アミノ酸の製造法
【課題】
本発明の課題は、Ｌ−バリンを嫌気又は微好気条件下で生産することのできる微生物を造成し、該微生物を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−バリンを生産する方法を提供することである。
【解決手段】
本発明によれば、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性を有する蛋白質の活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法を提供することができる。
本発明の課題は、Ｌ−バリンを嫌気又は微好気条件下で生産することのできる微生物を造成し、該微生物を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−バリンを生産する方法を提供することである。
【解決手段】
本発明によれば、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性を有する蛋白質の活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸液やサプリメント等の成分として利用されるＬ−バリンの微生物による製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−バリンは、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。そのような微生物の例としては、Ｄ−リボ-ス、プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を示す微生物（特許文献１）、ポリケトイド類に耐性を示す微生物(特許文献２) 、ピルビン酸アナログに感受性を示す微生物（特許文献３）、イソロイシンｔＲＮＡシンテターゼに変異を有する微生物（特許文献４）、分岐鎖アミノ酸の排出に関わる蛋白質の発現を増強させた微生物（特許文献５）、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを欠失させた微生物（特許文献６）、フィードバック阻害に耐性のアセト乳酸合成酵素を有する微生物（特許文献７）、ＮＡＤＰＨの供給を強化させた微生物（特許文献８）およびピルビン酸オキシダーゼの発現を低下させた微生物（特許文献９）など多くの例が挙げられる。
【０００３】
これらの微生物を用いたＬ−バリンの製造法は、微生物を好気条件下で培養すること前提としているが、微生物を好気条件下で培養することは、呼吸により原材料のグルコースが二酸化炭素として多く排出される、発酵槽の酸素供給能力によりＬ−バリンの生産性が制限される、微生物の分裂増殖に伴う発酵熱の除去に多量の冷却水やプロセスエネルギーが必要になる、などの問題があった。
【０００４】
上記問題に対しては、ある種の微生物を嫌気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する試みがなされている。例えば、クロストリジウム属に属する微生物を用いた例では、Ｌ−α−アミノ酪酸に耐性を示す該微生物を嫌気条件下で培養し、Ｌ−バリンを製造した例が報告されている（特許文献１０）。また、ブレビバクテリア属に属する微生物を用いた例では、該微生物を培地中の酸化還元電位（以下、ＯＲＰという。）を制御することで嫌気条件を制御し、Ｌ−バリンを製造した例が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、大腸菌においては、広くＬ−アミノ酸の工業生産に利用されているにも関わらず、大腸菌を嫌気もしくは微好気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する方法は、これまでに報告されていない。
また、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性（以下、ＮＶＤＨ活性という。）を有する蛋白質は既知であるが（非特許文献２）、該蛋白質をコードするＤＮＡでエシェリヒア属に属する微生物を形質転換し、該形質転換体を嫌気もしくは微好気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する方法についても、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭５３−０２５０３４
【特許文献２】特公平０６−０６５３１４
【特許文献３】特開平０５−００７４９３
【特許文献４】欧州特許第５６５８７６６号
【特許文献５】特開２００２−３００８７４
【特許文献６】特開２０００−１１６３９３
【特許文献７】特開２００８−０９９６６８
【特許文献８】欧州特許第０７３３７１２号
【特許文献９】国際公開パンフレットＷＯ０２／３６７９７
【特許文献１０】特開平３−５８７８１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Akashi Kunihiko et al. (1977) Journal of fermentation technology 55: 364-368
【非特許文献２】Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、Ｌ−バリンを嫌気又は微好気条件下で生産することのできる微生物を造成し、該微生物を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−バリンを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法。
（２）微生物が、下記の［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、上記（１）記載の製造法。
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、上記（１）または（２）記載の製造法。
（４）微生物が、Ｌ−バリンの生合成に関与する１つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
（５）微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
（６）嫌気または微好気条件が、培地中の酸化還元電位が−１００mV以下の条件である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、大腸菌を嫌気又は微好気条件下で培養し、Ｌ−バリンを生産することが可能となるため、二酸化炭素の排出を抑制でき、また発酵装置の酸素供給能力に依存せず、冷却水やプロセスエネルギーの消費を抑制したＬ−バリンの発酵生産が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法に関する。
１．本発明で用いられる微生物
本発明で用いられる微生物は、親株よりＮＶＤＨ活性が高く、かつL-バリンを生産する能力を有する微生物である。
【００１２】
親株よりＮＶＤＨ活性が高い微生物としては、親株がＮＶＤＨ活性を有している場合は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以下、ＮＶＤＨ遺伝子という）を改変することにより、１）該遺伝子の発現量が増大した微生物、または２）該蛋白質の比活性が増強した微生物を挙げることができる。
ＮＶＤＨ遺伝子の発現量が増大した微生物としては、３）該遺伝子のプロモーター部分が改変、または４）該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、親株を該遺伝子で形質転換することにより、５）染色体上のコピー数が増大した微生物、または６）プラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
【００１３】
プロモーターの改変、およびＮＶＤＨ活性を有する蛋白質の比活性を上げる方法としては、後述の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、プロモーター部位、またはコーディング領域のＤＮＡ（以下、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡともいう。）に変異を導入する方法をあげることができる。当該方法により、親株よりＮＶＤＨ遺伝子の発現量が増大、またはＮＶＤＨ活性を有する蛋白質の比活性が向上した微生物が取得できたことは、RT-PCRやノーザンハイブリダイゼーションによりmRNA量を測定、または該微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液もしくは水溶性画分を調整し、該画分を基質であるＮＡＤＨおよび２−オキソイソ吉草酸と混合し、結果として生成するＬ−バリンを検出するOhshimaらの方法（Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312）によってＮＶＤＨ活性を測定、比較することにより確認することができる。
【００１４】
また、親株よりＮＶＤＨ活性が高い微生物としては、親株がＮＶＤＨ活性を有していない、すなわちＮＶＤＨ遺伝子を有していない場合は、親株をＮＶＤＨ遺伝子で形質転換することにより、７）親株の染色体ＤＮＡに該遺伝子が組み込こまれた微生物、または８）プラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物をあげることができる。
【００１５】
本発明において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。元株及び宿主株は野生株であってもよいし、人為的操作により例えばバリンの生産能が野生株より向上した変異株であってもよい。
本発明で用いられる微生物は、いずれの属に属する微生物であっても良いが、好ましくは原核生物、より好ましくは偏性嫌気細菌および通性嫌気細菌、さらに好ましくは通性嫌気細菌、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物を挙げることができる。
２．ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質としては、各種データベース中に、該活性を有すると登録されている蛋白質、該蛋白質と高い同一性（例えば80％以上の同一性）があると記載されている蛋白質をあげることができるが、具体的には、
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質、および、
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
【００１６】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) 、Gene, 34, 315 (1985) 、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１７】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００１８】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１９】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、２,３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられるＮＶＤＨ活性を有する蛋白質としては、配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有している蛋白質を挙げることができる。
【００２０】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
３．ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、上記２に記載のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができ、具体的には、
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および、
［７］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
【００２１】
上記において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００２２】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
【００２３】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
【００２４】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００２５】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００２６】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液もしくは水溶性画分を調整し、該画分を基質であるＮＡＤＨおよび２−オキソイソ吉草酸と混合し、結果として生成するＬ−バリンを検出するOhshimaらの方法（Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312）によって確認できる。
４．本発明の製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法に用いられる、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、バチルス（Bacillus）属およびサーモアクチノマイセス(Thermoactinomyces)属に属する微生物より調製することができる。
【００２７】
バチルス属に属する微生物としては、具体的には、Bacillus subtilis 168を挙げることができ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）よりＡＴＣＣ２３８５７の微生物として入手できる。サーモアクチノマイセス属に属する微生物としては、具体的には、Thermoactinomyces intermedius IFO14230を挙げることができ、ＡＴＣＣよりＡＴＣＣ３３２０５の微生物として入手できる。
【００２８】
バチルス属またはサーモアクチノマイセス属に属する微生物を公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）に従って培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離・精製する。
ゲノム情報を基に、バチルス属に属する微生物のbcd遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、PCR〔PCR Protocols, Academic Press(1900)〕を行うことにより、バチルス属に属する微生物由来のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。同様に、サーモアクチノマイセス属に属する微生物のleudhまたはpdh遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、PCRを行うことにより、サーモアクチノマイセス属に属する微生物由来のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。
【００２９】
また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法等により、該ＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば3730xl・ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製）等を用いたジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕により該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３０】
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescript KS＋（ストラタジーン社製）、pDIRECT〔Nucleic Acid Research，18, 6069(1990)〕、pCR−Script Amp SK＋（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR−TRAP（ジーンハンター社製）、pNoTAT7（５プライム→３プライム社製）およびpTrc99a（lablife社製）等をあげることができる。
【００３１】
