（１００μｇ）の１回目の注射の４日後における、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）へと動員された細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ１１ｃ＋集団内における、ＣＤ１１ｃｈｉＢ２２０ｎｅｇ ｃＤＣ（右下の細区画）及びＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉ ｐＤＣ（左上の細区画））。ＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＰＢＳを注射したマウスと比較して、より多くのｐＤＣ（ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉｇｈ）が、ＥＦＤ ＢＣＧマウスにおいて検出された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち０．３％に対して１５％）。対照的に、ＰＢＳと比較して、より少ない従来型ＤＣ（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＢ２２０ｎｅｇ）が、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後にＤＬＮにおいて観察された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち８３％に対して３２％）。
【図２１】形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）が、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を促進したことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧ（１００μｇ）の１回目の注射の４日後における、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）へと動員された細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ４＋集団内における、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ）。ＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスのＤＬＮにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、対照マウスと比較して上昇した（ゲーティングされたＣＤ４＋細胞のうち５．５％に対して１３．２％）。
【図２２】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて免疫調節プロファイルが誘導されたことを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧの１回目の注射の４日後における、鼠径ＤＬＮへと動員された細胞のフローサイトメトリー解析。（Ａ）両方の鼠径ＤＬＮにおけるＩＣＯＳ−Ｌを発現するｐＤＣの数。（Ｂ）両方の鼠径ＤＬＮにおけるＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２３】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて病変の大きさ及び炎症が低減することを示す図である。マウスに６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。ＰＢＳ及びＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）大動脈洞におけるマクロファージ染色（ＭＯＭＡ−２＋細胞）の代表的な顕微鏡写真。ＥＦＤ ＢＣＧ処理後において、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の平均横断面積は、マクロファージ蓄積と同様に、対照と比較して有意に低かった。
【図２４】ＥＦＤで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの大動脈弓、並びにヘマトキシリン・エオシンスライド上でアテローム粥腫の面積を半定量した種々の部位（ａ、ｂ、ｃ）を表す図である。
【図２５】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤを（皮下に）投与した。マウスを３０週齢で屠殺し、病変の厚み及び大動脈の厚みの平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。病変の厚みを、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、病変の厚み／大動脈の厚みの比率として表す。
【図２６】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤを（皮下に）投与した。マウスを３０週齢で屠殺し、病変面積及び総大動脈面積の平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。病変面積を、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、病変面積／大動脈面積の比率として表す。
【図２７】長期的なＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてアテローム硬化性病変が低減することを示す図である。アテローム硬化性の食餌を与えたＬｄｌｒ−／−マウスに、６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ｎ＝６）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝６）を皮下注射し、３０週齢で屠殺した。（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）スーダンＩＶで染色した大動脈の代表的な顕微鏡写真。（Ｃ）病変横断面積に対する染色された面積のパーセンテージとして表したマクロファージ染色（ＭＯＭＡ−２＋細胞）。（Ｄ）ＰＢＳ処理又はＥＦＤ ＢＣＧ処理の後の大動脈病変中の大動脈ＭＯＭＡ−２＋細胞の代表的な顕微鏡写真。元の倍率：×４００。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２８】ＥＦＤ ＢＣＧ処理により、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスにおいて病変の大きさが低減し、免疫調節応答が誘導されることを示す図である。マウスに６週齢及び９週齢で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ｎ＝９）又は１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝８）を皮下注射し、大動脈、脾臓及び血清を１２週で回収した。（Ａ）大動脈根におけるアテローム性動脈硬化病変の平均横断面積（μｍ２×１０００）。（Ｂ）オイルレッドＯ染色後における大動脈洞の代表的な顕微鏡写真。（Ｃ）Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘによる個々の血清中のＩＬ−１０及びＴＮＦ−αの測定。（Ｄ）脾細胞抽出物中のウェスタンブロットによるＦｏｘｐ３の検出。各バンドが、３匹のマウス由来の脾細胞抽出物のプールを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２９】漸増用量のＥＦＤ ＢＣＧがＯＦ１非近交系スイスマウスにおいて副作用を誘導しないことを示す図である。様々な用量のＥＦＤ（０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ及び１ｍｇ）及び１００μｌのＰＢＳを、ＯＦ１マウスに１日１回１４日間皮下投与した（１群当たりｎ＝６）。（Ａ）直腸温度を各注射の２４時間後にモニタリングした。（Ｂ）各日のマウスの重量。（Ｃ）実験の終了時（１５日目）における脾臓核抽出物中のその特定のＤＮＡモチーフとのＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−αの結合。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３０】ＥＦＤ処理がマイコバクテリウム・ツベルクローシス感染又はＢＣＧワクチン接種を妨害しないことを示す図である。モルモットを、ＢＣＧ注射の前若しくは後に、又はＢＣＧ注射を行うことなく、ＥＦＤで処理した。それから、モルモットをマイコバクテリウム・ツベルクローシスに感染させ、脾臓中の病原性細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。１群当たりのモルモット数ｎ＝６。
