アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法及びアポクリン臭生成能の評価方法
【課題】アポクリン臭抑制剤を効率よくスクリーニングすることができる方法、及びアポクリン臭生成能を客観的かつ正確に、しかも簡便に評価する方法を提供する。
【解決手段】被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法、及びコリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法。
【解決手段】被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法、及びコリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法、及びアポクリン臭生成能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
汗はほぼ全身の各部から分泌されるが、その中でも腋の汗は細菌が繁殖しやすく匂いやすい。近年エチケット意識の高まりに伴い、自己や他人の腋臭を気にする人が特に増えてきている。
【０００３】
わきの下から発生するニオイ（腋臭ともいう）は酸っぱくて蒸れたニオイ（汗臭、酸臭などと呼ばれる）とアポクリン臭（「わきが」とも呼ばれる）に大別できる。アポクリン臭は、腋の下に分布するアポクリン汗腺由来の分泌物が原因で発生し、複雑かつ強い臭気のため、本人又はそばに居る人に特に感知されやすい。そのため、わきがを気にする人にとっては、特にアポクリン臭の強さが関心事となっている。さらに、わきがの発生を抑制する素材の開発も求められている。
【０００４】
アポクリン臭は主に、（１）硫黄様で生臭いニオイと、（２）動物的でスパイシーなニオイとから構成されており、それらの主要原因成分が、それぞれ、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールに代表される３位にチオール基を有するアルコール化合物（以下、これらの化合物を３−メルカプトアルコール化合物ともいう）、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に代表されるβ−ヒドロキシ酸化合物であることが知られている。
【０００５】
現在までに、アポクリン臭のうち、硫黄臭様の原因物質である３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールの生成菌として、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）やスタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemolyticus）が知られている（例えば、非特許文献１から３参照）。しかしながら、これらの細菌を用いたアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法やこれらの細菌におけるアポクリン臭生成能の評価方法に関する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．１０５８−１０７２、２００４年
【非特許文献２】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．１０２２−１０３４、２００４年
【非特許文献３】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第２巻、ｐ．７０５−７１６、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よくアポクリン臭抑制剤をスクリーニングすることができる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのアポクリン臭生成能を客観的かつ正確に、しかも簡便に評価する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、前記スクリーニング方法に好適に用いることができる微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者等は鋭意検討を行った。その結果、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）がアポクリン臭生成菌であることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
本発明は、被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法によれば、効率よくアポクリン臭抑制剤をスクリーニングすることができる。また、本発明のアポクリン臭生成能の評価方法によれば、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのアポクリン臭生成能を客観的かつ正確に、しかも簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アポクリン臭原因物質をラベル化剤でラベル化した反応生成物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ヒトの腋下の皮膚にコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが棲息することが知られている。
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下において、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択することを特徴とする。また、本発明のアポクリン臭生成能の評価方法は、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価することを特徴とする。
本発明における「コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム」は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌体自体の他に、破砕菌体、菌体培養液、並びにコリネバクテリウム・ツバークロステアリクム由来の、粗抽出物及び精製酵素等の、菌体処理物も含む。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法及び評価方法に用いられるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの入手方法に特に制限はない。本発明のスクリーニング方法に用いられるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは、市販されているものの他、一般に入手可能なものでもよいし、ヒト等の皮膚（好ましくは、ヒトの腋下）から採取したものでもよい。
