アポクリン細胞株
アポクリン細胞を初代組織から単離し、単離された細胞を第１培地内で培養し、第１培地から未付着細胞を取り出し、有効濃度のホルボールエステルを含む第２培地に該未付着細胞を移し、それにより、長期増殖能を示し多数回の培養の後に無限増殖を示すアポクリン細胞株を樹立する工程によりアポクリン細胞株を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポクリン細胞株、特に、長期増殖を示すアポクリン細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクリン腺に加えて、アポクリン腺は、ヒトの皮膚上で皮膚細菌集団にさらされると悪臭性化合物に変換される種々の脂質性およびアミノ酸溶質（ステロイドおよび短鎖脂肪酸を含む）を含有する水性流体を分泌する。換言すれば、アポクリン腺はヒトの発汗に関与している。皮膚上の悪臭性化合物の生成を抑制するための手段を見出すために、相当な研究が行われ続けているが、これは、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）、すなわちヒトの皮膚におけるアポクリン腺の機能を厳密に模擬するアポクリン細胞株が存在しないことにより妨げられている。後者の開発は非常に重要であろう。なぜなら、それは、本明細書に記載されている利益の１以上を提供するからである。それは、インビボと比べて非常に多くのインビトロの研究の実施を可能にするであろう。これは、（ｉ）発汗を招くアポクリン腺内の輸送メカニズムを特定するのを補助し、（ｉｉ）悪臭性化合物の形成を減少させる物質のスクリーニングおよび特定を促進し、（ｉｉｉ）それらの有効濃度（すなわち、身体に局所的に適用された場合に防臭剤として作用するのに要求される濃度）を決定するのを助けるであろう。適当な細胞株の存在は、発汗自体以外の新規腺機能を特定する機会をも提供するであろう。
【０００３】
長期培養内で他の分泌細胞を維持するための試みと同様に、アポクリン培養から得られた初代細胞株は、アポクリン腺に特徴的な形態学的、表現型的および／または機能的特徴を失う前に数回しか継代されていない。
【０００４】
Ｒ Ｗｉｃｈｅｒらによる論文（Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ ３５，ｐｐ３４２−３５０，題名“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｒａｔ ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｌａｎｄ”）はラット由来のアポクリン細胞に関するものであり、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。さらに、機能性を示すためにそこにおいて使用されている細胞マーカーは必ずしもヒトアポクリンモデルに関連したものではない。さらに、該著者は、一見したところ、凍結および解凍後にそれらの細胞を継代することを狙っていたのではなく、したがって、それらの長期増殖能を実証しなかった。
【０００５】
Ｚ．Ｍａｒａｓらの論文（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｖｏｌ ３５，Ｎｏｖ−Ｄｅｃ（１９９９），ｐｐ６０６−６１１，題名“Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｏｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｖｉｎｅ Ａｐｏｃｒｉｎｅ Ｇｌａｎｄ；Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｕｃｔａｌ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ”において公開）はヒツジ由来のアポクリン細胞に関するものであり、同様に、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。
【０００６】
Ｄｉｅｔｅｒ Ｃ．Ｇｒｕｅｎｅｒｔらの論文（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ２６，Ａｐｒｉｌ（１９９０），ｐｐ４１１−４１６，題名“Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｏｉｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”において公開）はアポクリン細胞ではなくエクリン細胞に関するものであり、したがって、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ ３５，ｐｐ３４２−３５０
【非特許文献２】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｖｏｌ ３５，Ｎｏｖ−Ｄｅｃ（１９９９），ｐｐ６０６−６１１
【非特許文献３】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ２６，Ａｐｒｉｌ（１９９０），ｐｐ４１１−４１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
本発明の目的は、長期増殖を示し継代培養により培養内で維持されうる、アポクリン腺の発汗機能を模擬するアポクリン細胞株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、長期増殖を示す培養アポクリン細胞株を提供する。
【００１０】
この場合の増殖は、該細胞が、適当な培地内で培養された場合に分裂する能力を保有することを示すものであるが、該細胞株が不死化されていることを示唆するものではない。
【００１１】
本発明の場合の長期は、該細胞が、少なくとも３０回の継代培養（継代）後に増殖するそれらの能力を保有することを示す。実際には、そのような長期増殖が細胞株により達成された場合、それは、一般に、少なくとも１００または１０００回の継代にわたる増殖を示しうる。そのような多数回の継代にわたる増殖は、少なくとも本発明の培養アポクリン細胞株の実用的な目的には、無限増殖を示す。
【００１２】
特に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＳＰ４ ０ＪＧ，Ｅｎｇｌａｎｄに寄託番号０７０２１３０１で寄託されたヒトアポクリン細胞株ＡＳＧ５を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】外植の９日後にアポクリンコイルから成長している細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】増殖中のアポクリン細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２】アミロリドの存在下の初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるピーク増加を示している。
【図３】初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるＩＳＣのピーク増加を示している。
【図４Ａ】ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である（アミロリド（１０μＭ）での先端前処理）。
【図４Ｂ】ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である（１ｍＭ フロセミドでの先端前処理）。
【図５】産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示している。
【図６】無限増殖性アポクリン腺細胞株において発現されることが示されている遺伝子が与えられた場合に明らかにされうるステロイド合成経路の概要図である。
【図７】産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示している。
【図８】該３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの相対レベルを示している。
【図９】７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるコレステロールの相対レベルを示している。
【図１０】７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるスクアレンの相対レベルを示している。
【図１１】短鎖脂肪酸の相対レベルを示している。
【図１２】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１３】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１４】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１５】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１６】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（１４日齢培養細胞）図である。
【図１７】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（１４日齢培養細胞）図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態および形態学的特徴の詳細な説明
本明細書は、長期増殖性アポクリン細胞株の作製、そしてついで、電気生理学的、分子的および生化学的技術によるその特徴づけ及び初代培養アポクリン細胞との比較を説明する。少なくとも長期増殖を示したアポクリン細胞株ＡＳＧ５に対する明確な関連性を有する臭気前駆体化合物の分析およびステロイド合成に特別の関心が払われる。
【００１５】
アポクリン腺の単離および初代培養
長期増殖能を示したアポクリン細胞株は以下の方法により得られた。関連倫理委員会からの許可および被験者のインフォームドコンセントを予め得て３０から７０歳の女性の腋窩皮膚を切除することにより、全アポクリン腺を単離した。該切除法により幾つかのアポクリン汗腺を断片化し、それらの断片から細胞を培養することができた。顕微鏡的観察およびニュートラルレッド（Ｎｅｒｕｔｒａｌ Ｒｅｄ）取り込み実験は、切除により単離されたアポクリン腺が、純粋に、管から分離されたコイルよりなることを示した。約５０ｍｍ×５ｍｍの腋窩皮膚のサンプルから、平均して１０から１００個のアポクリンコイルが単離された。
【００１６】
ついで、ＬｅｅらによりＪ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．８３：１０３−１１８，１９８６において提示されている変法を用いて、コラーゲンＩＩ型（２ｍｇ ｍｌ−１）を含有するウィリアムス・イー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ）培地（本明細書においてはＷＥＭと略称される）内で５％ ＣＯ２／相対湿度９５％の空気中、該アポクリンコイルを３０分間温置した。ついで、１０ｎｇ ｍｌ−１ 上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１０μｇ ｍｌ−１ インスリン、１０ｎｇ ｍｌ−１ ヒドロコルチゾン、１０μｇ ｍｌ−１ ホロトランスフェリン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ ｍｌ−１ ペニシリンおよび１００μｇ ｍｌ−１ ストレプトマイシンで補足された酵素非含有ＷＥＭ中で該コイルを洗浄した。
【００１７】
１０ｎｇ ｍｌ−１ ＥＧＦ、１０μｇ ｍｌ−１ インスリン、０．５μｇ ｍｌ−１ ヒドロコルチゾン、３０μｇ ｍｌ−１ ウシ下垂体抽出物、５０μｇ ｍｌ−１ ゲンタマイシンおよび５０ｎｇ ｍｌ−１ アンホテリシンで補足された１ｍｌの乳房上皮増殖培地内で２５ｃｍ２ フラスコ当たり約１５個のアポクリン腺をプレーティングした。９５％ 空気／５％ ＣＯ２ 加湿インキュベータ中で３７℃で２４時間の温置の後、さらに３ｍｌのＭＥＧＭを各フラスコに加え、ついで該培地を３日ごとに交換した。
【００１８】
無限増殖細胞株を示す長期増殖性アポクリン細胞株（ＡＳＧ５）の作製および維持
初代汗腺の単離および培養
前記のとおり、全無傷ヒトアポクリン汗腺を切除により単離した。アポクリン腺の組織学的検査は、切除が、短い吸収管を完全に取り出して分泌性コイル部分のみを無傷のまま残したことを示した。単離された腺を補足ＭＥＧＭ内でプレーティングした。プレーティングされた腺の約５０％が枝を生成し、これは２から３日後に常套的に観察された。枝は、２０日間まで増殖し続け、典型的な「丸石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）」上皮細胞形態学を示した（（Ａ）外植の９日後にアポクリンコイルから成長している細胞、および（Ｂ）増殖中のアポクリン細胞の位相差顕微鏡写真を示す図１に示すとおり）。培養の初期段階において、枝が観察される前に、伸長した繊維芽細胞状の形態学を示す少数の細胞が外植腺の周囲にしばしば観察された。しかし、これらの細胞はＭＥＧＭ内では増殖しなかった。
【００１９】
アポクリン分泌コイルの初代培養から増殖性アポクリン細胞株を誘導した。ＭＥＧＭ内で７日間の培養の後、強力なホルボールエステルであるＴＰＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３ アセタート；旧Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を２５０ｎＭの濃度で該培地に加えた。ホルボール（ホルボールは１，１ａ，１ｂ，４，４ａ，７ａ，７ｂ，８，９，９ａ−デカヒドロ−４ａ，７ｂ，９，９ａ−テトラヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−１，１，６，８−テトラメチル−５Ｈ−シクロプロパ［３，４］ベンゾ［１，２−ｅ］アズレン−５−オンとも称される）のエステルの有効濃度を該培地が含有することは、長期増殖能を示す細胞株を入手する方法の重要な特徴である。一般に、該エステルは、少なくとも脂肪族置換基、例えば長鎖アルキル（Ｃ７からＣ２４）および場合によっては更に短鎖アルキル（Ｃ２からＣ６）を、特に好適には１２および／または１３位に含む。したがって、本発明における方法は、無限増殖を示すアポクリン細胞株の調製を可能にする。
【００２０】
