アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法
例えば、式（１）で示されるアミノ化複合型糖鎖誘導体。（１）〔式中、Ｒ１は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯを示す。Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。Ｒ２およびＲ３は、水素原子、明細書中に示す式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ２およびＲ３が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ２あるいはＲ３が水素原子であって残りのＲ２あるいはＲ３が式（５）である場合を除く。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖誘導体（以下、アミノ化複合型糖鎖誘導体という）および糖鎖ペプチドに関する。
【背景技術】
生体内に存在するペプチド（タンパク質）の多くは、糖鎖を有している。糖鎖とは、単糖と単糖がグリコシル結合という結合を介して鎖状に結合したもので図１に示したように表されている。
ペプチド（タンパク質）と結合している糖鎖はそのアミノ酸との結合様式から大きく２種類に分類されている。アスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖に結合したアスパラギン結合型（Ｎ−結合型）とセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）の側鎖水酸基に結合したムチン結合型（Ｏ−結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって、図２に示すように高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。
このような糖鎖は、ペプチド（タンパク質）と結合しその分子の表面を覆うことでペプチド（タンパク質）の溶解性を調節したり、プロテアーゼへの耐性を付加し、血中からの代謝を遅延させるだけでなくペプチド（タンパク質）の３次元構造を維持するために働く。
代表的な例として、ヒトのエリスロポエチン（ＥＰＯ）という糖鎖ペプチド（糖タンパク質）がある。この糖鎖ペプチド（糖タンパク質）は、複合型アスパラギン結合型糖鎖を有しており、赤血球系前駆細胞に作用しその増殖・分化を促進することにより、末梢血中の赤血球数を維持する機能を持った血球分化ホルモンである。ペプチド（タンパク質）上の糖鎖構造と生理活性の相関についていろいろ研究され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは糖鎖が結合していないＥＰＯでも生理活性を有するが、ｉｎ ｖｉｖｏでは糖鎖がないと生理活性がないということが判明した。
このような糖鎖ペプチド（糖タンパク質）だけでなくさまざまなペプチド（タンパク質）を医薬品として用いる研究が展開されているが、依然として解決すべき問題点がある。ペプチド（タンパク質）製剤などが血中でタンパク質分解酵素（ペプチダーゼ）などにより簡単に分解し代謝されるために、十分な血中濃度を維持できないということである。
本発明の目的は、十分な血中濃度を維持可能なアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖鎖ペプチドを提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、以下の発明に係る。
１． アミノ化複合型糖鎖誘導体。
２． 式（１）で示されるアミノ化複合型糖鎖誘導体。
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯを示す。Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。Ｒ２およびＲ３は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ２およびＲ３が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ２あるいはＲ３が水素原子であって残りのＲ２あるいはＲ３が式（５）である場合を除く。〕
３． Ｒ１が−ＮＨ−ハロゲン化アセチル基である上記に記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
４． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチド。
５． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基を結合させることを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
６． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
７． 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いで上記アミノ化複合型糖鎖誘導体を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
８． 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いで上記アミノ化複合型糖鎖誘導体を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体は、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）のいずれかの基で置換した化合物である。
複合型アスパラギン結合型糖鎖は、例えば式（６）に示される糖鎖を挙げることができる。
（式中、Ｒ４およびＲ５は、水素原子、上記式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ４あるいはＲ５が水素原子であって残りのＲ４あるいはＲ５が式（５）である場合を除く。）
この複合型アスパラギン結合型糖鎖は、例えば、国際公開公報 ＷＯ ０３／００８４３１号公報に従って合成することができる。また、糖タンパク質から酵素により糖鎖を切り出す方法や化学的に切断する方法を使用してもよい。酵素としては、グリコペプチダーゼＡやＮ−グリカナーゼを使用できる。化学的切断法としては、ヒドラジン分解により糖鎖を製造することができる。
アミノ化複合型糖鎖誘導体は、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）のいずれかの基で置換した化合物であり、例えば、下記式（１）で示すことができる。ここでハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を例示することができる。
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は上記に同じである。）
アミノ化複合型糖鎖誘導体は、公知の方法で製造することができるが、例えば、アミノ化複合型糖鎖誘導体に−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）を持つ化合物を反応させればよい。具体的には、Ｒ１が−ＮＨ−ブロモアセチル基の場合、溶媒中、縮合剤存在下、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖とブロモ酢酸を反応させる。溶媒としては、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖、ブロモ酢酸等が溶解するものであれば良く、例えば、水、ＤＭＦ等を挙げることができる。縮合剤としては、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等を挙げることができ、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖１モルに対して、縮合剤を１〜１０モル使用するのが好ましい。また、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖１モルに対して、ブロモ酢酸を１〜１０モル使用するのが好ましい。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法〔例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）〕で精製するのが良い。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、任意のアミノ酸をペプチド結合したペプチドに、該ペプチドのチオール基を介して１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合させた糖鎖ペプチドである。
