アプタマー生成装置、アプタマー生成方法
【課題】より多くのターゲットに対応したアプタマーを短時間で容易に創成することができるようにする。
【解決手段】処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置１において、淘汰の目標回数を、分注機４に把持されるチップ３２による洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブ３４が個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップ３２をチップホルダ８に予め装填しておく。更に分注機４が、チップホルダ８におけるチップ３２の有無の状態を許容しながら、これらのチップ３２を把持できるように構成した。
【解決手段】処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置１において、淘汰の目標回数を、分注機４に把持されるチップ３２による洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブ３４が個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップ３２をチップホルダ８に予め装填しておく。更に分注機４が、チップホルダ８におけるチップ３２の有無の状態を許容しながら、これらのチップ３２を把持できるように構成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖ＤＮＡのライブラリからＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法による淘汰（洗浄）と、ＰＣＲ(Polymerase chain reaction)法による増幅を繰り返してターゲットと結合するＤＮＡアプタマー(aptamer)を取得する生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アプタマー生成方法においては、固定化用の磁気ビーズを用いて、磁気ビーズを好むＤＮＡを予め排除する前処理洗浄を行った後に、後処理洗浄をＳＥＬＥＸ法により、複数の淘汰（洗浄）を行ない、淘汰圧が高い条件下で生成したアプタマーを得るようにしている（以下「従来技術」という）。この淘汰に用いられるチップホルダＡは、図１５に示すように、横に８本、縦に１２本のチップＢが直立状態に装填されている。淘汰を行う場合には、チップホルダＡからチップ把持部Ｃにより一回分の淘汰に必要な横８本のチップＢを同時に取り上げて把持し、試薬槽に移動してチップＢによって洗浄液を吸引した後、８本のチューブＤの上方に移動して全チップＢから洗浄液を同時に注入する方法で行っている。例えば、淘汰を４回行う場合には、順次淘汰回数を重ねる毎に横８本のチップＢを同時に取り上げてチューブＤに注入していくことで行われるようにしている。なお、図１５において、黒丸はチップがチップホルダＡに装填されている状態を示し、白丸はチップＢが取り上げられて空になった状態を示す。
【０００３】
淘汰を行う他の技術として、例えば、特許文献１に記載の技術が知られている。この特許文献１に記載の技術は、アフィニティーカラム装置（磁気ビーズに対応する）、ＰＣＲサーマルサイクラー装置、アプタマー分離精製装置、および各装置を順次に連結して各装置からの回収物を次工程に送る移動装置を有し、オリゴヌクレオチド混合物からアフィニティーカラム装置を介して特定したアプタマー候補分子をＰＣＲサーマルサイクラー装置中で増幅し、このＰＣＲ生成物からアプタマー分離精製装置によって目的のアプタマーを選別し、回収する構成を有する。これにより、オリゴヌクレオチドの混合物をアフィニティー選別し、得られた目的アプタマーをＰＣＲ装置にて増幅した後、分離精製機に通して精製する一連の工程を繰り返すことにより、高純度のアプタマーが得られるようにしている。
【特許文献１】特開２００１−６１４７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の従来技術にあっては、４回の淘汰（洗浄）を行うチューブが仮に１本必要である場合に、他の７本のチューブＤは無駄となり、その結果、チップＢを不必要に消費する。また、通常は淘汰回数と必要本数とが異なるアプタマーを生成する場合には、チップの不必要となる消費が増大するだけでなく、チップ把持部ＣによるチップＢの取り上げ工程もそれに応じて増加し、ひいてはアプタマー生成に要する作業時間が厖大になるという問題がある。
【０００５】
例えば、４回の淘汰を行ったチューブと、５回の淘汰を行ったチューブと、６回の淘汰を行ったチューブを用意するためには、全体として３回のアプタマー生成工程を必要とし、淘汰作業だけでも合計１５回も必要となるという問題がある。
【０００６】
また、上記の特許文献１に記載の技術は、高速液体クロマトグラフ等の分離精製装置を設けることで、サーマルサイクラーで増幅されたアプタマー候補分子を含む混合液を精製するようにしているため、装置全体が複雑で、大がかりなものとなり、また、煩瑣な操作を要し、コストが嵩張るといった問題がある。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題に着目してなされたものであり、複雑で煩瑣な操作を要することがなく、莫大な労力を低減し、コスト安価でアプタマー生成の時間を大幅に低減可能なアプタマー生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）上記の目的を達成するために、本発明は、処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップをチップホルダに予め装填しておき、前記分注機が、前記チップホルダにおける前記チップの有無の状態を許容しながら、前記チップを把持する構成としたことを特徴とする。
【０００９】
これによれば、分注機はチップホルダに装填されたチップだけを引き上げて（取り上げて）把持するので、チップを把持した位置に対応するチューブにだけ洗浄液が注入され、それ以外のチップを把持しないチューブには洗浄液の注入が停止される。これにより、選択的な淘汰を実行できる。
【００１０】
（２）また、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が、前記チップホルダから必要な連数だけチップを引き上げて把持するようにしてもよい。
【００１１】
これによれば、各チューブが必要とする目標の淘汰回数に応じて、分注機がその都度、チップホルダからチップを取り出して把持し、試薬槽にて洗浄液を吸引後、個別に、あるいは同時的に各チューブへ洗浄液を注入することができる。
【００１２】
（３）また、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液を注入するようにすることもできる。
【００１３】
これによれば、電磁弁の開閉制御によりタンク内の洗浄液を、分注機を介してチューブへ直接的に注入することができる。また、供給手法としてチップを用いない場合は、上記のようなチップラックなどを不要にできる。
【００１４】
（４）また、処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成方法において、反応容器としての複数連のチューブに、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的に注入する選択注入工程を有するようにしてもよい。
【００１５】
これによれば、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的にチューブに注入するので、複雑で煩瑣な操作から解放され、生成時間の短縮を図ることができるようになる。
【００１６】
（５）また、前記選択注入工程は、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が前記チップホルダから必要な連数だけ前記チップを引き上げて把持するように構成してもよい。
【００１７】