上記のようにして取得された塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号１、３および５で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号１、３および５で表される塩基配列を有するＤＮＡとしては、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含むＤＮＡをあげることができる。
【００３２】
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側１００塩基、好ましくは５０塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、−１０および−３５領域に相当する領域をあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる微生物の造成
本発明の製造法に用いられる、ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物は、例えば、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物（下記に詳細を記載する。）を親株として、上記４の方法で得られるＤＮＡを該親株に導入する方法（下記７．に詳細を記載する。）、などにより造成することができる。
【００３３】
Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物は、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を親株として、（Ｉ）栄養要求性変異株、Ｌ−バリンのアナログ耐性変異株または代謝制御変異株を取得し、かつＬ−バリン生産能を有する変異株を選択する方法（アミノ酸発酵、学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁）、（ＩＩ）Ｌ−バリンの生合成系酵素の発現が増強された組換え株を造成する方法（前文献と同じ、第７７〜１００頁）、または、（ＩＩＩ）アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株を取得する方法(米国特許第5,658,766号)、などによって造成することができる。
【００３４】
エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、およびW3110株（ATCC 27325）を挙げることができる。
（Ｉ）栄養要求性変異株、Ｌ−バリンのアナログ耐性変異株または代謝制御変異株を取得し、かつＬ−バリン生産能を有する変異株を選択する方法としては、例えば、親株または野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性または代謝制御変異を示し、かつＬ−バリン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３５】
（ＩＩ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素の発現が増強された組換え株を造成する方法としては、例えば、（ＩＩ−ａ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを、親株の染色体ＤＮＡ上に１以上導入する方法、または、（ＩＩ−ｂ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで親株を形質転換する方法を挙げることができる。
【００３６】
Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡとしては、アセト乳酸シンターゼをコードするilvG、ilvM、ilvI、ilvH、ilvBもしくはilvN、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするilvD、または、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードするilvE等を挙げることができる。
（ＩＩ−ａ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを、親株の染色体ＤＮＡ上に１以上導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片を、当該ＤＮＡ断片を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡと連結して作製できるＤＮＡを用いる方法をあげることができる。
【００３７】
相同組換えを利用した方法としては、i）該相同組換え用ＤＮＡを常法により微生物細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に相同組換え用ＤＮＡが組込まれた形質転換株を選択し、ii）得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、iii）前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択する、ことで染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた微生物を取得する方法をあげることができる。
【００３８】
微生物の細胞内で自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するＤＮＡとして、薬剤耐性遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子sacB（Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)）を有するプラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡを用いて、レバンシュークラーゼが宿主細胞に有害な物質を生産することを利用した選択法 （J.Bacteriol., 174, 5462(1992)）を利用して上記２回目の相同組換えが生じた微生物を取得することもできる。
【００３９】
相同組換え用プラスミドを微生物の細胞に導入する方法としては、微生物の細胞へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法（Appl. Microbiol. Biotech., 52,541(1999)）やプロトプラスト法（J. Bacteriol., 159,306(1984)）等をあげることができる。
該微生物の染色体ＤＮＡ上への、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡの導入は、例えば、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的として利用して行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。
【００４０】
また、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを該微生物の染色体ＤＮＡ上に挿入することは、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡをトランスポゾンに連結してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に挿入することによっても得ることができる（特開平２−１０９９８５号公報）。
染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片を導入した周辺の領域の塩基配列を決定することや、該ＤＮＡ断片の一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション等により、染色体ＤＮＡ上の目的の位置に当該ＤＮＡ断片が導入されたことを確認することができる。
【００４１】
（ＩＩ−ｂ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで親株を形質転換する方法としては、例えば、宿主となる微生物細胞内で自律複製可能であり、連結するＤＮＡを転写できるプロモーターを有する発現ベクターと、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片とを連結して作製した組換え体ＤＮＡを、宿主微生物細胞内に導入することにより取得することができる。
発現ベクターとしては、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、pTrc99a（lablife社製）、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもロシュ・ダイアグノスティックス社製）、pKK233−2（ＧＥヘルスケア社製）、pKK223−3（ＧＥヘルスケア社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX−1（プロメガ社製）、pQE−8（キアゲン社製）、pQE−30（キアゲン社製）、pKYP10（特開昭５８−１１０６００）、pKYP200〔Agric．Biol．Chem．，48,669（1984）〕、pLSA1〔Agric．Biol．Chem．，53,277（1989）〕、pGEL1〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82，4306（1985）〕、pBluescript II SK＋（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK−（ストラタジーン社製）、pTrs30（FERM BP−5407）、pTrs32（FERM BP−5408）、pGHA2（FERM BP−400）、pGKA2（FERM BP−6798）、pTerm2（特開平３−２２９７９、US4686191、US4939094、US5160735）、pEG400〔J．Bacteriol．，172，2392（1990）〕、pGEX（ＧＥヘルスケア社製）、pETシステム（ノバジェン社製）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus（インビトロジェン社製）、pMAL−c2（New England Biolabs社製）、pUC18〔gene，33,103（1985）〕、pUC19〔Gene，33,103（1985）〕、pSTV29（タカラバイオ社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭６３−２３３７９８）等が挙げられる。
【００４２】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrpx2）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーター、trcプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４３】
上記のように調製した組換え体ＤＮＡの該微生物への導入は、これまでに報告されている形質転換法に従って行うことができる。そのような方法としては例えば、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）や、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153(1977)）などがある。あるいは、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。
【００４４】
発現が増強されるＬ−バリン生合成に関与する酵素は、単独であっても、２種以上であってもよい。該酵素の発現を２種以上増強する場合は、上記した（ＩＩ−ａ）および（ＩＩ−ｂ）の方法を組み合わせることもできる。
このような組換え株の例としては、ilvGおよびilvB遺伝子の発現が増強された組換え株を挙げることができる。
【００４５】
（ＩＩＩ）アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株を取得する方法としては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するエシェリヒア・コリVL1970株が存在する。エシェリヒア・コリVL1970株は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411として寄託されている。
【００４６】
ここで、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を造成するにおいては、上記した（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれの方法で造成してもよく、２種以上の方法を組み合わせて造成してもよい。
６．ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素活性が低下した微生物
本発明で用いる、Ｌ−バリンを生産する能力を有する微生物は、上記した方法で造成した上でさらに、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる１以上の酵素、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる２以上の酵素、より好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼならびにピルビン酸・ギ酸リアーゼ、およびフマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物、または該活性を喪失させた微生物であってもよい。
【００４７】
例えば、エシェリヒア・コリの乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼは、それぞれldhA、pflB、frdA、adhE、ackAおよびpta遺伝子によってコードされている。
上記において、酵素の活性を親株より低下させるとは、親株が該活性を有する場合に、１）該蛋白質の発現量を親株より減少させること、または２）該蛋白質の比活性を低下させることであり、酵素の活性を喪失させるとは、該活性を完全に喪失させることである。
該蛋白質の発現量を親株より減少させる方法としては、例えば、該蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により改変すること、などによって達成され、該蛋白質の比活性を親株より低下させる方法は、該蛋白質のコーディング領域に同様の手法により変異を導入することなどにより達成される。
【００４８】
該蛋白質の活性を喪失させる方法としては、例えば、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により、染色体上の該蛋白質をコードする遺伝子の前後の配列を含めて、該遺伝子全体を欠失させてもよい。また、該遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成される（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【００４９】
親株と比較して該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物であることは、周知の該蛋白質の活性の測定法に基づき、活性を測定、比較することにより確認できる。
７．上記４の方法で得られるＤＮＡをＬ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法
上記４の方法で得られるＤＮＡを、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法としては、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により、上記５に記載の方法で造成した親株の染色体ＤＮＡ上に、１以上の上記４の方法で得られるＤＮＡを導入する方法、または、上記（ＩＩ−ｂ）に記載した方法により、上記４の方法で得られるＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで、上記５に記載の方法で造成した微生物を形質転換する方法が挙げられる。
８．本発明のＬ−バリンの製造法
上記５に記載した方法で造成される微生物を培地で培養して、Ｌ−バリンを該培地中に生成蓄積させ、培養物からＬ−バリンを採取することにより、Ｌ−バリンを製造することができる。
【００５０】
通常、微生物の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給する好気的条件で培養することが好ましい。一方、本発明の方法では、嫌気または微好気条件で培養を行う。