本発明においてペプチドとは、同種または異種のアミノ酸が２個またはそれ以上で、互いに一方のカルボキシ基と他方のアミノ基との間で脱水して酸アミド結合、すなわちペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成してできる化合物を言う。約１０個以下のアミノ酸からなる比較的小さいものをオリゴペプチド、それよりも大きいものをポリペプチドという。また、ポリペプチドにはタンパク質を含む。
ペプチドは、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により得ることできる。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、アミノ化複合型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドとを反応させることにより製造することができる。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法［例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］で精製するのが良い。具体的には、アミノ化複合型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。
また、上記の製造方法により、予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有する糖鎖ペプチドにアミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、複数の糖あるいは糖鎖を有する１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。
さらに、予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有する糖鎖ペプチドにアミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、予め有していた糖あるいは糖鎖を切断することにより、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。この時、予め有していた糖あるいは糖鎖を切断するには、例えば、酵素を使用して切断することが好ましい。また、アミノ化複合型糖鎖誘導体の導入前でもよいし、導入後でもよいが、切断と同時にアミノ化複合型糖鎖誘導体をペプチドに導入することが好ましい。切断する酵素としては、ペプチドと糖あるいは糖鎖の還元末端を切断する酵素（糖加水分解酵素）であれば良く、例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ等を使用することができる。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法［例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］で精製するのが良い。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、天然に存在する複合型アスパラギン結合型糖鎖ペプチドよりも、糖加水分解酵素に対する耐性に優れている（分解されにくい）。この為、血中での安定性が向上し、血中寿命が延びる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドは、ペプチドのアミノ酸配列、糖鎖の結合位置あるいは糖鎖の構造や種類が均一である為、この糖鎖ペプチドが生理活性分子である場合（例えば、抗体）、生理活性分子の生理活性は均一である。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、ペプチドのチオール基に選択的にアミノ化複合型糖鎖誘導体を任意の位置に選択的に複合型アスパラギン結合型糖鎖を導入することができる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、高分子量（例えば、分子量１万以上）の糖鎖ペプチドを製造することができる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、糖鎖ペプチドのフォールディングを崩すことなく任意の複合型アスパラギン結合型糖鎖を任意の位置に選択的に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は糖鎖の構造の１例を示す図である。
図２はアスパラギン結合型糖鎖の分類を示す図である。
図３はＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）とＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）糖鎖修飾体の電気泳動を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、何らこれに限定されるものではない。
参考例１（ジシアロ糖鎖アスパラギンの合成）
粗精製のＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）５００ｍｇとアジ化ナトリウム１０ｍｇ（３１９μｍｏｌ）をトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝７．５）２５ｍｌに溶解させた。これにアクチナーゼ−Ｅ（タンパク質分解酵素、科研製薬）５０ｍｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液５ｍｌに溶かした溶液を加え、３７℃で静置した。１１５時間後、この溶液を凍結乾燥した。この残留物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで２回精製し、ジシアロ糖鎖アスパラギンを２５２ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （３０℃） δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ−１），４．２５（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７，２．６６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ａｘ）
参考例２（Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ糖鎖アスパラギンの合成）
参考例１で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン８０ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を蒸留水２．７ｍｌとアセトン４．１ｍｌ混合溶液に溶解させ、これに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｎ）３４．７ｍｇ（０．１０３ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム１１．５ｍｇ（０．１３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後この溶液を減圧濃縮し、アセトンを除去した。残渣をオクタデシルシリル基を結合したシリカゲルを充填したカラム（ＯＤＳカラム）にかけ精製し、目的のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン６０．１ｍｇ 収率６８％を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．７０〜４．６６（ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１ ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ１），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２９，（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．７７（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ３ｅｑ），２．８０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ３ａｘ）
