アフィニティートラップリアクター、及びそれを用いたアンジオスタチン様断片のヒト血漿からの一段階精製プロセス
本発明は、用いる酵素と基質の種類によってもその用途が制限されずに、担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく進行するアフィニティートラップリアクターを提供する。本発明は、酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体からなる、アフィニティートラップリアクター、並びに生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法であって、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、０〜５０℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得る方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、プロテアーゼなどの酵素を固定化したアフィニティートラップリアクターに関する。
【背景技術】
血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約４０，０００のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。アンジオスタチンの生産には、（１）プラスミノーゲンをエラスターゼというプロテアーゼで加水分解する（非特許文献２参照）、（２）遺伝子組換え技術を用いて大腸菌に直接生産させる（非特許文献３参照）、という２種類の方法が用いられている。この（１）の方法では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難である。また得られるアンジオスタチンの活性が低いなどの欠点がある。（２）の方法では、大腸菌によって生産されるアンジオスタチンの精製が困難であり、コストもかかる。また、溶解性の低さにも問題がある。このため、アンジオスタチンを簡便な方法で高純度で得る手段の開発が求められていた。
最近、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡが、プラスミノーゲンを特異的に切断して新生血管抑制作用を有するアンジオスタチン様断片（主にＧｌｕ１−Ｓｅｒ４４１，以降、ＢＬ−アンジオスタチンと記載する）と、血栓溶解活性を有するミニプラスミノーゲン様断片（主にＶａｌ４４２−Ａｓｎ７９１）を生成することが認められた（特許文献１参照）。また、この酵素バシロライシンＭＡは、非常に安定であるため、担体に固定して各種用途に用いることが可能である。そこでこのようなバシロライシンＭＡの特性を利用して、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なって高純度でＢＬ−アンジオスタチンを得る方法、及びそれを行なうための装置の開発が求められていた。
一方、各種用途に用いるプロテアーゼなどの各種酵素を反応に用いるために担体に固定した酵素固定化リアクターが、従来提案されている。しかし、プロテアーゼについては、固定したプロテアーゼが自己消化による分解で失活しやすい。またプロテアーゼなどの酵素の基質が高分子である場合、空間的な制限により担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく速やかに進行しにくい。これらの理由から、酵素固定化リアクターについては、用いる酵素と基質の種類によってはその用途が制限されており、各種酵素及び基質について広く利用できる酵素固定化リアクターの開発が期待されていた。
【特許文献１】 特開２００２−２７２４５３号公報
【非特許文献１】 エム・エス・オリリー（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ほか、「セル」（Ｃｅｌｌ）、（米国）、１９９４年１０月２１日、第７９巻、第２号、ｐ３１５−３２８
【非特許文献２】 エム・エス・オリリー（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ほか、「ネイチャー・メディシン」（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、（米国）、１９９６年、第２巻、ｐ６８９−６９２
【非特許文献３】 ビー・ケー・シム（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｍ）ほか、「キャンサー・リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（米国）、１９９７年、第５７巻、ｐ１３２９−１３３４
本発明者は、上記のような欠点のない酵素固定化リアクターを開発するとともに、上記のバシロライシンＭＡの特性を利用したＢＬ−アンジオスタチンの生産方法を開発するために鋭意研究を行なった結果、バシロライシンＭＡなどの酵素、及び酵素の基質と特異的に結合する分子を共に担体に結合させてアフィニティートラップリアクターとすることにより、上記のような欠点のないリアクターが得られるとともに、酵素としてバシロライシンＭＡを固定し、酵素の基質と特異的に結合する分子としてＬｙｓを固定したアフィニティートラップリアクターを用いることにより、血液などの生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを高効率かつ速やかに分解精製する方法が得られることを発見して、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
本発明は、酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体からなる、アフィニティートラップリアクターに関する。更に本発明は、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法であって、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、約０〜５０℃、好ましくは約４〜２５℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを高純度で得る方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミノーゲンをバシロライシンにより分解させることにより得られたＢＬ−アンジオスタチンの電気泳動図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のアフィニティートラップリアクター
本発明のアフィニティートラップリアクターは、酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合、固定させた担体からなる。酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の両方を担体に結合させることにより、酵素の基質が該分子を介して担体にトラップされて結合する結果、立体的な障害をうけることが少なく、かつ、基質と酵素が局所的に濃縮される環境が形成されるため、安定に高効率で速やかに酵素と基質との反応が進行する。
本発明のアフィニティートラップリアクターに固定される酵素としては、担体に共有結合により固定することができる酵素であれば、必要に応じて各種の酵素を用いることができる。プロテアーゼ、糖質分解酵素、及び脂質分解酵素などを含む加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素など、各種の酵素を用いることができる。