（６）また、前記選択注入工程は、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液が注入されるようにすることもできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、チューブラックに保持された反応容器としての複数連のチューブが必要とする淘汰の目標回数に応じて、分注機から洗浄液を選択的に注入する。このため、淘汰圧（条件）を臨機応変に変化させることができ、淘汰圧にばらつきある淘汰作業であっても、より短時間で作業を達成でき、この結果、より多くのターゲットに対応したアプタマーを短時間で容易に創成することができる効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図を参照して詳述する。図１は実施形態のアプタマー生成方法に適用されるアプタマー生成装置１の外観斜視図、図２は該アプタマー生成装置１の内部における平面図、図３は該アプタマー生成装置１のブロック図である。アプタマー生成装置１は、その前面上部にタッチパネル２が設けられ、後述するシーケンサ２３を中心とする電子回路が組み込まれ、タッチパネル２から入力される制御信号がシーケンサ２３やコンピュータ２４へ出力するようになっている。アプタマー生成装置１はウィンドゥが嵌め込まれ、外部雰囲気から内部を遮断していて、外部天井面に設けたクリーンユニット３により内部環境を清浄な状態に維持する。また、アプタマー生成装置１内部の天井部には、分注手段の一部である分注機４、およびアプタマーや洗浄液の入ったチューブを把持するロボットハンド５が移動可能に懸垂される。分注機４には、後述するチップホルダ８の孔部に立てて差し込まれたチップ３２を抜き取って保持する図示されないチップ把持部が設けられる。ロボットハンド５は一対のハンド部でなり、これらハンド部の間隔を狭めることで後述するチューブラック３３などの両側縁を把持し、間隔を広げることで把持したチューブラック３３などを離したりする。なお、チップラック３３には、チップの有無を検出する図示されないチップ検出センサが設けられている。
【００２０】
アプタマー生成装置１内部の作業台７には、淘汰圧を可変にしてアプタマーを自動的に創成するに必要となる機構要素として、チップを縦横にマトリックス状に立てて配列保持するチップラック（チップホルダ）８、ＤＮＡを洗浄する反応容器としてのチューブ（反応チューブ）９、該チューブ９を振動して攪拌するミキサユニット１０，磁気手段を昇降させる磁気昇降ステージ１１，チューブ９に被せたチューブ蓋を取り外す蓋取ステージ１２，取り外した該チューブ蓋を置くためのチューブ蓋ラック置場１３，ＰＣＲ産物を４℃の温度条件下で保管するＰＣＲ産物保管槽１４，ＰＣＲ試薬を４℃の条件下で調整する調整ステージ１５、試薬槽１６，自動開閉扉付きのアンモニア槽１７、チップ廃棄口１８，廃液槽１９，自動開閉扉と温度調節付きのＰＣＲ本体２０、試薬槽置場２１，および試薬槽２２が設けられている。上記分注機４やロボットハンド５は、図２に示す天井部に設けた案内レール６に沿ってコンピュータによるシーケンス制御にしたがって３次元空間を自由に移動制御される。従って、このアプタマー生成装置１は、分注機４やロボットハンド５が、アプタマー生成処理プログラムにより、上記所定のステージや種々の機構要素へ移動して動作し、後述する所用の前処理洗浄や後処理洗浄が実行できるようになっている。なお、アプタマー生成装置１の内部には蛍光灯、および殺菌灯なども配備されている。
【００２１】
アプタマー生成装置１の自動制御システムは、図３に示すブロック図で構成され、シーケンサ２３を中心として上記アプタマー生成装置１における適宜の機構要素を制御する。シーケンサ２３には、入力インターフェース、出力インターフェース、プログラム、データ格納部が設けられる。入力インターフェースには、上記タッチパネル２と演算部としてのコンピュータ２４とが接続される。タッチパネル２は種々のスイッチやキーが設けられ、これらを操作することで種々の制御条件を入力したり、プログラムを変更したりできるようになっている。また、パネル２からはコンピュータ２４へも制御条件が入力できるようになっていて、これによりシーケンサ２３内部のデータ格納部のデータやプログラムを書き換え変更して設定できる。タッチパネル２から入力される制御条件に応じてプログラムが実行され、演算処理された結果が出力インターフェースから出力され、アプタマー生成処理の手順が実行される。
【００２２】
また、入力インターフェースには、分注機７の図示されないチップ把持部に設置したチップセンサからの検出信号が入力される。これにより、チップセンサがチップホルダ８にチップが保持されているか、保持されない空状態であるかを検出し、チップの存在が検出されたチップは、分注機４のチップ把持部により把持されてチップホルダ８から取り出されるようになっている。
【００２３】
なお、仮に検出結果と、予め設定された淘汰条件に不一致がある場合には、その場で動作を停止し、エラーを表示するようにすることも可能である。
【００２４】
一方、出力インターフェースには、８連タイプの分注機７、ロボットハンド５，ＰＣＲ２０、磁気昇降ユニット２５、蓋取りユニット２６，冷却試薬槽１６，２５％アンモニア槽１７、およびＰＣＲ産物保管槽１４などが接続される。これにより、出力インターフェースから出力された制御信号により、これら制御対象が制御され、所定のアプタマー生成処理が行われる。
【００２５】
図４は、淘汰圧を可変する方法を説明する図である。分注手段の一構成要素であるチップホルダ８は、１２行８列のマトリックス状に配列されたチップ３２を保持する孔部を有し、横一列に８個の孔部（以下、「８連の孔部」ともいう）が、また、縦方向に１２列の孔部が並べられ、合計で９６個の孔部が設けられている。黒丸で示した部分はチップ３２を示し、白丸の部分はチップ３２が存在しない空の孔部を示す。
【００２６】
チップホルダ８の各行ごとにおける８連の孔部には、淘汰の目標回数に応じてスポイト状のチップ３２が、空孔を含むような状態でセットされる。具体的に図４には、後述するチューブラック３３に保持される８連のチューブ３４の洗浄回数（淘汰回数）を左側から順に４，３，２，１，４，３，２，１回に設定する場合を示す。、図４（ａ）は、チップホルダ８の一ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う１回目の淘汰工程、同（ｂ）は二ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う２回目の淘汰工程、同（ｃ）は三ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う３回目の淘汰工程、同（ｄ）は四ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う４回目の淘汰工程である。なお、淘汰における洗浄水の注入工程は上記のシーケンサ２３により処理が実行されていく。淘汰圧（淘汰回数）可変の注入工程を可能にするために、チップラック８には、その最も左側の縦の列から右側の縦の列の順に、４本、３本、２本、１本、４本、３本、２本、１本のチップ３２が先頭ライン位置から順番にセットされるようになっている。なお、淘汰回数（洗浄回数）は、装置が稼働する前にタッチパネル２で任意に入力して設定しておくことで、設定条件とチップ３２の配置状態が一致しているか否かを検出できる。
【００２７】
こうして、淘汰１回目では、第１行の孔部の全部に保持されたチップ３２が分注機４のチップ把持部により把持されてチップホルダ８から取り出される。取り出されたチップ３２は、分注機４によりチューブラック３３の真上の位置まで移動し、次いで下降移動してチップ３２の先端部がチューブ３４に進入し、エア圧を作用させてチップ３２内の洗浄水をチューブ３４に注入するようになっている（注入工程）。図４において、洗浄水が注入されたチューブは、黒色で表示した。なお、洗浄水は食塩水などが好ましいが、これ以外のものであってもよい。また、食塩水濃度は適宜に変えてもよく、これにより種類を２種類以上に分けて使用することも可能である。
【００２８】
淘汰２回目も、上記と同様にして第２行の孔部に立てて保持されているチップ３２だけが分注機で持ち上げられて搬送され、図４（ｂ）のように対応するチューブ３４に洗浄水が注入される。同（ｃ）では第３行の、（ｄ）では第４行のチップ３２がそれぞれ取り上げられ、注入工程を経て最終的に同（ｅ）に示すように、それぞれ淘汰の目標回数に到達した８本のチューブ３４が得られる。こうして、チップホルダ４に立てて保持されるチップ３２のうち、第１行の孔部には、淘汰１回目の洗浄を行うチューブ３４に対応させてチップ３２が配置され、第２行には、淘汰２回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置される。すなわち、淘汰２回目の洗浄を行わない孔部にはチップ３２はセットしない。第３行には淘汰３回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置され、第４行には淘汰４回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置される。換言すると、チップホルダ８上のチップ３２の配列を各列についてみると、各チューブ３４の淘汰回数に応じた本数のチップ３２を予め先頭行からセットしていくことで、同一の淘汰工程内で、チップ３２の供給回数をチューブ３４毎に個別に変化させながら、淘汰が実行されていくこととなる。