参考例３（ＨＯＯＣ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ２の合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン３７０ｍｇを入れ、ＣＨ２Ｃｌ２，ＤＭＦで十分に洗浄し反応に用いた。
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ａｒｇ−ＮＨ２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
この樹脂に、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ２を得た。
グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
樹脂を洗浄後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。
参考例４（ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２の合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン３７０ｍｇを入れ、ＣＨ２Ｃｌ２，ＤＭＦで十分に洗浄し反応に用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
次に、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用いＨＯＢｔ・Ｈ２ＯとＤＩＰＣＤＩによって縮合させた。
次に、参考例２のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギンをＤＭＳＯ、ＤＭＦ１対１の混合溶媒に溶かし、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて室温２４時間攪拌させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／２−プロパノール：メタノールで２０分間攪拌しキャッピングした。樹脂を２−プロパノール、ＤＭＦで洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０分間攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄した。
この樹脂に、システイン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２を得た。
システイン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
樹脂を洗浄後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。凍結乾燥品をｐＨ１１水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、ベンジルエステルを加水分解した後、酢酸で中和し、ＨＰＬＣで精製することで目的とするＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２を得た。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）
参考例５（ジシアロ糖鎖合成）
ＳＧＰ（１００ｍｇ）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に溶かしＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．１Ｕ）を加えた。３７度２４時間インキュベートし、ＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝１：１）で反応終了を確認後、凍結乾燥した。凍結乾燥品をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５，１．５ｃｍ×３０ｃｍ，水，流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製しジシアロ糖鎖を収量７４ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２８（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１ａ），５．２３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．７０（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１３（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
参考例６（アミノ化）
参考例５のジシアロ糖鎖（１０ｍｇ）を飽和炭酸水素アンモニウム水溶液に溶かし濃度３０ｍＭに調製した。室温で反応させ常に飽和している状態を維持した。７日間反応させＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝１：１）で反応がほぼ終了した後、反応溶液をそのまま凍結乾燥した。炭酸水素アンモニウムを除くために、凍結乾燥を３回繰り返しクルードの状態でアミノ化したジシアロ糖鎖を収量９ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６９（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２３（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
実施例１（ブロモアセチル化）
参考例６のアミノ化したジシアロ糖鎖（クルード ５ｍｇ）を水１００μＬに溶かし炭酸水素ナトリウム２ｍｇを加えた。そこに、ＤＭＦ（１００μｌ）に溶かしたブロモ酢酸６．２ｍｇとＤＣＣ４．６ｍｇを加え室温で反応させた。１．５時間後、ＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝２：１）で反応終了を確認し、炭酸水素ナトリウムで中和し、ろ過後、減圧濃縮した。続いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５，１．５ｃｍ×３０ｃｍ，水，流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製しブロモアセチル化したジシアロ糖鎖を収量４ｍｇ、収率７７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．１６（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．７０（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７７（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１０（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
【実施例２】
