アデノウイルスベクター送達用アダプター分子
本発明は、コクサッキーウイルスと、アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）およびヒトＣＤ４０リガンドとを含んでなるアダプタータンパク質、ならびに樹状細胞のアデノウイルス導入を促進するとともに、ＤＣの成熟化を促進するためのその使用に関する。また、本発明は、前記アダプタータンパク質と、抗原をコードするアデノウイルスとを含んでなる医薬組成物、および前記アデノウイルスにコードされている抗原に対する免疫反応を生じさせるための方法におけるそれらの使用、ならびにアダプタータンパク質およびアデノウイルスから得た抗原含有樹状細胞、およびアデノウイルスにコードされている抗原に対する免疫反応を生じさせるための方法におけるその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【優先権出願の参照】
【０００１】
本出願は、２００８年５月２２日提出の米国仮出願第６１／０５５，３３２号の優先権を主張するものであり、その内容は参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【連邦政府の資金による研究に関する記述】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から認可番号５Ｕ５４ ＡＩ０５７１５７−０４により米国政府の資金を提供されたものである。従って、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染は、慢性化の傾向が高い特徴があり、場合によっては、肝硬変に進行し、そして最終的に肝細胞癌に進行することがある。この感染の推定罹患率は１〜２％であり、感染の慢性期を治療するための現存の療法の有効性が低いこともあり、ワクチン開発が極めて重要になってきている。ＨＣＶ感染における免疫反応の重要性は、うまくウイルス感染を断ち切ることのできる人たちは強力且つ多特異的細胞免疫反応を起こすが、一方、慢性感染した患者はほとんど反応を示さないことを実証した研究により強調されており、そしてウイルス抗原のわずかな領域に焦点があてられている。
【０００４】
ＨＣＶに対する免疫反応を引き起こす種々の方法のうち、樹状細胞（ＤＣ）系ワクチンが、過去数年間でますます広まってきた。樹状細胞（ＤＣ）は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする不均一細胞集団である。感染または炎症のない状態では、ＤＣは、未成熟状態または静止状態にあり、一方、感染後または炎症過程中では、成熟として知られている活性化過程を経る。この過程で、ＤＣは、リンパ器官に移行する能力を獲得し、的確な活性化のために、抗原をＴリンパ球に提示する。
【０００５】
ＤＣを遺伝子改変する手法には、リポソームを利用した遺伝子送達（Ｃｏｐｌａｎｄら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ，２１：８８３−８９０）およびウイルスベクター（Ｊｅｎｎｅら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１０２−１０７）などがある。
【０００６】
アデノウイルス（Ａｄ）介在遺伝子送達は、インビトロおよびインビボでの効率が高いこと、Ａｄベクターのペイロード容量が大きいこと、ならびに分裂細胞と静止細胞の両方を感染する能力があることから、魅力的に見える。しかしながら、ＤＣを改変するためにＡｄベクターを適用するが、ヒトおよびマウス由来のＤＣにおける一次Ａｄ受容体、ＣＡＲ、の発現に欠けることから障害となっている。
【０００７】
ＡｄベクターによるＤＣ感染効率を改善するために、種々の方法が開発された。例えば、Ｋｉｔａ−Ｆｕｒｕｙａｍａら（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１３１：２３４−２４０）は、ＤＣにＡｄ介在遺伝子を導入するのに、ウイルスの投与量を多くすることを開示している。
【０００８】
別法として、ＤＣをＣＡＲ依存Ａｄ介在導入する種々の系が報告されている。ある方法では、樹状細胞へのアデノウイルス指向性を高めるように線維タンパク質を改変した改変Ａｄベクターを利用している。例えば、ＷＯ０３９３４５５は、アデノウイルスＢサブグループの線維タンパク質を担持している改変Ａｄベクターを記載している。ＵＳ２００８１２４３６０は、アデノウイルスＤベクターの線維タンパク質を担持している改変ＡＤベクターを記載している。ＵＳ２００８００３２３６は、線維タンパク質におけるＣＡＲ結合領域およびＲＧＤ領域および線維タンパク質を、Ｃ型アデノウイルスの幹により置き換えた改変Ａｄベクターを記載している。しかしながら、変化した指向性を示す組み換えアデノウイルスに基づく系は、改変線維タンパク質の指向性が広いため問題となり、細胞特異性が低く且つひいては生体内に用いるのには適さない場合がある。さらに、これらの系では、通常時間がかかる改変アデノウイルスベクターを構築する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなるポリペプチドに関する。
【００１０】
さらなる態様によれば、本発明は、上記したポリペプチドをコードする核酸、前記核酸を含んでなるベクター、上記したポリペプチドまたは上記した核酸または上記したベクターを含んでなる宿主細胞、ならびに上記したポリペプチドの製造方法に関し、具体的には、ＣＡＲの細胞外ドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドの断片を含んでなるポリペプチドに関し、この方法は、
（ａ）前記ポリペプチドを産生できる条件下で、上記した宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、
（ａ）上記したポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、
ならびに、本発明の組成物または複合体と薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明によるポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる複合体を、被験者に投与することを含んでなる、被験者において抗原に対する免疫反応を生じさせる方法に関する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスとを接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触が実施される得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと、前記アデノウイルスと、前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの取込み、プロセッシングおよび提示のために適切な条件下で維持する工程と
を含んでなる、方法に関する。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、上記した方法により得られた抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞、そして本発明の抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者に免疫反応を引き起こす方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＦｍ４０Ｌの使用によりＤＣへのアデノウイルスの導入効率が増加することを示す図である。グラフは、アダプター分子ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下で、ＤＣへの、緑色蛍光タンパク質をコードする組み換えアデノウイルスの導入効率を示す。結果は、各使用ウイルス量についての、導入細胞（ＧＦＰ＋）百分率として示される。
【図２】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、インビトロ成熟化：表面マーカーの発現を誘発することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＤＣをインキュベーションしたときの、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂ表面マーカー発現をＦＡＣＳ解析した結果である。数字は、各ヒストグラムについての平均蛍光値を示す。
【図３】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、インビトロ成熟化：サイトカインの産生を誘発することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でインキュベーションしたＤＣにより産生されたＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＩＬ−６のＥＬＩＳＡ判定の結果が示されている。
【図４】ＣＦｍ４０Ｌにより誘発された成熟化が、Ｔｈ１反応の誘発に関連したＮｏｔｃｈ配位子の発現を伴うことを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌに反応したＤＣにおけるＤＬＬ４、ジャグド（Jagged）１およびジャグド(Jagged)２の発現倍率の増加を示す。結果は、アクチンで標準化したもので表し、未処理ＤＣに対する誘発度で示す。
【図５】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると生体外刺激能を増加することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下においてアデノウイルスベクターを導入した同種ＤＣの存在下で培養したリンパ球における［３Ｈ］チミジン取込み（Ａ）、ＩＦＮ−ガンマ産生（Ｂ）およびＩＬ−４産生（Ｃ）を示す。ＣＦｍ４０Ｌ（Ｄ）の存在下または不存在下でアデノウイルスベクターを導入した同系ＤＣを用いて培養したときの、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定したＩＦＮ−γを産生するＮＳ３特異的リンパ球数を示す。結果は、ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示される。
【図６】ＣＦｍ４０Ｌと一緒にＡｄＮＳ３を導入したＤＣにより免疫すると、ＤＣおよびＡｄＮＳ３を単独で用いたときよりも強力な反応を誘発することを示す図である。（Ａ）ＮＳ３ ＣＤ８エピトープ１０３８〜１０４７、１０７３〜１０８１、１４０６〜１４１５または組み換えＮＳ３タンパク質での刺激に反応して、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＡｄＮＳ３を予め導入したＤＣを注射したマウスから単離したＩＦＮ−γを産生する脾細胞数。（Ｂ）Ｚａｂａｌｅｔａら， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８， １６：２１０−７に記載されているＮＳ３ペプチド１３６７、１４２７および１４４について、（Ａ）に示すようなＩＦＮ−γを産生する脾細胞数のＥＬＩＳＰＯＴ判定。
【図７】ＣＦｈ４０ＬがヒトＣＤ４０発現細胞へのＡｄ導入を高めることを示す図である。異なる濃度のＣＦｈ４０Ｌの不存在下または存在下でルシフェラーゼをコードするＡｄを導入したＣＤ４０発現２９３細胞のルシフェラーゼ活性を示す。結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で示す。
【図８】ＣＦｈ４０Ｌの使用によりＤＣへのアデノウイルスの導入効率が増加することを示す図である。アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下における感染多重度３０または３００でのＤＣへのＡｄＧＦＰの導入百分率である。結果は、ウイルスの各使用量ごとの、導入細胞（ＧＦＰ＋）の百分率で表される。
【図９】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現を誘発することを示す図である。未処理のまま、またはアダプターＣＦｈ４０Ｌで処理、ポリ（Ｉ：Ｃ）で処理またはＴＮＦ−α、アンピリゲンおよびＩＦＮ−αを含有するカクテルで処理したヒトＤＣにおけるＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ表面マーカー発現のＦＡＣＳ分析の結果である。結果は、各マーカーの値を平均蛍光指数（ＭＦＩ）で示す。
【図１０】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入するとＩＬ−１２の生体外成熟化を誘発することを示す図ある。未処理のまま、ＡｄＮＳ３を導入した、アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入した、ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下でＡｄＮＳ３を導入した、またはＴＮＦ−α、アンピリゲンおよびＩＦＮ−αを含有するカクテルで処理した培養ヒトＤＣから得た上清におけるＩＬ−１２レベルを示している。
【図１１】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると生体外成熟化：同種Ｔ細胞の刺激を誘発することを示す図である。ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０ＬまたはＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α°＋アンピリゲン＋ＩＦＮ−αまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理したＤＣへの［３Ｈ］チミジン取込みを示す。
【図１２】ＣＦｈ４０Ｌの存在下で慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を患った患者から得た単球由来のＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、健常ＨＣＶ血清反応陰性者から得た単球由来のＤＣに見られるものと類似の細胞活性化を誘発する。健常被験者またはＨＣＶ感染患者からの単球から得たＤＣにおいて、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でのＡｄＮＳ３での処理に反応した、フローサイトメトリーによるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ５４表面マーカーの発現（Ａ）、培養上清におけるＩＬ−１２の産生（Ｂ）および同種Ｔリンパ球を刺激する能力（Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、ｈＣＤ４０Ｌと、三量化モチーフと、ヒトＣＡＲ細胞外ドメインとを含んでなる二官能性アダプターにより、アデノウイルスベクターがヒトＤＣを効率的に導入するとともに、前記アデノウイルスがコードする抗原を提示することができる細胞で前記ＤＣの活性化を促進することを驚くべきことに見出した。
【００１７】
本発明のアダプターポリペプチド
第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなるポリペプチドに関する。
【００１８】
本明細書において使用されている用語「コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体」または「ＣＡＲ」は、ＡｄサブグループＡ（例えば、Ａｄ１２）、Ｃ（例えば、Ａｄ２およびＡｄ５）、Ｄ（例えば、Ａｄ８、Ａｄ９、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６〜３９および４２〜４９）、ＥおよびＦ（Ａｄ４０およびＡｄ４１）、ならびにコクサッキーＢウイルスの一次受容体としての役割を果たす免疫グロブリンスーパーファミリーに属する４６ｋＤａ膜貫通型タンパク質に関する。
【００１９】
本発明において用いられる好ましいＣＡＲタンパク質には、ヒトＣＡＲ、ラットＣＡＲおよびマウスＣＡＲなどがあるが、これらに限定されない。
【００２０】
ヒトＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ７８３１０、配列番号１に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３７により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３４がＩｇ様Ｃ２型１ドメインを形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２を形成する。
【００２１】
ラットＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｒ０６６、配列番号２に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜２３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３８により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３６がＩｇ様Ｃ２型１領域を形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２を形成する。
【００２２】
マウスＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７７９２、配列番号３に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３７により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３６がＩｇ様Ｃ２型１ドメインを形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２ドメインを形成する。
【００２３】
用語「アデノウイルス線維タンパク質に結合することができるＣＡＲのドメイン」とは、ＣＡＲから、好ましくはＣＡＲの細胞外領域からのいずれかの領域であって、標的細胞で発現したときに前記細胞がアデノウイルスにより感染できる領域を意味する。このドメインは、完全細胞外領域（ヒトＣＡＲのアミノ酸２０〜２３７、マウスＣＡＲのアミノ酸２０〜２３７、またはラットＣＡＲのアミノ酸２０〜２３８）、Ｉｇ様Ｃ１ドメイン（ヒトＣＡＲのアミノ酸２０〜１３４、ラットＣＡＲのアミノ酸２０〜１３６またはマウスＣＡＲのアミノ酸２０〜１３４）、Ｉｇ様Ｃ２ドメイン（ヒトＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８、ラットＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８およびマウスＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８、Ｉｇ様Ｃ１とＩｇ様Ｃ２ドメインの両方を含んでなる領域、または前記受容体を発現する細胞の十分な感染を確保するように十分な特異性でアデノウイルス線維タンパク質に結合できるいずれかの領域を含んでなることができる。一例として、アデノウイルス線維タンパク質へのＣＡＲドメインの結合能についての測定は、Ｋｉｒｂｙら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４：２８０４−２８１３）に記載の表面プラズモン共鳴により実施できる。本発明のアダプター分子に使用するのに好適なドメインには、少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは少なくとも１０〜８Ｍ、より好ましくは少なくとも９ｘ１０−９Ｍ、少なくとも８ｘ１０−９Ｍ、少なくとも７ｘ１０−９Ｍ、少なくとも６ｘ１０−９Ｍ、少なくとも５ｘ１０−９Ｍ、少なくとも４ｘ１０−９Ｍ、少なくとも３ｘ１０−９Ｍ、少なくとも２ｘ１０−９Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも９ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも８ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも７ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも６ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも５ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも４ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも３ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも２ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍの結合定数を有するものがあげられる。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「官能性変異体」は、一つ以上の残基の挿入、欠失または置換によりＣＡＲから得られ、上記で測定したアデノウイルス線維タンパク質と相互作用する能力を実質的に維持するいずれかのポリペプチドに関する。好適な官能性変異体は、ＣＡＲドメインに対しするアミノ酸配列同一性が約２５％超、例えば、２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一度を示すものである。二種のポリペプチド間の同一度は、コンピュータアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて求められる。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ）、ｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）］を用いて求められる。本明細書に記載のパラメータでＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を用いて、配列同一度（％）を求める。ＢＬＡＳＴ分析をおこなうソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により公表されている。アルゴリズムでは、最初にデーターベース配列における同じ長さのワードと整列したときにある正値閾値スコアＴに一致するか、または満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。これらの最初の近接ワードヒットは、より長いＨＳＰを含むそれらを見つけ出すための探索を開始する種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積整列スコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列に関して、累積スコアをパラメータＭ（一対一致残基のリワードスコア）；常に＞０）及びＮ（不一致残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積整列スコアが、その最大の達成値から量Ｘまで低下したとき；１つ以上の負のスコアを持つ残基の整列の蓄積により、累積スコアが０以下になったとき；又はどちらの配列の末端に 達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＰパラメータの好適値は、デフォルト値として３のワード長、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、そして両方の鎖の比較を使用するがこれには限定されない。
【００２５】
好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、ヒトＣＡＲの細胞外ドメインである。さらに好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜２６３を含んでなる。さらに好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜２６３からなる。
【００２６】
本発明によるポリペプチドの第二の成分は、三量化モチーフである。本明細書において用いられる用語「三量化モチーフ」は、２つの他のアミノ酸配列と関連して三量体を形成できる官能基を含んでなるアミノ酸配列に関する。三量化モチーフまたはドメインは、同一のアミノ酸配列の他の三量化ドメインと関連することもでき（ホモ三量体）、または異なるアミノ酸配列の三量化ドメインと関連することもできる（ヘテロ三量体）。このような相互反応は、三量化ドメインの成分間の二重結合により生じてもよく、または水素結合力、疎水力、ファンデスワースル力および塩橋により生じてもよい。
【００２７】
好適な三量化ドメインは、米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号に記載のテトラネクチン三量化構造要素、ＷＯ０６０７６０２４に記載のアセチルコリン受容体ＣｏＩＱ鎖のＣ末端領域に存在する三量化モチーフ、ＧＣＮ４ロイシンジッパーの三量化モチーフ（Ｈａｒｂｕｒｙら．１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−１４０７）、肺表面活性剤タンパク質からの三量化モチーフ（Ｈｏｐｐｅら．１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４４：１９１−１９５）、コラーゲンの三量化モチーフ （ＭｃＡｌｉｎｄｅｎら．２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４２２００−４２２０７）、コラーゲンＸＶＩＩＩ ＮＣ１ドメインの三量化ドメイン、ＴＮＦの三量化モチーフ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｋｐ三量化モチーフ、アデノウイルス線維タンパク質の三量化モチーフ、Ｄａｍｅｓ ＳＡ．ら （Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．、１９９８；５：６８７−９１）に記載のヒト母系の三量化モチーフ、Ｖｅｒｏｎ， Ｍ． ら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００４，２７９：２７８６１−２７８６９）に記載のＮＥＭＯの三量化モチーフ、ＷＯ０９０００５３８Ａに記載のテネイシン三量化モチーフ、Ｆｒａｎｋ等（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：１１６７２−１１６７７）に記載のマクロファージスキャベンジャー受容体のコイルドコイル領域、およびファージＴ４フィブリチン「フォルドン」（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖら、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２９−４１４）であるが、これらには限定されない。
【００２８】
好ましい実施態様によれば、三量化モチーフは、配列番号４（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦ）で定義されているファージＴ４フィブリチン「フォルドン」である。この配列は、ベータプロペラ配座を採用し、自律的方法で折り重なり、そして三量化する（Ｔａｏら． １９９７ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：７８９−７９８）。別の好ましい実施態様によれば、三量化モチーフは、配列番号５（ＰＤＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫＶＥＬＦＰＮＧ）で定義されているヒト肺表面活性剤Ｄから得た頸部ペプチド（ＮＲＰ）である。
【００２９】
本発明によるポリペプチドの第三の要素は、ヒトＣＤ４０リガンドである。本明細書において用いられている用語「ＣＤ４０リガンド」（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ４０受容体を特異的に認識し、活性化し、その生物学的活性を活性化するいずれのポリペプチドまたはタンパク質も包含する。この用語は膜貫通ドメインを含有するＣＤ４０Ｌの使用を排除しないが、細胞外ドメインの全てまたは一部分を含有する可溶型ＣＤ４０Ｌを使用することが好ましい。
【００３０】
ヒトＣＤ４０Ｌアミノ酸配列は、配列番号６に示されるとおりである。
【００３１】
本発明によるポリペプチドに使用するのに好適なＣＤ４０Ｌ断片には、配列番号６の残基４７〜２６１を含んでなる切断ＣＤ４０Ｌ；配列番号６のアミノ酸残基５１〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１２０〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１３〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２６１を含んでなるＣＤ４０断片；配列番号６のアミノ酸残基３５〜２６１を含んでなるＣＤ４０断片；配列番号６のアミノ酸残基３４〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１３〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１２０〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片などがあるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、ヒトＣＤ４０リガンドの断片は、配列番号６のアミノ酸１１８〜２３１を含んでなる。
【００３２】
本発明において用いられるのに好適なヒトＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得られ、ＣＤ４０を結合する能力を実質的に保存するＣＤ４０Ｌの変異体を含む。ＣＤ４０Ｌ変異体がＣＤ４０に結合する能力を維持するかどうかを判定するのに好適な方法には、Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ Ｓ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６：３４８２−９３）に記載の表面プラズモン共鳴等のいずれかの従来の技術を用いて実施してもよく、またはＭａｚｚｅｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９９５，２７０：７０２５−７０２８）に記載の固定化ＣＤ４０上への結合により実施してもよい、従来の結合アッセイなどがある。
【００３３】
本明細書において言及されるＣＤ４０Ｌ類似体は、ヒトまたはネズミＣＤ４０Ｌの配列に実質的に相同であるが、一つまたは複数の欠失、挿入または置換のために天然配列ＣＤ４０Ｌポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般的に、置換は保存的になされなければならない。すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、本発明のタンパク質が天然のＣＤ４０Ｌのそれに実質的に同等の方法でそれらの受容体に結合する能力に影響しないものである。好適な官能性変異体は、ヒトＣＤ４０Ｌに対してのアミノ酸配列の同一性が概略２５％超、例えば、２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のものである。さらに、ヒトＣＤ４０Ｌの一次アミノ酸構造またはその変異体を、他の化学部分、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等と共有または集合性結合体を形成することによるか、またはアミノ酸配列突然変異体を作製することにより、改変してＣＤ４０Ｌ誘導体を作製してもよい。ＣＤ４０Ｌの共有誘導体は、特定の官能基を、ＣＤ４０Ｌアミノ酸側鎖、またはＣＤ４０Ｌポリペプチドもしくはその細胞外ドメインのＮ末端もしくはＣ末端に連結することにより調製される。本発明の範囲の入るＣＤ４０Ｌの他誘導体には、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合としての組み換え培養における合成によりる、ＣＤ４０Ｌまたはその断片と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または集合性結合体などがある。例えば、結合体は、共翻訳的または翻訳後に結合体をその合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の壁に転移させる、ＣＤ４０ＬポリペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域に単一またはリーダーポリペプチド配列を含んでなるものでもよい（例えば、サッカロミセス属の［アルファ］因子リーダー）。
【００３４】
好ましい実施態様によれば、本発明によるアダプター因子は、標識をさらに含んでなる。本明細書において用いられる用語「標識」は、特異的結合分子が得られ、したがって、前記標識を担持するポリペプチドの検出／精製を可能とするアミノ酸配列に関する。標識は、一般的にポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。このような標識が存在すると、標識ポリペプチドに対する抗体を用いて、アダプター分子を検出できる。また、標識を設けると、アダプターポリペプチドを、抗標識抗体、またはエピトープ標識に結合する別の種類の親和試薬を用いて親和性精製により容易に精製できる。
【００３５】
種々の標識ポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野において周知である。例えば、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）標識；インフルエンザＨＡ標識ポリペプチドおよびその抗体２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、１９８８、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃ標識およびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、１９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０−３６１６）；単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，１９９０，Ｐｒｐｔｅｏｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３：５４７−５５３）などが挙げられる。他の標識ポリペプチドとして、ｔｈｅ Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｖ，６：１２０４−１２１０）； ｔｈｅ ＫＴ３ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ［Ｍａｒｔｉｎら．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，１９９１，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７）が挙げられる。好ましい実施態様によれば、精製標識は、ポリヒスチジン標識である。さらに好ましい実施態様によれば、精製標識は、ヘキサヒスチジン標識である。
【００３６】
当業者には、本発明によるポリペプチドの種々の要素は、ＣＤ４０ＬおよびＣＡＲの立体構造が保存され、ＣＤ４０との相互作用またはアデノウイルス線維タンパク質との相互作用の機能を維持する限り、どの順序で配置されていてもよい。したがって、本発明のアダプターポリペプチドの好適な配置には以下のものが含まれる：
−ＣＡＲドメイン−三量化モチーフ−ＣＤ４０Ｌ
−ＣＡＲドメイン−ＣＤ４０Ｌ−三量化モチーフ
−三量化モチーフ−ＣＡＲドメイン−ＣＤ４０Ｌ
−三量化モチーフ−ＣＤ４０Ｌ−ＣＡＲドメイン
−ＣＤ４０Ｌ−三量化モチーフ−ＣＡＲドメイン
−ＣＤ４０Ｌ−ＣＡＲドメイン−三量化モチーフ
【００３７】
好ましい実施態様によれば、アダプタータンパク質は、Ｎ末端から順番に、アデノウイルス線維タンパク質に結合できるＣＡＲドメイン、三量化モチーフおよびＣＤ４０Ｌを含んでなる。さらに好ましい実施態様によれば、アダプタータンパク質は、Ｎ末端から順番に、以下の要素を含んでなる：アデノウイルス線維タンパク質に結合できるＣＡＲドメイン、リンカー領域、ヘキサヒスチジン標識およびｈＣＤ４０Ｌ。
【００３８】
本発明のポリペプチドの種々の要素は、直接に結合していてもよい。すなわち、要素のＣ末端は、次の要素のＮ末端領域に直接連結している。しかしながら、要素をリンカー領域を介して接触させることもできる。
【００３９】
本発明によれば、前記領域配列は、ＣＡＲドメインとヒトＣＤ４０Ｌとの間のヒンジ領域としての役割を果たし、それらが個々のドメインの立体形状を維持しながら、互いに独立して移動することができる。この意味で、本発明による好ましい非天然中間アミノ酸配列は、この移動を可能にする構造的延性により特徴づけられるヒンジ領域であろう。特定の実施態様によれば、前記非天然中間アミノ酸配列は、非天然可撓性リンカーである。好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、アミノ酸長さが２０である可撓性リンカーペプチドである。より好ましい実施態様によれば、リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列の例としては、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号７），ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号８）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号９）およびＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号１０）を挙げることができる。これらの配列は、設計されたコイル状らせんを他のタンパク質ドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ， Ｋ．Ｍ．， Ａｒｎｄｔ， Ｋ．Ｍ．およびＡｌｂｅｒ， Ｔ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，３２８：２６１−２８１）に結合させるのに使用されてきた。好ましくは、前記リンカーは、アミノ酸配列ＧＰＧＳ（配列番号１１）からなる。