ヒトの皮膚からコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを採取する方法に特に制限はなく、濡らした綿棒で皮膚をこすり付着した細菌を緩衝液に回収して寒天平板培地に播く方法、皮膚上にガラス製のリング状カップを当てその中を緩衝液で満たし、テフロンなどの棒で皮膚表面をこすり、緩衝液中に遊離した細菌を回収して寒天平板培地に播く方法、皮膚表面に寒天平板培地を直接押し当て、細菌を培地に付着させ採取する方法、皮膚表面に粘着テープを貼り付け、剥がした後皮膚付着面を下にして寒天平板培地の上に乗せて培養する方法等が挙げられる。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのコロニーは黄色の色調を有していることから、寒天培地上に形成したコロニーのうち、黄色の色調を有するコロニーを選択することでコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを選抜しうる。また、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは０．７〜０．８μｍ程度×１．０〜１．２μｍ程度の大きさのグラム染色で陽性を示す桿菌であることから、前記選抜したコロニーを顕微鏡観察したり、グラム染色することで、より正確にコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを選抜しうる。このようにして選抜した菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列とコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列との同一性を調べることで、選抜した菌がコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムであるか否かを決定することができる。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な塩基配列に特異的に結合するプライマーを用いて、選抜した菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片が増幅されてくるか否かを調べることで行うこともできる。
【００１４】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法においては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの中でもアポクリン臭原因物質の生成能が相対的に高いコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌株を用いるのが好ましい。
【００１５】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法においては、被験物質の存在下、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、該コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを該被験物質及び該前駆物質と共にインキュベートし、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質を生成させる。また、本発明のアポクリン臭の評価方法においては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを該前駆物質と共にインキュベートし、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質を生成させる。
【００１６】
以下に、本発明に用いるのに必要な量のコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを調製するための方法を具体例を挙げて説明する。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを培養する培地としては、通常、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが生育し得る培地であれば良く、具体的には、ミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（ＳＣＤ Ｂｒｏｔｈ）等が挙げられる。炭素源としては菌体が資化することができる炭素化合物であればいずれでも使用可能であり、グルコース、スクロース、水飴、廃糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００１８】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは寒天平板培地等で前培養した後に、上記の培地に植菌することが好ましい。培地に植菌される菌量は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが培地中で増殖し得る量であれば良く、具体的には、培地１Ｌ当たり１〜１０白金耳量を植菌することが好ましい。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの培養条件に特に制限はないが、通常、温度１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃でｐＨ５〜８の条件下で行うことが好ましい。培養は静止して行ってもよく、振盪しながら行ってもよい。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの培養は嫌気下でも好気下でもよいが、好気下での培養が好ましい。培養時間はコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが活発に生育できる時間であれば良く、特に制限はないが、１６〜３６時間が好ましい。
【００１９】
培養後の菌体は遠心分離操作により集菌し、菌体が生存可能な水溶液で洗浄し、さらに菌体が生存可能な水溶液に再懸濁して濁度ＯＤ６００を測定しておく。菌体が生存可能な水溶液として、水や生理食塩水、緩衝液などが挙げられるが、緩衝液であることが好ましい。緩衝液としてはＤ−ＰＢＳ（−）などが挙げられる。このようにして得られた菌体溶液、又はその破砕物、粗抽出物等の菌体処理物を本発明に用いることができる。
【００２０】
本発明において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、アポクリン臭原因物質を生成させる方法を、以下に具体例を挙げて説明する。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
媒体中で、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとアポクリン臭原因物質の前駆物質とを共存させることで両者を接触させることができる。媒体としては、通常の培地を用いることもできるが、アポクリン臭の官能評価および機器分析評価を妨げないものが好ましく、具体的には、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが生存可能な水溶液を用いることが好ましい。水溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液が挙げられるが、緩衝液であることが好ましい。緩衝液としてはＤ−ＰＢＳ（−）などが挙げられる。
【００２２】
アポクリン臭原因物質の前駆物質との接触時におけるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌体濃度に特に制限はないが、該前駆物質と接触させた状態で、ＯＤ６００＝０．０６〜６．０に調整されることが好ましい。
アポクリン臭原因物質を生成させるために、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとアポクリン臭原因物質の前駆物質とを含む媒体を所望の時間インキュベートする。インキュベート温度、インキュベート時間に特に制限はないが、アポクリン臭原因物質が生成されるのに十分な温度及び時間であることが好ましく、具体的には１５〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃で６時間〜４８時間インキュベーとすることが好ましい。また、インキュベートは静止して行ってもよく、振盪しながら行ってもよい。
インキュベーション時の媒体のｐＨに特に制限はないが、アポクリン臭原因物質の前駆物質との接触時において、ｐＨ５〜８の範囲であることが好ましい。
【００２３】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法で用いる被験物質としては、任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖鎖、ポリマー、天然物抽出物等、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
アポクリン臭は主に硫黄臭様とスパイシー臭から構成されている。これらのうち、本発明における「アポクリン臭」とは、硫黄臭様であることが好ましい。