ＴＰＡは、添加の３から４日後に、未熟多層化を誘導した。しかし、上部の分化した層は反復洗浄により除去され、フラスコに尚も付着している細胞の増殖性単層が残った。該増殖性層の細胞を９６ウェルプレート内に継代して、クローン細胞株を作製した。細胞を維持し、継代し、ＴＰＡを含有するＭＥＧＭ内で約２ヶ月間、成長させ続けた。この期間の後、細胞をＭＥＧＭ単体において培養し、増殖の継続に関してモニターした。最初は多数のサブクローンが成長し続けたが、次の１０回の継代の終わりまでに、大多数が老化し始めていた。１つの培養、特にＡＳＧ５は成長し続け、現在も培養内で維持されており、成長速度の減少の徴候を伴うことなく４０継代以上増殖している。これは、無限の増殖能を示していることの指標となる。この培養はＴＰＡの非存在下で増殖し続け、低温保存においても生存可能であり、安定であるとみなされている。比較すると、初代アポクリン汗腺は最大で１ヶ月および４継代にわたって成長し、低温保存においては生存しない。長期増殖を示す本発明において継代された細胞培養は、例えばピークアゴニスト応答において、初代アポクリン培養に形態学的に類似している。したがって、そのような細胞培養は、インビトロで或る物質が防臭特性を示すかどうか及び／又はその度合を実証するために使用可能であり、すなわち、個人用防臭剤として作用しうる。
【００２１】
電気生理学のためのＡＳＧ５アポクリン細胞の調製
１３から１８日後、コンフルエントなＡＳＧ５培養をＴｒａｎｓｗｅｌｌコラーゲンコート化透過性支持体（面積０．３３ｃｍ２，Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号３４９５，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）上に継代した。これは２％ ＥＤＴＡ中で２０分間、およびそれに続くトリプシン（０．５％）−ＥＤＴＡ（０．２％）中で約５分間の温置を含むものであった。３×１０５個の細胞を、ＷＥＭで補足された各Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に移した。該Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ支持体を２４ウェルプレート内の０．６ｍｌの同じ培地中に懸濁させた。初代培養には、初回継代細胞のみを実験に使用した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養物を浸す培地は２日ごとに交換した。
【００２２】
電気生理学
オーム計に接続された「箸（ｃｈｏｐｓｔｉｃｋ）」電極（ＷＰＩ，Ａｌｒｅｓｆｏｒｄ，Ｈａｎｔｓ，ＵＫ）を使用して、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の上皮を隔てる経上皮抵抗性（ＴＥＲ）をモニターした。湿らせたフィルターブランクに関する測定値を引き算することにより、ＴＥＲを評価した。ピークＴＥＲにおいて、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ支持体をウッシング室（Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）内にマウントした。上皮を、修飾されたクレブスバッファー中に浸し、酸素化し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２、３７℃、ｐＨ７．４に維持した。該バッファーは、ＮａＣｌ，１１７；ＫＣｌ，４．７；ＣａＣｌ２，１．５；ＭｇＳＯ４，１．２；ＮａＨＣＯ３，２５；およびグルコース，１１．１（ｍＭ）よりなるものであった。電圧／電流クランプに接続された電圧および電流電極（それぞれ、カロメルおよび銀／塩化銀，ＡＢＢ Ｋｅｎｔ Ｔａｙｌｏｒ，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｓ，ＵＫ）を、３Ｍ 塩化カリウムに溶解した寒天を含有する橋を介して該浴内に伸長させた。
【００２３】
電圧電極をＴｒａｎｓｗｅｌｌの非存在下で平衡化し、任意ＤＣ電流の注入により電圧電極間の流体抵抗を補償した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌをマウントした後、該上皮を短絡させ、該電流を典型的には１５分間安定化させた。アポクリン物質が稀少であることを考慮して、典型的には、Ｂｒａｙｄｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，４０５：６５７−６７５、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，７７；８６３−８７１およびＳｈｅｎら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２６６：Ｌ４９３−５０１に開示されているとおりに、薬物を連続的に加え、短絡電流（ＩＳＣ）の変化を記録した。実験の継続時間は典型的には１５から６０分間であった。オームの法則を用いて、通常は、電圧を±１０ｍＶに固定し、これを達成するのに要した電流を測定することにより、ＴＥＲを評価した。特に示さない限り、先端側に加えられたアミロリドを除き、説明に挙げられている全ての薬物は基底側部に加えられた。アミロリドは上皮Ｎａ＋チャネル（ＥＮａＣ）およびＮａ＋／Ｈ＋交換体のインヒビターである。
【００２４】
クレブスバッファーの修飾
グルコン酸ナトリウムがＮａＣｌで、グルコン酸カリウムがＫＣｌで、そしてＣａＳＯ４がＣａＣｌ２で置換されたクレブスバッファー中で塩化物イオン（クロリド）置換実験を行った。浸透圧を維持するための代用物として１１．１ｍＭ マンニトールを使用して、グルコース非含有実験を行った。ＭｇＣｌ２がＭｇＳＯ４に取って代わるよう、カリウムチャネルのインヒビターとしてバリウムを使用した実験を硫酸イオンの非存在下で行った。
【００２５】
基底経上皮特性
増殖性アポクリン培養物を透過性支持体上に継代し、ピークＴＥＲにおいてウッシング室（Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）に移した。そのような増殖性培養に関する平均ＴＥＲは３９５±４０Ωｃｍ２であった（Ｐ＜０．００１）。増殖性アポクリン培養物に関する静止短絡電流（ＩＳＣ）は４．５±０．８μＡ ｃｍ−２であった（Ｐ＜０．００１）。静止経上皮電位差（ＴＥＰＤ）は、先端陰性（ａｐｉｃａｌｌｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ）の増殖性アポクリン培養に関しては１．０ｍＶであった。
【００２６】
以下の表１に要約されている静止ＩＳＣに対するイオン輸送インヒビターの効果
増殖性培養における静止ＩＳＣは１０μＭ アミロリドに対して感受性であった。このことは、ナトリウム再吸収が、培養された汗腺上皮におけるイオン輸送の重要な構成要素であることを証明している。先端に適用されたアミロリド（１０μＭ）は増殖性アポクリン培養において静止ＩＳＣを４．５±１．０μＡ ｃｍ−２減少させた（ｎ＝２０，Ｐ＜０．００１）。用量反応曲線は、アミロリドのＩＣ５０が２から４μＭであり、１０μＭ アミロリドが最大上用量であったことを示している。
【００２７】
上皮Ｎａ＋−Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送体であるＮＫＣＣｌ（ひいては経上皮塩化物イオン輸送）のインヒビターであるフロセミドの効果もアポクリン培養において調べた。１ｍＭ フロセミドの基底側部添加は形質転換培養において静止ＩＳＣを０．８±０．３０．２μＡ減少させた（ｎ＝２０，Ｐ＜０．００１）。
【００２８】
【表１】
【００２９】
アゴニスト応答におけるナトリウム再吸収の役割
アゴニスト応答におけるナトリウム再吸収の役割を決定するために、初代アポクリンおよび増殖性アポクリン培養を１０μＭ アミロリドで前処理した。添付されている図２は、アミロリドの存在下の初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるピーク増加を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養の基底側部に該アゴニストを加えた。各該図における棒グラフはｎ＝１０の最小値を表している。先端アミロリド（１０μＭ）の存在下の短絡電流におけるピーク増加が示されている。以下のアゴニストを基底側部に加えた：カルバコール（ＣＣｈ；２０μＭ）、イソプレナリン（Ｉｓｏ；１０μＭ）、Ｌ−ブラジキニン（ＬＢＫ；１７０ｎＭ）、ヒスタミン（Ｈｉｓ；２００μＭ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ；１００μＭ）。不対スチューデントｔ検定およびウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を用いて、有意性を試験した。
【００３０】
図２は、アミロリド前処理が長期増殖性アポクリン細胞株ＡＳＧ５においてＣＣｈ、ＨｉｓおよびＡＴＰに対する応答を有意に減少させたことを示しており、このことは、ナトリウム再吸収がこれらの応答の構成要素であることを示唆している。
【００３１】
図３は、初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるＩＳＣのピーク増加を示している。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養の基底側部にアゴニストを加えた。短絡電流におけるピーク増加が示されている。以下のアゴニストを基底側部に加えた：ＣＣｈ（２０μＭ）、Ｉｓｏ（１０μＭ）、ＬＢＫ（１７０ｎＭ）、Ｈｉｓ（２００μＭ）およびＡＴＰ（１００μＭ）。
【００３２】
図４Ａおよび４Ｂは、ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である。図４Ａは、アミロリド（１０μＭ）での先端前処理、ならびにＣＣｈ（２０μＭ）の応答に対する１ｍＭ フロセミド（Ｆｒｕ）および５０μＭ 塩化バリウム（Ｂａ；マキシ−Ｋチャネルブロッカー）の添加の効果を示す。図４Ｂは、１ｍＭ フロセミドでの先端前処理、ならびにＣＣｈ応答に対するアミロリドおよび塩化バリウムの効果を示す。
【００３３】
図４Ａにおける増殖性アポクリン培養の代表的トレースは、図３におけるアゴニスト刺激に関する観察値と比較して、アミロリド前処理後にカルバコール刺激が減少することをも示している。
【００３４】
４つの場合において、アポクリン培養の初代培養および継代がそれらの電気生理学的特性に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、全アポクリン分泌コイルを透過性支持体上に直接的に外植した。調べた培養においては、アミロリドの存在下であるか非存在下であるかには無関係に、基底およびアゴニスト刺激電気生理学的特性は初代培養と有意には異ならなかった（データ非表示）。
【００３５】
一過性アゴニスト応答における経上皮塩化物イオン輸送の役割
初代および増殖性アポクリン培養におけるアゴニスト誘導性応答のイオン的基礎を更に特徴づけるために、経上皮塩化物イオン輸送の役割を調べた。塩化物イオン（クロリド）非含有条件下、初代および増殖性アポクリン培養に関する静止ＩＳＣは、それぞれ、６．０±０．８μＡ ｃｍ−２および３．１±０．６μＡ ｃｍ−２であった。静止ＴＥＰＤは初代培養に関しては−０．９ｍＶ、そして増殖性培養に関しては−１．８ｍＶであった。１０μＭ アミロリドの添加は基底ＩＳＣを初代培養においては３．６μＡ ｃｍ−２、そして増殖性培養においては２．５μＡ ｃｍ−２減少させた。
【００３６】
カルバコール、ヒスタミンおよびＡＴＰに対する応答は、塩化物イオンの存在下の同一実験と比較して、初代アポクリン培養および増殖性アポクリン培養の両方において有意に減少し（表２）、このことは、塩化物イオン輸送がアゴニスト応答の媒介において重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、図４Ｂは増殖性培養からの代表的トレースを示し、これは、フロセミドでの前処理が、図３における値と比較して、カルバコールに対する応答の大きさを減少させることを示している。アゴニスト刺激後のフロセミドの添加は、初代アポクリン培養および形質転換アポクリン培養の両方において、応答における迅速な減少を誘導し、このことは塩化物イオンの取り込みの調節におけるＮＫＣＣｌの役割を示している（表３）。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
アゴニスト応答は、塩化物イオン含有バッファー中のアミロリド前処理と比較して、アミロリド前処理で有意に減少したが、特に増殖性培養においてはそれらは完全に阻止されたわけではなく、このことは、他のイオン輸送経路がこれらの応答において何らかの役割を果たしている可能性があることを示唆している（表４）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
総合すると、これらの結果は、該増殖性細胞株が初代培養と同じ特性を示し続けたことを示している。
【００４２】
長期増殖性アポクリン腺細胞株におけるステロイド産生
ヒト皮膚およびその付属器は、ホルモンの代謝および合成に関与するものを含む種々の代謝機能の能力を有する。アンドロゲン（性ステロイドホルモン）は、多数の酵素変換を要する生合成経路において親前駆体コレステロールから合成される。思春期の間にアポクリン腺が機能的になる際に、アンドロゲンが腺活性のモジュレーションにおいて何らかの役割を果たしているらしい。これは、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺の分泌細胞においてアンドロゲン受容体が検出されていることにより更に裏づけられている（Ｂｅｉｅｒら，（２００５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：６１−６５）。ステロイドの局所的またはイントラクリン形成は細胞機能の媒介において重要な役割を果たす可能性があるため（Ｌａｂｒｉｅ，Ｆ．ら（１９９１），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７８：１１３−１１８）、原因となる転写産物の発現を、本発明における無限増殖性アポクリン細胞株における活性アンドロゲンおよびエストロゲンならびにそれらの関連受容体の形成に関して調べた。
【００４３】
該研究の材料および方法
化学物質
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび分子マーカーＩＩＩをＲｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを供給業者の推奨に従い使用した。すべての他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，ＵＫから入手した。
【００４４】