本発明において、嫌気または微好気条件とは、培地中のＯＲＰが−１００mV以下、好ましくは−２００mＶ以下の条件で培養することを意味する。嫌気または微好気条件は、例えば、培地への通気量や培養装置の攪拌数を低下させること、培養容器を密閉して無通気で培養すること、炭酸ガス等の不活性ガスを培地に通気すること等により、培地中の溶存酸素濃度を調整することによって達成される。
【００５１】
ＯＲＰは発酵用ＯＲＰ複合電極（東亜ディーケーケー社製）を用いて測定することができる。
本発明においては、全培養期間を通じて嫌気又は微好気条件で培養してもよいが、培養期間を、微生物を増殖させる培養期と、Ｌ−バリンを生産させる培養期に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、通気および攪拌下で細菌を増殖させた後、嫌気または微好気条件下でＬ−バリンを生産させてもよい。
【００５２】
また、微生物を培地で培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接液体培地に接種しても良いが、微生物を予め液体培地で培養（種培養又は前培養）したものを本培養用の培地（発酵培地）に接種するのが好ましい。種培養又は前培養では、通常、好気的条件で培養を行うことが好ましい。前培養は、複数回行ってもよい。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００５３】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩又は硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００５４】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１5０時間程度培養することにより、培地中にＬ−バリンが蓄積される。
培養終了後の培養物からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養物から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−バリンが析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−バリンは、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−バリンを晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００５５】
以下に、本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物の造成
（１）ilvG遺伝子発現の増強
Ｌ−バリンの生産性を向上させる目的で、大腸菌由来のilvG遺伝子の開始コドン上流に、trcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、常法により得られたエシェリヒア・コリK-12株を由来とするBW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ilvG遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1100bpの領域を増幅した。
【００５７】
次に、配列番号３０および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ilvG遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1120bpの領域を増幅した。
上記のＰＣＲにより増幅された、ilvG遺伝子の上流約1100bpのＤＮＡ断片、ilvG遺伝子の下流約1120bpのＤＮＡ断片、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）およびレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）を含有するＤＮＡ断片（以下、cat-sacB断片という。）を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２８および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、ＰＣＲを行った。
【００５８】
上記のＤＮＡ断片の増幅に用いられたプライマー配列のうち、配列番号２９および３０の5'末端は、cat-sacB断片のいずれかの末端に相補的な配列を有しており、得られる増幅産物がマーカー遺伝子であるcat遺伝子およびsacB遺伝子を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約4.8kbのＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたilvB周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００５９】
次に、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を保持するエシェリヒア・コリ BW25113株に、上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたilvG周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。
【００６０】
得られた形質転換体を、25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択することで、ilvG遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつ株を取得した。
次に、ilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入するため、配列番号３２、３３および３４で表される塩基配列からなるＤＮＡを、ilvG遺伝子のフレームシフトを解消するために、配列番号３５、３６および３７で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
【００６１】
配列番号２８及び３２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５及び３６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３７及び３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。また、配列番号３３および３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、pTrc99aを鋳型としてPCRを行い、trcプロモーターを含む増幅産物を取得した。Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号２８および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、増幅産物を取得した。
【００６２】
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約 4.2 kbのＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて分離し、trcプロモーターが挿入されたilvG遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
次に、上記で得られたilvG遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつ株に、trcプロモーターが挿入されたilvG遺伝子を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。
【００６３】
得られた形質転換体を、スクロースを含むLB寒天プレートに塗布して培養し、スクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片を含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示すため、選択したコロニーをクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート、およびスクロースを含むLB寒天テンプレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性、かつスクロース耐性を示した株を選択した。
【００６４】
選択した株について配列番号２８及び３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入されていることを確認した。
上記のようにしてilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入され、かつilvG遺伝子のフレームシフトが解消された、BG pKD46株を取得した。
（２）ilvB遺伝子発現の増強
Ｌ−バリンの生産性を向上させる目的で、BG pKD46株のilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
【００６５】
配列番号３８ならびに３９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号４０ならびに４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、それぞれilvB遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1050bpの領域、およびilvB遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1050bpの領域を増幅した。
【００６６】
上記のＰＣＲにより増幅された２種類のＤＮＡ断片およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３８および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約4.8kbのＤＮＡ断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたilvG周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００６７】
次に、BG pKD46株に、cat-sacB断片の挿入されたilvB周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入し、得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、ilvB遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつBG pKD46株を取得した。
次に、配列番号３８および４２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４５及び４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。また、配列番号４３および４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、pTrc99aを鋳型としてPCRを行い、trcプロモーター領域を含む増幅産物を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号３８および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約 2.2 kbのＤＮＡ断片を分離し、ilvB遺伝子の開始コドンの上流にtrcプロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を得た。
【００６８】
次に、ilvB遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつBG pKD46株に、ilvB遺伝子の開始コドンの上流にtrcプロモーターが挿入されたＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、選択した株について配列番号３８及び４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入されていることを確認した。
【００６９】
上記のようにして、ilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入された、OSK pKD46株を取得した。
（３）ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素の欠損
上記したOSK pKD46株において、有機酸またはエタノールを生成する酵素を欠損させるため、以下の方法により、ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA、またはpta遺伝子を欠損させた。
【００７０】
ldhA遺伝子の欠損ついては、配列番号４６ならびに４７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号４８ならびに４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、それぞれldhA遺伝子の開始コドン付近からその上流の領域、およびldhA遺伝子の終止コドン付近からその下流の領域を増幅した。
【００７１】
上記のＰＣＲにより増幅された２種類のＤＮＡ断片およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供してＤＮＡ断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
次に、OSK pKD46株に、cat-sacB断片の挿入されたldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入し、得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、ldhA遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつOSK pKD46株を取得した。
【００７２】
次に、配列番号４６ならびに５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号５１及び４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供してＤＮＡ断片を分離し、ldhA遺伝子が欠損したldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００７３】
次に、ldhA遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつOSK pKD46株に、ldhA遺伝子が欠損したldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、選択した株について配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ldhA遺伝子が欠損していることを確認した。
【００７４】
上記のようにして、ldhA遺伝子が欠損した、OSKΔldhA pKD46株を取得した。
pflB遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号５２〜５７で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、pflB遺伝子が欠損したOSKΔpflB pKD46株を取得した。
【００７５】
frdA遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号５８〜６３で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、frdA遺伝子が欠損したOSKΔfrdA pKD46株を取得した。
adhE遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号６４〜６９で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、adhE遺伝子が欠損したOSKΔadhE pKD46株を取得した。
【００７６】
ackA遺伝子およびpta遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号７０〜７５で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、ackA遺伝子およびpta遺伝子が欠損したOSKΔackA-pta pKD46株を取得した。