【００４０】
リンカー領域の効果は、ＣＡＲドメインとヒトＣＤ４０Ｌとの間に空間を提供している。したがって、ＣＡＲの二次構造が、ｈＣＤ４０Ｌの存在により影響されることはなく、またこの逆も成立する。好ましくは、スペーサーは、ペプチドの性質を有している。好ましくは、リンカーペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含んでなる。
【００４１】
リンカーは、共有結合により本発明の結合体の２つの成分の側の成分に結合することができ、好ましくは、スペーサーは、実質的に非免疫原性であり、および／またはシステイン残基を含んでいない。同様に、スペーサーの立体構造は、好ましくは線状または実質的に線状である。
【００４２】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例としては、結合タンパク質の機能を実質的に劣化されることなく、または少なくとも結合タンパク質のうちの一つの機能を実質的に劣化させることなくタンパク質を結合するのに使用されてきたものが挙げられる。より好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、コイル状らせんを有する構造を含んでなるタンパク質を結合するのに使用されてきたものである。
【００４３】
好ましい実施態様によれば、リンカーを、ＣＡＲのＣ末端に配置する。すなわち、リンカーは、ＣＡＲドメインと三量化モチーフを連結することにより機能する。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターおよび宿主細胞
別の態様によれば、本発明は、本発明のアダプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。当業者には、本発明のポリヌクレオチドは、相対的な配向とは無関係およびアダプター分子がスペーサー領域により直接接続または分離されていることとは無関係にのみアダプター分子をコードすることが理解されるであろう。
【００４５】
本発明によるポリヌクレオチドは、単離されたものであってもよく、または遺伝子構築物の一部分を構成しているものであってもよい。好ましくは、この構築物は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列の動作制御下に位置して本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる。当業者には、本発明のポリヌクレオチドが、標的組織の核にアクセスできなければならず、転写され、翻訳されて、生物学的に活性な融合タンパク質を生じると理解される。
【００４６】
原則として、プロモーターが、ポリヌクレオチドが発現されるべきである細胞と適合するものであることを前提として、いずれのプロモーターも本発明による遺伝子構築物に使用することができる。したがって、本発明の実施態様に好適なプロモーターには、構成的プロモーター、例えば、真核生物ウイルスのゲノムの誘導体、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、レドロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子、さらには、タンパク質の発現が分子または外生信号、例えば、テトラサイクリンシステム、ＮＦκＢ／ＵＶ光システム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムの付加に依存する誘導プロモーター、熱衝撃遺伝子のプロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩの調節可能プロモーター、ならびに組織特異的プロモーターなどがあるが、必ずしもこれらには限定されない。好ましい実施態様によれば、本発明の遺伝子構築物は、単一コピーまたはそのいくつかのコピーの形態および単離された形態またはサイトメガロウイルス、アルファ−１−抗トリプシンもしくはアルブミンプロモーターなどの他の肝臓特異的発現要素との組み合わせにおいて、ヒト血清アルブミン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、アルファ−１−ミクログロブリン遺伝子またはアルドラーゼ遺伝子などの主に肝臓発現遺伝子のプロモーター領域に存在する発現を高める領域を含んでいる。
【００４７】
組織特異的であるプロモーターの他の例としては、例えば、アルブミン遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ ら．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスのコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇら， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９）；アルファ−フェトタンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら，１９９６，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：１５０３−１４）およびチロキシンに結合するグロブリン結合タンパク質のプロモーター（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，１９９７，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６）などがある。
【００４８】
本発明によるポリヌクレオチドまたはそれらを構成する遺伝子構築物は、ベクターの一部を構成する。したがって、別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクターに関する。当業者には、前記ベクターは、増殖に好適および結合体を精製するのに好適な種々の異種生物においてポリヌクレオチドまたは好適な遺伝子構築物または発現ベクターを得るのに好適なクローニングベクターであることができるので、使用できるベクターの種類は限定されないことは理解されるであろう。したがって、本発明による好適なベクターには、原核生物における発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプトおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージおよびシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母における発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミドのベクター、組込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミド等、昆虫細胞における発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系ベクターおよびｐＶＬ系ベクター、植物における発現ベクター、例えば、植物における発現のベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系ベクター等、ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルスに関連したウイルス、さらにレトロウイルスおよびレンチウイルス）、さらに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ （Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよび ａｎｄ ｐＴＤＴｌに基づく高級真核細胞における発現ベクターなどがある。
【００４９】
本発明によるベクターは、前記ベクターにより形質転換、形質移入または感染されることができる細胞を形質転換、形質移入または感染させるのに使用できる。前記細胞は、原核生物系でも、真核生物系でもよい。例えば、前記ＤＮＡ配列を導入するベクターは、宿主細胞に導入したときに、前記細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体（単一または複数）とともに複製する、プラスミドまたはベクターであることができる。前記ベクターは、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１）。
【００５０】
従って、別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含んでなる細胞であって、本発明により提供される構築物またはベクターにより形質転換、形質導入または感染されることができる細胞に関する。形質転換、形質導入または感染された細胞は、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１）。特定の実施態様によれば、前記宿主細胞は、好適なベクターを導入または好適なベクターで感染した動物細胞である。
【００５１】
本発明による複合体の発現に好適な宿主細胞には、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞などがあるが、これらには限定されない。細菌細胞には、グラム陽性菌細胞、例えば、バチルス属種、ストレプトミセス属種およびブドウ菌属種ならびにグラム陰性菌細胞、例えば、エシェリキア属およびシュードモナス属の細胞などがあるが、これらには限定されない。真菌細胞には、好ましくはサッカロミセス属、ピチアパストリス属およびハンゼヌラポリモルファなどの酵母の細胞などがある。昆虫細胞には、ショウジョバエ細胞およびＳｆ９細胞などがあるが、これらには限定されない。植物細胞には、とりわけシリアル、薬用植物、鑑賞植物または球根植物などの作物の細胞などがある。
【００５２】
好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチド、本発明の核酸または本発明のベクターは、ヒト細胞である。本発明に好適なヒト細胞には、上皮細胞株、骨肉腫細胞株、神経芽腫細胞株（ヒト等）、上皮癌（ヒト等）、グリア細胞（ネズミ等）、肝細胞株（サル等由来）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株のＤ３細胞、ヒト幹細胞、例えば、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７およびｈＭＳＣ細胞などがある。
【００５３】
本発明によるアダプターポリペプチドは、好適な宿主における組み換え発現により得ることができる。このため、本発明によるポリペプチドは、異種生物における発現に好適なベクターに、転写および必要に応じて翻訳制御要素とともに導入される。本発明の発現カセットに存在する転写および必要に応じて翻訳制御要素には、動作可能に連結されたヌクレオチド配列を転写させるようにさせるプロモーター、ならびに転写および時間や場所においてその好適な調節に必要または好適である他の配列、例えば、開始シグナル、終了シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、転写エンハンサー、転写サイレンサー等を含む。前記要素、さらに本発明による発現カセットおよび組み換えベクターを構築するのに使用されるベクターは、一般的に使用される宿主細胞にしたがって選択する。
【００５４】
従って、別の態様によれば、本発明は、アデノウイルス線維タンパク質またはその変異体に結合できるＣＡＲのドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドとをを含んでなる本発明によるアダプタータンパク質を製造する方法であって、
（ａ）ポリペプチドを産生できる条件下で、上記で定義した宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００５５】
好ましい実施態様によれば、発現を実施する宿主細胞は、ヒト細胞である。本発明のポリペプチドを産生するのに好適なヒト細胞には、本発明の細胞に関連して上記した細胞株のいずれもあげることができるが、これらには限定されない。
【００５６】
本発明による組成物および複合体
本発明者らは、ＤＣを本発明のアダプター分子の存在下でアデノウイルス粒子と接触させることにより、ＤＣの成熟を促進するとともに、インビトロおよびインビボ刺激能を促進することができることを明らかにした。したがって、アデノウイルス粒子と本発明のアダプターポリペプチドとを複合体組成物は、ＤＣワクチン接種として用いることができるＤＣを産生するのに特に適している。したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体に関する。
【００５７】
本明細書において用いられる用語「組成物」は、本発明の成分、すなわち、本発明のアダプターポリペプチドと、抗原をコードするアデノウイルスを含んでなる、物質の組成物に関する。組成物は、単独の構成物として製剤化してもよいし、あるいは別個の製剤として提供した後、混ぜて共投与してもよいことが理解されるであろう。また、本発明による組成物は、各成分を別個に製剤化し、そして単一の容器に収めたパーツからなるキット（キット・オブ・パーツ）として提供されてもよい。本発明による組成物を構成する成分のモル比は、異なることができ、好ましくは二成分の比は、５０：１〜１：５０、より好ましくは２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１、または５：１〜１：５である。
【００５８】
本明細書において用いられる用語「複合体」は、抗原をコードする一つ以上のアデノウイルス粒子を、アダプター分子におけるＣＡＲドメインとアデノウイルス線維タンパク質との間の特異的相互作用を介した本発明のアダプター分子の一つ以上の分子により結合している物質の組成物に関する。複合体の化学量論比は、同時に三量体アダプタータンパク質を結合できるアデノウイルスキャプシド上で利用できる線維タンパク質数に依存することが理解されるであろう。アデノウイルスキャプシドは、直径が約９００オングストロームである２０面体シェルとして構成されている７つのポリペプチドのアセブリである。
【００５９】
主要なキャプシド成分であるヘクソンの１２の三量体が、ペントンキャプソメアとそれらの突出した線維が１２の頂点の位置の各々を占めるようにして、２０の連結した三角形状のファセットの各々に配置されている。したがって、アデノウイルスは１２の線維を含んでなることから、本発明による複合体は、各アデノウイルス粒子に同時に結合した最大で１２のアダプター分子を含んでなることができる。したがって、好ましくは、本発明の複合体の化学量論比は、アデノウイルス粒子当たり１２のアダプター分子である。但し、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１および１：１の化学量論比も可能であり、本発明にあってはこれも意図している。
【００６０】
本発明による組成物または複合体の第一の成分は、本発明のポリペプチドに関連して詳細に説明してあるとおりである。
【００６１】
本発明による組成物または複合体の第二の成分は、抗原をコードするアデノウイルスである。本明細書において用いられる用語「アデノウイルス」または「アデノウイルス粒子」には、全てのグループ、サブグループおよび血清型を含むヒトまたは動物を感染するアデノウイルスを含むアデノウイルスとして分類されることができるあらゆるウイルスが含まれる。いくつかのサブグループに分類される少なくとも５１の血清型のアデノウイルスがある。例えば、サブグループＡは、アデノウイルス血清型１２、１８および３１を含む。サブグループＣは、アデノウイルス血清型１、２、５および６を含む。サブグループＤは、アデノウイルス血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３０、３２、３３、３６−３９および４２−４９を含む。サブグループＥは、アデノウイルス血清型４を含む。サブグループＦは、アデノウイルス血清型４０および４１を含む。これらの後者の２つの血清型は、長短の線維タンパク質を有している。したがって、本発明で使用されるアデノウイルスまたはアデノウイルス粒子は、パッケージベクターまたはゲノムである。さらに、用語「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」は、野生型に関する一つ以上の改変を含むその誘導体をも意味する。このような改変には、感染性ウイルスを製造するためにアデノウイルスゲノムを粒子に収納する改変などがあるがこれらには限定されない。典型的な改変には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の一つ以上における欠失等の当該技術分野において公知の欠失などがある。他の典型的な改変には、アデノウイルスゲノムのコード領域の全ての欠失などがある。このようなアデノウイルスは、「ガットレス（Ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスとして知られている。また、こられの用語には、一定の型の細胞または組織で優先的に複製するが、他の型の細胞では複製割合が小さいか、全く複製しないウイルスである、複製条件付きアデノウイルスなども含まれる。例えば、ここで提供されるアデノウイルス粒子には、固形腫瘍および他の新生物などの異常増殖組織で複製するアデノウイルス粒子が含まれる。これらには、米国特許第５，９９８，２０５号および米国特許第５，８０１，０２９号に開示されているウイルスなどがある。このようなウイルスは、「細胞障害」または「細胞変性」ウイルス（またはベクター）と称されることがあり、新生細胞に対してこのような効果を有する場合には、「腫瘍崩壊」ウイルス（またはベクター）と称される。
【００６２】
本発明による組成物または複合体のアデノウイルス構成部分は、抗原をコードするポリペプチド配列を含んでなる。
【００６３】
本発明による組成物および複合体を形成するアデノウイルスに組み込むのに好適なポリヌクレオチドには、ウイルス抗原、真菌抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胚抗原、癌遺伝子および突然変異癌抑制遺伝子の抗原、染色体転座および／またはそれらの誘導体から得られる独特な腫瘍抗原の全てまたは一部分をコードするものなどがあるが、これらには限定されない。
【００６４】
ウイルスに対する免疫反応を引き起こすことができるウイルス抗原には、ＨＩＶ−１抗原（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはそれらの誘導体、または前初期タンパク質、例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６、サイトメガロウイルス、特にヒト（例えば、ｇＢまたはその誘導体）、エプスタインバーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩ、ＩｌｌおよびＩＥ６３）由来、または肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えば、ｃｏｒｅ、Ｅ１、ＮＳ３またはＮＳ５抗原）由来、パラミクソウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質またはそれらの誘導体）由来、パラインフルエンザウイルス由来、風疹ウイルス（例えば、タンパク質ＥｌおよびＥ２）、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えば、ＬＩ、Ｌ２、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞、例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡまたはＭタンパク質またはそれらの組み合わせ）由来抗原、ロタウイルス抗原（例えば、ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分）などが挙げられる（ウイルス抗原についての更なる例については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｎ．およびＫｎｉｐｅ、Ｄ．Ｍ．編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）を参照されたい）。
【００６５】
細菌性抗原には、例えば、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ）、例えばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来抗原（トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘジン）；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来抗原（例えば、Ｍタンパク質またはその断片およびＣ５Ａプロテアーゼ）；Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ， Ｓ． ｍｕｔａｎｓ； Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ； モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えばＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られている）由来抗原（例えば、高分子量および低分子量アドヘジンおよびインベジン）；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）由来抗原；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来抗原；レジオネラ属 （Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ由来抗原；（例えば、ＥＳＡＴ６、Ａｎｔｉｇｅｎ８５Ａ、８５Ｂまたは８５Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰＩＯ、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ）、例えば、腸管毒性（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ）大腸菌由来抗原（例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌由来抗原（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ）、例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ由来抗原（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）；赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えばＳ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ由来抗原；エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ）、例えば、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来抗原（例えば、Ｙｏｐタンパク質）；Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ，Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来抗原；カンピロ バクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来抗原（例えば、毒素、アドヘジンおよびインベジン）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ由来抗原；リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来抗原；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）、例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来抗原（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来抗原；ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来抗原；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えばＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ由来抗原；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ由来抗原（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ由来抗原（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来抗原（例えばクロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）；バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、例えばＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来抗原（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来抗原（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、 ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、 ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ由来抗原；エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球性エーリキア症の物質由来抗原；リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ）、例えば、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ由来抗原；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来抗原（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来抗原（例えば、ＭＯＭＰ、へパリン結合タンパク質）；Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ由来抗原；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、Ｌ． ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ由来抗原；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来抗原（例えば稀少外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来の抗原；プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来抗原；トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ由来抗原（例えばＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）；エントアメーバ属、例えば、Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ由来抗原；バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ由来抗原；トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ由来抗原；ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ由来抗原；リューシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｌ．ｍａｊｏｒ由来抗原；ニューモシスティス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ由来抗原；トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来抗原；スキゾストーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ由来抗原、または酵母、例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来抗原；クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来抗原；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来抗原（例えば、Ｒｖ２５５７， Ｒｖ２５５８， ＲＰＦｓ： Ｒｖ０８３７ｃ， Ｒｖ１８８４ｃ， Ｒｖ２３８９ｃ， Ｒｖ２４５０， Ｒｖ１００９， ａｃｅＡ （Ｒｖ０４６７）， ＰｓｔＳ１， （Ｒｖ０９３２）， ＳｏｄＡ （Ｒｖ３８４６）， Ｒｖ２０３１ｃ １６ｋＤａｌ．， Ｔｂ Ｒａ１２， Ｔｂ Ｈ９， Ｔｂ Ｒａ３５， Ｔｂ３８−１， Ｅｒｄ １４， ＤＰＶ， ＭＴＩ， ＭＳＬ， ｍＴＴＣ２ ａｎｄ ｈＴＣＣ１）； Ｃｈｌａｍｙｄｉａ由来抗原（例えば、高分子量タンパク質 （ＨＷＭＰ）， ＯＲＦ３ （ＥＰ ３６６ ４１２）および推定膜タンパク質（Ｐｍｐｓ）；ストレプトコッカス属、例えば、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質、タンパク質抗原肺炎球菌溶血素およびその突然変異解毒誘導体）；ヘモフィルス属、例えば、Ｂ型インフルエンザ菌由来抗原（例えば、ＰＲＰおよびその複合体）；分類不能型インフルエンザ菌由来抗原（例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘジン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来のペプチドまたはそのマルチコピー変異体または融合タンパク質；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来抗原（例えば、ＲＴＳ．Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属におけるそれらの類似体）などがある。
【００６６】
本発明による複合体を構成するアデノウイルスに用いられる真菌抗原には、例えば、カンジダ真菌抗原成分；ヒストプラズマ真菌抗原、例えば、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）および他のヒストプラズマ真菌抗原成分；クリプトコッカス真菌抗原、例えば、莢膜多糖類および他のクリプトコッカス真菌抗原成分；コッシジオイド真菌抗原、例えば、小球抗原および他のコッシジオイド真菌抗原成分；ならびに白癬真菌抗原、例えば、トリコフィチンおよび他のコッシジオイド真菌抗原成分などがあるが、これらには限定されない。
【００６７】
原生動物抗原には、熱帯熱マラリア原虫抗原、例えば、メロゾイト表面抗原、種虫表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母体／配偶子表面抗原、ブラッドステージ抗原ｐｆ、５５／ＲＥＳＡおよび他のプラスモジウム抗原成分；トキソプラズマ抗原、例えば、ＳＡＧ−Ｉ、ｐ３０および他のトキソプラズマ抗原成分；住血吸虫抗原、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスケェラーゼ、パラミオシンおよび他の住血吸虫抗原成分；リーシュマニア主要および他のシュマニア抗原、例えば、ｇｐ６３、リポホスホグルカンおよびその関連タンパク質および他のシュマニア抗原成分；ならびにクルーズトリパノソーマ抗原、例えば、７５−７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分などがあるが、これらには限定されない。
【００６８】
抗原は、アレルゲンまたは環境抗原、例えば、天然アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草および草花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入、唾液および毒アレルゲン）、獣毛およびふけアレルゲンならびに食物アレルゲン由来抗原であることができるが、これらには限定されない。樹木、草およびハーブから得た重要な花粉アレルゲンは、分類学上のブナ目、モクセイ目、マツ目、及びスズカケノキ科、例えば、カバ（Ｂｉｒｃｈ）（カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ））、ハンノキ（ａｌｄｅｒ）（ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ））、セイヨウハシバミ（ｈａｚｅｌ）（ハシバミ属 （Ｃｏｒｙｌｕｓ））、セイヨウシデ（ｈｏｒｎｂｅａｍ）（クマシデ属（Ｃａｒｐｉｎｕｓ））及びオリーブ（ｏｌｉｖｅ）（オリーブ属（Ｏｌｅａ））、シーダー（ｃｅｄａｒ）（スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）及びビャクシン属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ））、プラタナス（Ｐｌａｎｅ ｔｒｅｅ）（プラタナス属（Ｐｌａｔａｎｕｓ））、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、例えば、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、シラゲガヤ属（Ｈｏｌｃｕｓ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）及びモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、例えばブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）及びヒカゲミズ属 （Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）のハーブに由来するものである。他の使用可能なアレルゲン抗原には、ヒョウヒ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）及びユーログリファス属（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）のチリダニ、貯蔵庫ダニ（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、レピドグリフィス属（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、ニクダニ属（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）及びケナガコナダニ属（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ））及びブロミア（Ｂｌｏｍｉａ）のようなダニに由来するもの、ゴキブリ、ユスリカ及びノミ（ｆｌｅａ）（例えば、チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ペリプラネタ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、キロノムス属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）及びクテノケファリデス属 （Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ））に由来するもの、及び哺乳動物（例えば、ネコ（ネコ属（Ｆｅｌｉｓ））、イヌ（イヌ属（Ｃａｎｉｓ））、ウシ（ウシ 属（Ｂｏｓ））、ウマ（ウマ属（Ｅｑｕｕｓ））、ラット（クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ））、マウス（ハツカネズミ属（Ｍｕｓ））及びモルモット（テンジク ネズミ属（Ｃａｖｉａ））に由来するもの、毒素アレルゲン（刺すか又は噛み付く昆虫（分類学上のハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）（ミツバチ（ミツバチ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ａｐｉｄａｅ））、スズメバチ（スズメバチ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖｅｓｐｉｄｅａ））及びアリ（アリ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ））を含む）に由来するものがある。さらに使用可能な他のアレルゲンには、吸入性アレルゲンは、例えばアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）及びクラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）に由来するものがある。
【００６９】
