アミノ酸転移酵素
【課題】 多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が可能なスクリーニング方法およびそれにより得られた組換アミノ酸転移酵素を提供する。
【解決手段】 活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供し、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する。このスクリーニング方法によれば、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が可能となる。前記組換アミノ酸転移酵素は、例えば、アミノペプチダーゼの活性中心セリン残基をシステインに置換することで得られる。この組換アミノ酸転移酵素によれば、例えば、アミノ酸誘導体を基質として、ジペプチドが環化したジケトピペラジンが合成できる。
【解決手段】 活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供し、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する。このスクリーニング方法によれば、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が可能となる。前記組換アミノ酸転移酵素は、例えば、アミノペプチダーゼの活性中心セリン残基をシステインに置換することで得られる。この組換アミノ酸転移酵素によれば、例えば、アミノ酸誘導体を基質として、ジペプチドが環化したジケトピペラジンが合成できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法および組換アミノ酸転移酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な機能を持つジペプチドおよびその誘導体が、食品や医薬品等の原料素材として注目を集めている。このようなジペプチドとしては、例えば、アスパルテーム（aspartame）、環状アルギニル−プロリン（cyclo(LR-DP)）、デヒドロフェニルアヒスチン（dehydrophenylahistin）、バリル−チロシン（LV-LY）およびアラニル−チロシン（LA-LY）が知られている。アスパルテームは、フェニルアラニンのメチルエステルと、アスパラギン酸とがペプチド結合した構造を持つジペプチドのメチルエステルであり、甘味は砂糖の約１８０倍である。環状アルギニル−プロリンは、キチナーゼ（chitinase）の特異的阻害剤であり、抗カビ剤および殺虫剤の用途が期待されている。デヒドロフェニルアヒスチンは、細胞分裂阻害作用を有し、新規抗がん剤としての用途が期待されている。バリル−チロシンは、アンジオテンシンＩ変換酵素活性を阻害する機能を有する。アラニル−チロシンは、水への溶解度が低いチロシンの有力な供給源になる。
【０００３】
ジペプチドの製造方法は、化学合成法と酵素合成法とに大別され、酵素合成法は、温和な反応条件での合成が可能であること、副生成物が少ないこと等の利点を有する。酵素合成法としては、例えば、サーモリシン等のメタロペプチダーゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、アラニンリガーゼ、又は非リボソームペプチド合成酵素を用いる方法等が知られている。このなかで、エステル結合のアミノ分解反応を含む酵素合成法（特許文献１）は、サーモリシン等を用いる酵素合成法と異なり、基質として化学的Ｎ−保護アミノ酸を必要とせず、遊離アミノ酸とアミノアシルメチルエステルとからジペプチドを合成することが可能である。しかしながら、従来の酵素合成法で使用されている酵素の中には、コストが高いものもあり、また、基質特異性に偏りがあるため、例えば、バリル−チロシンやアラニル−チロシン等のジペプチドを実用化レベルで製造できないといった問題があった。この問題に対し、ペプチダーゼファミリー２８に属する熱安定性アミノペプチダーゼを用いた酵素合成法が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０３／０１０３０７号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−３１９０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記特許文献２の方法は、合成されるジペプチドの種類の幅を広げ、例えば、疎水性のアミノ酸を含むジペプチドを合成でき、またジペプチドの構造の制御も可能な方法である。しかも、前記特許文献２の方法は、高収率、高速および簡便にジペプチドを合成可能である。一方、ジペプチドを含むオリゴペプチドに関しては、様々な機能が期待されている。このため、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が可能なスクリーニング方法およびそれにより得られた組換アミノ酸転移酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のスクリーニング方法は、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前記本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニン、アスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者等は、多様な構造のオリゴペプチドを製造するための酵素を開発するために、一連の研究を重ねたところ、酵素の活性中心であるセリン残基を置換するという着想を得た。この着想を基に、アミノペプチダーゼの活性中心を、遺伝子組み換え技術によってシステイン残基等のセリン残基以外のアミノ酸残基に置換したところ、後述するように、直鎖状ジペプチドに加え、環状ジペプチド、トリペプチドおよびテトラペプチド等も合成可能な酵素が得られることを見出し、本発明に至った。本発明では、組換アミノ酸転移酵素を用いるため、酵素を、低コストで、簡便にかつ高収率で得ることが可能であるため、オリゴペプチドの酵素合成法を、実用化（工業化）することも容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図２】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図４】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図６】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３および４における、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性の濃度による変化および経時的変化を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例４における、アミノリシンＳの至適ｐＨを示すグラフである。
【図９】本発明の実施例４における、ＤＭＳＯ存在下でのアミノリシンＳの活性を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例４における、アミノリシンＳ活性の処理温度および高温処理時間による変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例４における、アミノリシンＳの活性とＬＦ濃度またはＬＷ濃度との関係を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例５における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図１３】本発明の実施例５における、アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例６における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図１５】本発明の実施例６における、アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例７における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムおよびＭＳ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の実施例７における、ＭＳ／ＭＳスペクトルから推定されるイオンを示す。
【図１８】参考例における、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性を示すグラフである。
【図１９】本発明の実施例９における、プロリンベンジルエステルを含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２０】本発明の実施例９における、プロリンベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図２１】本発明の実施例９において、各ｐＨにおけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２２】本発明の実施例９において、各酵素量におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２３】本発明の実施例９において、各基質濃度におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２４】本発明の実施例９において、各反応時間におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２５】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２６】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２７】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２８】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体のｌｏｇＰとそれに対応するジペプチドエステルの生成を示すグラフである。
【図２９】本発明の実施例１２における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラム結果を示す。
【図３０】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンアミドを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３１】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンメチルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３２】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンエチルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３３】本発明の実施例１２における、Ｄ−体フェニルアラニンメチルエステルまたはベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３４】本発明の実施例１２における、Ｌ−体またはＤ−体ロイシンベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３５】本発明の実施例１３における、アミノ酸を含む反応液のイオンクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、
活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、
前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法において、前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基は、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つの残基であることが好ましい。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法において、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることが好ましい。
【００１４】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前述のように、本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、
前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素がアミノペプチダーゼであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、後述する反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒することが好ましい。
【００１６】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法について、以下に説明する。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明においては、以下、活性中心がセリン残基である酵素を、「非置換型酵素」といい、前記非置換型酵素の活性中心のセリン残基を他のアミノ酸残基に置換して得られる組換アミノ酸転移酵素を、「置換型アミノ酸転移酵素」または「置換型組換アミノ酸転移酵素」ともいう。なお、本発明において、前記非置換型酵素とは、活性中心のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されていないことを意味し、その他のアミノ酸残基の置換の有無を意味するものではない。また、「活性中心がセリン残基である酵素」とは、例えば、活性中心を形成するアミノ酸残基の少なくとも一つがセリン残基である酵素をいう。
【００１９】
前記アミノ酸転移酵素とは、アミノ酸の転移を触媒する酵素であり、例えば、アシルトランスフェラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、トランスアミノペプチダーゼともいう。
【００２０】
本発明においては、活性中心がセリン残基である所望の酵素について、前記セリン残基を他のアミノ酸残基に置換して、組換アミノ酸転移酵素を提供し、前記組換アミノ酸転移酵素が、他のアミノ酸残基への置換により新規な酵素反応を発揮するか否かを判定することがポイントである。したがって、組換アミノ酸転移酵素の提供にあたって、活性中心がセリン残基である非置換型酵素の種類や、セリン残基を他のアミノ酸残基へ置換する方法は、何ら制限されない。
【００２１】
前記非置換型酵素の由来は、何ら制限されず、例えば、自然界由来の酵素であってもよいし、人工的に構築された酵素であってもよい。本発明においては、このような活性中心がセリン残基である非置換型酵素について、前述のように他のアミノ酸残基への置換を行って置換型組換アミノ酸転移酵素を提供すればよい。前記自然界の由来としては、前述のように、特に制限されず、例えば、細菌等の微生物、ヒト、マウス等の哺乳類を含む動物、昆虫、植物等があげられる。前記細菌としては、例えば、一例として、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１があげられる。この他にも、例えば、ストレプトマイセス・サーモルテウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２６９、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８等があげられる。
【００２２】
本発明において、前記非置換型酵素の種類は、何ら制限されず、活性中心がセリン残基の酵素であればよい。前記非置換型酵素としては、例えば、アミノ酸を遊離する活性を示すアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１群）、アミノ酸転移酵素等があげられる。
【００２３】
本発明において、前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基は、特に制限されないが、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸等があげられ、中でも、好ましくは、アラニン、グリシンまたはシステインであり、より好ましくはシステインである。
【００２４】
前記非置換型酵素のセリン残基を他のアミノ酸残基へ置換する方法としては、何ら制限されず、例えば、遺伝子工学的手法等の従来公知の方法が使用できる。具体例としては、例えば、活性中心がセリン残基である非置換型酵素をコードする核酸について、前記活性中心のセリン残基に対応するコドンを、他のアミノ酸残基に対応するコドンに置換する方法があげられる。このように、活性中心のセリン残基に対応するコドンを他のアミノ酸に対応するコドンに置換した核酸から、タンパク質を発現させることによって、活性中心のセリン残基が他のアミノ酸に置換された組換アミノ酸転移酵素を得ることができる。前記核酸としては、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また、ＰＮＡ等の人工核酸を含んでもよい。
【００２５】
前記セリン以外のアミノ酸に対応するコドンに置換した核酸からのタンパク質の発現方法は、何ら制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、以下に示すような方法があげられる。まず、セリン以外のアミノ酸に対応するコドンに置換した前記核酸を準備し、これをベクターに挿入して発現ベクターを作製する。そして、前記発現ベクターを宿主に導入し、形質転換体を得て、前記形質転換体を培養する。前記培養により前記形質転換体においてタンパク質が発現するため、セリン残基を他のアミノ酸残基に置換した目的のタンパク質を得ることができる。
【００２６】
前記核酸を挿入する前記ベクターの種類は、何ら制限されず、例えば、宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド、放線菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ、人工プラスミド等があげられ、具体例としては、例えば、ｐＩＪ７０２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ３６７、ｐＮＵＴ４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、λｇｔ１０、ｐＴＯＮＡ５ａ、ｐＥＴ２８等があげられる。また、前記ベクターは、例えば、さらに、発現を制御する配列や、形質転換体を選択するための選択マーカーの配列等を有してもよい。前記発現を制御する配列としては、特に制限されないが、例えば、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等があげられる。前記選択マーカー配列としては、特に制限されないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。前記ベクターに前記核酸を挿入する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用でき、例えば、前記核酸を適当な制限酵素で切断した後、前記ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに連結する方法等があげられる。
【００２７】
前記宿主の種類は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。前記宿主としては、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等の細胞があげられる。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等があげられる。前記宿主への前記発現ベクターの導入方法としては、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、Ｌｉ法、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、パーティクル・ガン法等の従来公知の方法を適宜採用できる。
【００２８】
また、前記形質転換体の培養条件は、何ら制限されず、例えば、宿主、発現ベクター等の種類に応じて、温度、時間、ｐＨ、培地等の条件を適宜決定できる。
【００２９】
前記形質転換体の培養により発現した置換型組換アミノ酸転移酵素は、例えば、培養液、培養液の上清、培養液の沈殿物、培養細胞、培養細胞の抽出物等から採取できる。前記置換型組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記培養物から精製してもよい。精製方法は、特に制限されず、例えば、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の従来公知の方法を採用できる。
【００３０】
前記酵素反応の判定工程において、その判定手法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、活性中心がセリン残基である非置換型酵素では基質となり得ない基質を用いて、置換型組換アミノ酸転移酵素を用いた酵素反応を行い、生成物の有無を確認する方法があげられる。この方法によれば、例えば、セリン残基の置換により、置換型組換アミノ酸転移酵素が、非置換型酵素とは異なる基質特異性を有する酵素か否かを判定でき、新たな基質特異性を示す組換アミノ酸転移酵素を提供できる。また、置換型組換アミノ酸転移酵素を用いて酵素反応を行い、前記非置換型酵素の触媒反応による生成物とは異なる生成物の有無を確認する方法があげられる。この方法によれば、例えば、セリン残基の置換により、置換型組換アミノ酸転移酵素が、非置換型酵素とは異なる触媒反応を示す酵素か否かを判定でき、同じ基質であっても、非置換型酵素とは異なる生成物を生成可能な組換アミノ酸転移酵素を提供できる。なお、これらの判定手法は、一例であって、本発明を制限するものではない。
【００３１】
前記判定工程における酵素反応の条件は、何ら制限されず、例えば、非置換型酵素を使用する際と同様の条件に設定することができる。
【００３２】
＜組換アミノ酸転移酵素＞
つぎに、本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前述のように、本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニン、アスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であって、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、後述する反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒することが好ましい。
【００３４】
反応（１）
【化１】
【００３５】
前記反応（１）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）または水酸基（−ＯＨ）であり、Ｒ１は、例えば、下記の通りである。基質である各アミド化合物において、ＸおよびＲ１は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。前記反応において、例えば、一方のアミド化合物を構成するＸが、水酸基（−ＯＨ）の場合は、他方のアミド化合物を構成するＸは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であることが好ましい。前記反応においては、例えば、矢印で示すように、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等のオリゴペプチドを合成することができ、さらに、反応を進めることで、前記ジペプチドから環化したジケトピペラジンを合成することもできる。
【化２】
【００３６】
反応（２）
【化３】
【００３７】
前記反応（２）において、Ｙは、例えば、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはエトキシ基（−ＯＥｔ）であり、Ｒ２は、例えば、以下の通りである。基質である各アミド化合物において、Ｒ２は、同一でもよく、異なってもよい。このように、Ｙがベンゾキシ基であるアミド化合物を使用することにより、環化したジケトピペラジンを効率良く得ることができる。
【化４】
【００３８】
前記反応（２）において、一方のアミド化合物のＲ２をベンジル基（−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、他方のアミド化合物のＲ２をパラヒドロキシベンジル基（−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）とした場合、下記式の化合物が得られる。
【化５】
【００３９】
反応（３）
【化６】
【００４０】
前記反応（３）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ３およびＲ３’は、例えば、下記の通りである。基質である各アミド化合物において、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ同一でもよく、異なってもよいが、Ｒ３は、例えば、フェニル基（−Ｃ６Ｈ５）であることが好ましい。
【化７】
【００４１】
反応（４）
【化８】
【００４２】
前記反応（４）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ４は、例えば、下記の通りである。
【化９】
【００４３】
反応（５）
【化１０】
【００４４】
反応（６）
【化１１】
【００４５】
前記反応（６）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。また、Ｒ５は、例えば、ヒドロキシ基（−ＯＨ）であり、Ｒ６は、例えば、水素原子（−Ｈ）である。
【００４６】
反応（７）
【化１２】
【００４７】
前記反応（７）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ７は、例えば、下記のとおりである。
【化１３】
【００４８】
反応（８）
【化１４】
【００４９】
前記反応（８）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。また、Ｒ８は、例えば、ヒドロキシ基（−ＯＨ）であり、Ｒ９は、例えば、水素原子（−Ｈ）である。
【００５０】