【００２５】
また、硫黄臭様の主要原因成分は、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オール等の３−メルカプトアルコール化合物である。本発明における「アポクリン臭原因物質」としては、３−メルカプトアルコール化合物であることが好ましく、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オール（本明細書において、「３Ｍ３Ｔ」ともいう。）であることがより好ましい。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させる。
該前駆物質としては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質に変換されるものであれば特に制限はなく、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとヒトの汗とを接触させることで、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムと該汗中に含まれるアポクリン臭原因物質の前駆物質とを接触させることもできる、ヒトの汗としては、ヒトの腋下の汗を用いることが好ましい。
ヒトの汗を採取する方法に特に制限はないが、ガーゼ、脱脂綿等の布帛により腋下の皮膚をこする方法、腋下の皮膚に生理食塩水等を吹き付けた後ガーゼ、脱脂綿等の布帛により拭き取る方法、腋下の皮膚に綿パッドを一定時間挟んでおく方法、腋下の皮膚に当たる部分に綿パッドが縫い付けられた肌着やＴシャツを一定時間着用する方法などが挙げられ、これらの方法は、１つ又は２つ以上を組み合わせて適用することもできる。また、ヒトの汗を採取する前に、腋窩部の発汗を促進しておくことが好ましい。
【００２８】
また、本発明において、前記アポクリン臭原因物質の前駆物質が２−アミノ−７−ヒドロキシ−５−メチル−５−プロピル−４−チアヘプタン酸（本明細書において、「３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓ」ともいう。）であることが好ましい。
【００２９】
【化２】
【００３０】
本発明において好ましく用いることができる３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓの入手方法としては特に制限はなく、市販のものを用いてもよいし、通常の方法により合成したものを用いることができる。例えば、特開２００７−２２５４１１号公報の記載に従って、３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓを合成することができる。
【００３１】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法およびアポクリン臭の評価方法において、アポクリン臭原因物質の生成の検知方法に特に制限はないが、官能評価等、定性的な方法によって行ってもよいし、カラムクロマトグラフィーを用いて定量的にアポクリン臭原因物質の生成を検知することもできる。
本発明においては、アポクリン臭原因物質の生成の検知を、ラベル化剤を用いてアポクリン臭原因物質を標識し、標識されたアポクリン臭原因物質を検知することで行うことが好ましい。
本発明において用いることができるラベル化剤に特に制限はないが、ラベル化が特異的であることから、アポクリン臭原因物質のチオール基に対して選択性を有するラベル化剤を用いることが好ましい。ラベル化剤として、蛍光物質や発光物質、所望の波長に対して吸収をもつ物質、マススペクトロメトリーで検出しやすい物質などを用いることできる。
本発明において好ましく用いられるラベル化剤の具体例としては、下記式の例示化合物（１）〜（４）が挙げられる。
【００３２】
【化３】
【００３３】
本発明において、ラベル化剤としては上記例示化合物（４）が好ましい。
【００３４】
前記ラベル化剤は通常の方法により合成することができる。また、本発明に用いることができるラベル化剤として市販のものを用いてもよい。例えば、上記例示化合物（１）〜（３）は（株）同仁化学研究所から、例示化合物（４）はＲｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．から入手することができる。
【００３５】
本発明において、アポクリン臭原因物質とラベル化剤との反応条件に特に制限はない。
本発明において、前記ラベル化剤は適当な溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ＴＨＦ、アセトニトリル）に濃度が２５〜２５００μＭとなるように調製して用いるのが好ましい。
試料溶液にラベル化剤を添加してアポクリン臭原因物質を標識する際、０．５Ｍホウ酸−ＮＡ２ＣＯ３−２０ｍＭ ＥＤＴＡバッファー等、ラベル化剤添加後の試料溶液をｐＨ８．０程度に調製できる緩衝液を用いるのが好ましい。
【００３６】
アポクリン臭原因物質とラベル化剤との反応温度に特に制限はなく、０〜１００℃が好ましく、５０〜８０℃がより好ましい。反応時間も特に制限はなく、１０分〜２４時間が好ましく、１〜４時間がより好ましい。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法においては、通常には、被検物質の非存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量と、被検物質の存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量とを比較し、被検物質の存在下においてアポクリン臭原因物質の生成量が減少している場合には、該被検物質をアポクリン臭抑制作用を有する被験物質として選択することができる。また、所定のアポクリン臭抑制剤を標準品とし、被検物質の存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量が、該標準品存在下でのアポクリン臭原因物質の生成量と比べて同等又はそれ以下の場合に、該被検物質をアポクリン臭抑制作用を有する被験物質として選択することもできる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
参考例 例示化合物（４）によるアポクリン臭原因物質のラベル化
「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．２０４２−２０５０、２００４年に記載の方法に従い、３Ｍ３Ｔを合成した。
前記３Ｍ３Ｔの生理食塩水溶液（濃度：１ｐｐｍ）４０μＬに、例示化合物（４）（商品名：１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、Ｒｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．製）のジメチルホルムアミド溶液５０μＬ及び０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを添加し、ｐＨ＝８．０、５０℃で１．５時間反応させた。反応式を以下に示す。
【００４０】
反応終了後、反応液１０μＬについて、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析条件の詳細は以下の通りである。
装置：日立Ｄ−７０００システム
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ φ４．６×１５０ｍｍにガードカラム取り付け
検出：蛍光（λｅｘ ３７０ｎｍ、λｅｍ ４９０ｎｍ）
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
温度：４０℃
溶出溶媒：アセトニトリル／０．２Ｎ酢酸アンモニウム水溶液、グラジェント、２４％→３８％（８分）
【００４１】
その結果を図１に示す。
図１に示すように、保持時間が５．７〜６．１分の間に反応生成物が単一のピークとして検出された。この結果から、例示化合物（４）によるアポクリン臭原因物質のラベル化により下記反応式に示す反応生成物が生成し、前記ピーク面積から３Ｍ３Ｔを正確に定量できることがわかる。