次に、OSKΔldhA pKD46株からpflB、adhE、frdA、またはackAならびにpta遺伝子を欠損させた株を作製した。それぞれの遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflB pKD46株、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株、OSKΔldhAΔadhE pKD46株、およびOSKΔldhAΔpta-ack pKD46株と命名した。
【００７７】
また、OSKΔldhAΔpflB pKD46株からfrdAまたはadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。それぞれの遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflBΔfrdA pKD46株、およびOSKΔldhAΔpflBΔadhE pKD46株と命名した。
また、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株からadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損はOSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、OSKΔldhAΔfrdAΔadhE pKD46株と命名した。
【００７８】
また、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA pKD46株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE pKD46株、およびOSKΔldhAΔfrdAΔadhE pKD46株からackAおよびpta遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta pKD46株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta pKD46株、およびOSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta pKD46株と命名した。
【００７９】
また、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhE pKD46株からadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta pKD46株と命名した。
pKD46プラスミドは温度感受性の複製起点を有するために、42℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。OSK pKD46株を42℃で培養し、アンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落したOSK株を取得した。
【００８０】
同様の方法により、上記で造成したOSK pKD46以外の株においてもpKD46を脱落させ、それぞれOSKΔldhA株、OSKΔpflB株、OSKΔfrdA株、OSKΔadhE、OSKΔackA-pta株、OSKΔldhAΔpflB株、OSKΔldhAΔfrdA株、OSKΔldhAΔadhE株OSK、OSKΔldhAΔpta-ack株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhE株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta株を取得した。
【実施例２】
【００８１】
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの導入
（１）枯草菌のbcd遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするbcd遺伝子の発現プラスミドを造成した。
バチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７６および７７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、bcd遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８２】
上記で得られたbcd遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、bcd遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-BsLeuDHと名付けた。
（２）サーモアクチノマイセス・インターメディウスのleudh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするleudh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７８および７９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、leudh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８３】
上記で得られたleudh遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、leudh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiLeuDHと名付けた。
（３）サーモアクチノマイセス・インターメディウスのpdh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするpdh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８０および８１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、pdh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をNcoI及びKpnIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８４】
上記で得られたpdh遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pdh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiPheDHと名付けた。
（４）Ｌ−バリン生産菌へのＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードする組換え体ＤＮＡの導入
pTrc99a-BsLeuDHでOSK株を形質転換し、OSK BsleuDH株を取得した。
【００８５】
同様に、pTrc99a-BsLeuDHで実施例１の（３）で造成した菌株を形質転換し、OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔadhE BsLeuDH株、OSKΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpta-ack BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株を取得した。
【００８６】
また、pTrc99a-TiLeuDH でOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、OSKΔldhAΔpflB TiLeuDH株を取得した。
また、pTrc99a-TiPheDH でOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、OSKΔldhAΔpflB TiPheDH株を取得した。
尚、pTrc99a-BsLeuDH 、pTrc99a-TiLeuDH、或いはpTrc99a-TiPheDHは、それぞれの挿入遺伝子がtrcプロモーター下で発現するように設計されており、IPTG等により該遺伝子の発現を誘導することができる。
【実施例３】
【００８７】
Ｌ−バリンの生産
（１）Ｌ−バリン生産に対する微好気条件の効果
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株を、アンピシリン（100mg/L）を含有するＬＢプレート培地に植菌して、30℃で一晩培養した。プレート1/2枚分の菌体を、2 L容三角フラスコ中300 mlの種培地（20g/L グルコース、10g/L ハイニュートAM、10g/L 酵母エキス、2.5g/L 塩化ナトリウム、10 g/L 炭酸カルシウム、pH 7.4に水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加）に植菌し、30℃にて攪拌速度220rpmで好気的に24時間培養した。上記の培養液100 mlを、3 L容ジャーファーメンター中900 mlのＬ−バリン生産培地（4g/L KH2PO4、5.7g/L K2HPO4、4g/L (NH4）2HPO4、0.017g/L CaCl2・2H2O、0.134g/L 無水ベタイン、0.0058g/L チアミン塩酸塩、0.0002g/L CoCl2・6H2O、0.0001g/L CuCl2・6H2O、0.0002g/L ZnCl2、0.0002g/L Na2MoO4・2H2O、0.0001g/L H3BO3、5g/L 酵母エキス、40g/L グルコース、0.25g/L MgSO4・7H2O、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加、更にIPTGを終濃度1 mMとなるように別添加）に植菌し、36℃、通気量（空気流速）0.5vvm制御下にてORP制御を利用して、グルコースを完全に消費するまで培養した。この間、18％濃度のアンモニア水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のpHを7.0に常時維持した。ORPは、撹拌数を最大1200 rpm、最小を50 rpmとして設定値を維持するように制御した。培地中に含まれるＬ−バリンは島津製作所製のHPLCを用いて分析した。グルコースはグルコアナライザーＧＡ０５（アットウィル製）を利用して測定した。
【００８８】
その結果、設定ORPを低下させること、具体的には-100mV以下、更には-200mVとすることで、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表１）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
また、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株を、アンピシリン（100 mg/L）を含有するＬＢプレート培地に植菌して、30℃で一晩培養した。プレート1/2枚分の菌体を、2 L容三角フラスコ中300 mlの上記と同じ種培地に植菌し、30℃にて攪拌速度220rpmで好気的に24時間培養した。上記の培養液100 mlを、2 L容ジャーファーメンター中900 mlの上記と同じＬ−バリン生産培地に植菌し、36℃、通気量（空気流速）0.5vvm制御下にて様々な撹拌数に設定し、グルコースを完全に消費するまで培養した。この間、18％濃度のアンモニア水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のpHを7.0に常時維持した。培地中に含まれるＬ−バリンは島津製作所製のHPLCを用いて分析した。又、グルコースはグルコアナライザーＧＡ０５（アットウィル製）を利用して測定した。
【００９１】
その結果、設定撹拌数を低下させること、具体的には100 rpm以下、更には50 rpmとすることで、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表２）。
【００９２】
【表２】
【００９３】
これらのことから、微好気条件下でOSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株のＬ−バリン生産能が向上することが確認された。
また、以降の実施例における評価では、上記の培地及び培養工程（2 L容ジャーファーメンターを使用）の下、撹拌数50 rpmで行った。
（２）leudh遺伝子またはpdh遺伝子の発現が微好気条件下のＬ−バリン生産に及ぼす効果
pTrc99aでOSK株およびOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、それぞれOSK pTrc99a株およびOSKΔldhAΔpflB pTrc99a株を取得した。
【００９４】
また、OSK pTrc99a株、OSK BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB pTrc99a株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB TiLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflB TiPheDH株を、実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下においてleudh遺伝子またはpdh遺伝子を発現させた株は、該遺伝子を発現させていない対照株と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表３）。
【００９５】
【表３】
【００９６】
（３）ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA、pta遺伝子の欠損が微好気条件下におけるＬ−バリン生産に及ぼす効果
＜３−１＞１遺伝子欠損の効果
ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA-pta遺伝子のうち、１遺伝子（但しarkA-ptaは２遺伝子）の欠損がＬ−バリン生産に及ぼす効果を検証した。
【００９７】
OSK BsLeuDH株、OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔadhE BsLeuDH株、およびOSKΔackA-pta BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下においてldhA、pflBまたはackA-pta遺伝子を欠損させた株は、該遺伝子を欠損させていない対照株（OSK BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表４）。
【００９８】
【表４】
【００９９】
＜３−２＞２遺伝子欠損の効果
OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpta-ack BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下でldhAおよびpflB遺伝子、ldhAおよびfrdA遺伝子、またはldhA及びackA-pta遺伝子を欠損させた株は、1遺伝子のみを欠損させた対照株（OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
＜３−３＞多重遺伝子欠損の効果
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
【０１０３】
その結果、微好気条件下で、表７および８で示したように、多重遺伝子欠損株において、対照株（OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸液やサプリメント等の成分として利用されるＬ−バリンの微生物による製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−バリンは、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。そのような微生物の例としては、Ｄ−リボ-ス、プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を示す微生物（特許文献１）、ポリケトイド類に耐性を示す微生物(特許文献２) 、ピルビン酸アナログに感受性を示す微生物（特許文献３）、イソロイシンｔＲＮＡシンテターゼに変異を有する微生物（特許文献４）、分岐鎖アミノ酸の排出に関わる蛋白質の発現を増強させた微生物（特許文献５）、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを欠失させた微生物（特許文献６）、フィードバック阻害に耐性のアセト乳酸合成酵素を有する微生物（特許文献７）、ＮＡＤＰＨの供給を強化させた微生物（特許文献８）およびピルビン酸オキシダーゼの発現を低下させた微生物（特許文献９）など多くの例が挙げられる。
【０００３】
