アミドの製造方法
【課題】アミドを対応するニトリルから生産する方法の提供。
【解決手段】ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、ii）微生物を増殖培地中で培養する工程、iii）微生物を貯蔵する工程、iv）微生物を水性媒地中でニトリルと接触させ、それによりニトリルをアミドに変換する工程、を含み、微生物を活発には増殖しない遊離細胞として水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する方法。貯蔵される微生物は、微生物細胞全体であって、発酵培地から回収された細胞ペースト；水、生理的食塩水またはリン酸のような適当な緩衝液などの適当な懸濁媒質を用いて調製した微生物細胞の水性懸濁液の形をしていてもよく、または、発酵培養媒質の成分および微生物培養の産生物を含有する発酵培養液を含む。微生物は、例えば少なくとも２日間、特に３〜２８日間貯蔵しても、活性の著しい損失を示さない。
【解決手段】ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、ii）微生物を増殖培地中で培養する工程、iii）微生物を貯蔵する工程、iv）微生物を水性媒地中でニトリルと接触させ、それによりニトリルをアミドに変換する工程、を含み、微生物を活発には増殖しない遊離細胞として水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する方法。貯蔵される微生物は、微生物細胞全体であって、発酵培地から回収された細胞ペースト；水、生理的食塩水またはリン酸のような適当な緩衝液などの適当な懸濁媒質を用いて調製した微生物細胞の水性懸濁液の形をしていてもよく、または、発酵培養媒質の成分および微生物培養の産生物を含有する発酵培養液を含む。微生物は、例えば少なくとも２日間、特に３〜２８日間貯蔵しても、活性の著しい損失を示さない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミドを対応するニトリルから、ニトリルヒドラターゼ酵素を産生することができる微生物である生体触媒を用いて製造するための方法に関する。
【０００２】
酵素を含む微生物などの生体触媒を、化学反応を行なうために使用することは、周知である。ニトリルヒドラターゼ酵素は、ニトリルを直接対応するアミドとする水和反応を触媒することが知られている。典型的にはニトリルヒドラターゼ酵素を、様々な微生物、例えばバシラス（Bacillus）、バクテリジウム（Bacteridium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、キサントバクター（Xanthobacter）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、アエロモナス（Aeromonas）、シトロバクター（Citrobacter）、アヒロモバクター（Achromobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）およびロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物が産生することができる。
【０００３】
ロドコッカス ロドヒラス（Rhodococcus rhodochrous）種の様々な菌株が、非常に効率的にニトリルヒドラターゼ酵素を産生することが見出された。ＥＰ−０ ３０７ ９２６がロドコッカス ロドヒラスの培養、具体的にはＪ１株のコバルトイオンを含む培地中における培養について記述する。ニトリルヒドラターゼを、ニトリルを水和してアミドにするために、特に３−シアノピリジンをニコチンアミドへ転換するために用いることができる。ロドコッカス ロドヒラスJ1は、アクリルアミドモノマーをアクリロニトリルから製造するために商業的に用いられ、このプロセスはNagasawa and Yamada Pure Appl. Chem. 67: 1241-1256 (1995)に記述されている。ＥＰ−Ａ−０３６２８２９が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドヒラスの細胞を調製するための、尿素およびコバルトイオンの少なくとも１つを含むロドコッカス ロドヒラス種のバクテリアの培養方法について記述する。具体的に記述されているのは、ロドコッカス ロドヒラスJ1である。
【０００４】
Leonova et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000)題名「Nitrile Hydratase of Rhodococcus」が、ロドコッカス ロドヒラスM8における増殖およびニトリルヒドラターゼの合成について記述する。この菌株のニトリルヒドラターゼ合成を培地中の尿素が誘導し、また増殖のための窒素源としてこの生物に用いられる。コバルトも高いニトリルヒドラターゼ活性に必要である。この文献論文は、主に誘導および代謝効果に目を向けている。
【０００５】
Leonova et al., Appl.Biochem.Biotechnol.88: 231-241 (2000)は、さらに、アクリルアミドがロシアでロドコッカス ロドヒラスM8を用いて商業的に生産されていると述べている。Ｒｕｓｓｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ １７３１８１４が、ロドコッカス ロドヒラス菌株M8を記載している。
【０００６】
尿素のような誘導物質を必要とせずにニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス ロドヒラス菌株M33についてＵＳ−Ａ−５８２７６９９に記述されている。微生物のこの菌株はロドコッカス ロドヒラスM8の派生株である。
【０００７】
生体触媒の使用に伴う主な不利益は、貯蔵、輸送および使用中に湿った微生物材料で見られる一般的な安定性の欠如である。ロドコッカス細胞中のニトリルヒドラターゼなどの比較的安定した酵素およびバクテリアでさえも、使用前に損傷される可能性があるために、例えば水性混合物を凍結または凍結乾燥すること、または何かのポリマー基質中に細胞を固定化するなどの何らかの方法で、生体触媒細胞懸濁液を処理する必要性を業界が受け入れている。生体触媒から最大の生産性を得るために、その使用に先立つ調製および貯蔵の間に最大の生体触媒活性を保持することが重要である。Chaplin and Bucke (1990) in: Enzyme Technology, published by Cambridge University Press, p47 (Enzyme preparation and use)の中で、酵素の不活性化は、熱、タンパク質分解、至適でないｐＨ、酸化変性剤および不可逆的阻害剤により引き起され得ることが認識されていた。多くの物質が、酵素の反応触媒能力の率の低下を引き起こす可能性がある。これには、尿素などの非特異的タンパク質変性剤である物質が含まれる。
【０００８】
公開文書Protein Stability, by Willem JH van Berkel, Wageningen Universityでは、タンパク質の不活性化または変性を引き起こす可能性のある因子が検討され、これらにはプロテアーゼ、酸素または酸素ラジカルの存在による酸化および尿素などの可逆的な変性を引き起こす変性剤が含まれていた。
【０００９】
Chaplin and Bucke (1990) In Enzyme Technology, published by Cambridge University Press, p73(Enzyme preparation and use)は、酵素活性の保持に関する主要因子には、酵素の立体配座構造の維持が含まれることを明らかにした。したがって、変性、凝集および共有結合構造中の変化を防ぐことが相当重要であった。これを達成するために３つのアプローチ：（１）添加剤の使用；（２）共有結合修飾の制御された使用；および（３）酵素の固定化、が検討された。
【００１０】