株、プラスミド、培地および培養条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を全てのクローニング法における宿主株として使用した。ポリＴ突出部を含有する予め消化されたベクターｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、供給業者の説明に従い使用した。適当な選択圧（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）で補足されたＬＢ培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）内で回転振とう機上、３７℃で細菌を培養した。
【００４５】
細胞材料
無限増殖を示す長期増殖アポクリン腺細胞を前記のとおりに成長させた。クローニングのために、３７℃で１０日間の成長の後、細胞を集めた。
【００４６】
オリゴヌクレオチド合成および配列決定
使用した全てのオリゴヌクレオチドはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｌｔｄ，Ｐａｍｐｉｓｆｏｒｄ，ＵＫにより合成された。汎用Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して配列決定を行った。
【００４７】
プラスミドＤＮＡの単離
クローニングおよび配列決定用のプラスミドＤＮＡを得るために、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）ミニプレップキットを使用した。
【００４８】
クローニング
ステロイドアンドロゲン代謝に関与する転写産物の断片を、無限増殖性アポクリン腺細胞に由来するｃＤＮＡからクローニングした。Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫのＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）−４ＰＣＲキットを使用して、該細胞からＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄｔ）を使用して、Ａｍｂｉｏｎ ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（商標）を使用して１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。増幅のために用いたＰＣＲ反応プログラムは以下のとおりであった：１サイクル（９５℃で１２０秒間）、３０サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間または６０秒間）、１サイクル（７２℃で７分間）（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した）。各転写産物からの断片をクローニングするために使用したプライマーの概要を表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示したプライマーペアが設計された遺伝子断片の全てが検出可能であった。添付されている図５は、産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示す。
【００５１】
図５は以下の遺伝子断片の発現を示す：１．ステロイドスルファターゼ；２．３βヒドロキシ−Δ−５−ステロイドデヒドロゲナーゼ１；３．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ３；４．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ５；５．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ７；６．５αレダクターゼＩ；７．ＣＹＰ１９Ａ１アロマターゼ；８．アンドロゲン受容体；９．エストロゲン受容体β；Ｍ．ＤＮＡマーカーＩＩＩ。
【００５２】
ついでこれらのＰＣＲ産物を、配列決定のためにＴＯＰＯベクター内にクローニングした。各クローン化断片の実体を確認するために、各ＰＣＲ産物上で配列決定を行った。該遺伝子配列決定の結果を以下に示す。
【００５３】
【化１】
【００５４】
これらの結果は、無限増殖性アポクリン腺細胞株が、アンドロゲンおよびエストロゲン合成に必要な多数の遺伝子を発現していることを明らかに示している。添付された図６は、無限増殖性アポクリン腺細胞株において発現されることが示されている遺伝子が与えられた場合に明らかにされうるステロイド合成経路の概要を示す。また、該細胞は、これらのアンドロゲンおよびエストロゲンの産生に対する細胞内応答を媒介するのに必要な受容体、すなわち、アンドロゲンおよびエストロゲンβ受容体をも発現する。興味深いことに、エストロゲンα受容体の発現に関する転写産物は検出できなかった（データ非表示）。腋窩皮膚断片内のアポクリン腺分泌細胞において、両受容体型に対する免疫組織化学的染色を用いて、エストロゲンβ受容体は検出できるが、エストロゲンα受容体は検出できないことを示したこれまでの研究（Ｂｅｉｅｒ，Ｋ．ら（２００５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：６１−６５）に、これは合致している。同じ研究はまた、アポクリン腺分泌細胞におけるアンドロゲン受容体の存在を示した。
【００５５】
添付されている図６におけるデータは、無限増殖性アポクリン細胞株が、初代培養およびインビボで観察された分泌性アポクリン腺細胞のステロイド産生特性の多数を保有することを示している。この細胞株は、アポクリン腺におけるステロイド代謝および腺活性の調節におけるステロイドの役割を研究するための優れた手段を提供する。また、該細胞株は、これらの細胞におけるステロイド産生経路の介入を介した腺活性の調節における化合物の効力を評価するための非常に重要な手段として用いられるであろう。
【００５６】
無限増殖性アポクリン腺細胞株におけるアポクリン分泌活性の細胞マーカー
アポクリン汗腺の主要機能は、情動的刺激に直接的に応答して毛包の管を介して皮膚表面に運搬される、脂質に富む分泌物を産生することである。該分泌物は無臭であるが、細菌による分解を受け、これにより腋窩悪臭が生じる。アポクリン腺の分泌機能は、これらの鍵過程に関与する多数のタンパク質に関連している。ＡＢＣＣ１１タンパク質は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのようなプリンおよびピリミジンヌクレオチド類似体の流出に関与するＡＴＰ結合カセット輸送体のファミリーに属する（Ｇｕｏら，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２９５０９−２９５１４）。このタンパク質はヒトの耳垢アポクリン腺における耳垢の分泌に関連づけられている（Ｙｏｓｈｉｕｒａら，（２００６）Ｎａｔ．Ｇｅｎ．，３８：３２４−３３０）。ヒトの耳垢は、通常、乾燥型および湿潤型よりなる。乾燥耳垢は東アジアでよく見られ、湿潤耳垢は他の集団でよく見られる。ＡＢＣＣ１１遺伝子におけるＳＮＰ（５３８Ｇ→Ａ）は耳垢型の決定をもたらすとみなされる。Ａ対立遺伝子を有する細胞は、Ｇ対立遺伝子を有する細胞より低い、ｃＧＭＰに関する排出活性を示す。Ａ対立遺伝子頻度は、世界的な北−南および東−西の下方性地理的勾配を示す。世界的には、それは中国人および韓国人において最高であり、これらにおいては、これらの地域における種々の民族集団内で乾燥耳垢型が保有されている。腋窩臭のレベルの増加は湿潤型耳垢に関連づけられ、これは腋窩アポクリン腺機能の直接的な結果であると考えられる。
【００５７】
アポクリン腺分泌において重要な役割を果たすことが示されているもう１つのタンパク質は、Ｓｐｉｅｌｍａｎ，Ａ．Ｉ．（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，５０：４０−４７によるアポリポタンパク質Ｄである。このタンパク質は、豊富に存在する臭気分子Ｅ−３−メチル−２−ヘキサン酸（３Ｍ２Ｈ）の担体ビヒクルとして作用することが示されている。アポクリン分泌において、３Ｍ２Ｈは、アポクリン分泌臭気結合タンパク質１および２（ＡＳＯＢ１およびＡＳＯＢ２）の２つのタンパク質が結合した皮膚表面に運搬されることを、研究は示している。後にＡＳＯＢ２タンパク質は、リポカリンとしても公知の担体タンパク質のα２μ−ミクログロブリンスーパーファミリーの公知メンバーであるアポリポタンパク質Ｄ（ａｐｏＤ）と同定された（Ｚｅｎｇら，（１９９６），９３：６６２６−６６３０）。ａｐｏＤに対する免疫反応性は腋窩組織断片におけるアポクリン腺に局在化されており（Ｓｐｉｅｌｍａｎら，（１９９８）１３４，８１３−８１８）、このことは、３Ｍ２Ｈの糖タンパク質担体の少なくとも１つがアポクリン腺に存在することを示している。
【００５８】
グロス（Ｇｒｏｓｓ）嚢胞症流体は、ＧＣＤＦＰ−１５を含む幾つかの糖タンパク質から構成される、乳房からの病的分泌物である。ＧＣＤＦＰ−１５は、アポクリン異形成上皮裏層乳腺嚢胞に及び腋窩、外陰部、眼瞼および耳管のアポクリン腺に局在化されている（Ｍａｚｏｕｊｉａｎら，１９８３ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１０：１０５−１１２）。ＧＣＤＦＰ−１５は、精嚢、唾液腺および汗腺において特定されているＧｐ１７／分泌アクチン結合タンパク質（ＳＡＢＰ／外耳下糖タンパク質（ＥＰ−ＧＰ））と同一であり（Ａｕｔｉｅｒｏら，（１９９１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９７：２６８−２７１）、このタンパク質はプロラクチン誘導性タンパク質（ＰＩＰ）とも同一である（Ｍｕｒｐｈｙら，（１９８７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５２３６−１５２４１）。したがって、ＧＣＤＦＰ−１５はアポクリン上皮の特異的組織マーカーである。
【００５９】
亜鉛−α−糖タンパク質（ＺＡＧ）は、最初はヒト血漿から単離され（Ｂｕｒｇｉら，（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２３６，１０６６−１０７４）ついで肝臓、乳房、胃腸管および汗腺の分泌上皮細胞において見出された（Ｔａｄａら，（１９９１）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３９，１２２１−１２２６）４３ｋＤａの可溶性糖タンパク質である。ＺＡＧは或る悪性腫瘍において過剰発現され、したがって、それは癌マーカーとして用いられうる（Ｄｉｅｚ−Ｉｔｚａら，（１９９３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ａ ２９，１２５６−１２６０；Ｈａｌｅら，（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７，８４６−８５３）。ＺＡＧの生物学的機能はほとんど知られていないが、それは脂質動因因子（Ｔｏｄｏｒｏｖら，（１９９８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，２３５３−２３５８）、および脂肪組織機能の局所調節に関連づけられうる新規アディポカイン（Ｂａｏら，（２００５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７９，４１−４７）として作用することが示されている。
【００６０】
ＡＢＣＣ１１、ＡｐｏＤ、ＧＣＤＦＰ−１５および亜鉛−α−糖タンパク質はアポクリン腺の分泌および輸送過程において重要な役割を果たしているため、本発明者らは、該無限増殖性アポクリン細胞株においてこれらのタンパク質の翻訳を引き起こす転写産物の発現を調べた。
【００６１】
該遺伝子転写産物断片をクローニングするために使用したプライマーを表６に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
表６に示すプライマーペアが設計された遺伝子断片の全ては検出可能であった。添付されている図７は、産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示す。
【００６４】
添付されている図７．アポクリンマーカーを示すアガロースゲルが開示されている。以下の産物がそれぞれレーン１から４に示されている。
１．ＡＢＣＣ１１輸送体、
２．アポリポタンパク質Ｄ、
３．亜鉛−α−糖タンパク質、
４．ＧＣＤＦＰ−１５。
【００６５】
ついでこれらのＰＣＲ産物を、配列決定のためにＴＯＰＯベクター内にクローニングした。各クローン化断片の実体を確認するために、各ＰＣＲ産物上で配列決定を行った。該遺伝子配列決定の結果を以下に示す。
【００６６】
【化２】
【００６７】
該無限増殖性アポクリン細胞株は、細胞分泌過程に関連したＡＢＣＣ１１遺伝子を発現する。該配列決定データはＡＢＣＣ１１輸送体遺伝子の同一性を証明した。この細胞株における該遺伝子の遺伝子型はＧ（５３８Ｇ→Ａ太字および下線）であり、湿潤耳垢型および腋窩臭気のレベル増加に関連している。アポリポタンパク質Ｄ担体遺伝子も発現され、このことは、臭気物質の輸送に必要な装置も該細胞株内で作られていることを示している。該データは、この細胞株のアポクリン表現型の更なる証拠、およびアポクリン腺生物学の研究のための強力な手段の提供におけるその有用性の更なる証拠を提供する。
【００６８】
細胞化学組成−材料および方法
無限増殖性アポクリン細胞（継代４４）をそれぞれ第７日および第１４日に集めた。該細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、再遠心分離し、分析のために−８０℃で保存した。
【００６９】
３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの分析
１０μｌの（Ｎ−メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）、１％ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）および１０μｌのピリジンおよび１μｌのトリエチルアミンを使用して、該凍結細胞ペレットから３−メチル−２−ヘキサン酸グルタミンコンジュゲートを抽出した。該サンプル上の試薬において誘導体化を行った。該混合物を７０℃で１時間維持した。選択されたイオンモニターを伴うＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０／５９７３ガスクロマトグラフィー／質量選択データ系およびＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ５−ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）（ｉｄは内径を示す）を使用するガスクロマトグラフィーにより、３Ｍ２Ｈグルタミン誘導体を分析した。用いた温度プログラムは１０℃／分で７０℃から２７０℃であった。組込まれたソフトウェアを使用して、ピーク面積を自動的に計算した。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７０】