【００２９】
こうして、チップ３２の存在しないチューブ３４には、洗浄液の注入が停止され、チップが存在する位置のチューブ３４にだけ淘汰が実施される。これにより、分注機４が、８連の全てのチップ３２に注入用エアを同時に吹き込ませる構造であっても、チップ３２の有無によって、各チューブ３４に洗浄液が独立して注入することができ、淘汰圧を可変にしてアプタマーを生成できるようになっている。
【００３０】
図５では、後処理洗浄に使用される８本のチューブ３４と、これらチューブを保持するチューブラック３３と、各チューブ３４の蓋をするチューブ蓋３５と、これらチューブ蓋を保持するチューブ蓋ラック３６とが示されている。チューブラック３３に配置される８連のチューブ３４の間隔およびチューブ蓋ラック３６に配置される８個のチューブ蓋３５の間隔は、上記のチップホルダ８に形成した孔部の間隔とほぼ同じになるように設定される。図５（ｂ）のように、チューブ蓋ラック３６をチューブラック３３に重ねることで、チューブ３４がチューブ蓋３５により蓋をされ、外部から不純物が混入したり、内部の液が飛び出したりしないようになっている。なお、３７，３８は位置決めピンであり、重ねたときに位置決めピン３８がチューブラック３３に形成した孔に係合することで、２つのラック３３，３６が位置ズレしないようになっている。これらのラック３３、３６は、ロボットハンド５で把持され、例えば、図２，図６に示すように、磁気昇降ステージ１１の近傍に設けた一対の支持台３８に搬送され、図７に示す状態でセットされる。なお、チューブラック３３の位置決めピン３７は、支持台３８に設けた位置決め孔３９に係合し、チューブラック３３およびチューブ蓋ラック３６が支持台３８に位置決めされる。
【００３１】
上記の磁気昇降ステージ１１は、図示されない昇降機構により作業台７に対して上下に移動可能に形成されるとともに、磁石４０を有する孔４１がチューブ３４の保持間隔と同じ間隔で設けられる。また、作業台７には、磁気昇降ステージ１１を跨ぐ位置まで進行し、進行位置から後退する作用部材４２が設けられる。作用部材４２には、チューブラック３３が上方へ浮き上がらないように押えつける第１押え部４３と、第２押え部４４が設けられる。第１押え部４３はチューブ蓋３５を取り外す場合に使用され、第２押え部４４はチューブ蓋３５を取り外した後のチューブラック３３を真上から押える場合に使用されるように形成される。第２押え部４４は、図６（ｂ）に示すように、長孔部４５の下方に伸びるスカート部で形成され、チューブラック３３に着座したときに、チューブラック３３から首を出すチューブ３４に干渉することがなく、かつ、長孔部４５の存在によりチップ把持部に保持されたチップ３２の下降が許容されるようになっている。また、第１、第２両押え部４３，４４および長孔部４５には、チューブ３４に干渉しない円弧状の逃げ用凹部４６，４７が形成される。
【００３２】
したがって、図７の状態にあるチューブ蓋ラック３６を引き上げる場合には、作用部材４２の第１押え部４３をチューブラック３３とチューブ蓋ラック３６との間に側部から進入させてチューブラック３３を押える。この状態において、ロボットハンド５でチューブ蓋ラック３６を両側から挟持し、上方に引き上げることでチューブ蓋３５が図５（ａ）のように取り外すことができる。この蓋取り外し処理は、磁気昇降ステージ１１の支持台３８で行ったが、磁気昇降ステージ近傍の作業台７に別の支持台を設け、この支持台でチューブ蓋を取り外すようにすることも勿論可能である。
【００３３】
淘汰を行う場合には、その事前準備として作用部材４２は磁気昇降ステージ１１を跨ぐ位置まで移動させる。作用部材４２を下降させ、第２押え部４４でチューブラック３３を上から押しつけ、この状態で淘汰が行われる。支持ステージ１１近傍の上記別の支持台でチューブ蓋を取り外す形態の場合には、一旦、ロボットハンド５でチューブラック３３を両側から把持し、それを磁気昇降ステージ１１の支持台３８へ移動させてから第２押え部４４で押えるようにするとよい。
【００３４】
かかる押しつけ状態や上記のチューブ蓋３５の取り外しは、磁気昇降ステージ１１の支持台３８で行ったが、磁気昇降ステージ１１に隣接した作業台７に別の支持台を設け、ここで行う前処理洗浄の処理でも行われるようにしてもよい。
【００３５】
上記の磁気昇降ステージ１１は、該ステージが上昇することでチューブ３４が孔４１に包み込まれる。これにより、孔４１に取付けた磁石４０の磁場がチューブ外部から印加され、磁性を有する磁気ビーズが磁石４０に引き寄せられる。かかる機能を利用して淘汰を効率的に実行できるように構成している。磁気ビーズの吸着が終わると磁気昇降ステージ１１は、下降して作業台７の面とほぼ同じ高さの状態に復帰する。上記した種々の動作（手順）はシーケンサ２３により実行される。
【００３６】
次に、アプタマー生成方法の処理手順を図２，図８〜図１３を参照して説明する。図８は、ＳＥＬＥＸ法でタンパク結合ＤＮＡ（アプタマー）が回収されるサイクルを示し、図９〜図１３はアプタマー生成のプロトコル図である。なお、図９〜図１３中における□枠内の数字は生成過程のステップを示すものとする。ステップ１からステップ５までは前処理洗浄工程であり、ステップ６以降のステップは後処理洗浄工程を示す。また、本実施形態における各処理工程における処理時間、分注容量、処理温度などの各条件の一例については、各図に記載した通りである。
【００３７】
図９はライブラリ混合、ビーズ非特異排除工程を示し、スタート時において、事前に色々な配列構造を有する一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と、磁気ビーズを好むＤＮＡを固定するための磁気ビーズを用意する。ｓｓＤＮＡをチューブ内でＰＣＲ装置２０により増幅し（ステップ０−１〜ステップ０−３）、ステップ１でこれに固定化用の磁気ビーズを分注した後、ミキサユニット１０によりチューブを加振して内部を攪拌し（ステップ２）て磁気ビーズを好むＤＮＡを磁気ビーズを磁石４０に固定する。ステップ３において、磁気昇降ステージ１１の磁石４０（図７参照）を用いて、磁気ビーズを好むＤＮＡと共にを磁気ビーズをチューブ３４の内壁に固定した状態で、ステップ４において、チューブ３４から溶液だけを吸引し、その溶液を別の容器（チューブ）に分注してＰＣＲ装置２０で増幅させることで前処理洗浄（プレ洗浄）が行われる。これにより、非特異吸着による洗浄（すすぎ）が終わる（ステップ５）。これは図８のＳ１に相当する。
【００３８】
後処理洗浄工程の最初のステップとなるステップ６において、癌細胞等のターゲット（タンパク）付きの固定化磁気ビーズを分注し（図８のＳ２に相当）、ＰＣＲ装置により増幅させた後、ミキサーにて攪拌し（ステップ７）、磁気昇降ステージ１１で磁気ビーズをチューブ３４の内壁に固定した状態で（ステップ８）、内部の溶液を吸引して（ステップ８）、それを廃液槽１９へ廃棄する（ステップ１０）。これにより、淘汰一回目の洗浄が終わり（図８のＳ３に相当）、磁気ビーズ側に、目的のタンパク結合ＤＮＡを残留させることができる。
【００３９】
図１０はターゲット（タンパク）と混合、淘汰、ＰＣＲ工程を示し、同図において、上記で得られたタンパク結合ＤＮＡにBinding bufferＡ（生理食塩水等）を分注してから（ステップ１１）、攪拌し（ステップ１２）、磁気昇降ステージ１１にて磁気ビーズを吸着させ（ステップ１３）、内部の溶液を廃液する（ステップ１４〜１５）。こうして、淘汰２回目の洗浄によるタンパク結合ＤＮＡを回収できることとなる（ステップ１５）。
【００４０】
以下同様にして、例えば、淘汰８回目の洗浄を実施する場合には、再びステップ１１に戻って行う。ステップ１２〜１５は淘汰圧が可変であるので、これらステップを繰り返して実行することで淘汰８回目の洗浄によるタンパク結合ＤＮＡを得ることができる。本実施形態ではすすぎ回数（淘汰回数）を８回の場合で説明したが、勿論これに限定されるものでないことは言うまでもない。なお、この淘汰圧を可変にするのは、既に図４等で説明した手法による。
【００４１】
ステップ１６−１においてＰＣＲ試薬調整ステージ１５でＰＣＲ溶液を分注した後、攪拌し（ステップ１７−１）、ＰＣＲ工程で増幅させる（ステップ１８−１）。
【００４２】