【図３１】ＥＦＤ処理が、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のワクチン接種を妨害しないことを示す図である。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＥＦＤ又はＰＢＳで処理した後、ナイセリア・メニンジティディスのワクチン接種を行った。最後のワクチン注射の２週間後、ワクチン接種した及びワクチン接種していないマウスに、１０７ＣＦＵの病原性ナイセリア・メニンジティディスを（ｉｐ）負荷し、負荷の２時間後、６時間後及び２４時間後に血中の細菌（bacteriemia）を測定した。１群当たりのマウス数ｎ＝６。（◆）ＥＦＤ １００μｇ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）＋不活性化型ナイセリアワクチン接種（ｄ１、ｄ８、ｄ１５）。（●）ＰＢＳ １００μｌ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）＋不活性化型ナイセリアワクチン接種（ｄ１、ｄ８、ｄ１５）。（■）ＰＢＳ １００μｌ ｓ．ｃ．（ｄ−２１）（ナイセリアワクチン接種なし）。
【図３２】ＥＦＤ処理により、インフルエンザウイルス感染の経過が変化しないことを示す図である。（◆）ＢＡＬＢ／ＣマウスをＥＦＤ（１００μｌ中１００μｇ）で皮下的に（ｓ．ｃ．）処理した（ｄ−２１）。（●）ＢＡＬＢ／ＣマウスをＰＢＳ（１００μｌ）で皮下的に（ｓ．ｃ．）処理した（ｄ−２１）。２１日後、両方の群をインフルエンザウイルススコットランドＡ株（５０００ｐｆｕ）に鼻腔内感染させ、マウスの臨床症状及び生存しているマウスの数を１４日目まで１日１回記録した。
【図３３】脂質分析結果を示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清中の総コレステロール及びトリグリセリドのレベルを測定した。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。値を、平均値±ＳＤ（１群当たりのマウス数ｎ＝４）として表す。ｎ．ｓ．＝有意でない。
【図３４】コレステロールリポタンパク質プロファイルを示す図である。ＰＢＳ又はＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清由来のリポタンパク質プロファイルの大きさの分析。簡潔に述べると、マウス由来の血漿試料（５０μｌ）を、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣシステム（株式会社島津製作所）に接続し、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したＨＲ１０／３０ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（GE HEALTHCARE）及びプレカラムとしてのＤｉｓｏｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ ＧＦＣ−５００（５ｃｍ×７．８ｉ．ｄ．；Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；SIGMA-ALDRICH）により分画した。２００μｌの画分をＦｏｘｙ Ｊｒ（登録商標）（TELEDYNE ISCO INC.）により回収し、各画分中の総コレステロールを、酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。各画分中のコレステロール濃度（ｙ軸）を、保持画分番号（ｘ軸）に対してプロットする。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。曲線は、ＥＦＤ ＢＣＧ免疫化マウス（暗灰色の線）及びＰＢＳ免疫化マウス（明灰色の線）に関する平均値±ＳＤを示す。１群当たりのマウス数ｎ＝４。ＣＲ、カイロミクロンレムナント。
【図３５】ＥＦＤ ＢＣＧ処理後のｏｘＬＤＬに対する抗体力価を示す図である。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血清中のｏｘＬＤＬに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより測定した。（Ａ）Ｌｄｌｒ−／−マウス、（Ｂ）Ａｐｏｅ−／−マウス、及び（Ｃ）Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス。曲線は、ＥＦＤ ＢＣＧ免疫化マウス（暗灰色の線）及びＰＢＳ免疫化マウス（明灰色の線）に関する平均値±ＳＤを示す。１群当たりのマウス数ｎ＝６。簡潔に述べると、５０μＬの抗原（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で終夜インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％ゼラチン（GIBCO INVITROGEN）で室温で１時間ブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、マウス血漿とともに更に２時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）／ゼラチン０．１％で希釈した。洗浄工程の後、総ＩｇＧレベルを、酵素結合型抗マウス抗体（BD BIOSCIENCES）を使用して測定した。プレートを洗浄し、比色分析反応物をＴＭＢ（BD BIOSCIENCES）により発色させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、MOLECULAR DEVICES）により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
実施例１：ＥＦＤの調製
長期凍結乾燥（ＥＦＤ）により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧパスツール株（１１７３Ｐ２）を、ＰＣＴの国際出願の特許文献１に以前に記載されたように調製した。ＥＦＤ調製物は、カール・フィッシャー法を使用することによる電量計（METROHM）で決定されるように、手順の終了時に１．５％未満の水を含有していた。２０ミリグラムのＥＦＤをＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０（DIFCO）寒天プレート上で培養して、生きた細菌が存在しないことを確認した。
【００４７】
ＥＦＤを、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度でマンニトール（５％）中に再懸濁し、０．０４０ｍＢａｒの圧力下で７２時間凍結乾燥させ（この工程では、凍結乾燥の目的は乾燥組成物を得ることのみである）、最後に、蒸留水（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した後、マウスに注射した。
実施例２：ＡｐｏＥ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデル及びＬｄｌｒ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化の発症に関するＥＦＤ処理の評価
１）材料及び方法
ａ）アテローム性動脈硬化の誘導／予防の実験モデル
雄性ＡｐｏＥ−／−及びＬｄｌｒ−／−マウスを、２つの長期処理モデルとして使用した。アポリポタンパク質Ｅ欠損型（ＡｐｏＥ−／−）及び低密度リポタンパク質受容体欠損型（Ｌｄｌｒ−／−）雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Jouy en JosasにあるＩＮＲＡのキャンパスの動物飼育施設で繁殖させた。実験開始時に６匹〜７匹のマウス（５週齢〜６週齢）の群を分配した：
１）群１のＡｐｏＥ−／−マウスには、１０週間毎に（２ヶ月に１回）、計３回１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し、最後の注射の２ヶ月後（３４週齢）に屠殺した。
【００４８】
２）群２のＡｐｏＥ−／−マウスには、群１と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、３回目のＥＦＤ注射の２ヶ月後（３４週齢）に屠殺した。
【００４９】
３）群３のＡｐｏＥ−／−マウスには、４週間毎に１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し（６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で計６回の注射）、最後の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５０】