コレステロールおよびスクアレンの分析
２０μｌのクロロホルムを使用して、該凍結細胞ペレットからコレステロールおよびスクアレンを抽出した。ついでこの抽出物をＧＣ（前記に詳細に説明されているとおり）内に直接的に注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ５−ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）を使用して完全走査下で分析した。加熱プログラム：１０℃／分で７０℃から２７０℃。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７１】
短鎖脂肪酸
２０μｌのクロロホルムを使用して、該凍結細胞ペレットから短鎖脂肪酸を抽出した。ついでこの抽出物をＧＣ（前記に詳細に説明されているとおり）内に直接的に注入し、選択的イオンモニターを行いながら、ＨＰ−Ｉｎｎｏｗａｘカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）を使用して分析した。加熱プログラム：５℃／分で７０℃から２４０℃。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７２】
該３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの相対レベルを、添付されている図８に示す。
【００７３】
７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるコレステロールの相対レベルを、添付されている図９に示す。
【００７４】
７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるスクアレンの相対レベルを、添付されている図１０に示す。
【００７５】
短鎖脂肪酸の相対レベルを、添付されている図１１に示す。
【００７６】
Ｃ１６／１８脂肪酸もその１４日のサンプルにおいて検出された。種々の揮発性脂肪酸の存在を示す、本明細書中に要約されているデータは、該無限増殖性細胞株がアポクリン腺の機能を成功裏に模擬したことを更に示している。
【００７７】
インヒビター研究
悪臭前駆体化合物の産生および細胞増殖は、アンドロゲン代謝酵素を阻害することが知られている化合物の作用によりモジュレーションされると予想されるであろう。細胞の増殖および悪臭前駆体化合物の産生は、アンドロゲン代謝酵素を又は直接的にアンドロゲン受容体を阻害することが知られているアンタゴニストの培地の添加により抑制されるであろう。そのような化合物は、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺および培養の両方における臭気前駆体分子の合成または分泌を軽減すると予想されるであろう。そのような化合物には以下のものが含まれる（それらに限定されるものではない）。
１７α−置換ベンジルエストラジオール、
三環式クマリンスルファマート、
エストロン−３−Ｏ−スルファマート、
三環式オキセピンスルファマート、
２−メトキシエストロン−３−Ｏ−スルファマート、
置換クロメノンスルファマート、
１７α−ベンジル（または４’−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）エストラ−１，３，５（１０）−トリエン、
１７β−（Ｎ−アルキルカルバモイル）−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−Ｏ−スルファマート、
トリロスタン、
シアノケトン、
シプロテロンアセタート、
ノルゲストレル、
ノルエチンドロン、
チアゾリジンジオン、
１６−（ブロモアルキル）−エストラジオール、
フラボノイド、
イソフラボノイド、
リグナン、
トリフルオロメチルアセチレン性セコエストラジオール、
エストラジオールの６β−（チアヘプタンアミド）誘導体、
１７位にスピロ−ガンマ−ラクトンを含有するエストロン、
７α−チオアルキルおよび７α−チオアリール、
スピロノラクトンの誘導体、
Ｎ−ブチル−Ｎ−メチル−１１−（３’−ヒドロキシ−２１’，１７’−カルボラクトン−１９’−ノル−１７’α−プレグナ−１’，３’，５’（１０’）−トリエン−７’α−イル）−ウンデカンアミド、
１，４−アンドロスタジエン−１，６，１７−トリオン、
アンドロステロン３３−置換誘導体、
４−アザステロイド（ＭＫ３８６）、
６−アザステロイド性１７β−カルボキサミドトリアリール、
８−クロロ−４−メチル−１，２，３，４，４ａ，５，６，１０ｂ−オクタヒドロ−ベンゾ［ｆ］キノリン−３（２Ｈ）−オン（ＬＹ １９１７０４）、
６−［４−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルバモイル）フェニル］−Ｎ−メチル−キノリン−２−オン５）、
ベンゾ［ｃ］キノリジン−３−オン、
エピカテキン−３−ガラート、
エピガロカテキン−３−カラート、
スラミン、
亜鉛、
アセライン酸、
６−［４−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルバモイル）フェニル］−１Ｈ−キノリン−２−オン ４
４−［３−［５−ベンジル−８−（２−メチル）プロピル−１０，１１−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボキサミド］フェノキシ］酪酸、
ツロステリド、
ＭＫ−４３４、
ジヒドロフィナステリド、
クロルマジノンアセタート、
ＴＺＰ−４２３８、
エプリステリド（ＳＫ＆Ｆ １０５６５７、ＯＮＯ−９３０２）、
１７α−エストラジオール、
１７−（５’−イソオキサゾリル）アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン、
Ｎ−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロフェニル−プロピル）−３−オキソ−４−アザ−５α−アンドロスタ−１−エン−１７β−カルボキサミド（ＰＮＵ １５７７０６）、
デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）、
オキセンドロン（ＴＳＡＡ−２９１：１６β−エチル−１７β−ヒドロキシ−４−エストレン−３−オン）、
１９−ノル−１０−アザステロイド、
ステロイドＤ環に結合したオキシム基を含有する、プロゲステロンに基づくステロイド、
ベンゾキノリノン、
セレノア・レペンス（Ｓｅｒｅｎｏａ ｒｅｐｅｎｓ）抽出物ペルミキソン、
アルトカルプス・インシウス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｃｉｓｕｓ）、
アリザリン、
クルクミン、
フェナジン誘導体、
ミリストオレイン酸、
γ−リノレン酸、
４−［３−［３−［ビス（４−イソブチルフェニル）−メチルアミノ］ベンゾイル］−１Ｈ−インドール−１−イル］酪酸（ＦＫ １４３）、
フルタミド、
スピロノラクトン。
【００７８】
多数の化合物が皮膚における細胞（皮脂腺のような皮膚付属器に由来する細胞を含む）の増殖を軽減することが示されている。そのような化合物は、アポクリン細胞と接触すると、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺および培養の両方における臭気前駆体分子の合成および分泌を軽減すると予想されるであろう。そのような化合物には、１３−シス−レチノイン酸、レチノイン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によるヒトアポクリン細胞株ＡＳＧ５の超微細構造分析
サンプル調製
既に記載されているとおりに、９５％空気／５％ＣＯ２ 加湿インキュベーター中、ＭＥＧＭ内で３７℃でＡＳＧ５細胞継代番号４７を培養した。それぞれ３日間および１４日間の温置の後、細胞を集めた。固定前に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）中で２回洗浄した。
【００８０】
透過型電子顕微鏡法
洗浄された細胞培養を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中の３％ グルタルアルデヒド中で室温で１時間固定した。該試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中、５分間の３回の期間にわたって洗浄した。初回固定後、試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中の１％ 四酸化オスミウム中で室温で１時間固定した。該試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中、５分間の３回の期間にわたって再び洗浄した。ついで試料を一連の勾配のエタノールにより脱水した。該細胞をルフト（Ｌｕｆｔ）のエポン（Ｅｐｏｎ）樹脂中に包埋し、６０℃で４８時間重合させた。該塊を、厚さ約１２０ｎｍの切片を与えるように設定されたＲｅｉｃｈｅｒｔ“Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ”Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ上で切片化した。該切片を２００メッシュの六角形細棒銅格子上に拾い上げた。該切片を酢酸ウラニル、ついでクエン酸鉛（Ｌｅｉｃａ ＥＭ染料上）中で染色した。染色された切片を、１２０ｋＶで作動させたＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０透過型電子顕微鏡で検査した。イメージを．ｔｉｆファイルとしてデジタル的に記録し、本明細書においては、３日齢培養細胞に関しては図１２から１５、そして１４日齢培養細胞に関しては図１６および１７として示す。
【００８１】
結果
図１２、１３および１６に示す細胞は、培養内の上皮細胞に典型的な丸い又は「丸石状」外観を示した。該細胞の分泌特性は、細胞質全体にわたる「Ｓ」として示される多数の分泌顆粒（図１２から１７）の存在と共に、「Ｍ」として特定される多数の微小絨毛（図１２、１３、１４、１６および１７）、および内腔膜における「Ａ」として示される先端（ａｐｉｃａｌ）ブレブ（図１２、１５および１６）の存在により実証された。先端細胞質（すなわち、微小絨毛「Ｍ」および先端ブレブ「Ａ」）の小さな部分の切断はアポクリン分泌過程を構成する（Ｍｏｎｔａｇｎａら（１９５３）Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．Ｖ．Ａｘｉｌｌａｒｙ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｓｗｅａｔ ｇｌａｎｄｓ．Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．，９２：４５１−４７０）。Ｂｅｌｌ（１９７４）Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｘｉｌｌａｒｙ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｇｌａｎｄｓ ａｆｔｅｒ ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，６３：１４７−１５９に従いＩ型顆粒とＩＩ型顆粒とを識別することは不可能であったが、すべての細胞は、「Ｓ」として示される多数の分泌顆粒を含有していた（図１２から１７）。該顆粒は、おそらくは小さな脂質滴を含有する著しく電子不透過性である粒子を含有していた。ほとんどの細胞において、「Ｖ」として示される多数の「空」小胞が観察された（図１２、１３、１４、１６および１７）。これは、おそらく、小胞の内容物が失われた固定過程の結果であろう。そのような小胞は分泌の過程への関与に利用されうる。図１３および１６における細胞は外観においてやや平らであり、「Ｎ１」で示される核小体を明らかに示した。
【００８２】
３日齢および１４日齢のＡＳＧ５培養からの全ての細胞において、先端ブレブ「Ａ」、内腔微小絨毛「Ｍ」および多数の分泌顆粒「Ｓ」が観察され、このことは、これらの細胞が典型的な活性アポクリン分泌形態学を示すことを証明している。これらの知見はＡＳＧ５細胞株のアポクリン特性を更に立証し、ヒト腋窩アポクリン汗腺の機能的に典型的な細胞モデルとしてのこの細胞株の有用性の追加的な証拠を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポクリン細胞株、特に、長期増殖を示すアポクリン細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクリン腺に加えて、アポクリン腺は、ヒトの皮膚上で皮膚細菌集団にさらされると悪臭性化合物に変換される種々の脂質性およびアミノ酸溶質（ステロイドおよび短鎖脂肪酸を含む）を含有する水性流体を分泌する。換言すれば、アポクリン腺はヒトの発汗に関与している。皮膚上の悪臭性化合物の生成を抑制するための手段を見出すために、相当な研究が行われ続けているが、これは、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）、すなわちヒトの皮膚におけるアポクリン腺の機能を厳密に模擬するアポクリン細胞株が存在しないことにより妨げられている。後者の開発は非常に重要であろう。なぜなら、それは、本明細書に記載されている利益の１以上を提供するからである。それは、インビボと比べて非常に多くのインビトロの研究の実施を可能にするであろう。これは、（ｉ）発汗を招くアポクリン腺内の輸送メカニズムを特定するのを補助し、（ｉｉ）悪臭性化合物の形成を減少させる物質のスクリーニングおよび特定を促進し、（ｉｉｉ）それらの有効濃度（すなわち、身体に局所的に適用された場合に防臭剤として作用するのに要求される濃度）を決定するのを助けるであろう。適当な細胞株の存在は、発汗自体以外の新規腺機能を特定する機会をも提供するであろう。
【０００３】
長期培養内で他の分泌細胞を維持するための試みと同様に、アポクリン培養から得られた初代細胞株は、アポクリン腺に特徴的な形態学的、表現型的および／または機能的特徴を失う前に数回しか継代されていない。
【０００４】