【００４２】
【化４】
【００４３】
実施例 本発明のスクリーニング方法及び評価方法
（１）検量線の作成
サンプル中の３Ｍ３Ｔが１〜１００ｐｐｂとなるように、３Ｍ３Ｔの生理食塩水溶液４０μＬに、例示化合物（４）（商品名：１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、Ｒｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．製）のジメチルホルムアミド溶液５０μＬ及び０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを添加し、８０℃で１時間３Ｍ３Ｔのラベル化を行った。反応終了後、参考例１に記載の条件と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、反応生成物由来のピーク面積を測定し、３Ｍ３Ｔ濃度に対するピーク面積の検量線を作成した。
【００４４】
（２）コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによる３Ｍ３Ｔの生成
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム標準菌（菌株番号：ＪＣＭ１３３８９、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室より入手）をＳＣＤＬＰ寒天平板培地上で３７℃において１日生育させた後、その菌叢の１白金耳量を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業株式会社製）を加えたミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ））１Ｌに接種し好気条件下３７℃で１８時間培養した。遠心分離による集菌後、菌のペレットをＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁し、ＯＤ６００＝２０．０となるように菌液を調製した。
【００４５】
健康な米国人女性４９名の腋の下の汗を１．５ｍＬのイオン交換水を含浸した脱脂ガーゼで１日１回、３日間にわたり拭き取った。このガーゼ１枚あたりに無菌水２ｍｌを加えて汗を抽出する操作を２回繰り返し、全ての抽出液をプールした。抽出液と同容量のヘキサンで洗浄後、抽出液を凍結乾燥した。この乾燥標品を無菌水３００μＬ（ガーゼ１枚あたり約１００μＬに相当）を加えて再溶解し、フィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を用いてろ過滅菌したものをアポクリン臭原因物質の前駆物質を含むヒト汗標品とした。
【００４６】
前記菌液１０μＬに、前記ヒト汗標品１０μＬと、Ｄ−ＰＢＳ（−）８０μＬとを添加し、３７℃で６時間振とうしながらインキュベートした（１６０ｒｐｍ）。
【００４７】
（３）アポクリン臭の評価
培養終了後、培養を行なった試験管のふたを開け鼻に近づけて、発せられる臭気を嗅いでアポクリン臭（硫黄臭様）を評価した。評価は、アポクリン臭の官能評価に熟練した者が２人以上で２連行なった。その結果を表１に示す。
【００４８】
（４）３Ｍ３Ｔの生成量測定
次に、培養液を濾過フィルターで除菌して得た濾液について、ＨＰＬＣにより３Ｍ３Ｔの生成量を２連測定した。ＨＰＬＣによる分析条件は以下のとおりである。
除菌後の濾液４０μＬに、直ちにラベル化剤として２５０μＭの例示化合物（４）（ジメチルホルムアミド溶液）５０μＬと０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬとを混合し、８０℃で１時間反応させて蛍光ラベル化を行なった。反応終了後、反応物をＨＰＬＣで分析し、上記実施例（１）で作成した検量線に基づき、３Ｍ３Ｔと例示化合物（４）との反応物由来のピーク面積から生成した３Ｍ３Ｔ量を定量した。その結果も表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１から、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは、アポクリン臭（硫黄臭様）の原因物質（３Ｍ３Ｔ）生成能を有し、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に用いうることが示された。
【００５１】
比較例
コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）標準菌（菌株番号：ＪＣＭ９３９０、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室より入手）を、Ｒ Ａｇａｒ培地（本菌の指定培地）またはＳＣＤＬＰ寒天平板培地上で、３７℃において１日生育させた後、その菌叢の１白金耳量を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業株式会社製）を加えたミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ））１Ｌに接種し、好気条件下３７℃で１８時間培養した。遠心分離による集菌後、菌のペレットをＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁し、ＯＤ６００＝２０．０となるように菌液を調製した。
この菌液１０μＬに、上記実施例（２）と同様に調製したアポクリン臭原因物質の前駆物質を含むヒト汗標品１０μＬと、Ｄ−ＰＢＳ（−）８０μＬを添加し、３７℃で６時間振とうしながらインキュベートした（１６０ｒｐｍ）。
培養終了後、アポクリン臭の評価と３Ｍ３Ｔの生成量測定を、上記実施例と同様に実施した。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
表２から、コリネバクテリウム・ストリアツム標準菌は、指定培地で増殖させたものから調製した菌液及びＳＣＤＬＰ培地から調製した菌液のいずれにおいても３Ｍ３Ｔ生成能を有さず、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に用いるのに適さないことが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法、及びアポクリン臭生成能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
汗はほぼ全身の各部から分泌されるが、その中でも腋の汗は細菌が繁殖しやすく匂いやすい。近年エチケット意識の高まりに伴い、自己や他人の腋臭を気にする人が特に増えてきている。
【０００３】
わきの下から発生するニオイ（腋臭ともいう）は酸っぱくて蒸れたニオイ（汗臭、酸臭などと呼ばれる）とアポクリン臭（「わきが」とも呼ばれる）に大別できる。アポクリン臭は、腋の下に分布するアポクリン汗腺由来の分泌物が原因で発生し、複雑かつ強い臭気のため、本人又はそばに居る人に特に感知されやすい。そのため、わきがを気にする人にとっては、特にアポクリン臭の強さが関心事となっている。さらに、わきがの発生を抑制する素材の開発も求められている。
【０００４】
アポクリン臭は主に、（１）硫黄様で生臭いニオイと、（２）動物的でスパイシーなニオイとから構成されており、それらの主要原因成分が、それぞれ、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールに代表される３位にチオール基を有するアルコール化合物（以下、これらの化合物を３−メルカプトアルコール化合物ともいう）、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に代表されるβ−ヒドロキシ酸化合物であることが知られている。
【０００５】