ＥＰ−Ｂ−０−２４３−９６７は、ニトリル、アミドおよび有機酸ならびにそれらの塩から選ばれる安定化化合物を、酵素の溶液または懸濁液、あるいは固定化型酵素へ加えることによる、ニトリラーゼのニトリル水和活性の保持について記述している。それは記述の中で、アクリロニトリルなどのニトリルを水和してアクリルアミドなどの対応するアミドを生産するニトリラーゼを産生することができる微生物の溶液または懸濁液は、保存期間が短い限り室温で保存してもよいが、低温での、特に０℃近くの温度での保存が好ましい、と明白に述べている。ＥＰ−Ａ−０ ７０７ ０６１には、１００mM〜飽和濃度の濃度の無機塩類を、微生物細胞の懸濁液または固定化微生物細胞のいずれかを含む水性媒質へ添加することにより、細胞および酵素活性が長期間保存されたことが記載された。ニトリルヒドラターゼまたはニトリラーゼ活性を有する微生物細胞を保存するために、この技術について記述する。重炭酸塩または炭酸塩の、ニトリラーゼ活性を有する固定された、または固定されていない微生物細胞の水溶液への添加について、ＵＳ−Ｂ−６，３６８，８０４に記述されている。固定化には、基質中に酵素を固定する前に、しばしば細胞全体から酵素を取り出すことが含まれる。しかし、そのような固定化は酵素に非常によい保護をもたらすが、細胞全体からの酵素の抽出は、時間がかかり、高価で、また酵素が損失する結果となり得る、複雑な工程である。さらに、微生物細胞全体を固定することができる。ＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８には、良好な保存安定性を有し、腐敗を防ぐ陽イオン性コポリマー中に全細胞生体触媒を固定する方法が与えられている。
【００１１】
アクリルアミドモノマーを製造するために商業的に用いられるロドコッカス ロドヒラスJ1を、（ａ）輸送を可能にするため、および（ｂ）使用中の生体触媒の寿命を増大させるために固定化する。ＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８において発明者らは、生体触媒を工業的規模での使用においては通常固定化して、生体触媒から生産物の中へ不純物が溶出するのを防ぎつつ反応生産物から生体触媒を容易に分離することを促進し、また生体触媒の連続処理および再利用を促進すると述べている。しかし固定化は、追加の設備、ならびに、アルギン酸塩、カラギーナン、アクリルアミドおよび他のアクリラートモノマー、およびビニルアルコールなどの多数の他の原料の使用を必要とする可能性がある余分の処理工程である。したがって、これは高価な処理工程である。
【００１２】
化学反応プロセスへの悪影響を減少させる試みの中で、酵素不活性化の有害な作用を最小限にするために、様々な他の方法が提案されてきた。
【００１３】
ＵＳ−Ａ−６，０４３，０６１において、反応混合物中のシアン化水素酸濃度の減少が、ニトリルヒドラターゼの不活性化を抑制できることが明らかされた。
【００１４】
また長期間に亘る貯蔵中に酵素活性を保持するために、生体触媒を凍結乾燥することも知られている。これもまた、小規模に調製される生体触媒ついて通常行なわれる、高価である可能性のある処理工程である。液体窒素中または液体窒素の気相中での低温保存もまた微生物細胞を長期間貯蔵することができるが、液体窒素の持続的な供給が必要である。
【００１５】
生体触媒として使用する微生物の増殖が数日間に亘って起る可能性がある。この間は、微生物は、活発に増殖しており、適切な栄養源の供給、増殖用の正確な温度およびｐＨの維持、およびもし必要であれば酸素の供給により、増殖状態で維持される。
【００１６】
通常は、微生物の増殖は栄養源の涸渇または有毒代謝産物の蓄積のいずれかにより制限され、増殖速度が低下する。適切な栄養源の供給および増殖用の正確な温度とｐＨの維持により、また必要な場合には酸素の供給により、増殖が維持される。
【００１７】
全微生物細胞の形の生体触媒がその増殖期を終わったが、それが活性を有する生体触媒であるためには、例えば生体触媒反応が起こるための補助因子の再生のために代謝し続けることが必要な場合がある。これらの場合には、代謝を維持するために化合物を生体触媒に供給する。
【００１８】
しかしながら、ニトリルヒドラターゼを産生するような生体触媒を継続的な増殖なしにある期間、たとえ数日間でも貯蔵することになる場合は、触媒として必要なのが細胞内の酵素であるか、あるいは酵素が発酵培地へ分泌されるかにかかわらず、微生物細胞を発酵培養液から取り出すのが普通である。これは、培養液の腐敗を引き起こす発酵培養液中の微生物増殖を防ぎ、必要な酵素の破壊を引き起こす場合があるプロテアーゼ活性を減少させるためである。したがって、発酵培養液それ自身を保存するか、または微生物汚染などの外来の生物活性による生体触媒の分解を防ぐために、細胞を取り出すことが普通である。もしこれを実行しなければ、生体触媒の活性は一日以内に、また確実に２日未満などの極めて短期間で、普通は低下すると予想することができるであろう。生体触媒を貯蔵中に、１週間の期間までさえも活性を保持しておく方法は、普通は発酵培養液からの生体触媒の分離、および／または生体触媒の適当な基質中への固定化、および／または安定化物質を用いた安定化を含んでいた。安定化物質はその後反応液中の混入物となり、またこれは、生体触媒として用いる前に微生物細胞懸濁液からそれらを取り出すために、さらに下流のまたは追加の処理工程が必要となるという問題である可能性がある。
【００１９】
そのような保存処置がない状態では、生体触媒は、周囲温度で維持されたときには、もはや触媒反応に同程度に有効ではないか、適切ですらない程度に活性を失う傾向がある。
【００２０】
生物学的にニトリルをアミドに変換するための単純化された手段を提供することが望ましいであろう。更に微生物を、アミドの製造に微生物を使用するのに先立って、活性の実質的な消失がなく、および貯蔵安定性を達成するために通常は必要な追加の処理工程を避ける方法で貯蔵することが望ましいであろう。周囲温度で貯蔵する際の微生物の腐敗を避けることも望ましいであろう。
【００２１】
本発明に従って、本発明者らは、アミドを対応するニトリルから生産する方法であって：
ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、
ii）微生物を適当な増殖培地中で培養する工程、
iii）微生物を貯蔵する工程、
iv）水性媒質中で微生物をニトリルと接触させ、そして、それによってニトリルをアミドへ変換する工程、
を含み、微生物を、活発には増殖していない遊離細胞として、水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する方法を提供する。
【００２２】
貯蔵する微生物は、微生物細胞全体として存在してよく、これは発酵培地（培地または増殖培地）から回収された細胞ペーストの形をしていてもよい。
【００２３】
さらに微生物を増殖培地から回収し、次に微生物細胞の水性懸濁液として懸濁用媒質中に貯蔵してもよい。これは例えば水、生理的食塩液、またはリン酸緩衝液または発酵培地の成分および／または微生物の増殖による生産物を含む発酵培養液などの適当なｐＨ緩衝液のような適当な懸濁溶媒を用いて調製した微生物細胞の水性懸濁液である。
【００２４】
好ましくは微生物を、例えば遠心分離またはろ過を用いる微生物の回収などのさらなる下流の処理工程なしに、元の発酵培地から回収せず貯蔵する。
【００２５】
微生物細胞を、活発には増殖していない培養物と見なすことができる。これによって本発明者らは、微生物を保持する媒質および貯蔵条件が増殖を促進するとは予想されないことを意味する。貯蔵媒質は、例えば発酵培地；水；生理的食塩水；リン酸緩衝液または他の同様の緩衝液などの適当な緩衝液、あるいは増殖速度またはバイオマス濃度または酸素消費量または栄養素消費の測定、あるいは一般に微生物の増殖および代謝のモニターに用いられる他の形式の測定により決定される、微生物細胞内の代謝が実質的にゼロの増殖培地から回収された微生物細胞であり得る。
【００２６】
組成物または貯蔵媒質は、任意の残余の発酵培養液の成分を含んでよい。発酵培養液は、微生物を培養するために用いられる任意の典型的な成分を含んでいてよく、また微生物により産生された生産物および副産物をさらに含んでいてもよい。発酵培養液の典型的な成分には、砂糖、多糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、窒素源、無機塩類、ビタミン、生長調節物質および酵素誘導物質が含まれる。具体的には、これには、糖として単糖または二糖類；アンモニウム塩または他の窒素源；リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウム塩などの無機塩類、金属化合物；ビタミン；および例えばコーンスティープリカー（corn steep liquor）のような複雑な発酵培地成分；ペプトン；酵母エキス；特別の微生物生育の必要性のために用いられる有機または無機化合物；特異的な酵素誘導物質（ある微生物のニトリルヒドラターゼを誘導するために用いられる尿素など）；およびクエン酸またはピルビン酸などの有機酸；および微生物の良好な増殖を確実にするため必要な他の任意の有機または無機化合物が含まれるであろう。
【００２７】