Ｒ Ｗｉｃｈｅｒらによる論文（Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ ３５，ｐｐ３４２−３５０，題名“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｒａｔ ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｌａｎｄ”）はラット由来のアポクリン細胞に関するものであり、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。さらに、機能性を示すためにそこにおいて使用されている細胞マーカーは必ずしもヒトアポクリンモデルに関連したものではない。さらに、該著者は、一見したところ、凍結および解凍後にそれらの細胞を継代することを狙っていたのではなく、したがって、それらの長期増殖能を実証しなかった。
【０００５】
Ｚ．Ｍａｒａｓらの論文（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｖｏｌ ３５，Ｎｏｖ−Ｄｅｃ（１９９９），ｐｐ６０６−６１１，題名“Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｏｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｖｉｎｅ Ａｐｏｃｒｉｎｅ Ｇｌａｎｄ；Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｕｃｔａｌ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ”において公開）はヒツジ由来のアポクリン細胞に関するものであり、同様に、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。
【０００６】
Ｄｉｅｔｅｒ Ｃ．Ｇｒｕｅｎｅｒｔらの論文（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ２６，Ａｐｒｉｌ（１９９０），ｐｐ４１１−４１６，題名“Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｏｉｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”において公開）はアポクリン細胞ではなくエクリン細胞に関するものであり、したがって、長期増殖を示すヒト由来のアポクリン細胞株を開示していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ ３５，ｐｐ３４２−３５０
【非特許文献２】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｖｏｌ ３５，Ｎｏｖ−Ｄｅｃ（１９９９），ｐｐ６０６−６１１
【非特許文献３】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ２６，Ａｐｒｉｌ（１９９０），ｐｐ４１１−４１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
本発明の目的は、長期増殖を示し継代培養により培養内で維持されうる、アポクリン腺の発汗機能を模擬するアポクリン細胞株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、長期増殖を示す培養アポクリン細胞株を提供する。
【００１０】
この場合の増殖は、該細胞が、適当な培地内で培養された場合に分裂する能力を保有することを示すものであるが、該細胞株が不死化されていることを示唆するものではない。
【００１１】
本発明の場合の長期は、該細胞が、少なくとも３０回の継代培養（継代）後に増殖するそれらの能力を保有することを示す。実際には、そのような長期増殖が細胞株により達成された場合、それは、一般に、少なくとも１００または１０００回の継代にわたる増殖を示しうる。そのような多数回の継代にわたる増殖は、少なくとも本発明の培養アポクリン細胞株の実用的な目的には、無限増殖を示す。
【００１２】
特に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＳＰ４ ０ＪＧ，Ｅｎｇｌａｎｄに寄託番号０７０２１３０１で寄託されたヒトアポクリン細胞株ＡＳＧ５を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】外植の９日後にアポクリンコイルから成長している細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】増殖中のアポクリン細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２】アミロリドの存在下の初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるピーク増加を示している。
【図３】初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるＩＳＣのピーク増加を示している。
【図４Ａ】ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である（アミロリド（１０μＭ）での先端前処理）。
【図４Ｂ】ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である（１ｍＭ フロセミドでの先端前処理）。
【図５】産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示している。
【図６】無限増殖性アポクリン腺細胞株において発現されることが示されている遺伝子が与えられた場合に明らかにされうるステロイド合成経路の概要図である。
【図７】産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示している。
【図８】該３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの相対レベルを示している。
【図９】７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるコレステロールの相対レベルを示している。
【図１０】７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるスクアレンの相対レベルを示している。
【図１１】短鎖脂肪酸の相対レベルを示している。
【図１２】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１３】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１４】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１５】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（３日齢培養細胞）図である。
【図１６】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（１４日齢培養細胞）図である。
【図１７】細胞培養染色切片の透過型電子顕微鏡（１４日齢培養細胞）図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態および形態学的特徴の詳細な説明
本明細書は、長期増殖性アポクリン細胞株の作製、そしてついで、電気生理学的、分子的および生化学的技術によるその特徴づけ及び初代培養アポクリン細胞との比較を説明する。少なくとも長期増殖を示したアポクリン細胞株ＡＳＧ５に対する明確な関連性を有する臭気前駆体化合物の分析およびステロイド合成に特別の関心が払われる。
【００１５】
アポクリン腺の単離および初代培養
長期増殖能を示したアポクリン細胞株は以下の方法により得られた。関連倫理委員会からの許可および被験者のインフォームドコンセントを予め得て３０から７０歳の女性の腋窩皮膚を切除することにより、全アポクリン腺を単離した。該切除法により幾つかのアポクリン汗腺を断片化し、それらの断片から細胞を培養することができた。顕微鏡的観察およびニュートラルレッド（Ｎｅｒｕｔｒａｌ Ｒｅｄ）取り込み実験は、切除により単離されたアポクリン腺が、純粋に、管から分離されたコイルよりなることを示した。約５０ｍｍ×５ｍｍの腋窩皮膚のサンプルから、平均して１０から１００個のアポクリンコイルが単離された。
【００１６】
ついで、ＬｅｅらによりＪ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．８３：１０３−１１８，１９８６において提示されている変法を用いて、コラーゲンＩＩ型（２ｍｇ ｍｌ−１）を含有するウィリアムス・イー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ）培地（本明細書においてはＷＥＭと略称される）内で５％ ＣＯ２／相対湿度９５％の空気中、該アポクリンコイルを３０分間温置した。ついで、１０ｎｇ ｍｌ−１ 上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１０μｇ ｍｌ−１ インスリン、１０ｎｇ ｍｌ−１ ヒドロコルチゾン、１０μｇ ｍｌ−１ ホロトランスフェリン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ ｍｌ−１ ペニシリンおよび１００μｇ ｍｌ−１ ストレプトマイシンで補足された酵素非含有ＷＥＭ中で該コイルを洗浄した。
【００１７】
１０ｎｇ ｍｌ−１ ＥＧＦ、１０μｇ ｍｌ−１ インスリン、０．５μｇ ｍｌ−１ ヒドロコルチゾン、３０μｇ ｍｌ−１ ウシ下垂体抽出物、５０μｇ ｍｌ−１ ゲンタマイシンおよび５０ｎｇ ｍｌ−１ アンホテリシンで補足された１ｍｌの乳房上皮増殖培地内で２５ｃｍ２ フラスコ当たり約１５個のアポクリン腺をプレーティングした。９５％ 空気／５％ ＣＯ２ 加湿インキュベータ中で３７℃で２４時間の温置の後、さらに３ｍｌのＭＥＧＭを各フラスコに加え、ついで該培地を３日ごとに交換した。
【００１８】
無限増殖細胞株を示す長期増殖性アポクリン細胞株（ＡＳＧ５）の作製および維持
初代汗腺の単離および培養
前記のとおり、全無傷ヒトアポクリン汗腺を切除により単離した。アポクリン腺の組織学的検査は、切除が、短い吸収管を完全に取り出して分泌性コイル部分のみを無傷のまま残したことを示した。単離された腺を補足ＭＥＧＭ内でプレーティングした。プレーティングされた腺の約５０％が枝を生成し、これは２から３日後に常套的に観察された。枝は、２０日間まで増殖し続け、典型的な「丸石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）」上皮細胞形態学を示した（（Ａ）外植の９日後にアポクリンコイルから成長している細胞、および（Ｂ）増殖中のアポクリン細胞の位相差顕微鏡写真を示す図１に示すとおり）。培養の初期段階において、枝が観察される前に、伸長した繊維芽細胞状の形態学を示す少数の細胞が外植腺の周囲にしばしば観察された。しかし、これらの細胞はＭＥＧＭ内では増殖しなかった。
【００１９】
アポクリン分泌コイルの初代培養から増殖性アポクリン細胞株を誘導した。ＭＥＧＭ内で７日間の培養の後、強力なホルボールエステルであるＴＰＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３ アセタート；旧Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を２５０ｎＭの濃度で該培地に加えた。ホルボール（ホルボールは１，１ａ，１ｂ，４，４ａ，７ａ，７ｂ，８，９，９ａ−デカヒドロ−４ａ，７ｂ，９，９ａ−テトラヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−１，１，６，８−テトラメチル−５Ｈ−シクロプロパ［３，４］ベンゾ［１，２−ｅ］アズレン−５−オンとも称される）のエステルの有効濃度を該培地が含有することは、長期増殖能を示す細胞株を入手する方法の重要な特徴である。一般に、該エステルは、少なくとも脂肪族置換基、例えば長鎖アルキル（Ｃ７からＣ２４）および場合によっては更に短鎖アルキル（Ｃ２からＣ６）を、特に好適には１２および／または１３位に含む。したがって、本発明における方法は、無限増殖を示すアポクリン細胞株の調製を可能にする。
【００２０】
ＴＰＡは、添加の３から４日後に、未熟多層化を誘導した。しかし、上部の分化した層は反復洗浄により除去され、フラスコに尚も付着している細胞の増殖性単層が残った。該増殖性層の細胞を９６ウェルプレート内に継代して、クローン細胞株を作製した。細胞を維持し、継代し、ＴＰＡを含有するＭＥＧＭ内で約２ヶ月間、成長させ続けた。この期間の後、細胞をＭＥＧＭ単体において培養し、増殖の継続に関してモニターした。最初は多数のサブクローンが成長し続けたが、次の１０回の継代の終わりまでに、大多数が老化し始めていた。１つの培養、特にＡＳＧ５は成長し続け、現在も培養内で維持されており、成長速度の減少の徴候を伴うことなく４０継代以上増殖している。これは、無限の増殖能を示していることの指標となる。この培養はＴＰＡの非存在下で増殖し続け、低温保存においても生存可能であり、安定であるとみなされている。比較すると、初代アポクリン汗腺は最大で１ヶ月および４継代にわたって成長し、低温保存においては生存しない。長期増殖を示す本発明において継代された細胞培養は、例えばピークアゴニスト応答において、初代アポクリン培養に形態学的に類似している。したがって、そのような細胞培養は、インビトロで或る物質が防臭特性を示すかどうか及び／又はその度合を実証するために使用可能であり、すなわち、個人用防臭剤として作用しうる。
【００２１】
電気生理学のためのＡＳＧ５アポクリン細胞の調製
１３から１８日後、コンフルエントなＡＳＧ５培養をＴｒａｎｓｗｅｌｌコラーゲンコート化透過性支持体（面積０．３３ｃｍ２，Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号３４９５，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）上に継代した。これは２％ ＥＤＴＡ中で２０分間、およびそれに続くトリプシン（０．５％）−ＥＤＴＡ（０．２％）中で約５分間の温置を含むものであった。３×１０５個の細胞を、ＷＥＭで補足された各Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に移した。該Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ支持体を２４ウェルプレート内の０．６ｍｌの同じ培地中に懸濁させた。初代培養には、初回継代細胞のみを実験に使用した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養物を浸す培地は２日ごとに交換した。
【００２２】
電気生理学