図１１はＰＣＲ産物回収、保存、ビチオン固定工程を示し、同図においてステップ１９で攪拌してＰＣＲ産物を得て、磁気昇降ステージ１１にて磁気ビーズを吸着させてから（ステップ２０）、内部の溶液を吸引し（ステップ２１）、その溶液を別の容器に分注し（ステップ２２）、新規チップを投入して吸引し（ステップ２３）、できたＰＣＲ産物を保管槽１４に分注して回収保存する。ＰＣＲ産物に新規チップを投入してBinding BufferＢを分注し（ステップ２６）、攪拌（ステップ２７）、磁気ビーズ吸着（ステップ２８）、溶液の吸引（ステップ２９）を経て溶液を廃液する（ステップ３０）。こうして、ビチオンを固定できる。
【００４３】
図１２はビチオン固定、一本鎖ＤＮＡ（single strand ＤＮＡ）化工程を示し、ステップ３１で新規チップを投入し、Binding BufferＣを分注し、攪拌（ステップ３２）、磁気ビーズ吸着（ステップ３３）、溶液吸引（ステップ３４）、溶液廃液（ステップ３５）を経た後、ステップ３６で新規チップを投入してBinding BufferＣを分注する。その後、蓋取ステージ１２にて攪拌し（ステップ３７）、磁気昇降ステージ１１にてビーズの吸着（ステップ３８）、溶液の吸引（ステップ３９）を経て溶液を廃液する（ステップ４０）。ＤＮＡの一本鎖化が可能となる。
【００４４】
図１３はｓｓＤＮＡ化、ライブラリ再調整工程を示し、蓋取ステージ１２で新規チップを投入してからアンモニアを分注し（ステップ４１）、攪拌処理を経て（ステップ４２）、ステップ４３で磁気ビーズを吸着させ、内部溶液を吸引して（ステップ４４）、それを別の容器に分注して増幅し（ステップ４５）、乾燥させる（ステップ４６）。これにBinding BufferＡを分注してＰＣＲ装置２０で増幅させ（ステップ４７）、攪拌し（ステップ４８）てからステップ６に復帰し、ライブラリ再調整工程に戻される。このように一本鎖化したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡライブラリに戻すことができる。
【００４５】
本実施形態によれば、８連分注機におけるチップ有無を変えることにより、淘汰圧（条件）を変えることができる。チップホルダに装填されるチップを淘汰回数に見合うように有無を調整して装填することで、淘汰圧にばらつきある淘汰を複雑で煩雑な操作を要することなくシーケンス制御により短時間で自動化して実施できる。また、より多くのターゲットに対応したアプタマーを容易に創成することができる利点もある。
【００４６】
以上、本発明を実施形態により詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものでなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等があっても本発明の範囲に含まれるものである。
【００４７】
例えば、チップの間違いを発見した場合には、エラー表示をタッチパネル２の表示画面に表示させ、あるいはアプタマー生成装置そのものの稼働を自動停止するようにしてもよい。
【００４８】
また、淘汰圧（条件）設定は、アプタマー生成装置が稼働する前に設定することで、洗浄回数を設定するようにしてもよく、また稼動中も設定できるようにすることが望ましい。
【００４９】
また、上記実施形態では、チップホルダ８に装填されるチップの有無で選択的に洗浄（淘汰）を行うようにしたが、タッチパネルの操作部に、例えば８本のチューブに対応する８個の淘汰回数設定部を設けておき、他方、チップ把持部には、８本のチップに対応して個別に作動するアームを備えるようにする。各チューブの淘汰設定回数を個別に上記設定部に入力して設定し、スタートスイッチをＯＮすることで、チップ把持部が淘汰設定回数だけチップホルダに伸びてチップを引き上げて、淘汰が必要なアームだけが個々にチップを把持して、チューブに注入するようにしてもよい。
【００５０】
また、図１４に示すように、８連型の分注機４における各ピペット５０（チップを用いることも可能）を、洗浄液を貯留するタンク５１に対して供給管５２を介して接続するようにしても良い。各ピペット５０に通じる供給管の途中に電磁弁５２を配備し、これを淘汰に応じてシーケンサ２３により開閉制御し、電磁弁５２が開作動したときに洗浄液をピペット５０に圧送する構成も可能である。これにより、チップホルダ８を有しない形態のアプタマー生成装置を得ることができ、チューブ毎に淘汰回数を可変にすることができる。
【００５１】
更に上記実施形態では、ＤＮＡによるアプタマーを生成する場合に限って例示したが、本発明はそれに限定されず、ＲＮＡやペプチドのアプタマーを生成する場合にも用いることが可能である。
【００５２】
また、上記では８連タイプのチューブの場合について説明したが、これに限定されないのは勿論である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、各種素材によるアプタマーを製造する装置に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施形態におけるアプタマー生成方法に適用されるアプタマー生成装置１の外観斜視図である。
【図２】該アプタマー生成装置の内部における平面図である。
【図３】該アプタマー生成装置１のブロック図である。
【図４】アプタマー生成過程のおける淘汰圧可変の方法を示す作用説明図である。
【図５】チューブラックとチップラックの相関関係を示す正面拡大図である。
【図６】磁気昇降ステージと作用部材との相関関係を示す外観斜視図である。
【図７】チューブラックと、チップラックと、作用部材と、磁気昇降ステージとの相関関係を示す外観斜視図である。
【図８】ＳＥＬＥＸサイクルにおける洗浄淘汰工程を説明する概念図である。
【図９】ライブラリ、磁気ビーズ非特異排除工程を説明するプロトコル図である。
【図１０】淘汰及びＰＣＲ工程を説明するプロトコル図である。
【図１１】ＰＣＲ産物回収、保存、ビチオン固定工程を説明するプロトコル図である。
【図１２】ビチオン固定、一本鎖ＤＮＡ化工程を説明するプロトコル図である。
【図１３】一本鎖ＤＮＡ化、ライブラリ再調整工程を説明するプロトコル図である。
【図１４】本実施形態の変形例における要部拡大図である。
【図１５】従来技術における説明図である。
【符号の説明】
【００５５】
１ アプタマー生成装置
２ タッチパネル
３ クリーンユニット
４ 分注機
５ ロボットハンド
６ 案内レール
７ 作業台
８ チップホルダ
１１ 磁気昇降ステージ
２０ ＰＣＲ本体
３２ チップ
３３ チューブラック
３４ チューブ
４０ 磁石
４２ 作用部材
４３ 第１押え部
４４ 第２押え部
５０ ピペット
５１ タンク
５３ 電磁弁
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖ＤＮＡのライブラリからＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法による淘汰（洗浄）と、ＰＣＲ(Polymerase chain reaction)法による増幅を繰り返してターゲットと結合するＤＮＡアプタマー(aptamer)を取得する生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アプタマー生成方法においては、固定化用の磁気ビーズを用いて、磁気ビーズを好むＤＮＡを予め排除する前処理洗浄を行った後に、後処理洗浄をＳＥＬＥＸ法により、複数の淘汰（洗浄）を行ない、淘汰圧が高い条件下で生成したアプタマーを得るようにしている（以下「従来技術」という）。この淘汰に用いられるチップホルダＡは、図１５に示すように、横に８本、縦に１２本のチップＢが直立状態に装填されている。淘汰を行う場合には、チップホルダＡからチップ把持部Ｃにより一回分の淘汰に必要な横８本のチップＢを同時に取り上げて把持し、試薬槽に移動してチップＢによって洗浄液を吸引した後、８本のチューブＤの上方に移動して全チップＢから洗浄液を同時に注入する方法で行っている。例えば、淘汰を４回行う場合には、順次淘汰回数を重ねる毎に横８本のチップＢを同時に取り上げてチューブＤに注入していくことで行われるようにしている。なお、図１５において、黒丸はチップがチップホルダＡに装填されている状態を示し、白丸はチップＢが取り上げられて空になった状態を示す。
【０００３】
淘汰を行う他の技術として、例えば、特許文献１に記載の技術が知られている。この特許文献１に記載の技術は、アフィニティーカラム装置（磁気ビーズに対応する）、ＰＣＲサーマルサイクラー装置、アプタマー分離精製装置、および各装置を順次に連結して各装置からの回収物を次工程に送る移動装置を有し、オリゴヌクレオチド混合物からアフィニティーカラム装置を介して特定したアプタマー候補分子をＰＣＲサーマルサイクラー装置中で増幅し、このＰＣＲ生成物からアプタマー分離精製装置によって目的のアプタマーを選別し、回収する構成を有する。これにより、オリゴヌクレオチドの混合物をアフィニティー選別し、得られた目的アプタマーをＰＣＲ装置にて増幅した後、分離精製機に通して精製する一連の工程を繰り返すことにより、高純度のアプタマーが得られるようにしている。