実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖 ２ｍｇと参考例３で合成したペプチド鎖１．８ｍｇ（Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ）を１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、１７０μｌに溶かし、室温でインキュベートした。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ−ＧＰ（５μｍ）、φ１０×２５０ｍｍ、グラジエント：０．１％トリフルオロ酢酸／水 １００％から０．１％トリフルオロ酢酸 アセトニトリル／水＝９０／１０ ７５％；６０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ、流速２．５ｍｌ］で精製し、ジシアロ糖鎖ペプチドを収量２ｍｇ、収率６４％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ７．１８（４Ｈ，Ｐｈ），６．８９（４Ｈ，Ｐｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．１４（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），５．０４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６９−４．６３（ｍ，５Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１，Ｔｙｒ−αＨ，Ｃｙｓ−αＨ），４．５５−４．５２（ｍ，４Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１，Ｇｌｎ−αＨ，Ｓｅｒ−αＨ），４．４４−４．３８（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−αＨ×２，Ａｒｇ−Ｈα，Ｔｈｒ−αＨ），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｍ，３Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２，Ｔｈｒ−βＨ），４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｖａｌ−αＨ），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１５（１Ｈ，Ａｒｇ−αＨ），３．３０，３．２５（ｅａｃｈ ２Ｈ，Ａｒｇ−δＣＨ２），３．１４−２．９９（６Ｈ，Ｃｙｓ−βＨ，Ｔｙｒ−βＨ×２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．５７（２Ｈ，Ｇｌｎ−γＣＨ２），２．４９，２．３５（ｅａｃｈ ２Ｈ，Ｇｌｕ−γＣＨ２），２．２３−２．１０（ｍ，３Ｈ，Ｖａｌ−βＨ，Ｇｌｎ−βＨ），２．１６（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１０−１．９８（ｍ，６Ｈ，Ｇｌｕ−βＨ×２，Ａｒｇ−βＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．９２−１．５７（ｍ，８Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ，Ａｒｇ−βＨ，Ａｒｇ−γＣＨ２×２），１．２３（ｄ，３Ｈ，Ｔｈｒ−γＣＨ３），１．０４（ｄ，６Ｈ，Ｖａｌ−γＣＨ３）
実施例３（１−ブロモアセチル−ジシアロ糖鎖を用いたすり替え）
参考例４で合成したジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇと実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させた。生成物をＨＰＬＣで精製することにより目的とするシステインにジシアロ糖鎖が結合したジシアロ糖鎖ペプチドを得た。
（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）
試験例１（糖加水分解酵素に対する耐性）
実施例３で得られたジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させ、ジシアロ糖鎖がペプチドから切断される時間を測定した。切断されるまでの時間は、６時間であった。
参考例４で得られたジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させ、ジシアロ糖鎖がペプチドから切断される時間を測定した。切断されるまでの時間は、３０分であった。
この結果から明らかなように天然結合型糖鎖ペプチド（参考例４）に比べて糖加水分解酵素に対する耐性が高いことがわかる。
【実施例４】
Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）（株式会社医学生物学研究所製：ミューテーション技術により、アミノ酸配列２９７番目のアスパラギンをシステインに変換した抗体）４３．９μｇと実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖 １００μｇを１００ｍＭリン酸緩衝液３００μｌに溶かし、室温でインキュベートした。反応終了後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーと、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することにより目的とするシステインにジシアロ糖鎖が結合した抗体を得た。抗体は、電気泳動（１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｗｉｔｈ ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）：分子量マーカーは、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製 プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード ブロードレンジ（カタログＮｏ１６１−０３１８））およびＭＡＳＳにより確認した。結果を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、十分な血中濃度を維持可能な新規なアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖鎖ペプチドを得ることができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖誘導体（以下、アミノ化複合型糖鎖誘導体という）および糖鎖ペプチドに関する。
【背景技術】
生体内に存在するペプチド（タンパク質）の多くは、糖鎖を有している。糖鎖とは、単糖と単糖がグリコシル結合という結合を介して鎖状に結合したもので図１に示したように表されている。
ペプチド（タンパク質）と結合している糖鎖はそのアミノ酸との結合様式から大きく２種類に分類されている。アスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖に結合したアスパラギン結合型（Ｎ−結合型）とセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）の側鎖水酸基に結合したムチン結合型（Ｏ−結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって、図２に示すように高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。
このような糖鎖は、ペプチド（タンパク質）と結合しその分子の表面を覆うことでペプチド（タンパク質）の溶解性を調節したり、プロテアーゼへの耐性を付加し、血中からの代謝を遅延させるだけでなくペプチド（タンパク質）の３次元構造を維持するために働く。
代表的な例として、ヒトのエリスロポエチン（ＥＰＯ）という糖鎖ペプチド（糖タンパク質）がある。この糖鎖ペプチド（糖タンパク質）は、複合型アスパラギン結合型糖鎖を有しており、赤血球系前駆細胞に作用しその増殖・分化を促進することにより、末梢血中の赤血球数を維持する機能を持った血球分化ホルモンである。ペプチド（タンパク質）上の糖鎖構造と生理活性の相関についていろいろ研究され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは糖鎖が結合していないＥＰＯでも生理活性を有するが、ｉｎ ｖｉｖｏでは糖鎖がないと生理活性がないということが判明した。