これらの微生物を用いたＬ−バリンの製造法は、微生物を好気条件下で培養すること前提としているが、微生物を好気条件下で培養することは、呼吸により原材料のグルコースが二酸化炭素として多く排出される、発酵槽の酸素供給能力によりＬ−バリンの生産性が制限される、微生物の分裂増殖に伴う発酵熱の除去に多量の冷却水やプロセスエネルギーが必要になる、などの問題があった。
【０００４】
上記問題に対しては、ある種の微生物を嫌気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する試みがなされている。例えば、クロストリジウム属に属する微生物を用いた例では、Ｌ−α−アミノ酪酸に耐性を示す該微生物を嫌気条件下で培養し、Ｌ−バリンを製造した例が報告されている（特許文献１０）。また、ブレビバクテリア属に属する微生物を用いた例では、該微生物を培地中の酸化還元電位（以下、ＯＲＰという。）を制御することで嫌気条件を制御し、Ｌ−バリンを製造した例が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、大腸菌においては、広くＬ−アミノ酸の工業生産に利用されているにも関わらず、大腸菌を嫌気もしくは微好気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する方法は、これまでに報告されていない。
また、ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性（以下、ＮＶＤＨ活性という。）を有する蛋白質は既知であるが（非特許文献２）、該蛋白質をコードするＤＮＡでエシェリヒア属に属する微生物を形質転換し、該形質転換体を嫌気もしくは微好気条件化で培養し、Ｌ−バリンを製造する方法についても、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭５３−０２５０３４
【特許文献２】特公平０６−０６５３１４
【特許文献３】特開平０５−００７４９３
【特許文献４】欧州特許第５６５８７６６号
【特許文献５】特開２００２−３００８７４
【特許文献６】特開２０００−１１６３９３
【特許文献７】特開２００８−０９９６６８
【特許文献８】欧州特許第０７３３７１２号
【特許文献９】国際公開パンフレットＷＯ０２／３６７９７
【特許文献１０】特開平３−５８７８１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Akashi Kunihiko et al. (1977) Journal of fermentation technology 55: 364-368
【非特許文献２】Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、Ｌ−バリンを嫌気又は微好気条件下で生産することのできる微生物を造成し、該微生物を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−バリンを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法。
（２）微生物が、下記の［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、上記（１）記載の製造法。
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、上記（１）または（２）記載の製造法。
（４）微生物が、Ｌ−バリンの生合成に関与する１つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
（５）微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
（６）嫌気または微好気条件が、培地中の酸化還元電位が−１００mV以下の条件である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、大腸菌を嫌気又は微好気条件下で培養し、Ｌ−バリンを生産することが可能となるため、二酸化炭素の排出を抑制でき、また発酵装置の酸素供給能力に依存せず、冷却水やプロセスエネルギーの消費を抑制したＬ−バリンの発酵生産が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法に関する。
１．本発明で用いられる微生物
本発明で用いられる微生物は、親株よりＮＶＤＨ活性が高く、かつL-バリンを生産する能力を有する微生物である。
【００１２】
親株よりＮＶＤＨ活性が高い微生物としては、親株がＮＶＤＨ活性を有している場合は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以下、ＮＶＤＨ遺伝子という）を改変することにより、１）該遺伝子の発現量が増大した微生物、または２）該蛋白質の比活性が増強した微生物を挙げることができる。
ＮＶＤＨ遺伝子の発現量が増大した微生物としては、３）該遺伝子のプロモーター部分が改変、または４）該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、親株を該遺伝子で形質転換することにより、５）染色体上のコピー数が増大した微生物、または６）プラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
【００１３】
プロモーターの改変、およびＮＶＤＨ活性を有する蛋白質の比活性を上げる方法としては、後述の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、プロモーター部位、またはコーディング領域のＤＮＡ（以下、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡともいう。）に変異を導入する方法をあげることができる。当該方法により、親株よりＮＶＤＨ遺伝子の発現量が増大、またはＮＶＤＨ活性を有する蛋白質の比活性が向上した微生物が取得できたことは、RT-PCRやノーザンハイブリダイゼーションによりmRNA量を測定、または該微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液もしくは水溶性画分を調整し、該画分を基質であるＮＡＤＨおよび２−オキソイソ吉草酸と混合し、結果として生成するＬ−バリンを検出するOhshimaらの方法（Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312）によってＮＶＤＨ活性を測定、比較することにより確認することができる。
【００１４】
また、親株よりＮＶＤＨ活性が高い微生物としては、親株がＮＶＤＨ活性を有していない、すなわちＮＶＤＨ遺伝子を有していない場合は、親株をＮＶＤＨ遺伝子で形質転換することにより、７）親株の染色体ＤＮＡに該遺伝子が組み込こまれた微生物、または８）プラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物をあげることができる。
【００１５】
本発明において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。元株及び宿主株は野生株であってもよいし、人為的操作により例えばバリンの生産能が野生株より向上した変異株であってもよい。
本発明で用いられる微生物は、いずれの属に属する微生物であっても良いが、好ましくは原核生物、より好ましくは偏性嫌気細菌および通性嫌気細菌、さらに好ましくは通性嫌気細菌、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物を挙げることができる。
２．ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質としては、各種データベース中に、該活性を有すると登録されている蛋白質、該蛋白質と高い同一性（例えば80％以上の同一性）があると記載されている蛋白質をあげることができるが、具体的には、
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質、および、
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
【００１６】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) 、Gene, 34, 315 (1985) 、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１７】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００１８】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１９】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、２,３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられるＮＶＤＨ活性を有する蛋白質としては、配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有している蛋白質を挙げることができる。
【００２０】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
３．ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、上記２に記載のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができ、具体的には、
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および、
［７］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
【００２１】
上記において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００２２】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
【００２３】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
【００２４】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００２５】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００２６】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液もしくは水溶性画分を調整し、該画分を基質であるＮＡＤＨおよび２−オキソイソ吉草酸と混合し、結果として生成するＬ−バリンを検出するOhshimaらの方法（Ohshima Toshihisa et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222: 305-312）によって確認できる。
４．本発明の製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法に用いられる、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、バチルス（Bacillus）属およびサーモアクチノマイセス(Thermoactinomyces)属に属する微生物より調製することができる。
【００２７】
バチルス属に属する微生物としては、具体的には、Bacillus subtilis 168を挙げることができ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）よりＡＴＣＣ２３８５７の微生物として入手できる。サーモアクチノマイセス属に属する微生物としては、具体的には、Thermoactinomyces intermedius IFO14230を挙げることができ、ＡＴＣＣよりＡＴＣＣ３３２０５の微生物として入手できる。
【００２８】
バチルス属またはサーモアクチノマイセス属に属する微生物を公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）に従って培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離・精製する。
ゲノム情報を基に、バチルス属に属する微生物のbcd遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、PCR〔PCR Protocols, Academic Press(1900)〕を行うことにより、バチルス属に属する微生物由来のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。同様に、サーモアクチノマイセス属に属する微生物のleudhまたはpdh遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、PCRを行うことにより、サーモアクチノマイセス属に属する微生物由来のＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。
【００２９】
また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法等により、該ＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば3730xl・ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製）等を用いたジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕により該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３０】
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescript KS＋（ストラタジーン社製）、pDIRECT〔Nucleic Acid Research，18, 6069(1990)〕、pCR−Script Amp SK＋（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR−TRAP（ジーンハンター社製）、pNoTAT7（５プライム→３プライム社製）およびpTrc99a（lablife社製）等をあげることができる。
【００３１】
上記のようにして取得された塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号１、３および５で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号１、３および５で表される塩基配列を有するＤＮＡとしては、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含むＤＮＡをあげることができる。
【００３２】
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側１００塩基、好ましくは５０塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、−１０および−３５領域に相当する領域をあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる微生物の造成
本発明の製造法に用いられる、ＮＶＤＨ活性が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物は、例えば、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物（下記に詳細を記載する。）を親株として、上記４の方法で得られるＤＮＡを該親株に導入する方法（下記７．に詳細を記載する。）、などにより造成することができる。
【００３３】
Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物は、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を親株として、（Ｉ）栄養要求性変異株、Ｌ−バリンのアナログ耐性変異株または代謝制御変異株を取得し、かつＬ−バリン生産能を有する変異株を選択する方法（アミノ酸発酵、学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁）、（ＩＩ）Ｌ−バリンの生合成系酵素の発現が増強された組換え株を造成する方法（前文献と同じ、第７７〜１００頁）、または、（ＩＩＩ）アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株を取得する方法(米国特許第5,658,766号)、などによって造成することができる。
【００３４】
エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、およびW3110株（ATCC 27325）を挙げることができる。