現在までに、アポクリン臭のうち、硫黄臭様の原因物質である３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールの生成菌として、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）やスタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemolyticus）が知られている（例えば、非特許文献１から３参照）。しかしながら、これらの細菌を用いたアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法やこれらの細菌におけるアポクリン臭生成能の評価方法に関する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．１０５８−１０７２、２００４年
【非特許文献２】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．１０２２−１０３４、２００４年
【非特許文献３】「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第２巻、ｐ．７０５−７１６、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よくアポクリン臭抑制剤をスクリーニングすることができる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのアポクリン臭生成能を客観的かつ正確に、しかも簡便に評価する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、前記スクリーニング方法に好適に用いることができる微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者等は鋭意検討を行った。その結果、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）がアポクリン臭生成菌であることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
本発明は、被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法によれば、効率よくアポクリン臭抑制剤をスクリーニングすることができる。また、本発明のアポクリン臭生成能の評価方法によれば、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのアポクリン臭生成能を客観的かつ正確に、しかも簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アポクリン臭原因物質をラベル化剤でラベル化した反応生成物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ヒトの腋下の皮膚にコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが棲息することが知られている。
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下において、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択することを特徴とする。また、本発明のアポクリン臭生成能の評価方法は、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価することを特徴とする。
本発明における「コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム」は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌体自体の他に、破砕菌体、菌体培養液、並びにコリネバクテリウム・ツバークロステアリクム由来の、粗抽出物及び精製酵素等の、菌体処理物も含む。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法及び評価方法に用いられるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの入手方法に特に制限はない。本発明のスクリーニング方法に用いられるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは、市販されているものの他、一般に入手可能なものでもよいし、ヒト等の皮膚（好ましくは、ヒトの腋下）から採取したものでもよい。
ヒトの皮膚からコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを採取する方法に特に制限はなく、濡らした綿棒で皮膚をこすり付着した細菌を緩衝液に回収して寒天平板培地に播く方法、皮膚上にガラス製のリング状カップを当てその中を緩衝液で満たし、テフロンなどの棒で皮膚表面をこすり、緩衝液中に遊離した細菌を回収して寒天平板培地に播く方法、皮膚表面に寒天平板培地を直接押し当て、細菌を培地に付着させ採取する方法、皮膚表面に粘着テープを貼り付け、剥がした後皮膚付着面を下にして寒天平板培地の上に乗せて培養する方法等が挙げられる。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムのコロニーは黄色の色調を有していることから、寒天培地上に形成したコロニーのうち、黄色の色調を有するコロニーを選択することでコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを選抜しうる。また、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは０．７〜０．８μｍ程度×１．０〜１．２μｍ程度の大きさのグラム染色で陽性を示す桿菌であることから、前記選抜したコロニーを顕微鏡観察したり、グラム染色することで、より正確にコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを選抜しうる。このようにして選抜した菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列とコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列との同一性を調べることで、選抜した菌がコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムであるか否かを決定することができる。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な塩基配列に特異的に結合するプライマーを用いて、選抜した菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片が増幅されてくるか否かを調べることで行うこともできる。
【００１４】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法においては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの中でもアポクリン臭原因物質の生成能が相対的に高いコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌株を用いるのが好ましい。
【００１５】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法においては、被験物質の存在下、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、該コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを該被験物質及び該前駆物質と共にインキュベートし、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質を生成させる。また、本発明のアポクリン臭の評価方法においては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを該前駆物質と共にインキュベートし、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質を生成させる。