通常、ニトリルヒドラターゼを産生するような微生物を、ある期間たとえ数日でさえも、継続的な増殖なしに貯蔵する場合には、発酵培養液から微生物細胞を取り出すのが、触媒として必要なのが細胞であっても、あるいは細胞または発酵培地から酵素を回収するのであっても、通常である。これは、培養液の腐敗を引き起こす発酵培養液中の微生物増殖を阻止し、必要な酵素の破壊を引き起こす可能性があるプロテアーゼ活性を低下させるためである。したがって、発酵培養液それ自身を保存するか、細胞を取り除いて、微生物汚染などの外来の生物活性による生体触媒の分解を防ぐことが通常である。もしこれを実行しなければ、生体触媒活性は一日以内に、２日未満には確実に、など極めて短期間に低下すると予想することが通常できるであろう。
【００２８】
この局面で記載する貯蔵方法は、活性の実質的な損失なしに容易に生体触媒を用いることができる有効な安定性を増進するべきである。貯蔵安定性は、例えば固定化、安定化化合物の添加、凍結乾燥などに頼る必要なしに達成される。尿素は公知のタンパク質不活性化剤であるが、尿素または尿素誘導体などの発酵培養液成分の何れかの除去に頼らずに、貯蔵安定性を達成することができる。
【００２９】
貯蔵方法において用いられる組成物または環境は、酸素を含んでいてもよいし、または実質的に酸素フリーの環境であることもできる。酸素フリーという語句で、本発明者らは酸素の濃度が１％溶存酸素濃度未満であるべきことを意味する。発酵培養液からの酸素の除去を、酸素を除去するための任意の従来方法により達成することができる。これらには、不活性ガスによる一定期間の浄化、貯蔵容器のヘッドスペースの除去、減圧下での貯蔵またはアスコルビン酸またはヒドラジンおよびヒドラジドなどの公知の脱酸素剤の添加が含まれる。
【００３０】
２日間、特に数日間の貯蔵後には、ある程度のニトリルヒドラターゼ活性の損失があると予想されていたであろう。酸素不在下でさえ、これが予想されていたであろう。特にそれは、尿素などの残余の発酵培養液成分の存在下で、そしてさらに０℃を越す温度では、予想されていたであろう。これは生体触媒中のプロテアーゼ酵素がニトリルヒドラターゼを含む細胞の他のタンパク質を分解すると予想されるからかもしれない。しかし、生体触媒は、予期された不利益のいずれも蒙らず、したがってニトリルヒドラターゼ活性の実質的な損失を蒙らない。
【００３１】
反対に本発明者らは、貯蔵期間に、ニトリルヒドラターゼを含む生体触媒の活性が実際に増大することを見出している。したがって、本発明の別の局面では、本発明者らは、本発明の貯蔵方法に従って貯蔵媒質中に生体触媒を貯蔵することにより、ニトリルヒドラターゼを形成できる生体触媒のニトリルヒドラターゼ活性を増大させる方法を提供する。したがって、その方法は、その活性が増大する結果、新しい生体触媒組成物をもたらすことができる。したがって、生体触媒組成物の、また特に生体触媒の貯蔵中に形成されたニトリルヒドラターゼは新規である。さらに、生体触媒は、貯蔵期間中に腐敗に伴う悪臭を産生しない。
【００３２】
好ましくは、貯蔵方法は、少なくとも２日、より好ましくは１週間以上生体触媒を貯蔵しておくことを可能にする。特に生体触媒を３日〜２８日、例えば３〜１４日、貯蔵してもよい。
【００３３】
尿素または尿素誘導体が、発酵混合物に含まれることにより、生体触媒組成物の中に存在する可能性がある。本発明のある形式では、生体触媒を含む組成物または貯蔵媒質は、脱酸素されてもよく、また尿素のような発酵培養液成分を含んでもよい。生体触媒は望ましくは、ニトリルヒドラターゼ酵素を産生することができる微生物である。例えば、これはバシラス、バクテリジウム、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、シュードモナス、アシネトバクター、キサントバクター、ストレプトマイセス、リゾビウム、クレブシエラ、エンテロバクター、エルウィニア、アエロモナス、シトロバクター、アヒロモバクター、アグロバクテリウム、シュードノカルディアおよびロドコッカス属から選ばれる微生物であってよい。生体触媒は、特にロドコッカス属の微生物、好ましくはロドコッカス ロドヒラス種である。特に適切な生体触媒は、ロドコッカス ロドヒラス菌株 NCIMB 41164であり、これは本発明者らの同時出願に係る、事件参照番号ＢＴ／３−２２３５１／Ｐ１を割当られたＵＫ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０３２７９０７．２に記載されクレームされている。
【００３４】
ロドコッカス ロドヒラス菌株NCIMB 41164
１． 起源および寄託
菌株 NCIMB 41164は、本発明者らが英国、ブラッドフォードで土壌から分離して、２００３年３月５日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria(ＮＣＩＭＢ)に寄託し、ブダペスト条約の下に受託番号ＮＣＩＭＢ ４１１６４を割当てられた。
２． 形態的および培養特性
（１） 多形性の増殖
（２） 運動性：運動不能
（３） 非胞子形成菌
（４） グラム陽性
（５） 好気性
（６） 栄養寒天培地上の増殖により、３０℃４８時間以内にサーモンピンクの円形コロニーを生ずる。
【００３５】
本発明のこの局面の特に有利な特徴は、生体触媒を、それを培養した発酵混合物から分離することがもはや必要でないということである。それは、追加の処理工程を必要でなくするので重要な価値がある。したがって、組成物がさらに発酵混合物を含んでもよく、その後それを貯蔵する。生体触媒を貯蔵する方法では、発酵混合物が存在する状態でも酵素活性になんら有害な影響なくこれを達成できることを本発明者らは見出している。これがまた、生物変換工程を数日間にわたって実行しながら、その発酵培養液を反応を触媒するために直ちに用いることを可能にし、または損傷なく数日間または何週間も貯蔵することを可能にする。その結果、追加の処理工程を必要とせずに、容易に利用できる生体触媒の定常的な供給が保証され、したがって生物変換工程のコストを簡素化し低下させることになる。
【００３６】
生体触媒は、その凍結点より上の温度で便利に貯蔵できる。通常、生体触媒を周囲温度で、例えば３０℃または４０℃までで貯蔵する。しかし、本発明の方法の利点は、周囲温度で、温度の監視と制御のための特別の注意なしに、生体触媒を貯蔵できることである。生体触媒を、好ましくは４〜３０℃または４０℃の温度で、より好ましくは５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、特に１５〜２５℃で貯蔵する。
【００３７】
本発明によれば、生体触媒は酸素を含む環境中に保持されていたのでもよく、または酸素フリーの環境に保持されていたのでもよい。ニトリルの変換を始める前に残余の発酵培養液成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。これは発酵培養液成分存在下の微生物貯蔵に従った生体触媒貯蔵の結果であってもよい。
【００３８】
以前に示したように、生体触媒を調製した発酵混合物から生体触媒を取り出す必要はない。本発明に従い、生体触媒を保持する環境もまた発酵培養液の成分を含む。したがって、発酵培養液の成分を含む生体触媒組成物をニトリルと混合することができ、ニトリルはその後水和されて対応するアミドとなる。本発明者らは驚くべきことに、従来の；例えばＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８中で記述されている、生体触媒の固定化が生体触媒から反応生産物中への不純物の溶出を防ぐのに望ましいという知識とは対照的に、反応混合液中へ発酵培養液を含めることが、最終生産物の質に影響しないことを発見した。この局面については、本発明者らの同時出願に係る、事件番号ＢＴ／３−２２３４９／Ｐ１により特定されるＵＫ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０３２７９０１．５に記述されている。
【００３９】
発酵混合物は微生物を増殖させ保持することを可能にするために必須の成分を含むことになる。一般に、混合物は少なくとも炭素源、窒素源および様々な栄養源を含むであろう。これは、例えばグルコースまたは他の糖などの単糖、または二糖類または多糖類のような糖類、アンモニウム塩、酵母エキスおよびペプトンなどの複合培地成分、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウム塩、鉄、コバルト、マンガン、銅、亜鉛その他などの微量元素を含んでもよい。これらおよび他の成分を、特定の微生物に適切な濃度で発酵混合物中に含めることができる。発酵物は生体触媒の生産性の変化に依存する可能性があることが知られており、様々な生育段階で発酵培養液が用いられる可能性がある。したがって、そのような方法による生産の後に生体触媒を貯蔵できることが重要である。
【００４０】
本発明者らは、生体触媒の活性が長期間の反応の間に実質的に減少することはないことを見出している。従って、生体触媒をそれほど頻繁に交換しなくてもよい。生体触媒を少なくとも２日間用いて、その期間中活性を実質的に失わないのが好ましい。
【００４１】