本発明の組換アミノ酸転移酵素において、前記反応（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン残基に置換することで得られる。前記（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＮＢＲＣ１４２７１由来アミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８由来アミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素等があげられる。また、前記反応（４）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記反応（５）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記反応（６）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られ、前記反応（７）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られ、前記反応（８）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記式（６）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、前記反応（４）または（５）を触媒する組換アミノ酸転移酵素と同様のものがあげられ、反応に応じた基質を使用することで、所望の反応を行うことができる。前記反応（４）、（５）および（７）を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ ＮＢＲＣ１４２７０由来プロリルアミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素があげられる。
【００５１】
前記アミノペプチダーゼの由来は、特に制限されないが、例えば、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アシドサーマス属（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）が好ましく、より好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８である。
【００５２】
また、本発明の第１の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、５０２番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、５０２番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５３】
前記（ｂ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００５４】
前記（ｃ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、一般に、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕ ＳＦ、外４名、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９０年１０月５日、第２１５巻、第３号、ｐ．４０３−４１０）。
【００５５】
本発明の第２の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１４４番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１４４番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号１７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５６】
前記（ｅ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００５７】
前記（ｆ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）の意味は、前述と同様である。また、同一性比較のための配列間での適切な整列は、前述と同様にして決定できる。
【００５８】
本発明の第３の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ｇ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、４９１番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｉ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、４９１番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号２２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５９】
前記（ｈ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００６０】
前記（ｉ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）の意味は、前述と同様である。また、同一性比較のための配列間での適切な整列は、前述と同様にして決定できる。
【００６１】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質であることが好ましい。
【００６２】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｘ１）〜（ｘ３）の性質であることを特徴とする。
（ｘ１）分子量が３０〜８０ｋＤａの範囲
（ｘ２）至適ｐＨが５〜８の範囲
（ｘ３）至適温度が３０〜６０℃の範囲
【００６３】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質であることが好ましい。
【００６４】
前記（ｘ１）において、分子量は、好ましくは、３０〜８０ｋＤａであり、特に好ましくは４５〜８０ｋＤａである。前記（ｘ２）において、至適ｐＨは、好ましくは、５〜８であり、特に好ましくは６〜７．７である。前記（ｘ３）において、至適温度は、好ましくは、３０〜６０℃であり、特に好ましくは３０〜５０℃である。
【００６５】
＜組換アミノ酸転移酵素遺伝子＞
本発明の第１のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ａ）〜（Ｄ）は、配列番号８で表される塩基配列において、例えば、１１１２〜１１１４番目がシステインのコドンｔｇｃである。
（Ａ）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸
（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｃ）配列番号８で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｄ）配列番号８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００６６】
前記（Ｂ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
【００６７】
前記（Ｃ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、求めることができる。
【００６８】
前記（Ｄ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００６９】
前記（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００７０】
本発明の第２のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ｅ）〜（Ｈ）は、配列番号１８で表される塩基配列において、例えば、４３０〜４３２番目がシステインのコドンｔｇｃである。
（Ｅ）配列番号１８で表される塩基配列からなる核酸
（Ｆ）配列番号１８で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｇ）配列番号１８で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｈ）配列番号１８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００７１】
前記（Ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述と同様の実験条件である。
【００７２】
前記（Ｇ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、前述と同様にして、求めることができる。
【００７３】
前記（Ｈ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００７４】
前記（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００７５】
本発明の第３のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ｉ）〜（Ｌ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ｉ）〜（Ｌ）は、配列番号２３で表される塩基配列において、例えば、１４７１〜１４７３番目がシステインのコドンｔｇｔである。
（Ｉ）配列番号２３で表される塩基配列からなる核酸
（Ｊ）配列番号２３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｋ）配列番号２３で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｌ）配列番号２３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００７６】
前記（Ｊ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述と同様の実験条件である。
【００７７】
前記（Ｋ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、前述と同様にして、求めることができる。
【００７８】
前記（Ｌ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００７９】
前記（Ｊ）、（Ｋ）および（Ｌ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００８０】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、本発明の組換アミノ酸転移酵素遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、本発明の組換アミノ酸転移酵素遺伝子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、宿主内で複製可能なベクターに前記組換アミノ酸転移酵素遺伝子を連結することにより調製できる。前記遺伝子を連結する前記ベクターとしては、特に制限されず、例えば、前述のものが使用できる。
【００８１】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前記本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の形質転換体は、例えば、宿主に前記発現ベクターを導入することにより調製できる。前記宿主としては、特に制限されず、例えば、前述のものが使用できる。
【００８２】
このような本発明のアミノ酸転移酵素遺伝子、発現ベクターまたは形質転換体によれば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素を容易に製造することができる。
【００８３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
＜実施例１＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）由来トランスアミノペプチダーゼ（以下、「アミノリシンＳ」という。）を、以下のようにして作製した。
【００８５】
［Ｓ９ＡＰ−ＳＴ遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）由来アミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「Ｓ９ＡＰ−ＳＴ」という）をクローニングした。
【００８６】
ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１の菌体より、ホップウッドらの方法（Ｈｏｐｗｏｏｄ, Ｄ．Ａ．Ｂｉｂｂ, Ｍ．Ｊ．Ｃｈａｔｅｒ, Ｋ．Ｆ．Ｋｉｅｓｅｒ, Ｔ．Ｂｒｕｔｏｎ, Ｃ.Ｊ.Ｋｉｅｓｅｒ, Ｈ．Ｍ．Ｌｙｄｉａｔｅ, Ｄ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ, Ｃ．Ｐ．Ｗａｒｄ, Ｊ．Ｍ．Ｓｃｈｒｅｍｐｆ,Ｈ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ; Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ:Ｎｏｒｗｉｃｈ, ＣＴ, １９８５, ｐｐ.７０−８４．）によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、アシルペプチド加水分解酵素と推定される遺伝子の保存領域から、以下に示す配列番号１のセンスプライマー１および配列番号２のアンチセンスプライマー１を合成した。前記アシルペプチド加水分解酵素と推定される遺伝子としては、ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ １８９８およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ６４８８を用いた。なお、下記プライマーの配列において、Ｓは、グアニンまたはシトシンを表す。
【００８７】
センスプライマー１：（配列番号１）
５′−ＧＳＧＴＳＡＴＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＧＧ−３′
アンチセンスプライマー１：（配列番号２）
５′−ＣＣＧＴＧＳＣＣＣＴＣＳＣＣＣＴＣＧＡＡ−３′
【００８８】
前記調製したゲノムＤＮＡ、センスプライマー１およびアンチセンスプライマー１を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片（１．５ｋｂｐ）を、ＰＣＲクローニングキット（商品名「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）」、インビトロジェン社製）を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。また、制限酵素ＰｖｕＩＩを用いた逆ＰＣＲ法により、５′および３′領域の配列情報を得た。そして、開始コドンの上流側にＮｄｅＩ部位を導入するセンスプライマー２（配列番号３）と、停止コドンの下流側にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するアンチセンスプライマー２（配列番号４）とを用いて、増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。なお、下記センスプライマー２の配列において、下線部の３塩基は開始コドンであり、下記アンチセンスプライマー２の配列において、下線部の３塩基は停止コドンである。
【００８９】
センスプライマー２：（配列番号３）
５′−ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣ−３′
アンチセンスプライマー２：（配列番号４）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡ−３′
【００９０】
増幅したＤＮＡ断片（２ｋｂｐ）を、前述のＰＣＲクローニングキットを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。そして、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、前記ＤＮＡ断片を消化し、前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴをコードするＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＴ ２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、Ｓ９ＡＰ−ＳＴアミノペプチダーゼを発現するプラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴを構築した。なお、この発現ベクターは、Ｎ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを含むように設計した。前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴの全塩基配列は、ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ.ｎｉｇ.ａｃ.ｊｐ/）にアクセッション番号ＡＢ４８０２８４として登録されている。
【００９１】
［アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの発現］
つぎに、商品名「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ｓｙｓｔｅｍ １」（ノバジェン社製）を用いて、以下のようにして、前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴアミノペプチダーゼを過剰発現させた。
【００９２】
まず、前記製品付属の使用説明書に従い、製品付属の培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ）５０ｍＬに、前記発現プラスミドを有するＲｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社製）のコロニーを植菌し、３０℃、回転数１８０ｒｐｍの条件下で、１６時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、商品名「Ｅｌｅｓｔｉｎ ＮＰ０３５ＳＰ」（ネパジーン社製）を用いて、１分間隔で、最大出力で合計３０分間、超音波処理した。得られた細胞除去抽出物を、Ｈｉｓ−タグ精製レジン（商品名「Ｔａｌｏｎ（登録商標）Ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ」、クロンテック社製）を用いて、製品付属の使用説明書に従い精製した。精製タンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質であることを確認した。
【００９３】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、以下のようにして、前記アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの変異タンパク質（以下、「アミノリシンＳ」という）を構築した。
【００９４】
まず、下記のセンスプライマー３（配列番号５）およびアンチセンスプライマー３（配列番号６）を用いて、前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴをＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー３の配列は、Ｓ９ＡＰ−ＳＴの１５０５番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、１４８７−１５１６番目の塩基配列に相当し、下線部はＢａｌＩ部位である。また、下記アンチセンスプライマー３の配列は、下線部がＨｉｎｄＩＩＩ部位であり、その３´側に停止コドンＴＣＡを有する。
【００９５】
センスプライマー３：（配列番号５）
５′−ＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴ−３′
アンチセンスプライマー３：（配列番号６）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡ−３′
【００９６】
増幅したＤＮＡ断片（０．５ｋｂｐ）を、前述のＰＣＲクローニングキットを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴのＢａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃを構築し、塩基配列を決定した。前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃを使用し、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社製）を形質転換させた。なお、この発現ベクターは、Ｎ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを含むように設計した。
【００９７】
前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃをプラスミドとして用いたこと以外は、前述と同様にして、アミノリシンＳを過剰発現させ、精製した。前記アミノリシンＳのアミノ酸配列を、配列番号７に示し、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を、配列番号８に示す。前記アミノリシンＳは、配列番号７のアミノ酸配列において５０２番目のシステインは、野生型のセリンから置換されたものである。
【００９８】
＜実施例２＞
［アミノ酸誘導体に対する反応性評価］
基質として、下記表１記載のアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、本発明のアミノリシンＳの前記基質に対する反応性を評価した。下記表１において、Ｏ−Ｍｅは、メトキシ基を表し、Ｏ−Ｂｚｌは、ベンゾキシ基を表し、Ｏ−Ｅｔは、エトキシ基を表す（以下、同様）。また、実施例において、アミノ酸およびアミノ酸誘導体におけるアミノ酸残基を、下記表１のように、省略形または一文字表記で記載することもある。
【００９９】
【表１】
【０１００】
まず、アミノリシンＳ １０μｇを含む０．５ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、前記各アミノ酸誘導体を２０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加え、５０℃で２３時間反応させた。なお、前記緩衝液には、前記反応液の最終容量が１００μＬとなるように、５体積％のＤＭＳＯを添加した。反応終了後、３体積％のギ酸１００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。
【０１０１】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有アセトニトリル、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：１５％溶媒Ｂ
同 ５−３０分後：溶媒Ｂ濃度を１５％から５０％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ３０−３５分後：５０％溶媒Ｂ
同 ３５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を５０％から８０％に変化させる
直線勾配グラジェント
検出条件： ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０１０２】
前記表１記載のアミノ酸誘導体を用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、前記１０のアミノ酸誘導体と、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１０３】
図１のグラフに、前記Ｎｏ．１〜３のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．１、３、２のアミノ酸誘導体の結果である。同図中の（ａ）〜（ｋ）は、検出された各ピークである。同図の上段に示すように、Ｎｏ．１（Ｌ−フェニルアラニンアミド、ＬＦ−ＮＨ２）を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｃ）のピークに示される、３つの生成物が確認された。また、同図の中段に示すように、Ｎｏ．３（エトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ）を基質とする反応の結果、（ｄ）〜（ｇ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。そして、同図の下段に示すように、Ｎｏ．２（メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ）を基質とする反応の結果、（ｈ）〜（ｋ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。
【０１０４】
図２に、図１における前記ピーク（ａ）〜（ｋ）のＭＳ分析結果を示す。
【０１０５】
図２において、グラフ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、図１のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）およびピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ａ）〜（ｃ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ａ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２にＬＦが結合したＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図１のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．１（ＬＦ−ＮＨ２）のＣ末端側にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２およびＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２が生成した。
【０１０６】