【特許文献１】特開２００１−６１４７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の従来技術にあっては、４回の淘汰（洗浄）を行うチューブが仮に１本必要である場合に、他の７本のチューブＤは無駄となり、その結果、チップＢを不必要に消費する。また、通常は淘汰回数と必要本数とが異なるアプタマーを生成する場合には、チップの不必要となる消費が増大するだけでなく、チップ把持部ＣによるチップＢの取り上げ工程もそれに応じて増加し、ひいてはアプタマー生成に要する作業時間が厖大になるという問題がある。
【０００５】
例えば、４回の淘汰を行ったチューブと、５回の淘汰を行ったチューブと、６回の淘汰を行ったチューブを用意するためには、全体として３回のアプタマー生成工程を必要とし、淘汰作業だけでも合計１５回も必要となるという問題がある。
【０００６】
また、上記の特許文献１に記載の技術は、高速液体クロマトグラフ等の分離精製装置を設けることで、サーマルサイクラーで増幅されたアプタマー候補分子を含む混合液を精製するようにしているため、装置全体が複雑で、大がかりなものとなり、また、煩瑣な操作を要し、コストが嵩張るといった問題がある。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題に着目してなされたものであり、複雑で煩瑣な操作を要することがなく、莫大な労力を低減し、コスト安価でアプタマー生成の時間を大幅に低減可能なアプタマー生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）上記の目的を達成するために、本発明は、処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップをチップホルダに予め装填しておき、前記分注機が、前記チップホルダにおける前記チップの有無の状態を許容しながら、前記チップを把持する構成としたことを特徴とする。
【０００９】
これによれば、分注機はチップホルダに装填されたチップだけを引き上げて（取り上げて）把持するので、チップを把持した位置に対応するチューブにだけ洗浄液が注入され、それ以外のチップを把持しないチューブには洗浄液の注入が停止される。これにより、選択的な淘汰を実行できる。
【００１０】
（２）また、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が、前記チップホルダから必要な連数だけチップを引き上げて把持するようにしてもよい。
【００１１】
これによれば、各チューブが必要とする目標の淘汰回数に応じて、分注機がその都度、チップホルダからチップを取り出して把持し、試薬槽にて洗浄液を吸引後、個別に、あるいは同時的に各チューブへ洗浄液を注入することができる。
【００１２】
（３）また、淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液を注入するようにすることもできる。
【００１３】
これによれば、電磁弁の開閉制御によりタンク内の洗浄液を、分注機を介してチューブへ直接的に注入することができる。また、供給手法としてチップを用いない場合は、上記のようなチップラックなどを不要にできる。
【００１４】
（４）また、処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成方法において、反応容器としての複数連のチューブに、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的に注入する選択注入工程を有するようにしてもよい。
【００１５】
これによれば、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的にチューブに注入するので、複雑で煩瑣な操作から解放され、生成時間の短縮を図ることができるようになる。
【００１６】
（５）また、前記選択注入工程は、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が前記チップホルダから必要な連数だけ前記チップを引き上げて把持するように構成してもよい。
【００１７】
（６）また、前記選択注入工程は、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液が注入されるようにすることもできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、チューブラックに保持された反応容器としての複数連のチューブが必要とする淘汰の目標回数に応じて、分注機から洗浄液を選択的に注入する。このため、淘汰圧（条件）を臨機応変に変化させることができ、淘汰圧にばらつきある淘汰作業であっても、より短時間で作業を達成でき、この結果、より多くのターゲットに対応したアプタマーを短時間で容易に創成することができる効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図を参照して詳述する。図１は実施形態のアプタマー生成方法に適用されるアプタマー生成装置１の外観斜視図、図２は該アプタマー生成装置１の内部における平面図、図３は該アプタマー生成装置１のブロック図である。アプタマー生成装置１は、その前面上部にタッチパネル２が設けられ、後述するシーケンサ２３を中心とする電子回路が組み込まれ、タッチパネル２から入力される制御信号がシーケンサ２３やコンピュータ２４へ出力するようになっている。アプタマー生成装置１はウィンドゥが嵌め込まれ、外部雰囲気から内部を遮断していて、外部天井面に設けたクリーンユニット３により内部環境を清浄な状態に維持する。また、アプタマー生成装置１内部の天井部には、分注手段の一部である分注機４、およびアプタマーや洗浄液の入ったチューブを把持するロボットハンド５が移動可能に懸垂される。分注機４には、後述するチップホルダ８の孔部に立てて差し込まれたチップ３２を抜き取って保持する図示されないチップ把持部が設けられる。ロボットハンド５は一対のハンド部でなり、これらハンド部の間隔を狭めることで後述するチューブラック３３などの両側縁を把持し、間隔を広げることで把持したチューブラック３３などを離したりする。なお、チップラック３３には、チップの有無を検出する図示されないチップ検出センサが設けられている。
【００２０】
アプタマー生成装置１内部の作業台７には、淘汰圧を可変にしてアプタマーを自動的に創成するに必要となる機構要素として、チップを縦横にマトリックス状に立てて配列保持するチップラック（チップホルダ）８、ＤＮＡを洗浄する反応容器としてのチューブ（反応チューブ）９、該チューブ９を振動して攪拌するミキサユニット１０，磁気手段を昇降させる磁気昇降ステージ１１，チューブ９に被せたチューブ蓋を取り外す蓋取ステージ１２，取り外した該チューブ蓋を置くためのチューブ蓋ラック置場１３，ＰＣＲ産物を４℃の温度条件下で保管するＰＣＲ産物保管槽１４，ＰＣＲ試薬を４℃の条件下で調整する調整ステージ１５、試薬槽１６，自動開閉扉付きのアンモニア槽１７、チップ廃棄口１８，廃液槽１９，自動開閉扉と温度調節付きのＰＣＲ本体２０、試薬槽置場２１，および試薬槽２２が設けられている。上記分注機４やロボットハンド５は、図２に示す天井部に設けた案内レール６に沿ってコンピュータによるシーケンス制御にしたがって３次元空間を自由に移動制御される。従って、このアプタマー生成装置１は、分注機４やロボットハンド５が、アプタマー生成処理プログラムにより、上記所定のステージや種々の機構要素へ移動して動作し、後述する所用の前処理洗浄や後処理洗浄が実行できるようになっている。なお、アプタマー生成装置１の内部には蛍光灯、および殺菌灯なども配備されている。
【００２１】
アプタマー生成装置１の自動制御システムは、図３に示すブロック図で構成され、シーケンサ２３を中心として上記アプタマー生成装置１における適宜の機構要素を制御する。シーケンサ２３には、入力インターフェース、出力インターフェース、プログラム、データ格納部が設けられる。入力インターフェースには、上記タッチパネル２と演算部としてのコンピュータ２４とが接続される。タッチパネル２は種々のスイッチやキーが設けられ、これらを操作することで種々の制御条件を入力したり、プログラムを変更したりできるようになっている。また、パネル２からはコンピュータ２４へも制御条件が入力できるようになっていて、これによりシーケンサ２３内部のデータ格納部のデータやプログラムを書き換え変更して設定できる。タッチパネル２から入力される制御条件に応じてプログラムが実行され、演算処理された結果が出力インターフェースから出力され、アプタマー生成処理の手順が実行される。