このような糖鎖ペプチド（糖タンパク質）だけでなくさまざまなペプチド（タンパク質）を医薬品として用いる研究が展開されているが、依然として解決すべき問題点がある。ペプチド（タンパク質）製剤などが血中でタンパク質分解酵素（ペプチダーゼ）などにより簡単に分解し代謝されるために、十分な血中濃度を維持できないということである。
本発明の目的は、十分な血中濃度を維持可能なアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖鎖ペプチドを提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、以下の発明に係る。
１． アミノ化複合型糖鎖誘導体。
２． 式（１）で示されるアミノ化複合型糖鎖誘導体。
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯを示す。Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。Ｒ２およびＲ３は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ２およびＲ３が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ２あるいはＲ３が水素原子であって残りのＲ２あるいはＲ３が式（５）である場合を除く。〕
３． Ｒ１が−ＮＨ−ハロゲン化アセチル基である上記に記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
４． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチド。
５． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基を結合させることを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
６． 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
７． 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いで上記アミノ化複合型糖鎖誘導体を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
８． 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いで上記アミノ化複合型糖鎖誘導体を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体は、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）のいずれかの基で置換した化合物である。
複合型アスパラギン結合型糖鎖は、例えば式（６）に示される糖鎖を挙げることができる。
（式中、Ｒ４およびＲ５は、水素原子、上記式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ４あるいはＲ５が水素原子であって残りのＲ４あるいはＲ５が式（５）である場合を除く。）
この複合型アスパラギン結合型糖鎖は、例えば、国際公開公報 ＷＯ ０３／００８４３１号公報に従って合成することができる。また、糖タンパク質から酵素により糖鎖を切り出す方法や化学的に切断する方法を使用してもよい。酵素としては、グリコペプチダーゼＡやＮ−グリカナーゼを使用できる。化学的切断法としては、ヒドラジン分解により糖鎖を製造することができる。
アミノ化複合型糖鎖誘導体は、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）のいずれかの基で置換した化合物であり、例えば、下記式（１）で示すことができる。ここでハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を例示することができる。
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は上記に同じである。）
アミノ化複合型糖鎖誘導体は、公知の方法で製造することができるが、例えば、アミノ化複合型糖鎖誘導体に−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯ（Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。）を持つ化合物を反応させればよい。具体的には、Ｒ１が−ＮＨ−ブロモアセチル基の場合、溶媒中、縮合剤存在下、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖とブロモ酢酸を反応させる。溶媒としては、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖、ブロモ酢酸等が溶解するものであれば良く、例えば、水、ＤＭＦ等を挙げることができる。縮合剤としては、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等を挙げることができ、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖１モルに対して、縮合剤を１〜１０モル使用するのが好ましい。また、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖１モルに対して、ブロモ酢酸を１〜１０モル使用するのが好ましい。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法〔例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）〕で精製するのが良い。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、任意のアミノ酸をペプチド結合したペプチドに、該ペプチドのチオール基を介して１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合させた糖鎖ペプチドである。
本発明においてペプチドとは、同種または異種のアミノ酸が２個またはそれ以上で、互いに一方のカルボキシ基と他方のアミノ基との間で脱水して酸アミド結合、すなわちペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成してできる化合物を言う。約１０個以下のアミノ酸からなる比較的小さいものをオリゴペプチド、それよりも大きいものをポリペプチドという。また、ポリペプチドにはタンパク質を含む。
ペプチドは、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により得ることできる。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、アミノ化複合型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドとを反応させることにより製造することができる。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法［例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］で精製するのが良い。具体的には、アミノ化複合型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。
また、上記の製造方法により、予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有する糖鎖ペプチドにアミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、複数の糖あるいは糖鎖を有する１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。