【００１６】
以下に、本発明に用いるのに必要な量のコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを調製するための方法を具体例を挙げて説明する。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムを培養する培地としては、通常、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが生育し得る培地であれば良く、具体的には、ミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（ＳＣＤ Ｂｒｏｔｈ）等が挙げられる。炭素源としては菌体が資化することができる炭素化合物であればいずれでも使用可能であり、グルコース、スクロース、水飴、廃糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００１８】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは寒天平板培地等で前培養した後に、上記の培地に植菌することが好ましい。培地に植菌される菌量は、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが培地中で増殖し得る量であれば良く、具体的には、培地１Ｌ当たり１〜１０白金耳量を植菌することが好ましい。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの培養条件に特に制限はないが、通常、温度１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃でｐＨ５〜８の条件下で行うことが好ましい。培養は静止して行ってもよく、振盪しながら行ってもよい。
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの培養は嫌気下でも好気下でもよいが、好気下での培養が好ましい。培養時間はコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが活発に生育できる時間であれば良く、特に制限はないが、１６〜３６時間が好ましい。
【００１９】
培養後の菌体は遠心分離操作により集菌し、菌体が生存可能な水溶液で洗浄し、さらに菌体が生存可能な水溶液に再懸濁して濁度ＯＤ６００を測定しておく。菌体が生存可能な水溶液として、水や生理食塩水、緩衝液などが挙げられるが、緩衝液であることが好ましい。緩衝液としてはＤ−ＰＢＳ（−）などが挙げられる。このようにして得られた菌体溶液、又はその破砕物、粗抽出物等の菌体処理物を本発明に用いることができる。
【００２０】
本発明において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、アポクリン臭原因物質を生成させる方法を、以下に具体例を挙げて説明する。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
媒体中で、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとアポクリン臭原因物質の前駆物質とを共存させることで両者を接触させることができる。媒体としては、通常の培地を用いることもできるが、アポクリン臭の官能評価および機器分析評価を妨げないものが好ましく、具体的には、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムが生存可能な水溶液を用いることが好ましい。水溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液が挙げられるが、緩衝液であることが好ましい。緩衝液としてはＤ−ＰＢＳ（−）などが挙げられる。
【００２２】
アポクリン臭原因物質の前駆物質との接触時におけるコリネバクテリウム・ツバークロステアリクムの菌体濃度に特に制限はないが、該前駆物質と接触させた状態で、ＯＤ６００＝０．０６〜６．０に調整されることが好ましい。
アポクリン臭原因物質を生成させるために、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとアポクリン臭原因物質の前駆物質とを含む媒体を所望の時間インキュベートする。インキュベート温度、インキュベート時間に特に制限はないが、アポクリン臭原因物質が生成されるのに十分な温度及び時間であることが好ましく、具体的には１５〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃で６時間〜４８時間インキュベーとすることが好ましい。また、インキュベートは静止して行ってもよく、振盪しながら行ってもよい。
インキュベーション時の媒体のｐＨに特に制限はないが、アポクリン臭原因物質の前駆物質との接触時において、ｐＨ５〜８の範囲であることが好ましい。
【００２３】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法で用いる被験物質としては、任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖鎖、ポリマー、天然物抽出物等、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
アポクリン臭は主に硫黄臭様とスパイシー臭から構成されている。これらのうち、本発明における「アポクリン臭」とは、硫黄臭様であることが好ましい。
【００２５】
また、硫黄臭様の主要原因成分は、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オール等の３−メルカプトアルコール化合物である。本発明における「アポクリン臭原因物質」としては、３−メルカプトアルコール化合物であることが好ましく、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オール（本明細書において、「３Ｍ３Ｔ」ともいう。）であることがより好ましい。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムをアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させる。
該前駆物質としては、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによりアポクリン臭原因物質に変換されるものであれば特に制限はなく、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムとヒトの汗とを接触させることで、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムと該汗中に含まれるアポクリン臭原因物質の前駆物質とを接触させることもできる、ヒトの汗としては、ヒトの腋下の汗を用いることが好ましい。
ヒトの汗を採取する方法に特に制限はないが、ガーゼ、脱脂綿等の布帛により腋下の皮膚をこする方法、腋下の皮膚に生理食塩水等を吹き付けた後ガーゼ、脱脂綿等の布帛により拭き取る方法、腋下の皮膚に綿パッドを一定時間挟んでおく方法、腋下の皮膚に当たる部分に綿パッドが縫い付けられた肌着やＴシャツを一定時間着用する方法などが挙げられ、これらの方法は、１つ又は２つ以上を組み合わせて適用することもできる。また、ヒトの汗を採取する前に、腋窩部の発汗を促進しておくことが好ましい。
【００２８】
また、本発明において、前記アポクリン臭原因物質の前駆物質が２−アミノ−７−ヒドロキシ−５−メチル−５−プロピル−４−チアヘプタン酸（本明細書において、「３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓ」ともいう。）であることが好ましい。
【００２９】
【化２】
【００３０】
本発明において好ましく用いることができる３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓの入手方法としては特に制限はなく、市販のものを用いてもよいし、通常の方法により合成したものを用いることができる。例えば、特開２００７−２２５４１１号公報の記載に従って、３Ｍ３Ｔ−Ｃｙｓを合成することができる。