一般に、ニトリルヒドラターゼを用いる反応の触媒作用は、単一工程でニトリルを対応するアミドに変換することができる。このプロセスは、ニトリルがアクリロニトリルで、アミドがアクリルアミドである場合に、特に価値がある。この変換工程を、生体触媒の単一バッチを用いて数回行ない、そこから数日間に亘って一部分ずつを取り出して、ニトリルをアミドに変換するいくつかの反応を行なうことが望ましい。したがって、生物変換工程を同時に行なっている間に、触媒に対する損傷なしに、生体触媒をできるだけ低費用で貯蔵できることが重要である。そうすれば、実際上生体触媒の１つのバッチを、例えばアクリルアミドのいくつかのバッチを作るためにすぐに使用できるように貯蔵することができる。いくつかのバッチは、５〜１０またはより多くのバッチであり、１５〜２０のバッチでさえも、あり得る。
【００４２】
次の実施例は本発明の説明例である。
【００４３】
実施例１
（１）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１．０；酵母エキス３．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１；尿素５．０、を含む１８０Ｌの培地を入れた２８０Ｌの発酵槽中で増殖させた。培地のｐＨをpH７．２に調整した。培養物を３０℃で３日間増殖させた。
【００４４】
２５Ｌの発酵培養液を、周囲温度での貯蔵に先立って２０分間窒素で脱気した。貯蔵は約５℃で３1/2日であった。ニトリルヒドラターゼ活性を収穫１５ｈ後に測定し、それは、２５℃で２４２，０００U/gであった。３日後の最初のアクリルアミド生産試行の直前に再度ＮＨ活性を測定した時、それは２９３，０００U/gであった。
【００４５】
実施例２
ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２Lエルレンマイヤーフラスコ中で５日間２８℃で、１８０rpmで振動させながら、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１０，０；酵母エキス３．０；尿素５．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１、を含む培地中で増殖させた。細菌細胞を培養液の半分から遠心分離を用いて収穫した。培養液を２分し、半分に窒素を１０分間用いて脱酸素した。脱酸素した培養液部分、酸素を含む培養液部分の両方を、４、１５および２５℃で１週間インキュベーションした。両部分のニトリルヒドラターゼ活性を定期的に測定した。
【００４６】
ニトリルヒドラターゼ分析の結果を、表１に示す。結果は、Ｕ／mg乾燥細胞で示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例３
ロドコッカス ロドヒラスJ1を、２Lエルレンマイヤーフラスコ中、５日間２８℃で１８０rpmで振動させながら次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．５；リン酸水素カリウム０．５；グルコース２０．０；ペプトン５．０；酵母エキス１．０；尿素７．５；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１、を含む培地中で増殖させた。培養液の半分からの細菌細胞を、遠心分離を用いて収穫した。培養液を２分し、半分を窒素を１０分間用いて脱酸素した。脱酸素した培養液部分、酸素を含む培養液部分の両方を、４、１５および２５℃で１週間インキュベーションした。両部分のニトリルヒドラターゼ活性を定期的に測定した。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
実施例２および３の両方の結果から、生体触媒を周囲温度で効果的に貯蔵できることがわかる。さらに、ニトリルヒドラターゼ活性が０日目に比較して貯蔵により増大することがわかる。これは、ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164で最も顕著であった。
【００５１】
実施例４
解凍したロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164の細胞を水に再懸濁した。１週間の間ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。測定した相対的なニトリルヒドラターゼ活性を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】
表３の結果は、１〜７日間のインキュベーション期間の貯蔵温度のいずれにおいても、活性が減少しなかったことを示す。
【００５４】
実施例５
（１）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１０．０；酵母エキス３．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；尿素５．０；塩化コバルト六水和物０．０１；全体で１Lとする水道水、を含む１００mlの培地を含む、０．５Lのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中で増殖させた。培地のｐＨをpH７．２に調整した。培養物を３０℃で４日間増殖させた。ニトリルヒドラターゼ活性を２５℃で２、３および４日間の増殖の後に測定した。
（２）（ａ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、尿素をジメチル尿素と置き換えた点を除いて（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｂ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、尿素をエチル尿素と置き換えた点を除いて（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｃ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２．５g/Lの尿素および２．５g/Lのジメチル尿素を５g/Lの尿素のかわりに培地に加えた点を除いて、（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｄ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２．５g/Lの尿素および２．５g/Lのエチル尿素を５g/Lの尿素のかわりに加えた点を除いて、（１）に記述した培地で増殖させた。
ニトリルヒドラターゼ活性を表４に示す。
【００５５】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミドを対応するニトリルから、ニトリルヒドラターゼ酵素を産生することができる微生物である生体触媒を用いて製造するための方法に関する。
【０００２】
酵素を含む微生物などの生体触媒を、化学反応を行なうために使用することは、周知である。ニトリルヒドラターゼ酵素は、ニトリルを直接対応するアミドとする水和反応を触媒することが知られている。典型的にはニトリルヒドラターゼ酵素を、様々な微生物、例えばバシラス（Bacillus）、バクテリジウム（Bacteridium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、キサントバクター（Xanthobacter）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、アエロモナス（Aeromonas）、シトロバクター（Citrobacter）、アヒロモバクター（Achromobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）およびロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物が産生することができる。
【０００３】
ロドコッカス ロドヒラス（Rhodococcus rhodochrous）種の様々な菌株が、非常に効率的にニトリルヒドラターゼ酵素を産生することが見出された。ＥＰ−０ ３０７ ９２６がロドコッカス ロドヒラスの培養、具体的にはＪ１株のコバルトイオンを含む培地中における培養について記述する。ニトリルヒドラターゼを、ニトリルを水和してアミドにするために、特に３−シアノピリジンをニコチンアミドへ転換するために用いることができる。ロドコッカス ロドヒラスJ1は、アクリルアミドモノマーをアクリロニトリルから製造するために商業的に用いられ、このプロセスはNagasawa and Yamada Pure Appl. Chem. 67: 1241-1256 (1995)に記述されている。ＥＰ−Ａ−０３６２８２９が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドヒラスの細胞を調製するための、尿素およびコバルトイオンの少なくとも１つを含むロドコッカス ロドヒラス種のバクテリアの培養方法について記述する。具体的に記述されているのは、ロドコッカス ロドヒラスJ1である。