また担体に結合させる、酵素の基質と特異的に結合する分子とは、低分子リガンドや抗原抗体反応などにより、酵素基質と特異的かつ可逆的に結合する分子であって、担体と結合しうる分子であれば、必要に応じて任意のものを用いることができる。例えば、酵素の基質、及び目的とする反応生成物には特異的に結合するが、副生成物には結合しない分子を選択して結合させることにより、酵素反応後、副生成物はアフィニティートラップリアクターから容易に除去され、目的生成物のみを高純度で回収することができる。以下に、酵素、基質、それと特異的に結合する分子の例を以下に示す。
上記に示したように、担体に結合させる酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生する酵素であるバシロライシンＭＡである場合、このような分子としてはリシン（Ｌｙｓ）を好ましく用いることができる。この場合、リシンは、基質であるプラスミノーゲン、及び目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンとは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターに使用しうる担体としては、アフィニティークロマトグラフィーにおいて通常使用されている担体であれば、固定化する酵素や、基質と特異的に結合する分子の種類、性質に応じて、当業者であれば適宜選択、使用することができる。このような担体としては、例えば、多孔性シリカビーズ担体；セレックス、セレックスＡＥ、セレックスＣＭ、セレックスＰＡＢなどのセルロース系担体（いずれもセルバ社）；セファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂなどのアガロース系担体（いずれもファルマシア社）；セファデックス、ＣＭ−セファデックスなどの架橋デキストラン系担体（いずれもファルマシア社）；クロマゲルＰ、エンザフィックスＰ−ＨＺ、エンザフィックスＰ−ＳＨ、エンザフィクスＰ−ＡＢなどの架橋ポリアクリルアミド系担体（いずれも和光純薬工業）などを用いることができる。なかでも、安定性、機械的性質に優れ、リガンドの固定可能化量が高く、非特定的吸着性が低いなどの理由から、ビーズ状の担体であるセファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂなどのアガロース系担体を好ましく使用することができる。アガロースゲルを用いる場合は、ハロゲン化シアン（臭化シアン、ヨウ化シアン、塩化シアンなど）によってあらかじめ活性化しておくのが好ましい。
また、上記の酵素は、担体と直接結合していてもよいが、必要に応じて、スペーサー基を介して結合していてもよい。例えば、担体と酵素とを直接の化学結合でカップリングさせることができない場合、酵素が比較的小さい分子であって酵素と基質との結合を完全に行なわせるのが困難である場合などに、スペーサー基を用いることができる。このようなスペーサー基は、当業者が、結合させる酵素の種類に応じて適宜選択することができる。一方、バシロライシンＭＡを担体に結合させる場合には、スペーサーは特に使用しなくても、これを担体に容易に結合させることができる。
以下に、本発明のアフィニティートラップリアクターに好適に使用しうる担体、酵素、その基質、基質と特異的に結合しうる分子、及び用いうるスペーサー基の例を挙げるが、本発明のアフィニティートラップリアクターは、これらに限定されるものではない。
本発明のアフィニティートラップリアクターの作成
本発明のアフィニティートラップリアクターは、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させたものであるので、生化学の分野で使用されるアフィニティークロマトグラフィーを製造する方法を応用することにより、当業者であれば容易に作成をすることができる。
作成に際しては、まず使用する担体に酵素を結合させる。結合に際しては、必要に応じて、担体の官能基を活性化することにより、担体と酵素との結合を容易にする。例えば担体としてアガロースゲルを用いる場合には、あらかじめハロゲン化シアン（臭化シアン、ヨウ化シアン、塩化シアンなど）で処理することによりアガロースゲルを活性化する。活性化されたアガロースゲルも市販されているので、これを用いることもできる。
必要に応じて活性化した担体を緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液に溶解した酵素溶液で担体を処理して、担体に酵素を結合させる。緩衝液に含まれる酵素の濃度は、固定する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。またここで使用する緩衝液の組成、ｐＨ、反応時間なども、固定する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。例えばバシロライシンＭＡを担体に固定する場合、バシロライシンＭＡ約０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２．８４ｍｇ／ｍｌを含む、ｐＨ８〜９の緩衝液（組成：０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３、更に約０．５Ｍ ＮａＣｌ、約５％イソプロピルアルコールを含む）を用い、約２時間反応させる。
次に酵素溶液を吸引などの手段により除去し、酵素の基質と特異的に結合する分子を含む水溶液で処理することにより、酵素の基質と特異的に結合する分子を担体に結合させる。この水溶液に含まれる、酵素の基質と特異的に結合する分子の濃度や反応時間は、分子の種類によって適宜決定することができる。このような分子としてリシンを用いる場合、リシン塩酸塩約０．１〜１Ｍ、好ましくは約０．２Ｍを含む約５％イソプロピルアルコール水溶液を使用して、約２時間反応させる。上記の反応はいずれも室温で行なうことができる。
次に、酵素の基質と特異的に結合する分子の水溶液を吸引などの手段により除去し、酵素及び酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体を緩衝液で洗浄することによって、本発明のアフィニティートラップリアクターが得られる。緩衝液の種類は、固定する酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターの場合、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ｂ）などの緩衝液で洗浄することができる。
上記のバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターを作成する各工程で用いる緩衝液又は水溶液に含まれるイソプロピルアルコール濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％である。イソプロピルアルコールの存在下で上記の各工程を行なうことにより、担体に固定した酵素の失活を防ぎ、酵素を安定に長期間保持することができる。
なお、上述した、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させる順序については、いずれを先に結合させることも可能である。
このようにして得た本発明のアフィニティートラップリアクターは、約０．０１〜０．１％、好ましくは約０．０２％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中、約０〜５℃程度の低温、好ましくは約４℃で保存する。緩衝液の種類は、適宜選択することができる。バシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターの場合、約０．０２％アジ化ナトリウムを含有する、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）などの緩衝液中で保存することができる。このようにアジ化ナトリウム溶液中、低温で保存することにより、本発明のアフィニティートラップリアクターは、酵素を失活させることなく、長期にわたって安定に保存することができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターは、上記のような構成とすることにより、固定する酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に制限されることなく、酵素と基質との反応を高効率で、かつ特異的に進行させることができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターの使用