【００３１】
本発明のアポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法およびアポクリン臭の評価方法において、アポクリン臭原因物質の生成の検知方法に特に制限はないが、官能評価等、定性的な方法によって行ってもよいし、カラムクロマトグラフィーを用いて定量的にアポクリン臭原因物質の生成を検知することもできる。
本発明においては、アポクリン臭原因物質の生成の検知を、ラベル化剤を用いてアポクリン臭原因物質を標識し、標識されたアポクリン臭原因物質を検知することで行うことが好ましい。
本発明において用いることができるラベル化剤に特に制限はないが、ラベル化が特異的であることから、アポクリン臭原因物質のチオール基に対して選択性を有するラベル化剤を用いることが好ましい。ラベル化剤として、蛍光物質や発光物質、所望の波長に対して吸収をもつ物質、マススペクトロメトリーで検出しやすい物質などを用いることできる。
本発明において好ましく用いられるラベル化剤の具体例としては、下記式の例示化合物（１）〜（４）が挙げられる。
【００３２】
【化３】
【００３３】
本発明において、ラベル化剤としては上記例示化合物（４）が好ましい。
【００３４】
前記ラベル化剤は通常の方法により合成することができる。また、本発明に用いることができるラベル化剤として市販のものを用いてもよい。例えば、上記例示化合物（１）〜（３）は（株）同仁化学研究所から、例示化合物（４）はＲｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．から入手することができる。
【００３５】
本発明において、アポクリン臭原因物質とラベル化剤との反応条件に特に制限はない。
本発明において、前記ラベル化剤は適当な溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ＴＨＦ、アセトニトリル）に濃度が２５〜２５００μＭとなるように調製して用いるのが好ましい。
試料溶液にラベル化剤を添加してアポクリン臭原因物質を標識する際、０．５Ｍホウ酸−ＮＡ２ＣＯ３−２０ｍＭ ＥＤＴＡバッファー等、ラベル化剤添加後の試料溶液をｐＨ８．０程度に調製できる緩衝液を用いるのが好ましい。
【００３６】
アポクリン臭原因物質とラベル化剤との反応温度に特に制限はなく、０〜１００℃が好ましく、５０〜８０℃がより好ましい。反応時間も特に制限はなく、１０分〜２４時間が好ましく、１〜４時間がより好ましい。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法においては、通常には、被検物質の非存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量と、被検物質の存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量とを比較し、被検物質の存在下においてアポクリン臭原因物質の生成量が減少している場合には、該被検物質をアポクリン臭抑制作用を有する被験物質として選択することができる。また、所定のアポクリン臭抑制剤を標準品とし、被検物質の存在下におけるアポクリン臭原因物質の生成量が、該標準品存在下でのアポクリン臭原因物質の生成量と比べて同等又はそれ以下の場合に、該被検物質をアポクリン臭抑制作用を有する被験物質として選択することもできる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
参考例 例示化合物（４）によるアポクリン臭原因物質のラベル化
「ケミストリー アンド バイオダイバーシティ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」、第１巻、ｐ．２０４２−２０５０、２００４年に記載の方法に従い、３Ｍ３Ｔを合成した。
前記３Ｍ３Ｔの生理食塩水溶液（濃度：１ｐｐｍ）４０μＬに、例示化合物（４）（商品名：１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、Ｒｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．製）のジメチルホルムアミド溶液５０μＬ及び０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを添加し、ｐＨ＝８．０、５０℃で１．５時間反応させた。反応式を以下に示す。
【００４０】
反応終了後、反応液１０μＬについて、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析条件の詳細は以下の通りである。
装置：日立Ｄ−７０００システム
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ φ４．６×１５０ｍｍにガードカラム取り付け
検出：蛍光（λｅｘ ３７０ｎｍ、λｅｍ ４９０ｎｍ）
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
温度：４０℃
溶出溶媒：アセトニトリル／０．２Ｎ酢酸アンモニウム水溶液、グラジェント、２４％→３８％（８分）
【００４１】
その結果を図１に示す。
図１に示すように、保持時間が５．７〜６．１分の間に反応生成物が単一のピークとして検出された。この結果から、例示化合物（４）によるアポクリン臭原因物質のラベル化により下記反応式に示す反応生成物が生成し、前記ピーク面積から３Ｍ３Ｔを正確に定量できることがわかる。
【００４２】
【化４】
【００４３】
実施例 本発明のスクリーニング方法及び評価方法
（１）検量線の作成
サンプル中の３Ｍ３Ｔが１〜１００ｐｐｂとなるように、３Ｍ３Ｔの生理食塩水溶液４０μＬに、例示化合物（４）（商品名：１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、Ｒｅｓａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．製）のジメチルホルムアミド溶液５０μＬ及び０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを添加し、８０℃で１時間３Ｍ３Ｔのラベル化を行った。反応終了後、参考例１に記載の条件と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、反応生成物由来のピーク面積を測定し、３Ｍ３Ｔ濃度に対するピーク面積の検量線を作成した。
【００４４】
（２）コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムによる３Ｍ３Ｔの生成
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム標準菌（菌株番号：ＪＣＭ１３３８９、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室より入手）をＳＣＤＬＰ寒天平板培地上で３７℃において１日生育させた後、その菌叢の１白金耳量を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業株式会社製）を加えたミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ））１Ｌに接種し好気条件下３７℃で１８時間培養した。遠心分離による集菌後、菌のペレットをＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁し、ＯＤ６００＝２０．０となるように菌液を調製した。
【００４５】
健康な米国人女性４９名の腋の下の汗を１．５ｍＬのイオン交換水を含浸した脱脂ガーゼで１日１回、３日間にわたり拭き取った。このガーゼ１枚あたりに無菌水２ｍｌを加えて汗を抽出する操作を２回繰り返し、全ての抽出液をプールした。抽出液と同容量のヘキサンで洗浄後、抽出液を凍結乾燥した。この乾燥標品を無菌水３００μＬ（ガーゼ１枚あたり約１００μＬに相当）を加えて再溶解し、フィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を用いてろ過滅菌したものをアポクリン臭原因物質の前駆物質を含むヒト汗標品とした。