また、抗原は、腫瘍抗原、例えば、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス性生成物、腫瘍抗原のスマッドファミリー、ｌｍｐ−１、ｐ１Ａ、ＥＢウイルスコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンフォスフォリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、グリオーマ（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱ガン（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳ガン（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸ガン（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸ガン（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛腫（ＣＥＡ）、上皮細胞ガン（シクロフィリンｂ）、胃ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞ガン、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺ガン（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔ガン（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣ガン（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺ガン（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部及び食道の扁平上皮細胞癌（ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物）、睾丸ガン（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が挙げられる。
【００７０】
好ましい実施態様によれば、抗原ポリペプチドは、ＨＣＶ抗原である。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３タンパク質またその断片である。
【００７１】
ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼは、いずれかのＨＣＶ型（例えば、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１があるが、これらには限定されない）からのアミノ酸１０２７〜１６５７にわたるＨＣＶポリタンパク質領域に相当し、その公知のサブタイプには、ＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、５ａ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａおよび１１ａなどがある。但し、これらのエンドポイントは近似値である。上記したエンドポイントは、例えば、ＨＣＶポリタンパク質の上流部またＨＣＶＮＳ３領域自体における挿入／欠失により変化することがあるので、絶対的なものではない。このような挿入／欠失は、種々の遺伝子型のＨＣＶポリタンパク質配列を比較したときに明らかなように、存在することは公知である。
【００７２】
本明細書において用いられる用語「ＮＳ３断片」は、少なくとも一つのＨＣＶＮＳ３エピトープ（Ｂ細胞エピトープまたＴ細胞エピトープ）を含んでなるＨＣＶＮＳ３の領域に関する。本明細書で使用される用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは、約５から１０または１５、および約１，０００を超えないアミノ酸であって、それ自身またはより大きい配列の一部として、このような配列に反応して生成した抗体に結合する配列を定義するアミノ酸のペプチド配列を意味する。
【００７３】
具体的実施態様によれば、本発明のＮＳ３抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶＮＳ３ペプチドを含んでなる。エピトープの一つ以上を含んでなるＮＳ３ポリタンパク質の好適な断片には、以下のものがあるがこれらには限定されない：
−受託番号ＡＣＨ８１０２０のＮＣＢＩおいて定義されているペプチド（配列番号：１２）
−ＨＣＶポリタンパク質領域またはその一部分のアミノ酸１０７１〜１０８４、例えば、ＨＣＶポリタンパク質領域のアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるポリペプチド
−ＨＣＶＨからのＮＳ３ヘフリカーゼドメインを含んでなるアミノ酸１１９２〜１４５８にわたるペプチド
−ＷＯ２００７５６７６０の表１に記載のＨＣＶポリタンパク質および変異体のアミノ酸１４０６〜１４１５にわたるペプチド
−ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるペプチド
−ｃ２５ＮＳ３エピトープ
−ＵＳ５３５０６７１、Ｃｈｉｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国、１９９２、８９：１００１１−１００１５）；Ｃｈｉｅｎら（Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ． Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９３、８：Ｓ３３−３９）；ＷＯ ９３００３６５；ＷＯ９４０１７７８およびＵＳ６１５００８７に記載のエピトープ
−ＨＣＶエピトープデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏ／ｉｍｍｕｎｏ−ｍａｉｎ．ｈｔｍｌ）（Ｙｕｓｉｍ Ｋら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５；４（４）に含まれているＨＣＶＮＳ３のＣＴＬおよびＴヘルパーエピトープ
−Ａｒｒｉｂｉｌｌａｇａら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２００２、２１：２０２−２１０）により同定され、Ｈ−２ｄ結合モチーフを有し且つ表１に示す配列を有するペプチド
【００７４】
【表１】
【００７５】
好ましい実施態様によれば、ＮＳ３抗原は、
ＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＤＧＥＶＱＶＬＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＶＰＶＲＲＲＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＩＥＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＧＰＩＴＹＳＴＹＣＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬＡＴＡＴＰＰＧＳＩＴＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹＧＫＡＩＰＩＥＡＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫＬＴＧＬＧＬＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＬＰＱＤＡＶＳＲＡＱＲＲＧＲＴＧＲＧＲＳＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＬＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴＳＴＷＶ（配列番号：１２）
に対応するＨＣＶ遺伝子型１ｂからのＮＳ３タンパク質に相当する。
【００７６】
本発明による医薬組成物
別の態様によれば、本発明は、上記で定義した本発明による組成物または複合体と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容される担体」は、非毒性、不活性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、包摂材料、又は任意の種類の製剤補助剤を意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５は、医薬組成物を製剤化するのに使用される種々の担体およびその調製についての公知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として機能することができる物質をいくつか挙げると、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えば、コーンスターチおよびジャガイモ澱粉、セルロースおよびその誘導体、例えば、ソジウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテート；粉末状トラガントガム；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバターおよび座薬用ロウ；オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油；サフラワー油；ごま油；オリーブ油；コーン油および大豆油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；洗剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質を含有しない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液、さらには他の非毒性適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに製剤業者の判断に従い組成物中に存在してもよい着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、防腐剤および抗酸化剤などがあるが、これらには限定されない。濾過または最終滅菌法が可能でない場合には、製剤は、無菌条件下で製造できる。
【００７８】
ある条件下では、本発明による複合体または組成物を制御放出製剤として提供することが好ましいことがある。本明細書において用いられる用語「制御放出」（およびその用語の変形）（例えば、「制御放出系」において）は、一般的に、選択された部位での物質（例えば、薬剤またはタンパク質）の放出、または速度、間隔および／または量の面で制御可能な放出を包含することを意味する。制御放出は、実質的に連続した送達、パターン化した送達（例えば、規則的または不規則な時間間隔で中断する一定期間にわたる断続的送達）、および選択された物質の塊の送達（例えば、比較的短時間（例えば、数秒または数分）での物質の所定の個別量として）を包含するが、これらには限定されない。
【００７９】
本発明による治療方法
本発明者らは、被験者に、本発明によるアダプターの存在下に抗原をコードするアデノウイルス粒子と予め接触させたＤＣを投与すると、アダプター分子の不存在下でアデノウイルス粒子と接触させたＤＣで観察されるよりも強力な単離ＮＳ３抗原に対する反応を生じることを見出した。したがって、本発明による複合体を両方とも必要とする被験者に直接投与することにより、被験者自身のＤＣがアデノウイルス粒子により生体内に導入される。
【００８０】
したがって、別の態様によれば、本発明は、被験者に、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体を投与する工程を含んでなる、被験者において抗原に対する免疫反応を引き起こす方法に関する。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、
または医薬に使用される、前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００８２】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、または前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物の、前記抗原に対する免疫反応を引き起こすための薬剤を製造するための使用に関する。
【００８３】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、前記抗原に対する免疫反応を引き起こすための、前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００８４】
本発明による方法に使用される複合体の成分（ａ）および（ｂ）は、本発明による複合体に関連して詳細に説明したものと実質的に同様であり、したがって、ここではさらには説明しない。好ましい実施態様によれば、アデノウイルスは、ＨＣＶ抗原をコードする。この場合、本発明の方法は、Ｃ型肝炎の治療または予防に使用される。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原性断片である。
【００８５】
好ましい実施態様によれば、複合体は、投与前に、前記複合体の形成に適切な条件下で、複合体の構成成分を接触させることにより形成される。複合体の形成に適切である条件は、２成分の結合を判定する従来の方法、例えば、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配遠心分離、クロマトグラフィー、生物発光共鳴エネルギー伝達（ＢＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）等を用いて、当業者により容易に決定することができる。
【００８６】
本発明による複合体を、経口経路および非経口経路を含む当該技術分野において公知の手段により患者に投与できる。このような実施態様によれば、注射（例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射）、直腸内、経膣的、局所的（粉末、クリーム、軟膏または点滴剤による）または吸入（スプレーによる）により投与できる。
【００８７】
複合体を、それを必要としている被験者に、全身に、例えば、静脈内注入または注射により投与できる。注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化できる。また、無菌注射剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒を用いた無菌注射液、懸濁液または乳剤、例えば、１，３−ブタンジオールを用いた溶液でもよい。使用できる許容可能なビヒクルには、水、リンガー溶液、米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）および等張塩化ナトリウム溶液などがある。さらに、無菌固定油が、溶液または懸濁化剤として通常用いられている。このためには、合成モノ−またはジグリセリドなどのいずれの無菌性固定油を用いてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用される。一実施態様によれば、本発明の複合体を、１％（ｗ／ｖ）ソジウムカルボキシメチルセルロースと、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０とを含んでなるキャリア流体に懸濁する。注射製剤を、例えば、使用前に、細菌保持フィルターを用いた濾過によるか、または滅菌水または他の無菌注射媒体に溶解または分散されることのできる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより滅菌することができる。
【００８８】
直腸または膣投与用組成物は、座薬でもよい。この座薬は、本発明による複合体を、好適な非刺激性賦形剤または担体、例えば、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶融する、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬用ロウと混合することにより調製することができる。
【００８９】
本発明による医薬組成物の局所または経皮吸収投与用剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチなどがある。本発明の複合体を、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要とされることがあるいずれかの必要とされる保存剤または緩衝液と混合される。また、眼科製剤、点耳薬および点眼薬も、本発明の範囲内であることを意図している。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の複合体の他に、賦形剤、例えば、動物および植物脂肪、オイル、ロウ、パラフィン、澱粉、トラガントガム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物を含有していてもよい。経皮パッチは、化合物の体への制御送達が可能であるさらなる利点がある。このような剤形は、本発明の複合体を適切な媒体に溶解または分散することにより製造することができる。また、吸収促進剤を使用して、皮膚を通しての化合物の流量を増加させることもできる。速度は、律速膜を設けることによるか、または本発明の複合体をポリマーマトリックスまたはゲルに分散することにより制御することができる。粉末または噴霧剤は、本発明の複合体の他に、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはそれらの混合物を含有できる。噴霧剤は、通常の推進剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有できる。経口投与するとき、本発明の複合体を、カプセル化できるが、必ずしもカプセル化をしなくてもよい。種々の好適なカプセル化系が、当該技術分野において公知である（「薬剤および調剤におけるマイクロカプセルおよびナノ粒子（Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、Ｄｏｕｂｒｏｗ、Ｍ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ ｒａｔｏｎ、１９９２；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ ５：１３、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、反応性ポリマー（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）６：２７５、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．３５：７５５、１９８８；Ｌａｎｇｅｒ Ａｃｅ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３３：９４，２０００；Ｌａｎｇｅｒ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅｌｅａｓｅ ６２：７，１９９９； Ｕｈｒｉｃｈら、 Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９９：３１８１，１９９９；Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅｌｅａｓｅ ７５：２７、２００１；およびＨａｎｅｓら、Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：３８９，１９９５）。本発明の複合体を、生分解性高分子微小球またはリポソーム内にカプセルル化してもよい。生分解性微小球の調製に有用な天然および合成ポリマーとしては例えば、炭水化物、例えば、アルギン酸塩、セルロース、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミド、ポリホスファゼン、ポリプロピルフマレート、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、ポリカーボネート、多無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）および他の生分解性ポリエステルなどがある。リポソーム産生に有用な脂質としては、例えば、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどがある。
【００９０】
経口投与用医薬組成物は、液体または固体であることができる。本発明による組成物を経口投与するのに好適な液状剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤などがある。カプセル化または未カプセル化複合体の他に、液状剤形は、当該技術分野において一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物を含有することができる。
【００９１】
不活性希釈剤の他に，経口組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤，甘味剤、矯味剤、芳香剤を含むこともできる。本明細書で使用される用語「アジュバント」は、免疫反応の非特異的調節剤であるいずもの化合物をも意味する。ある実施態様によれば、アジュバントは、免疫反応を刺激する。本発明にあわせて、いずれのアジュバントを使用してもよい。多数のアジュバント化合物が当該技術分野において公知である（Ａｌｌｉｓｏｎ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ９２：３−１１，１９９８；Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−２８１，１９９８；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １０：１５１−１５８，１９９２）。経口投与用固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末剤および顆粒剤などがある。
【００９２】
このような固体剤形では、カプセル化または未カプセル化複合体を、少なくとも一種の不活性の薬学的に許容される賦形剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウムおよび／または（ａ）フィラーまたは増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉、タピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば第４アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、並びに（ｉ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸
剤の場合、その投与形態はさらに緩衝剤を含有してもよい。同様の種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟質および硬質ゼラチンカプセル剤においてフィラーとして使用することもできる。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤のような固体剤形は、被膜およびシェル、例えば、腸溶被膜および医薬製剤分野でよく知られている他のものを用いて製造することができる。対象逆ミセルの正確な投与量は、個々の医師によって、治療される患者を考慮して選択され、一般的に、投与量および投与は、有効量の対象粒子を治療すべき患者に投与するように調整されることが理解されるであろう。対象粒子について本明細書で使用される「有効量」は、所望の生物学的反応を引き起こすのに必要な量を指す。当業者には、対象粒子の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、標的組織、投与経路等の因子に応じて異なることができることは理解されるであろう。例えば、抗癌剤を含有する対象粒子の有効量は、所望の期間で所望の量の腫瘍サイズの減少を生じさせる対象粒子の量であることができる。考慮することがあるさらなる因子には、疾病状態の程度；治療患者の年齢、体重および性別；食事；投与の時間および頻度；薬剤の組み合わせ；反応感度；ならびに治療に対する耐性／反応などがある。
【００９３】
本発明による複合体は、投与を容易するためおよび投与量の均一性の観点から、投与量単位の形態で製剤化してもよい。本明細書において用いられる表現「投与量単位の形態」とは、治療患者に適切な複合体の物理的な個別単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の毎日の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医により決定されることは理解されるであろう。いずれの複合体についても、治療的に有効な投与量は、最初に、細胞培養アッセイによるか、動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにより推定できる。動物モデルを用いて、望ましい濃度範囲および投与経路を得ることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトへの投与に有効な投与量および経路を決定することができる。複合体の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％を致死させる投与量）により決定できる。毒性：治療効果投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表される。大きな治療指数を示す医薬組成物が、一部の実施態様に有用なことがある。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を決めるのに使用できる。
【００９４】
複合体は、体重１キログラム当たり概略１複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１４複合体の範囲の投与量で送達される。一般的に、複合体は、体重１キログラム当たり概略１０６複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１３複合体の範囲の投与量で送達され、典型的な投与量は、体重１キログラム当たり概略１０８複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１２複合体の範囲である。
【００９５】
選択された間隔で、レシピエントのリンパ器官からのＤＣを使用して、発現を、例えば、マーカー遺伝子の発現を観察することにより測定してもよい。ウイルス処理レシピエントのエリンパ節および脾臓からのＴ細胞を、抗原刺激に対する反応の大きさおよび持続性から測定できる。上皮細胞およびリンパ細胞などのＤＣ以外の組織細胞を、生体内遺伝子送達の特異性について分析できる。
【００９６】
抗原負荷ＣＤ４０陽性細胞を得る方法
本発明者らは、本発明によるアダプタータンパク質は、アデノウイルスがＣＤ４０細胞に効率的に導入されることを可能にするとともに、標的細胞におけるアダプタータンパク質のＣＤ４０Ｌ部分とｃ０との相互作用によりＣＤ４０の成熟化を促進することを見出した。実際に、実施例１、２、３、４、８、９、１０、１１および１２で得られた結果は、本発明のアダプター分子の存在下でのＤＣのアデノウイルスに対する反応を開示している。したがって、別の態様によれば、本発明は、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を、本発明によるアダプタータンパク質および抗原をコードするアデノウイルスと接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触を実施する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと、前記アデノウイルスと、前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの取込み、プロセッシングおよび提示に適切な条件下で細胞を維持する工程と
を含んでなる、方法に関する。
【００９７】
本明細書において用いられる用語「ＣＤ４０陽性抗原提示細胞」は、ＭＨＣ分子との関連でペプチドを提示することができ、そしてＣＤ４０Ｌの発現を示すいずれの細胞も含むことが理解されるであろう。ＣＤ４０陽性ＡＰＣには、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞、例えば、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ラングルハンス細胞および人工抗原提示細胞などがあるが、これらには限定されない。
【００９８】
好ましい実施態様によれば、「ＣＤ４０陽性抗原提示細胞」は、樹状細胞である。本明細書において用いられる用語「樹状細胞」はリンパ球または非リンパ球に見られる形態学的に類似した細胞型のさまざまな集団のものを指す。ＤＣは、「プロフェッショナル」抗原提示細胞と称され、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作する高い能力を有している。ＤＣは、機能、表現型および／または発現パターン、細胞表面表現型により認識されることができる。これらの細胞は、独特の形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ表現および抗原をＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、特に未感作Ｔ細胞に提示する能力により特徴づけられる。樹状細胞により活性化されたＣＤ４＋細胞は、樹状細胞により活性化されたＣＤ４＋細胞は、ＩＦＮ−ガンマ産生し、抗原特異的Ｂリンパ球の増殖および抗体産生を誘発する。樹状細胞により活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞毒性顆粒を細胞に放出することにより、抗原（例えば、ウイルス感染細胞）を表示する細胞を殺生する。
【００９９】
形態学的に、樹状細胞は、特徴的な静脈様突起を有する独特の表面により特徴づけられ、そして細胞表面マーカーＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現により特徴づけられる。ほとんどのＤＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび顆粒球を含む他の白血球系統のマーカーに対して陰性である。樹状細胞の亜母集団は、さらなるマーカー、例えば、３３Ｄ１、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ−ｄ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３ （ＩＬ３Ｒ．ａｌｐｈａ．）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１６２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＥＣ２０５、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＭＡＲＣＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３ ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９および数種のレクチン発現するものでもよい。これらの表面マーカーの発現のパターンは、樹状細胞の成熟性、それらの起源組織および／またはそれらの起源種により異なる。機能的には、ＤＣは、抗原提示の判定に用いられる簡易なアッセイにより同定できる。このようなアッセイは、試験抗原の提示により抗原感作および／または未変性Ｔ細胞を刺激する能力を試験後、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２の放出等を判定することを含む。
【０１００】
抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得るための方法の第一工程では、ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を、本発明によるアダプタータンパク質および抗原をコードするアデノウイルスと接触させる。この接触は、ポリペプチドとアデノウイルスとを別個に添加することによるか、または予め形成したポリペプチド−アデノウイルス複合体］を添加することにより実施できる。
【０１０１】
ＣＤ４０陽性抗原提示細胞は、好適な起源から標準的な方法を用いて得られる。このような好適な組織源には、例えば、抹消血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節生体組織、胸腺、脾臓、皮膚、臍帯血、抹消血から採取した単球、抹消血から採取したＣＤ３４またはＣＤ１４陽性細胞、骨髄血または他の好適な組織または流体などがある。
【０１０２】
ＡＰＣがＤＣである特定の場合において、そしてある種の疾病を患っている患者は樹状細胞機能の減少（すなわち、抗原提示不全および成熟不全）を示すことから、前躯体細胞を得た後、生体外で機能的樹状細胞を得ることが好ましい。
【０１０３】
したがって、本発明においては、幹細胞前躯体刺激樹状細胞分化を、過剰増殖性疾病の生体外治療法として用いることを意図している。単球を培養し、樹状細胞に分化する方法は、米国特許５８４９５８９に記載されている。この方法は、前躯体細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαを含有する培地で培養することを含む。樹状細胞単離する別法が、米国特許５６４３７８６に記載されている。この方法は、水簸ローターから少なくとも４種の流量で抹消血を水簸することを含む。カルシウムイオノフォアを使用して、プロセス中に単離した単球を刺激して樹状細胞すること、および活性化樹状細胞の再導入を含む疾病の治療も開示される。また、本発明において有用であると考えられる不死化前躯体細胞を調製することも可能ある（米国特許５８３０６８２および米国特許５８１１２９７）。別の例において、ｐ５３成長抑制遺伝子欠乏動物由来の未成熟樹状細胞株を調製する（米国特許５６４８２１９）。未成熟樹状細胞を誘発することにより、Ｔ細胞増殖を刺激し、したがって、本発明に使用することが意図される活性化、不死化樹状細胞株としてもよい。
【０１０４】
一旦ＤＣが入手できると、細胞は本発明によるアダプターポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスと接触されるか、または予め形成されたアダプターポリペプチドとアデノウイルスとの複合体と接触される。三成分を接触させる場合、アデノウイルスの線維タンパク質とアダプタータンパク質のＣＡＲドメインとの相互作用およびアダプターにおけるヒトＣＤ４０ＬとＣＤ４０陽性細胞との間の相互作用から、三元複合体を形成する必要がある。アデノウイルスとアダプターポリペプチドとの間の複合体がすでに形成されている場合には、接触工程では、アデノウイルス−アダプター複合体に存在するヒトＣＤ４０Ｌと、ＣＤ４０細胞の表面に存在するＣＤ４０との間の相互作用により、アデノウイルス−アダプター複合体とＣＤ４０陽性細胞との間の二次複合体を形成する必要がある。
【０１０５】
第一工程で使用されるアデノウイルスによりコードされている抗原は、上記で定義されたいずれかの好適な抗原であることができる。好ましい実施態様によれば、抗原は、ＨＣＶ抗原である。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原性断片である。上記で定義したＮＳ３変異体またはその抗原性断片は、本発明の方法に使用するのに好適である。
【０１０６】
別の好ましい実施態様によれば、第一工程で使用される樹状細胞は、Ｃ型肝炎の患人から得られる。ＨＣＶに感染した患者から得たＤＣは、通常の刺激に反応した成熟化が不十分であるという従来技術における証拠とは対照的に、本発明者らは、ＩＬ−１２発現および同種Ｔリンパ球を刺激する能力とにより測定したとき、ＨＣＶに感染した患者から得たＤＣが、対照被験者からの細胞と同様に本発明のアダプターに反応して成熟するという驚くべき知見を得た（実施例１２参照）。
【０１０７】
これらの細胞に、生体内で、本発明によるアダプター分子の存在下で、ＨＣＶ抗原を発現する組み換えアデノウイルスベクター（ｒＡｄ）を導入する。
【０１０８】
さらなる工程において、細胞を、抗原由来の一種以上のペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示に適切な条件下に維持する。アデノウイルスによりコードされている抗原から得た少なくとも一種の抗原性ペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示に好適な条件は、ＤＣ活性化を測定する標準アッセイを用いることにより測定することができる。
【０１０９】
多数の分子マーカーおよび多数の細胞表面表現型の変化を用いて、ＤＣの成熟化をすることができる。これらの変化を、例えば、フローサイトメトリー法を用いて分析できる。典型的には、成熟マーカーを、特異的抗体およびマーカーを発現するＤＣを用いて標識するか、または一連の意図するマーカーを、例えば、細胞選別ＦＡＣＳ分析を用いて、総ＤＣ集団から分離することができる。ＤＣ成熟化のマーカーには、未成熟ＤＣと比較して、成熟ＤＣにおいてより高いレベルで発現する遺伝子などがある。このようなマーカーには、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ抗原（特に、ＨＬＡ−ＤＲ）、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、細胞輸送分子、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１８などがあるが、これらには限定されない。さらに、ＤＣの成熟化を、Ｔｈ１反応の誘導と関連する一定のリッチリガンド、例えば、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ジャグド１およびジャグド２を測定することにより実施できる。さらに、成熟樹状細胞は、混合白血球反応（ＭＬＲ）における未変性同種Ｔ細胞の増殖を刺激する能力に基づいて同定できる。さらに、一般的に、未成熟樹状細胞は抗原取込みにおいて非常に効率的であるが、不十分な抗原提示細胞であるのに対して、成熟樹状細胞は抗原取込みでは不十分であるが、非常に効率的な抗原提示細胞であることが判明した。樹状細胞の抗原提示機能は、本明細書に記載の抗原依存性ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞活性化アッセイ、さらには当業者に周知の他の標準アッセイ、抹消血リンパ球に対する生体内刺激能を用いて、例えば、ＤＣの存在下で、ＣＤ８＋リンパ球により産生されるＩＦＮ−γの量の測定により測定できる。この測定は、ＥＬＩＳＰＯＴとして知られている技術を用いて実施できる。さらに、細胞活性化は、例えば、刺激樹状細胞により産生したサイトカインの誘導を測定することにより判定できる。サイトカインの産生の刺激は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ等の種々の標準的手法を用いて定量化できる。
【０１１０】
トリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）による標的細胞の標識等の他の細胞毒性アッセイを使用することもできる。３Ｈ−ＴｄＲは、標的細胞により、細胞の核に取り込まれる。３Ｈ−ＴｄＲの放出は、ＤＮＡ断片化による細胞死の目安である。アッセイは、インキュベーション時間が少なくとも約４８時間であり、５０ｐ、１〜約１００ｍｌの上清を、少なくとも約１ｍｌのシンチレーション流体の存在下でベータカウンターにより測定する以外は、上記のようにしてアッセイをおこなう。特異的溶解百分率の計算は、上記式を用いておこなう。
【０１１１】
本発明による樹状細胞製剤（前躯体または成熟、免疫原性またはトレラゲン性、そして免疫原性である場合には抗原を負荷した前または後）のいずれも、調製後に保存して、後で治療投与またはさらなる処理に使用できる。負荷前または負荷後に樹状細胞を凍結保存する方法は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２１６５６０に記載されている。
【０１１２】
樹状細胞ワクチン接種
本発明によれば、成熟で且つ抗原を負荷したＡＰＣを得るための方法が提供される。したがって、別の態様によれば、本発明は、上記に記載した方法により得られる抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞に関する。
【０１１３】
細胞を、ＤＣワクチンとしてそれらを使用することにより、すなわち、前記患者に細胞を投与することにより、患者に免疫反応を引き起こすのに使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、被験者における免疫反応を引き起こすための、本発明で定義した抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞に関する。換言すれば、本発明は、また抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者において免疫反応を引き起こすための方法に関する。
【０１１４】
ＤＣワクチン接種は、免疫反応を誘発する被験者（例えば、ヒト患者）に抗原負荷ＤＣを投与することにより実施される。典型的には、免疫反応には、標的抗原性ペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体）を有する標的細胞に対するＣＴＬ反応などがある。これらの標的細胞は、典型的には癌細胞である。改変ＤＣを患者に投与するときには、好ましくは患者からの前躯体細胞から単離または得る（すなわち、ＤＣを、採取したのと同じ患者に投与する）。しかしながら、細胞を、ＨＬＡ適合同種またはＨＬＡ不適合同種患者に注入してもよい。後者の場合、免疫抑制薬をレシピエントに投与してもよい。
【０１１５】
細胞を、好ましくは薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）とともに、いずれかの好適な方法で投与できる。通常、投与は静脈注射でおこなうが、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路での投与も可能である。投与（すなわち、免疫化）は、時間間隔を設けて反復してもよい。ＤＣの注入を、ＤＣ数と活性を維持する役割を果たすサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２）の投与と組み合わせてもよい。
【０１１６】
患者への投与量は、Ｔ細胞増殖を測定するアッセイにより検出される免疫反応、Ｔリンパ球細胞障害を測定するアッセイで検出される免疫応答の誘発および／または経時的に患者における有益な治療反応を生じさせるのに十分なものでなければならない。典型的には、可能な場合には、１０６〜１０９またはそれ以上のＤＣを、注入する。ワクチンは、有益な結果を付与するために、患者に一回以上投与することができる。当業者は、ワクチン投与の適切なタイミングを決定することができる。ワクチンの最初の投与および／または続いての投与のタイミングは、種々の要因、例えば、患者の健康、安定性、年齢および体重（但し、これらには限定されない）に依存する。ワクチンは、適切な時間間隔（例えば、一週間に一度、二週間ごと、三週間に一度、一カ月に一度（但し、これらには限定されない））で投与できる。一実施態様によれば、ワクチンを無期限に投与できる。一実施態様によれば、ワクチンを、２週間間隔で３回投与できる。ワクチンの適切な投与量は、種々の因子、例えば、患者の健康、安定性、年齢および体重（但し、これらには限定されない）にも依存する。臨床的利点得るのに十分なレベルの免疫が得られたら、持続追加免疫が必要なことがあるが、この場合、一般的に、投与頻度を少なくすることができる（例えば、一カ月ごとまたは半年ごと）。
【０１１７】
免疫反応を引き起こす方法で使用されるＤＣは、好ましくは容器に入手可能な医薬品として使用できるように製剤化される。この場合、製剤における細胞と治療患者との間の組織適合性が不一致な場合がある。ある場合、クラスＩＩ部位での不一致がワクチンの効果を高めることがある。同種細胞は、エキソソームの形態でパッケージ化腫瘍抗原を導入することにより、抗原提示細胞を交差摂取することができる（Ｓ．Ｌ．Ａｌｔｉｅｒｉら．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：２８２，２００４；Ｆ．Ａｎｄｒｅら．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２１２６，２００４；Ｎ．Ｃｈａｐｕｔら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：２３４，２００４）。投与細胞が、代わりに、宿主における食細胞により取り込まれる場合、それらの腫瘍抗原ペイロードが、勿論宿主細胞により提示されるであろう。他の例では、ＨＬＡ不一致が、細胞の早期除去を促進する（とりわけ複数回投与後）ことによるか、または免疫系を意図する標的からそらす強力な抗アロタイプ反応を生成することにより、ワクチンの効果を弱めることがある。この場合、樹状細胞上のＨＬＡ対立遺伝子（とりわけＡ座および特にＡ２対立遺伝）の少なくとも一部が患者と共有される、ワクチン製剤を使用することが有利なことがある。このように、腫瘍標的抗原の少なくとも一部分が、自己クラスＩ分子において提示され、抗腫瘍反応を高め、同種反応を減少させる。
【０１１８】
部分一致は、単に一般的な２種以上のアロタイプ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ１、Ａ１９、Ａ３、Ａ９およびＡ２４）を有する細胞の混合物から調製した樹状細胞ワクチンを提供することにより達成できる。ほとんどの患者のための完全一致は、臨床医に、一連の異なる樹状細胞を提供し、そこから各々ＨＬＡ−Ａ部位で単一のアロタイプを有すると思われるものを選択することで達成できる。治療は、標準組織適合検査により患者における一つ以上のＨＬＡアロタイプを同定した後、患者を患者に一致するＨＬＡアロタイプを有する樹状細胞で患者を治療することを含む。例えば、ＨＬＡ−Ａ２およびＡ１９だった患者は、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ１９ホモ接合細胞または両者の混合物で処理できる。
【０１１９】
また、ＨＬＡ不一致の生じるかもしれないマイナス効果は、外来アロタイプに対する免疫寛容を生成することにより対処することもできる。ワクチンの調製中、ＤＣを２つの集団に分ける：一つは未成熟寛容性（ｔｏｌｅｒａｇｅｎｉｃ）樹状細胞を生成するためのもので、もう一つは、抗原提示用成熟樹状細胞を生成するためのもの。同じ株由来であるので、寛容性細胞は、成熟細胞のグラフト受容性を高めるであろうＨＬＡ特異的寛容性を誘発するように設計される。被験者に、まず寛容性細胞を一回以上投与して、十分な程度の免疫無反応（例えば、混合リンパ球反応で測定可能）を生成する。寛容状態になったら（１週間〜１カ月後）、抗原負荷樹状細胞を必要な頻度で投与して、標的腫瘍抗原に対する免疫反応を引き起こす。
【０１２０】
好ましい実施態様によれば、抗原提示細胞は、治療被験者の自己由来樹状細胞である。
【０１２１】
ＤＣワクチン組成物は、抗原負荷ＡＰＣの他に、免疫刺激化合物、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび／または一種以上の免疫刺激性サイトカインを含んでなる。好適なＴＬＲアゴニストには、ＴＬＲ１を介して作用するアゴニスト、ＴＬＲ２アゴニスト、例えば、フェノール可溶性モジュリン、ＴＬＲ３アゴニスト、例えば、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ＰｏｌｙＩＣ）、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、フィブロネクチンの一つ以上のＥＤＡドメイン、または細菌性リポ多糖類、ＴＬＲ−５アゴニスト、例えば、細菌性フラジェリン、ＴＬＲ−６アゴニスト、例えば、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化ＬＰおよびおよびフェノール可溶性モジュリン、ＴＬＲ７アゴニスト、例えば、ロクソリビンまたはイミダゾキノリン化合物、ＴＬＲ−８アゴニスト、例えば、レジキモド、ＴＬＲ−９アゴニスト、例えば、未メチル化ＣｐＧヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあるが、これらには限定されない。
【０１２２】
本明細書において用いられる用語「免疫刺激性サイトカイン」は、免疫系のいずれかの成分の活性の増加を促進する化合物、例えば、それらの成分を形成している部分、あるいは細胞介在免疫反応、体液介在免疫反応および補体系に関与するものとして理解される。好ましくは、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγおよびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される。
【０１２３】
ワクチン組成物は、必要に応じてアジュバントを含む。アジュバント成分は、いずれかの好適なアジュバントまたは複数のアジュバントの組み合わせであることができる。例えば、好適なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；水中油型および油中水型配合物、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；鉱物ゲル；ブロック共重合体；アブリジン（登録商標）脂質−アミン；ＳＥＡＭ６２；細菌性細胞壁成分から形成したアジュバント、例えば、リポ多糖類（例えば、脂質Ａまたはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）；熱ショックタンパク質またはそれらの誘導体；ＡＤＰリボシル化細菌性トキシン、例えば、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、コレラトキシン（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定トキシン（ＬＴｌおよびＬＴ２）由来のアジュバント、シュードモナスエンドトキシンＡ、シュードモナスエンドトキシンＳ、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）外酵素、バチルススファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）トキシン、ボツリヌス菌Ｃ２およびＣ３トキシン、Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍ外酵素、さらには、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＤＩＮおよびＡＤＰ−リボシル化細菌性トキシン突然変異体、例えば、ＣＲＭ１９７、非毒性ジフテリアトキシン突然変異体由来のトキシン；サポニンアジュバント、例えば、ＱｕｉｌＡ（米国特許第５，０５７，５４０号）、またはサポニンから生成した粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；ケモカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２等）、インターフェロン類（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、デフェンシン１または２、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ＭＩＰｌ−アルファおよびＭＥＰ−２等；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタム（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスフォリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等；ＣｐＧ族分子、ＣｐＧジヌクレオチド、および合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含んでなる）由来のアジュバント、リモサム外酵素および合成アジュバント、例えば、ＰＣＰＰなどがあるが、これらには限定されない。
【０１２４】
ＤＣがＨＣＶおよびより具体的には、ＨＣＶＮＳ３の一種以上の抗原性ペプチドを含んでなるＤＣ系ワクチンの特定の場合においては、ワクチンは、ＨＣＶ感染の治療または予防、さらにはＨＣＶ感染、例えば、無症状慢性保菌状態、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌から生じる他の状態の治療に使用される。
【０１２５】
本発明を、以下の実施例により説明するが、これらの実施例は単に発明を説明したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
ＣＦｍ４０Ｌの使用が、ＤＣへのアデノウイルス導入効率を増加させる。
Ｃ５７ＢＬ６マウスの樹状細胞（ＤＣ）を、骨髄前駆細胞からＺａｂａｌｅｔａら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００８，１６：２１０−２１７）に記載のようにして生成した。このため、大腿骨および脛骨の骨髄細胞を抽出し、赤血球を溶解緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）を用いて溶解した。次に、ＲＰＭＩ１６４０での洗浄を実施し、ウサギサプリメントととともに種々の細胞集団に対する抗体の混合物を用いたインキュベーションにより、リンパ球と顆粒球を除去した：
−抗−ＣＤ４抗体（１００μｇ／ｍｌ）:ハイブリドーマＧＫ１−５（Ｄｉａｌｙｎａｓら，１９８３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３ Ｎｏｖ；１３１：２４４５−５１）から得た。
−抗−ＣＤ８抗体（１００μｇ／ｍｌ）：ラットハイブリドーマＨ３５．１７．２（Ｐｉｅｒｒｅｓら，１９８２，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２（１９８２），６０−６９）から得た。
−Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）（１０μｌ／ｍｌ）。
−ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（１５μｌ／ｍｌ）。
−ウサギサプリメント（ＳＩＧＭＡ社)（５０μｇ／ｍｌ）。
【０１２７】
この混合物を、２０分ごとに攪拌しながら、３７℃で５０分間インキュベーションした。インキュベーション後、洗浄し、得られた細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびインターロイキン（ＩＬ−４、２０ｎｇ／ｍｌ）（ともにＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社、英国ロンドン、から入手）を追加した完全培地（ＣＭ；１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）およびグルタミン（２ｍＭ）含有ＲＰＭＩ１６４０）中、１２ウエルプレート（日本国イワキ社製）において濃度１０６細胞／ｍｌで培養した。２日おきに、培地の３分の２を、サイトカインを追加した新鮮培地で交換した。７日目に、非付着細胞を集め、１０７細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０に再懸濁した。ＡｄＧＦＰアデノウイルス（緑色蛍光タンパク質をコードするもの）を種々の量で含有する溶液を、ＰＢＳ５０μｌ中、アダプターＣＦｍ４０Ｌ６μｇの存在下または不存在下、３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＤＣ（１０６）に添加した。Ｐｅｒｅｂｏｅｖら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；９：７１２−７２０）に記載のようにして、前記分子を発現するプラスミドを安定的に取り込んだ２９３細胞の培養上清からの精製により、アダプターＣＦｍ４０Ｌを得た。１時間のインキュベーション後、サイトカインを追加したＣＭを、最終濃度106 細胞／ｍｌまで細胞が希釈されるまで添加した。２４時間後細胞を集め、十分に洗浄して、アデノウイルス粒子を完全に除去した。洗浄後、得られた細胞を、フローサイトメトリーによる分析に使用した。結果は、各ウイルス使用量ごとに、形質導入細胞の百分率として図１に示されるとおりであった。
【０１２８】
実施例２
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現が誘発される。
Ｃ５７ＢＬ６マウスから得たＤＣを実施例１に記載のようにして調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＡｄＮＳ３（多重感染度３０）を導入した。未処理ＤＣまたはＣＦｍ４０Ｌ単独で処理したＤＣを、対照群として使用した。１日後にＤＣを集め、それらの成熟度を、フローサイトメトリーによる表面マーカー分析により検討した。マーカーＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂ（ＭＨＣクラスＩＩ）に対する抗体および対照アイソタイプ（上記の全てはＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から入手）を使用した。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中、４℃で標識を実施した。３０分後、細胞を洗浄し、種々の表面マーカーの発現を分析した。結果は図２に示されるとおりであった。
【０１２９】
実施例３
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でのＤＣへのＡｄＮＳ３の導入は、生体外成熟化：サイトカインの産生を誘発する。
実施例２と同様にして調製し、同じ群に分割（未処理、ＡｄＮＳ３、ＣＦｍ４０ＬおよびＣＦｍ４０Ｌ＋ＡｄＮＳ３）したＤＣを、２４時間培養した後、培養の上清を集めた。これらの培養上清における産生したＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＩＬ−６の量を、ELISA(BD−Pharmingen、米国ニュージャジー州フランクリンレイク)により、メーカーの瀬説明書に準じて測定した。結果は図３に示されるとおりであった。
【０１３０】
実施例４
ＣＦｍ４０Ｌにより誘発されるＤＣの成熟化は、Ｔｈ１反応の誘発に関連するＮｏｔｃｈリガンドの発現を伴う。ＤＣを実施例２と同様にして調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３（多重感染度３０）を導入した。１日後、細胞を集め、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ジャグド１およびジャグド２の遺伝子のｍＲＮＡの発現を、ＺａｂａｌｅｔａＡら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ １６：２１０−７）に記載のようにして、リアルタイムＰＣＲにより分析した。増幅に使用したプライマーを下表に示す：
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
結果は、アクチンで標準化し、未処理ＤＣに対する誘発度として図４に示されるとおりであった。
【０１３３】
実施例５
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣへＡｄＮＳ３を導入すると、生体外刺激能が増加する。
実施例２および３で述べた処理に附した（未処理、ＡｄＮＳ３およびＣＦｍ４０Ｌ＋ＡｄＮＳ３）Ｃ５７ＢＬ６マウスから得た種々の数のＤＣを、同種リンパ球（ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から得た１０５非付着細胞）とともに培養した。Ｕ型底９６ウエルプレートでアッセイを実施し、２日後に培養上清を集め、１ウエル当たり［３Ｈ］チミジン０．５μＣｉを添加し、さらに１８時間放置した。（Ａ）その後、試料を、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ベルギー）に集めた。乾燥後、シンチレーション流体をプレートに添加し組み込まれたチミジンを、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ；Ｐａｃｋａｒｄ社製、コネティカット州メリディン）で測定した。また、上清に存在するＩＦＮ−ガンマ（Ｂ）およびＩＬ−４（Ｃ）の量を、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により測定した。（Ｄ）ヒト分子HLA−A2遺伝子およびα２ミクログロブリン遺伝子導入HHD マウス [15]から得たＤＣを調製した。これらに、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下で多重感染度３０でＡｄＮＳ３を導入するかまたは未処理のままとし、２４時間後に集めた。これらのＤＣ（５ｘ１０３）／ウエルを使用して、Ｚａｂａｌｅｔａら（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２００７ Ａｐｒ；７４（１）：２５−３５）に記載されているようにしてポリ（Ｉ：Ｃ）および抗−ＣＤ４０とともに前記ペプチドで予め免疫したＨＨＤマウスの脾臓から得たペプチド１０７３−１０８１（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）（配列番号：４４）に特異的な１０３ＣＤ８Ｔリンパ球を刺激した。ＤＣおよびＴリンパ球を、９６ウエルELISPOTプレート(Multiscreen HTS; Millipore社)で培養し、２４時間後、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞数を、市販のBD−Pharmingenキットを用いて、メーカーの説明書に準じて測定した。スポットを、ELISPOTカウンター（CTL； Aalen、ドイツ）でカウントした。結果は図５に示されるとおりであった。
【０１３４】
実施例６
ＣＦｍ４０ＬとともにＡｄＮＳ３を導入したＤＣを免疫すると、ＤＣおよびＡｄＮＳ３単独よりも反応が大きくなる。
（Ａ）ＨＨＤマウスから得たＤＣを調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下において、多重感染度３０でＡｄＮＳ３を導入し、２４時間後に集めた。２ｘ１０５ＤＣを、ＨＨＤマウス（１群当たりｎ＝３）の尾部の基底に皮下注射し、１週間後にマウスを殺した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、市販のＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎキットを用いて、メーカーの説明書に準じてＩＦＮ−γ産生細胞頻度を測定した。脾細胞（５ ｘ １０５／ウエル）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートで培養した。ＰＢＳでの洗浄および１０％ウマ血清でのブロッキング後、細胞を、ＨＬ−１培地中、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＤ８エピトープ１０３８〜１０４７（ＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬ）（配列番号：４５）、１０７３〜１０８１（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）（配列番号：４４）、１４０６〜１４１５（ＫＬＶＧＬＧＩＮＡＶ）（配列番号：４６）（上記の全ては１０μＭ）または組み換えＮＳ３ タンパク質（ドイツ国Ｎｅｕｒｉｅｄ、Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）（１μｇ／ｍｌ） に対応する合成ペプチドの存在下または不存在下で、三重反復培養した。１日後、ＩＦＮ−γ産生細胞数を、メーカーの説明書に準じて測定した。結果は、抗原なしで培養したウエルで得たものを除いて、抗原の存在下で得たポイントを示している。（Ｂ）Zabaleta ら (Mol Ther. 2008, 16:210−7)に記載のNS3ペプチド1367、1427 および1447を抗原として使用した以外は、同様の実験を、C57Bl6 マウス株でおこなった。結果は図６に示されるとおりであった。
【０１３５】
実施例７
ＣＦｈ４０Ｌは、ヒトＣＤ発現細胞のＡｄ導入を高める。
ヒトＣＤ４０を安定して発現する２９３細胞に、多重感染度５００v.p.／細胞でルシフェラーゼをコードするＡｄを導入した。天然Ａｄ受容体ＣＡＲをブロックするために、細胞を、１０ｍｇ／ｍｌの組み換えＡｄ５ノブで処理した。Ａｄを、表示濃度でＣＦｈ４０Ｌアダプターと複合し、三重反復で細胞に転写した。２日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を相対光単位として測定した。結果は図７に示されるとおりであった。
【０１３６】
実施例８
ＣＦｈ４０Ｌを使用すると、ＤＣへのアデノウイルス導入能を増加する。
ヒトＤＣを、Ｂａｎｃｏ ｄｅ Ｓａｎｇｒｅ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ（ナバル血液銀行）から入手した血液試料から得た単球から調製した。血液を、フィコール勾配で遠心分離して、単核細胞を精製し、その後、ＣＤ１４＋単球を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットを用いて、メーカーの説明書に準じて磁気ビーズにより分離した。単球の精製後、１０００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手）を用いてＣＭ中で培養した。培養３日後、培地の半分を新鮮培地およびサイトカインと変更し、培養を７日まで継続した。細胞を集め、アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下において多重感染度３０およびアダプターＣＦｈ４０Ｌの不存在下において多重感染度３００で、ＡｄＧＦＰにより感染した。インキュベーション１時間後、サイトカインを追加したＣＭを、細胞が最終濃度１０６ 細胞／ｍｌまで希釈されるまで添加した。２４時間後、細胞を集め、十分に洗浄して、アデノウイルス粒子を完全に除去した。洗浄後、得られた細胞を、フローサイトメトリー による分析に使用した。結果は、ウイルスの各使用量ごとに、形質導入細胞（ＧＦＰ＋）の百分率として図８に示されるとおりであった。
【０１３７】
実施例９
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現を誘発する。
ヒトＤＣを、実施例８に記載したようにして単球から調製した。細胞を集め、ＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下において、多重感染度３０でＡｄＮＳ３により感染させた。一部の例では、比較法において、別の成熟化刺激、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）（２０μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−α含有カクテル（Ｂｅｒｏｍｕｎｅ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，２００ｎｇ／ｍｌ）＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２５μｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ−α（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ， Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ，１０００Ｕ／ｍｌ）を、感染後添加した。２４時間後、細胞を集め、マーカーＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現を、実施例２に説明したようなこれらの分子に対する抗体（これらの全ては、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から入手）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。結果は、平均蛍光指数（ＭＦＩ）としてマーカーの各々の値として図９に示されるとおりであった。
【０１３８】
実施例１０
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣをＡｄＮＳ３を導入することにより、生体外成熟化：ＩＬ−１２の産生を誘発する。ヒトＤＣを、図７に示すように単球から調製し、ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）＋ＩＦＮaまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理した。結果は図１０に示されるとおりであった。
【０１３９】
実施例１１
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：同種Ｔ細胞の刺激を誘発する。ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）＋ＩＦＮaまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理したヒトＤＣの種々の量を、別の個体から得た１０５非付着単核細胞とともに培養した。４日後、１ウエル当たり0.5 μCiの[3H]チミジンを添加し、さらに１８時間放置した。この後、試料を、Unifilterプレート（PerkinElmer社、ベルギー）に集めた。乾燥後、シンチレーション流体を、プレートに添加し、取り込まれたチミジンを、実施例５に記載したシンチレーションカウンターで測定した。結果は図１１に示されるとおりであった。
【０１４０】
実施例１２
慢性Ｃ型肝炎ウイルスを患った患者から得た単球由来のＤＣに、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入すると、健常ＨＣＶ血清反応陰性の人から得たＤＣで見られるのと同様の細胞活性化を誘発する。ＤＣを、慢性Ｃ型肝炎を患った患者または健常な人から得た単球から調製した。７日後、これらに、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入し、２４時間後、フローサイトメトリーによる表面マーカーの発現（Ａ）、培養上清のＩＬ−１２の産生（Ｂ）およびそれらの同種Ｔリンパ球刺激能を分析した。結果は図１２に示されるとおりであった。
【優先権出願の参照】
【０００１】
本出願は、２００８年５月２２日提出の米国仮出願第６１／０５５，３３２号の優先権を主張するものであり、その内容は参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【連邦政府の資金による研究に関する記述】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から認可番号５Ｕ５４ ＡＩ０５７１５７−０４により米国政府の資金を提供されたものである。従って、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染は、慢性化の傾向が高い特徴があり、場合によっては、肝硬変に進行し、そして最終的に肝細胞癌に進行することがある。この感染の推定罹患率は１〜２％であり、感染の慢性期を治療するための現存の療法の有効性が低いこともあり、ワクチン開発が極めて重要になってきている。ＨＣＶ感染における免疫反応の重要性は、うまくウイルス感染を断ち切ることのできる人たちは強力且つ多特異的細胞免疫反応を起こすが、一方、慢性感染した患者はほとんど反応を示さないことを実証した研究により強調されており、そしてウイルス抗原のわずかな領域に焦点があてられている。
【０００４】
ＨＣＶに対する免疫反応を引き起こす種々の方法のうち、樹状細胞（ＤＣ）系ワクチンが、過去数年間でますます広まってきた。樹状細胞（ＤＣ）は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする不均一細胞集団である。感染または炎症のない状態では、ＤＣは、未成熟状態または静止状態にあり、一方、感染後または炎症過程中では、成熟として知られている活性化過程を経る。この過程で、ＤＣは、リンパ器官に移行する能力を獲得し、的確な活性化のために、抗原をＴリンパ球に提示する。
【０００５】
ＤＣを遺伝子改変する手法には、リポソームを利用した遺伝子送達（Ｃｏｐｌａｎｄら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ，２１：８８３−８９０）およびウイルスベクター（Ｊｅｎｎｅら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１０２−１０７）などがある。
【０００６】
アデノウイルス（Ａｄ）介在遺伝子送達は、インビトロおよびインビボでの効率が高いこと、Ａｄベクターのペイロード容量が大きいこと、ならびに分裂細胞と静止細胞の両方を感染する能力があることから、魅力的に見える。しかしながら、ＤＣを改変するためにＡｄベクターを適用するが、ヒトおよびマウス由来のＤＣにおける一次Ａｄ受容体、ＣＡＲ、の発現に欠けることから障害となっている。
【０００７】
ＡｄベクターによるＤＣ感染効率を改善するために、種々の方法が開発された。例えば、Ｋｉｔａ−Ｆｕｒｕｙａｍａら（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１３１：２３４−２４０）は、ＤＣにＡｄ介在遺伝子を導入するのに、ウイルスの投与量を多くすることを開示している。
【０００８】
別法として、ＤＣをＣＡＲ依存Ａｄ介在導入する種々の系が報告されている。ある方法では、樹状細胞へのアデノウイルス指向性を高めるように線維タンパク質を改変した改変Ａｄベクターを利用している。例えば、ＷＯ０３９３４５５は、アデノウイルスＢサブグループの線維タンパク質を担持している改変Ａｄベクターを記載している。ＵＳ２００８１２４３６０は、アデノウイルスＤベクターの線維タンパク質を担持している改変ＡＤベクターを記載している。ＵＳ２００８００３２３６は、線維タンパク質におけるＣＡＲ結合領域およびＲＧＤ領域および線維タンパク質を、Ｃ型アデノウイルスの幹により置き換えた改変Ａｄベクターを記載している。しかしながら、変化した指向性を示す組み換えアデノウイルスに基づく系は、改変線維タンパク質の指向性が広いため問題となり、細胞特異性が低く且つひいては生体内に用いるのには適さない場合がある。さらに、これらの系では、通常時間がかかる改変アデノウイルスベクターを構築する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなるポリペプチドに関する。
【００１０】
さらなる態様によれば、本発明は、上記したポリペプチドをコードする核酸、前記核酸を含んでなるベクター、上記したポリペプチドまたは上記した核酸または上記したベクターを含んでなる宿主細胞、ならびに上記したポリペプチドの製造方法に関し、具体的には、ＣＡＲの細胞外ドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドの断片を含んでなるポリペプチドに関し、この方法は、
（ａ）前記ポリペプチドを産生できる条件下で、上記した宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、
（ａ）上記したポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、
ならびに、本発明の組成物または複合体と薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明によるポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる複合体を、被験者に投与することを含んでなる、被験者において抗原に対する免疫反応を生じさせる方法に関する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスとを接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触が実施される得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと、前記アデノウイルスと、前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの取込み、プロセッシングおよび提示のために適切な条件下で維持する工程と
を含んでなる、方法に関する。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、上記した方法により得られた抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞、そして本発明の抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者に免疫反応を引き起こす方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＦｍ４０Ｌの使用によりＤＣへのアデノウイルスの導入効率が増加することを示す図である。グラフは、アダプター分子ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下で、ＤＣへの、緑色蛍光タンパク質をコードする組み換えアデノウイルスの導入効率を示す。結果は、各使用ウイルス量についての、導入細胞（ＧＦＰ＋）百分率として示される。