さらに、予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有する糖鎖ペプチドにアミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、予め有していた糖あるいは糖鎖を切断することにより、１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。この時、予め有していた糖あるいは糖鎖を切断するには、例えば、酵素を使用して切断することが好ましい。また、アミノ化複合型糖鎖誘導体の導入前でもよいし、導入後でもよいが、切断と同時にアミノ化複合型糖鎖誘導体をペプチドに導入することが好ましい。切断する酵素としては、ペプチドと糖あるいは糖鎖の還元末端を切断する酵素（糖加水分解酵素）であれば良く、例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ等を使用することができる。反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは、１５〜３５℃で行うのが良く、通常３０分〜５時間で行うのが良い。反応終了後は、適宜、公知の方法［例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］で精製するのが良い。
本発明の１−アミノ−複合型アスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドは、天然に存在する複合型アスパラギン結合型糖鎖ペプチドよりも、糖加水分解酵素に対する耐性に優れている（分解されにくい）。この為、血中での安定性が向上し、血中寿命が延びる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドは、ペプチドのアミノ酸配列、糖鎖の結合位置あるいは糖鎖の構造や種類が均一である為、この糖鎖ペプチドが生理活性分子である場合（例えば、抗体）、生理活性分子の生理活性は均一である。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、ペプチドのチオール基に選択的にアミノ化複合型糖鎖誘導体を任意の位置に選択的に複合型アスパラギン結合型糖鎖を導入することができる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、高分子量（例えば、分子量１万以上）の糖鎖ペプチドを製造することができる。
本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、糖鎖ペプチドのフォールディングを崩すことなく任意の複合型アスパラギン結合型糖鎖を任意の位置に選択的に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は糖鎖の構造の１例を示す図である。
図２はアスパラギン結合型糖鎖の分類を示す図である。
図３はＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）とＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）糖鎖修飾体の電気泳動を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、何らこれに限定されるものではない。
参考例１（ジシアロ糖鎖アスパラギンの合成）
粗精製のＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）５００ｍｇとアジ化ナトリウム１０ｍｇ（３１９μｍｏｌ）をトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝７．５）２５ｍｌに溶解させた。これにアクチナーゼ−Ｅ（タンパク質分解酵素、科研製薬）５０ｍｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液５ｍｌに溶かした溶液を加え、３７℃で静置した。１１５時間後、この溶液を凍結乾燥した。この残留物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで２回精製し、ジシアロ糖鎖アスパラギンを２５２ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （３０℃） δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ−１），４．２５（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７，２．６６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ａｘ）
参考例２（Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ糖鎖アスパラギンの合成）
参考例１で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン８０ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を蒸留水２．７ｍｌとアセトン４．１ｍｌ混合溶液に溶解させ、これに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｎ）３４．７ｍｇ（０．１０３ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム１１．５ｍｇ（０．１３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後この溶液を減圧濃縮し、アセトンを除去した。残渣をオクタデシルシリル基を結合したシリカゲルを充填したカラム（ＯＤＳカラム）にかけ精製し、目的のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン６０．１ｍｇ 収率６８％を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．７０〜４．６６（ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１ ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ１），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２９，（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．７７（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ３ｅｑ），２．８０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ３ａｘ）
参考例３（ＨＯＯＣ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ２の合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン３７０ｍｇを入れ、ＣＨ２Ｃｌ２，ＤＭＦで十分に洗浄し反応に用いた。
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ａｒｇ−ＮＨ２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
この樹脂に、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ２を得た。
グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
樹脂を洗浄後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。
参考例４（ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２の合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン３７０ｍｇを入れ、ＣＨ２Ｃｌ２，ＤＭＦで十分に洗浄し反応に用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
次に、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用いＨＯＢｔ・Ｈ２ＯとＤＩＰＣＤＩによって縮合させた。
次に、参考例２のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギンをＤＭＳＯ、ＤＭＦ１対１の混合溶媒に溶かし、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて室温２４時間攪拌させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／２−プロパノール：メタノールで２０分間攪拌しキャッピングした。樹脂を２−プロパノール、ＤＭＦで洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０分間攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄した。