本発明のアフィニティートラップリアクターを用いて、所望の酵素と基質の反応を進行させるには、上記のように調製した本発明のアフィニティートラップリアクターをあらかじめ緩衝液で平衡化しておく。緩衝液の種類は、固定した酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができる。例えば酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約１〜１０％、好ましくは約５％のイソプロピルアルコールを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｃ）を用いることができる。
次にアフィニティートラップリアクターに固定されている酵素の基質を含む、生体試料などの試料（血液など）を遠心分離することにより上清を得る。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合には、遠心分離する前に、血漿などの生体試料にあらかじめイソプロピルアルコールを、氷上で添加しておく。添加後のイソプロピルアルコールの濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％である。遠心分離の条件は、試料の種類に応じて適宜決定することができる。得られた上清を、平衡化しておいた本発明のアフィニティートラップリアクターに添加することによって生体試料中の基質と酵素との反応を進行させ、その後アフィニティートラップリアクターを緩衝液で洗浄し、次いで溶出液を添加することにより酵素反応によって生じた生成物を溶出する。洗浄に用いる緩衝液としては、平衡化に用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約０．５ＭのＮａＣｌを含む上記の緩衝液Ｃで洗浄する。溶出液も、酵素、基質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させたアフィニティートラップリアクターの場合、約２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む、約１〜１０％、好ましくは約５％のイソプロピルアルコール水溶液を溶出液として用いる。
酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させたアフィニティートラップリアクターの場合、上記の一連の反応はすべて、約０〜５０℃程度の温度、好ましくは約４〜２５℃の温度で行なう。このような温度で反応を進行させることによって、アフィニティートラップリアクターに固定されたバシロライシンＭＡは自己消化せずに安定に保持される一方、プラスミノーゲンに対するバシロライシンＭＡの作用は、必要最低限確保されるため、酵素反応は円滑かつ特異的に進行する。またこの一連の反応で使用する各種緩衝液には、カルシウムイオンを含有させず、カルシウムイオンの存在しない条件で各反応を進行させる。
使用後の本発明のアフィニティートラップリアクターは、緩衝液で洗浄し、アジ化ナトリウムを含む緩衝液中で保存する。緩衝液の種類は適宜選択することができるが、アフィニティートラップリアクターを平衡化するのに用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約１ＭのＮａＣｌ、約２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含有する緩衝液Ｃで洗浄し、約０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液Ｃ中で保存する。このような条件で洗浄、保存することにより、本発明のアフィニティートラップリアクターは、数ヶ月に渡り、繰り返し使用することができる。
以上、本発明のアフィニティートラップリアクターの作成法及び使用法について記載したが、本発明は、このアフィニティートラップリアクターを用いた、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法にも関する。本方法は、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、約０〜５０℃、好ましくは約４〜２５℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得ることによる。リシンは、基質であるプラスミノーゲンと、目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンの両者とは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物はリシンを介して担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。このような特定の条件で本発明のアフィニティートラップリアクターを用いて酵素反応を進行させることにより、プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で高純度で得ることができる。
本発明の方法は、先に詳細に記載した本発明のアフィニティートラップリアクターを用い、先に記載した本発明のアフィニティートラップリアクターの使用法により実施することができる。プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得るための具体的かつ詳細な条件は、以下の実施例に記載したとおりであるので、実施例の記載に基づいて実施することができる。
【実施例】
以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。
例１．バシロライシンＭＡの生産及び精製
バシロライシンＭＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８２６８で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている）から、以下の方法により分離精製した。
グルコース１％、コーンスターチ３％、大豆ミール１％、ペプトン０．５％、イースト抽出物０．５％、ＣａＣＯ３０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％の成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株を２８℃で６日間振とう培養後、培養液３リットルをセライトを用いてろ過し、そのろ液１リットルをＨ２Ｏで５リットルに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。その後、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化した４００ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、生化学工業株式会社）カラムに流速１５ｍｌ／分で注入した。同じ緩衝液６００ｍｌで洗浄した後、２０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍｌずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、精製物９０ｍｇを得た。