４）群４のＡｐｏＥ−／−マウスには、群３と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、６回目の注射の１ヶ月後に屠殺した。
【００５１】
５）群５のＬｄｌｒ−／−マウスには、４週間毎に１００μｌのＰＢＳを皮下に投与し（６週齢、１０週齢、１４週齢、１８週齢、２２週齢及び２６週齢で計６回の注射）、最後の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５２】
６）群６のＬｄｌｒ−／−マウスには、群５と同じ間隔で１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧ（ＥＦＤ）を皮下に投与し、６回目の注射の１ヶ月後（３０週齢）に屠殺した。
【００５３】
ＥＦＤの１回目の注射（５週齢〜６週齢）から実験終了時まで、ＡｐｏＥ−／−マウスには従来の食餌を与えたが、Ｌｄｌｒ−／−マウスには脂質（１５％豚脂）及び０．５％コレステロール（Genestil）を添加した食餌を投与した。
ｂ）リンパ器官細胞のフローサイトメトリー解析
Ｔｒｅｇ及び樹状細胞（ＤＣ）を同定するために、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）を、１回目のＥＦＤ ＢＣＧ又はＰＢＳの注射の４日後に回収した。コラゲナーゼ−Ｄｎａｓｅ消化の後、流入領域リンパ節（ＤＬＮ）をｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒにより粉砕し、細胞を抽出した後、製造業者の推奨に従って、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体、Ｂ２２０に対する抗体（BD PHARMINGEN）、Ｆｏｘｐ３に対する抗体（EBIOSCIENCES）、ＩＣＯＳに対する抗体、ＩＣＯＳ−Ｌに対する抗体（EBIOSCIENCES）及びＰＤＣＡ−１に対する抗体（MILTENYI BIOTEC）を用いて染色した。
【００５４】
ＡｐｏＥ−／−マウス由来の脾細胞を、３０週目に脾臓の半分から単離し、ＣＤ４に対する抗体（BD PHARMINGEN）及びＦｏｘｐ３に対する抗体（EBIOSCIENCES）で染色した。全ての試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD BIOSCIENCES）を使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより解析した。
ｃ）脾臓細胞抽出物及び大動脈抽出物中の転写因子の検出
脾臓のもう一方の半分（２匹のマウスのプール）を−２５℃で凍結して、数日間貯蔵した。タンパク質を、脾臓から抽出し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ニトロセルロースシートに移したタンパク質バンドを、マウスモノクローナル抗ＦＯＸＰ３、抗Ｔ−ｂｅｔ、抗ＧＡＴＡ−３、抗ＲＯＲγｔ、抗ＲＸＲα、抗ｐ−ＲＸＲα、抗ＳＴＡＴ−１、抗ｐＳＴＡＴ−１、抗ＳＴＡＴ−４、抗ｐ−ＳＴＡＴ−４、抗ＳＴＡＴ−５ｂ、抗ｐ−ＳＴＡＴ−５ｂ、抗ＳＴＡＴ−６、抗ｐ−ＳＴＡＴ−６（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）、又はβ−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ａｃ−１５、ABCAM）を用いて調べた。ポリクローナルヤギ抗ウサギ（DAKO CYTOMATION）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）（両方ともＨＲＰ結合型）を二次抗体として使用した。免疫複合体を、増強型化学発光検出システム（AMERSHAM）を用いて可視化し、走査解析した。
【００５５】
核タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤処理後に脾臓又は大動脈のホモジネート（３匹のマウスのプール）から抽出し、製造業者の推奨に従ってＴｒａｎｓＡＭ（商標）転写因子アッセイキット（ACTIVE MOTIF）を用いて、ＮＦκＢｐ６５、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲ−α又はＳＰ−１で処理した。簡潔に述べると、１０μｇの核抽出物を９６ウェルプレート（各プレートは、それぞれの転写因子のコンセンサス結合部位を含有する特定のオリゴヌクレオチドでコーティングされている）に添加した。結合を光学密度（ＯＤ）として表した。各実験における処理した試料又はプールの数を、図の説明文において報告する。
ｄ）血清学的分析
血清を、３０週目にＬｄｌｒ−／−マウスから、及び３０週目又は３４週目にＡｐｏＥ−／−マウスから回収した。血清中の炎症促進性サイトカイン及びケモカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＫＣ（ＩＬ−８）、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β、エオタキシン）並びに抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）のレベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘサイトカインアッセイ（BIO-RAD）を使用して測定した。ＴＧＦ−βを、ＥＬＩＳＡキット（EBIOSCIENCE）により測定した。
【００５６】
ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血漿中のコレステロール及びトリグリセリドのレベルを、製造業者のプロトコルに従って酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。血漿コレステロールリポタンパク質プロファイルを、Okazaki et al., J. Biochem., 1981, 89,879-887の変更した方法を使用して検証した。簡潔に述べると、マウス由来の血漿試料（５０μｌ）を、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣシステム（株式会社島津製作所）に接続し、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したＨＲ１０／３０ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（GE HEALTHCARE）及びプレカラムとしてのＤｉｓｏｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ ＧＦＣ−５００（５ｃｍ×７．８ｉ．ｄ．；Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；SIGMA-ALDRICH）により分画した。２００μｌの画分をＦｏｘｙ Ｊｒ（登録商標）（TELEDYNE）により回収し、各画分中の総コレステロールを、酵素比色分析キット（RANDOX LAB.）を使用して測定した。
【００５７】
ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの血清中のｏｘＬＤＬに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、５０μＬの抗原（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で終夜インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ゼラチン（GIBCO INVITROGEN）で室温で１時間ブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、マウス血漿とともに更に２時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）／ゼラチン０．１％で希釈した。洗浄工程の後、総ＩｇＧレベルを、酵素結合型抗マウス抗体（BD BIOSCIENCES）を使用して測定した。プレートを洗浄し、比色分析反応物をＴＭＢ（BD BIOSCIENCES）により発色させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、MOLECULAR DEVICE）により測定した。
ｅ）アテローム硬化性病変の組織学的解析及び免疫染色
心臓及び大動脈を、ＥＦＤで処理したＡｐｏＥ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＡｐｏＥ−／−マウス、並びにＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＬｄｌｒ−／−マウスから回収し、最適切断温度（ＯＣＴ；サクラファインテックジャパン株式会社）において凍結した。凍結したブロックを、低温切開するまで−８０℃に維持した。