図２において、グラフ（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図１のピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）、ピーク（ｆ）およびピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ｄ）〜（ｇ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図１のピーク（ｆ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｇ）の生成物は、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．３（ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ）にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ、および、ジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。なお、以下、ジペプチドが環化したものを、シクロジペプチドともいう。
【０１０７】
図２において、グラフ（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）は、それぞれ、図１のピーク（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ｈ）〜（ｋ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｉ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図１のピーク（ｊ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｋ）の生成物は、ＬＦ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．２（ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０１０８】
図３のグラフに、Ｎｏ．４〜７のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．４、５、６、７のアミノ酸誘導体の結果である。また、同図中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図の上段に示すように、Ｎｏ．４（ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ａ）および（ｂ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。また、同図の２段目に示すように、Ｎｏ．５（ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ）に対する反応の結果、（ｃ）〜（ｅ）のピークに示される、３つの生成物が確認された。そして、同図の３段目に示すように、Ｎｏ．６（ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）に対する反応の結果、（ｆ）のピークに示される、１つの生成物が確認された。さらに、同図の４段目に示すように、Ｎｏ．７（ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）に対する反応の結果、（ｇ）のピークに示される、１つの生成物が確認された。
【０１０９】
図４に、図３における前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のＭＳ分析結果およびＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。
【０１１０】
図４において、グラフ（ａ）は、上段が、図３のピーク（ａ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ａ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。図４において、グラフ（ｂ）は、図３のピーク（ｂ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ａ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図３のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．４（ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−ロイシンが転移したペプチドＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１１】
図４において、グラフ（ｃ）は、上段が、図３のピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｃ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。図４において、グラフ（ｄ）は、図３のピーク（ｄ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、グラフ（ｅ）は、図３のピーク（ｅ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図３のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−ＥｔにＬＬが結合したＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔであり、図３のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−Ｅｔに２分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．５（ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ）にＬ−ロイシンが転移したペプチド ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１２】
図４において、グラフ（ｆ）は、上段が、図３のピーク（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｆ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｆ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．６（ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）にＬ−ロイシンが転移したジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１３】
図４において、グラフ（ｇ）は、上段が、図３のピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｇ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｇ）の生成物は、ＤＬ−ＤＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．７（ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）にＤ−ロイシンが転移したジペプチドが環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）が生成した。
【０１１４】
図５に、Ｎｏ．８〜１０のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．８、１０、９のアミノ酸誘導体の結果である。また、同図中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークを示す。同図の上段に示すように、Ｎｏ．８（ＬＷ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ａ）および（ｂ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。また、同図の中段に示すように、Ｎｏ．１０（ＬＹ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ｃ））のピークに示される、１つの生成物が確認された。そして、同図の下段に示すように、Ｎｏ．９（ＬＭ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ｄ）および（ｅ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。
【０１１５】
図６に、図５における前記ピーク（ａ）〜（ｅ）のＭＳ分析結果を示す。
【０１１６】
図６において、グラフ（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、図５のピーク（ａ）およびピーク（ｂ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ａ）の生成物は、ＬＷ−ＬＷのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＷ−ＬＷ）であり、図５のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＷ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＷが連続して結合したＬＷ−ＬＷ−ＬＷ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．８（ＬＷ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−トリプトファンが転移したペプチド ＬＷ−ＬＷ−ＬＷ−Ｏ−Ｍｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＷ−ＬＷ）が生成した。
【０１１７】
図６において、グラフ（ｃ）は、図５のピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＹ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＹが連続して結合したＬＹ−ＬＹ−ＬＹ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．１０（ＬＹ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−チロシンが転移したＬＹ−ＬＹ−ＬＹ−Ｏ−Ｍｅが生成した。
【０１１８】
図６において、グラフ（ｄ）および（ｅ）は、それぞれ、図５のピーク（ｄ）およびピーク（ｅ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＭ−ＬＭのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＭ−ＬＭ）であり、図５のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＭ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＭが連続して結合したＬＭ−ＬＭ−ＬＭ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．９（ＬＭ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−メチオニンが転移したペプチド ＬＭ−ＬＭ−ＬＭ−Ｏ−Ｍｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＭ−ＬＭ）が生成した。
【０１１９】
＜実施例３＞
［酵素量］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、酵素量によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価においては、前記アミノ酸誘導体に代えて、６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦおよび０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦ−Ｏ−Ｅｔを使用し、アミノリシンＳ量を所定量（０、３．７５、７．５、１５、３０μｇ）とし、反応時間を１時間としたこと以外は、実施例２と同様にして反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。なお、前記分析において、シグマ社製の試薬ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦのリテンション時間との比較から、ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦの検出を確認した。また、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの検出は、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ２９５およびｍ／ｚ ３４２の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから確認した。そして、下記式１を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＦへの変換率を算出した。
【０１２０】
（式１）
変換率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｂ：基質として添加したＬＦ−Ｏ−Ｅｔのモル数
【０１２１】
図７（Ａ）のグラフに、酵素量による活性測定結果を示す。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、アミノリシンＳ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、アミノリシンＳ ３０μｇのとき、基質であるＬＦ−Ｏ−Ｅｔが全て、他のペプチドに転換された。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。最も生成量の多いＬＦ−ＬＦの変換率は、約３０％であった。
【０１２２】
＜実施例４＞
本発明のアミノリシンＳについて、各種要因による酵素活性への影響を評価した。
【０１２３】
［反応時間］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、反応時間によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価においては、アミノリシンＳ量を１０μｇとし、反応時間を所定時間（０、０．５、１、１．５、２、３時間）としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
【０１２４】
図７（Ｂ）のグラフに、反応時間による活性測定結果を示す。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、時間依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、反応時間が１．５時間を過ぎると、基質であるＬＦ−Ｏ−Ｅｔが全て、他のペプチドに転換された。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１２５】
［ｐＨ］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、ｐＨによるアミノ酸結合活性をへの影響を評価した。すなわち、まず、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＷ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦ−ＮＨ２および１ｖ／ｖ％ ＤＭＳＯを添加した緩衝液 １００μＬに、アミノリシンＳ １０μｇを加え、３０℃で１時間反応させた。なお、前記緩衝液としては、所定ｐＨ（ｐＨ６．６、７．０、７．２、７．５および７．７）に調整した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液、または所定ｐＨ（ｐＨ７．７、７．９、８．４、８．８および９．３）に調整した０．５ｍｏｌ／Ｌのホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた。反応後、０．０５ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含む、２０ｖ／ｖ％のアセトニトリル １００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離した。上層の２０μＬを回収し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、また、ＬＦ−ＬＷの検出は、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ３３４の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから確認した。そして、ＬＦ−ＬＷの生成量を、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）における該当ピークのピーク面積から算出し、前記ピーク面積から、アミノ酸結合活性を評価した。
【０１２６】
図８のグラフに、ｐＨによる活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ｐＨであり、縦軸は、前記ＬＦ−ＬＷの生成量を示す。また、同図において、白丸（○）のスポットは、リン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．６〜７．７の測定結果であり、白三角（△）のスポットは、ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ７．７〜９．３の測定結果である。同図に示すように、アミノリシンＳは、ｐＨ６．６〜８．８で酵素活性が確認され、至適ｐＨは、７．７であった。
【０１２７】
［ＤＭＳＯ］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、ＤＭＳＯによるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価において、前記ＬＦの濃度を４０ｍｍｏｌ／Ｌとし、アミノリシンＳ量を１０μｇとし、ＤＭＳＯを所定濃度（５、１０、１５、２０ｖ／ｖ％）としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。そして、得られた反応液を、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦの検出は、実施例３と同様にして行った。また、下記式２を用いて、ＬＦ−ＬＦの生成量から、比活性（％）を算出した。
【０１２８】
（式２）
比活性（％）＝（Ｃ／Ｄ）×１００
Ｃ：各濃度のＤＭＳＯ添加区における生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｄ：ＤＭＳＯ添加濃度５％における生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１２９】
図９のグラフに、ＤＭＳＯによる活性測定結果を示す。同図において、横軸は、反応液中のＤＭＳＯ濃度（ｖ／ｖ％）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図に示すように、ＤＭＳＯ ５体積％添加時と比較して、ＤＭＳＯ １０体積％添加時は約９５％、ＤＭＳＯ １５体積％添加時は約９０％、ＤＭＳＯ ２０体積％添加時は約６０％の比活性を有した。すなわち、本発明のアミノリシンＳは、高濃度のＤＭＳＯ条件下も、高い酵素活性を示した。
【０１３０】
［温度］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、処理温度によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。すなわち、まず、アミノリシンＳ ５０μｇを添加した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを、所定温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０℃）で１時間処理し、処理液を調製した。そして、前記リン酸ナトリウム緩衝液９０μＬに、アミノリシンＳに代えて前記処理液１０μＬを添加したこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。得られた反応液１０μＬを回収し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦの検出は、実施例３と同様にして行った。また、下記式３を用いて、ＬＦ−ＬＦの生成量から、比活性（％）を算出した。
【０１３１】
（式３）
比活性（％）＝（Ｅ／Ｆ）×１００
Ｅ：各温度で処理した酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｆ：未加熱処理の酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１３２】
図１０（Ａ）のグラフに、耐熱性の測定結果を示す。同図において、横軸は、処理温度（℃）であり、縦軸は、前記比活性（％）である。前述のように、各温度で１時間処理した後の酵素を用いて、その残存活性を測定した。同図に示すように、アミノリシンＳは、２０〜５０℃の処理間で酵素活性が９０％以上保持され、６０℃処理においても６０％以上の酵素活性が保持された。この結果から、本発明のアミノリシンＳは、高い耐熱性を有することが明らかとなった。
【０１３３】
［高温処理時間］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、高温処理時間によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。前記アミノリシンＳ ５０μｇを添加した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを、５０℃で所定時間（０、１、２、３、４、５時間）処理したこと以外は、前記処理温度によるアミノ酸結合活性への影響の評価と同様にして、処理液を反応させ、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。そして、ＬＦ−ＬＦの生成量から、下記式４を用いて比活性（％）を算出した。
【０１３４】
（式４）
比活性（％）＝（Ｇ／Ｈ）×１００
Ｇ：各温度で処理した酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｈ：未加熱処理の酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１３５】
図１０（Ｂ）のグラフに、高温処理時間による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、処理時間（時間）であり、縦軸は、前記比活性（％）である。同図に示すように、アミノリシンＳは、５０℃で５時間処理後も、４０％以上の酵素活性が確認された。
【０１３６】
［アミノ酸濃度］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、アミノ酸の濃度によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価において、前記アミノ酸誘導体に代えて、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと、ＬＦまたはＬＷとを使用し、反応時間を１時間としたこと以外は、実施例２と同様にして反応を行い、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。反応液における濃度は、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＦまたはＬＷを所定濃度（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔは、実施例３と同様にして検出した。ＬＦ−ＬＷは、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ３３４の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから検出した。また、各ペプチドの生成量は、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）における該当ピークのピーク面積から算出した。そして、前述の式１を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＦへの変換率を算出した。また、下記式５を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＷへの変換率を算出した。
【０１３７】
（式５）
変換率（％）＝（Ｉ／Ｊ）×１００
Ｉ：生成ＬＦ−ＬＷのモル数
Ｊ：基質として添加したＬＦ−Ｏ−Ｅｔのモル数
【０１３８】
図１１（Ａ）のグラフに、ＬＦ濃度による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ＬＦの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、左端の縦軸は、各ペプチドの生成量を示すピーク面積であり、右端の縦軸は、前記変換率（％）である。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、ＬＦ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、ＬＦ濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌのとき、ＬＦ−ＬＦの生成量が最も高かった。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１３９】
図１１（Ｂ）のグラフに、ＬＷ濃度による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ＬＷの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、左端の縦軸は、各ペプチドの生成量を示すピーク面積であり、右端の縦軸は、前記変換率（％）である。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＷであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、ＬＷ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＷ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、ＬＷ濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌのとき、ＬＦ−ＬＷの生成量が最も高かった。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＷ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１４０】