【００４６】
前記菌液１０μＬに、前記ヒト汗標品１０μＬと、Ｄ−ＰＢＳ（−）８０μＬとを添加し、３７℃で６時間振とうしながらインキュベートした（１６０ｒｐｍ）。
【００４７】
（３）アポクリン臭の評価
培養終了後、培養を行なった試験管のふたを開け鼻に近づけて、発せられる臭気を嗅いでアポクリン臭（硫黄臭様）を評価した。評価は、アポクリン臭の官能評価に熟練した者が２人以上で２連行なった。その結果を表１に示す。
【００４８】
（４）３Ｍ３Ｔの生成量測定
次に、培養液を濾過フィルターで除菌して得た濾液について、ＨＰＬＣにより３Ｍ３Ｔの生成量を２連測定した。ＨＰＬＣによる分析条件は以下のとおりである。
除菌後の濾液４０μＬに、直ちにラベル化剤として２５０μＭの例示化合物（４）（ジメチルホルムアミド溶液）５０μＬと０．５Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム−２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬとを混合し、８０℃で１時間反応させて蛍光ラベル化を行なった。反応終了後、反応物をＨＰＬＣで分析し、上記実施例（１）で作成した検量線に基づき、３Ｍ３Ｔと例示化合物（４）との反応物由来のピーク面積から生成した３Ｍ３Ｔ量を定量した。その結果も表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１から、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクムは、アポクリン臭（硫黄臭様）の原因物質（３Ｍ３Ｔ）生成能を有し、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に用いうることが示された。
【００５１】
比較例
コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）標準菌（菌株番号：ＪＣＭ９３９０、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室より入手）を、Ｒ Ａｇａｒ培地（本菌の指定培地）またはＳＣＤＬＰ寒天平板培地上で、３７℃において１日生育させた後、その菌叢の１白金耳量を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業株式会社製）を加えたミューラーヒントン液体培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ））１Ｌに接種し、好気条件下３７℃で１８時間培養した。遠心分離による集菌後、菌のペレットをＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁し、ＯＤ６００＝２０．０となるように菌液を調製した。
この菌液１０μＬに、上記実施例（２）と同様に調製したアポクリン臭原因物質の前駆物質を含むヒト汗標品１０μＬと、Ｄ−ＰＢＳ（−）８０μＬを添加し、３７℃で６時間振とうしながらインキュベートした（１６０ｒｐｍ）。
培養終了後、アポクリン臭の評価と３Ｍ３Ｔの生成量測定を、上記実施例と同様に実施した。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
表２から、コリネバクテリウム・ストリアツム標準菌は、指定培地で増殖させたものから調製した菌液及びＳＣＤＬＰ培地から調製した菌液のいずれにおいても３Ｍ３Ｔ生成能を有さず、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法に用いるのに適さないことが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記アポクリン臭が硫黄臭様である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記アポクリン臭原因物質が３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールである、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記接触が、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をヒトの汗と接触させることにより行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記アポクリン臭原因物質の前駆物質が２−アミノ−７−ヒドロキシ−５−メチル−５−プロピル−４−チアヘプタン酸である、請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）としてヒトの皮膚から分離した菌を用いる、請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ラベル化剤を用いて生成したアポクリン臭原因物質を標識し、標識されたアポクリン臭原因物質を検知することでアポクリン臭原因物質の生成の検知を行う、請求項１〜６のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法。
【請求項１】
被験物質の存在下において、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知することにより、アポクリン臭抑制作用を有する被験物質を選択する、アポクリン臭抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記アポクリン臭が硫黄臭様である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記アポクリン臭原因物質が３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールである、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記接触が、コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をヒトの汗と接触させることにより行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記アポクリン臭原因物質の前駆物質が２−アミノ−７−ヒドロキシ−５−メチル−５−プロピル−４−チアヘプタン酸である、請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）としてヒトの皮膚から分離した菌を用いる、請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ラベル化剤を用いて生成したアポクリン臭原因物質を標識し、標識されたアポクリン臭原因物質を検知することでアポクリン臭原因物質の生成の検知を行う、請求項１〜６のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
コリネバクテリウム・ツバークロステアリクム（Corynebacterium tuberculostearicum）をアポクリン臭原因物質の前駆物質と接触させ、前記微生物によるアポクリン臭原因物質の生成を検知し、アポクリン臭原因物質の生成量を測定することによりアポクリン臭の生成能を評価する、前記微生物のアポクリン臭生成能の評価方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１６７０８２（Ｐ２０１１−１６７０８２Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３１３４２（Ｐ２０１０−３１３４２）
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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