【図２】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、インビトロ成熟化：表面マーカーの発現を誘発することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＤＣをインキュベーションしたときの、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂ表面マーカー発現をＦＡＣＳ解析した結果である。数字は、各ヒストグラムについての平均蛍光値を示す。
【図３】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、インビトロ成熟化：サイトカインの産生を誘発することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でインキュベーションしたＤＣにより産生されたＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＩＬ−６のＥＬＩＳＡ判定の結果が示されている。
【図４】ＣＦｍ４０Ｌにより誘発された成熟化が、Ｔｈ１反応の誘発に関連したＮｏｔｃｈ配位子の発現を伴うことを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌに反応したＤＣにおけるＤＬＬ４、ジャグド（Jagged）１およびジャグド(Jagged)２の発現倍率の増加を示す。結果は、アクチンで標準化したもので表し、未処理ＤＣに対する誘発度で示す。
【図５】ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると生体外刺激能を増加することを示す図である。ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下においてアデノウイルスベクターを導入した同種ＤＣの存在下で培養したリンパ球における［３Ｈ］チミジン取込み（Ａ）、ＩＦＮ−ガンマ産生（Ｂ）およびＩＬ−４産生（Ｃ）を示す。ＣＦｍ４０Ｌ（Ｄ）の存在下または不存在下でアデノウイルスベクターを導入した同系ＤＣを用いて培養したときの、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定したＩＦＮ−γを産生するＮＳ３特異的リンパ球数を示す。結果は、ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示される。
【図６】ＣＦｍ４０Ｌと一緒にＡｄＮＳ３を導入したＤＣにより免疫すると、ＤＣおよびＡｄＮＳ３を単独で用いたときよりも強力な反応を誘発することを示す図である。（Ａ）ＮＳ３ ＣＤ８エピトープ１０３８〜１０４７、１０７３〜１０８１、１４０６〜１４１５または組み換えＮＳ３タンパク質での刺激に反応して、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＡｄＮＳ３を予め導入したＤＣを注射したマウスから単離したＩＦＮ−γを産生する脾細胞数。（Ｂ）Ｚａｂａｌｅｔａら， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８， １６：２１０−７に記載されているＮＳ３ペプチド１３６７、１４２７および１４４について、（Ａ）に示すようなＩＦＮ−γを産生する脾細胞数のＥＬＩＳＰＯＴ判定。
【図７】ＣＦｈ４０ＬがヒトＣＤ４０発現細胞へのＡｄ導入を高めることを示す図である。異なる濃度のＣＦｈ４０Ｌの不存在下または存在下でルシフェラーゼをコードするＡｄを導入したＣＤ４０発現２９３細胞のルシフェラーゼ活性を示す。結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で示す。
【図８】ＣＦｈ４０Ｌの使用によりＤＣへのアデノウイルスの導入効率が増加することを示す図である。アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下における感染多重度３０または３００でのＤＣへのＡｄＧＦＰの導入百分率である。結果は、ウイルスの各使用量ごとの、導入細胞（ＧＦＰ＋）の百分率で表される。
【図９】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現を誘発することを示す図である。未処理のまま、またはアダプターＣＦｈ４０Ｌで処理、ポリ（Ｉ：Ｃ）で処理またはＴＮＦ−α、アンピリゲンおよびＩＦＮ−αを含有するカクテルで処理したヒトＤＣにおけるＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ表面マーカー発現のＦＡＣＳ分析の結果である。結果は、各マーカーの値を平均蛍光指数（ＭＦＩ）で示す。
【図１０】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入するとＩＬ−１２の生体外成熟化を誘発することを示す図ある。未処理のまま、ＡｄＮＳ３を導入した、アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入した、ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下でＡｄＮＳ３を導入した、またはＴＮＦ−α、アンピリゲンおよびＩＦＮ−αを含有するカクテルで処理した培養ヒトＤＣから得た上清におけるＩＬ−１２レベルを示している。
【図１１】ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると生体外成熟化：同種Ｔ細胞の刺激を誘発することを示す図である。ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０ＬまたはＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α°＋アンピリゲン＋ＩＦＮ−αまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理したＤＣへの［３Ｈ］チミジン取込みを示す。
【図１２】ＣＦｈ４０Ｌの存在下で慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を患った患者から得た単球由来のＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、健常ＨＣＶ血清反応陰性者から得た単球由来のＤＣに見られるものと類似の細胞活性化を誘発する。健常被験者またはＨＣＶ感染患者からの単球から得たＤＣにおいて、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でのＡｄＮＳ３での処理に反応した、フローサイトメトリーによるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ５４表面マーカーの発現（Ａ）、培養上清におけるＩＬ−１２の産生（Ｂ）および同種Ｔリンパ球を刺激する能力（Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、ｈＣＤ４０Ｌと、三量化モチーフと、ヒトＣＡＲ細胞外ドメインとを含んでなる二官能性アダプターにより、アデノウイルスベクターがヒトＤＣを効率的に導入するとともに、前記アデノウイルスがコードする抗原を提示することができる細胞で前記ＤＣの活性化を促進することを驚くべきことに見出した。
【００１７】
本発明のアダプターポリペプチド
第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなるポリペプチドに関する。
【００１８】
本明細書において使用されている用語「コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体」または「ＣＡＲ」は、ＡｄサブグループＡ（例えば、Ａｄ１２）、Ｃ（例えば、Ａｄ２およびＡｄ５）、Ｄ（例えば、Ａｄ８、Ａｄ９、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６〜３９および４２〜４９）、ＥおよびＦ（Ａｄ４０およびＡｄ４１）、ならびにコクサッキーＢウイルスの一次受容体としての役割を果たす免疫グロブリンスーパーファミリーに属する４６ｋＤａ膜貫通型タンパク質に関する。
【００１９】
本発明において用いられる好ましいＣＡＲタンパク質には、ヒトＣＡＲ、ラットＣＡＲおよびマウスＣＡＲなどがあるが、これらに限定されない。
【００２０】
ヒトＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ７８３１０、配列番号１に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３７により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３４がＩｇ様Ｃ２型１ドメインを形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２を形成する。
【００２１】
ラットＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｒ０６６、配列番号２に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜２３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３８により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３６がＩｇ様Ｃ２型１領域を形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２を形成する。
【００２２】
マウスＣＡＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７７９２、配列番号３に示す）は、３６５アミノ酸ポリペプチドであり、アミノ酸１〜１９がシグナル配列を形成し、アミノ酸２０〜３６５が成熟ＣＡＲタンパク質を形成する。ＣＡＲ細胞外ドメインの可溶性領域は、アミノ酸２０〜２３７により形成されてなり、ここでアミノ酸２０〜１３６がＩｇ様Ｃ２型１ドメインを形成し、アミノ酸１４１〜２２８がＩｇ様Ｃ２型２ドメインを形成する。
【００２３】
用語「アデノウイルス線維タンパク質に結合することができるＣＡＲのドメイン」とは、ＣＡＲから、好ましくはＣＡＲの細胞外領域からのいずれかの領域であって、標的細胞で発現したときに前記細胞がアデノウイルスにより感染できる領域を意味する。このドメインは、完全細胞外領域（ヒトＣＡＲのアミノ酸２０〜２３７、マウスＣＡＲのアミノ酸２０〜２３７、またはラットＣＡＲのアミノ酸２０〜２３８）、Ｉｇ様Ｃ１ドメイン（ヒトＣＡＲのアミノ酸２０〜１３４、ラットＣＡＲのアミノ酸２０〜１３６またはマウスＣＡＲのアミノ酸２０〜１３４）、Ｉｇ様Ｃ２ドメイン（ヒトＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８、ラットＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８およびマウスＣＡＲのアミノ酸１４１〜２２８、Ｉｇ様Ｃ１とＩｇ様Ｃ２ドメインの両方を含んでなる領域、または前記受容体を発現する細胞の十分な感染を確保するように十分な特異性でアデノウイルス線維タンパク質に結合できるいずれかの領域を含んでなることができる。一例として、アデノウイルス線維タンパク質へのＣＡＲドメインの結合能についての測定は、Ｋｉｒｂｙら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４：２８０４−２８１３）に記載の表面プラズモン共鳴により実施できる。本発明のアダプター分子に使用するのに好適なドメインには、少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは少なくとも１０〜８Ｍ、より好ましくは少なくとも９ｘ１０−９Ｍ、少なくとも８ｘ１０−９Ｍ、少なくとも７ｘ１０−９Ｍ、少なくとも６ｘ１０−９Ｍ、少なくとも５ｘ１０−９Ｍ、少なくとも４ｘ１０−９Ｍ、少なくとも３ｘ１０−９Ｍ、少なくとも２ｘ１０−９Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも９ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも８ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも７ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも６ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも５ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも４ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも３ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも２ｘ１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍの結合定数を有するものがあげられる。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「官能性変異体」は、一つ以上の残基の挿入、欠失または置換によりＣＡＲから得られ、上記で測定したアデノウイルス線維タンパク質と相互作用する能力を実質的に維持するいずれかのポリペプチドに関する。好適な官能性変異体は、ＣＡＲドメインに対しするアミノ酸配列同一性が約２５％超、例えば、２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一度を示すものである。二種のポリペプチド間の同一度は、コンピュータアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて求められる。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ）、ｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）］を用いて求められる。本明細書に記載のパラメータでＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を用いて、配列同一度（％）を求める。ＢＬＡＳＴ分析をおこなうソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により公表されている。アルゴリズムでは、最初にデーターベース配列における同じ長さのワードと整列したときにある正値閾値スコアＴに一致するか、または満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。これらの最初の近接ワードヒットは、より長いＨＳＰを含むそれらを見つけ出すための探索を開始する種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積整列スコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列に関して、累積スコアをパラメータＭ（一対一致残基のリワードスコア）；常に＞０）及びＮ（不一致残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積整列スコアが、その最大の達成値から量Ｘまで低下したとき；１つ以上の負のスコアを持つ残基の整列の蓄積により、累積スコアが０以下になったとき；又はどちらの配列の末端に 達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＰパラメータの好適値は、デフォルト値として３のワード長、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、そして両方の鎖の比較を使用するがこれには限定されない。
【００２５】
好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、ヒトＣＡＲの細胞外ドメインである。さらに好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜２６３を含んでなる。さらに好ましい実施態様によれば、ＣＡＲドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜２６３からなる。
【００２６】
本発明によるポリペプチドの第二の成分は、三量化モチーフである。本明細書において用いられる用語「三量化モチーフ」は、２つの他のアミノ酸配列と関連して三量体を形成できる官能基を含んでなるアミノ酸配列に関する。三量化モチーフまたはドメインは、同一のアミノ酸配列の他の三量化ドメインと関連することもでき（ホモ三量体）、または異なるアミノ酸配列の三量化ドメインと関連することもできる（ヘテロ三量体）。このような相互反応は、三量化ドメインの成分間の二重結合により生じてもよく、または水素結合力、疎水力、ファンデスワースル力および塩橋により生じてもよい。
【００２７】
好適な三量化ドメインは、米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号に記載のテトラネクチン三量化構造要素、ＷＯ０６０７６０２４に記載のアセチルコリン受容体ＣｏＩＱ鎖のＣ末端領域に存在する三量化モチーフ、ＧＣＮ４ロイシンジッパーの三量化モチーフ（Ｈａｒｂｕｒｙら．１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−１４０７）、肺表面活性剤タンパク質からの三量化モチーフ（Ｈｏｐｐｅら．１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４４：１９１−１９５）、コラーゲンの三量化モチーフ （ＭｃＡｌｉｎｄｅｎら．２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４２２００−４２２０７）、コラーゲンＸＶＩＩＩ ＮＣ１ドメインの三量化ドメイン、ＴＮＦの三量化モチーフ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｋｐ三量化モチーフ、アデノウイルス線維タンパク質の三量化モチーフ、Ｄａｍｅｓ ＳＡ．ら （Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．、１９９８；５：６８７−９１）に記載のヒト母系の三量化モチーフ、Ｖｅｒｏｎ， Ｍ． ら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００４，２７９：２７８６１−２７８６９）に記載のＮＥＭＯの三量化モチーフ、ＷＯ０９０００５３８Ａに記載のテネイシン三量化モチーフ、Ｆｒａｎｋ等（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：１１６７２−１１６７７）に記載のマクロファージスキャベンジャー受容体のコイルドコイル領域、およびファージＴ４フィブリチン「フォルドン」（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖら、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２９−４１４）であるが、これらには限定されない。
【００２８】
好ましい実施態様によれば、三量化モチーフは、配列番号４（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦ）で定義されているファージＴ４フィブリチン「フォルドン」である。この配列は、ベータプロペラ配座を採用し、自律的方法で折り重なり、そして三量化する（Ｔａｏら． １９９７ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：７８９−７９８）。別の好ましい実施態様によれば、三量化モチーフは、配列番号５（ＰＤＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫＶＥＬＦＰＮＧ）で定義されているヒト肺表面活性剤Ｄから得た頸部ペプチド（ＮＲＰ）である。
【００２９】
本発明によるポリペプチドの第三の要素は、ヒトＣＤ４０リガンドである。本明細書において用いられている用語「ＣＤ４０リガンド」（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ４０受容体を特異的に認識し、活性化し、その生物学的活性を活性化するいずれのポリペプチドまたはタンパク質も包含する。この用語は膜貫通ドメインを含有するＣＤ４０Ｌの使用を排除しないが、細胞外ドメインの全てまたは一部分を含有する可溶型ＣＤ４０Ｌを使用することが好ましい。
【００３０】
ヒトＣＤ４０Ｌアミノ酸配列は、配列番号６に示されるとおりである。
【００３１】
本発明によるポリペプチドに使用するのに好適なＣＤ４０Ｌ断片には、配列番号６の残基４７〜２６１を含んでなる切断ＣＤ４０Ｌ；配列番号６のアミノ酸残基５１〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１２０〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１３〜２６１を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２６１を含んでなるＣＤ４０断片；配列番号６のアミノ酸残基３５〜２６１を含んでなるＣＤ４０断片；配列番号６のアミノ酸残基３４〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１１３〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片；配列番号６のアミノ酸残基１２０〜２２５を含んでなるＣＤ４０Ｌ断片などがあるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、ヒトＣＤ４０リガンドの断片は、配列番号６のアミノ酸１１８〜２３１を含んでなる。
【００３２】
本発明において用いられるのに好適なヒトＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得られ、ＣＤ４０を結合する能力を実質的に保存するＣＤ４０Ｌの変異体を含む。ＣＤ４０Ｌ変異体がＣＤ４０に結合する能力を維持するかどうかを判定するのに好適な方法には、Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ Ｓ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６：３４８２−９３）に記載の表面プラズモン共鳴等のいずれかの従来の技術を用いて実施してもよく、またはＭａｚｚｅｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９９５，２７０：７０２５−７０２８）に記載の固定化ＣＤ４０上への結合により実施してもよい、従来の結合アッセイなどがある。
【００３３】
本明細書において言及されるＣＤ４０Ｌ類似体は、ヒトまたはネズミＣＤ４０Ｌの配列に実質的に相同であるが、一つまたは複数の欠失、挿入または置換のために天然配列ＣＤ４０Ｌポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般的に、置換は保存的になされなければならない。すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、本発明のタンパク質が天然のＣＤ４０Ｌのそれに実質的に同等の方法でそれらの受容体に結合する能力に影響しないものである。好適な官能性変異体は、ヒトＣＤ４０Ｌに対してのアミノ酸配列の同一性が概略２５％超、例えば、２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のものである。さらに、ヒトＣＤ４０Ｌの一次アミノ酸構造またはその変異体を、他の化学部分、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等と共有または集合性結合体を形成することによるか、またはアミノ酸配列突然変異体を作製することにより、改変してＣＤ４０Ｌ誘導体を作製してもよい。ＣＤ４０Ｌの共有誘導体は、特定の官能基を、ＣＤ４０Ｌアミノ酸側鎖、またはＣＤ４０Ｌポリペプチドもしくはその細胞外ドメインのＮ末端もしくはＣ末端に連結することにより調製される。本発明の範囲の入るＣＤ４０Ｌの他誘導体には、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合としての組み換え培養における合成によりる、ＣＤ４０Ｌまたはその断片と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または集合性結合体などがある。例えば、結合体は、共翻訳的または翻訳後に結合体をその合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の壁に転移させる、ＣＤ４０ＬポリペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域に単一またはリーダーポリペプチド配列を含んでなるものでもよい（例えば、サッカロミセス属の［アルファ］因子リーダー）。
【００３４】
好ましい実施態様によれば、本発明によるアダプター因子は、標識をさらに含んでなる。本明細書において用いられる用語「標識」は、特異的結合分子が得られ、したがって、前記標識を担持するポリペプチドの検出／精製を可能とするアミノ酸配列に関する。標識は、一般的にポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。このような標識が存在すると、標識ポリペプチドに対する抗体を用いて、アダプター分子を検出できる。また、標識を設けると、アダプターポリペプチドを、抗標識抗体、またはエピトープ標識に結合する別の種類の親和試薬を用いて親和性精製により容易に精製できる。
【００３５】
種々の標識ポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野において周知である。例えば、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）標識；インフルエンザＨＡ標識ポリペプチドおよびその抗体２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、１９８８、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃ標識およびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、１９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０−３６１６）；単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，１９９０，Ｐｒｐｔｅｏｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３：５４７−５５３）などが挙げられる。他の標識ポリペプチドとして、ｔｈｅ Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｖ，６：１２０４−１２１０）； ｔｈｅ ＫＴ３ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ［Ｍａｒｔｉｎら．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，１９９１，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７）が挙げられる。好ましい実施態様によれば、精製標識は、ポリヒスチジン標識である。さらに好ましい実施態様によれば、精製標識は、ヘキサヒスチジン標識である。
【００３６】
当業者には、本発明によるポリペプチドの種々の要素は、ＣＤ４０ＬおよびＣＡＲの立体構造が保存され、ＣＤ４０との相互作用またはアデノウイルス線維タンパク質との相互作用の機能を維持する限り、どの順序で配置されていてもよい。したがって、本発明のアダプターポリペプチドの好適な配置には以下のものが含まれる：
−ＣＡＲドメイン−三量化モチーフ−ＣＤ４０Ｌ
−ＣＡＲドメイン−ＣＤ４０Ｌ−三量化モチーフ
−三量化モチーフ−ＣＡＲドメイン−ＣＤ４０Ｌ
−三量化モチーフ−ＣＤ４０Ｌ−ＣＡＲドメイン
−ＣＤ４０Ｌ−三量化モチーフ−ＣＡＲドメイン
−ＣＤ４０Ｌ−ＣＡＲドメイン−三量化モチーフ
【００３７】
好ましい実施態様によれば、アダプタータンパク質は、Ｎ末端から順番に、アデノウイルス線維タンパク質に結合できるＣＡＲドメイン、三量化モチーフおよびＣＤ４０Ｌを含んでなる。さらに好ましい実施態様によれば、アダプタータンパク質は、Ｎ末端から順番に、以下の要素を含んでなる：アデノウイルス線維タンパク質に結合できるＣＡＲドメイン、リンカー領域、ヘキサヒスチジン標識およびｈＣＤ４０Ｌ。
【００３８】
本発明のポリペプチドの種々の要素は、直接に結合していてもよい。すなわち、要素のＣ末端は、次の要素のＮ末端領域に直接連結している。しかしながら、要素をリンカー領域を介して接触させることもできる。
【００３９】
本発明によれば、前記領域配列は、ＣＡＲドメインとヒトＣＤ４０Ｌとの間のヒンジ領域としての役割を果たし、それらが個々のドメインの立体形状を維持しながら、互いに独立して移動することができる。この意味で、本発明による好ましい非天然中間アミノ酸配列は、この移動を可能にする構造的延性により特徴づけられるヒンジ領域であろう。特定の実施態様によれば、前記非天然中間アミノ酸配列は、非天然可撓性リンカーである。好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、アミノ酸長さが２０である可撓性リンカーペプチドである。より好ましい実施態様によれば、リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列の例としては、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号７），ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号８）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号９）およびＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号１０）を挙げることができる。これらの配列は、設計されたコイル状らせんを他のタンパク質ドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ， Ｋ．Ｍ．， Ａｒｎｄｔ， Ｋ．Ｍ．およびＡｌｂｅｒ， Ｔ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，３２８：２６１−２８１）に結合させるのに使用されてきた。好ましくは、前記リンカーは、アミノ酸配列ＧＰＧＳ（配列番号１１）からなる。
【００４０】
リンカー領域の効果は、ＣＡＲドメインとヒトＣＤ４０Ｌとの間に空間を提供している。したがって、ＣＡＲの二次構造が、ｈＣＤ４０Ｌの存在により影響されることはなく、またこの逆も成立する。好ましくは、スペーサーは、ペプチドの性質を有している。好ましくは、リンカーペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含んでなる。
【００４１】
リンカーは、共有結合により本発明の結合体の２つの成分の側の成分に結合することができ、好ましくは、スペーサーは、実質的に非免疫原性であり、および／またはシステイン残基を含んでいない。同様に、スペーサーの立体構造は、好ましくは線状または実質的に線状である。
【００４２】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例としては、結合タンパク質の機能を実質的に劣化されることなく、または少なくとも結合タンパク質のうちの一つの機能を実質的に劣化させることなくタンパク質を結合するのに使用されてきたものが挙げられる。より好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、コイル状らせんを有する構造を含んでなるタンパク質を結合するのに使用されてきたものである。
【００４３】
好ましい実施態様によれば、リンカーを、ＣＡＲのＣ末端に配置する。すなわち、リンカーは、ＣＡＲドメインと三量化モチーフを連結することにより機能する。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターおよび宿主細胞
別の態様によれば、本発明は、本発明のアダプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。当業者には、本発明のポリヌクレオチドは、相対的な配向とは無関係およびアダプター分子がスペーサー領域により直接接続または分離されていることとは無関係にのみアダプター分子をコードすることが理解されるであろう。
【００４５】
本発明によるポリヌクレオチドは、単離されたものであってもよく、または遺伝子構築物の一部分を構成しているものであってもよい。好ましくは、この構築物は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列の動作制御下に位置して本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる。当業者には、本発明のポリヌクレオチドが、標的組織の核にアクセスできなければならず、転写され、翻訳されて、生物学的に活性な融合タンパク質を生じると理解される。
【００４６】
原則として、プロモーターが、ポリヌクレオチドが発現されるべきである細胞と適合するものであることを前提として、いずれのプロモーターも本発明による遺伝子構築物に使用することができる。したがって、本発明の実施態様に好適なプロモーターには、構成的プロモーター、例えば、真核生物ウイルスのゲノムの誘導体、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、レドロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子、さらには、タンパク質の発現が分子または外生信号、例えば、テトラサイクリンシステム、ＮＦκＢ／ＵＶ光システム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムの付加に依存する誘導プロモーター、熱衝撃遺伝子のプロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩの調節可能プロモーター、ならびに組織特異的プロモーターなどがあるが、必ずしもこれらには限定されない。好ましい実施態様によれば、本発明の遺伝子構築物は、単一コピーまたはそのいくつかのコピーの形態および単離された形態またはサイトメガロウイルス、アルファ−１−抗トリプシンもしくはアルブミンプロモーターなどの他の肝臓特異的発現要素との組み合わせにおいて、ヒト血清アルブミン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、アルファ−１−ミクログロブリン遺伝子またはアルドラーゼ遺伝子などの主に肝臓発現遺伝子のプロモーター領域に存在する発現を高める領域を含んでいる。
【００４７】
組織特異的であるプロモーターの他の例としては、例えば、アルブミン遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ ら．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスのコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇら， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９）；アルファ−フェトタンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら，１９９６，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：１５０３−１４）およびチロキシンに結合するグロブリン結合タンパク質のプロモーター（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，１９９７，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６）などがある。
【００４８】
本発明によるポリヌクレオチドまたはそれらを構成する遺伝子構築物は、ベクターの一部を構成する。したがって、別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクターに関する。当業者には、前記ベクターは、増殖に好適および結合体を精製するのに好適な種々の異種生物においてポリヌクレオチドまたは好適な遺伝子構築物または発現ベクターを得るのに好適なクローニングベクターであることができるので、使用できるベクターの種類は限定されないことは理解されるであろう。したがって、本発明による好適なベクターには、原核生物における発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプトおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージおよびシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母における発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミドのベクター、組込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミド等、昆虫細胞における発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系ベクターおよびｐＶＬ系ベクター、植物における発現ベクター、例えば、植物における発現のベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系ベクター等、ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルスに関連したウイルス、さらにレトロウイルスおよびレンチウイルス）、さらに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ （Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよび ａｎｄ ｐＴＤＴｌに基づく高級真核細胞における発現ベクターなどがある。
【００４９】