オーム計に接続された「箸（ｃｈｏｐｓｔｉｃｋ）」電極（ＷＰＩ，Ａｌｒｅｓｆｏｒｄ，Ｈａｎｔｓ，ＵＫ）を使用して、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の上皮を隔てる経上皮抵抗性（ＴＥＲ）をモニターした。湿らせたフィルターブランクに関する測定値を引き算することにより、ＴＥＲを評価した。ピークＴＥＲにおいて、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ支持体をウッシング室（Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）内にマウントした。上皮を、修飾されたクレブスバッファー中に浸し、酸素化し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２、３７℃、ｐＨ７．４に維持した。該バッファーは、ＮａＣｌ，１１７；ＫＣｌ，４．７；ＣａＣｌ２，１．５；ＭｇＳＯ４，１．２；ＮａＨＣＯ３，２５；およびグルコース，１１．１（ｍＭ）よりなるものであった。電圧／電流クランプに接続された電圧および電流電極（それぞれ、カロメルおよび銀／塩化銀，ＡＢＢ Ｋｅｎｔ Ｔａｙｌｏｒ，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｓ，ＵＫ）を、３Ｍ 塩化カリウムに溶解した寒天を含有する橋を介して該浴内に伸長させた。
【００２３】
電圧電極をＴｒａｎｓｗｅｌｌの非存在下で平衡化し、任意ＤＣ電流の注入により電圧電極間の流体抵抗を補償した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌをマウントした後、該上皮を短絡させ、該電流を典型的には１５分間安定化させた。アポクリン物質が稀少であることを考慮して、典型的には、Ｂｒａｙｄｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，４０５：６５７−６７５、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，７７；８６３−８７１およびＳｈｅｎら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２６６：Ｌ４９３−５０１に開示されているとおりに、薬物を連続的に加え、短絡電流（ＩＳＣ）の変化を記録した。実験の継続時間は典型的には１５から６０分間であった。オームの法則を用いて、通常は、電圧を±１０ｍＶに固定し、これを達成するのに要した電流を測定することにより、ＴＥＲを評価した。特に示さない限り、先端側に加えられたアミロリドを除き、説明に挙げられている全ての薬物は基底側部に加えられた。アミロリドは上皮Ｎａ＋チャネル（ＥＮａＣ）およびＮａ＋／Ｈ＋交換体のインヒビターである。
【００２４】
クレブスバッファーの修飾
グルコン酸ナトリウムがＮａＣｌで、グルコン酸カリウムがＫＣｌで、そしてＣａＳＯ４がＣａＣｌ２で置換されたクレブスバッファー中で塩化物イオン（クロリド）置換実験を行った。浸透圧を維持するための代用物として１１．１ｍＭ マンニトールを使用して、グルコース非含有実験を行った。ＭｇＣｌ２がＭｇＳＯ４に取って代わるよう、カリウムチャネルのインヒビターとしてバリウムを使用した実験を硫酸イオンの非存在下で行った。
【００２５】
基底経上皮特性
増殖性アポクリン培養物を透過性支持体上に継代し、ピークＴＥＲにおいてウッシング室（Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）に移した。そのような増殖性培養に関する平均ＴＥＲは３９５±４０Ωｃｍ２であった（Ｐ＜０．００１）。増殖性アポクリン培養物に関する静止短絡電流（ＩＳＣ）は４．５±０．８μＡ ｃｍ−２であった（Ｐ＜０．００１）。静止経上皮電位差（ＴＥＰＤ）は、先端陰性（ａｐｉｃａｌｌｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ）の増殖性アポクリン培養に関しては１．０ｍＶであった。
【００２６】
以下の表１に要約されている静止ＩＳＣに対するイオン輸送インヒビターの効果
増殖性培養における静止ＩＳＣは１０μＭ アミロリドに対して感受性であった。このことは、ナトリウム再吸収が、培養された汗腺上皮におけるイオン輸送の重要な構成要素であることを証明している。先端に適用されたアミロリド（１０μＭ）は増殖性アポクリン培養において静止ＩＳＣを４．５±１．０μＡ ｃｍ−２減少させた（ｎ＝２０，Ｐ＜０．００１）。用量反応曲線は、アミロリドのＩＣ５０が２から４μＭであり、１０μＭ アミロリドが最大上用量であったことを示している。
【００２７】
上皮Ｎａ＋−Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送体であるＮＫＣＣｌ（ひいては経上皮塩化物イオン輸送）のインヒビターであるフロセミドの効果もアポクリン培養において調べた。１ｍＭ フロセミドの基底側部添加は形質転換培養において静止ＩＳＣを０．８±０．３０．２μＡ減少させた（ｎ＝２０，Ｐ＜０．００１）。
【００２８】
【表１】
【００２９】
アゴニスト応答におけるナトリウム再吸収の役割
アゴニスト応答におけるナトリウム再吸収の役割を決定するために、初代アポクリンおよび増殖性アポクリン培養を１０μＭ アミロリドで前処理した。添付されている図２は、アミロリドの存在下の初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるピーク増加を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養の基底側部に該アゴニストを加えた。各該図における棒グラフはｎ＝１０の最小値を表している。先端アミロリド（１０μＭ）の存在下の短絡電流におけるピーク増加が示されている。以下のアゴニストを基底側部に加えた：カルバコール（ＣＣｈ；２０μＭ）、イソプレナリン（Ｉｓｏ；１０μＭ）、Ｌ−ブラジキニン（ＬＢＫ；１７０ｎＭ）、ヒスタミン（Ｈｉｓ；２００μＭ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ；１００μＭ）。不対スチューデントｔ検定およびウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定を用いて、有意性を試験した。
【００３０】
図２は、アミロリド前処理が長期増殖性アポクリン細胞株ＡＳＧ５においてＣＣｈ、ＨｉｓおよびＡＴＰに対する応答を有意に減少させたことを示しており、このことは、ナトリウム再吸収がこれらの応答の構成要素であることを示唆している。
【００３１】
図３は、初代アポクリン、エクリンおよび増殖性アポクリン培養におけるＩＳＣのピーク増加を示している。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上の培養の基底側部にアゴニストを加えた。短絡電流におけるピーク増加が示されている。以下のアゴニストを基底側部に加えた：ＣＣｈ（２０μＭ）、Ｉｓｏ（１０μＭ）、ＬＢＫ（１７０ｎＭ）、Ｈｉｓ（２００μＭ）およびＡＴＰ（１００μＭ）。
【００３２】
図４Ａおよび４Ｂは、ＡＳＧ５細胞におけるカルバコールに対する応答に対するイオンチャネルインヒビターの効果に関する代表的なＩＳＣ記録（トレース）である。図４Ａは、アミロリド（１０μＭ）での先端前処理、ならびにＣＣｈ（２０μＭ）の応答に対する１ｍＭ フロセミド（Ｆｒｕ）および５０μＭ 塩化バリウム（Ｂａ；マキシ−Ｋチャネルブロッカー）の添加の効果を示す。図４Ｂは、１ｍＭ フロセミドでの先端前処理、ならびにＣＣｈ応答に対するアミロリドおよび塩化バリウムの効果を示す。
【００３３】
図４Ａにおける増殖性アポクリン培養の代表的トレースは、図３におけるアゴニスト刺激に関する観察値と比較して、アミロリド前処理後にカルバコール刺激が減少することをも示している。
【００３４】
４つの場合において、アポクリン培養の初代培養および継代がそれらの電気生理学的特性に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、全アポクリン分泌コイルを透過性支持体上に直接的に外植した。調べた培養においては、アミロリドの存在下であるか非存在下であるかには無関係に、基底およびアゴニスト刺激電気生理学的特性は初代培養と有意には異ならなかった（データ非表示）。
【００３５】
一過性アゴニスト応答における経上皮塩化物イオン輸送の役割
初代および増殖性アポクリン培養におけるアゴニスト誘導性応答のイオン的基礎を更に特徴づけるために、経上皮塩化物イオン輸送の役割を調べた。塩化物イオン（クロリド）非含有条件下、初代および増殖性アポクリン培養に関する静止ＩＳＣは、それぞれ、６．０±０．８μＡ ｃｍ−２および３．１±０．６μＡ ｃｍ−２であった。静止ＴＥＰＤは初代培養に関しては−０．９ｍＶ、そして増殖性培養に関しては−１．８ｍＶであった。１０μＭ アミロリドの添加は基底ＩＳＣを初代培養においては３．６μＡ ｃｍ−２、そして増殖性培養においては２．５μＡ ｃｍ−２減少させた。
【００３６】
カルバコール、ヒスタミンおよびＡＴＰに対する応答は、塩化物イオンの存在下の同一実験と比較して、初代アポクリン培養および増殖性アポクリン培養の両方において有意に減少し（表２）、このことは、塩化物イオン輸送がアゴニスト応答の媒介において重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、図４Ｂは増殖性培養からの代表的トレースを示し、これは、フロセミドでの前処理が、図３における値と比較して、カルバコールに対する応答の大きさを減少させることを示している。アゴニスト刺激後のフロセミドの添加は、初代アポクリン培養および形質転換アポクリン培養の両方において、応答における迅速な減少を誘導し、このことは塩化物イオンの取り込みの調節におけるＮＫＣＣｌの役割を示している（表３）。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
アゴニスト応答は、塩化物イオン含有バッファー中のアミロリド前処理と比較して、アミロリド前処理で有意に減少したが、特に増殖性培養においてはそれらは完全に阻止されたわけではなく、このことは、他のイオン輸送経路がこれらの応答において何らかの役割を果たしている可能性があることを示唆している（表４）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
総合すると、これらの結果は、該増殖性細胞株が初代培養と同じ特性を示し続けたことを示している。
【００４２】
長期増殖性アポクリン腺細胞株におけるステロイド産生
ヒト皮膚およびその付属器は、ホルモンの代謝および合成に関与するものを含む種々の代謝機能の能力を有する。アンドロゲン（性ステロイドホルモン）は、多数の酵素変換を要する生合成経路において親前駆体コレステロールから合成される。思春期の間にアポクリン腺が機能的になる際に、アンドロゲンが腺活性のモジュレーションにおいて何らかの役割を果たしているらしい。これは、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺の分泌細胞においてアンドロゲン受容体が検出されていることにより更に裏づけられている（Ｂｅｉｅｒら，（２００５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：６１−６５）。ステロイドの局所的またはイントラクリン形成は細胞機能の媒介において重要な役割を果たす可能性があるため（Ｌａｂｒｉｅ，Ｆ．ら（１９９１），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７８：１１３−１１８）、原因となる転写産物の発現を、本発明における無限増殖性アポクリン細胞株における活性アンドロゲンおよびエストロゲンならびにそれらの関連受容体の形成に関して調べた。
【００４３】
該研究の材料および方法
化学物質
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび分子マーカーＩＩＩをＲｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを供給業者の推奨に従い使用した。すべての他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，ＵＫから入手した。
【００４４】
株、プラスミド、培地および培養条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を全てのクローニング法における宿主株として使用した。ポリＴ突出部を含有する予め消化されたベクターｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、供給業者の説明に従い使用した。適当な選択圧（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）で補足されたＬＢ培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）内で回転振とう機上、３７℃で細菌を培養した。
【００４５】
細胞材料
無限増殖を示す長期増殖アポクリン腺細胞を前記のとおりに成長させた。クローニングのために、３７℃で１０日間の成長の後、細胞を集めた。
【００４６】
オリゴヌクレオチド合成および配列決定
使用した全てのオリゴヌクレオチドはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｌｔｄ，Ｐａｍｐｉｓｆｏｒｄ，ＵＫにより合成された。汎用Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して配列決定を行った。
【００４７】
プラスミドＤＮＡの単離
クローニングおよび配列決定用のプラスミドＤＮＡを得るために、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）ミニプレップキットを使用した。
【００４８】
クローニング