＜実施例５＞
［遊離アミノ酸のアシル受容体評価］
アシル受容体として、下記表２記載の遊離アミノ酸を用い、以下のようにして、アミノリシンＳによるアミノ酸結合反応を行い、生成物を分析した。前記ＬＦに代えて、６０ｍｍｏｌ／Ｌの前記遊離アミノ酸を用い、アミノリシンＳを１０μｇとし、反応時間を１５時間としたこと以外は、実施例３と同様にして、前記遊離アミノ酸とＬＦ−Ｏ−Ｅｔとを反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行い、各ペプチドを検出した。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
前記表２記載の、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−アリルグリシンおよび（Ｒ）−α−プロパルギルグリシンについて、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１４３】
図１２に、前述の７つの化合物の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−アリルグリシン、（Ｒ）−α−プロパルギルグリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンの結果である。分析の結果、同図において、ピーク（ａ）〜（ｇ）は、ジペプチドであり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であった。
【０１４４】
図１３に、図１２における前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のＭＳ分析結果を示す。図１３において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図１２のピーク（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。グラフ（ａ）〜（ｇ）中の構造化学式は、各ピークのジペプチドである。
【０１４５】
＜実施例６＞
［ベンジルエステルアミノ酸誘導体の評価］
アミノ酸誘導体として、下記表３のベンジルエステルアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、アミノリシンＳによるアミノ酸結合反応を行い、生成物を分析した。前記ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの濃度を２．５ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記ＬＦに代えて、２．５ｍｍｏｌ／Ｌの下記ベンジルエステルアミノ酸誘導体を用い、アミノリシンＳを１０μｇとし、前記ＤＭＳＯ濃度を１ｖ／ｖ％とし、反応時間を１５時間としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。反応後、ＤＭＳＯ ２００μＬを加えて反応を停止させ、上層の１０μＬを回収したこと以外は、実施例３と同様にして、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
前記表３記載の、アミノ酸部分が、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン、Ｄ−バリンおよびＤ−フェニルアラニンのベンジルエステルアミノ酸誘導体について、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１４８】
図１４に、前述の６つの化合物の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、縦軸は、測定波長２１０ｎｍにおける相対強度であり、上から順に、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＶ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＦ−Ｏ−Ｂｚｌの結果である。分析の結果、同図において、ピーク（ａ）〜（ｆ）は、一方のペプチドのみがＬＦであるシクロジペプチドであり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であった。
【０１４９】
図１５に、図１４のピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳ分析結果を示す。図１５において、グラフ（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、図１４のピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、ピーク（ａ）は、ＬＦとＬＹのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＹ）であり、ピーク（ｂ）は、ＬＦとＤＹのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＹ）であり、ピーク（ｃ）は、ＬＦとＬＬのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＬ）であり、ピーク（ｄ）は、ＬＦとＤＬのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＬ）であり、ピーク（ｅ）は、ＬＦとＤＶのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＶ）であり、ピーク（ｆ）は、ＬＦとＤＦのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＦ）であった。このように、アミノリシンＳによる、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと、Ｌ−アミノ酸型またはＤ−アミノ酸型のベンジルエステル誘導体との結合反応が、確認された。
【０１５０】
＜実施例７＞
［生成したシクロジペプチドの分析］
実施例６において、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと前記ＬＹ−Ｏ−ＢｚｌまたはＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌとの反応から得られた生成物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０１５１】
まず、図１６（Ａ）のグラフに、前記ベンジルエステルアミノ酸誘導体として、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌを使用した反応液、および、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌの反応液のトータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、測定波長２１０ｎｍにおける相対強度である。また、同図において、上段のチャートが、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌの結果であり、下段のチャートが、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌの結果である。なお、同図において、線Ｘは、ＬＹ−Ｏ−ＢｚｌまたはＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌを用いた結果であり、線Ｙは、アミノリシンＳを添加していないコントロールの結果である。同図に示すように、前記分析の結果、ピーク（ａ）および（ｂ）の生成物が確認された。そして、ＭＳ分析により、前記ピーク（ａ）は、シクロ（ＬＦ−ＬＹ）であり、前記ピーク（ｂ）は、シクロ（ＬＦ−ＤＹ）であり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であることが確認された。
【０１５２】
つぎに、図１６（Ｂ）のグラフに、図１６（Ａ）のピーク（ａ）およびピーク（ｂ）のＭＳ/ＭＳスペクトルプロファイルを、それぞれ示す。同図において、上段のチャートが、図１６（Ａ）のピーク（ａ）の結果であり、下段のチャートが、図１６（Ａ）のピーク（ｂ）の結果である。図１６（Ｂ）の上段に示すように、ＭＳ／ＭＳ分析により、図１６（Ａ）のピーク（ａ）は、さらに、ピーク（ａ）〜（ｇ）に分離され、図１６（Ｂ）の下段に示すように、図１６（Ａ）のピーク（ｂ）は、さらに、前記上段と同じピーク（ａ）〜（ｇ）に分離された。図１６（Ｂ）において、ピーク（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、２８３．１、２６５．９、２３７．８であり、ジケトピペラジン骨格に特徴的なイオンピークであり、ピーク（ｄ）および（ｆ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、２０５．１、１２０．０であり、トリプロファンに特徴的なイオンピークであり、ピーク（ｅ）および（ｇ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、１３６．０、１０６．８であり、チロシンに特徴的なイオンピークであった。
【０１５３】
図１７に、前記ＭＳ／ＭＳスペクトルから推定される、図１６（Ｂ）の前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のイオンを示す。
【０１５４】
＜参考例＞
［アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性評価］
実施例１で精製したアミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの酵素活性を、下記表４のパラニトロアニリド誘導体を基質として使用し、以下のようにして測定した。まず、前記パラニトロアニリド誘導体を含む５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、前記アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴ １．０μｇを加え、３７℃で、５分間反応させた。分光光度計（Ｕ２８００、日立製作所製）を用い、４０５ｎｍの測定波長で、前記反応液の吸光度を連続的に５分間測定した。下記式６を用いて、比活性（％）を算出した。
【０１５５】
（式６）
比活性（％）＝（Ｋ／Ｌ）×１００
Ｋ：各基質を添加した系における遊離パラニトロアニリドのモル数
Ｌ：Ａｌａ−ｐＮＡを基質とした系における遊離パラニトロアニリドのモル数
【０１５６】
【表４】
【０１５７】
図１８のグラフに、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性測定結果を示す。同図において、縦軸は、比活性（％）であり、横軸は、各種基質である。なお、前記横軸には、各種基質のアミノ酸部分の省略形のみ表記している。同図に示すように、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴは、フェニルアラニン、アラニン、プロリン、グリシン、アルギニン、メチオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リジンまたはアスパラギンをジペプチドのＮ末端から遊離させ、特に、フェニルアラニン、アラニンおよびプロリンに対し、高い酵素活性を有した。このように、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴは、幅広いアミノ酸に対するアミノペプチダーゼ活性が確認された。また、いずれの基質を用いた場合にも、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴによるアミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０１５８】
＜実施例８＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０由来アミノ酸転移酵素（以下、「ｓｃＰＡＰ１４２７０」という。）を、以下のようにして作製した。
【０１５９】
［ｐａｐ１４２７０遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）由来プロリルアミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「ｐａｐ１４２７０遺伝子」という）をクローニングした。
【０１６０】
ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０の菌体より、前記ホップウッドらの方法によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、プロリルアミノペプチダーゼと推定される遺伝子の保存領域から、以下に示す配列番号９のセンスプライマー４および配列番号１０のアンチセンスプライマー４を合成した。前記プロリルアミノペプチダーゼと推定される遺伝子としては、前述のストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ ３１４４、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ５１２２およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のＳＧＲ ２４０７を用いた。なお、下記プライマーの配列において、Ｗは、アデニンまたはチミンを表し、Ｓは、グアニンまたはシトシンを表す。
【０１６１】
センスプライマー４：（配列番号９）
５′−ＣＡＧＷＳＳＴＴＣＧＧＳＧＧＳＴＴＣＴＧＣ−３′
アンチセンスプライマー４：（配列番号１０）
５′−ＡＣＧＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡ−３′
【０１６２】
下記組成のＰＣＲ反応液についてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させた。なお、下記センスプライマーとしては、前記センスプライマー４を用い、下記アンチセンスプライマーとしては、前記アンチセンスプライマー４を用いた。前記ＰＣＲは、９４℃で１分処理後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で９０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で５分間処理して行った。
【０１６３】
（ＰＣＲ反応液）
０．１μｇ／Ｌ ゲノムＤＮＡ
１０μｍｏｌ／Ｌ センスプライマー
１０μｍｏｌ／Ｌ アンチセンスプライマー
０．０４２Ｕ／μＬ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（タカラバイオ社製）
ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（タカラバイオ社製）
【０１６４】
増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＣｐｏｌＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を用いて抽出した。前記ゲノムＤＮＡおよびプライマーに代えて、この抽出したＤＮＡ、下記センスプライマー５およびアンチセンスプライマー５を用いた以外は、前述と同様にしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片（約２ｋｂｐ）を、下記センスプライマー５およびアンチセンスプライマー５を用いてシークエンスし、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の塩基配列を決定した。なお、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の全塩基配列は、ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ.ｎｉｇ.ａｃ.ｊｐ/）にアクセッション番号ＡＢ５１９６４５として登録されている。
【０１６５】
センスプライマー５：（配列番号１１）
５′−ＡＡＣＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣ−３′
アンチセンスプライマー５：（配列番号１２）
５′−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧＡＣＡ−３′
【０１６６】
前記ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびプライマーに代えて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、下記センスプライマー６および下記アンチセンスプライマー６を用いた以外は前述と同様にして、ＰＣＲを行い、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。なお、前記センスプライマー６は、ＮｄｅｌＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ：下線部の塩基は開始コドンである）を含み、前記アンチセンスプライマー６は、停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトを含んだ。ＰＣＲクローニングキット（商品名「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）」、インビトロジェン社製）を用いて、得られたＤＮＡ断片をクローニングおよびシークエンスし、塩基配列を決定した。そして、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、前記ＤＮＡ断片を消化し、前記ＰＡＰ１４２７０をコードするＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＴ ２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、前記ＰＡＰ１４２７０を発現する発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０を得た。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅＸｃｅｌｌ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０を、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ−２（ＤＥ３）（メルク社製）に導入し、形質転換体を得た。
【０１６７】
センスプライマー６：（配列番号１３）
５′−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＧ−３′
アンチセンスプライマー６：（配列番号１４）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧ−３′
【０１６８】
［ＰＡＰ１４２７０の発現］
つぎに、以下のようにして、前記ＰＡＰ１４２７０を過剰発現させた。
【０１６９】
まず、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（メルク社製）を用いて、製品付属の培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ）５０ｍＬに、前記形質転換体を植菌し、２５℃、回転数１８０ｒｐｍの条件下で、４８時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、Ｅｌｅｓｔｉｎ ＮＰ０３５ＳＰ（ネパジーン社製）を用いて、５分間隔で１分間欠し、合計４５分間、最大出力で超音波処理した。得られた無細胞抽出物（細胞除去抽出物）を、コバルトアフィニティ製レジン（Ｔａｌｏｎ（登録商標）、クロンテック社製）を用いて、製品付属の使用説明書に従い精製した。精製タンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質であることを確認した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、前記タンパク質の濃度を測定した。
【０１７０】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、以下のようにして、前記ＰＡＰ１４２７０の変異タンパク質（以下、「ｓｃＰＡＰ１４２７０」という）を構築した。
【０１７１】
まず、前記ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびプライマーに代えて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、下記センスプライマー７および下記アンチセンスプライマー７を用いた以外は前述と同様にして、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０をＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー７の配列は、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の全塩基配列における４３０番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、４２４−４４４番目の塩基配列に相当する。また、前記ＰＣＲは、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒および６８℃で７分を１サイクルとして３０サイクル繰り返して行った。
【０１７２】
センスプライマー７：（配列番号１５）
５′−ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣ−３′
アンチセンスプライマー７：（配列番号１６）
５′−ＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＣＣ−３′
【０１７３】
増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＤｐｎＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を用いて抽出した。エタノール沈殿後、取扱説明書に従って、得られた沈殿物をＪＭ１０９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ、東洋紡社製）にトランスフェクトした。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅＸｃｅｌｌ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、抽出プラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＥｘｔｒａｃｔＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）をＲｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ−２（ＤＥ３）（メルク社製）に導入し、変異ＰＡＰ１４２７０（ｓｃＰＡＰ１４２７０）の発現プラスミドｐＥＴ２８−ｓｃＰＡＰ１４２７０を得た。
【０１７４】
前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ｓｃＰＡＰ１４２７０を用いた以外は、前記ＰＡＰ１４２７０と同様にして、形質転換体を作製し、ｓｃＰＡＰ１４２７０を過剰発現させて、精製した。精製したタンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質（ｓｃＰＡＰ１４２７０）であることを確認した。前記ｓｃＰＡＰ１４２７０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は、約４５ｋＤａであった。前記ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸配列を、配列番号１７に示し、前記アミノ酸配列をコードするｓｃＰＡＰ１４２７０遺伝子の塩基配列を、配列番号１８に示す。配列番号１７に示すアミノ酸配列において、１４４番目のシステインは、野生型のセリンから置換されている。配列番号１８に示す前記ｓｃＰＡＰ１４２７０遺伝子の塩基配列において、４３０番目のチミンは、野生型のアデニンから置換されている。
【０１７５】
＜実施例９＞
［プロリンペプチド生成測定］
本例では、プロリンベンジルエステル（Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ）を基質として用い、以下のようにして、実施例８のｓｃＰＡＰ１４２７０によるペプチド生成を測定した。
【０１７６】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）５０μＬに、ｓｃＰＡＰ１４２７０ ８．７μｇを含む酵素液４０μＬ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ プロリンベンジルエステル（バッケムＡＧ社製）５μＬおよびＤＭＳＯ ５μＬを加え、３７℃、９００ｒｐｍで３時間反応させた。反応終了後、メタノール２００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離（１００００ｒｐｍ、約１１０００×ｇ）した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＬＳ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＬＳ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。そして、各ペプチドの生成量を、ＭＳ分析により得られる、指定された分子量のイオン強度が示す面積から算出した。
【０１７７】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有メタノール、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：５％溶媒Ｂ
同 ５−３０分後：溶媒Ｂ濃度を５％から５０％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ３０−３５分後：５０％溶媒Ｂ