【００２２】
また、入力インターフェースには、分注機７の図示されないチップ把持部に設置したチップセンサからの検出信号が入力される。これにより、チップセンサがチップホルダ８にチップが保持されているか、保持されない空状態であるかを検出し、チップの存在が検出されたチップは、分注機４のチップ把持部により把持されてチップホルダ８から取り出されるようになっている。
【００２３】
なお、仮に検出結果と、予め設定された淘汰条件に不一致がある場合には、その場で動作を停止し、エラーを表示するようにすることも可能である。
【００２４】
一方、出力インターフェースには、８連タイプの分注機７、ロボットハンド５，ＰＣＲ２０、磁気昇降ユニット２５、蓋取りユニット２６，冷却試薬槽１６，２５％アンモニア槽１７、およびＰＣＲ産物保管槽１４などが接続される。これにより、出力インターフェースから出力された制御信号により、これら制御対象が制御され、所定のアプタマー生成処理が行われる。
【００２５】
図４は、淘汰圧を可変する方法を説明する図である。分注手段の一構成要素であるチップホルダ８は、１２行８列のマトリックス状に配列されたチップ３２を保持する孔部を有し、横一列に８個の孔部（以下、「８連の孔部」ともいう）が、また、縦方向に１２列の孔部が並べられ、合計で９６個の孔部が設けられている。黒丸で示した部分はチップ３２を示し、白丸の部分はチップ３２が存在しない空の孔部を示す。
【００２６】
チップホルダ８の各行ごとにおける８連の孔部には、淘汰の目標回数に応じてスポイト状のチップ３２が、空孔を含むような状態でセットされる。具体的に図４には、後述するチューブラック３３に保持される８連のチューブ３４の洗浄回数（淘汰回数）を左側から順に４，３，２，１，４，３，２，１回に設定する場合を示す。、図４（ａ）は、チップホルダ８の一ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う１回目の淘汰工程、同（ｂ）は二ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う２回目の淘汰工程、同（ｃ）は三ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う３回目の淘汰工程、同（ｄ）は四ライン目のチップ３２列を用いて淘汰を行う４回目の淘汰工程である。なお、淘汰における洗浄水の注入工程は上記のシーケンサ２３により処理が実行されていく。淘汰圧（淘汰回数）可変の注入工程を可能にするために、チップラック８には、その最も左側の縦の列から右側の縦の列の順に、４本、３本、２本、１本、４本、３本、２本、１本のチップ３２が先頭ライン位置から順番にセットされるようになっている。なお、淘汰回数（洗浄回数）は、装置が稼働する前にタッチパネル２で任意に入力して設定しておくことで、設定条件とチップ３２の配置状態が一致しているか否かを検出できる。
【００２７】
こうして、淘汰１回目では、第１行の孔部の全部に保持されたチップ３２が分注機４のチップ把持部により把持されてチップホルダ８から取り出される。取り出されたチップ３２は、分注機４によりチューブラック３３の真上の位置まで移動し、次いで下降移動してチップ３２の先端部がチューブ３４に進入し、エア圧を作用させてチップ３２内の洗浄水をチューブ３４に注入するようになっている（注入工程）。図４において、洗浄水が注入されたチューブは、黒色で表示した。なお、洗浄水は食塩水などが好ましいが、これ以外のものであってもよい。また、食塩水濃度は適宜に変えてもよく、これにより種類を２種類以上に分けて使用することも可能である。
【００２８】
淘汰２回目も、上記と同様にして第２行の孔部に立てて保持されているチップ３２だけが分注機で持ち上げられて搬送され、図４（ｂ）のように対応するチューブ３４に洗浄水が注入される。同（ｃ）では第３行の、（ｄ）では第４行のチップ３２がそれぞれ取り上げられ、注入工程を経て最終的に同（ｅ）に示すように、それぞれ淘汰の目標回数に到達した８本のチューブ３４が得られる。こうして、チップホルダ４に立てて保持されるチップ３２のうち、第１行の孔部には、淘汰１回目の洗浄を行うチューブ３４に対応させてチップ３２が配置され、第２行には、淘汰２回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置される。すなわち、淘汰２回目の洗浄を行わない孔部にはチップ３２はセットしない。第３行には淘汰３回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置され、第４行には淘汰４回目の洗浄を行うチューブ３４に対応する孔部にチップ３２が配置される。換言すると、チップホルダ８上のチップ３２の配列を各列についてみると、各チューブ３４の淘汰回数に応じた本数のチップ３２を予め先頭行からセットしていくことで、同一の淘汰工程内で、チップ３２の供給回数をチューブ３４毎に個別に変化させながら、淘汰が実行されていくこととなる。
【００２９】
こうして、チップ３２の存在しないチューブ３４には、洗浄液の注入が停止され、チップが存在する位置のチューブ３４にだけ淘汰が実施される。これにより、分注機４が、８連の全てのチップ３２に注入用エアを同時に吹き込ませる構造であっても、チップ３２の有無によって、各チューブ３４に洗浄液が独立して注入することができ、淘汰圧を可変にしてアプタマーを生成できるようになっている。
【００３０】
図５では、後処理洗浄に使用される８本のチューブ３４と、これらチューブを保持するチューブラック３３と、各チューブ３４の蓋をするチューブ蓋３５と、これらチューブ蓋を保持するチューブ蓋ラック３６とが示されている。チューブラック３３に配置される８連のチューブ３４の間隔およびチューブ蓋ラック３６に配置される８個のチューブ蓋３５の間隔は、上記のチップホルダ８に形成した孔部の間隔とほぼ同じになるように設定される。図５（ｂ）のように、チューブ蓋ラック３６をチューブラック３３に重ねることで、チューブ３４がチューブ蓋３５により蓋をされ、外部から不純物が混入したり、内部の液が飛び出したりしないようになっている。なお、３７，３８は位置決めピンであり、重ねたときに位置決めピン３８がチューブラック３３に形成した孔に係合することで、２つのラック３３，３６が位置ズレしないようになっている。これらのラック３３、３６は、ロボットハンド５で把持され、例えば、図２，図６に示すように、磁気昇降ステージ１１の近傍に設けた一対の支持台３８に搬送され、図７に示す状態でセットされる。なお、チューブラック３３の位置決めピン３７は、支持台３８に設けた位置決め孔３９に係合し、チューブラック３３およびチューブ蓋ラック３６が支持台３８に位置決めされる。
【００３１】
上記の磁気昇降ステージ１１は、図示されない昇降機構により作業台７に対して上下に移動可能に形成されるとともに、磁石４０を有する孔４１がチューブ３４の保持間隔と同じ間隔で設けられる。また、作業台７には、磁気昇降ステージ１１を跨ぐ位置まで進行し、進行位置から後退する作用部材４２が設けられる。作用部材４２には、チューブラック３３が上方へ浮き上がらないように押えつける第１押え部４３と、第２押え部４４が設けられる。第１押え部４３はチューブ蓋３５を取り外す場合に使用され、第２押え部４４はチューブ蓋３５を取り外した後のチューブラック３３を真上から押える場合に使用されるように形成される。第２押え部４４は、図６（ｂ）に示すように、長孔部４５の下方に伸びるスカート部で形成され、チューブラック３３に着座したときに、チューブラック３３から首を出すチューブ３４に干渉することがなく、かつ、長孔部４５の存在によりチップ把持部に保持されたチップ３２の下降が許容されるようになっている。また、第１、第２両押え部４３，４４および長孔部４５には、チューブ３４に干渉しない円弧状の逃げ用凹部４６，４７が形成される。
【００３２】
したがって、図７の状態にあるチューブ蓋ラック３６を引き上げる場合には、作用部材４２の第１押え部４３をチューブラック３３とチューブ蓋ラック３６との間に側部から進入させてチューブラック３３を押える。この状態において、ロボットハンド５でチューブ蓋ラック３６を両側から挟持し、上方に引き上げることでチューブ蓋３５が図５（ａ）のように取り外すことができる。この蓋取り外し処理は、磁気昇降ステージ１１の支持台３８で行ったが、磁気昇降ステージ近傍の作業台７に別の支持台を設け、この支持台でチューブ蓋を取り外すようにすることも勿論可能である。