本発明によるベクターは、前記ベクターにより形質転換、形質移入または感染されることができる細胞を形質転換、形質移入または感染させるのに使用できる。前記細胞は、原核生物系でも、真核生物系でもよい。例えば、前記ＤＮＡ配列を導入するベクターは、宿主細胞に導入したときに、前記細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体（単一または複数）とともに複製する、プラスミドまたはベクターであることができる。前記ベクターは、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１）。
【００５０】
従って、別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含んでなる細胞であって、本発明により提供される構築物またはベクターにより形質転換、形質導入または感染されることができる細胞に関する。形質転換、形質導入または感染された細胞は、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１）。特定の実施態様によれば、前記宿主細胞は、好適なベクターを導入または好適なベクターで感染した動物細胞である。
【００５１】
本発明による複合体の発現に好適な宿主細胞には、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞などがあるが、これらには限定されない。細菌細胞には、グラム陽性菌細胞、例えば、バチルス属種、ストレプトミセス属種およびブドウ菌属種ならびにグラム陰性菌細胞、例えば、エシェリキア属およびシュードモナス属の細胞などがあるが、これらには限定されない。真菌細胞には、好ましくはサッカロミセス属、ピチアパストリス属およびハンゼヌラポリモルファなどの酵母の細胞などがある。昆虫細胞には、ショウジョバエ細胞およびＳｆ９細胞などがあるが、これらには限定されない。植物細胞には、とりわけシリアル、薬用植物、鑑賞植物または球根植物などの作物の細胞などがある。
【００５２】
好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチド、本発明の核酸または本発明のベクターは、ヒト細胞である。本発明に好適なヒト細胞には、上皮細胞株、骨肉腫細胞株、神経芽腫細胞株（ヒト等）、上皮癌（ヒト等）、グリア細胞（ネズミ等）、肝細胞株（サル等由来）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株のＤ３細胞、ヒト幹細胞、例えば、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７およびｈＭＳＣ細胞などがある。
【００５３】
本発明によるアダプターポリペプチドは、好適な宿主における組み換え発現により得ることができる。このため、本発明によるポリペプチドは、異種生物における発現に好適なベクターに、転写および必要に応じて翻訳制御要素とともに導入される。本発明の発現カセットに存在する転写および必要に応じて翻訳制御要素には、動作可能に連結されたヌクレオチド配列を転写させるようにさせるプロモーター、ならびに転写および時間や場所においてその好適な調節に必要または好適である他の配列、例えば、開始シグナル、終了シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、転写エンハンサー、転写サイレンサー等を含む。前記要素、さらに本発明による発現カセットおよび組み換えベクターを構築するのに使用されるベクターは、一般的に使用される宿主細胞にしたがって選択する。
【００５４】
従って、別の態様によれば、本発明は、アデノウイルス線維タンパク質またはその変異体に結合できるＣＡＲのドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドとをを含んでなる本発明によるアダプタータンパク質を製造する方法であって、
（ａ）ポリペプチドを産生できる条件下で、上記で定義した宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００５５】
好ましい実施態様によれば、発現を実施する宿主細胞は、ヒト細胞である。本発明のポリペプチドを産生するのに好適なヒト細胞には、本発明の細胞に関連して上記した細胞株のいずれもあげることができるが、これらには限定されない。
【００５６】
本発明による組成物および複合体
本発明者らは、ＤＣを本発明のアダプター分子の存在下でアデノウイルス粒子と接触させることにより、ＤＣの成熟を促進するとともに、インビトロおよびインビボ刺激能を促進することができることを明らかにした。したがって、アデノウイルス粒子と本発明のアダプターポリペプチドとを複合体組成物は、ＤＣワクチン接種として用いることができるＤＣを産生するのに特に適している。したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体に関する。
【００５７】
本明細書において用いられる用語「組成物」は、本発明の成分、すなわち、本発明のアダプターポリペプチドと、抗原をコードするアデノウイルスを含んでなる、物質の組成物に関する。組成物は、単独の構成物として製剤化してもよいし、あるいは別個の製剤として提供した後、混ぜて共投与してもよいことが理解されるであろう。また、本発明による組成物は、各成分を別個に製剤化し、そして単一の容器に収めたパーツからなるキット（キット・オブ・パーツ）として提供されてもよい。本発明による組成物を構成する成分のモル比は、異なることができ、好ましくは二成分の比は、５０：１〜１：５０、より好ましくは２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１、または５：１〜１：５である。
【００５８】
本明細書において用いられる用語「複合体」は、抗原をコードする一つ以上のアデノウイルス粒子を、アダプター分子におけるＣＡＲドメインとアデノウイルス線維タンパク質との間の特異的相互作用を介した本発明のアダプター分子の一つ以上の分子により結合している物質の組成物に関する。複合体の化学量論比は、同時に三量体アダプタータンパク質を結合できるアデノウイルスキャプシド上で利用できる線維タンパク質数に依存することが理解されるであろう。アデノウイルスキャプシドは、直径が約９００オングストロームである２０面体シェルとして構成されている７つのポリペプチドのアセブリである。
【００５９】
主要なキャプシド成分であるヘクソンの１２の三量体が、ペントンキャプソメアとそれらの突出した線維が１２の頂点の位置の各々を占めるようにして、２０の連結した三角形状のファセットの各々に配置されている。したがって、アデノウイルスは１２の線維を含んでなることから、本発明による複合体は、各アデノウイルス粒子に同時に結合した最大で１２のアダプター分子を含んでなることができる。したがって、好ましくは、本発明の複合体の化学量論比は、アデノウイルス粒子当たり１２のアダプター分子である。但し、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１および１：１の化学量論比も可能であり、本発明にあってはこれも意図している。
【００６０】
本発明による組成物または複合体の第一の成分は、本発明のポリペプチドに関連して詳細に説明してあるとおりである。
【００６１】
本発明による組成物または複合体の第二の成分は、抗原をコードするアデノウイルスである。本明細書において用いられる用語「アデノウイルス」または「アデノウイルス粒子」には、全てのグループ、サブグループおよび血清型を含むヒトまたは動物を感染するアデノウイルスを含むアデノウイルスとして分類されることができるあらゆるウイルスが含まれる。いくつかのサブグループに分類される少なくとも５１の血清型のアデノウイルスがある。例えば、サブグループＡは、アデノウイルス血清型１２、１８および３１を含む。サブグループＣは、アデノウイルス血清型１、２、５および６を含む。サブグループＤは、アデノウイルス血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３０、３２、３３、３６−３９および４２−４９を含む。サブグループＥは、アデノウイルス血清型４を含む。サブグループＦは、アデノウイルス血清型４０および４１を含む。これらの後者の２つの血清型は、長短の線維タンパク質を有している。したがって、本発明で使用されるアデノウイルスまたはアデノウイルス粒子は、パッケージベクターまたはゲノムである。さらに、用語「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」は、野生型に関する一つ以上の改変を含むその誘導体をも意味する。このような改変には、感染性ウイルスを製造するためにアデノウイルスゲノムを粒子に収納する改変などがあるがこれらには限定されない。典型的な改変には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の一つ以上における欠失等の当該技術分野において公知の欠失などがある。他の典型的な改変には、アデノウイルスゲノムのコード領域の全ての欠失などがある。このようなアデノウイルスは、「ガットレス（Ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスとして知られている。また、こられの用語には、一定の型の細胞または組織で優先的に複製するが、他の型の細胞では複製割合が小さいか、全く複製しないウイルスである、複製条件付きアデノウイルスなども含まれる。例えば、ここで提供されるアデノウイルス粒子には、固形腫瘍および他の新生物などの異常増殖組織で複製するアデノウイルス粒子が含まれる。これらには、米国特許第５，９９８，２０５号および米国特許第５，８０１，０２９号に開示されているウイルスなどがある。このようなウイルスは、「細胞障害」または「細胞変性」ウイルス（またはベクター）と称されることがあり、新生細胞に対してこのような効果を有する場合には、「腫瘍崩壊」ウイルス（またはベクター）と称される。
【００６２】
本発明による組成物または複合体のアデノウイルス構成部分は、抗原をコードするポリペプチド配列を含んでなる。
【００６３】
本発明による組成物および複合体を形成するアデノウイルスに組み込むのに好適なポリヌクレオチドには、ウイルス抗原、真菌抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胚抗原、癌遺伝子および突然変異癌抑制遺伝子の抗原、染色体転座および／またはそれらの誘導体から得られる独特な腫瘍抗原の全てまたは一部分をコードするものなどがあるが、これらには限定されない。
【００６４】
ウイルスに対する免疫反応を引き起こすことができるウイルス抗原には、ＨＩＶ−１抗原（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはそれらの誘導体、または前初期タンパク質、例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６、サイトメガロウイルス、特にヒト（例えば、ｇＢまたはその誘導体）、エプスタインバーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩ、ＩｌｌおよびＩＥ６３）由来、または肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えば、ｃｏｒｅ、Ｅ１、ＮＳ３またはＮＳ５抗原）由来、パラミクソウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質またはそれらの誘導体）由来、パラインフルエンザウイルス由来、風疹ウイルス（例えば、タンパク質ＥｌおよびＥ２）、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えば、ＬＩ、Ｌ２、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞、例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡまたはＭタンパク質またはそれらの組み合わせ）由来抗原、ロタウイルス抗原（例えば、ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分）などが挙げられる（ウイルス抗原についての更なる例については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｎ．およびＫｎｉｐｅ、Ｄ．Ｍ．編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）を参照されたい）。
【００６５】
細菌性抗原には、例えば、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ）、例えばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来抗原（トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘジン）；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来抗原（例えば、Ｍタンパク質またはその断片およびＣ５Ａプロテアーゼ）；Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ， Ｓ． ｍｕｔａｎｓ； Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ； モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えばＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られている）由来抗原（例えば、高分子量および低分子量アドヘジンおよびインベジン）；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）由来抗原；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来抗原；レジオネラ属 （Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ由来抗原；（例えば、ＥＳＡＴ６、Ａｎｔｉｇｅｎ８５Ａ、８５Ｂまたは８５Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰＩＯ、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ）、例えば、腸管毒性（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ）大腸菌由来抗原（例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌由来抗原（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ）、例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ由来抗原（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）；赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えばＳ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ由来抗原；エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ）、例えば、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来抗原（例えば、Ｙｏｐタンパク質）；Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ，Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来抗原；カンピロ バクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来抗原（例えば、毒素、アドヘジンおよびインベジン）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ由来抗原；リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来抗原；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）、例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来抗原（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来抗原；ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来抗原；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えばＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ由来抗原；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ由来抗原（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ由来抗原（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来抗原（例えばクロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）；バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、例えばＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来抗原（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来抗原（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、 ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ由来抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、 ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ由来抗原；エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球性エーリキア症の物質由来抗原；リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ）、例えば、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ由来抗原；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来抗原（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来抗原（例えば、ＭＯＭＰ、へパリン結合タンパク質）；Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ由来抗原；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、Ｌ． ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ由来抗原；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来抗原（例えば稀少外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来の抗原；プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来抗原；トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ由来抗原（例えばＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）；エントアメーバ属、例えば、Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ由来抗原；バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ由来抗原；トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ由来抗原；ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ由来抗原；リューシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｌ．ｍａｊｏｒ由来抗原；ニューモシスティス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ由来抗原；トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来抗原；スキゾストーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．）、例えば、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ由来抗原、または酵母、例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来抗原；クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来抗原；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来抗原（例えば、Ｒｖ２５５７， Ｒｖ２５５８， ＲＰＦｓ： Ｒｖ０８３７ｃ， Ｒｖ１８８４ｃ， Ｒｖ２３８９ｃ， Ｒｖ２４５０， Ｒｖ１００９， ａｃｅＡ （Ｒｖ０４６７）， ＰｓｔＳ１， （Ｒｖ０９３２）， ＳｏｄＡ （Ｒｖ３８４６）， Ｒｖ２０３１ｃ １６ｋＤａｌ．， Ｔｂ Ｒａ１２， Ｔｂ Ｈ９， Ｔｂ Ｒａ３５， Ｔｂ３８−１， Ｅｒｄ １４， ＤＰＶ， ＭＴＩ， ＭＳＬ， ｍＴＴＣ２ ａｎｄ ｈＴＣＣ１）； Ｃｈｌａｍｙｄｉａ由来抗原（例えば、高分子量タンパク質 （ＨＷＭＰ）， ＯＲＦ３ （ＥＰ ３６６ ４１２）および推定膜タンパク質（Ｐｍｐｓ）；ストレプトコッカス属、例えば、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質、タンパク質抗原肺炎球菌溶血素およびその突然変異解毒誘導体）；ヘモフィルス属、例えば、Ｂ型インフルエンザ菌由来抗原（例えば、ＰＲＰおよびその複合体）；分類不能型インフルエンザ菌由来抗原（例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘジン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来のペプチドまたはそのマルチコピー変異体または融合タンパク質；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来抗原（例えば、ＲＴＳ．Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属におけるそれらの類似体）などがある。
【００６６】
本発明による複合体を構成するアデノウイルスに用いられる真菌抗原には、例えば、カンジダ真菌抗原成分；ヒストプラズマ真菌抗原、例えば、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）および他のヒストプラズマ真菌抗原成分；クリプトコッカス真菌抗原、例えば、莢膜多糖類および他のクリプトコッカス真菌抗原成分；コッシジオイド真菌抗原、例えば、小球抗原および他のコッシジオイド真菌抗原成分；ならびに白癬真菌抗原、例えば、トリコフィチンおよび他のコッシジオイド真菌抗原成分などがあるが、これらには限定されない。
【００６７】
原生動物抗原には、熱帯熱マラリア原虫抗原、例えば、メロゾイト表面抗原、種虫表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母体／配偶子表面抗原、ブラッドステージ抗原ｐｆ、５５／ＲＥＳＡおよび他のプラスモジウム抗原成分；トキソプラズマ抗原、例えば、ＳＡＧ−Ｉ、ｐ３０および他のトキソプラズマ抗原成分；住血吸虫抗原、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスケェラーゼ、パラミオシンおよび他の住血吸虫抗原成分；リーシュマニア主要および他のシュマニア抗原、例えば、ｇｐ６３、リポホスホグルカンおよびその関連タンパク質および他のシュマニア抗原成分；ならびにクルーズトリパノソーマ抗原、例えば、７５−７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分などがあるが、これらには限定されない。
【００６８】
抗原は、アレルゲンまたは環境抗原、例えば、天然アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草および草花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入、唾液および毒アレルゲン）、獣毛およびふけアレルゲンならびに食物アレルゲン由来抗原であることができるが、これらには限定されない。樹木、草およびハーブから得た重要な花粉アレルゲンは、分類学上のブナ目、モクセイ目、マツ目、及びスズカケノキ科、例えば、カバ（Ｂｉｒｃｈ）（カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ））、ハンノキ（ａｌｄｅｒ）（ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ））、セイヨウハシバミ（ｈａｚｅｌ）（ハシバミ属 （Ｃｏｒｙｌｕｓ））、セイヨウシデ（ｈｏｒｎｂｅａｍ）（クマシデ属（Ｃａｒｐｉｎｕｓ））及びオリーブ（ｏｌｉｖｅ）（オリーブ属（Ｏｌｅａ））、シーダー（ｃｅｄａｒ）（スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）及びビャクシン属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ））、プラタナス（Ｐｌａｎｅ ｔｒｅｅ）（プラタナス属（Ｐｌａｔａｎｕｓ））、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、例えば、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、シラゲガヤ属（Ｈｏｌｃｕｓ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）及びモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、例えばブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）及びヒカゲミズ属 （Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）のハーブに由来するものである。他の使用可能なアレルゲン抗原には、ヒョウヒ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）及びユーログリファス属（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）のチリダニ、貯蔵庫ダニ（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、レピドグリフィス属（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、ニクダニ属（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）及びケナガコナダニ属（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ））及びブロミア（Ｂｌｏｍｉａ）のようなダニに由来するもの、ゴキブリ、ユスリカ及びノミ（ｆｌｅａ）（例えば、チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ペリプラネタ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、キロノムス属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）及びクテノケファリデス属 （Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ））に由来するもの、及び哺乳動物（例えば、ネコ（ネコ属（Ｆｅｌｉｓ））、イヌ（イヌ属（Ｃａｎｉｓ））、ウシ（ウシ 属（Ｂｏｓ））、ウマ（ウマ属（Ｅｑｕｕｓ））、ラット（クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ））、マウス（ハツカネズミ属（Ｍｕｓ））及びモルモット（テンジク ネズミ属（Ｃａｖｉａ））に由来するもの、毒素アレルゲン（刺すか又は噛み付く昆虫（分類学上のハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）（ミツバチ（ミツバチ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ａｐｉｄａｅ））、スズメバチ（スズメバチ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖｅｓｐｉｄｅａ））及びアリ（アリ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ））を含む）に由来するものがある。さらに使用可能な他のアレルゲンには、吸入性アレルゲンは、例えばアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）及びクラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）に由来するものがある。
【００６９】
また、抗原は、腫瘍抗原、例えば、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス性生成物、腫瘍抗原のスマッドファミリー、ｌｍｐ−１、ｐ１Ａ、ＥＢウイルスコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンフォスフォリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、グリオーマ（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱ガン（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳ガン（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸ガン（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸ガン（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛腫（ＣＥＡ）、上皮細胞ガン（シクロフィリンｂ）、胃ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞ガン、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺ガン（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔ガン（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣ガン（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺ガン（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部及び食道の扁平上皮細胞癌（ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物）、睾丸ガン（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が挙げられる。
【００７０】
好ましい実施態様によれば、抗原ポリペプチドは、ＨＣＶ抗原である。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３タンパク質またその断片である。
【００７１】
ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼは、いずれかのＨＣＶ型（例えば、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１があるが、これらには限定されない）からのアミノ酸１０２７〜１６５７にわたるＨＣＶポリタンパク質領域に相当し、その公知のサブタイプには、ＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、５ａ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａおよび１１ａなどがある。但し、これらのエンドポイントは近似値である。上記したエンドポイントは、例えば、ＨＣＶポリタンパク質の上流部またＨＣＶＮＳ３領域自体における挿入／欠失により変化することがあるので、絶対的なものではない。このような挿入／欠失は、種々の遺伝子型のＨＣＶポリタンパク質配列を比較したときに明らかなように、存在することは公知である。
【００７２】
本明細書において用いられる用語「ＮＳ３断片」は、少なくとも一つのＨＣＶＮＳ３エピトープ（Ｂ細胞エピトープまたＴ細胞エピトープ）を含んでなるＨＣＶＮＳ３の領域に関する。本明細書で使用される用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは、約５から１０または１５、および約１，０００を超えないアミノ酸であって、それ自身またはより大きい配列の一部として、このような配列に反応して生成した抗体に結合する配列を定義するアミノ酸のペプチド配列を意味する。
【００７３】
具体的実施態様によれば、本発明のＮＳ３抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶＮＳ３ペプチドを含んでなる。エピトープの一つ以上を含んでなるＮＳ３ポリタンパク質の好適な断片には、以下のものがあるがこれらには限定されない：
−受託番号ＡＣＨ８１０２０のＮＣＢＩおいて定義されているペプチド（配列番号：１２）
−ＨＣＶポリタンパク質領域またはその一部分のアミノ酸１０７１〜１０８４、例えば、ＨＣＶポリタンパク質領域のアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるポリペプチド
−ＨＣＶＨからのＮＳ３ヘフリカーゼドメインを含んでなるアミノ酸１１９２〜１４５８にわたるペプチド
−ＷＯ２００７５６７６０の表１に記載のＨＣＶポリタンパク質および変異体のアミノ酸１４０６〜１４１５にわたるペプチド
−ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるペプチド
−ｃ２５ＮＳ３エピトープ
−ＵＳ５３５０６７１、Ｃｈｉｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国、１９９２、８９：１００１１−１００１５）；Ｃｈｉｅｎら（Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ． Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９３、８：Ｓ３３−３９）；ＷＯ ９３００３６５；ＷＯ９４０１７７８およびＵＳ６１５００８７に記載のエピトープ
−ＨＣＶエピトープデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏ／ｉｍｍｕｎｏ−ｍａｉｎ．ｈｔｍｌ）（Ｙｕｓｉｍ Ｋら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５；４（４）に含まれているＨＣＶＮＳ３のＣＴＬおよびＴヘルパーエピトープ
−Ａｒｒｉｂｉｌｌａｇａら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２００２、２１：２０２−２１０）により同定され、Ｈ−２ｄ結合モチーフを有し且つ表１に示す配列を有するペプチド
【００７４】
【表１】
【００７５】
好ましい実施態様によれば、ＮＳ３抗原は、
ＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＤＧＥＶＱＶＬＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＶＰＶＲＲＲＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＩＥＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＧＰＩＴＹＳＴＹＣＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬＡＴＡＴＰＰＧＳＩＴＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹＧＫＡＩＰＩＥＡＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫＬＴＧＬＧＬＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＬＰＱＤＡＶＳＲＡＱＲＲＧＲＴＧＲＧＲＳＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＬＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴＳＴＷＶ（配列番号：１２）
に対応するＨＣＶ遺伝子型１ｂからのＮＳ３タンパク質に相当する。
【００７６】
本発明による医薬組成物