【０００４】
Leonova et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000)題名「Nitrile Hydratase of Rhodococcus」が、ロドコッカス ロドヒラスM8における増殖およびニトリルヒドラターゼの合成について記述する。この菌株のニトリルヒドラターゼ合成を培地中の尿素が誘導し、また増殖のための窒素源としてこの生物に用いられる。コバルトも高いニトリルヒドラターゼ活性に必要である。この文献論文は、主に誘導および代謝効果に目を向けている。
【０００５】
Leonova et al., Appl.Biochem.Biotechnol.88: 231-241 (2000)は、さらに、アクリルアミドがロシアでロドコッカス ロドヒラスM8を用いて商業的に生産されていると述べている。Ｒｕｓｓｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ １７３１８１４が、ロドコッカス ロドヒラス菌株M8を記載している。
【０００６】
尿素のような誘導物質を必要とせずにニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス ロドヒラス菌株M33についてＵＳ−Ａ−５８２７６９９に記述されている。微生物のこの菌株はロドコッカス ロドヒラスM8の派生株である。
【０００７】
生体触媒の使用に伴う主な不利益は、貯蔵、輸送および使用中に湿った微生物材料で見られる一般的な安定性の欠如である。ロドコッカス細胞中のニトリルヒドラターゼなどの比較的安定した酵素およびバクテリアでさえも、使用前に損傷される可能性があるために、例えば水性混合物を凍結または凍結乾燥すること、または何かのポリマー基質中に細胞を固定化するなどの何らかの方法で、生体触媒細胞懸濁液を処理する必要性を業界が受け入れている。生体触媒から最大の生産性を得るために、その使用に先立つ調製および貯蔵の間に最大の生体触媒活性を保持することが重要である。Chaplin and Bucke (1990) in: Enzyme Technology, published by Cambridge University Press, p47 (Enzyme preparation and use)の中で、酵素の不活性化は、熱、タンパク質分解、至適でないｐＨ、酸化変性剤および不可逆的阻害剤により引き起され得ることが認識されていた。多くの物質が、酵素の反応触媒能力の率の低下を引き起こす可能性がある。これには、尿素などの非特異的タンパク質変性剤である物質が含まれる。
【０００８】
公開文書Protein Stability, by Willem JH van Berkel, Wageningen Universityでは、タンパク質の不活性化または変性を引き起こす可能性のある因子が検討され、これらにはプロテアーゼ、酸素または酸素ラジカルの存在による酸化および尿素などの可逆的な変性を引き起こす変性剤が含まれていた。
【０００９】
Chaplin and Bucke (1990) In Enzyme Technology, published by Cambridge University Press, p73(Enzyme preparation and use)は、酵素活性の保持に関する主要因子には、酵素の立体配座構造の維持が含まれることを明らかにした。したがって、変性、凝集および共有結合構造中の変化を防ぐことが相当重要であった。これを達成するために３つのアプローチ：（１）添加剤の使用；（２）共有結合修飾の制御された使用；および（３）酵素の固定化、が検討された。
【００１０】
ＥＰ−Ｂ−０−２４３−９６７は、ニトリル、アミドおよび有機酸ならびにそれらの塩から選ばれる安定化化合物を、酵素の溶液または懸濁液、あるいは固定化型酵素へ加えることによる、ニトリラーゼのニトリル水和活性の保持について記述している。それは記述の中で、アクリロニトリルなどのニトリルを水和してアクリルアミドなどの対応するアミドを生産するニトリラーゼを産生することができる微生物の溶液または懸濁液は、保存期間が短い限り室温で保存してもよいが、低温での、特に０℃近くの温度での保存が好ましい、と明白に述べている。ＥＰ−Ａ−０ ７０７ ０６１には、１００mM〜飽和濃度の濃度の無機塩類を、微生物細胞の懸濁液または固定化微生物細胞のいずれかを含む水性媒質へ添加することにより、細胞および酵素活性が長期間保存されたことが記載された。ニトリルヒドラターゼまたはニトリラーゼ活性を有する微生物細胞を保存するために、この技術について記述する。重炭酸塩または炭酸塩の、ニトリラーゼ活性を有する固定された、または固定されていない微生物細胞の水溶液への添加について、ＵＳ−Ｂ−６，３６８，８０４に記述されている。固定化には、基質中に酵素を固定する前に、しばしば細胞全体から酵素を取り出すことが含まれる。しかし、そのような固定化は酵素に非常によい保護をもたらすが、細胞全体からの酵素の抽出は、時間がかかり、高価で、また酵素が損失する結果となり得る、複雑な工程である。さらに、微生物細胞全体を固定することができる。ＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８には、良好な保存安定性を有し、腐敗を防ぐ陽イオン性コポリマー中に全細胞生体触媒を固定する方法が与えられている。
【００１１】
アクリルアミドモノマーを製造するために商業的に用いられるロドコッカス ロドヒラスJ1を、（ａ）輸送を可能にするため、および（ｂ）使用中の生体触媒の寿命を増大させるために固定化する。ＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８において発明者らは、生体触媒を工業的規模での使用においては通常固定化して、生体触媒から生産物の中へ不純物が溶出するのを防ぎつつ反応生産物から生体触媒を容易に分離することを促進し、また生体触媒の連続処理および再利用を促進すると述べている。しかし固定化は、追加の設備、ならびに、アルギン酸塩、カラギーナン、アクリルアミドおよび他のアクリラートモノマー、およびビニルアルコールなどの多数の他の原料の使用を必要とする可能性がある余分の処理工程である。したがって、これは高価な処理工程である。
【００１２】
化学反応プロセスへの悪影響を減少させる試みの中で、酵素不活性化の有害な作用を最小限にするために、様々な他の方法が提案されてきた。
【００１３】
ＵＳ−Ａ−６，０４３，０６１において、反応混合物中のシアン化水素酸濃度の減少が、ニトリルヒドラターゼの不活性化を抑制できることが明らかされた。
【００１４】
また長期間に亘る貯蔵中に酵素活性を保持するために、生体触媒を凍結乾燥することも知られている。これもまた、小規模に調製される生体触媒ついて通常行なわれる、高価である可能性のある処理工程である。液体窒素中または液体窒素の気相中での低温保存もまた微生物細胞を長期間貯蔵することができるが、液体窒素の持続的な供給が必要である。
【００１５】
生体触媒として使用する微生物の増殖が数日間に亘って起る可能性がある。この間は、微生物は、活発に増殖しており、適切な栄養源の供給、増殖用の正確な温度およびｐＨの維持、およびもし必要であれば酸素の供給により、増殖状態で維持される。
【００１６】
通常は、微生物の増殖は栄養源の涸渇または有毒代謝産物の蓄積のいずれかにより制限され、増殖速度が低下する。適切な栄養源の供給および増殖用の正確な温度とｐＨの維持により、また必要な場合には酸素の供給により、増殖が維持される。
【００１７】
全微生物細胞の形の生体触媒がその増殖期を終わったが、それが活性を有する生体触媒であるためには、例えば生体触媒反応が起こるための補助因子の再生のために代謝し続けることが必要な場合がある。これらの場合には、代謝を維持するために化合物を生体触媒に供給する。
【００１８】
しかしながら、ニトリルヒドラターゼを産生するような生体触媒を継続的な増殖なしにある期間、たとえ数日間でも貯蔵することになる場合は、触媒として必要なのが細胞内の酵素であるか、あるいは酵素が発酵培地へ分泌されるかにかかわらず、微生物細胞を発酵培養液から取り出すのが普通である。これは、培養液の腐敗を引き起こす発酵培養液中の微生物増殖を防ぎ、必要な酵素の破壊を引き起こす場合があるプロテアーゼ活性を減少させるためである。したがって、発酵培養液それ自身を保存するか、または微生物汚染などの外来の生物活性による生体触媒の分解を防ぐために、細胞を取り出すことが普通である。もしこれを実行しなければ、生体触媒の活性は一日以内に、また確実に２日未満などの極めて短期間で、普通は低下すると予想することができるであろう。生体触媒を貯蔵中に、１週間の期間までさえも活性を保持しておく方法は、普通は発酵培養液からの生体触媒の分離、および／または生体触媒の適当な基質中への固定化、および／または安定化物質を用いた安定化を含んでいた。安定化物質はその後反応液中の混入物となり、またこれは、生体触媒として用いる前に微生物細胞懸濁液からそれらを取り出すために、さらに下流のまたは追加の処理工程が必要となるという問題である可能性がある。