この樹脂に、システイン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２を得た。
システイン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
樹脂を洗浄後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。凍結乾燥品をｐＨ１１水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、ベンジルエステルを加水分解した後、酢酸で中和し、ＨＰＬＣで精製することで目的とするＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ２を得た。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）
参考例５（ジシアロ糖鎖合成）
ＳＧＰ（１００ｍｇ）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に溶かしＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．１Ｕ）を加えた。３７度２４時間インキュベートし、ＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝１：１）で反応終了を確認後、凍結乾燥した。凍結乾燥品をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５，１．５ｃｍ×３０ｃｍ，水，流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製しジシアロ糖鎖を収量７４ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２８（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１ａ），５．２３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．７０（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１３（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
参考例６（アミノ化）
参考例５のジシアロ糖鎖（１０ｍｇ）を飽和炭酸水素アンモニウム水溶液に溶かし濃度３０ｍＭに調製した。室温で反応させ常に飽和している状態を維持した。７日間反応させＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝１：１）で反応がほぼ終了した後、反応溶液をそのまま凍結乾燥した。炭酸水素アンモニウムを除くために、凍結乾燥を３回繰り返しクルードの状態でアミノ化したジシアロ糖鎖を収量９ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６９（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２３（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
実施例１（ブロモアセチル化）
参考例６のアミノ化したジシアロ糖鎖（クルード ５ｍｇ）を水１００μＬに溶かし炭酸水素ナトリウム２ｍｇを加えた。そこに、ＤＭＦ（１００μｌ）に溶かしたブロモ酢酸６．２ｍｇとＤＣＣ４．６ｍｇを加え室温で反応させた。１．５時間後、ＴＬＣ（ＩＰＡ：１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＝２：１）で反応終了を確認し、炭酸水素ナトリウムで中和し、ろ過後、減圧濃縮した。続いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５，１．５ｃｍ×３０ｃｍ，水，流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製しブロモアセチル化したジシアロ糖鎖を収量４ｍｇ、収率７７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．１６（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．７０（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７７（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１０（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ）
【実施例２】
実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖 ２ｍｇと参考例３で合成したペプチド鎖１．８ｍｇ（Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ）を１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、１７０μｌに溶かし、室温でインキュベートした。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ−ＧＰ（５μｍ）、φ１０×２５０ｍｍ、グラジエント：０．１％トリフルオロ酢酸／水 １００％から０．１％トリフルオロ酢酸 アセトニトリル／水＝９０／１０ ７５％；６０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ、流速２．５ｍｌ］で精製し、ジシアロ糖鎖ペプチドを収量２ｍｇ、収率６４％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ ７．１８（４Ｈ，Ｐｈ），６．８９（４Ｈ，Ｐｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．１４（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），５．０４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６９−４．６３（ｍ，５Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１，Ｔｙｒ−αＨ，Ｃｙｓ−αＨ），４．５５−４．５２（ｍ，４Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１，Ｇｌｎ−αＨ，Ｓｅｒ−αＨ），４．４４−４．３８（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−αＨ×２，Ａｒｇ−Ｈα，Ｔｈｒ−αＨ），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｍ，３Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２，Ｔｈｒ−βＨ），４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｖａｌ−αＨ），４．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１５（１Ｈ，Ａｒｇ−αＨ），３．３０，３．２５（ｅａｃｈ ２Ｈ，Ａｒｇ−δＣＨ２），３．１４−２．９９（６Ｈ，Ｃｙｓ−βＨ，Ｔｙｒ−βＨ×２），２．７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ｅｑ），２．５７（２Ｈ，Ｇｌｎ−γＣＨ２），２．４９，２．３５（ｅａｃｈ ２Ｈ，Ｇｌｕ−γＣＨ２），２．２３−２．１０（ｍ，３Ｈ，Ｖａｌ−βＨ，Ｇｌｎ−βＨ），２．１６（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．１０−１．９８（ｍ，６Ｈ，Ｇｌｕ−βＨ×２，Ａｒｇ−βＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．９２−１．５７（ｍ，８Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ−３ａｘ，Ａｒｇ−βＨ，Ａｒｇ−γＣＨ２×２），１．２３（ｄ，３Ｈ，Ｔｈｒ−γＣＨ３），１．０４（ｄ，６Ｈ，Ｖａｌ−γＣＨ３）