例２．バシロライシンＭＡ及びリシンを固定した本発明のアフィニティートラップリアクターの作成（リアクター１０ｍｌを作成）
臭化シアンであらかじめ活性化しておいたアガロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシア社）２．８６ｇを１ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁し、室温で１５分間撹拌した。これをカラムに移し、吸引してＨＣｌ溶液を除去し、１ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍｌで３回、次に０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ａ（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３）７５ｍｌで１回ゲルを洗浄した。２．８４ｍｇ／ｍｌのバシロライシンＭＡ溶液を同じ緩衝液Ａで作成し、その１７．６ｍｌをカラムに添加し、室温で２時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、吸引により溶液を除去し、０．２Ｍ Ｌ−リシン塩酸塩を含む５％イソプロピルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて、室温で２時間撹拌することによりリシンの固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を吸引により除去し、５％イソプロピルアルコールを含む、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ）５００ｍｌでゲルを洗浄し、最後に０．０２％アジ化ナトリウムを含む、上記組成の緩衝液Ｂ中、４℃で保存した。
例３．バシロライシンＭＡ／リシンリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
クエン酸処理したヒト血漿９５ｍｌにイソプロピルアルコール５ｍｌを氷上で添加し、３０分間放置した後、遠心分離（２２，０００ｘｇ、４℃、１時間）により上清を得、ろ過した。以降の操作はすべて４℃で行なった。例２で作成した本発明のバシロライシンＭＡ／リシンリアクター１０ｍｌを、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ｃ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。平衡化したリアクターに、上記の上清を流速１．５ｍｌ／分で添加した。その後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む上記組成の緩衝液Ｃ２００ｍｌでリアクターを洗浄した（３ｍｌ／分）。生成したＢＬ−アンジオスタチンの溶出は、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む５％イソプロピルアルコール溶液５０ｍｌで行なった。その結果、ほとんどのＢＬ−アンジオスタチンは、１０〜３０ｍｌの溶出液で溶出された。ＢＬ−アンジオスタチンの収量は、４．２ｍｇであり、純度は９５％であった。
なお、使用後のリアクターは、１ＭのＮａＣｌと２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む上記組成の緩衝液Ｃ５０ｍｌを用いて４℃で洗浄した。その後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ中、４℃で保存した。この状態で洗浄、保存したリアクターは、２ヶ月以上繰り返して使用可能であった。
得られたＢＬ−アンジオスタチンのうち３μｇを精製水に溶解して１０μｌとし、これにサンプル緩衝液１０μｌ（４％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール、２０％ショ糖、０．００４％ブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）を加え、そのうち１５μｌを７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。その結果を、図１のレーン２に示す。
図に示されるとおり、本発明のアフィニティートラップリアクターを用いてヒト血漿中プラスミノーゲンから得られたＢＬ−アンジオスタチンには、プラスミノーゲンや副生成物及びその他の血漿タンパク質はほとんど含まれておらず、高純度のアンジオスタチンが得られた。
比較例１．バシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンの分解反応
バシロライシンＭＡ（５ｎＭ）とプラスミノーゲン（３μＭ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ７．４）を、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、その１０μｌを、サンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール、２０％ショ糖、０．００４％ブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）１０μｌに加え、その１５μｌを、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。その結果を、図１のレーン１に示す。
図に示されるとおり、プラスミノーゲンをバシロライシンにより直接分解させた方法では、分解生成物に、ＢＬ−アンジオスタチン以外に、未反応のプラスミノーゲンや副生成物であるミニプラスミノーゲンが含まれており、アンジオスタチンを高純度で得ることはできなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明のアフィニティートラップリアクターを用いると、用いる酵素と基質の種類によってもその用途が制限されずに、担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく進行する。更にこのリアクターを、バシロライシンＭＡとリシンを固定したリアクターとすることにより、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なうことができる。
【図１】
【技術分野】
本発明は、プロテアーゼなどの酵素を固定化したアフィニティートラップリアクターに関する。
【背景技術】
血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約４０，０００のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。アンジオスタチンの生産には、（１）プラスミノーゲンをエラスターゼというプロテアーゼで加水分解する（非特許文献２参照）、（２）遺伝子組換え技術を用いて大腸菌に直接生産させる（非特許文献３参照）、という２種類の方法が用いられている。この（１）の方法では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難である。また得られるアンジオスタチンの活性が低いなどの欠点がある。（２）の方法では、大腸菌によって生産されるアンジオスタチンの精製が困難であり、コストもかかる。また、溶解性の低さにも問題がある。このため、アンジオスタチンを簡便な方法で高純度で得る手段の開発が求められていた。