【００１９】
そのような保存処置がない状態では、生体触媒は、周囲温度で維持されたときには、もはや触媒反応に同程度に有効ではないか、適切ですらない程度に活性を失う傾向がある。
【００２０】
生物学的にニトリルをアミドに変換するための単純化された手段を提供することが望ましいであろう。更に微生物を、アミドの製造に微生物を使用するのに先立って、活性の実質的な消失がなく、および貯蔵安定性を達成するために通常は必要な追加の処理工程を避ける方法で貯蔵することが望ましいであろう。周囲温度で貯蔵する際の微生物の腐敗を避けることも望ましいであろう。
【００２１】
本発明に従って、本発明者らは、アミドを対応するニトリルから生産する方法であって：
ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、
ii）微生物を適当な増殖培地中で培養する工程、
iii）微生物を貯蔵する工程、
iv）水性媒質中で微生物をニトリルと接触させ、そして、それによってニトリルをアミドへ変換する工程、
を含み、微生物を、活発には増殖していない遊離細胞として、水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する方法を提供する。
【００２２】
貯蔵する微生物は、微生物細胞全体として存在してよく、これは発酵培地（培地または増殖培地）から回収された細胞ペーストの形をしていてもよい。
【００２３】
さらに微生物を増殖培地から回収し、次に微生物細胞の水性懸濁液として懸濁用媒質中に貯蔵してもよい。これは例えば水、生理的食塩液、またはリン酸緩衝液または発酵培地の成分および／または微生物の増殖による生産物を含む発酵培養液などの適当なｐＨ緩衝液のような適当な懸濁溶媒を用いて調製した微生物細胞の水性懸濁液である。
【００２４】
好ましくは微生物を、例えば遠心分離またはろ過を用いる微生物の回収などのさらなる下流の処理工程なしに、元の発酵培地から回収せず貯蔵する。
【００２５】
微生物細胞を、活発には増殖していない培養物と見なすことができる。これによって本発明者らは、微生物を保持する媒質および貯蔵条件が増殖を促進するとは予想されないことを意味する。貯蔵媒質は、例えば発酵培地；水；生理的食塩水；リン酸緩衝液または他の同様の緩衝液などの適当な緩衝液、あるいは増殖速度またはバイオマス濃度または酸素消費量または栄養素消費の測定、あるいは一般に微生物の増殖および代謝のモニターに用いられる他の形式の測定により決定される、微生物細胞内の代謝が実質的にゼロの増殖培地から回収された微生物細胞であり得る。
【００２６】
組成物または貯蔵媒質は、任意の残余の発酵培養液の成分を含んでよい。発酵培養液は、微生物を培養するために用いられる任意の典型的な成分を含んでいてよく、また微生物により産生された生産物および副産物をさらに含んでいてもよい。発酵培養液の典型的な成分には、砂糖、多糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、窒素源、無機塩類、ビタミン、生長調節物質および酵素誘導物質が含まれる。具体的には、これには、糖として単糖または二糖類；アンモニウム塩または他の窒素源；リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウム塩などの無機塩類、金属化合物；ビタミン；および例えばコーンスティープリカー（corn steep liquor）のような複雑な発酵培地成分；ペプトン；酵母エキス；特別の微生物生育の必要性のために用いられる有機または無機化合物；特異的な酵素誘導物質（ある微生物のニトリルヒドラターゼを誘導するために用いられる尿素など）；およびクエン酸またはピルビン酸などの有機酸；および微生物の良好な増殖を確実にするため必要な他の任意の有機または無機化合物が含まれるであろう。
【００２７】
通常、ニトリルヒドラターゼを産生するような微生物を、ある期間たとえ数日でさえも、継続的な増殖なしに貯蔵する場合には、発酵培養液から微生物細胞を取り出すのが、触媒として必要なのが細胞であっても、あるいは細胞または発酵培地から酵素を回収するのであっても、通常である。これは、培養液の腐敗を引き起こす発酵培養液中の微生物増殖を阻止し、必要な酵素の破壊を引き起こす可能性があるプロテアーゼ活性を低下させるためである。したがって、発酵培養液それ自身を保存するか、細胞を取り除いて、微生物汚染などの外来の生物活性による生体触媒の分解を防ぐことが通常である。もしこれを実行しなければ、生体触媒活性は一日以内に、２日未満には確実に、など極めて短期間に低下すると予想することが通常できるであろう。
【００２８】
この局面で記載する貯蔵方法は、活性の実質的な損失なしに容易に生体触媒を用いることができる有効な安定性を増進するべきである。貯蔵安定性は、例えば固定化、安定化化合物の添加、凍結乾燥などに頼る必要なしに達成される。尿素は公知のタンパク質不活性化剤であるが、尿素または尿素誘導体などの発酵培養液成分の何れかの除去に頼らずに、貯蔵安定性を達成することができる。
【００２９】
貯蔵方法において用いられる組成物または環境は、酸素を含んでいてもよいし、または実質的に酸素フリーの環境であることもできる。酸素フリーという語句で、本発明者らは酸素の濃度が１％溶存酸素濃度未満であるべきことを意味する。発酵培養液からの酸素の除去を、酸素を除去するための任意の従来方法により達成することができる。これらには、不活性ガスによる一定期間の浄化、貯蔵容器のヘッドスペースの除去、減圧下での貯蔵またはアスコルビン酸またはヒドラジンおよびヒドラジドなどの公知の脱酸素剤の添加が含まれる。
【００３０】
２日間、特に数日間の貯蔵後には、ある程度のニトリルヒドラターゼ活性の損失があると予想されていたであろう。酸素不在下でさえ、これが予想されていたであろう。特にそれは、尿素などの残余の発酵培養液成分の存在下で、そしてさらに０℃を越す温度では、予想されていたであろう。これは生体触媒中のプロテアーゼ酵素がニトリルヒドラターゼを含む細胞の他のタンパク質を分解すると予想されるからかもしれない。しかし、生体触媒は、予期された不利益のいずれも蒙らず、したがってニトリルヒドラターゼ活性の実質的な損失を蒙らない。
【００３１】
反対に本発明者らは、貯蔵期間に、ニトリルヒドラターゼを含む生体触媒の活性が実際に増大することを見出している。したがって、本発明の別の局面では、本発明者らは、本発明の貯蔵方法に従って貯蔵媒質中に生体触媒を貯蔵することにより、ニトリルヒドラターゼを形成できる生体触媒のニトリルヒドラターゼ活性を増大させる方法を提供する。したがって、その方法は、その活性が増大する結果、新しい生体触媒組成物をもたらすことができる。したがって、生体触媒組成物の、また特に生体触媒の貯蔵中に形成されたニトリルヒドラターゼは新規である。さらに、生体触媒は、貯蔵期間中に腐敗に伴う悪臭を産生しない。
【００３２】
好ましくは、貯蔵方法は、少なくとも２日、より好ましくは１週間以上生体触媒を貯蔵しておくことを可能にする。特に生体触媒を３日〜２８日、例えば３〜１４日、貯蔵してもよい。
【００３３】
尿素または尿素誘導体が、発酵混合物に含まれることにより、生体触媒組成物の中に存在する可能性がある。本発明のある形式では、生体触媒を含む組成物または貯蔵媒質は、脱酸素されてもよく、また尿素のような発酵培養液成分を含んでもよい。生体触媒は望ましくは、ニトリルヒドラターゼ酵素を産生することができる微生物である。例えば、これはバシラス、バクテリジウム、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、シュードモナス、アシネトバクター、キサントバクター、ストレプトマイセス、リゾビウム、クレブシエラ、エンテロバクター、エルウィニア、アエロモナス、シトロバクター、アヒロモバクター、アグロバクテリウム、シュードノカルディアおよびロドコッカス属から選ばれる微生物であってよい。生体触媒は、特にロドコッカス属の微生物、好ましくはロドコッカス ロドヒラス種である。特に適切な生体触媒は、ロドコッカス ロドヒラス菌株 NCIMB 41164であり、これは本発明者らの同時出願に係る、事件参照番号ＢＴ／３−２２３５１／Ｐ１を割当られたＵＫ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０３２７９０７．２に記載されクレームされている。