実施例３（１−ブロモアセチル−ジシアロ糖鎖を用いたすり替え）
参考例４で合成したジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇと実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させた。生成物をＨＰＬＣで精製することにより目的とするシステインにジシアロ糖鎖が結合したジシアロ糖鎖ペプチドを得た。
（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）
試験例１（糖加水分解酵素に対する耐性）
実施例３で得られたジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させ、ジシアロ糖鎖がペプチドから切断される時間を測定した。切断されるまでの時間は、６時間であった。
参考例４で得られたジシアロ糖鎖ペプチド１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌに溶かし、アスパラギン結合型糖鎖をアスパラギンから切断する酵素である、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（５Ｕ）を加え室温で反応させ、ジシアロ糖鎖がペプチドから切断される時間を測定した。切断されるまでの時間は、３０分であった。
この結果から明らかなように天然結合型糖鎖ペプチド（参考例４）に比べて糖加水分解酵素に対する耐性が高いことがわかる。
【実施例４】
Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体（Ｍｕｔａｎｔ）（株式会社医学生物学研究所製：ミューテーション技術により、アミノ酸配列２９７番目のアスパラギンをシステインに変換した抗体）４３．９μｇと実施例１のブロモアセチル化したジシアロ糖鎖 １００μｇを１００ｍＭリン酸緩衝液３００μｌに溶かし、室温でインキュベートした。反応終了後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーと、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することにより目的とするシステインにジシアロ糖鎖が結合した抗体を得た。抗体は、電気泳動（１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｗｉｔｈ ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）：分子量マーカーは、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製 プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード ブロードレンジ（カタログＮｏ１６１−０３１８））およびＭＡＳＳにより確認した。結果を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、十分な血中濃度を維持可能な新規なアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖鎖ペプチドを得ることができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ化複合型糖鎖誘導体。
【請求項２】
式（１）で示される請求項１記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯを示す。Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。Ｒ２およびＲ３は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ２およびＲ３が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ２あるいはＲ３が水素原子であって残りのＲ２あるいはＲ３が式（５）である場合を除く。〕
【請求項３】
Ｒ１が−ＮＨ−ハロゲン化アセチル基である請求の範囲第２項記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
【請求項４】
アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチド。
【請求項５】
アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基を結合させることを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
【請求項６】
糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の糖鎖ペプチド。
【請求項７】
糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
【請求項８】
糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
【請求項１】
アミノ化複合型糖鎖誘導体。
【請求項２】
式（１）で示される請求項１記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２Ｘ、イソチオシアネート基、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−（ＣＯ）ａ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨＯを示す。Ｘはハロゲン原子、ａは０または１であり、ｂは１〜４の整数を示す。Ｒ２およびＲ３は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ２およびＲ３が共に水素原子または式（５）である場合、Ｒ２あるいはＲ３が水素原子であって残りのＲ２あるいはＲ３が式（５）である場合を除く。〕
【請求項３】
Ｒ１が−ＮＨ−ハロゲン化アセチル基である請求の範囲第２項記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。
【請求項４】
アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖ペプチド。
【請求項５】
アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基を結合させることを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
【請求項６】
糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の糖鎖ペプチド。
【請求項７】
糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。
【請求項８】
糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１００５３
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２１１１（Ｐ２００５−５１２１１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１０３６
【国際出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【出願人】（５０２２４４２５８）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１０３６
【国際出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【出願人】（５０２２４４２５８）
【Ｆターム（参考）】
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