別の態様によれば、本発明は、上記で定義した本発明による組成物または複合体と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容される担体」は、非毒性、不活性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、包摂材料、又は任意の種類の製剤補助剤を意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５は、医薬組成物を製剤化するのに使用される種々の担体およびその調製についての公知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として機能することができる物質をいくつか挙げると、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えば、コーンスターチおよびジャガイモ澱粉、セルロースおよびその誘導体、例えば、ソジウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテート；粉末状トラガントガム；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバターおよび座薬用ロウ；オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油；サフラワー油；ごま油；オリーブ油；コーン油および大豆油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；洗剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質を含有しない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液、さらには他の非毒性適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに製剤業者の判断に従い組成物中に存在してもよい着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、防腐剤および抗酸化剤などがあるが、これらには限定されない。濾過または最終滅菌法が可能でない場合には、製剤は、無菌条件下で製造できる。
【００７８】
ある条件下では、本発明による複合体または組成物を制御放出製剤として提供することが好ましいことがある。本明細書において用いられる用語「制御放出」（およびその用語の変形）（例えば、「制御放出系」において）は、一般的に、選択された部位での物質（例えば、薬剤またはタンパク質）の放出、または速度、間隔および／または量の面で制御可能な放出を包含することを意味する。制御放出は、実質的に連続した送達、パターン化した送達（例えば、規則的または不規則な時間間隔で中断する一定期間にわたる断続的送達）、および選択された物質の塊の送達（例えば、比較的短時間（例えば、数秒または数分）での物質の所定の個別量として）を包含するが、これらには限定されない。
【００７９】
本発明による治療方法
本発明者らは、被験者に、本発明によるアダプターの存在下に抗原をコードするアデノウイルス粒子と予め接触させたＤＣを投与すると、アダプター分子の不存在下でアデノウイルス粒子と接触させたＤＣで観察されるよりも強力な単離ＮＳ３抗原に対する反応を生じることを見出した。したがって、本発明による複合体を両方とも必要とする被験者に直接投与することにより、被験者自身のＤＣがアデノウイルス粒子により生体内に導入される。
【００８０】
したがって、別の態様によれば、本発明は、被験者に、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体を投与する工程を含んでなる、被験者において抗原に対する免疫反応を引き起こす方法に関する。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、
または医薬に使用される、前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００８２】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、または前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物の、前記抗原に対する免疫反応を引き起こすための薬剤を製造するための使用に関する。
【００８３】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明のアダプターポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる組成物または複合体、前記抗原に対する免疫反応を引き起こすための、前記本発明の組成物または複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００８４】
本発明による方法に使用される複合体の成分（ａ）および（ｂ）は、本発明による複合体に関連して詳細に説明したものと実質的に同様であり、したがって、ここではさらには説明しない。好ましい実施態様によれば、アデノウイルスは、ＨＣＶ抗原をコードする。この場合、本発明の方法は、Ｃ型肝炎の治療または予防に使用される。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原性断片である。
【００８５】
好ましい実施態様によれば、複合体は、投与前に、前記複合体の形成に適切な条件下で、複合体の構成成分を接触させることにより形成される。複合体の形成に適切である条件は、２成分の結合を判定する従来の方法、例えば、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配遠心分離、クロマトグラフィー、生物発光共鳴エネルギー伝達（ＢＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）等を用いて、当業者により容易に決定することができる。
【００８６】
本発明による複合体を、経口経路および非経口経路を含む当該技術分野において公知の手段により患者に投与できる。このような実施態様によれば、注射（例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射）、直腸内、経膣的、局所的（粉末、クリーム、軟膏または点滴剤による）または吸入（スプレーによる）により投与できる。
【００８７】
複合体を、それを必要としている被験者に、全身に、例えば、静脈内注入または注射により投与できる。注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化できる。また、無菌注射剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒を用いた無菌注射液、懸濁液または乳剤、例えば、１，３−ブタンジオールを用いた溶液でもよい。使用できる許容可能なビヒクルには、水、リンガー溶液、米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）および等張塩化ナトリウム溶液などがある。さらに、無菌固定油が、溶液または懸濁化剤として通常用いられている。このためには、合成モノ−またはジグリセリドなどのいずれの無菌性固定油を用いてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用される。一実施態様によれば、本発明の複合体を、１％（ｗ／ｖ）ソジウムカルボキシメチルセルロースと、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０とを含んでなるキャリア流体に懸濁する。注射製剤を、例えば、使用前に、細菌保持フィルターを用いた濾過によるか、または滅菌水または他の無菌注射媒体に溶解または分散されることのできる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより滅菌することができる。
【００８８】
直腸または膣投与用組成物は、座薬でもよい。この座薬は、本発明による複合体を、好適な非刺激性賦形剤または担体、例えば、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶融する、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬用ロウと混合することにより調製することができる。
【００８９】
本発明による医薬組成物の局所または経皮吸収投与用剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチなどがある。本発明の複合体を、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要とされることがあるいずれかの必要とされる保存剤または緩衝液と混合される。また、眼科製剤、点耳薬および点眼薬も、本発明の範囲内であることを意図している。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の複合体の他に、賦形剤、例えば、動物および植物脂肪、オイル、ロウ、パラフィン、澱粉、トラガントガム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物を含有していてもよい。経皮パッチは、化合物の体への制御送達が可能であるさらなる利点がある。このような剤形は、本発明の複合体を適切な媒体に溶解または分散することにより製造することができる。また、吸収促進剤を使用して、皮膚を通しての化合物の流量を増加させることもできる。速度は、律速膜を設けることによるか、または本発明の複合体をポリマーマトリックスまたはゲルに分散することにより制御することができる。粉末または噴霧剤は、本発明の複合体の他に、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはそれらの混合物を含有できる。噴霧剤は、通常の推進剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有できる。経口投与するとき、本発明の複合体を、カプセル化できるが、必ずしもカプセル化をしなくてもよい。種々の好適なカプセル化系が、当該技術分野において公知である（「薬剤および調剤におけるマイクロカプセルおよびナノ粒子（Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、Ｄｏｕｂｒｏｗ、Ｍ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ ｒａｔｏｎ、１９９２；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ ５：１３、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、反応性ポリマー（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）６：２７５、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．３５：７５５、１９８８；Ｌａｎｇｅｒ Ａｃｅ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３３：９４，２０００；Ｌａｎｇｅｒ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅｌｅａｓｅ ６２：７，１９９９； Ｕｈｒｉｃｈら、 Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９９：３１８１，１９９９；Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅｌｅａｓｅ ７５：２７、２００１；およびＨａｎｅｓら、Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：３８９，１９９５）。本発明の複合体を、生分解性高分子微小球またはリポソーム内にカプセルル化してもよい。生分解性微小球の調製に有用な天然および合成ポリマーとしては例えば、炭水化物、例えば、アルギン酸塩、セルロース、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミド、ポリホスファゼン、ポリプロピルフマレート、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、ポリカーボネート、多無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）および他の生分解性ポリエステルなどがある。リポソーム産生に有用な脂質としては、例えば、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどがある。
【００９０】
経口投与用医薬組成物は、液体または固体であることができる。本発明による組成物を経口投与するのに好適な液状剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤などがある。カプセル化または未カプセル化複合体の他に、液状剤形は、当該技術分野において一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物を含有することができる。
【００９１】
不活性希釈剤の他に，経口組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤，甘味剤、矯味剤、芳香剤を含むこともできる。本明細書で使用される用語「アジュバント」は、免疫反応の非特異的調節剤であるいずもの化合物をも意味する。ある実施態様によれば、アジュバントは、免疫反応を刺激する。本発明にあわせて、いずれのアジュバントを使用してもよい。多数のアジュバント化合物が当該技術分野において公知である（Ａｌｌｉｓｏｎ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ９２：３−１１，１９９８；Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−２８１，１９９８；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １０：１５１−１５８，１９９２）。経口投与用固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末剤および顆粒剤などがある。
【００９２】
このような固体剤形では、カプセル化または未カプセル化複合体を、少なくとも一種の不活性の薬学的に許容される賦形剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウムおよび／または（ａ）フィラーまたは増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉、タピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば第４アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、並びに（ｉ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸
剤の場合、その投与形態はさらに緩衝剤を含有してもよい。同様の種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟質および硬質ゼラチンカプセル剤においてフィラーとして使用することもできる。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤のような固体剤形は、被膜およびシェル、例えば、腸溶被膜および医薬製剤分野でよく知られている他のものを用いて製造することができる。対象逆ミセルの正確な投与量は、個々の医師によって、治療される患者を考慮して選択され、一般的に、投与量および投与は、有効量の対象粒子を治療すべき患者に投与するように調整されることが理解されるであろう。対象粒子について本明細書で使用される「有効量」は、所望の生物学的反応を引き起こすのに必要な量を指す。当業者には、対象粒子の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、標的組織、投与経路等の因子に応じて異なることができることは理解されるであろう。例えば、抗癌剤を含有する対象粒子の有効量は、所望の期間で所望の量の腫瘍サイズの減少を生じさせる対象粒子の量であることができる。考慮することがあるさらなる因子には、疾病状態の程度；治療患者の年齢、体重および性別；食事；投与の時間および頻度；薬剤の組み合わせ；反応感度；ならびに治療に対する耐性／反応などがある。
【００９３】
本発明による複合体は、投与を容易するためおよび投与量の均一性の観点から、投与量単位の形態で製剤化してもよい。本明細書において用いられる表現「投与量単位の形態」とは、治療患者に適切な複合体の物理的な個別単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の毎日の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医により決定されることは理解されるであろう。いずれの複合体についても、治療的に有効な投与量は、最初に、細胞培養アッセイによるか、動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにより推定できる。動物モデルを用いて、望ましい濃度範囲および投与経路を得ることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトへの投与に有効な投与量および経路を決定することができる。複合体の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％を致死させる投与量）により決定できる。毒性：治療効果投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表される。大きな治療指数を示す医薬組成物が、一部の実施態様に有用なことがある。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を決めるのに使用できる。
【００９４】
複合体は、体重１キログラム当たり概略１複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１４複合体の範囲の投与量で送達される。一般的に、複合体は、体重１キログラム当たり概略１０６複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１３複合体の範囲の投与量で送達され、典型的な投与量は、体重１キログラム当たり概略１０８複合体〜体重１キログラム当たり概略１０１２複合体の範囲である。
【００９５】
選択された間隔で、レシピエントのリンパ器官からのＤＣを使用して、発現を、例えば、マーカー遺伝子の発現を観察することにより測定してもよい。ウイルス処理レシピエントのエリンパ節および脾臓からのＴ細胞を、抗原刺激に対する反応の大きさおよび持続性から測定できる。上皮細胞およびリンパ細胞などのＤＣ以外の組織細胞を、生体内遺伝子送達の特異性について分析できる。
【００９６】
抗原負荷ＣＤ４０陽性細胞を得る方法
本発明者らは、本発明によるアダプタータンパク質は、アデノウイルスがＣＤ４０細胞に効率的に導入されることを可能にするとともに、標的細胞におけるアダプタータンパク質のＣＤ４０Ｌ部分とｃ０との相互作用によりＣＤ４０の成熟化を促進することを見出した。実際に、実施例１、２、３、４、８、９、１０、１１および１２で得られた結果は、本発明のアダプター分子の存在下でのＤＣのアデノウイルスに対する反応を開示している。したがって、別の態様によれば、本発明は、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を、本発明によるアダプタータンパク質および抗原をコードするアデノウイルスと接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触を実施する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと、前記アデノウイルスと、前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの取込み、プロセッシングおよび提示に適切な条件下で細胞を維持する工程と
を含んでなる、方法に関する。
【００９７】
本明細書において用いられる用語「ＣＤ４０陽性抗原提示細胞」は、ＭＨＣ分子との関連でペプチドを提示することができ、そしてＣＤ４０Ｌの発現を示すいずれの細胞も含むことが理解されるであろう。ＣＤ４０陽性ＡＰＣには、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞、例えば、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ラングルハンス細胞および人工抗原提示細胞などがあるが、これらには限定されない。
【００９８】
好ましい実施態様によれば、「ＣＤ４０陽性抗原提示細胞」は、樹状細胞である。本明細書において用いられる用語「樹状細胞」はリンパ球または非リンパ球に見られる形態学的に類似した細胞型のさまざまな集団のものを指す。ＤＣは、「プロフェッショナル」抗原提示細胞と称され、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作する高い能力を有している。ＤＣは、機能、表現型および／または発現パターン、細胞表面表現型により認識されることができる。これらの細胞は、独特の形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ表現および抗原をＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、特に未感作Ｔ細胞に提示する能力により特徴づけられる。樹状細胞により活性化されたＣＤ４＋細胞は、樹状細胞により活性化されたＣＤ４＋細胞は、ＩＦＮ−ガンマ産生し、抗原特異的Ｂリンパ球の増殖および抗体産生を誘発する。樹状細胞により活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞毒性顆粒を細胞に放出することにより、抗原（例えば、ウイルス感染細胞）を表示する細胞を殺生する。
【００９９】
形態学的に、樹状細胞は、特徴的な静脈様突起を有する独特の表面により特徴づけられ、そして細胞表面マーカーＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現により特徴づけられる。ほとんどのＤＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび顆粒球を含む他の白血球系統のマーカーに対して陰性である。樹状細胞の亜母集団は、さらなるマーカー、例えば、３３Ｄ１、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ−ｄ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３ （ＩＬ３Ｒ．ａｌｐｈａ．）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１６２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＥＣ２０５、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＭＡＲＣＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３ ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９および数種のレクチン発現するものでもよい。これらの表面マーカーの発現のパターンは、樹状細胞の成熟性、それらの起源組織および／またはそれらの起源種により異なる。機能的には、ＤＣは、抗原提示の判定に用いられる簡易なアッセイにより同定できる。このようなアッセイは、試験抗原の提示により抗原感作および／または未変性Ｔ細胞を刺激する能力を試験後、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２の放出等を判定することを含む。
【０１００】
抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得るための方法の第一工程では、ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を、本発明によるアダプタータンパク質および抗原をコードするアデノウイルスと接触させる。この接触は、ポリペプチドとアデノウイルスとを別個に添加することによるか、または予め形成したポリペプチド−アデノウイルス複合体］を添加することにより実施できる。
【０１０１】
ＣＤ４０陽性抗原提示細胞は、好適な起源から標準的な方法を用いて得られる。このような好適な組織源には、例えば、抹消血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節生体組織、胸腺、脾臓、皮膚、臍帯血、抹消血から採取した単球、抹消血から採取したＣＤ３４またはＣＤ１４陽性細胞、骨髄血または他の好適な組織または流体などがある。
【０１０２】
ＡＰＣがＤＣである特定の場合において、そしてある種の疾病を患っている患者は樹状細胞機能の減少（すなわち、抗原提示不全および成熟不全）を示すことから、前躯体細胞を得た後、生体外で機能的樹状細胞を得ることが好ましい。
【０１０３】
したがって、本発明においては、幹細胞前躯体刺激樹状細胞分化を、過剰増殖性疾病の生体外治療法として用いることを意図している。単球を培養し、樹状細胞に分化する方法は、米国特許５８４９５８９に記載されている。この方法は、前躯体細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαを含有する培地で培養することを含む。樹状細胞単離する別法が、米国特許５６４３７８６に記載されている。この方法は、水簸ローターから少なくとも４種の流量で抹消血を水簸することを含む。カルシウムイオノフォアを使用して、プロセス中に単離した単球を刺激して樹状細胞すること、および活性化樹状細胞の再導入を含む疾病の治療も開示される。また、本発明において有用であると考えられる不死化前躯体細胞を調製することも可能ある（米国特許５８３０６８２および米国特許５８１１２９７）。別の例において、ｐ５３成長抑制遺伝子欠乏動物由来の未成熟樹状細胞株を調製する（米国特許５６４８２１９）。未成熟樹状細胞を誘発することにより、Ｔ細胞増殖を刺激し、したがって、本発明に使用することが意図される活性化、不死化樹状細胞株としてもよい。
【０１０４】
一旦ＤＣが入手できると、細胞は本発明によるアダプターポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスと接触されるか、または予め形成されたアダプターポリペプチドとアデノウイルスとの複合体と接触される。三成分を接触させる場合、アデノウイルスの線維タンパク質とアダプタータンパク質のＣＡＲドメインとの相互作用およびアダプターにおけるヒトＣＤ４０ＬとＣＤ４０陽性細胞との間の相互作用から、三元複合体を形成する必要がある。アデノウイルスとアダプターポリペプチドとの間の複合体がすでに形成されている場合には、接触工程では、アデノウイルス−アダプター複合体に存在するヒトＣＤ４０Ｌと、ＣＤ４０細胞の表面に存在するＣＤ４０との間の相互作用により、アデノウイルス−アダプター複合体とＣＤ４０陽性細胞との間の二次複合体を形成する必要がある。
【０１０５】
第一工程で使用されるアデノウイルスによりコードされている抗原は、上記で定義されたいずれかの好適な抗原であることができる。好ましい実施態様によれば、抗原は、ＨＣＶ抗原である。さらに好ましい実施態様によれば、ＨＣＶ抗原は、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原性断片である。上記で定義したＮＳ３変異体またはその抗原性断片は、本発明の方法に使用するのに好適である。
【０１０６】
別の好ましい実施態様によれば、第一工程で使用される樹状細胞は、Ｃ型肝炎の患人から得られる。ＨＣＶに感染した患者から得たＤＣは、通常の刺激に反応した成熟化が不十分であるという従来技術における証拠とは対照的に、本発明者らは、ＩＬ−１２発現および同種Ｔリンパ球を刺激する能力とにより測定したとき、ＨＣＶに感染した患者から得たＤＣが、対照被験者からの細胞と同様に本発明のアダプターに反応して成熟するという驚くべき知見を得た（実施例１２参照）。
【０１０７】
これらの細胞に、生体内で、本発明によるアダプター分子の存在下で、ＨＣＶ抗原を発現する組み換えアデノウイルスベクター（ｒＡｄ）を導入する。
【０１０８】
さらなる工程において、細胞を、抗原由来の一種以上のペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示に適切な条件下に維持する。アデノウイルスによりコードされている抗原から得た少なくとも一種の抗原性ペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示に好適な条件は、ＤＣ活性化を測定する標準アッセイを用いることにより測定することができる。
【０１０９】
多数の分子マーカーおよび多数の細胞表面表現型の変化を用いて、ＤＣの成熟化をすることができる。これらの変化を、例えば、フローサイトメトリー法を用いて分析できる。典型的には、成熟マーカーを、特異的抗体およびマーカーを発現するＤＣを用いて標識するか、または一連の意図するマーカーを、例えば、細胞選別ＦＡＣＳ分析を用いて、総ＤＣ集団から分離することができる。ＤＣ成熟化のマーカーには、未成熟ＤＣと比較して、成熟ＤＣにおいてより高いレベルで発現する遺伝子などがある。このようなマーカーには、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ抗原（特に、ＨＬＡ−ＤＲ）、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、細胞輸送分子、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１８などがあるが、これらには限定されない。さらに、ＤＣの成熟化を、Ｔｈ１反応の誘導と関連する一定のリッチリガンド、例えば、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ジャグド１およびジャグド２を測定することにより実施できる。さらに、成熟樹状細胞は、混合白血球反応（ＭＬＲ）における未変性同種Ｔ細胞の増殖を刺激する能力に基づいて同定できる。さらに、一般的に、未成熟樹状細胞は抗原取込みにおいて非常に効率的であるが、不十分な抗原提示細胞であるのに対して、成熟樹状細胞は抗原取込みでは不十分であるが、非常に効率的な抗原提示細胞であることが判明した。樹状細胞の抗原提示機能は、本明細書に記載の抗原依存性ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞活性化アッセイ、さらには当業者に周知の他の標準アッセイ、抹消血リンパ球に対する生体内刺激能を用いて、例えば、ＤＣの存在下で、ＣＤ８＋リンパ球により産生されるＩＦＮ−γの量の測定により測定できる。この測定は、ＥＬＩＳＰＯＴとして知られている技術を用いて実施できる。さらに、細胞活性化は、例えば、刺激樹状細胞により産生したサイトカインの誘導を測定することにより判定できる。サイトカインの産生の刺激は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ等の種々の標準的手法を用いて定量化できる。
【０１１０】
トリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）による標的細胞の標識等の他の細胞毒性アッセイを使用することもできる。３Ｈ−ＴｄＲは、標的細胞により、細胞の核に取り込まれる。３Ｈ−ＴｄＲの放出は、ＤＮＡ断片化による細胞死の目安である。アッセイは、インキュベーション時間が少なくとも約４８時間であり、５０ｐ、１〜約１００ｍｌの上清を、少なくとも約１ｍｌのシンチレーション流体の存在下でベータカウンターにより測定する以外は、上記のようにしてアッセイをおこなう。特異的溶解百分率の計算は、上記式を用いておこなう。
【０１１１】
本発明による樹状細胞製剤（前躯体または成熟、免疫原性またはトレラゲン性、そして免疫原性である場合には抗原を負荷した前または後）のいずれも、調製後に保存して、後で治療投与またはさらなる処理に使用できる。負荷前または負荷後に樹状細胞を凍結保存する方法は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２１６５６０に記載されている。
【０１１２】
樹状細胞ワクチン接種
本発明によれば、成熟で且つ抗原を負荷したＡＰＣを得るための方法が提供される。したがって、別の態様によれば、本発明は、上記に記載した方法により得られる抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞に関する。
【０１１３】
細胞を、ＤＣワクチンとしてそれらを使用することにより、すなわち、前記患者に細胞を投与することにより、患者に免疫反応を引き起こすのに使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、被験者における免疫反応を引き起こすための、本発明で定義した抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞に関する。換言すれば、本発明は、また抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者において免疫反応を引き起こすための方法に関する。
【０１１４】
ＤＣワクチン接種は、免疫反応を誘発する被験者（例えば、ヒト患者）に抗原負荷ＤＣを投与することにより実施される。典型的には、免疫反応には、標的抗原性ペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体）を有する標的細胞に対するＣＴＬ反応などがある。これらの標的細胞は、典型的には癌細胞である。改変ＤＣを患者に投与するときには、好ましくは患者からの前躯体細胞から単離または得る（すなわち、ＤＣを、採取したのと同じ患者に投与する）。しかしながら、細胞を、ＨＬＡ適合同種またはＨＬＡ不適合同種患者に注入してもよい。後者の場合、免疫抑制薬をレシピエントに投与してもよい。
【０１１５】
細胞を、好ましくは薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）とともに、いずれかの好適な方法で投与できる。通常、投与は静脈注射でおこなうが、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路での投与も可能である。投与（すなわち、免疫化）は、時間間隔を設けて反復してもよい。ＤＣの注入を、ＤＣ数と活性を維持する役割を果たすサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２）の投与と組み合わせてもよい。
【０１１６】
患者への投与量は、Ｔ細胞増殖を測定するアッセイにより検出される免疫反応、Ｔリンパ球細胞障害を測定するアッセイで検出される免疫応答の誘発および／または経時的に患者における有益な治療反応を生じさせるのに十分なものでなければならない。典型的には、可能な場合には、１０６〜１０９またはそれ以上のＤＣを、注入する。ワクチンは、有益な結果を付与するために、患者に一回以上投与することができる。当業者は、ワクチン投与の適切なタイミングを決定することができる。ワクチンの最初の投与および／または続いての投与のタイミングは、種々の要因、例えば、患者の健康、安定性、年齢および体重（但し、これらには限定されない）に依存する。ワクチンは、適切な時間間隔（例えば、一週間に一度、二週間ごと、三週間に一度、一カ月に一度（但し、これらには限定されない））で投与できる。一実施態様によれば、ワクチンを無期限に投与できる。一実施態様によれば、ワクチンを、２週間間隔で３回投与できる。ワクチンの適切な投与量は、種々の因子、例えば、患者の健康、安定性、年齢および体重（但し、これらには限定されない）にも依存する。臨床的利点得るのに十分なレベルの免疫が得られたら、持続追加免疫が必要なことがあるが、この場合、一般的に、投与頻度を少なくすることができる（例えば、一カ月ごとまたは半年ごと）。
【０１１７】
免疫反応を引き起こす方法で使用されるＤＣは、好ましくは容器に入手可能な医薬品として使用できるように製剤化される。この場合、製剤における細胞と治療患者との間の組織適合性が不一致な場合がある。ある場合、クラスＩＩ部位での不一致がワクチンの効果を高めることがある。同種細胞は、エキソソームの形態でパッケージ化腫瘍抗原を導入することにより、抗原提示細胞を交差摂取することができる（Ｓ．Ｌ．Ａｌｔｉｅｒｉら．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：２８２，２００４；Ｆ．Ａｎｄｒｅら．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２１２６，２００４；Ｎ．Ｃｈａｐｕｔら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：２３４，２００４）。投与細胞が、代わりに、宿主における食細胞により取り込まれる場合、それらの腫瘍抗原ペイロードが、勿論宿主細胞により提示されるであろう。他の例では、ＨＬＡ不一致が、細胞の早期除去を促進する（とりわけ複数回投与後）ことによるか、または免疫系を意図する標的からそらす強力な抗アロタイプ反応を生成することにより、ワクチンの効果を弱めることがある。この場合、樹状細胞上のＨＬＡ対立遺伝子（とりわけＡ座および特にＡ２対立遺伝）の少なくとも一部が患者と共有される、ワクチン製剤を使用することが有利なことがある。このように、腫瘍標的抗原の少なくとも一部分が、自己クラスＩ分子において提示され、抗腫瘍反応を高め、同種反応を減少させる。
【０１１８】
部分一致は、単に一般的な２種以上のアロタイプ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ１、Ａ１９、Ａ３、Ａ９およびＡ２４）を有する細胞の混合物から調製した樹状細胞ワクチンを提供することにより達成できる。ほとんどの患者のための完全一致は、臨床医に、一連の異なる樹状細胞を提供し、そこから各々ＨＬＡ−Ａ部位で単一のアロタイプを有すると思われるものを選択することで達成できる。治療は、標準組織適合検査により患者における一つ以上のＨＬＡアロタイプを同定した後、患者を患者に一致するＨＬＡアロタイプを有する樹状細胞で患者を治療することを含む。例えば、ＨＬＡ−Ａ２およびＡ１９だった患者は、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ１９ホモ接合細胞または両者の混合物で処理できる。
【０１１９】
また、ＨＬＡ不一致の生じるかもしれないマイナス効果は、外来アロタイプに対する免疫寛容を生成することにより対処することもできる。ワクチンの調製中、ＤＣを２つの集団に分ける：一つは未成熟寛容性（ｔｏｌｅｒａｇｅｎｉｃ）樹状細胞を生成するためのもので、もう一つは、抗原提示用成熟樹状細胞を生成するためのもの。同じ株由来であるので、寛容性細胞は、成熟細胞のグラフト受容性を高めるであろうＨＬＡ特異的寛容性を誘発するように設計される。被験者に、まず寛容性細胞を一回以上投与して、十分な程度の免疫無反応（例えば、混合リンパ球反応で測定可能）を生成する。寛容状態になったら（１週間〜１カ月後）、抗原負荷樹状細胞を必要な頻度で投与して、標的腫瘍抗原に対する免疫反応を引き起こす。