【００３４】
ロドコッカス ロドヒラス菌株NCIMB 41164
１． 起源および寄託
菌株 NCIMB 41164は、本発明者らが英国、ブラッドフォードで土壌から分離して、２００３年３月５日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria(ＮＣＩＭＢ)に寄託し、ブダペスト条約の下に受託番号ＮＣＩＭＢ ４１１６４を割当てられた。
２． 形態的および培養特性
（１） 多形性の増殖
（２） 運動性：運動不能
（３） 非胞子形成菌
（４） グラム陽性
（５） 好気性
（６） 栄養寒天培地上の増殖により、３０℃４８時間以内にサーモンピンクの円形コロニーを生ずる。
【００３５】
本発明のこの局面の特に有利な特徴は、生体触媒を、それを培養した発酵混合物から分離することがもはや必要でないということである。それは、追加の処理工程を必要でなくするので重要な価値がある。したがって、組成物がさらに発酵混合物を含んでもよく、その後それを貯蔵する。生体触媒を貯蔵する方法では、発酵混合物が存在する状態でも酵素活性になんら有害な影響なくこれを達成できることを本発明者らは見出している。これがまた、生物変換工程を数日間にわたって実行しながら、その発酵培養液を反応を触媒するために直ちに用いることを可能にし、または損傷なく数日間または何週間も貯蔵することを可能にする。その結果、追加の処理工程を必要とせずに、容易に利用できる生体触媒の定常的な供給が保証され、したがって生物変換工程のコストを簡素化し低下させることになる。
【００３６】
生体触媒は、その凍結点より上の温度で便利に貯蔵できる。通常、生体触媒を周囲温度で、例えば３０℃または４０℃までで貯蔵する。しかし、本発明の方法の利点は、周囲温度で、温度の監視と制御のための特別の注意なしに、生体触媒を貯蔵できることである。生体触媒を、好ましくは４〜３０℃または４０℃の温度で、より好ましくは５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、特に１５〜２５℃で貯蔵する。
【００３７】
本発明によれば、生体触媒は酸素を含む環境中に保持されていたのでもよく、または酸素フリーの環境に保持されていたのでもよい。ニトリルの変換を始める前に残余の発酵培養液成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。これは発酵培養液成分存在下の微生物貯蔵に従った生体触媒貯蔵の結果であってもよい。
【００３８】
以前に示したように、生体触媒を調製した発酵混合物から生体触媒を取り出す必要はない。本発明に従い、生体触媒を保持する環境もまた発酵培養液の成分を含む。したがって、発酵培養液の成分を含む生体触媒組成物をニトリルと混合することができ、ニトリルはその後水和されて対応するアミドとなる。本発明者らは驚くべきことに、従来の；例えばＵＳ−Ａ−５，５６７，６０８中で記述されている、生体触媒の固定化が生体触媒から反応生産物中への不純物の溶出を防ぐのに望ましいという知識とは対照的に、反応混合液中へ発酵培養液を含めることが、最終生産物の質に影響しないことを発見した。この局面については、本発明者らの同時出願に係る、事件番号ＢＴ／３−２２３４９／Ｐ１により特定されるＵＫ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０３２７９０１．５に記述されている。
【００３９】
発酵混合物は微生物を増殖させ保持することを可能にするために必須の成分を含むことになる。一般に、混合物は少なくとも炭素源、窒素源および様々な栄養源を含むであろう。これは、例えばグルコースまたは他の糖などの単糖、または二糖類または多糖類のような糖類、アンモニウム塩、酵母エキスおよびペプトンなどの複合培地成分、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウム塩、鉄、コバルト、マンガン、銅、亜鉛その他などの微量元素を含んでもよい。これらおよび他の成分を、特定の微生物に適切な濃度で発酵混合物中に含めることができる。発酵物は生体触媒の生産性の変化に依存する可能性があることが知られており、様々な生育段階で発酵培養液が用いられる可能性がある。したがって、そのような方法による生産の後に生体触媒を貯蔵できることが重要である。
【００４０】
本発明者らは、生体触媒の活性が長期間の反応の間に実質的に減少することはないことを見出している。従って、生体触媒をそれほど頻繁に交換しなくてもよい。生体触媒を少なくとも２日間用いて、その期間中活性を実質的に失わないのが好ましい。
【００４１】
一般に、ニトリルヒドラターゼを用いる反応の触媒作用は、単一工程でニトリルを対応するアミドに変換することができる。このプロセスは、ニトリルがアクリロニトリルで、アミドがアクリルアミドである場合に、特に価値がある。この変換工程を、生体触媒の単一バッチを用いて数回行ない、そこから数日間に亘って一部分ずつを取り出して、ニトリルをアミドに変換するいくつかの反応を行なうことが望ましい。したがって、生物変換工程を同時に行なっている間に、触媒に対する損傷なしに、生体触媒をできるだけ低費用で貯蔵できることが重要である。そうすれば、実際上生体触媒の１つのバッチを、例えばアクリルアミドのいくつかのバッチを作るためにすぐに使用できるように貯蔵することができる。いくつかのバッチは、５〜１０またはより多くのバッチであり、１５〜２０のバッチでさえも、あり得る。
【００４２】
次の実施例は本発明の説明例である。
【００４３】
実施例１
（１）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１．０；酵母エキス３．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１；尿素５．０、を含む１８０Ｌの培地を入れた２８０Ｌの発酵槽中で増殖させた。培地のｐＨをpH７．２に調整した。培養物を３０℃で３日間増殖させた。
【００４４】
２５Ｌの発酵培養液を、周囲温度での貯蔵に先立って２０分間窒素で脱気した。貯蔵は約５℃で３1/2日であった。ニトリルヒドラターゼ活性を収穫１５ｈ後に測定し、それは、２５℃で２４２，０００U/gであった。３日後の最初のアクリルアミド生産試行の直前に再度ＮＨ活性を測定した時、それは２９３，０００U/gであった。
【００４５】
実施例２
ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２Lエルレンマイヤーフラスコ中で５日間２８℃で、１８０rpmで振動させながら、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１０，０；酵母エキス３．０；尿素５．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１、を含む培地中で増殖させた。細菌細胞を培養液の半分から遠心分離を用いて収穫した。培養液を２分し、半分に窒素を１０分間用いて脱酸素した。脱酸素した培養液部分、酸素を含む培養液部分の両方を、４、１５および２５℃で１週間インキュベーションした。両部分のニトリルヒドラターゼ活性を定期的に測定した。
【００４６】
ニトリルヒドラターゼ分析の結果を、表１に示す。結果は、Ｕ／mg乾燥細胞で示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例３
ロドコッカス ロドヒラスJ1を、２Lエルレンマイヤーフラスコ中、５日間２８℃で１８０rpmで振動させながら次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．５；リン酸水素カリウム０．５；グルコース２０．０；ペプトン５．０；酵母エキス１．０；尿素７．５；硫酸マグネシウム七水和物０．５；塩化コバルト六水和物０．０１、を含む培地中で増殖させた。培養液の半分からの細菌細胞を、遠心分離を用いて収穫した。培養液を２分し、半分を窒素を１０分間用いて脱酸素した。脱酸素した培養液部分、酸素を含む培養液部分の両方を、４、１５および２５℃で１週間インキュベーションした。両部分のニトリルヒドラターゼ活性を定期的に測定した。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
実施例２および３の両方の結果から、生体触媒を周囲温度で効果的に貯蔵できることがわかる。さらに、ニトリルヒドラターゼ活性が０日目に比較して貯蔵により増大することがわかる。これは、ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164で最も顕著であった。
【００５１】
実施例４