【００３３】
淘汰を行う場合には、その事前準備として作用部材４２は磁気昇降ステージ１１を跨ぐ位置まで移動させる。作用部材４２を下降させ、第２押え部４４でチューブラック３３を上から押しつけ、この状態で淘汰が行われる。支持ステージ１１近傍の上記別の支持台でチューブ蓋を取り外す形態の場合には、一旦、ロボットハンド５でチューブラック３３を両側から把持し、それを磁気昇降ステージ１１の支持台３８へ移動させてから第２押え部４４で押えるようにするとよい。
【００３４】
かかる押しつけ状態や上記のチューブ蓋３５の取り外しは、磁気昇降ステージ１１の支持台３８で行ったが、磁気昇降ステージ１１に隣接した作業台７に別の支持台を設け、ここで行う前処理洗浄の処理でも行われるようにしてもよい。
【００３５】
上記の磁気昇降ステージ１１は、該ステージが上昇することでチューブ３４が孔４１に包み込まれる。これにより、孔４１に取付けた磁石４０の磁場がチューブ外部から印加され、磁性を有する磁気ビーズが磁石４０に引き寄せられる。かかる機能を利用して淘汰を効率的に実行できるように構成している。磁気ビーズの吸着が終わると磁気昇降ステージ１１は、下降して作業台７の面とほぼ同じ高さの状態に復帰する。上記した種々の動作（手順）はシーケンサ２３により実行される。
【００３６】
次に、アプタマー生成方法の処理手順を図２，図８〜図１３を参照して説明する。図８は、ＳＥＬＥＸ法でタンパク結合ＤＮＡ（アプタマー）が回収されるサイクルを示し、図９〜図１３はアプタマー生成のプロトコル図である。なお、図９〜図１３中における□枠内の数字は生成過程のステップを示すものとする。ステップ１からステップ５までは前処理洗浄工程であり、ステップ６以降のステップは後処理洗浄工程を示す。また、本実施形態における各処理工程における処理時間、分注容量、処理温度などの各条件の一例については、各図に記載した通りである。
【００３７】
図９はライブラリ混合、ビーズ非特異排除工程を示し、スタート時において、事前に色々な配列構造を有する一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と、磁気ビーズを好むＤＮＡを固定するための磁気ビーズを用意する。ｓｓＤＮＡをチューブ内でＰＣＲ装置２０により増幅し（ステップ０−１〜ステップ０−３）、ステップ１でこれに固定化用の磁気ビーズを分注した後、ミキサユニット１０によりチューブを加振して内部を攪拌し（ステップ２）て磁気ビーズを好むＤＮＡを磁気ビーズを磁石４０に固定する。ステップ３において、磁気昇降ステージ１１の磁石４０（図７参照）を用いて、磁気ビーズを好むＤＮＡと共にを磁気ビーズをチューブ３４の内壁に固定した状態で、ステップ４において、チューブ３４から溶液だけを吸引し、その溶液を別の容器（チューブ）に分注してＰＣＲ装置２０で増幅させることで前処理洗浄（プレ洗浄）が行われる。これにより、非特異吸着による洗浄（すすぎ）が終わる（ステップ５）。これは図８のＳ１に相当する。
【００３８】
後処理洗浄工程の最初のステップとなるステップ６において、癌細胞等のターゲット（タンパク）付きの固定化磁気ビーズを分注し（図８のＳ２に相当）、ＰＣＲ装置により増幅させた後、ミキサーにて攪拌し（ステップ７）、磁気昇降ステージ１１で磁気ビーズをチューブ３４の内壁に固定した状態で（ステップ８）、内部の溶液を吸引して（ステップ８）、それを廃液槽１９へ廃棄する（ステップ１０）。これにより、淘汰一回目の洗浄が終わり（図８のＳ３に相当）、磁気ビーズ側に、目的のタンパク結合ＤＮＡを残留させることができる。
【００３９】
図１０はターゲット（タンパク）と混合、淘汰、ＰＣＲ工程を示し、同図において、上記で得られたタンパク結合ＤＮＡにBinding bufferＡ（生理食塩水等）を分注してから（ステップ１１）、攪拌し（ステップ１２）、磁気昇降ステージ１１にて磁気ビーズを吸着させ（ステップ１３）、内部の溶液を廃液する（ステップ１４〜１５）。こうして、淘汰２回目の洗浄によるタンパク結合ＤＮＡを回収できることとなる（ステップ１５）。
【００４０】
以下同様にして、例えば、淘汰８回目の洗浄を実施する場合には、再びステップ１１に戻って行う。ステップ１２〜１５は淘汰圧が可変であるので、これらステップを繰り返して実行することで淘汰８回目の洗浄によるタンパク結合ＤＮＡを得ることができる。本実施形態ではすすぎ回数（淘汰回数）を８回の場合で説明したが、勿論これに限定されるものでないことは言うまでもない。なお、この淘汰圧を可変にするのは、既に図４等で説明した手法による。
【００４１】
ステップ１６−１においてＰＣＲ試薬調整ステージ１５でＰＣＲ溶液を分注した後、攪拌し（ステップ１７−１）、ＰＣＲ工程で増幅させる（ステップ１８−１）。
【００４２】
図１１はＰＣＲ産物回収、保存、ビチオン固定工程を示し、同図においてステップ１９で攪拌してＰＣＲ産物を得て、磁気昇降ステージ１１にて磁気ビーズを吸着させてから（ステップ２０）、内部の溶液を吸引し（ステップ２１）、その溶液を別の容器に分注し（ステップ２２）、新規チップを投入して吸引し（ステップ２３）、できたＰＣＲ産物を保管槽１４に分注して回収保存する。ＰＣＲ産物に新規チップを投入してBinding BufferＢを分注し（ステップ２６）、攪拌（ステップ２７）、磁気ビーズ吸着（ステップ２８）、溶液の吸引（ステップ２９）を経て溶液を廃液する（ステップ３０）。こうして、ビチオンを固定できる。
【００４３】
図１２はビチオン固定、一本鎖ＤＮＡ（single strand ＤＮＡ）化工程を示し、ステップ３１で新規チップを投入し、Binding BufferＣを分注し、攪拌（ステップ３２）、磁気ビーズ吸着（ステップ３３）、溶液吸引（ステップ３４）、溶液廃液（ステップ３５）を経た後、ステップ３６で新規チップを投入してBinding BufferＣを分注する。その後、蓋取ステージ１２にて攪拌し（ステップ３７）、磁気昇降ステージ１１にてビーズの吸着（ステップ３８）、溶液の吸引（ステップ３９）を経て溶液を廃液する（ステップ４０）。ＤＮＡの一本鎖化が可能となる。
【００４４】
図１３はｓｓＤＮＡ化、ライブラリ再調整工程を示し、蓋取ステージ１２で新規チップを投入してからアンモニアを分注し（ステップ４１）、攪拌処理を経て（ステップ４２）、ステップ４３で磁気ビーズを吸着させ、内部溶液を吸引して（ステップ４４）、それを別の容器に分注して増幅し（ステップ４５）、乾燥させる（ステップ４６）。これにBinding BufferＡを分注してＰＣＲ装置２０で増幅させ（ステップ４７）、攪拌し（ステップ４８）てからステップ６に復帰し、ライブラリ再調整工程に戻される。このように一本鎖化したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡライブラリに戻すことができる。
【００４５】
本実施形態によれば、８連分注機におけるチップ有無を変えることにより、淘汰圧（条件）を変えることができる。チップホルダに装填されるチップを淘汰回数に見合うように有無を調整して装填することで、淘汰圧にばらつきある淘汰を複雑で煩雑な操作を要することなくシーケンス制御により短時間で自動化して実施できる。また、より多くのターゲットに対応したアプタマーを容易に創成することができる利点もある。
【００４６】
以上、本発明を実施形態により詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものでなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等があっても本発明の範囲に含まれるものである。
【００４７】
例えば、チップの間違いを発見した場合には、エラー表示をタッチパネル２の表示画面に表示させ、あるいはアプタマー生成装置そのものの稼働を自動停止するようにしてもよい。
【００４８】
また、淘汰圧（条件）設定は、アプタマー生成装置が稼働する前に設定することで、洗浄回数を設定するようにしてもよく、また稼動中も設定できるようにすることが望ましい。
【００４９】
また、上記実施形態では、チップホルダ８に装填されるチップの有無で選択的に洗浄（淘汰）を行うようにしたが、タッチパネルの操作部に、例えば８本のチューブに対応する８個の淘汰回数設定部を設けておき、他方、チップ把持部には、８本のチップに対応して個別に作動するアームを備えるようにする。各チューブの淘汰設定回数を個別に上記設定部に入力して設定し、スタートスイッチをＯＮすることで、チップ把持部が淘汰設定回数だけチップホルダに伸びてチップを引き上げて、淘汰が必要なアームだけが個々にチップを把持して、チューブに注入するようにしてもよい。