同 ３５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を５０％から８０％に変化させる
直線勾配グラジェント
検出条件：ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０１７８】
プロリンベンジルエステルを用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、プロリンベンジルエステルと、ｓｃＰＡＰ１４２７０との反応による生成物が確認された。
【０１７９】
図１９のグラフに、プロリンベンジルエステルを含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、プロリンベンジルエステル（Ｐ−ＯＢｚｌ）を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。
【０１８０】
図２０に、図１９における前記ピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳ分析結果を示す。以下、プロリンを「Ｐ」で示す。
【０１８１】
図２０において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は、それぞれ、図１９のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｃ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）およびピーク（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２０（ａ）〜（ｆ）に示すＭＳ分析の結果から、図１９のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図１９のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌであり、図１９のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ２−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ３−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ４−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ５−ＯＢｚｌ」ということもある）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｐ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、５種類のペプチドＰ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。なお、図２０の各グラフ中の［Ｍ＋Ｈ］＋の値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いたｍ／ｚ値である。また、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＰＡＰ１４２７０を用いた場合には、アミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０１８２】
［ｐＨ］
ｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、ｐＨによるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、基質として、プロリンベンジルエステルを用い、前記緩衝液として、各所定ｐＨに調整したクエン酸−リン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ３．５−１１．５）を用いた以外は、前記プロリンペプチド生成測定と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８３】
図２１のグラフに、各ｐＨにおけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、ｐＨであり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、シクロ（Ｐ−Ｐ）はｐＨ８．５、Ｐ２−ＯＢｚｌはｐＨ６．５、Ｐ３−ＯＢｚｌはｐＨ８．５、Ｐ４−ＯＢｚｌはｐＨ８．５、Ｐ５−ＯＢｚｌはｐＨ９．５において、それぞれ最も生成量が高かった。このように、ｐＨにより、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８４】
［酵素量］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、酵素量によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、前記酵素液中のｓｃＰＡＰ１４２７０量を、所定濃度（０．５５、１．０９、２．１９、４．３８、８．７５、１７．５および３５μｇ）とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８５】
図２２のグラフに、各酵素量におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、酵素量（μｇ）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、０．５５〜８．７５μｇの酵素量では、シクロ（Ｐ−Ｐ）、Ｐ３−ＯＢｚｌ、Ｐ４−ＯＢｚｌの順に生成量が多く、Ｐ５−ＯＢｚｌは、ほとんど生成されなかった。これに対して、１７．５〜３５μｇの酵素量では、Ｐ３−ＯＢｚｌおよびＰ４−ＯＢｚｌに比べて、シクロ（Ｐ−Ｐ）およびＰ５−ＯＢｚｌの生成量が多かった。このように、反応系中の酵素量により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８６】
［基質濃度］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、基質濃度によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、プロリンベンジルエステル量を、所定濃度（５、１０、２５、５０および１００ｍｍｏｌ／Ｌ）とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８７】
図２３のグラフに、各基質濃度におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、６．２５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの基質濃度では、シクロ（Ｐ−Ｐ）の生成量が最も多く、Ｐ３−ＯＢｚｌおよびＰ４−ＯＢｚｌの生成量が次に多かった。これに対して、Ｐ２−ＯＢｚｌおよびＰ５−ＯＢｚｌは、生成量が少なかった。このように、反応系中の基質濃度により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８８】
［反応時間］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、反応時間によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、所定（０．５、１、１．５、３、６、１２および２４時間）の反応時間とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８９】
図２４のグラフに、各反応時間におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、反応時間（時間）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、白丸（○）は、Ｐ−ＯＢｚｌの結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、０．５〜３時間においては、Ｐ２−ＯＢｚｌ、Ｐ４−ＯＢｚｌおよびＰ５−ＯＢｚｌに比べて、シクロ（Ｐ−Ｐ）およびＰ３−ＯＢｚｌの生成量が高かった。これに対して、６〜２４時間においては、シクロ（Ｐ−Ｐ）の生成量が高く、その他のペプチドは減少した。このように、反応時間により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１９０】
＜実施例１０＞
［へテロオリゴペプチド生成測定］
本例では、アシル供与体として、プロリンベンジルエステル（Ｐ−ＯＢｚｌ）を用い、アシル受容体として、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、実施例８のｓｃＰＡＰ１４２７０によるペプチド生成を測定した。なお、前記アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、アルギニン、ヒスチジン、バリン、ヒドロキシプロリン、トレオニン、グリシン、リシン、アラニン、システイン、プロリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを用いた。また、前記アミノ酸誘導体としては、アミノ酸ベンジルエステル、アミノ酸メチルエステルおよびアミノ酸エチルエステルを用いた。本測定では、前記ＤＭＳＯに代えて、前記アシル受容体 ５μＬを所定濃度で添加して反応させた以外は、実施例８と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１９１】
図２５〜２７のグラフに、前記アシル受容体のうち、下記表５記載のアミノ酸誘導体を含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。図２５〜２７のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。なお、図２５〜２７の各グラフ中のｍ／ｚ値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いた［Ｍ＋Ｈ］＋の値である。
【０１９２】
【表５】
【０１９３】
図２５（Ａ）中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トリプトファンベンジルエステル（Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ、Ｗ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｇ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＹのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｗ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｗ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ａ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｗ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｗ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｗ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｗ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｗ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９４】
図２５（Ｂ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トリプトファンメチルエステル（Ｔｒｐ−ＯＭｅ、Ｗ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｗ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｗ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｗ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｗ−ＯＭｅと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９５】
図２５（Ｃ）中の（ａ）〜（ｈ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、フェニルアラニンエチルエステル（Ｐｈｅ−ＯＥｔ、Ｆ−ＯＥｔ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｈ）のピークに示される、８つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｆ−ＯＥｔであり、図２５（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｆ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｆ−ＯＥｔにＰが結合したＰ−Ｆ−ＯＥｔ（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｈ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｆ−ＯＥｔのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｆ−ＯＥｔおよびシクロ（Ｐ−Ｆ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９６】
図２５（Ｄ）中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、チロシンベンジルエステル（Ｔｙｒ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｇ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＹのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｙ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｙ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｙ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｙ−ＯＢｚｌ（Ｐ−Ｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｙ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｙ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｙ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９７】
図２５（Ｅ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、チロシンメチルエステル（Ｔｙｒ−ＯＭｅ、Ｙ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｅ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｙ−ＯＭｅであり、図２５（Ｅ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｙ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｙ−ＯＭｅ（Ｐ−Ｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｙ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｙ−ＯＭｅと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９８】
図２５（Ｆ）中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、イソロイシンベンジルエステル（Ｉｌｅ−ＯＢｚｌ、Ｉ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｅ）のピークに示される、５つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｆ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｉ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ｆ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｉ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｉ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｉ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｗ−ＯＢｚｌと、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９９】
図２６（Ａ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、ロイシンベンジルエステル（Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｌ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｌ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｌ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｌ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｌ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｌ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２００】
図２６（Ｂ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、ロイシンメチルエステル（Ｌｅｕ−ＯＭｅ、Ｌ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｌ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｌ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｌ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｌ−ＯＭｅおよびシクロ（Ｐ−Ｌ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０１】
図２６（Ｃ）中の（ａ）〜（ｄ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、メチオニンメチルエステル（Ｍｅｔ−ＯＭｅ、Ｍ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｄ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｍ−ＯＭｅであり、図２６（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｍ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｍ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＭｅ）であり、図２６（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｍ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｍ−ＯＭｅと、２種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０２】
図２６（Ｄ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、アラニンベンジルエステル（Ａｌａ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＡのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ａ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ａ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ａ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ａ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ａ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ａ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ａ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０３】
図２６（Ｅ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、リシンベンジルエステル（Ｌｙｓ−ＯＢｚｌ、Ｋ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｅ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｋ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｅ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｋ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｋ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｋ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｌ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０４】
図２６（Ｆ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、グリシンベンジルエステル（Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ、Ｇ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｆ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＧのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｇ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｇ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｆ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｇ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｇ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｇ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｇ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｇ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０５】
図２７（Ａ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トレオニンベンジルエステル（Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ、Ｔ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｔ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｔ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｔ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｔ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｔ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０６】
図２７（Ｂ）中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、バリンベンジルエステル（Ｖａｌ−ＯＢｚｌ、Ｖ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｅ）のピークに示される、５つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｖ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｖ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｖ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｖ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｖ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０７】