解凍したロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164の細胞を水に再懸濁した。１週間の間ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。測定した相対的なニトリルヒドラターゼ活性を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】
表３の結果は、１〜７日間のインキュベーション期間の貯蔵温度のいずれにおいても、活性が減少しなかったことを示す。
【００５４】
実施例５
（１）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、次の成分（g/L）：リン酸水素二カリウム０．７；リン酸水素カリウム０．３；グルコース１０．０；酵母エキス３．０；硫酸マグネシウム七水和物０．５；尿素５．０；塩化コバルト六水和物０．０１；全体で１Lとする水道水、を含む１００mlの培地を含む、０．５Lのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中で増殖させた。培地のｐＨをpH７．２に調整した。培養物を３０℃で４日間増殖させた。ニトリルヒドラターゼ活性を２５℃で２、３および４日間の増殖の後に測定した。
（２）（ａ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、尿素をジメチル尿素と置き換えた点を除いて（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｂ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、尿素をエチル尿素と置き換えた点を除いて（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｃ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２．５g/Lの尿素および２．５g/Lのジメチル尿素を５g/Lの尿素のかわりに培地に加えた点を除いて、（１）に記述した培地で増殖させた。
（ｄ）ロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164を、２．５g/Lの尿素および２．５g/Lのエチル尿素を５g/Lの尿素のかわりに加えた点を除いて、（１）に記述した培地で増殖させた。
ニトリルヒドラターゼ活性を表４に示す。
【００５５】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミドを対応するニトリルから生産する方法であって、
ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、
ii）増殖培地中で微生物を培養する工程、
iii）微生物を貯蔵する工程、
iv）ニトリルを水性媒質中で微生物と接触させ、それによりニトリルをアミドに変換する工程、
を含み、微生物を、活発には増殖しない遊離細胞として水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する、方法。
【請求項２】
微生物を増殖培地から微生物細胞全体を含む水性ペーストの形で回収する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物を増殖培地から回収し、水、生理的食塩水、生理的緩衝液および増殖培地の少なくとも１つの成分を含む水溶液からなる群より選ばれる懸濁媒質中に、微生物細胞の水性懸濁液として貯蔵する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物を増殖培地中で保持する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アミドがエチレン性不飽和のアミド、好ましくはアクリルアミドまたはメタクリルアミドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
貯蔵媒質中に含まれる増殖培地の成分が尿素または尿素誘導体を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
微生物を貯蔵媒質の凍結点より上の温度で、好ましくは０℃以上、より好ましくは４〜３０℃で貯蔵する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
微生物を少なくとも２日間、好ましくは３〜２８日間貯蔵する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
微生物がロドコッカス（Rhodococcus）属であり、好ましくはロドコッカス ロドヒラス（Rhodococcus rhodochrous）種である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
微生物がロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164である、請求項１〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
アミドを対応するニトリルから生産する方法であって、
ｉ）ニトリルヒドラターゼ生体触媒を産生することができる微生物を用意する工程、
ii）増殖培地中で微生物を培養する工程、
iii）微生物を貯蔵する工程、
iv）ニトリルを水性媒質中で微生物と接触させ、それによりニトリルをアミドに変換する工程、
を含み、微生物を、活発には増殖しない遊離細胞として水を含む貯蔵媒質中で貯蔵する、方法。
【請求項２】
微生物を増殖培地から微生物細胞全体を含む水性ペーストの形で回収する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物を増殖培地から回収し、水、生理的食塩水、生理的緩衝液および増殖培地の少なくとも１つの成分を含む水溶液からなる群より選ばれる懸濁媒質中に、微生物細胞の水性懸濁液として貯蔵する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物を増殖培地中で保持する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アミドがエチレン性不飽和のアミド、好ましくはアクリルアミドまたはメタクリルアミドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
貯蔵媒質中に含まれる増殖培地の成分が尿素または尿素誘導体を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
微生物を貯蔵媒質の凍結点より上の温度で、好ましくは０℃以上、より好ましくは４〜３０℃で貯蔵する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
微生物を少なくとも２日間、好ましくは３〜２８日間貯蔵する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
微生物がロドコッカス（Rhodococcus）属であり、好ましくはロドコッカス ロドヒラス（Rhodococcus rhodochrous）種である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
微生物がロドコッカス ロドヒラスNCIMB 41164である、請求項１〜９８のいずれかに記載の方法。
【公開番号】特開２０１２−２１０２１４（Ｐ２０１２−２１０２１４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１２４２６７（Ｐ２０１２−１２４２６７）
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【分割の表示】特願２００６−５４１８３８（Ｐ２００６−５４１８３８）の分割
【原出願日】平成１６年１１月２２日（２００４．１１．２２）
【出願人】（５９２００６８５５）チバ スペシャルティ ケミカルズ ウォーター トリートメント リミテッド (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２４２６７（Ｐ２０１２−１２４２６７）
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【分割の表示】特願２００６−５４１８３８（Ｐ２００６−５４１８３８）の分割
【原出願日】平成１６年１１月２２日（２００４．１１．２２）
【出願人】（５９２００６８５５）チバ スペシャルティ ケミカルズ ウォーター トリートメント リミテッド (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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