最近、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡが、プラスミノーゲンを特異的に切断して新生血管抑制作用を有するアンジオスタチン様断片（主にＧｌｕ１−Ｓｅｒ４４１，以降、ＢＬ−アンジオスタチンと記載する）と、血栓溶解活性を有するミニプラスミノーゲン様断片（主にＶａｌ４４２−Ａｓｎ７９１）を生成することが認められた（特許文献１参照）。また、この酵素バシロライシンＭＡは、非常に安定であるため、担体に固定して各種用途に用いることが可能である。そこでこのようなバシロライシンＭＡの特性を利用して、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なって高純度でＢＬ−アンジオスタチンを得る方法、及びそれを行なうための装置の開発が求められていた。
一方、各種用途に用いるプロテアーゼなどの各種酵素を反応に用いるために担体に固定した酵素固定化リアクターが、従来提案されている。しかし、プロテアーゼについては、固定したプロテアーゼが自己消化による分解で失活しやすい。またプロテアーゼなどの酵素の基質が高分子である場合、空間的な制限により担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく速やかに進行しにくい。これらの理由から、酵素固定化リアクターについては、用いる酵素と基質の種類によってはその用途が制限されており、各種酵素及び基質について広く利用できる酵素固定化リアクターの開発が期待されていた。
【特許文献１】 特開２００２−２７２４５３号公報
【非特許文献１】 エム・エス・オリリー（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ほか、「セル」（Ｃｅｌｌ）、（米国）、１９９４年１０月２１日、第７９巻、第２号、ｐ３１５−３２８
【非特許文献２】 エム・エス・オリリー（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ほか、「ネイチャー・メディシン」（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、（米国）、１９９６年、第２巻、ｐ６８９−６９２
【非特許文献３】 ビー・ケー・シム（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｍ）ほか、「キャンサー・リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（米国）、１９９７年、第５７巻、ｐ１３２９−１３３４
本発明者は、上記のような欠点のない酵素固定化リアクターを開発するとともに、上記のバシロライシンＭＡの特性を利用したＢＬ−アンジオスタチンの生産方法を開発するために鋭意研究を行なった結果、バシロライシンＭＡなどの酵素、及び酵素の基質と特異的に結合する分子を共に担体に結合させてアフィニティートラップリアクターとすることにより、上記のような欠点のないリアクターが得られるとともに、酵素としてバシロライシンＭＡを固定し、酵素の基質と特異的に結合する分子としてＬｙｓを固定したアフィニティートラップリアクターを用いることにより、血液などの生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを高効率かつ速やかに分解精製する方法が得られることを発見して、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
本発明は、酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体からなる、アフィニティートラップリアクターに関する。更に本発明は、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法であって、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、約０〜５０℃、好ましくは約４〜２５℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを高純度で得る方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミノーゲンをバシロライシンにより分解させることにより得られたＢＬ−アンジオスタチンの電気泳動図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のアフィニティートラップリアクター
本発明のアフィニティートラップリアクターは、酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合、固定させた担体からなる。酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の両方を担体に結合させることにより、酵素の基質が該分子を介して担体にトラップされて結合する結果、立体的な障害をうけることが少なく、かつ、基質と酵素が局所的に濃縮される環境が形成されるため、安定に高効率で速やかに酵素と基質との反応が進行する。
本発明のアフィニティートラップリアクターに固定される酵素としては、担体に共有結合により固定することができる酵素であれば、必要に応じて各種の酵素を用いることができる。プロテアーゼ、糖質分解酵素、及び脂質分解酵素などを含む加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素など、各種の酵素を用いることができる。
また担体に結合させる、酵素の基質と特異的に結合する分子とは、低分子リガンドや抗原抗体反応などにより、酵素基質と特異的かつ可逆的に結合する分子であって、担体と結合しうる分子であれば、必要に応じて任意のものを用いることができる。例えば、酵素の基質、及び目的とする反応生成物には特異的に結合するが、副生成物には結合しない分子を選択して結合させることにより、酵素反応後、副生成物はアフィニティートラップリアクターから容易に除去され、目的生成物のみを高純度で回収することができる。以下に、酵素、基質、それと特異的に結合する分子の例を以下に示す。
上記に示したように、担体に結合させる酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生する酵素であるバシロライシンＭＡである場合、このような分子としてはリシン（Ｌｙｓ）を好ましく用いることができる。この場合、リシンは、基質であるプラスミノーゲン、及び目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンとは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターに使用しうる担体としては、アフィニティークロマトグラフィーにおいて通常使用されている担体であれば、固定化する酵素や、基質と特異的に結合する分子の種類、性質に応じて、当業者であれば適宜選択、使用することができる。このような担体としては、例えば、多孔性シリカビーズ担体；セレックス、セレックスＡＥ、セレックスＣＭ、セレックスＰＡＢなどのセルロース系担体（いずれもセルバ社）；セファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂなどのアガロース系担体（いずれもファルマシア社）；セファデックス、ＣＭ−セファデックスなどの架橋デキストラン系担体（いずれもファルマシア社）；クロマゲルＰ、エンザフィックスＰ−ＨＺ、エンザフィックスＰ−ＳＨ、エンザフィクスＰ−ＡＢなどの架橋ポリアクリルアミド系担体（いずれも和光純薬工業）などを用いることができる。なかでも、安定性、機械的性質に優れ、リガンドの固定可能化量が高く、非特定的吸着性が低いなどの理由から、ビーズ状の担体であるセファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂなどのアガロース系担体を好ましく使用することができる。アガロースゲルを用いる場合は、ハロゲン化シアン（臭化シアン、ヨウ化シアン、塩化シアンなど）によってあらかじめ活性化しておくのが好ましい。