（Ｉ）栄養要求性変異株、Ｌ−バリンのアナログ耐性変異株または代謝制御変異株を取得し、かつＬ−バリン生産能を有する変異株を選択する方法としては、例えば、親株または野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性または代謝制御変異を示し、かつＬ−バリン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３５】
（ＩＩ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素の発現が増強された組換え株を造成する方法としては、例えば、（ＩＩ−ａ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを、親株の染色体ＤＮＡ上に１以上導入する方法、または、（ＩＩ−ｂ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで親株を形質転換する方法を挙げることができる。
【００３６】
Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡとしては、アセト乳酸シンターゼをコードするilvG、ilvM、ilvI、ilvH、ilvBもしくはilvN、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするilvD、または、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードするilvE等を挙げることができる。
（ＩＩ−ａ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを、親株の染色体ＤＮＡ上に１以上導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片を、当該ＤＮＡ断片を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡと連結して作製できるＤＮＡを用いる方法をあげることができる。
【００３７】
相同組換えを利用した方法としては、i）該相同組換え用ＤＮＡを常法により微生物細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に相同組換え用ＤＮＡが組込まれた形質転換株を選択し、ii）得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、iii）前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択する、ことで染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた微生物を取得する方法をあげることができる。
【００３８】
微生物の細胞内で自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するＤＮＡとして、薬剤耐性遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子sacB（Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)）を有するプラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡを用いて、レバンシュークラーゼが宿主細胞に有害な物質を生産することを利用した選択法 （J.Bacteriol., 174, 5462(1992)）を利用して上記２回目の相同組換えが生じた微生物を取得することもできる。
【００３９】
相同組換え用プラスミドを微生物の細胞に導入する方法としては、微生物の細胞へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法（Appl. Microbiol. Biotech., 52,541(1999)）やプロトプラスト法（J. Bacteriol., 159,306(1984)）等をあげることができる。
該微生物の染色体ＤＮＡ上への、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡの導入は、例えば、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的として利用して行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。
【００４０】
また、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを該微生物の染色体ＤＮＡ上に挿入することは、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡをトランスポゾンに連結してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に挿入することによっても得ることができる（特開平２−１０９９８５号公報）。
染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片を導入した周辺の領域の塩基配列を決定することや、該ＤＮＡ断片の一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション等により、染色体ＤＮＡ上の目的の位置に当該ＤＮＡ断片が導入されたことを確認することができる。
【００４１】
（ＩＩ−ｂ）Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで親株を形質転換する方法としては、例えば、宿主となる微生物細胞内で自律複製可能であり、連結するＤＮＡを転写できるプロモーターを有する発現ベクターと、Ｌ−バリンの生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片とを連結して作製した組換え体ＤＮＡを、宿主微生物細胞内に導入することにより取得することができる。
発現ベクターとしては、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、pTrc99a（lablife社製）、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもロシュ・ダイアグノスティックス社製）、pKK233−2（ＧＥヘルスケア社製）、pKK223−3（ＧＥヘルスケア社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX−1（プロメガ社製）、pQE−8（キアゲン社製）、pQE−30（キアゲン社製）、pKYP10（特開昭５８−１１０６００）、pKYP200〔Agric．Biol．Chem．，48,669（1984）〕、pLSA1〔Agric．Biol．Chem．，53,277（1989）〕、pGEL1〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82，4306（1985）〕、pBluescript II SK＋（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK−（ストラタジーン社製）、pTrs30（FERM BP−5407）、pTrs32（FERM BP−5408）、pGHA2（FERM BP−400）、pGKA2（FERM BP−6798）、pTerm2（特開平３−２２９７９、US4686191、US4939094、US5160735）、pEG400〔J．Bacteriol．，172，2392（1990）〕、pGEX（ＧＥヘルスケア社製）、pETシステム（ノバジェン社製）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus（インビトロジェン社製）、pMAL−c2（New England Biolabs社製）、pUC18〔gene，33,103（1985）〕、pUC19〔Gene，33,103（1985）〕、pSTV29（タカラバイオ社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭６３−２３３７９８）等が挙げられる。
【００４２】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrpx2）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーター、trcプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４３】
上記のように調製した組換え体ＤＮＡの該微生物への導入は、これまでに報告されている形質転換法に従って行うことができる。そのような方法としては例えば、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）や、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153(1977)）などがある。あるいは、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。
【００４４】
発現が増強されるＬ−バリン生合成に関与する酵素は、単独であっても、２種以上であってもよい。該酵素の発現を２種以上増強する場合は、上記した（ＩＩ−ａ）および（ＩＩ−ｂ）の方法を組み合わせることもできる。
このような組換え株の例としては、ilvGおよびilvB遺伝子の発現が増強された組換え株を挙げることができる。
【００４５】
（ＩＩＩ）アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株を取得する方法としては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するエシェリヒア・コリVL1970株が存在する。エシェリヒア・コリVL1970株は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411として寄託されている。
【００４６】
ここで、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を造成するにおいては、上記した（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれの方法で造成してもよく、２種以上の方法を組み合わせて造成してもよい。
６．ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素活性が低下した微生物
本発明で用いる、Ｌ−バリンを生産する能力を有する微生物は、上記した方法で造成した上でさらに、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる１以上の酵素、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる２以上の酵素、より好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼならびにピルビン酸・ギ酸リアーゼ、およびフマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物、または該活性を喪失させた微生物であってもよい。
【００４７】
例えば、エシェリヒア・コリの乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼは、それぞれldhA、pflB、frdA、adhE、ackAおよびpta遺伝子によってコードされている。
上記において、酵素の活性を親株より低下させるとは、親株が該活性を有する場合に、１）該蛋白質の発現量を親株より減少させること、または２）該蛋白質の比活性を低下させることであり、酵素の活性を喪失させるとは、該活性を完全に喪失させることである。
該蛋白質の発現量を親株より減少させる方法としては、例えば、該蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により改変すること、などによって達成され、該蛋白質の比活性を親株より低下させる方法は、該蛋白質のコーディング領域に同様の手法により変異を導入することなどにより達成される。
【００４８】
該蛋白質の活性を喪失させる方法としては、例えば、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により、染色体上の該蛋白質をコードする遺伝子の前後の配列を含めて、該遺伝子全体を欠失させてもよい。また、該遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成される（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【００４９】
親株と比較して該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物であることは、周知の該蛋白質の活性の測定法に基づき、活性を測定、比較することにより確認できる。
７．上記４の方法で得られるＤＮＡをＬ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法
上記４の方法で得られるＤＮＡを、Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法としては、上記（ＩＩ−ａ）に記載した相同組換えを利用した方法により、上記５に記載の方法で造成した親株の染色体ＤＮＡ上に、１以上の上記４の方法で得られるＤＮＡを導入する方法、または、上記（ＩＩ−ｂ）に記載した方法により、上記４の方法で得られるＤＮＡを含有する自律複製型の組換え体ＤＮＡで、上記５に記載の方法で造成した微生物を形質転換する方法が挙げられる。
８．本発明のＬ−バリンの製造法
上記５に記載した方法で造成される微生物を培地で培養して、Ｌ−バリンを該培地中に生成蓄積させ、培養物からＬ−バリンを採取することにより、Ｌ−バリンを製造することができる。
【００５０】
通常、微生物の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給する好気的条件で培養することが好ましい。一方、本発明の方法では、嫌気または微好気条件で培養を行う。
本発明において、嫌気または微好気条件とは、培地中のＯＲＰが−１００mV以下、好ましくは−２００mＶ以下の条件で培養することを意味する。嫌気または微好気条件は、例えば、培地への通気量や培養装置の攪拌数を低下させること、培養容器を密閉して無通気で培養すること、炭酸ガス等の不活性ガスを培地に通気すること等により、培地中の溶存酸素濃度を調整することによって達成される。
【００５１】
ＯＲＰは発酵用ＯＲＰ複合電極（東亜ディーケーケー社製）を用いて測定することができる。
本発明においては、全培養期間を通じて嫌気又は微好気条件で培養してもよいが、培養期間を、微生物を増殖させる培養期と、Ｌ−バリンを生産させる培養期に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、通気および攪拌下で細菌を増殖させた後、嫌気または微好気条件下でＬ−バリンを生産させてもよい。
【００５２】
また、微生物を培地で培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接液体培地に接種しても良いが、微生物を予め液体培地で培養（種培養又は前培養）したものを本培養用の培地（発酵培地）に接種するのが好ましい。種培養又は前培養では、通常、好気的条件で培養を行うことが好ましい。前培養は、複数回行ってもよい。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００５３】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩又は硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００５４】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１5０時間程度培養することにより、培地中にＬ−バリンが蓄積される。
培養終了後の培養物からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養物から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−バリンが析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−バリンは、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−バリンを晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００５５】
以下に、本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
Ｌ−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物の造成