【００５８】
ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスの心臓及び上行大動脈を、以前に記載されたように低温切開した（Nicoletti et al., J. Clin. Invest. 1998, 102, 910-918）。１０ミクロン厚の切片を、大動脈弁の開始部分から１００μｍから始めて１００μｍ間隔で回収した。切片を風乾させ、それぞれ組織学的解析及び免疫組織化学的解析のためにＰＢＳ及び氷冷アセトン中で４％ホルムアルデヒドで固定した。ホルムアルデヒドで固定した切片を、ヘマトキシリン及びオイルレッド−Ｏ又はヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色し、光学顕微鏡下で可視化した。病変及び大動脈の横断面の面積を、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ（LEICA）及びＡｔｈｅｒｏｓｅ（商標）画像解析ソフトウェアプログラム（MICROVISION INSTRUMENTS）を使用して定量化した。病変の横断面の絶対面積を、１００μｍ間隔の大動脈根の８個の切片に関して算出した。群間の比較を、３つの最も大きい切片の平均値を使用して行った。Ｌｄｌｒ−／−マウスの大動脈弓を低温切開した。切片を風乾させ、氷冷アセトンで固定し、それからヘマトキシリン・エオシン染色を行った。大動脈弓の３つの異なる部位（ａ、ｂ、ｃ）における病変の面積及び厚みを、Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像解析ソフトウェアを使用して解析した。結果を、各部位に関するスコア（病変面積）として表した。加えて、病変の厚み及び表面積の平均値、並びに大動脈の厚み及び表面積の平均値を、各マウスの８個〜１６個の大動脈弓の切片から算出した。結果を、病変の厚み／大動脈の厚み、病変面積／大動脈面積の比率として、及び病変面積として表した。
【００５９】
大動脈弓を、４％ホルムアルデヒドで固定し、縦方向に開き、スーダンＩＶ（MERCK）で染色した。脂質病変は赤色で示された。
【００６０】
免疫細胞を、ＭＯＭＡ−２（マクロファージ）に対する抗体を使用する従来の免疫染色により検出した。
ｆ）統計解析
データを、平均値±ＳＤとして表す。Ｇｒａｐｈ ＰａｄソフトウェアのＩｎｓｔａｔパッケージを、ウェルチの補正を用いるｔ検定を使用してデータを解析するために使用した。
２）結果
ａ）血清中のサイトカイン及びケモカイン
３回又は６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウス（群２及び群４）では、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の血清レベルが有意に増大した（８倍；図１、図５及び図１１）。同時に、炎症性サイトカイン及びケモカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＫＣ（ＩＬ−８）、ＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αの血清レベルは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して有意に減少したが、ＩＦＮ−γの血清レベルは有意に減少しなかった（図１、図２、図５、図６及び図１１）。ＴＧＦ−βの血清レベルは、群４のＥＦＤで処理したＡｐｏＥ−／−マウスでは有意には増大しなかった（２．６倍）（図１１）。試験した他のサイトカイン及びケモカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳ）は、ＥＦＤ処理後、変化しないままであった（図３及び図７）。
【００６１】
６回のＥＦＤ注射を行ったＬｄｌｒ−／−マウス（群６）では、ＩＬ−１０の血清レベルが、ＡｐｏＥ−／−に関して観察された結果と同様に増大した（図１２及び図１５）。試験した「炎症促進性の」サイトカイン及びケモカインの中では、非処理マウスと比較して、ＩＬ１−β、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−１３、ＫＣ（ＩＬ−８）及びＴＮＦ−αが有意に低減し、ＩＦＮ−γがやや増大した（図１３及び図１５）。ＴＧＦ−βレベルは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウスの血清中で１．９倍（しかし有意でなく）増大した（図１５）。Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいてはＥＦＤ処理によりＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７及びエオタキシンは有意に低減しなかったが、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいては３回又は６回のＥＦＤ処理後にこれらのサイトカイン及びケモカインが有意に低減したことに留意しなければならない。他のサイトカイン及びケモカインは変化しないままであった（ＩＬ−５、ＭＩＰ−１α、ＭＩＧ；図１４）。
【００６２】
これらのデータにより、ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により全身的な（systemic）ＩＬ−１０産生が増大し、炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γを除く）のレベルが減少することが示される。
ｂ）脾臓細胞抽出物及び大動脈抽出物中の転写因子
３回又は６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウスの脾細胞核抽出物では、ＮＦκＢｐ６５は有意に減少し、ＰＰＡＲγの発現は増強又は安定化された（図４及び図９）。
【００６３】
６回のＥＦＤ注射を行ったＡｐｏＥ−／−マウスの脾臓抽出物では、ＰＢＳで処理したＡｐｏＥ−／−マウスと比較して、ＲＯＲγｔ（Ｔｈ１７の発生を統制する転写因子（Ivanov et al., Cell, 2006, 126, 1121-1133）；炎症性Ｔｈ１７細胞のシグネチャー）及びＧＡＴＡ−３（Ｔｈ２細胞のシグネチャー）の発現は減少し、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１の発生に重要な転写因子（Szabo et al., Cell, 2000, 100, 655-669）；Ｔｈ１細胞のシグネチャー）及びＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇ細胞）の発現は強く増強された（図８）。ＩＬ−１０に媒介される免疫調節の重要な成分であるＳＰ−１転写因子（Chanteux et al., Respiratory Research, 2007, 8, 71-80）が、ＥＦＤで処理したマウスの血清において見出された高レベルのＩＬ−１０と相関して、脾臓核抽出物中で有意に増強された（図１０）。脾臓細胞のＦＡＣＳ分析により、ＰＢＳで処理したマウス（６回の注射）よりＥＦＤで処理したマウスにおいて、有意に多数のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞が示された（図１０）。
【００６４】
Ｌｄｌｒ−／−マウスでは、６回のＥＦＤ注射により、６匹のマウス由来の脾細胞核抽出物においてＮＦκＢ活性化が有意に低減し、ＰＰＡＲγの発現が増強された（図１６Ｂ）。３匹のマウスのプールの血管樹状（tree）組織の２つの抽出物から、同様の結果が得られた（プールの数が低すぎるため統計解析を行うことができなかった）（図１６Ａ）。
【００６５】
転写を活性化するために、ＰＰＡＲγはレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）とのヘテロ二量体化を必要とするが、リン酸化型ＲＸＲα及びｐ−ＲＸＲα−ＰＰＡＲγ複合体は不活性である。ＥＦＤで処理したマウスの脾細胞核抽出物中のＰＰＡＲγの発現の増強と相関して、そのリン酸化の遮断と関連してＥＦＤ処理後にＲＸＲαの発現が増強されるが、ＰＢＳで処理したマウスにおいてはｐ−ＲＸＲαの不活性形態が発現された（図１８）。さらに、ＩＬ−１０産生と相関する転写因子であるＳＰ−１のより高い発現が、ＡｐｏＥ−／−マウスに関して先に報告された（図１０）のと同様に、Ｌｄｌｒ−／−マウスのＥＦＤ処理後に観察された（図１９）。
【００６６】