ステロイドアンドロゲン代謝に関与する転写産物の断片を、無限増殖性アポクリン腺細胞に由来するｃＤＮＡからクローニングした。Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫのＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）−４ＰＣＲキットを使用して、該細胞からＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄｔ）を使用して、Ａｍｂｉｏｎ ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（商標）を使用して１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。増幅のために用いたＰＣＲ反応プログラムは以下のとおりであった：１サイクル（９５℃で１２０秒間）、３０サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間または６０秒間）、１サイクル（７２℃で７分間）（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した）。各転写産物からの断片をクローニングするために使用したプライマーの概要を表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示したプライマーペアが設計された遺伝子断片の全てが検出可能であった。添付されている図５は、産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示す。
【００５１】
図５は以下の遺伝子断片の発現を示す：１．ステロイドスルファターゼ；２．３βヒドロキシ−Δ−５−ステロイドデヒドロゲナーゼ１；３．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ３；４．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ５；５．ヒドロキシステロイド１７β−デヒドロゲナーゼ７；６．５αレダクターゼＩ；７．ＣＹＰ１９Ａ１アロマターゼ；８．アンドロゲン受容体；９．エストロゲン受容体β；Ｍ．ＤＮＡマーカーＩＩＩ。
【００５２】
ついでこれらのＰＣＲ産物を、配列決定のためにＴＯＰＯベクター内にクローニングした。各クローン化断片の実体を確認するために、各ＰＣＲ産物上で配列決定を行った。該遺伝子配列決定の結果を以下に示す。
【００５３】
【化１】
【００５４】
これらの結果は、無限増殖性アポクリン腺細胞株が、アンドロゲンおよびエストロゲン合成に必要な多数の遺伝子を発現していることを明らかに示している。添付された図６は、無限増殖性アポクリン腺細胞株において発現されることが示されている遺伝子が与えられた場合に明らかにされうるステロイド合成経路の概要を示す。また、該細胞は、これらのアンドロゲンおよびエストロゲンの産生に対する細胞内応答を媒介するのに必要な受容体、すなわち、アンドロゲンおよびエストロゲンβ受容体をも発現する。興味深いことに、エストロゲンα受容体の発現に関する転写産物は検出できなかった（データ非表示）。腋窩皮膚断片内のアポクリン腺分泌細胞において、両受容体型に対する免疫組織化学的染色を用いて、エストロゲンβ受容体は検出できるが、エストロゲンα受容体は検出できないことを示したこれまでの研究（Ｂｅｉｅｒ，Ｋ．ら（２００５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：６１−６５）に、これは合致している。同じ研究はまた、アポクリン腺分泌細胞におけるアンドロゲン受容体の存在を示した。
【００５５】
添付されている図６におけるデータは、無限増殖性アポクリン細胞株が、初代培養およびインビボで観察された分泌性アポクリン腺細胞のステロイド産生特性の多数を保有することを示している。この細胞株は、アポクリン腺におけるステロイド代謝および腺活性の調節におけるステロイドの役割を研究するための優れた手段を提供する。また、該細胞株は、これらの細胞におけるステロイド産生経路の介入を介した腺活性の調節における化合物の効力を評価するための非常に重要な手段として用いられるであろう。
【００５６】
無限増殖性アポクリン腺細胞株におけるアポクリン分泌活性の細胞マーカー
アポクリン汗腺の主要機能は、情動的刺激に直接的に応答して毛包の管を介して皮膚表面に運搬される、脂質に富む分泌物を産生することである。該分泌物は無臭であるが、細菌による分解を受け、これにより腋窩悪臭が生じる。アポクリン腺の分泌機能は、これらの鍵過程に関与する多数のタンパク質に関連している。ＡＢＣＣ１１タンパク質は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのようなプリンおよびピリミジンヌクレオチド類似体の流出に関与するＡＴＰ結合カセット輸送体のファミリーに属する（Ｇｕｏら，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２９５０９−２９５１４）。このタンパク質はヒトの耳垢アポクリン腺における耳垢の分泌に関連づけられている（Ｙｏｓｈｉｕｒａら，（２００６）Ｎａｔ．Ｇｅｎ．，３８：３２４−３３０）。ヒトの耳垢は、通常、乾燥型および湿潤型よりなる。乾燥耳垢は東アジアでよく見られ、湿潤耳垢は他の集団でよく見られる。ＡＢＣＣ１１遺伝子におけるＳＮＰ（５３８Ｇ→Ａ）は耳垢型の決定をもたらすとみなされる。Ａ対立遺伝子を有する細胞は、Ｇ対立遺伝子を有する細胞より低い、ｃＧＭＰに関する排出活性を示す。Ａ対立遺伝子頻度は、世界的な北−南および東−西の下方性地理的勾配を示す。世界的には、それは中国人および韓国人において最高であり、これらにおいては、これらの地域における種々の民族集団内で乾燥耳垢型が保有されている。腋窩臭のレベルの増加は湿潤型耳垢に関連づけられ、これは腋窩アポクリン腺機能の直接的な結果であると考えられる。
【００５７】
アポクリン腺分泌において重要な役割を果たすことが示されているもう１つのタンパク質は、Ｓｐｉｅｌｍａｎ，Ａ．Ｉ．（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，５０：４０−４７によるアポリポタンパク質Ｄである。このタンパク質は、豊富に存在する臭気分子Ｅ−３−メチル−２−ヘキサン酸（３Ｍ２Ｈ）の担体ビヒクルとして作用することが示されている。アポクリン分泌において、３Ｍ２Ｈは、アポクリン分泌臭気結合タンパク質１および２（ＡＳＯＢ１およびＡＳＯＢ２）の２つのタンパク質が結合した皮膚表面に運搬されることを、研究は示している。後にＡＳＯＢ２タンパク質は、リポカリンとしても公知の担体タンパク質のα２μ−ミクログロブリンスーパーファミリーの公知メンバーであるアポリポタンパク質Ｄ（ａｐｏＤ）と同定された（Ｚｅｎｇら，（１９９６），９３：６６２６−６６３０）。ａｐｏＤに対する免疫反応性は腋窩組織断片におけるアポクリン腺に局在化されており（Ｓｐｉｅｌｍａｎら，（１９９８）１３４，８１３−８１８）、このことは、３Ｍ２Ｈの糖タンパク質担体の少なくとも１つがアポクリン腺に存在することを示している。
【００５８】
グロス（Ｇｒｏｓｓ）嚢胞症流体は、ＧＣＤＦＰ−１５を含む幾つかの糖タンパク質から構成される、乳房からの病的分泌物である。ＧＣＤＦＰ−１５は、アポクリン異形成上皮裏層乳腺嚢胞に及び腋窩、外陰部、眼瞼および耳管のアポクリン腺に局在化されている（Ｍａｚｏｕｊｉａｎら，１９８３ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１０：１０５−１１２）。ＧＣＤＦＰ−１５は、精嚢、唾液腺および汗腺において特定されているＧｐ１７／分泌アクチン結合タンパク質（ＳＡＢＰ／外耳下糖タンパク質（ＥＰ−ＧＰ））と同一であり（Ａｕｔｉｅｒｏら，（１９９１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９７：２６８−２７１）、このタンパク質はプロラクチン誘導性タンパク質（ＰＩＰ）とも同一である（Ｍｕｒｐｈｙら，（１９８７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５２３６−１５２４１）。したがって、ＧＣＤＦＰ−１５はアポクリン上皮の特異的組織マーカーである。
【００５９】
亜鉛−α−糖タンパク質（ＺＡＧ）は、最初はヒト血漿から単離され（Ｂｕｒｇｉら，（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２３６，１０６６−１０７４）ついで肝臓、乳房、胃腸管および汗腺の分泌上皮細胞において見出された（Ｔａｄａら，（１９９１）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３９，１２２１−１２２６）４３ｋＤａの可溶性糖タンパク質である。ＺＡＧは或る悪性腫瘍において過剰発現され、したがって、それは癌マーカーとして用いられうる（Ｄｉｅｚ−Ｉｔｚａら，（１９９３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ａ ２９，１２５６−１２６０；Ｈａｌｅら，（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７，８４６−８５３）。ＺＡＧの生物学的機能はほとんど知られていないが、それは脂質動因因子（Ｔｏｄｏｒｏｖら，（１９９８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，２３５３−２３５８）、および脂肪組織機能の局所調節に関連づけられうる新規アディポカイン（Ｂａｏら，（２００５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７９，４１−４７）として作用することが示されている。
【００６０】
ＡＢＣＣ１１、ＡｐｏＤ、ＧＣＤＦＰ−１５および亜鉛−α−糖タンパク質はアポクリン腺の分泌および輸送過程において重要な役割を果たしているため、本発明者らは、該無限増殖性アポクリン細胞株においてこれらのタンパク質の翻訳を引き起こす転写産物の発現を調べた。
【００６１】
該遺伝子転写産物断片をクローニングするために使用したプライマーを表６に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
表６に示すプライマーペアが設計された遺伝子断片の全ては検出可能であった。添付されている図７は、産生された全ＰＣＲ産物の１．２％ アガロースゲルを示す。
【００６４】
添付されている図７．アポクリンマーカーを示すアガロースゲルが開示されている。以下の産物がそれぞれレーン１から４に示されている。
１．ＡＢＣＣ１１輸送体、
２．アポリポタンパク質Ｄ、
３．亜鉛−α−糖タンパク質、
４．ＧＣＤＦＰ−１５。
【００６５】
ついでこれらのＰＣＲ産物を、配列決定のためにＴＯＰＯベクター内にクローニングした。各クローン化断片の実体を確認するために、各ＰＣＲ産物上で配列決定を行った。該遺伝子配列決定の結果を以下に示す。
【００６６】
【化２】
【００６７】
該無限増殖性アポクリン細胞株は、細胞分泌過程に関連したＡＢＣＣ１１遺伝子を発現する。該配列決定データはＡＢＣＣ１１輸送体遺伝子の同一性を証明した。この細胞株における該遺伝子の遺伝子型はＧ（５３８Ｇ→Ａ太字および下線）であり、湿潤耳垢型および腋窩臭気のレベル増加に関連している。アポリポタンパク質Ｄ担体遺伝子も発現され、このことは、臭気物質の輸送に必要な装置も該細胞株内で作られていることを示している。該データは、この細胞株のアポクリン表現型の更なる証拠、およびアポクリン腺生物学の研究のための強力な手段の提供におけるその有用性の更なる証拠を提供する。
【００６８】
細胞化学組成−材料および方法
無限増殖性アポクリン細胞（継代４４）をそれぞれ第７日および第１４日に集めた。該細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、再遠心分離し、分析のために−８０℃で保存した。
【００６９】
３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの分析
１０μｌの（Ｎ−メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）、１％ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）および１０μｌのピリジンおよび１μｌのトリエチルアミンを使用して、該凍結細胞ペレットから３−メチル−２−ヘキサン酸グルタミンコンジュゲートを抽出した。該サンプル上の試薬において誘導体化を行った。該混合物を７０℃で１時間維持した。選択されたイオンモニターを伴うＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０／５９７３ガスクロマトグラフィー／質量選択データ系およびＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ５−ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）（ｉｄは内径を示す）を使用するガスクロマトグラフィーにより、３Ｍ２Ｈグルタミン誘導体を分析した。用いた温度プログラムは１０℃／分で７０℃から２７０℃であった。組込まれたソフトウェアを使用して、ピーク面積を自動的に計算した。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７０】
コレステロールおよびスクアレンの分析
２０μｌのクロロホルムを使用して、該凍結細胞ペレットからコレステロールおよびスクアレンを抽出した。ついでこの抽出物をＧＣ（前記に詳細に説明されているとおり）内に直接的に注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ５−ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）を使用して完全走査下で分析した。加熱プログラム：１０℃／分で７０℃から２７０℃。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７１】
短鎖脂肪酸
２０μｌのクロロホルムを使用して、該凍結細胞ペレットから短鎖脂肪酸を抽出した。ついでこの抽出物をＧＣ（前記に詳細に説明されているとおり）内に直接的に注入し、選択的イオンモニターを行いながら、ＨＰ−Ｉｎｎｏｗａｘカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉｄ×０．２５μｍフィルム）を使用して分析した。加熱プログラム：５℃／分で７０℃から２４０℃。質量分析および既知標準に対する保持時間により構造を特定した。
【００７２】
該３Ｍ２Ｈグルタミンコンジュゲートの相対レベルを、添付されている図８に示す。
【００７３】
７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるコレステロールの相対レベルを、添付されている図９に示す。
【００７４】
７日間および１４日間の培養の後に集めたアポクリン細胞におけるスクアレンの相対レベルを、添付されている図１０に示す。
【００７５】
短鎖脂肪酸の相対レベルを、添付されている図１１に示す。
【００７６】
Ｃ１６／１８脂肪酸もその１４日のサンプルにおいて検出された。種々の揮発性脂肪酸の存在を示す、本明細書中に要約されているデータは、該無限増殖性細胞株がアポクリン腺の機能を成功裏に模擬したことを更に示している。
【００７７】
インヒビター研究