図２７（Ｃ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、セリンベンジルエステル（Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ、Ｓ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｓ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｓ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｓ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｓ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｓ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０８】
図２７（Ｄ）中の（ａ）〜（ｈ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、フェニルアラニンメチルエステル（Ｐｈｅ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｈ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、フェニルアラニン（Ｆ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｆ−ＯＭｅであり、図２７（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｆ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｆ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｆ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｈ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｆ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｆ−ＯＭｅおよびシクロ（Ｐ―Ｆ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０９】
図２８に、前記各アシル受容体のｌｏｇＰ値と生成したジペプチドエステルとの関係を示す。同図において、横軸は、前記各アシル受容体のアミノ酸部分の番号であり、縦軸は、ｌｏｇＰである。なお、前記アミノ酸部分の番号は、同図中に示すアミノ酸の番号に対応する。また、同図において、白丸（○）のプロットは、アミノ酸ベンジルエステルの結果であり、白四角（□）のプロットは、アミノ酸メチルエステルの結果であり、白三角（△）のプロットは、アミノ酸エチルエステルの結果であり、白菱形（◇）のプロットは、遊離アミノ酸の結果である。なお、ヘテロプロリンペプチドが生成された誘導体の結果は、前記プロットの色を白から黒に変えている。なお、前記へテロプロリンペプチドは、アシル受容体にプロリンが結合したペプチド（Ｐ−Ｘ−ＯＹ、Ｘ＝アミノ酸、Ｙ＝Ｂｚｌ、ＭｅまたはＥｔ）である。また、同図中の文字「ｃ」は、シクロペプチドの生成を示し、アスタリスクは、反応液中のプロリンベンジルエステル濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌであることを示す。
【０２１０】
図２８に示すように、前記アシル受容体として、Ｓ−ＯＢｚｌ、Ｖ−ＯＢｚｌ、Ｔ−ＯＢｚｌ、Ｇ−ＯＢｚｌ、Ｋ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ、Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｍ−ＯＭｅ、Ｌ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＭｅ、Ｉ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＥｔ、Ｗ−ＯＢｚｌおよびＷ−ＯＭｅを用いた場合には、前記ヘテロプロリンペプチドが生成した。このうち、Ｇ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ、Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＥｔおよびＷ−ＯＢｚｌを用いた場合には、シクロペプチドが生成した。このように、アシル受容体の種類により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。なお、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＰＡＰ１４２７０は、いずれのアシル受容体を用いた場合にも、アミノ酸転移反応を示さなかった。
【０２１１】
＜実施例１１＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８由来アミノペプチダーゼ（以下、「アミノリシンＡ」という。）を、以下のようにして作製した。
【０２１２】
［Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来アミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子」という）をクローニングした。
【０２１３】
アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８の菌体より、前記ホップウッドらの方法によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、アミノペプチダーゼと推定される遺伝子の保存領域から、下記センスプライマー８およびアンチセンスプライマー８を合成した。前記アミノペプチダーゼと推定される遺伝子としては、ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ ３１４４、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ５１２２およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のＳＧＲ ２４０７を用いた。
【０２１４】
センスプライマー８：（配列番号１９）
５′−ＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＣＴＣＣＧＴＡ−３′
アンチセンスプライマー８：（配列番号２０）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧ−３′
【０２１５】
前記ＡＴＣＣ４３０６８のゲノムＤＮＡ、前記センスプライマー８およびアンチセンスプライマー８を用いた以外は、実施例８と同様にして、ＰＣＲを行い、クローニングおよびシークエンスし、前記Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を用いて、実施例８と同様にして、発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ９−ＡＣＡＰを作製し、形質転換体を得た。そして、前記形質転換体を用いた以外は、実施例８と同様にして、前記Ｓ９−ＡＣＡＰを過剰発現させた。なお、前記Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子の全塩基配列および前記Ｓ９−ＡＣＡＰのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪデータベースのＡ．Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ １１Ｂ ゲノムプロジェクトのローカスタグＡｃｅｌ＿１４８９（http://gib.genes.nig.ac.jp/single/main.php?spid=Acel_11B）に開示されている。
【０２１６】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、下記センスプライマー９を用いた以外は、実施例８と同様にして、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ９−ＡＣＡＰをＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー９の配列は、前記Ｓ９−ＡＣＡＰの全塩基配列における１４７１番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、１４５６−１４８５番目の塩基配列に相当する。得られたＤＮＡ断片を用いた以外は、実施例８と同様にして、発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ４９１Ｃを作製した。
【０２１７】
センスプライマー９：（配列番号２１）
５′−ＧＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧ−３′
【０２１８】
前記発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ４９１Ｃを用いた以外は、実施例８と同様にして、アミノリシンＡを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質（アミノリシンＡ）であることを確認した。前記アミノリシンＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は、約７０ｋＤａであった。前記アミノリシンＡのアミノ酸配列を、配列番号２２に示し、前記アミノ酸配列をコードするアミノリシンＡ遺伝子の塩基配列を、配列番号２３に示す。配列番号２２に示すアミノ酸配列において、４９１番目のシステインは、野生型のセリンから置換されている。配列番号２３に示す塩基配列において、１４７１番目のチミンは、野生型のアデニンから置換されている。
【０２１９】
＜実施例１２＞
［ホモオリゴペプチド生成分析］
本例では、下記表６のアミノ酸誘導体を基質として用い、以下のようにして、実施例９のアミノリシンＡによるペプチド生成を分析した。
【０２２０】
【表６】
【０２２１】
まず、０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、アミノリシンＡ １０μｇ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ アミノ酸誘導体および１０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯを加え、反応液 １００μＬを調製した。この反応液を、５０℃、９００ｒｐｍで６時間反応させた。反応終了後、１０ｖ／ｖ％ ギ酸／メタノール／ＤＭＳＯ混合液（容積比１：１：１）３００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離（１０００ｒｐｍ）した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＬＳ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＬＳ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。そして、各ペプチドの生成量を、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）におけるピーク面積から算出した。
【０２２２】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有メタノール、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：２０％溶媒Ｂ
同 ５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を２０％から９９％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ４０−４５分後：９９％溶媒Ｂ
検出条件：ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０２２３】
前記表６のアミノ酸誘導体を用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、アミノ酸誘導体と、アミノリシンＡとの反応による生成物が確認された。
【０２２４】
図２９のグラフに、前記表６のアミノ酸誘導体を含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図において、（Ａ）は、ＬＦ−ＮＨ２の結果であり、（Ｂ）は、ＬＦ−ＯＭｅの結果であり、（Ｃ）は、ＬＦ−ＯＥｔの結果であり、（Ｄ）は、ＤＦ−ＯＭｅの結果であり、（Ｅ）は、ＤＦ−ＯＢｚｌの結果であり、（Ｆ）は、ＬＬ−ＯＢｚｌの結果であり、（Ｇ）は、ＤＬ−ＯＢｚｌの結果である。同図中の（ａ）〜（ｚ６）は、検出された各ピークである。同図に示すように、前記アミノ酸誘導体を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｙ）のピークに示される、２５の生成物が確認された。図３０〜３４に、図２９における前記ピーク（ａ）〜（ｚ６）のＭＳ分析結果を示す。なお、図３０〜３４の各グラフ中の［Ｍ＋Ｈ］＋の値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いたｍ／ｚ値である。
【０２２５】
図３０において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図２９（Ａ）のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｃ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）、ピーク（ｆ）およびピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３０（ａ）〜（ｇ）に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２にＬＦが結合したＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｇ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＮＨ２のＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、７種類のペプチドＬＦ−ＬＦ，ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦおよびＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２が生成した。
【０２２６】
図３１において、グラフ（ｚ１）、（ｂ）、（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｆ）、（ｊ）および（ｋ）は、それぞれ、図２９（Ｂ）のピーク（ｚ１）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｈ）、ピーク（ｉ）、ピーク（ｆ）、ピーク（ｊ）およびピーク（ｋ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３１に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｂ）のピーク（ｚ１）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅ（基質）であり、図２９（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図２９（Ｂ）のピーク（ｉ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｊ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｋ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＯＭｅのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、６種類のペプチドＬＦ−ＬＦ，ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０２２７】
図３２において、グラフ（ｚ２）、（ｂ）、（ｈ）、（ｌ）、（ｍ）および（ｎ）は、それぞれ、図２９（Ｃ）のピーク（ｚ１）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｈ）、ピーク（ｌ）、ピーク（ｍ）およびピーク（ｎ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３２に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｃ）のピーク（ｚ２）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔ（基質）であり、図２９（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図２９（Ｃ）のピーク（ｌ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｍ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｎ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＯＥｔのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、６種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０２２８】
図３３において、グラフ（ｚ３）、（ｚ４）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）および（ｒ）は、それぞれ、図２９（Ｄ）および（Ｅ）のピーク（ｚ３）、（ｚ４）、ピーク（ｏ）、ピーク（ｐ）、ピーク（ｑ）およびピーク（ｒ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３３に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｄ）のピーク（ｚ３）の生成物は、ＤＦ−ＯＭｅ（基質）であり、図２９（Ｅ）のピーク（ｚ４）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｄ）および（Ｅ）のピーク（ｏ）の生成物は、ＤＦ−ＤＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＦ−ＤＦ）であり、図２９（Ｅ）のピーク（ｐ）の生成物は、ＤＦにＤＦが結合したＤＦ−ＤＦであり、図２９（Ｅ）のピーク（ｑ）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌにＤＦが結合したＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｅ）のピーク（ｒ）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌに２分子のＤＦが連続して結合したＤＦ−ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＤＦ−ＯＢｚｌのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＤＦ−ＤＦ，ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌ、ＤＦ−ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＤＦ−ＤＦ）が生成した。
【０２２９】
図３４において、グラフ（ｚ５）、（ｚ６）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）および（ｙ）は、それぞれ、図２９（Ｆ）および（Ｇ）のピーク（ｚ５）、ピーク（ｚ６）、ピーク（ｓ）、ピーク（ｔ）、ピーク（ｕ）、ピーク（ｖ）、ピーク（ｗ）、ピーク（ｘ）およびピーク（ｙ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３４に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｆ）のピーク（ｚ５）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｇ）のピーク（ｚ６）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｆ）のピーク（ｓ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図２９（Ｆ）のピーク（ｔ）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌに３分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｆ）のピーク（ｕ）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌに４分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｖ）の生成物は、ＤＬにＤＬが結合したＤＬ−ＤＬであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｗ）の生成物は、ＤＬ−ＤＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）であり、図２９（Ｇ）のピーク（ｘ）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌにＤＬが結合したＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｙ）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌに２分子のＤＬが連続して結合したＤＬ−ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＬ−ＯＢｚｌのＣ末端側にロイシンが転移した、２種類のペプチド、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌ、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成し、ＤＬ−ＯＢｚｌのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＤＬ−ＤＬ、ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌ、ＤＬ−ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）が生成した。
【０２３０】
なお、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＳ９−ＡＣＡＰを用いた場合には、アミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０２３１】
＜実施例１３＞
［へテロオリゴペプチド生成評価］
本例では、アシル供与体として、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ プロリンメチルエステルを用い、アシル受容体として、２２．５ｍｍｏｌ／Ｌ アミンを用い、５ｖ／ｖ％ギ酸 ２００μＬを用いて反応を停止した以外は、実施例１１と同様にして、ペプチド生成を評価した。下記表７に、前記アミン（アミノ酸）を示す。
【０２３２】
【表７】
【０２３３】
前記表７のアミンを用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。前記ピークには、プロリンおよびメチオニン残基を有するヘテロジペプチドのピークが含まれた。すなわち、プロリンメチルエステルと前記アミンと前記アミノリシンＡとの反応による、ヘテロオリゴペプチドの生成が確認された。
【０２３４】
図３５のグラフに、プロリンメチルエステルおよび前記表７のアミンを含む反応液における、前記へテロジペプチドのイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図中の矢印は、検出されたヘテロジペプチド（Ｆ−Ｘ、Ｘはアミン由来のアミノ酸残基）のピークである。同図に示すように、前記アミンを基質とする反応の結果、矢印のピークに示される、１５のヘテロジペプチドが確認された。下記表８に、生成した各ヘテロジペプチドを示す。なお、同図中のｍ／ｚ値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ヘテロジペプチドの確認に用いた［Ｍ＋Ｈ］＋の値である。なお、本例の反応では、アスタリスクのピークに示される、シクロ（Ｆ−Ｆ）も確認された（ｍ／ｚ＝２９５）。
【０２３５】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２３６】
本発明によれば、組換アミノ酸転移酵素を用いるため、酵素を、低コストで、簡便にかつ高収率で得ることが可能である。このため、例えば、オリゴペプチドの酵素合成法を、実用化（工業化）することも容易になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法および組換アミノ酸転移酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な機能を持つジペプチドおよびその誘導体が、食品や医薬品等の原料素材として注目を集めている。このようなジペプチドとしては、例えば、アスパルテーム（aspartame）、環状アルギニル−プロリン（cyclo(LR-DP)）、デヒドロフェニルアヒスチン（dehydrophenylahistin）、バリル−チロシン（LV-LY）およびアラニル−チロシン（LA-LY）が知られている。アスパルテームは、フェニルアラニンのメチルエステルと、アスパラギン酸とがペプチド結合した構造を持つジペプチドのメチルエステルであり、甘味は砂糖の約１８０倍である。環状アルギニル−プロリンは、キチナーゼ（chitinase）の特異的阻害剤であり、抗カビ剤および殺虫剤の用途が期待されている。デヒドロフェニルアヒスチンは、細胞分裂阻害作用を有し、新規抗がん剤としての用途が期待されている。バリル−チロシンは、アンジオテンシンＩ変換酵素活性を阻害する機能を有する。アラニル−チロシンは、水への溶解度が低いチロシンの有力な供給源になる。
【０００３】