それから、Ｔ細胞のコミットメントを調節する転写因子に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を決定した。ＥＦＤ処理は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいても見出された（図８）のと同様に、Ｌｄｌｒ−／−マウスの脾細胞抽出物におけるＴ−ｂｅｔ及びＦＯＸＰ３の増大、並びにＲＯＲγｔ及びＧＡＴＡ−３の減少と関連した（図１８）。ＥＦＤ処理は、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−６（全て、Ｔｈ１及びＴｈ２炎症応答のシグネチャー）のより低いリン酸化と相関した。加えて、ＳＴＡＴ−４はＴｈ１細胞の発生を調節する重要な因子であり（Thieu et al., Immunity, 2008, 29, 679-690）、ｐ−ＳＴＡＴ−４は近年、Ｔｒｅｇの発生を損なうことが示されている（O'Malley JT et al., Immunology, 2009, 127, 587-5953）。対照的に、Ｔｒｅｇの応答及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の成長を活性化することが報告されている転写因子であるｐ−ＳＴＡＴ−５ｂが増大した（図１７）。
【００６７】
したがって、これらのデータにより、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＳＰ−１及びｐ−ＳＴＡＴ−５ｂを活性化することにより、Ｔｈ２及びＴｈ１７の分化を調節する転写因子の発現を低下させることにより、並びにＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団を増大させることにより、免疫調節応答を開始することが示される。これらの知見により、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＲＸＲα、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−４及びＳＴＡＴ−６のリン酸化の減少、ＮＦ−κＢの活性化の障害、並びにＰＰＡＲ−γの発現の増大により証明されるように、抗炎症効果を有することも示唆される。
ｃ）形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
樹状細胞（ＤＣ）の様々な発生段階及びサブセットが他の免疫Ｔ細胞を調節又は抑制するＴ細胞の増殖及び分化に寄与する（Steinman RM et al., Annu. Rev. Immunol., 2003, 21, 685-711）ため、Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径ＤＬＮにおけるＤＣサブセット及びＴｒｅｇの解析を行った。ＥＦＤ処理により、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の動員が誘導された。１００μｇのＥＦＤの１回目の皮下注射の４日後、ＰＢＳを注射したマウスと比較して、より多くの形質細胞様（plasmacytoid）ＤＣ（ｐＤＣ；ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉｇｈ）が、ＥＦＤ ＢＣＧを注射したマウスの流入領域リンパ節において検出された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち０．３％に対して１５％；図２０）。対照的に、ＰＢＳと比較して、より少ない従来型ＤＣ（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＢ２２０ｎｅｇ）が、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後にＤＬＮにおいて観察された（ゲーティングされたＣＤ１１ｃ＋細胞のうち８３％に対して３２％；図２０）。さらに、ＥＦＤ ＢＣＧ又はＰＢＳの注射後に鼠径ＤＬＮに存在するｐＤＣ（ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉ）のうち９９％〜１００％が、マウスｐＤＣのマーカーであるＰＤＣＡ−１を発現した（Asselin et al., J. Immunol., 2003, 171, 6466-6477）。
【００６８】
成熟（Maturing）ｐＤＣは、高レベルの誘導性同時刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）を発現することによりＴｒｅｇを生成することができる（Ito T, et al., J. Exp. Med., 2007, 204, 105-115）。Ｌｄｌｒ−／−マウスの鼠径ＤＬＮ中において、ＰＢＳ処理後よりＥＦＤ ＢＣＧ注射後に、ＩＣＯＳ−Ｌを発現するｐＤＣをより多く検出した（ゲーティングされたＣＤ１１ｃのうち０．７％に対して８％、絶対数では４１５±４８に対して３８５２９±１９０６、Ｐ＜０．００１；図２２Ａ）。同時に、対照マウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの鼠径ＤＬＮ中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、増大した（ゲーティングされたＣＤ４＋細胞のうち５．５％に対して１３．２％；図２１）。ＩＣＯＳの発現はアテローム性動脈硬化の低減に関与する（非特許文献１２）ため、ＥＦＤ−ＢＣＧにより誘導されるＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの数を測定した。鼠径リンパ節中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＩＣＯＳ＋細胞は、ＰＢＳ注射後よりＥＦＤ−ＢＣＧ注射後ではるかに多かった（２２８１４±２６２６に対して１１９０９１±５８９０、Ｐ＜０．００１；図２２Ｂ）。
ｄ）アテローム硬化性病変
ＡｐｏＥ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を決定した。
【００６９】
ＡｐｏＥ−／−マウスのＥＦＤ ＢＣＧ処理（６回の注射）後、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の平均横断面積は、マクロファージ蓄積（ＭＯＭＡ−２＋細胞）（図２３Ｂ）と同様に、対照と比較して有意に低かった（９２５０２±４３６０７μｍ２に対して５９４４２±２４６９５μｍ２；図２３Ａ）。
【００７０】
Ｌｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により、アテローム硬化性病変の大きさが低減した（表Ｉ、図２４、図２５及び図２６）。
【００７１】
表Ｉは、ＰＢＳ処理群の各Ｌｄｌｒ−／−マウス（６匹のマウス）及びＥＦＤ処理群の各Ｌｄｌｒ−／−マウス（６匹マウス）に関する、大動脈弓の３つの異なる部位（ａ、ｂ又はｃ）（図２４）におけるアテローム硬化性病変面積の半定量結果を示す。ＰＢＳ処理群及びＥＦＤ処理群に関する各部位の平均値も示す（表Ｉ）。
【００７２】
【表１】
【００７３】
ＥＦＤで処理したマウスでは、病変は部位ｂにおいて統計的に小さかった（ｐ＝０．０１５；マン・ホイットニー検定）。
【００７４】
６匹のＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウス及びＰＢＳで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおける病変の面積及び厚みの定量（図２５及び図２６）により、ＥＦＤで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおいて病変の面積及び厚みが有意に低減することが実証された。
【００７５】
Ｌｄｌｒ−／−マウスへのＥＦＤ ＢＣＧの投与により、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、大動脈根における病変の横断面積が低減し（２０４０５１±７３６２３μｍ２に対して８７０７２±２８０７９μｍ２、Ｐ＜０．０１；図２７Ａ）、図２７Ｂに示されるように、表面の（en face）大動脈標本における脂質病変面積が減少した。
【００７６】
免疫組織化学的検査により、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおいて、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、アテローム硬化性病変の横断面におけるＭＯＭＡ２＋マクロファージの浸潤がより少ないことが示された（Ｐ＜０．０１；図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。
ｅ）脂質プロファイル、及び酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）に対する抗体力価