また、上記の酵素は、担体と直接結合していてもよいが、必要に応じて、スペーサー基を介して結合していてもよい。例えば、担体と酵素とを直接の化学結合でカップリングさせることができない場合、酵素が比較的小さい分子であって酵素と基質との結合を完全に行なわせるのが困難である場合などに、スペーサー基を用いることができる。このようなスペーサー基は、当業者が、結合させる酵素の種類に応じて適宜選択することができる。一方、バシロライシンＭＡを担体に結合させる場合には、スペーサーは特に使用しなくても、これを担体に容易に結合させることができる。
以下に、本発明のアフィニティートラップリアクターに好適に使用しうる担体、酵素、その基質、基質と特異的に結合しうる分子、及び用いうるスペーサー基の例を挙げるが、本発明のアフィニティートラップリアクターは、これらに限定されるものではない。
本発明のアフィニティートラップリアクターの作成
本発明のアフィニティートラップリアクターは、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させたものであるので、生化学の分野で使用されるアフィニティークロマトグラフィーを製造する方法を応用することにより、当業者であれば容易に作成をすることができる。
作成に際しては、まず使用する担体に酵素を結合させる。結合に際しては、必要に応じて、担体の官能基を活性化することにより、担体と酵素との結合を容易にする。例えば担体としてアガロースゲルを用いる場合には、あらかじめハロゲン化シアン（臭化シアン、ヨウ化シアン、塩化シアンなど）で処理することによりアガロースゲルを活性化する。活性化されたアガロースゲルも市販されているので、これを用いることもできる。
必要に応じて活性化した担体を緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液に溶解した酵素溶液で担体を処理して、担体に酵素を結合させる。緩衝液に含まれる酵素の濃度は、固定する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。またここで使用する緩衝液の組成、ｐＨ、反応時間なども、固定する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。例えばバシロライシンＭＡを担体に固定する場合、バシロライシンＭＡ約０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２．８４ｍｇ／ｍｌを含む、ｐＨ８〜９の緩衝液（組成：０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３、更に約０．５Ｍ ＮａＣｌ、約５％イソプロピルアルコールを含む）を用い、約２時間反応させる。
次に酵素溶液を吸引などの手段により除去し、酵素の基質と特異的に結合する分子を含む水溶液で処理することにより、酵素の基質と特異的に結合する分子を担体に結合させる。この水溶液に含まれる、酵素の基質と特異的に結合する分子の濃度や反応時間は、分子の種類によって適宜決定することができる。このような分子としてリシンを用いる場合、リシン塩酸塩約０．１〜１Ｍ、好ましくは約０．２Ｍを含む約５％イソプロピルアルコール水溶液を使用して、約２時間反応させる。上記の反応はいずれも室温で行なうことができる。
次に、酵素の基質と特異的に結合する分子の水溶液を吸引などの手段により除去し、酵素及び酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体を緩衝液で洗浄することによって、本発明のアフィニティートラップリアクターが得られる。緩衝液の種類は、固定する酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターの場合、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ｂ）などの緩衝液で洗浄することができる。
上記のバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターを作成する各工程で用いる緩衝液又は水溶液に含まれるイソプロピルアルコール濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％である。イソプロピルアルコールの存在下で上記の各工程を行なうことにより、担体に固定した酵素の失活を防ぎ、酵素を安定に長期間保持することができる。
なお、上述した、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させる順序については、いずれを先に結合させることも可能である。
このようにして得た本発明のアフィニティートラップリアクターは、約０．０１〜０．１％、好ましくは約０．０２％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中、約０〜５℃程度の低温、好ましくは約４℃で保存する。緩衝液の種類は、適宜選択することができる。バシロライシンＭＡ及びリシンを結合させたリアクターの場合、約０．０２％アジ化ナトリウムを含有する、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）などの緩衝液中で保存することができる。このようにアジ化ナトリウム溶液中、低温で保存することにより、本発明のアフィニティートラップリアクターは、酵素を失活させることなく、長期にわたって安定に保存することができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターは、上記のような構成とすることにより、固定する酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に制限されることなく、酵素と基質との反応を高効率で、かつ特異的に進行させることができる。
本発明のアフィニティートラップリアクターの使用
本発明のアフィニティートラップリアクターを用いて、所望の酵素と基質の反応を進行させるには、上記のように調製した本発明のアフィニティートラップリアクターをあらかじめ緩衝液で平衡化しておく。緩衝液の種類は、固定した酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができる。例えば酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約１〜１０％、好ましくは約５％のイソプロピルアルコールを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｃ）を用いることができる。
次にアフィニティートラップリアクターに固定されている酵素の基質を含む、生体試料などの試料（血液など）を遠心分離することにより上清を得る。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合には、遠心分離する前に、血漿などの生体試料にあらかじめイソプロピルアルコールを、氷上で添加しておく。添加後のイソプロピルアルコールの濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％である。遠心分離の条件は、試料の種類に応じて適宜決定することができる。得られた上清を、平衡化しておいた本発明のアフィニティートラップリアクターに添加することによって生体試料中の基質と酵素との反応を進行させ、その後アフィニティートラップリアクターを緩衝液で洗浄し、次いで溶出液を添加することにより酵素反応によって生じた生成物を溶出する。洗浄に用いる緩衝液としては、平衡化に用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約０．５ＭのＮａＣｌを含む上記の緩衝液Ｃで洗浄する。溶出液も、酵素、基質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させたアフィニティートラップリアクターの場合、約２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む、約１〜１０％、好ましくは約５％のイソプロピルアルコール水溶液を溶出液として用いる。
酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させたアフィニティートラップリアクターの場合、上記の一連の反応はすべて、約０〜５０℃程度の温度、好ましくは約４〜２５℃の温度で行なう。このような温度で反応を進行させることによって、アフィニティートラップリアクターに固定されたバシロライシンＭＡは自己消化せずに安定に保持される一方、プラスミノーゲンに対するバシロライシンＭＡの作用は、必要最低限確保されるため、酵素反応は円滑かつ特異的に進行する。またこの一連の反応で使用する各種緩衝液には、カルシウムイオンを含有させず、カルシウムイオンの存在しない条件で各反応を進行させる。
使用後の本発明のアフィニティートラップリアクターは、緩衝液で洗浄し、アジ化ナトリウムを含む緩衝液中で保存する。緩衝液の種類は適宜選択することができるが、アフィニティートラップリアクターを平衡化するのに用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子としてリシンを結合させた本発明のアフィニティートラップリアクターの場合、約１ＭのＮａＣｌ、約２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含有する緩衝液Ｃで洗浄し、約０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液Ｃ中で保存する。このような条件で洗浄、保存することにより、本発明のアフィニティートラップリアクターは、数ヶ月に渡り、繰り返し使用することができる。
以上、本発明のアフィニティートラップリアクターの作成法及び使用法について記載したが、本発明は、このアフィニティートラップリアクターを用いた、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法にも関する。本方法は、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、約０〜５０℃、好ましくは約４〜２５℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得ることによる。リシンは、基質であるプラスミノーゲンと、目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンの両者とは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物はリシンを介して担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。このような特定の条件で本発明のアフィニティートラップリアクターを用いて酵素反応を進行させることにより、プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で高純度で得ることができる。
本発明の方法は、先に詳細に記載した本発明のアフィニティートラップリアクターを用い、先に記載した本発明のアフィニティートラップリアクターの使用法により実施することができる。プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得るための具体的かつ詳細な条件は、以下の実施例に記載したとおりであるので、実施例の記載に基づいて実施することができる。
【実施例】
以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。
例１．バシロライシンＭＡの生産及び精製
バシロライシンＭＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８２６８で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている）から、以下の方法により分離精製した。
グルコース１％、コーンスターチ３％、大豆ミール１％、ペプトン０．５％、イースト抽出物０．５％、ＣａＣＯ３０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％の成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株を２８℃で６日間振とう培養後、培養液３リットルをセライトを用いてろ過し、そのろ液１リットルをＨ２Ｏで５リットルに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。その後、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化した４００ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、生化学工業株式会社）カラムに流速１５ｍｌ／分で注入した。同じ緩衝液６００ｍｌで洗浄した後、２０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍｌずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、精製物９０ｍｇを得た。
例２．バシロライシンＭＡ及びリシンを固定した本発明のアフィニティートラップリアクターの作成（リアクター１０ｍｌを作成）
臭化シアンであらかじめ活性化しておいたアガロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシア社）２．８６ｇを１ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁し、室温で１５分間撹拌した。これをカラムに移し、吸引してＨＣｌ溶液を除去し、１ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍｌで３回、次に０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ａ（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３）７５ｍｌで１回ゲルを洗浄した。２．８４ｍｇ／ｍｌのバシロライシンＭＡ溶液を同じ緩衝液Ａで作成し、その１７．６ｍｌをカラムに添加し、室温で２時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、吸引により溶液を除去し、０．２Ｍ Ｌ−リシン塩酸塩を含む５％イソプロピルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて、室温で２時間撹拌することによりリシンの固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を吸引により除去し、５％イソプロピルアルコールを含む、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ）５００ｍｌでゲルを洗浄し、最後に０．０２％アジ化ナトリウムを含む、上記組成の緩衝液Ｂ中、４℃で保存した。
例３．バシロライシンＭＡ／リシンリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