（１）ilvG遺伝子発現の増強
Ｌ−バリンの生産性を向上させる目的で、大腸菌由来のilvG遺伝子の開始コドン上流に、trcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、常法により得られたエシェリヒア・コリK-12株を由来とするBW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ilvG遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1100bpの領域を増幅した。
【００５７】
次に、配列番号３０および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ilvG遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1120bpの領域を増幅した。
上記のＰＣＲにより増幅された、ilvG遺伝子の上流約1100bpのＤＮＡ断片、ilvG遺伝子の下流約1120bpのＤＮＡ断片、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）およびレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）を含有するＤＮＡ断片（以下、cat-sacB断片という。）を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２８および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、ＰＣＲを行った。
【００５８】
上記のＤＮＡ断片の増幅に用いられたプライマー配列のうち、配列番号２９および３０の5'末端は、cat-sacB断片のいずれかの末端に相補的な配列を有しており、得られる増幅産物がマーカー遺伝子であるcat遺伝子およびsacB遺伝子を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約4.8kbのＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたilvB周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００５９】
次に、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を保持するエシェリヒア・コリ BW25113株に、上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたilvG周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。
【００６０】
得られた形質転換体を、25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択することで、ilvG遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつ株を取得した。
次に、ilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入するため、配列番号３２、３３および３４で表される塩基配列からなるＤＮＡを、ilvG遺伝子のフレームシフトを解消するために、配列番号３５、３６および３７で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
【００６１】
配列番号２８及び３２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５及び３６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３７及び３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。また、配列番号３３および３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、pTrc99aを鋳型としてPCRを行い、trcプロモーターを含む増幅産物を取得した。Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号２８および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、増幅産物を取得した。
【００６２】
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約 4.2 kbのＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて分離し、trcプロモーターが挿入されたilvG遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
次に、上記で得られたilvG遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつ株に、trcプロモーターが挿入されたilvG遺伝子を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。
【００６３】
得られた形質転換体を、スクロースを含むLB寒天プレートに塗布して培養し、スクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片を含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示すため、選択したコロニーをクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート、およびスクロースを含むLB寒天テンプレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性、かつスクロース耐性を示した株を選択した。
【００６４】
選択した株について配列番号２８及び３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入されていることを確認した。
上記のようにしてilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入され、かつilvG遺伝子のフレームシフトが解消された、BG pKD46株を取得した。
（２）ilvB遺伝子発現の増強
Ｌ−バリンの生産性を向上させる目的で、BG pKD46株のilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
【００６５】
配列番号３８ならびに３９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号４０ならびに４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、それぞれilvB遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1050bpの領域、およびilvB遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1050bpの領域を増幅した。
【００６６】
上記のＰＣＲにより増幅された２種類のＤＮＡ断片およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３８および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約4.8kbのＤＮＡ断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたilvG周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００６７】
次に、BG pKD46株に、cat-sacB断片の挿入されたilvB周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入し、得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、ilvB遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつBG pKD46株を取得した。
次に、配列番号３８および４２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４５及び４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。また、配列番号４３および４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、pTrc99aを鋳型としてPCRを行い、trcプロモーター領域を含む増幅産物を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号３８および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約 2.2 kbのＤＮＡ断片を分離し、ilvB遺伝子の開始コドンの上流にtrcプロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を得た。
【００６８】
次に、ilvB遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつBG pKD46株に、ilvB遺伝子の開始コドンの上流にtrcプロモーターが挿入されたＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、選択した株について配列番号３８及び４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入されていることを確認した。
【００６９】
上記のようにして、ilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入された、OSK pKD46株を取得した。
（３）ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素の欠損
上記したOSK pKD46株において、有機酸またはエタノールを生成する酵素を欠損させるため、以下の方法により、ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA、またはpta遺伝子を欠損させた。
【００７０】
ldhA遺伝子の欠損ついては、配列番号４６ならびに４７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号４８ならびに４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、それぞれldhA遺伝子の開始コドン付近からその上流の領域、およびldhA遺伝子の終止コドン付近からその下流の領域を増幅した。
【００７１】
上記のＰＣＲにより増幅された２種類のＤＮＡ断片およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供してＤＮＡ断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
次に、OSK pKD46株に、cat-sacB断片の挿入されたldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入し、得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、ldhA遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつOSK pKD46株を取得した。
【００７２】
次に、配列番号４６ならびに５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号５１及び４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供してＤＮＡ断片を分離し、ldhA遺伝子が欠損したldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００７３】
次に、ldhA遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつOSK pKD46株に、ldhA遺伝子が欠損したldhA周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体を、実施例１の（１）に記載の方法により選択し、選択した株について配列番号４６および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーが有するゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、ldhA遺伝子が欠損していることを確認した。
【００７４】
上記のようにして、ldhA遺伝子が欠損した、OSKΔldhA pKD46株を取得した。
pflB遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号５２〜５７で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、pflB遺伝子が欠損したOSKΔpflB pKD46株を取得した。
【００７５】
frdA遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号５８〜６３で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、frdA遺伝子が欠損したOSKΔfrdA pKD46株を取得した。
adhE遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号６４〜６９で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、adhE遺伝子が欠損したOSKΔadhE pKD46株を取得した。
【００７６】
ackA遺伝子およびpta遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号４６〜５１で表されるＤＮＡを、配列番号７０〜７５で表されるＤＮＡにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、ackA遺伝子およびpta遺伝子が欠損したOSKΔackA-pta pKD46株を取得した。
次に、OSKΔldhA pKD46株からpflB、adhE、frdA、またはackAならびにpta遺伝子を欠損させた株を作製した。それぞれの遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflB pKD46株、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株、OSKΔldhAΔadhE pKD46株、およびOSKΔldhAΔpta-ack pKD46株と命名した。
【００７７】
また、OSKΔldhAΔpflB pKD46株からfrdAまたはadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。それぞれの遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflBΔfrdA pKD46株、およびOSKΔldhAΔpflBΔadhE pKD46株と命名した。
また、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株からadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損はOSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、OSKΔldhAΔfrdAΔadhE pKD46株と命名した。
【００７８】
また、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA pKD46株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE pKD46株、およびOSKΔldhAΔfrdAΔadhE pKD46株からackAおよびpta遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta pKD46株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta pKD46株、およびOSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta pKD46株と命名した。
【００７９】