ジペプチドの製造方法は、化学合成法と酵素合成法とに大別され、酵素合成法は、温和な反応条件での合成が可能であること、副生成物が少ないこと等の利点を有する。酵素合成法としては、例えば、サーモリシン等のメタロペプチダーゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、アラニンリガーゼ、又は非リボソームペプチド合成酵素を用いる方法等が知られている。このなかで、エステル結合のアミノ分解反応を含む酵素合成法（特許文献１）は、サーモリシン等を用いる酵素合成法と異なり、基質として化学的Ｎ−保護アミノ酸を必要とせず、遊離アミノ酸とアミノアシルメチルエステルとからジペプチドを合成することが可能である。しかしながら、従来の酵素合成法で使用されている酵素の中には、コストが高いものもあり、また、基質特異性に偏りがあるため、例えば、バリル−チロシンやアラニル−チロシン等のジペプチドを実用化レベルで製造できないといった問題があった。この問題に対し、ペプチダーゼファミリー２８に属する熱安定性アミノペプチダーゼを用いた酵素合成法が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０３／０１０３０７号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−３１９０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記特許文献２の方法は、合成されるジペプチドの種類の幅を広げ、例えば、疎水性のアミノ酸を含むジペプチドを合成でき、またジペプチドの構造の制御も可能な方法である。しかも、前記特許文献２の方法は、高収率、高速および簡便にジペプチドを合成可能である。一方、ジペプチドを含むオリゴペプチドに関しては、様々な機能が期待されている。このため、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は、多様な構造のオリゴペプチドを合成可能な酵素の開発が可能なスクリーニング方法およびそれにより得られた組換アミノ酸転移酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のスクリーニング方法は、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前記本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニン、アスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者等は、多様な構造のオリゴペプチドを製造するための酵素を開発するために、一連の研究を重ねたところ、酵素の活性中心であるセリン残基を置換するという着想を得た。この着想を基に、アミノペプチダーゼの活性中心を、遺伝子組み換え技術によってシステイン残基等のセリン残基以外のアミノ酸残基に置換したところ、後述するように、直鎖状ジペプチドに加え、環状ジペプチド、トリペプチドおよびテトラペプチド等も合成可能な酵素が得られることを見出し、本発明に至った。本発明では、組換アミノ酸転移酵素を用いるため、酵素を、低コストで、簡便にかつ高収率で得ることが可能であるため、オリゴペプチドの酵素合成法を、実用化（工業化）することも容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図２】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図４】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図６】本発明の実施例２における、前記アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３および４における、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性の濃度による変化および経時的変化を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例４における、アミノリシンＳの至適ｐＨを示すグラフである。
【図９】本発明の実施例４における、ＤＭＳＯ存在下でのアミノリシンＳの活性を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例４における、アミノリシンＳ活性の処理温度および高温処理時間による変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例４における、アミノリシンＳの活性とＬＦ濃度またはＬＷ濃度との関係を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例５における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図１３】本発明の実施例５における、アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例６における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムである。
【図１５】本発明の実施例６における、アミノ酸誘導体の反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例７における、アミノ酸誘導体の反応液のイオンクロマトグラムおよびＭＳ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の実施例７における、ＭＳ／ＭＳスペクトルから推定されるイオンを示す。
【図１８】参考例における、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性を示すグラフである。
【図１９】本発明の実施例９における、プロリンベンジルエステルを含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２０】本発明の実施例９における、プロリンベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図２１】本発明の実施例９において、各ｐＨにおけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２２】本発明の実施例９において、各酵素量におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２３】本発明の実施例９において、各基質濃度におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２４】本発明の実施例９において、各反応時間におけるペプチド生成結果を示すグラフである。
【図２５】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２６】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２７】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラムである。
【図２８】本発明の実施例１０における、アミノ酸誘導体のｌｏｇＰとそれに対応するジペプチドエステルの生成を示すグラフである。
【図２９】本発明の実施例１２における、アミノ酸誘導体を含む反応液のトータルイオンクロマトグラム結果を示す。
【図３０】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンアミドを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３１】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンメチルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３２】本発明の実施例１２における、フェニルアラニンエチルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３３】本発明の実施例１２における、Ｄ−体フェニルアラニンメチルエステルまたはベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３４】本発明の実施例１２における、Ｌ−体またはＤ−体ロイシンベンジルエステルを含む反応液のＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図３５】本発明の実施例１３における、アミノ酸を含む反応液のイオンクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、
活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、
前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法において、前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基は、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つの残基であることが好ましい。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法において、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることが好ましい。
【００１４】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前述のように、本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、
前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素がアミノペプチダーゼであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、後述する反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒することが好ましい。
【００１６】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法について、以下に説明する。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明においては、以下、活性中心がセリン残基である酵素を、「非置換型酵素」といい、前記非置換型酵素の活性中心のセリン残基を他のアミノ酸残基に置換して得られる組換アミノ酸転移酵素を、「置換型アミノ酸転移酵素」または「置換型組換アミノ酸転移酵素」ともいう。なお、本発明において、前記非置換型酵素とは、活性中心のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されていないことを意味し、その他のアミノ酸残基の置換の有無を意味するものではない。また、「活性中心がセリン残基である酵素」とは、例えば、活性中心を形成するアミノ酸残基の少なくとも一つがセリン残基である酵素をいう。
【００１９】
前記アミノ酸転移酵素とは、アミノ酸の転移を触媒する酵素であり、例えば、アシルトランスフェラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、トランスアミノペプチダーゼともいう。
【００２０】
本発明においては、活性中心がセリン残基である所望の酵素について、前記セリン残基を他のアミノ酸残基に置換して、組換アミノ酸転移酵素を提供し、前記組換アミノ酸転移酵素が、他のアミノ酸残基への置換により新規な酵素反応を発揮するか否かを判定することがポイントである。したがって、組換アミノ酸転移酵素の提供にあたって、活性中心がセリン残基である非置換型酵素の種類や、セリン残基を他のアミノ酸残基へ置換する方法は、何ら制限されない。
【００２１】
前記非置換型酵素の由来は、何ら制限されず、例えば、自然界由来の酵素であってもよいし、人工的に構築された酵素であってもよい。本発明においては、このような活性中心がセリン残基である非置換型酵素について、前述のように他のアミノ酸残基への置換を行って置換型組換アミノ酸転移酵素を提供すればよい。前記自然界の由来としては、前述のように、特に制限されず、例えば、細菌等の微生物、ヒト、マウス等の哺乳類を含む動物、昆虫、植物等があげられる。前記細菌としては、例えば、一例として、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１があげられる。この他にも、例えば、ストレプトマイセス・サーモルテウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２６９、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８等があげられる。
【００２２】
本発明において、前記非置換型酵素の種類は、何ら制限されず、活性中心がセリン残基の酵素であればよい。前記非置換型酵素としては、例えば、アミノ酸を遊離する活性を示すアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１群）、アミノ酸転移酵素等があげられる。
【００２３】
本発明において、前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基は、特に制限されないが、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸等があげられ、中でも、好ましくは、アラニン、グリシンまたはシステインであり、より好ましくはシステインである。
【００２４】
前記非置換型酵素のセリン残基を他のアミノ酸残基へ置換する方法としては、何ら制限されず、例えば、遺伝子工学的手法等の従来公知の方法が使用できる。具体例としては、例えば、活性中心がセリン残基である非置換型酵素をコードする核酸について、前記活性中心のセリン残基に対応するコドンを、他のアミノ酸残基に対応するコドンに置換する方法があげられる。このように、活性中心のセリン残基に対応するコドンを他のアミノ酸に対応するコドンに置換した核酸から、タンパク質を発現させることによって、活性中心のセリン残基が他のアミノ酸に置換された組換アミノ酸転移酵素を得ることができる。前記核酸としては、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また、ＰＮＡ等の人工核酸を含んでもよい。
【００２５】
前記セリン以外のアミノ酸に対応するコドンに置換した核酸からのタンパク質の発現方法は、何ら制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、以下に示すような方法があげられる。まず、セリン以外のアミノ酸に対応するコドンに置換した前記核酸を準備し、これをベクターに挿入して発現ベクターを作製する。そして、前記発現ベクターを宿主に導入し、形質転換体を得て、前記形質転換体を培養する。前記培養により前記形質転換体においてタンパク質が発現するため、セリン残基を他のアミノ酸残基に置換した目的のタンパク質を得ることができる。
【００２６】
前記核酸を挿入する前記ベクターの種類は、何ら制限されず、例えば、宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド、放線菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ、人工プラスミド等があげられ、具体例としては、例えば、ｐＩＪ７０２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ３６７、ｐＮＵＴ４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、λｇｔ１０、ｐＴＯＮＡ５ａ、ｐＥＴ２８等があげられる。また、前記ベクターは、例えば、さらに、発現を制御する配列や、形質転換体を選択するための選択マーカーの配列等を有してもよい。前記発現を制御する配列としては、特に制限されないが、例えば、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等があげられる。前記選択マーカー配列としては、特に制限されないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。前記ベクターに前記核酸を挿入する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用でき、例えば、前記核酸を適当な制限酵素で切断した後、前記ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに連結する方法等があげられる。
【００２７】
前記宿主の種類は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。前記宿主としては、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等の細胞があげられる。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等があげられる。前記宿主への前記発現ベクターの導入方法としては、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、Ｌｉ法、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、パーティクル・ガン法等の従来公知の方法を適宜採用できる。
【００２８】
また、前記形質転換体の培養条件は、何ら制限されず、例えば、宿主、発現ベクター等の種類に応じて、温度、時間、ｐＨ、培地等の条件を適宜決定できる。
【００２９】
前記形質転換体の培養により発現した置換型組換アミノ酸転移酵素は、例えば、培養液、培養液の上清、培養液の沈殿物、培養細胞、培養細胞の抽出物等から採取できる。前記置換型組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記培養物から精製してもよい。精製方法は、特に制限されず、例えば、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の従来公知の方法を採用できる。
【００３０】
前記酵素反応の判定工程において、その判定手法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、活性中心がセリン残基である非置換型酵素では基質となり得ない基質を用いて、置換型組換アミノ酸転移酵素を用いた酵素反応を行い、生成物の有無を確認する方法があげられる。この方法によれば、例えば、セリン残基の置換により、置換型組換アミノ酸転移酵素が、非置換型酵素とは異なる基質特異性を有する酵素か否かを判定でき、新たな基質特異性を示す組換アミノ酸転移酵素を提供できる。また、置換型組換アミノ酸転移酵素を用いて酵素反応を行い、前記非置換型酵素の触媒反応による生成物とは異なる生成物の有無を確認する方法があげられる。この方法によれば、例えば、セリン残基の置換により、置換型組換アミノ酸転移酵素が、非置換型酵素とは異なる触媒反応を示す酵素か否かを判定でき、同じ基質であっても、非置換型酵素とは異なる生成物を生成可能な組換アミノ酸転移酵素を提供できる。なお、これらの判定手法は、一例であって、本発明を制限するものではない。
【００３１】
前記判定工程における酵素反応の条件は、何ら制限されず、例えば、非置換型酵素を使用する際と同様の条件に設定することができる。
【００３２】
＜組換アミノ酸転移酵素＞
つぎに、本発明の組換アミノ酸転移酵素は、前述のように、本発明のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニン、アスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であって、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、後述する反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒することが好ましい。
【００３４】
反応（１）
【化１】
【００３５】
前記反応（１）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）または水酸基（−ＯＨ）であり、Ｒ１は、例えば、下記の通りである。基質である各アミド化合物において、ＸおよびＲ１は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。前記反応において、例えば、一方のアミド化合物を構成するＸが、水酸基（−ＯＨ）の場合は、他方のアミド化合物を構成するＸは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であることが好ましい。前記反応においては、例えば、矢印で示すように、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等のオリゴペプチドを合成することができ、さらに、反応を進めることで、前記ジペプチドから環化したジケトピペラジンを合成することもできる。
【化２】
【００３６】
反応（２）
【化３】
【００３７】
前記反応（２）において、Ｙは、例えば、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはエトキシ基（−ＯＥｔ）であり、Ｒ２は、例えば、以下の通りである。基質である各アミド化合物において、Ｒ２は、同一でもよく、異なってもよい。このように、Ｙがベンゾキシ基であるアミド化合物を使用することにより、環化したジケトピペラジンを効率良く得ることができる。
【化４】
【００３８】
前記反応（２）において、一方のアミド化合物のＲ２をベンジル基（−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、他方のアミド化合物のＲ２をパラヒドロキシベンジル基（−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）とした場合、下記式の化合物が得られる。
【化５】
【００３９】
反応（３）
【化６】
【００４０】
前記反応（３）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ３およびＲ３’は、例えば、下記の通りである。基質である各アミド化合物において、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ同一でもよく、異なってもよいが、Ｒ３は、例えば、フェニル基（−Ｃ６Ｈ５）であることが好ましい。
【化７】
【００４１】
反応（４）
【化８】
【００４２】
前記反応（４）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ４は、例えば、下記の通りである。
【化９】
【００４３】
反応（５）
【化１０】
【００４４】
反応（６）
【化１１】
【００４５】
前記反応（６）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。また、Ｒ５は、例えば、ヒドロキシ基（−ＯＨ）であり、Ｒ６は、例えば、水素原子（−Ｈ）である。
【００４６】
反応（７）
【化１２】
【００４７】
前記反応（７）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、Ｒ７は、例えば、下記のとおりである。
【化１３】
【００４８】
反応（８）
【化１４】
【００４９】
前記反応（８）において、Ｘは、例えば、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。また、Ｒ８は、例えば、ヒドロキシ基（−ＯＨ）であり、Ｒ９は、例えば、水素原子（−Ｈ）である。
【００５０】
本発明の組換アミノ酸転移酵素において、前記反応（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン残基に置換することで得られる。前記（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＮＢＲＣ１４２７１由来アミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８由来アミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素等があげられる。また、前記反応（４）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記反応（５）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記反応（６）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られ、前記反応（７）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られ、前記反応（８）を触媒する組換アミノ酸転移酵素は、例えば、プロリルアミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンまたはアスパラギン酸残基に置換することで得られる。前記式（６）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、前記反応（４）または（５）を触媒する組換アミノ酸転移酵素と同様のものがあげられ、反応に応じた基質を使用することで、所望の反応を行うことができる。前記反応（４）、（５）および（７）を触媒する組換アミノ酸転移酵素の具体例としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ ＮＢＲＣ１４２７０由来プロリルアミノペプチダーゼについて、活性中心のセリン残基をシステイン残基に置換した酵素があげられる。
【００５１】
前記アミノペプチダーゼの由来は、特に制限されないが、例えば、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アシドサーマス属（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）が好ましく、より好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８である。
【００５２】
また、本発明の第１の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、５０２番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、５０２番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５３】
前記（ｂ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００５４】
前記（ｃ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、一般に、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕ ＳＦ、外４名、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９０年１０月５日、第２１５巻、第３号、ｐ．４０３−４１０）。
【００５５】