【００５０】
また、図１４に示すように、８連型の分注機４における各ピペット５０（チップを用いることも可能）を、洗浄液を貯留するタンク５１に対して供給管５２を介して接続するようにしても良い。各ピペット５０に通じる供給管の途中に電磁弁５２を配備し、これを淘汰に応じてシーケンサ２３により開閉制御し、電磁弁５２が開作動したときに洗浄液をピペット５０に圧送する構成も可能である。これにより、チップホルダ８を有しない形態のアプタマー生成装置を得ることができ、チューブ毎に淘汰回数を可変にすることができる。
【００５１】
更に上記実施形態では、ＤＮＡによるアプタマーを生成する場合に限って例示したが、本発明はそれに限定されず、ＲＮＡやペプチドのアプタマーを生成する場合にも用いることが可能である。
【００５２】
また、上記では８連タイプのチューブの場合について説明したが、これに限定されないのは勿論である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、各種素材によるアプタマーを製造する装置に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施形態におけるアプタマー生成方法に適用されるアプタマー生成装置１の外観斜視図である。
【図２】該アプタマー生成装置の内部における平面図である。
【図３】該アプタマー生成装置１のブロック図である。
【図４】アプタマー生成過程のおける淘汰圧可変の方法を示す作用説明図である。
【図５】チューブラックとチップラックの相関関係を示す正面拡大図である。
【図６】磁気昇降ステージと作用部材との相関関係を示す外観斜視図である。
【図７】チューブラックと、チップラックと、作用部材と、磁気昇降ステージとの相関関係を示す外観斜視図である。
【図８】ＳＥＬＥＸサイクルにおける洗浄淘汰工程を説明する概念図である。
【図９】ライブラリ、磁気ビーズ非特異排除工程を説明するプロトコル図である。
【図１０】淘汰及びＰＣＲ工程を説明するプロトコル図である。
【図１１】ＰＣＲ産物回収、保存、ビチオン固定工程を説明するプロトコル図である。
【図１２】ビチオン固定、一本鎖ＤＮＡ化工程を説明するプロトコル図である。
【図１３】一本鎖ＤＮＡ化、ライブラリ再調整工程を説明するプロトコル図である。
【図１４】本実施形態の変形例における要部拡大図である。
【図１５】従来技術における説明図である。
【符号の説明】
【００５５】
１ アプタマー生成装置
２ タッチパネル
３ クリーンユニット
４ 分注機
５ ロボットハンド
６ 案内レール
７ 作業台
８ チップホルダ
１１ 磁気昇降ステージ
２０ ＰＣＲ本体
３２ チップ
３３ チューブラック
３４ チューブ
４０ 磁石
４２ 作用部材
４３ 第１押え部
４４ 第２押え部
５０ ピペット
５１ タンク
５３ 電磁弁
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップをチップホルダに予め装填しておき、
前記分注機が、前記チップホルダにおける前記チップの有無の状態を許容しながら、前記チップを把持する構成としたことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項２】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、チップホルダにチップを複数装填し、
反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が、前記チップホルダから必要な連数だけチップを引き上げて把持するように構成したことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項３】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機による洗浄液の供給回数によって変えられるようにすると共に、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、
前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液を注入するようにしたことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項４】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成方法において、
反応容器としての複数連のチューブに、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的に注入する選択注入工程を有することを特徴とするアプタマー生成方法。
【請求項５】
前記選択注入工程は、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が前記チップホルダから必要な連数だけ前記チップを引き上げて把持するように構成したことを特徴とする請求項４記載のアプタマー生成方法。
【請求項６】
前記選択注入工程は、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液が注入されることを特徴とする請求項４記載のアプタマー生成方法。
【請求項１】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰目標回数に対応させて、洗浄液入りの複数のチップをチップホルダに予め装填しておき、
前記分注機が、前記チップホルダにおける前記チップの有無の状態を許容しながら、前記チップを把持する構成としたことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項２】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機に把持されるチップによる洗浄液を供給回数によって変えられるようにすると共に、チップホルダにチップを複数装填し、
反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が、前記チップホルダから必要な連数だけチップを引き上げて把持するように構成したことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項３】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成装置において、
淘汰の目標回数を、分注機による洗浄液の供給回数によって変えられるようにすると共に、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、
前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液を注入するようにしたことを特徴とするアプタマー生成装置。
【請求項４】
処理洗浄で淘汰を行うアプタマー生成方法において、
反応容器としての複数連のチューブに、淘汰回数に応じて洗浄液を選択的に注入する選択注入工程を有することを特徴とするアプタマー生成方法。
【請求項５】
前記選択注入工程は、チップホルダにチップを複数装填し、反応容器としての複数連のチューブが個別に必要とする淘汰の目標回数に応じて、前記分注機が前記チップホルダから必要な連数だけ前記チップを引き上げて把持するように構成したことを特徴とする請求項４記載のアプタマー生成方法。
【請求項６】
前記選択注入工程は、前記分注機を洗浄液が貯留されるタンクに接続し、前記分注機によって、反応容器としての複数連のチューブの個々に選択的に洗浄液が注入されることを特徴とする請求項４記載のアプタマー生成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００８−２６３８５６（Ｐ２００８−２６３８５６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１１２４０（Ｐ２００７−１１１２４０）
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【出願人】（３０００９０８４６）株式会社ライフテック (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【出願人】（３０００９０８４６）株式会社ライフテック (13)
【Ｆターム（参考）】
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