また、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhE pKD46株からadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta pKD46株と命名した。
pKD46プラスミドは温度感受性の複製起点を有するために、42℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。OSK pKD46株を42℃で培養し、アンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落したOSK株を取得した。
【００８０】
同様の方法により、上記で造成したOSK pKD46以外の株においてもpKD46を脱落させ、それぞれOSKΔldhA株、OSKΔpflB株、OSKΔfrdA株、OSKΔadhE、OSKΔackA-pta株、OSKΔldhAΔpflB株、OSKΔldhAΔfrdA株、OSKΔldhAΔadhE株OSK、OSKΔldhAΔpta-ack株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhE株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta株を取得した。
【実施例２】
【００８１】
ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの導入
（１）枯草菌のbcd遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするbcd遺伝子の発現プラスミドを造成した。
バチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７６および７７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、bcd遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８２】
上記で得られたbcd遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、bcd遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-BsLeuDHと名付けた。
（２）サーモアクチノマイセス・インターメディウスのleudh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするleudh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７８および７９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、leudh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８３】
上記で得られたleudh遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、leudh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiLeuDHと名付けた。
（３）サーモアクチノマイセス・インターメディウスのpdh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、ＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするpdh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８０および８１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてPCRを行い、pdh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a（Pharmacia社製）をNcoI及びKpnIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
【００８４】
上記で得られたpdh遺伝子断片、及びpTrc99aの制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pdh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiPheDHと名付けた。
（４）Ｌ−バリン生産菌へのＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードする組換え体ＤＮＡの導入
pTrc99a-BsLeuDHでOSK株を形質転換し、OSK BsleuDH株を取得した。
【００８５】
同様に、pTrc99a-BsLeuDHで実施例１の（３）で造成した菌株を形質転換し、OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔadhE BsLeuDH株、OSKΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpta-ack BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株を取得した。
【００８６】
また、pTrc99a-TiLeuDH でOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、OSKΔldhAΔpflB TiLeuDH株を取得した。
また、pTrc99a-TiPheDH でOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、OSKΔldhAΔpflB TiPheDH株を取得した。
尚、pTrc99a-BsLeuDH 、pTrc99a-TiLeuDH、或いはpTrc99a-TiPheDHは、それぞれの挿入遺伝子がtrcプロモーター下で発現するように設計されており、IPTG等により該遺伝子の発現を誘導することができる。
【実施例３】
【００８７】
Ｌ−バリンの生産
（１）Ｌ−バリン生産に対する微好気条件の効果
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株を、アンピシリン（100mg/L）を含有するＬＢプレート培地に植菌して、30℃で一晩培養した。プレート1/2枚分の菌体を、2 L容三角フラスコ中300 mlの種培地（20g/L グルコース、10g/L ハイニュートAM、10g/L 酵母エキス、2.5g/L 塩化ナトリウム、10 g/L 炭酸カルシウム、pH 7.4に水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加）に植菌し、30℃にて攪拌速度220rpmで好気的に24時間培養した。上記の培養液100 mlを、3 L容ジャーファーメンター中900 mlのＬ−バリン生産培地（4g/L KH2PO4、5.7g/L K2HPO4、4g/L (NH4）2HPO4、0.017g/L CaCl2・2H2O、0.134g/L 無水ベタイン、0.0058g/L チアミン塩酸塩、0.0002g/L CoCl2・6H2O、0.0001g/L CuCl2・6H2O、0.0002g/L ZnCl2、0.0002g/L Na2MoO4・2H2O、0.0001g/L H3BO3、5g/L 酵母エキス、40g/L グルコース、0.25g/L MgSO4・7H2O、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加、更にIPTGを終濃度1 mMとなるように別添加）に植菌し、36℃、通気量（空気流速）0.5vvm制御下にてORP制御を利用して、グルコースを完全に消費するまで培養した。この間、18％濃度のアンモニア水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のpHを7.0に常時維持した。ORPは、撹拌数を最大1200 rpm、最小を50 rpmとして設定値を維持するように制御した。培地中に含まれるＬ−バリンは島津製作所製のHPLCを用いて分析した。グルコースはグルコアナライザーＧＡ０５（アットウィル製）を利用して測定した。
【００８８】
その結果、設定ORPを低下させること、具体的には-100mV以下、更には-200mVとすることで、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表１）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
また、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株を、アンピシリン（100 mg/L）を含有するＬＢプレート培地に植菌して、30℃で一晩培養した。プレート1/2枚分の菌体を、2 L容三角フラスコ中300 mlの上記と同じ種培地に植菌し、30℃にて攪拌速度220rpmで好気的に24時間培養した。上記の培養液100 mlを、2 L容ジャーファーメンター中900 mlの上記と同じＬ−バリン生産培地に植菌し、36℃、通気量（空気流速）0.5vvm制御下にて様々な撹拌数に設定し、グルコースを完全に消費するまで培養した。この間、18％濃度のアンモニア水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のpHを7.0に常時維持した。培地中に含まれるＬ−バリンは島津製作所製のHPLCを用いて分析した。又、グルコースはグルコアナライザーＧＡ０５（アットウィル製）を利用して測定した。
【００９１】
その結果、設定撹拌数を低下させること、具体的には100 rpm以下、更には50 rpmとすることで、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表２）。
【００９２】
【表２】
【００９３】
これらのことから、微好気条件下でOSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株のＬ−バリン生産能が向上することが確認された。
また、以降の実施例における評価では、上記の培地及び培養工程（2 L容ジャーファーメンターを使用）の下、撹拌数50 rpmで行った。
（２）leudh遺伝子またはpdh遺伝子の発現が微好気条件下のＬ−バリン生産に及ぼす効果
pTrc99aでOSK株およびOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、それぞれOSK pTrc99a株およびOSKΔldhAΔpflB pTrc99a株を取得した。
【００９４】
また、OSK pTrc99a株、OSK BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB pTrc99a株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB TiLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflB TiPheDH株を、実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下においてleudh遺伝子またはpdh遺伝子を発現させた株は、該遺伝子を発現させていない対照株と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表３）。
【００９５】
【表３】
【００９６】
（３）ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA、pta遺伝子の欠損が微好気条件下におけるＬ−バリン生産に及ぼす効果
＜３−１＞１遺伝子欠損の効果
ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA-pta遺伝子のうち、１遺伝子（但しarkA-ptaは２遺伝子）の欠損がＬ−バリン生産に及ぼす効果を検証した。
【００９７】
OSK BsLeuDH株、OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔadhE BsLeuDH株、およびOSKΔackA-pta BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下においてldhA、pflBまたはackA-pta遺伝子を欠損させた株は、該遺伝子を欠損させていない対照株（OSK BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた（表４）。
【００９８】
【表４】
【００９９】
＜３−２＞２遺伝子欠損の効果
OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpta-ack BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下でldhAおよびpflB遺伝子、ldhAおよびfrdA遺伝子、またはldhA及びackA-pta遺伝子を欠損させた株は、1遺伝子のみを欠損させた対照株（OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
＜３−３＞多重遺伝子欠損の効果
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株を実施例３の（１）に記した方法で培養し、Ｌ−バリン生産を評価した。
【０１０３】
その結果、微好気条件下で、表７および８で示したように、多重遺伝子欠損株において、対照株（OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株）と比べ、培養液中のＬ−バリンの濃度の向上が見られた。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性（以下、ＮＶＤＨ活性という。）が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法。
【請求項２】
微生物が、下記の［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、請求項１記載の製造法。
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
微生物が、Ｌ−バリンの生合成に関与する１つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
嫌気または微好気条件が、培地中の酸化還元電位が−１００mV以下の条件である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１】
ＮＡＤＨを補酵素として利用し、２−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してＬ−バリンを生成する活性（以下、ＮＶＤＨ活性という。）が親株より高く、かつＬ−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、Ｌ−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造法。
【請求項２】
微生物が、下記の［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、請求項１記載の製造法。
［１］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号２、４および６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１、３および５のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＮＶＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
微生物が、Ｌ−バリンの生合成に関与する１つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
嫌気または微好気条件が、培地中の酸化還元電位が−１００mV以下の条件である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。
【公開番号】特開２０１３−６３０３０（Ｐ２０１３−６３０３０Ａ）
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０２８５９（Ｐ２０１１−２０２８５９）
【出願日】平成２３年９月１６日（２０１１．９．１６）
【出願人】（３０８０３２６６６）協和発酵バイオ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１６日（２０１１．９．１６）
【出願人】（３０８０３２６６６）協和発酵バイオ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
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