クエン酸処理したヒト血漿９５ｍｌにイソプロピルアルコール５ｍｌを氷上で添加し、３０分間放置した後、遠心分離（２２，０００ｘｇ、４℃、１時間）により上清を得、ろ過した。以降の操作はすべて４℃で行なった。例２で作成した本発明のバシロライシンＭＡ／リシンリアクター１０ｍｌを、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ｃ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。平衡化したリアクターに、上記の上清を流速１．５ｍｌ／分で添加した。その後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む上記組成の緩衝液Ｃ２００ｍｌでリアクターを洗浄した（３ｍｌ／分）。生成したＢＬ−アンジオスタチンの溶出は、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む５％イソプロピルアルコール溶液５０ｍｌで行なった。その結果、ほとんどのＢＬ−アンジオスタチンは、１０〜３０ｍｌの溶出液で溶出された。ＢＬ−アンジオスタチンの収量は、４．２ｍｇであり、純度は９５％であった。
なお、使用後のリアクターは、１ＭのＮａＣｌと２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む上記組成の緩衝液Ｃ５０ｍｌを用いて４℃で洗浄した。その後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ中、４℃で保存した。この状態で洗浄、保存したリアクターは、２ヶ月以上繰り返して使用可能であった。
得られたＢＬ−アンジオスタチンのうち３μｇを精製水に溶解して１０μｌとし、これにサンプル緩衝液１０μｌ（４％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール、２０％ショ糖、０．００４％ブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）を加え、そのうち１５μｌを７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。その結果を、図１のレーン２に示す。
図に示されるとおり、本発明のアフィニティートラップリアクターを用いてヒト血漿中プラスミノーゲンから得られたＢＬ−アンジオスタチンには、プラスミノーゲンや副生成物及びその他の血漿タンパク質はほとんど含まれておらず、高純度のアンジオスタチンが得られた。
比較例１．バシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンの分解反応
バシロライシンＭＡ（５ｎＭ）とプラスミノーゲン（３μＭ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ７．４）を、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、その１０μｌを、サンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール、２０％ショ糖、０．００４％ブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）１０μｌに加え、その１５μｌを、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。その結果を、図１のレーン１に示す。
図に示されるとおり、プラスミノーゲンをバシロライシンにより直接分解させた方法では、分解生成物に、ＢＬ−アンジオスタチン以外に、未反応のプラスミノーゲンや副生成物であるミニプラスミノーゲンが含まれており、アンジオスタチンを高純度で得ることはできなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明のアフィニティートラップリアクターを用いると、用いる酵素と基質の種類によってもその用途が制限されずに、担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく進行する。更にこのリアクターを、バシロライシンＭＡとリシンを固定したリアクターとすることにより、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なうことができる。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体からなる、アフィニティートラップリアクター。
【請求項２】
酵素が、プロテアーゼである、請求の範囲第１項記載のアフィニティートラップリアクター。
【請求項３】
酵素が、バシロライシンＭＡであり、酵素の基質と特異的に結合する分子がリシンである、請求の範囲第２項記載のアフィニティートラップリアクター。
【請求項４】
生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法であって、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、０〜５０℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得る方法。
【請求項１】
酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体からなる、アフィニティートラップリアクター。
【請求項２】
酵素が、プロテアーゼである、請求の範囲第１項記載のアフィニティートラップリアクター。
【請求項３】
酵素が、バシロライシンＭＡであり、酵素の基質と特異的に結合する分子がリシンである、請求の範囲第２項記載のアフィニティートラップリアクター。
【請求項４】
生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法であって、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及びリシンを結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターに付して、０〜５０℃の温度で、イソプロピルアルコールの存在下、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得る方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５５９５
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６７１０１（Ｐ２００４−５６７１０１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０００３３８
【国際出願日】平成１５年１月１７日（２００３．１．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．刊行物：２００２年８月２５日、生化学、第７４巻、第８号 ２．学会発表：２００２年１０月１７日、日本生化学会、第７５回大会、京都府京都市左京区宝ヶ池 国立京都国際会館 ３．刊行物：２００２年１２月１日、三島海雲記念財団 研究報告書 平成１３年度（第３９号）
【出願人】（５０１１８４２４９）株式会社ティーティーシー (10)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０００３３８
【国際出願日】平成１５年１月１７日（２００３．１．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．刊行物：２００２年８月２５日、生化学、第７４巻、第８号 ２．学会発表：２００２年１０月１７日、日本生化学会、第７５回大会、京都府京都市左京区宝ヶ池 国立京都国際会館 ３．刊行物：２００２年１２月１日、三島海雲記念財団 研究報告書 平成１３年度（第３９号）
【出願人】（５０１１８４２４９）株式会社ティーティーシー (10)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]