【０１２０】
好ましい実施態様によれば、抗原提示細胞は、治療被験者の自己由来樹状細胞である。
【０１２１】
ＤＣワクチン組成物は、抗原負荷ＡＰＣの他に、免疫刺激化合物、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび／または一種以上の免疫刺激性サイトカインを含んでなる。好適なＴＬＲアゴニストには、ＴＬＲ１を介して作用するアゴニスト、ＴＬＲ２アゴニスト、例えば、フェノール可溶性モジュリン、ＴＬＲ３アゴニスト、例えば、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ＰｏｌｙＩＣ）、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、フィブロネクチンの一つ以上のＥＤＡドメイン、または細菌性リポ多糖類、ＴＬＲ−５アゴニスト、例えば、細菌性フラジェリン、ＴＬＲ−６アゴニスト、例えば、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化ＬＰおよびおよびフェノール可溶性モジュリン、ＴＬＲ７アゴニスト、例えば、ロクソリビンまたはイミダゾキノリン化合物、ＴＬＲ−８アゴニスト、例えば、レジキモド、ＴＬＲ−９アゴニスト、例えば、未メチル化ＣｐＧヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあるが、これらには限定されない。
【０１２２】
本明細書において用いられる用語「免疫刺激性サイトカイン」は、免疫系のいずれかの成分の活性の増加を促進する化合物、例えば、それらの成分を形成している部分、あるいは細胞介在免疫反応、体液介在免疫反応および補体系に関与するものとして理解される。好ましくは、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγおよびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される。
【０１２３】
ワクチン組成物は、必要に応じてアジュバントを含む。アジュバント成分は、いずれかの好適なアジュバントまたは複数のアジュバントの組み合わせであることができる。例えば、好適なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；水中油型および油中水型配合物、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；鉱物ゲル；ブロック共重合体；アブリジン（登録商標）脂質−アミン；ＳＥＡＭ６２；細菌性細胞壁成分から形成したアジュバント、例えば、リポ多糖類（例えば、脂質Ａまたはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）；熱ショックタンパク質またはそれらの誘導体；ＡＤＰリボシル化細菌性トキシン、例えば、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、コレラトキシン（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定トキシン（ＬＴｌおよびＬＴ２）由来のアジュバント、シュードモナスエンドトキシンＡ、シュードモナスエンドトキシンＳ、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）外酵素、バチルススファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）トキシン、ボツリヌス菌Ｃ２およびＣ３トキシン、Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍ外酵素、さらには、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＤＩＮおよびＡＤＰ−リボシル化細菌性トキシン突然変異体、例えば、ＣＲＭ１９７、非毒性ジフテリアトキシン突然変異体由来のトキシン；サポニンアジュバント、例えば、ＱｕｉｌＡ（米国特許第５，０５７，５４０号）、またはサポニンから生成した粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；ケモカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２等）、インターフェロン類（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、デフェンシン１または２、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ＭＩＰｌ−アルファおよびＭＥＰ−２等；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタム（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスフォリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等；ＣｐＧ族分子、ＣｐＧジヌクレオチド、および合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含んでなる）由来のアジュバント、リモサム外酵素および合成アジュバント、例えば、ＰＣＰＰなどがあるが、これらには限定されない。
【０１２４】
ＤＣがＨＣＶおよびより具体的には、ＨＣＶＮＳ３の一種以上の抗原性ペプチドを含んでなるＤＣ系ワクチンの特定の場合においては、ワクチンは、ＨＣＶ感染の治療または予防、さらにはＨＣＶ感染、例えば、無症状慢性保菌状態、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌から生じる他の状態の治療に使用される。
【０１２５】
本発明を、以下の実施例により説明するが、これらの実施例は単に発明を説明したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
ＣＦｍ４０Ｌの使用が、ＤＣへのアデノウイルス導入効率を増加させる。
Ｃ５７ＢＬ６マウスの樹状細胞（ＤＣ）を、骨髄前駆細胞からＺａｂａｌｅｔａら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００８，１６：２１０−２１７）に記載のようにして生成した。このため、大腿骨および脛骨の骨髄細胞を抽出し、赤血球を溶解緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）を用いて溶解した。次に、ＲＰＭＩ１６４０での洗浄を実施し、ウサギサプリメントととともに種々の細胞集団に対する抗体の混合物を用いたインキュベーションにより、リンパ球と顆粒球を除去した：
−抗−ＣＤ４抗体（１００μｇ／ｍｌ）:ハイブリドーマＧＫ１−５（Ｄｉａｌｙｎａｓら，１９８３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３ Ｎｏｖ；１３１：２４４５−５１）から得た。
−抗−ＣＤ８抗体（１００μｇ／ｍｌ）：ラットハイブリドーマＨ３５．１７．２（Ｐｉｅｒｒｅｓら，１９８２，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２（１９８２），６０−６９）から得た。
−Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）（１０μｌ／ｍｌ）。
−ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（１５μｌ／ｍｌ）。
−ウサギサプリメント（ＳＩＧＭＡ社)（５０μｇ／ｍｌ）。
【０１２７】
この混合物を、２０分ごとに攪拌しながら、３７℃で５０分間インキュベーションした。インキュベーション後、洗浄し、得られた細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびインターロイキン（ＩＬ−４、２０ｎｇ／ｍｌ）（ともにＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社、英国ロンドン、から入手）を追加した完全培地（ＣＭ；１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）およびグルタミン（２ｍＭ）含有ＲＰＭＩ１６４０）中、１２ウエルプレート（日本国イワキ社製）において濃度１０６細胞／ｍｌで培養した。２日おきに、培地の３分の２を、サイトカインを追加した新鮮培地で交換した。７日目に、非付着細胞を集め、１０７細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０に再懸濁した。ＡｄＧＦＰアデノウイルス（緑色蛍光タンパク質をコードするもの）を種々の量で含有する溶液を、ＰＢＳ５０μｌ中、アダプターＣＦｍ４０Ｌ６μｇの存在下または不存在下、３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＤＣ（１０６）に添加した。Ｐｅｒｅｂｏｅｖら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；９：７１２−７２０）に記載のようにして、前記分子を発現するプラスミドを安定的に取り込んだ２９３細胞の培養上清からの精製により、アダプターＣＦｍ４０Ｌを得た。１時間のインキュベーション後、サイトカインを追加したＣＭを、最終濃度106 細胞／ｍｌまで細胞が希釈されるまで添加した。２４時間後細胞を集め、十分に洗浄して、アデノウイルス粒子を完全に除去した。洗浄後、得られた細胞を、フローサイトメトリーによる分析に使用した。結果は、各ウイルス使用量ごとに、形質導入細胞の百分率として図１に示されるとおりであった。
【０１２８】
実施例２
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現が誘発される。
Ｃ５７ＢＬ６マウスから得たＤＣを実施例１に記載のようにして調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下でＡｄＮＳ３（多重感染度３０）を導入した。未処理ＤＣまたはＣＦｍ４０Ｌ単独で処理したＤＣを、対照群として使用した。１日後にＤＣを集め、それらの成熟度を、フローサイトメトリーによる表面マーカー分析により検討した。マーカーＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂ（ＭＨＣクラスＩＩ）に対する抗体および対照アイソタイプ（上記の全てはＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から入手）を使用した。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中、４℃で標識を実施した。３０分後、細胞を洗浄し、種々の表面マーカーの発現を分析した。結果は図２に示されるとおりであった。
【０１２９】
実施例３
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でのＤＣへのＡｄＮＳ３の導入は、生体外成熟化：サイトカインの産生を誘発する。
実施例２と同様にして調製し、同じ群に分割（未処理、ＡｄＮＳ３、ＣＦｍ４０ＬおよびＣＦｍ４０Ｌ＋ＡｄＮＳ３）したＤＣを、２４時間培養した後、培養の上清を集めた。これらの培養上清における産生したＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＩＬ−６の量を、ELISA(BD−Pharmingen、米国ニュージャジー州フランクリンレイク)により、メーカーの瀬説明書に準じて測定した。結果は図３に示されるとおりであった。
【０１３０】
実施例４
ＣＦｍ４０Ｌにより誘発されるＤＣの成熟化は、Ｔｈ１反応の誘発に関連するＮｏｔｃｈリガンドの発現を伴う。ＤＣを実施例２と同様にして調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３（多重感染度３０）を導入した。１日後、細胞を集め、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ジャグド１およびジャグド２の遺伝子のｍＲＮＡの発現を、ＺａｂａｌｅｔａＡら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ １６：２１０−７）に記載のようにして、リアルタイムＰＣＲにより分析した。増幅に使用したプライマーを下表に示す：
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
結果は、アクチンで標準化し、未処理ＤＣに対する誘発度として図４に示されるとおりであった。
【０１３３】
実施例５
ＣＦｍ４０Ｌの存在下でＤＣへＡｄＮＳ３を導入すると、生体外刺激能が増加する。
実施例２および３で述べた処理に附した（未処理、ＡｄＮＳ３およびＣＦｍ４０Ｌ＋ＡｄＮＳ３）Ｃ５７ＢＬ６マウスから得た種々の数のＤＣを、同種リンパ球（ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から得た１０５非付着細胞）とともに培養した。Ｕ型底９６ウエルプレートでアッセイを実施し、２日後に培養上清を集め、１ウエル当たり［３Ｈ］チミジン０．５μＣｉを添加し、さらに１８時間放置した。（Ａ）その後、試料を、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ベルギー）に集めた。乾燥後、シンチレーション流体をプレートに添加し組み込まれたチミジンを、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ；Ｐａｃｋａｒｄ社製、コネティカット州メリディン）で測定した。また、上清に存在するＩＦＮ−ガンマ（Ｂ）およびＩＬ−４（Ｃ）の量を、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により測定した。（Ｄ）ヒト分子HLA−A2遺伝子およびα２ミクログロブリン遺伝子導入HHD マウス [15]から得たＤＣを調製した。これらに、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下で多重感染度３０でＡｄＮＳ３を導入するかまたは未処理のままとし、２４時間後に集めた。これらのＤＣ（５ｘ１０３）／ウエルを使用して、Ｚａｂａｌｅｔａら（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２００７ Ａｐｒ；７４（１）：２５−３５）に記載されているようにしてポリ（Ｉ：Ｃ）および抗−ＣＤ４０とともに前記ペプチドで予め免疫したＨＨＤマウスの脾臓から得たペプチド１０７３−１０８１（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）（配列番号：４４）に特異的な１０３ＣＤ８Ｔリンパ球を刺激した。ＤＣおよびＴリンパ球を、９６ウエルELISPOTプレート(Multiscreen HTS; Millipore社)で培養し、２４時間後、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞数を、市販のBD−Pharmingenキットを用いて、メーカーの説明書に準じて測定した。スポットを、ELISPOTカウンター（CTL； Aalen、ドイツ）でカウントした。結果は図５に示されるとおりであった。
【０１３４】
実施例６
ＣＦｍ４０ＬとともにＡｄＮＳ３を導入したＤＣを免疫すると、ＤＣおよびＡｄＮＳ３単独よりも反応が大きくなる。
（Ａ）ＨＨＤマウスから得たＤＣを調製し、ＣＦｍ４０Ｌの存在下または不存在下において、多重感染度３０でＡｄＮＳ３を導入し、２４時間後に集めた。２ｘ１０５ＤＣを、ＨＨＤマウス（１群当たりｎ＝３）の尾部の基底に皮下注射し、１週間後にマウスを殺した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、市販のＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎキットを用いて、メーカーの説明書に準じてＩＦＮ−γ産生細胞頻度を測定した。脾細胞（５ ｘ １０５／ウエル）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートで培養した。ＰＢＳでの洗浄および１０％ウマ血清でのブロッキング後、細胞を、ＨＬ−１培地中、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＤ８エピトープ１０３８〜１０４７（ＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬ）（配列番号：４５）、１０７３〜１０８１（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）（配列番号：４４）、１４０６〜１４１５（ＫＬＶＧＬＧＩＮＡＶ）（配列番号：４６）（上記の全ては１０μＭ）または組み換えＮＳ３ タンパク質（ドイツ国Ｎｅｕｒｉｅｄ、Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）（１μｇ／ｍｌ） に対応する合成ペプチドの存在下または不存在下で、三重反復培養した。１日後、ＩＦＮ−γ産生細胞数を、メーカーの説明書に準じて測定した。結果は、抗原なしで培養したウエルで得たものを除いて、抗原の存在下で得たポイントを示している。（Ｂ）Zabaleta ら (Mol Ther. 2008, 16:210−7)に記載のNS3ペプチド1367、1427 および1447を抗原として使用した以外は、同様の実験を、C57Bl6 マウス株でおこなった。結果は図６に示されるとおりであった。
【０１３５】
実施例７
ＣＦｈ４０Ｌは、ヒトＣＤ発現細胞のＡｄ導入を高める。
ヒトＣＤ４０を安定して発現する２９３細胞に、多重感染度５００v.p.／細胞でルシフェラーゼをコードするＡｄを導入した。天然Ａｄ受容体ＣＡＲをブロックするために、細胞を、１０ｍｇ／ｍｌの組み換えＡｄ５ノブで処理した。Ａｄを、表示濃度でＣＦｈ４０Ｌアダプターと複合し、三重反復で細胞に転写した。２日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を相対光単位として測定した。結果は図７に示されるとおりであった。
【０１３６】
実施例８
ＣＦｈ４０Ｌを使用すると、ＤＣへのアデノウイルス導入能を増加する。
ヒトＤＣを、Ｂａｎｃｏ ｄｅ Ｓａｎｇｒｅ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ（ナバル血液銀行）から入手した血液試料から得た単球から調製した。血液を、フィコール勾配で遠心分離して、単核細胞を精製し、その後、ＣＤ１４＋単球を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットを用いて、メーカーの説明書に準じて磁気ビーズにより分離した。単球の精製後、１０００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手）を用いてＣＭ中で培養した。培養３日後、培地の半分を新鮮培地およびサイトカインと変更し、培養を７日まで継続した。細胞を集め、アダプターＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下において多重感染度３０およびアダプターＣＦｈ４０Ｌの不存在下において多重感染度３００で、ＡｄＧＦＰにより感染した。インキュベーション１時間後、サイトカインを追加したＣＭを、細胞が最終濃度１０６ 細胞／ｍｌまで希釈されるまで添加した。２４時間後、細胞を集め、十分に洗浄して、アデノウイルス粒子を完全に除去した。洗浄後、得られた細胞を、フローサイトメトリー による分析に使用した。結果は、ウイルスの各使用量ごとに、形質導入細胞（ＧＦＰ＋）の百分率として図８に示されるとおりであった。
【０１３７】
実施例９
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：表面マーカーの発現を誘発する。
ヒトＤＣを、実施例８に記載したようにして単球から調製した。細胞を集め、ＣＦｈ４０Ｌの存在下または不存在下において、多重感染度３０でＡｄＮＳ３により感染させた。一部の例では、比較法において、別の成熟化刺激、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）（２０μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−α含有カクテル（Ｂｅｒｏｍｕｎｅ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，２００ｎｇ／ｍｌ）＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２５μｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ−α（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ， Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ，１０００Ｕ／ｍｌ）を、感染後添加した。２４時間後、細胞を集め、マーカーＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現を、実施例２に説明したようなこれらの分子に対する抗体（これらの全ては、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から入手）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。結果は、平均蛍光指数（ＭＦＩ）としてマーカーの各々の値として図９に示されるとおりであった。
【０１３８】
実施例１０
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣをＡｄＮＳ３を導入することにより、生体外成熟化：ＩＬ−１２の産生を誘発する。ヒトＤＣを、図７に示すように単球から調製し、ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）＋ＩＦＮaまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理した。結果は図１０に示されるとおりであった。
【０１３９】
実施例１１
ＣＦｈ４０Ｌの存在下でヒトＤＣにＡｄＮＳ３を導入すると、生体外成熟化：同種Ｔ細胞の刺激を誘発する。ＡｄＮＳ３、ＡｄＮＳ３＋ＴＮＦ−α＋アンプリゲン（ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）＋ＩＦＮaまたはＡｄＮＳ３＋ＣＦｈ４０Ｌで処理したヒトＤＣの種々の量を、別の個体から得た１０５非付着単核細胞とともに培養した。４日後、１ウエル当たり0.5 μCiの[3H]チミジンを添加し、さらに１８時間放置した。この後、試料を、Unifilterプレート（PerkinElmer社、ベルギー）に集めた。乾燥後、シンチレーション流体を、プレートに添加し、取り込まれたチミジンを、実施例５に記載したシンチレーションカウンターで測定した。結果は図１１に示されるとおりであった。
【０１４０】
実施例１２
慢性Ｃ型肝炎ウイルスを患った患者から得た単球由来のＤＣに、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入すると、健常ＨＣＶ血清反応陰性の人から得たＤＣで見られるのと同様の細胞活性化を誘発する。ＤＣを、慢性Ｃ型肝炎を患った患者または健常な人から得た単球から調製した。７日後、これらに、ＣＦｈ４０Ｌの存在下でＡｄＮＳ３を導入し、２４時間後、フローサイトメトリーによる表面マーカーの発現（Ａ）、培養上清のＩＬ−１２の産生（Ｂ）およびそれらの同種Ｔリンパ球刺激能を分析した。結果は図１２に示されるとおりであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＡＲのドメインが、ＣＡＲの細胞外ドメイン、好ましくは配列番号１のアミノ酸１〜２３６を含んでなるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ヒトＣＤ４０リガンドが、配列番号６のアミノ酸１１８〜２３１を含んでなるものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記三量化モチーフが、バクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質の断片を含んでなるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記バクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質の断片が、配列番号４を含んでなるものである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
標識をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記標識が、ポリヒスチジン標識、好ましくはヘキサヒスチジン標識である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ＣＡＲの細胞外ドメインのＣ末端にペプチドリンカーをさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１１を含んでなるものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、前記アミノ末端から順番に、ＣＡＲの細胞外ドメインと、前記三量化モチーフと、前記ヒトＣＤ４０リガンドとを含んでなるものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１２】
請求項１１で定義される核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチド、請求項１１で定義されている核酸または請求項１２で定義されているベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１４】
ＣＡＲの細胞外ドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドの断片とを含んでなるポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを産生できる条件下で、請求項１３で定義されている宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる、組成物または複合体。
【請求項１７】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項１６に記載の組成物または複合体。
【請求項１８】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原複合体である、請求項１７に記載の組成物または複合体。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項で定義されている組成物または複合体と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
被験者において抗原に対する免疫反応を生じさせる方法に用いられる組成物または複合体であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなるものである、組成物または複合体。
【請求項２１】
前記複合体の形成に適切な条件下で、前記複合体の成分を、投与前に接触させることにより形成させたものである、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項２０または２１に記載の組成物または複合体。
【請求項２３】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原断片である、請求項２２に記載の組成物または複合体。
【請求項２４】
抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞と、請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスとを接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触が実施され得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスと前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示のために適切な条件下で維持する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記抗原負荷抗原提示細胞を単離することをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ４０陽性抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記樹状細胞が、ＨＣＶ患者から単離したものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれかの方法により得られた、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞。
【請求項３１】
被験者において免疫反応を生じさせるために用いられる、請求項３０で定義された抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞。
【請求項３２】
請求項３０の前記抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者において免疫反応を生じさせる方法。
【請求項３３】
前記抗原提示細胞が、治療される被験者に対して自己由来樹状細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）アデノウイルス線維タンパク質またはその機能的変異体に結合することができるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のドメインと、
（ｉｉ）三量化モチーフと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ４０リガンドと
を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＡＲのドメインが、ＣＡＲの細胞外ドメイン、好ましくは配列番号１のアミノ酸１〜２３６を含んでなるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ヒトＣＤ４０リガンドが、配列番号６のアミノ酸１１８〜２３１を含んでなるものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記三量化モチーフが、バクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質の断片を含んでなるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記バクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質の断片が、配列番号４を含んでなるものである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
標識をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記標識が、ポリヒスチジン標識、好ましくはヘキサヒスチジン標識である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ＣＡＲの細胞外ドメインのＣ末端にペプチドリンカーをさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１１を含んでなるものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、前記アミノ末端から順番に、ＣＡＲの細胞外ドメインと、前記三量化モチーフと、前記ヒトＣＤ４０リガンドとを含んでなるものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１２】
請求項１１で定義される核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチド、請求項１１で定義されている核酸または請求項１２で定義されているベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１４】
ＣＡＲの細胞外ドメインと、三量化モチーフと、ヒトＣＤ４０リガンドの断片とを含んでなるポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを産生できる条件下で、請求項１３で定義されている宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程と
を含んでなる方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなる、組成物または複合体。
【請求項１７】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項１６に記載の組成物または複合体。
【請求項１８】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原複合体である、請求項１７に記載の組成物または複合体。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項で定義されている組成物または複合体と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
被験者において抗原に対する免疫反応を生じさせる方法に用いられる組成物または複合体であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと、
（ｂ）抗原をコードするアデノウイルスと
を含んでなるものである、組成物または複合体。
【請求項２１】
前記複合体の形成に適切な条件下で、前記複合体の成分を、投与前に接触させることにより形成させたものである、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項２０または２１に記載の組成物または複合体。
【請求項２３】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原断片である、請求項２２に記載の組成物または複合体。
【請求項２４】
抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＣＤ４０陽性抗原提示細胞と、請求項１〜１０のいずれか一項で定義されているポリペプチドおよび抗原をコードするアデノウイルスとを接触させる工程であり、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスを別個に添加することによるか、または予め形成されたポリペプチド−アデノウイルス複合体を添加することにより前記接触が実施され得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記混合物を、前記ポリペプチドと前記アデノウイルスと前記細胞との間の三元複合体の形成に適切な条件下で維持する工程と、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記抗原由来の一種以上のペプチドの内在化、プロセッシングおよび提示のために適切な条件下で維持する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記抗原負荷抗原提示細胞を単離することをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ４０陽性抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原がＨＣＶ抗原である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＣＶ抗原が、ＮＳ３プロテアーゼまたはその抗原断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記樹状細胞が、ＨＣＶ患者から単離したものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれかの方法により得られた、抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞。
【請求項３１】
被験者において免疫反応を生じさせるために用いられる、請求項３０で定義された抗原負荷ＣＤ４０陽性抗原提示細胞。
【請求項３２】
請求項３０の前記抗原提示細胞を被験者に投与することを含んでなる、被験者において免疫反応を生じさせる方法。
【請求項３３】
前記抗原提示細胞が、治療される被験者に対して自己由来樹状細胞である、請求項３２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５２０４５８（Ｐ２０１１−５２０４５８Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９９５５（Ｐ２０１１−５０９９５５）
【出願日】平成２１年５月１９日（２００９．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６０５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４１３３５
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【出願人】（５０４１６８２６０）ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１９日（２００９．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６０５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４１３３５
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【出願人】（５０４１６８２６０）ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション (12)
【Ｆターム（参考）】
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