血清コレステロール、トリグリセリド及びコレステロール脂質プロファイルは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理後に変化しなかった（図３３及び図３４）。
【００７７】
加えて、血清ｏｘＬＤＬに対する抗体のレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスとＰＢＳで処理したマウスとの間で異なっておらず、ＥＦＤ ＢＣＧによる保護がアテローム性動脈硬化特異的抗原と無関係であることが示唆された（図３５）。
実施例３：ＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対するＥＦＤ ＢＣＧ処理の評価
１）材料及び方法
ＣＤ４プロモーター下でドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体ＩＩを発現するＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドの雌性ＡｐｏＥ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウス（非特許文献１３）を、アテローム性動脈硬化の短期間モデルとして使用した。マウスは、ストックホルム州地域倫理委員会の許可を得て、カロリンスカ大学病院の繁殖施設で作製及び飼育した。これらのマウスに、６週齢及び９週齢で、尾の根元に１００μｌのＰＢＳ又は１００μｇのＥＦＤ ＢＣＧの２回の皮下注射を行った。これらのマウスに標準的な飼料を与え、１２週齢で屠殺した。サイトカイン及び転写因子の分析、並びに免疫組織化学的研究を、実施例２に記載されるように行った。
２）結果
ＴＧＦ−βは、Ｔｒｅｇが産生することができるものであり、Ｔ細胞の活性化を阻止することによりアテローム性動脈硬化の発症を低減させる（Gojova et al., Blood, 2003, 102, 4052-4058；非特許文献１３；非特許文献１１）。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスの血清中でＴＧＦ−βのレベルの増大の傾向が観察された（図１１及び図１５）ため、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスにおけるＥＦＤ ＢＣＧの効果が検証された。
【００７８】
ＥＦＤ ＢＣＧによる短期の処理にもかかわらず、大動脈根におけるアテローム硬化性病変の大きさは、ＰＢＳと比較して３０％低減した（２７８０８６±８７０８９μｍ２に対して１９３６００±８５９４８μｍ２、Ｐ＜０．０５；図２８Ａ、図２８Ｂ）。
【００７９】
アテローム性動脈硬化の従来のモデル（Ｌｄｌｒ−／−及びＡｐｏｅ−／−）では、ＥＦＤ ＢＣＧにより、それぞれ、ＩＬ−１０産生が４倍〜８倍増大し、ＥＦＤ ＢＣＧ処理したＡｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスでは、非処理マウスに対して１６倍増大した（Ｐ＜０．００１；図２８Ｃ）。血清ＴＮＦ−αレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスではＰＢＳで処理したマウスと比較して僅かに減少した（図２８Ｃ）が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１７の血清レベルは２群間で異ならなかった。特に、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ａｐｏｅ−／−×ＣＤ４ｄｎＴβＲＩＩマウスの脾細胞抽出物中におけるＦｏｘｐ３タンパク質の発現が増強された（図２８Ｄ）。
【００８０】
これらの結果により、ＥＦＤ ＢＣＧが、ＴＧＦ−βシグナル伝達の非存在下でＴｒｅｇの増殖及びＩＬ−１０の産生を促進することによりアテローム性動脈硬化を低減させることが示唆される。
実施例４：ＥＦＤ ＢＣＧ処理は、測定可能な毒性学的副作用を有しない
１）材料及び方法
毒性学研究に通常使用される雌性ＯＦ１スイスマウスを、パスツール研究所の動物実験部で飼育し、１００μｌのＰＢＳ又は０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ若しくは１ｍｇのＥＦＤ ＢＣＧを１４日間連続して注射した（１群当たりのマウス数１０）。体重及び直腸温度を、以前に記載されたように、１日毎に、各注射の２４時間後に測定した（非特許文献１６）。実施例２に記載されるように、最後の注射の２４時間後、マウスを屠殺し、核内のＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−αの測定のために脾臓を回収した。
２）結果
複数回のＥＦＤ注射は、測定可能な副作用を誘導しない
ＥＦＤ ＢＣＧによる処理の繰り返しの副作用を、集団レベルでの多様性が高く毒性学的研究に使用されることが多いＯＦ１非近交系スイスマウスにおいて評価した。様々な用量のＥＦＤ ＢＣＧ（０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ）の１４回の連続注射の後、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、直腸温度の変化は観察されなかった（図２９Ａ）。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウス及びＰＢＳで処理したマウスの体重は、０日目から１４日目までに同程度（６％〜７％）増大した（図２９Ｂ）。
【００８１】
最後に、本発明者らは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理によりＰＰＡＲαの発現に影響を及ぼすことなくＰＰＡＲγの発現が増強されることも示した。実際に、ＰＰＡＲ−γアゴニスト（心血管疾患のリスクが高い糖尿病患者においてインスリン増感剤として使用される）及びＰＰＡＲ−αアゴニスト（脂質異常症を治療するために使用される）の組合せにより、ＡｐｏＥ−／−においてアテローム性動脈硬化が増強され（非特許文献６）、ヒトにおいて主要な心血管の有害事象が誘導された（非特許文献７）。
【００８２】
したがって、漸増用量のＥＦＤ ＢＣＧを１４日間連続して投与したＯＦ１スイスマウス由来の脾細胞抽出物中における２つのＰＰＡＲアイソフォーム（α及びγ）の発現を測定した。ＰＢＳを注射したマウスと比較して、ＥＦＤ ＢＣＧ注射後に、ＰＰＡＲ−γの発現は用量依存的に増大したが、ＰＰＡＲ−αレベルは、最高用量のＥＦＤ ＢＣＧであっても同一のままであった（図２９Ｃ）。ＥＦＤ ＢＣＧがＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−αの活性化を誘導しないことは利点であり、ヒトにおける臨床的な使用のためのその可能性を支持する。
実施例５：ＥＦＤ処理は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、リーシュマニア・メジャー若しくはインフルエンザウイルスの感染を妨害せず、又はＢＣＧ若しくはナイセリアのワクチン接種を損なわない。
【００８３】
最後に、宿主の防御能に対するＥＦＤ ＢＣＧの効果を評価した。
ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染、及びＢＣＧワクチン接種
マウスよりマイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する感受性の高い種であるモルモットに、以下のものを注射した：
群１：０日目にＰＢＳ（１００μｌ）（対照）
群２：０日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群３：４２日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群４：０日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））
群５：０日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））、及び４２日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））
群６：０日目にＢＣＧ（１００μｌのＰＢＳ中１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ））、及び４２日目にＥＦＤ（１００μｌのＰＢＳ中（１００μｇ））。
【００８４】
８０日目に、全ての群（１群当たりのモルモット数ｎ＝６）にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｈ３７Ｒｖ；５×１０５ＣＦＵ）を負荷した。モルモットを１２２日目に屠殺した。脾臓を回収し、ホモジナイズした。ホモジナイズした脾臓の適当な希釈物を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天培地（DIFCO）上で平板培養した。プレートを、３７℃で１ヶ月間インキュベートし、病原性細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