悪臭前駆体化合物の産生および細胞増殖は、アンドロゲン代謝酵素を阻害することが知られている化合物の作用によりモジュレーションされると予想されるであろう。細胞の増殖および悪臭前駆体化合物の産生は、アンドロゲン代謝酵素を又は直接的にアンドロゲン受容体を阻害することが知られているアンタゴニストの培地の添加により抑制されるであろう。そのような化合物は、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺および培養の両方における臭気前駆体分子の合成または分泌を軽減すると予想されるであろう。そのような化合物には以下のものが含まれる（それらに限定されるものではない）。
１７α−置換ベンジルエストラジオール、
三環式クマリンスルファマート、
エストロン−３−Ｏ−スルファマート、
三環式オキセピンスルファマート、
２−メトキシエストロン−３−Ｏ−スルファマート、
置換クロメノンスルファマート、
１７α−ベンジル（または４’−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）エストラ−１，３，５（１０）−トリエン、
１７β−（Ｎ−アルキルカルバモイル）−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−Ｏ−スルファマート、
トリロスタン、
シアノケトン、
シプロテロンアセタート、
ノルゲストレル、
ノルエチンドロン、
チアゾリジンジオン、
１６−（ブロモアルキル）−エストラジオール、
フラボノイド、
イソフラボノイド、
リグナン、
トリフルオロメチルアセチレン性セコエストラジオール、
エストラジオールの６β−（チアヘプタンアミド）誘導体、
１７位にスピロ−ガンマ−ラクトンを含有するエストロン、
７α−チオアルキルおよび７α−チオアリール、
スピロノラクトンの誘導体、
Ｎ−ブチル−Ｎ−メチル−１１−（３’−ヒドロキシ−２１’，１７’−カルボラクトン−１９’−ノル−１７’α−プレグナ−１’，３’，５’（１０’）−トリエン−７’α−イル）−ウンデカンアミド、
１，４−アンドロスタジエン−１，６，１７−トリオン、
アンドロステロン３３−置換誘導体、
４−アザステロイド（ＭＫ３８６）、
６−アザステロイド性１７β−カルボキサミドトリアリール、
８−クロロ−４−メチル−１，２，３，４，４ａ，５，６，１０ｂ−オクタヒドロ−ベンゾ［ｆ］キノリン−３（２Ｈ）−オン（ＬＹ １９１７０４）、
６−［４−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルバモイル）フェニル］−Ｎ−メチル−キノリン−２−オン５）、
ベンゾ［ｃ］キノリジン−３−オン、
エピカテキン−３−ガラート、
エピガロカテキン−３−カラート、
スラミン、
亜鉛、
アセライン酸、
６−［４−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルバモイル）フェニル］−１Ｈ−キノリン−２−オン ４
４−［３−［５−ベンジル−８−（２−メチル）プロピル−１０，１１−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボキサミド］フェノキシ］酪酸、
ツロステリド、
ＭＫ−４３４、
ジヒドロフィナステリド、
クロルマジノンアセタート、
ＴＺＰ−４２３８、
エプリステリド（ＳＫ＆Ｆ １０５６５７、ＯＮＯ−９３０２）、
１７α−エストラジオール、
１７−（５’−イソオキサゾリル）アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン、
Ｎ−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロフェニル−プロピル）−３−オキソ−４−アザ−５α−アンドロスタ−１−エン−１７β−カルボキサミド（ＰＮＵ １５７７０６）、
デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）、
オキセンドロン（ＴＳＡＡ−２９１：１６β−エチル−１７β−ヒドロキシ−４−エストレン−３−オン）、
１９−ノル−１０−アザステロイド、
ステロイドＤ環に結合したオキシム基を含有する、プロゲステロンに基づくステロイド、
ベンゾキノリノン、
セレノア・レペンス（Ｓｅｒｅｎｏａ ｒｅｐｅｎｓ）抽出物ペルミキソン、
アルトカルプス・インシウス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｃｉｓｕｓ）、
アリザリン、
クルクミン、
フェナジン誘導体、
ミリストオレイン酸、
γ−リノレン酸、
４−［３−［３−［ビス（４−イソブチルフェニル）−メチルアミノ］ベンゾイル］−１Ｈ−インドール−１−イル］酪酸（ＦＫ １４３）、
フルタミド、
スピロノラクトン。
【００７８】
多数の化合物が皮膚における細胞（皮脂腺のような皮膚付属器に由来する細胞を含む）の増殖を軽減することが示されている。そのような化合物は、アポクリン細胞と接触すると、腋窩皮膚に存在するアポクリン腺および培養の両方における臭気前駆体分子の合成および分泌を軽減すると予想されるであろう。そのような化合物には、１３−シス−レチノイン酸、レチノイン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によるヒトアポクリン細胞株ＡＳＧ５の超微細構造分析
サンプル調製
既に記載されているとおりに、９５％空気／５％ＣＯ２ 加湿インキュベーター中、ＭＥＧＭ内で３７℃でＡＳＧ５細胞継代番号４７を培養した。それぞれ３日間および１４日間の温置の後、細胞を集めた。固定前に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）中で２回洗浄した。
【００８０】
透過型電子顕微鏡法
洗浄された細胞培養を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中の３％ グルタルアルデヒド中で室温で１時間固定した。該試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中、５分間の３回の期間にわたって洗浄した。初回固定後、試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中の１％ 四酸化オスミウム中で室温で１時間固定した。該試料を０．１Ｍ カコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中、５分間の３回の期間にわたって再び洗浄した。ついで試料を一連の勾配のエタノールにより脱水した。該細胞をルフト（Ｌｕｆｔ）のエポン（Ｅｐｏｎ）樹脂中に包埋し、６０℃で４８時間重合させた。該塊を、厚さ約１２０ｎｍの切片を与えるように設定されたＲｅｉｃｈｅｒｔ“Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ”Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ上で切片化した。該切片を２００メッシュの六角形細棒銅格子上に拾い上げた。該切片を酢酸ウラニル、ついでクエン酸鉛（Ｌｅｉｃａ ＥＭ染料上）中で染色した。染色された切片を、１２０ｋＶで作動させたＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０透過型電子顕微鏡で検査した。イメージを．ｔｉｆファイルとしてデジタル的に記録し、本明細書においては、３日齢培養細胞に関しては図１２から１５、そして１４日齢培養細胞に関しては図１６および１７として示す。
【００８１】
結果
図１２、１３および１６に示す細胞は、培養内の上皮細胞に典型的な丸い又は「丸石状」外観を示した。該細胞の分泌特性は、細胞質全体にわたる「Ｓ」として示される多数の分泌顆粒（図１２から１７）の存在と共に、「Ｍ」として特定される多数の微小絨毛（図１２、１３、１４、１６および１７）、および内腔膜における「Ａ」として示される先端（ａｐｉｃａｌ）ブレブ（図１２、１５および１６）の存在により実証された。先端細胞質（すなわち、微小絨毛「Ｍ」および先端ブレブ「Ａ」）の小さな部分の切断はアポクリン分泌過程を構成する（Ｍｏｎｔａｇｎａら（１９５３）Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．Ｖ．Ａｘｉｌｌａｒｙ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｓｗｅａｔ ｇｌａｎｄｓ．Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．，９２：４５１−４７０）。Ｂｅｌｌ（１９７４）Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｘｉｌｌａｒｙ ａｐｏｃｒｉｎｅ ｇｌａｎｄｓ ａｆｔｅｒ ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，６３：１４７−１５９に従いＩ型顆粒とＩＩ型顆粒とを識別することは不可能であったが、すべての細胞は、「Ｓ」として示される多数の分泌顆粒を含有していた（図１２から１７）。該顆粒は、おそらくは小さな脂質滴を含有する著しく電子不透過性である粒子を含有していた。ほとんどの細胞において、「Ｖ」として示される多数の「空」小胞が観察された（図１２、１３、１４、１６および１７）。これは、おそらく、小胞の内容物が失われた固定過程の結果であろう。そのような小胞は分泌の過程への関与に利用されうる。図１３および１６における細胞は外観においてやや平らであり、「Ｎ１」で示される核小体を明らかに示した。
【００８２】
３日齢および１４日齢のＡＳＧ５培養からの全ての細胞において、先端ブレブ「Ａ」、内腔微小絨毛「Ｍ」および多数の分泌顆粒「Ｓ」が観察され、このことは、これらの細胞が典型的な活性アポクリン分泌形態学を示すことを証明している。これらの知見はＡＳＧ５細胞株のアポクリン特性を更に立証し、ヒト腋窩アポクリン汗腺の機能的に典型的な細胞モデルとしてのこの細胞株の有用性の追加的な証拠を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期増殖を示すアポクリン細胞株。
【請求項２】
ヒトアポクリン腺に由来する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
アポクリン腺の特徴的特性を示す、請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
無限に増殖しうる、請求項１から３のいずれかに記載の細胞株。
【請求項５】
寄託番号ＥＣＡＣＣ ０７０２１３０１を有する細胞株。
【請求項６】
アポクリン細胞を初代組織から単離し、単離された細胞を第１培地内で培養し、第１培地から未付着細胞を除去し、および有効濃度のホルボールエステルを含む第２培地に該未付着細胞を移し、ならびにそれにより、長期増殖能を示すアポクリン細胞株を樹立する工程を含んでなる、長期増殖を示す培養細胞株を入手する方法。
【請求項７】
診断用、治療用または美容用製剤のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項８】
物質が、皮膚に局所適用された場合に防臭物質であるかどうかをインビトロで評価するための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項９】
ヒトアポクリン腺の生理学または病態生理学の検査のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項１０】
疾患に対する化合物または物質の試験のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の、前記細胞に由来する産物の製造のための使用。
【請求項１】
長期増殖を示すアポクリン細胞株。
【請求項２】
ヒトアポクリン腺に由来する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
アポクリン腺の特徴的特性を示す、請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
無限に増殖しうる、請求項１から３のいずれかに記載の細胞株。
【請求項５】
寄託番号ＥＣＡＣＣ ０７０２１３０１を有する細胞株。
【請求項６】
アポクリン細胞を初代組織から単離し、単離された細胞を第１培地内で培養し、第１培地から未付着細胞を除去し、および有効濃度のホルボールエステルを含む第２培地に該未付着細胞を移し、ならびにそれにより、長期増殖能を示すアポクリン細胞株を樹立する工程を含んでなる、長期増殖を示す培養細胞株を入手する方法。
【請求項７】
診断用、治療用または美容用製剤のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項８】
物質が、皮膚に局所適用された場合に防臭物質であるかどうかをインビトロで評価するための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項９】
ヒトアポクリン腺の生理学または病態生理学の検査のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項１０】
疾患に対する化合物または物質の試験のための、請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の使用。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の又は請求項６に従い産生されたアポクリン細胞株の、前記細胞に由来する産物の製造のための使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５２２５４５（Ｐ２０１０−５２２５４５Ａ）
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００１７１（Ｐ２０１０−５００１７１）
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６７１３
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５９０００３０６５）ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ (494)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６７１３
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５９０００３０６５）ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ (494)
【Ｆターム（参考）】
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