【００８５】
ＢＣＧワクチン接種の前若しくは後の、又はＢＣＧワクチン接種を伴わないＥＦＤ処理は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染に対して感作させず、又はＢＣＧワクチン接種を損なわなかった（図３０）。
ｂ）リーシュマニア・メジャー感染アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ノンヒーラー（non healer）マウス）及びＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）（１群当たり８匹）の尾の根元に、１００μｌのＰＢＳ又は１００μｌのＰＢＳ中１００μｇのＥＦＤを注射した（０日目）。４５日目に、マウスの右耳に、１０μｌ中１０個〜２０個の生きたリーシュマニア・メジャー寄生虫を投与した。
【００８６】
局所的な炎症を６ヶ月間観察し、測定した。ＰＢＳ処理群とＥＦＤ処理群との間で差異は観察されなかった。
【００８７】
転移性の病変が、１６０日目に記録された。
【００８８】
ＰＢＳ処理群では、全てのマウス（１匹を除く）が、小〜中程度の局所的な病変を有していた。５匹は正常な尾を有しており、１匹は尾の根元に小さい病変を有しており、２匹は尾を失くしてしまっており、後足底（rear footpads）に病変を有していた。
【００８９】
ＥＦＤ処理群では、全てのマウスが小〜中程度の局所的な病変を有していた。７匹は尾を有しており、２匹は尾の根元に小さい病変を有しており、１匹は尾を失くしてしまっており、両方の後足底に病変を有していた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ノンヒーラーマウス）のＰＢＳ処理群とＥＦＤ処理群との間で差異は観察されなかった（同様の病変）。ＰＢＳを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）及びＥＦＤを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ヒーラーマウス）の間で差異は観察されなかった（全てのマウスで病変なし）。
【００９０】
ＥＦＤ処理がマウスをリーシュマニア・メジャー感染に対して感作させないことを示すこれらの結果により、ＥＦＤが病原体感染を妨害しないことが示される。
ｃ）ナイセリアワクチン接種
１つの群のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｌ中１００μｇのＥＦＤで皮下的に処理し、２つの他の群には１００μｌのＰＢＳを投与した（１群当たりのマウス数ｎ＝６）。２１日後、ＥＦＤ処理群及びＰＢＳ処理群のうちの１群に、熱により死滅したナイセリア・メニンジティディス（Nesseiria meningitidis）をワクチン接種した（１週間間隔で３回投与）。ＰＢＳを注射したマウスの２つ目の群にはワクチン接種しなかった（対照）。最後のワクチン注射の２週間後、ワクチン接種したマウス及びワクチン接種していないマウスに１０７ＣＦＵの病原性ナイセリア・メニンジティディスを負荷（ｉｐ）し、負荷の２時間後、６時間後及び２４時間後に血中の細菌を測定した。ＥＦＤ処理により、ワクチン接種の保護効果は変化しなかった（図３１）。
ｄ）インフルエンザウイルス感染
１つの群のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｌ中１００μｇのＥＦＤで皮下的に処理し、他の群には、１００μｌのＰＢＳを投与した。２１日後、両方の群をインフルエンザウイルススコットランドＡ株（５０００ｐｆｕ）に鼻腔内感染させ、マウスの臨床症状及び生存しているマウスの数を１４日間１日１回記録した。ＥＦＤ処理群とＰＢＳ処理群との間で差異は見出されず（図３２）、ＥＦＤ処理によりインフルエンザウイルス感染の経過が変化しないことが示された。
【００９１】
これらのデータにより、その免疫調節効果にもかかわらず、ＥＦＤ ＢＣＧが、モルモットにおいてマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マウスにおいてナイセリア・メニンジティディスに対するワクチン（それぞれ、Ｔｈ１に媒介される免疫応答及びＴｈ２に媒介される免疫応答を誘導する感染）によりもたらされる保護を弱力化することもなく、モルモットにおけるマイコバクテリウム・ツベルクローシス感染、及びマウスにおけるインフルエンザウイルス感染又はリーシュマニア・メジャー感染を悪化させることもなかったことが実証される。したがって、ＥＦＤ ＢＣＧは、２つの動物種において、種々のマウス株において、及び高用量で投与した場合に、測定可能な程度の有害作用を何ら引き起こさない。
実施例１〜実施例５からの結論
本研究により、ＥＦＤ ＢＣＧが３つの相異なるマウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化の発症に対する保護効果を発揮することが実証される。ＥＦＤ ＢＣＧにより、以下のことが同時に誘発された：１）ＩＬ−１０産生及びＴｒｅｇの増殖を介した免疫調節効果、２）ＮＦ−κＢ活性化の阻害、並びに３）ＰＰＡＲ−αレベルの変化を伴わないＰＰＡＲ−γの増大。ＥＦＤ ＢＣＧは、本研究において測定可能な程度の副作用を有さず、また、その免疫調節活性にもかかわらず、Ｔｈ１免疫応答及びＴｈ２免疫応答を生じるワクチンによりもたらされる保護を弱力化することもなく、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染を悪化させることもなかった。
【００９２】
全てのモデルにおいて、ＥＦＤ ＢＣＧにより、アテローム硬化性病変の大きさが有意に低減し、ＩＬ−１０産生が有意に誘導された。さらに、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて、ＥＦＤ ＢＣＧ処理により、注射直後に、流入領域リンパ節における形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及びＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの数が増大した。実験の終了時に、脾臓におけるＴｒｅｇの蓄積、炎症促進性サイトカインの血清レベルの減少、ＮＦ−κＢの低減、並びに脾臓核抽出物及び血管核抽出物におけるＰＰＡＲ−γの発現の増大が、Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて観察された。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したＬｄｌｒ−／−マウスにおけるＩＬ−１０の血清レベルの上昇は、ＩＬ−１０の活性化を統制する転写因子（ＳＰ−１及びｐ−ＳＴＡＴ５ｂ）の脾臓抽出物における発現の増大を伴い、ＩＬ−１０がアテローム保護（atheroprotection）を媒介するという考えを支持した。ＩＬ−１０シグナル伝達を増強することに加えて、Ｌｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＥＦＤ ＢＣＧでの長期的処理は、本発明者らが試験した炎症性サイトカインのほとんど（ＩＦＮ−γを除く）を減少させた。Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて同時に起こる核内ＮＦ−κＢの低減、及びリン酸化型ＲＸＲ−αレベルの低減を伴うＰＰＡＲγの増大により、ＥＦＤ ＢＣＧが炎症状態を強く阻止することが示唆される。転写因子及びサイトカインの発現プロファイルは、ＩＬ−１３のより低い血清レベル、及び脾臓中のＧＡＴＡ３及びｐ−ＳＴＡＴ−６の減少により証明されるように、ＥＦＤ ＢＣＧによるＴｈ２分化の下方調節を反映していた。Ｔｈ１系列（arm）に関しては、パターンはあまり明らかではなかった。実際、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ｌｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏＥ−／−マウスの血清中においてＴｈ１サイトカインのシグネチャーであるＩＦＮ−γのより高いレベルが誘起され、脾臓細胞抽出物中において、Ｔｈ１の発生の重要な転写因子であるＴ−ｂｅｔの発現が増強された。しかしながら、ＥＦＤ ＢＣＧにより、Ｔｈ１細胞の発生を調節する別の重要な因子であるＳＴＡＴ−４のリン酸化が低下した。ｐ−ＳＴＡＴ−４は近年、Ｔｒｅｇの発生を損なうことが示されているため、ＥＦＤ ＢＣＧにより誘導されるｐ−ＳＴＡＴ−４の低減は、本研究において、Ｔｒｅｇの増殖に利益をもたらした可能性がある。最後に、Ｔｈ１７細胞の役割を、Ｔｈ１７細胞の発生を統制する転写因子であるＲＯＲγｔを研究することにより検証した。ＲＯＲγｔのレベルは、ＥＦＤ ＢＣＧ処理後にＬｄｌｒ−／−マウス及びＡｐｏｅ−／−マウスにおいてより低く、Ａｐｏｅ−／−マウスモデルではＩＬ−１７のレベルの減少を伴っていた。Ｔｈ１７の低減及びより強いＴｒｅｇプロファイルと関連する、免疫のＴｈ１系列の部分的な変調は、ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおいてマイコバクテリウム・ツベルクローシス及びナイセリア・メニンジティディスに対する免疫防御が変化しなかったことにより裏付けられるように、宿主の効率的な免疫能を維持しながらアテローム性動脈硬化を防ぐのに十分なものであり得る。ＥＦＤ ＢＣＧで処理したマウスにおける全身的炎症プロファイルの変調は、アテローム硬化性疾患における最大の危険である粥腫の崩壊を防止し得るものでもある、病変におけるＭＯＭＡ＋マクロファージの局所的な蓄積の低減とも関連していた（図２３Ｂ、図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。ＥＦＤ ＢＣＧによる免疫化後には、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する反応性（Ｔｈ１に媒介される保護）又はナイセリア・メニンジティディスに対する反応性（Ｔｈ２に媒介される保護）により評価されたように、免疫抑制の痕跡は観察されなかった。ＥＦＤ ＢＣＧ処理後における感染に対する免疫能の維持により、ＥＦＤ ＢＣＧがヒトにおいて耐容性を有する治療剤であることが示唆された。最後に、ＥＦＤ ＢＣＧはＰＰＡＲ−γの選択的な誘導因子であり、ＰＰＡＲ−αの活性化を誘導しないが、これは１つの利点であり、臨床的使用に関するその可能性を裏付ける。結論として、ＥＦＤ ＢＣＧは、アテローム性動脈硬化の予防及び治療のための、免疫治療用調製物としての有望な候補である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む組成物。
【請求項２】
前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌が、変性しておらず、好ましくは一次構造が保存されているタンパク質を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌が、１．５％未満の水を含有する、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌からなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
約１０μｇ〜約１０ｍｇの長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
約１００μｇ〜約１ｍｇの長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１００μｇの単位用量の長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含み、前記単位用量は１週間毎、１ヶ月毎又は３ヶ月毎〜６ヶ月毎の皮下投与を目的とするものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記細菌が、
（ｉ）生きたマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞の培養物を回収することと、
（ｉｉ）水中で又は塩の水溶液中で前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞を凍結することと、
（ｉｉｉ）凍結した前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞を、凍結乾燥器中で少なくとも９８．５％の水を除去するのに十分な時間該細胞を乾燥させることにより、死滅させることと、
（ｉｖ）長期凍結乾燥した前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの死滅した細菌細胞を回収することと
を含むプロセスにより取得可能である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アテローム性動脈硬化の予防又は治療における同時、別々又は連続の使用のための組合せ調製物としての、請求項１〜７のいずれか一項に規定されるような組成物と、少なくとも、抗炎症薬及び免疫変調薬からなる群から選択される別の製品とを含有する製品。
【請求項１】
アテローム性動脈硬化を予防又は治療するための、長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む組成物。
【請求項２】
前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌が、変性しておらず、好ましくは一次構造が保存されているタンパク質を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌が、１．５％未満の水を含有する、死滅しておりかつ変性していないマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌からなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
約１０μｇ〜約１０ｍｇの長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
約１００μｇ〜約１ｍｇの長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１００μｇの単位用量の長期凍結乾燥により死滅したマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌を含み、前記単位用量は１週間毎、１ヶ月毎又は３ヶ月毎〜６ヶ月毎の皮下投与を目的とするものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記細菌が、
（ｉ）生きたマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞の培養物を回収することと、
（ｉｉ）水中で又は塩の水溶液中で前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞を凍結することと、
（ｉｉｉ）凍結した前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ細菌細胞を、凍結乾燥器中で少なくとも９８．５％の水を除去するのに十分な時間該細胞を乾燥させることにより、死滅させることと、
（ｉｖ）長期凍結乾燥した前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの死滅した細菌細胞を回収することと
を含むプロセスにより取得可能である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アテローム性動脈硬化の予防又は治療における同時、別々又は連続の使用のための組合せ調製物としての、請求項１〜７のいずれか一項に規定されるような組成物と、少なくとも、抗炎症薬及び免疫変調薬からなる群から選択される別の製品とを含有する製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公表番号】特表２０１３−５０１７７５（Ｐ２０１３−５０１７７５Ａ）
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２４３３０（Ｐ２０１２−５２４３３０）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５３６５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１８７６９
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（５１０１１３７２６）
【出願人】（５１２０３４９１１）アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミーク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５３６５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１８７６９
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（５１０１１３７２６）
【出願人】（５１２０３４９１１）アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミーク (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]