本発明の第２の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１４４番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１４４番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号１７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５６】
前記（ｅ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００５７】
前記（ｆ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）の意味は、前述と同様である。また、同一性比較のための配列間での適切な整列は、前述と同様にして決定できる。
【００５８】
本発明の第３の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（ｇ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、４９１番目のアミノ酸残基がシステインであり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
（ｉ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、４９１番目のアミノ酸残基がシステインであり、前記配列番号２２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質
【００５９】
前記（ｈ）のタンパク質において、欠失、置換、挿入または付加された前記アミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜３３個であることが好ましく、より好ましくは、１個〜１５個である。
【００６０】
前記（ｉ）のタンパク質において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）の意味は、前述と同様である。また、同一性比較のための配列間での適切な整列は、前述と同様にして決定できる。
【００６１】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質であることが好ましい。
【００６２】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、下記（ｘ１）〜（ｘ３）の性質であることを特徴とする。
（ｘ１）分子量が３０〜８０ｋＤａの範囲
（ｘ２）至適ｐＨが５〜８の範囲
（ｘ３）至適温度が３０〜６０℃の範囲
【００６３】
本発明の組換アミノ酸転移酵素は、例えば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質であることが好ましい。
【００６４】
前記（ｘ１）において、分子量は、好ましくは、３０〜８０ｋＤａであり、特に好ましくは４５〜８０ｋＤａである。前記（ｘ２）において、至適ｐＨは、好ましくは、５〜８であり、特に好ましくは６〜７．７である。前記（ｘ３）において、至適温度は、好ましくは、３０〜６０℃であり、特に好ましくは３０〜５０℃である。
【００６５】
＜組換アミノ酸転移酵素遺伝子＞
本発明の第１のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ａ）〜（Ｄ）は、配列番号８で表される塩基配列において、例えば、１１１２〜１１１４番目がシステインのコドンｔｇｃである。
（Ａ）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸
（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｃ）配列番号８で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｄ）配列番号８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００６６】
前記（Ｂ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
【００６７】
前記（Ｃ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、求めることができる。
【００６８】
前記（Ｄ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００６９】
前記（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００７０】
本発明の第２のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ｅ）〜（Ｈ）は、配列番号１８で表される塩基配列において、例えば、４３０〜４３２番目がシステインのコドンｔｇｃである。
（Ｅ）配列番号１８で表される塩基配列からなる核酸
（Ｆ）配列番号１８で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｇ）配列番号１８で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｈ）配列番号１８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００７１】
前記（Ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述と同様の実験条件である。
【００７２】
前記（Ｇ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、前述と同様にして、求めることができる。
【００７３】
前記（Ｈ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００７４】
前記（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００７５】
本発明の第３のアミノ酸転移酵素遺伝子は、下記（Ｉ）〜（Ｌ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。なお、下記（Ｉ）〜（Ｌ）は、配列番号２３で表される塩基配列において、例えば、１４７１〜１４７３番目がシステインのコドンｔｇｔである。
（Ｉ）配列番号２３で表される塩基配列からなる核酸
（Ｊ）配列番号２３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｋ）配列番号２３で表される塩基配列との相同性が６０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
（Ｌ）配列番号２３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる核酸であり、且つ、アミノ酸転移活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００７６】
前記（Ｊ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述と同様の実験条件である。
【００７７】
前記（Ｋ）において、前記相同性は、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、前述と同様にして、求めることができる。
【００７８】
前記（Ｌ）において、欠失、置換、挿入または付加された前記塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１個〜４０６個、好ましくは、１個〜２００個である。
【００７９】
前記（Ｊ）、（Ｋ）および（Ｌ）において、前記核酸は、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒するタンパク質をコードする核酸であることが好ましい。
【００８０】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、本発明の組換アミノ酸転移酵素遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、本発明の組換アミノ酸転移酵素遺伝子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、宿主内で複製可能なベクターに前記組換アミノ酸転移酵素遺伝子を連結することにより調製できる。前記遺伝子を連結する前記ベクターとしては、特に制限されず、例えば、前述のものが使用できる。
【００８１】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前記本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の形質転換体は、例えば、宿主に前記発現ベクターを導入することにより調製できる。前記宿主としては、特に制限されず、例えば、前述のものが使用できる。
【００８２】
このような本発明のアミノ酸転移酵素遺伝子、発現ベクターまたは形質転換体によれば、前記反応（１）〜（８）からなる群から選択された少なくとも一つの反応を触媒する組換アミノ酸転移酵素を容易に製造することができる。
【００８３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
＜実施例１＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）由来トランスアミノペプチダーゼ（以下、「アミノリシンＳ」という。）を、以下のようにして作製した。
【００８５】
［Ｓ９ＡＰ−ＳＴ遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）由来アミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「Ｓ９ＡＰ−ＳＴ」という）をクローニングした。
【００８６】
ストレプトマイセス・サーモシアネオビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙａｎｅｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７１の菌体より、ホップウッドらの方法（Ｈｏｐｗｏｏｄ, Ｄ．Ａ．Ｂｉｂｂ, Ｍ．Ｊ．Ｃｈａｔｅｒ, Ｋ．Ｆ．Ｋｉｅｓｅｒ, Ｔ．Ｂｒｕｔｏｎ, Ｃ.Ｊ.Ｋｉｅｓｅｒ, Ｈ．Ｍ．Ｌｙｄｉａｔｅ, Ｄ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ, Ｃ．Ｐ．Ｗａｒｄ, Ｊ．Ｍ．Ｓｃｈｒｅｍｐｆ,Ｈ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ; Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ:Ｎｏｒｗｉｃｈ, ＣＴ, １９８５, ｐｐ.７０−８４．）によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、アシルペプチド加水分解酵素と推定される遺伝子の保存領域から、以下に示す配列番号１のセンスプライマー１および配列番号２のアンチセンスプライマー１を合成した。前記アシルペプチド加水分解酵素と推定される遺伝子としては、ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ １８９８およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ６４８８を用いた。なお、下記プライマーの配列において、Ｓは、グアニンまたはシトシンを表す。
【００８７】
センスプライマー１：（配列番号１）
５′−ＧＳＧＴＳＡＴＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＧＧ−３′
アンチセンスプライマー１：（配列番号２）
５′−ＣＣＧＴＧＳＣＣＣＴＣＳＣＣＣＴＣＧＡＡ−３′
【００８８】
前記調製したゲノムＤＮＡ、センスプライマー１およびアンチセンスプライマー１を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片（１．５ｋｂｐ）を、ＰＣＲクローニングキット（商品名「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）」、インビトロジェン社製）を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。また、制限酵素ＰｖｕＩＩを用いた逆ＰＣＲ法により、５′および３′領域の配列情報を得た。そして、開始コドンの上流側にＮｄｅＩ部位を導入するセンスプライマー２（配列番号３）と、停止コドンの下流側にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するアンチセンスプライマー２（配列番号４）とを用いて、増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。なお、下記センスプライマー２の配列において、下線部の３塩基は開始コドンであり、下記アンチセンスプライマー２の配列において、下線部の３塩基は停止コドンである。
【００８９】
センスプライマー２：（配列番号３）
５′−ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣ−３′
アンチセンスプライマー２：（配列番号４）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡ−３′
【００９０】
増幅したＤＮＡ断片（２ｋｂｐ）を、前述のＰＣＲクローニングキットを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。そして、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、前記ＤＮＡ断片を消化し、前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴをコードするＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＴ ２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、Ｓ９ＡＰ−ＳＴアミノペプチダーゼを発現するプラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴを構築した。なお、この発現ベクターは、Ｎ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを含むように設計した。前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴの全塩基配列は、ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ.ｎｉｇ.ａｃ.ｊｐ/）にアクセッション番号ＡＢ４８０２８４として登録されている。
【００９１】
［アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの発現］
つぎに、商品名「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ｓｙｓｔｅｍ １」（ノバジェン社製）を用いて、以下のようにして、前記Ｓ９ＡＰ−ＳＴアミノペプチダーゼを過剰発現させた。
【００９２】
まず、前記製品付属の使用説明書に従い、製品付属の培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ）５０ｍＬに、前記発現プラスミドを有するＲｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社製）のコロニーを植菌し、３０℃、回転数１８０ｒｐｍの条件下で、１６時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、商品名「Ｅｌｅｓｔｉｎ ＮＰ０３５ＳＰ」（ネパジーン社製）を用いて、１分間隔で、最大出力で合計３０分間、超音波処理した。得られた細胞除去抽出物を、Ｈｉｓ−タグ精製レジン（商品名「Ｔａｌｏｎ（登録商標）Ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ」、クロンテック社製）を用いて、製品付属の使用説明書に従い精製した。精製タンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質であることを確認した。
【００９３】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、以下のようにして、前記アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの変異タンパク質（以下、「アミノリシンＳ」という）を構築した。
【００９４】
まず、下記のセンスプライマー３（配列番号５）およびアンチセンスプライマー３（配列番号６）を用いて、前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴをＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー３の配列は、Ｓ９ＡＰ−ＳＴの１５０５番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、１４８７−１５１６番目の塩基配列に相当し、下線部はＢａｌＩ部位である。また、下記アンチセンスプライマー３の配列は、下線部がＨｉｎｄＩＩＩ部位であり、その３´側に停止コドンＴＣＡを有する。
【００９５】
センスプライマー３：（配列番号５）
５′−ＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴ−３′
アンチセンスプライマー３：（配列番号６）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡ−３′
【００９６】
増幅したＤＮＡ断片（０．５ｋｂｐ）を、前述のＰＣＲクローニングキットを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ９ＡＰ−ＳＴのＢａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃを構築し、塩基配列を決定した。前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃを使用し、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社製）を形質転換させた。なお、この発現ベクターは、Ｎ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを含むように設計した。
【００９７】
前記プラスミドｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６−Ｓ５０２Ｃをプラスミドとして用いたこと以外は、前述と同様にして、アミノリシンＳを過剰発現させ、精製した。前記アミノリシンＳのアミノ酸配列を、配列番号７に示し、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を、配列番号８に示す。前記アミノリシンＳは、配列番号７のアミノ酸配列において５０２番目のシステインは、野生型のセリンから置換されたものである。
【００９８】
＜実施例２＞
［アミノ酸誘導体に対する反応性評価］
基質として、下記表１記載のアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、本発明のアミノリシンＳの前記基質に対する反応性を評価した。下記表１において、Ｏ−Ｍｅは、メトキシ基を表し、Ｏ−Ｂｚｌは、ベンゾキシ基を表し、Ｏ−Ｅｔは、エトキシ基を表す（以下、同様）。また、実施例において、アミノ酸およびアミノ酸誘導体におけるアミノ酸残基を、下記表１のように、省略形または一文字表記で記載することもある。
【００９９】
【表１】
【０１００】
まず、アミノリシンＳ １０μｇを含む０．５ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、前記各アミノ酸誘導体を２０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加え、５０℃で２３時間反応させた。なお、前記緩衝液には、前記反応液の最終容量が１００μＬとなるように、５体積％のＤＭＳＯを添加した。反応終了後、３体積％のギ酸１００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。
【０１０１】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有アセトニトリル、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：１５％溶媒Ｂ
同 ５−３０分後：溶媒Ｂ濃度を１５％から５０％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ３０−３５分後：５０％溶媒Ｂ
同 ３５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を５０％から８０％に変化させる
直線勾配グラジェント
検出条件： ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０１０２】
前記表１記載のアミノ酸誘導体を用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、前記１０のアミノ酸誘導体と、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１０３】
図１のグラフに、前記Ｎｏ．１〜３のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．１、３、２のアミノ酸誘導体の結果である。同図中の（ａ）〜（ｋ）は、検出された各ピークである。同図の上段に示すように、Ｎｏ．１（Ｌ−フェニルアラニンアミド、ＬＦ−ＮＨ２）を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｃ）のピークに示される、３つの生成物が確認された。また、同図の中段に示すように、Ｎｏ．３（エトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ）を基質とする反応の結果、（ｄ）〜（ｇ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。そして、同図の下段に示すように、Ｎｏ．２（メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ）を基質とする反応の結果、（ｈ）〜（ｋ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。
【０１０４】
図２に、図１における前記ピーク（ａ）〜（ｋ）のＭＳ分析結果を示す。
【０１０５】
図２において、グラフ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、図１のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）およびピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ａ）〜（ｃ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ａ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２にＬＦが結合したＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図１のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．１（ＬＦ−ＮＨ２）のＣ末端側にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２およびＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２が生成した。
【０１０６】
図２において、グラフ（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図１のピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）、ピーク（ｆ）およびピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ｄ）〜（ｇ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図１のピーク（ｆ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｇ）の生成物は、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．３（ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ）にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔ、および、ジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。なお、以下、ジペプチドが環化したものを、シクロジペプチドともいう。
【０１０７】
図２において、グラフ（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）は、それぞれ、図１のピーク（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２（ｈ）〜（ｋ）に示すＭＳ分析の結果から、図１のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｉ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図１のピーク（ｊ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図１のピーク（ｋ）の生成物は、ＬＦ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．２（ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−フェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｍｅ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０１０８】
図３のグラフに、Ｎｏ．４〜７のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．４、５、６、７のアミノ酸誘導体の結果である。また、同図中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図の上段に示すように、Ｎｏ．４（ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ａ）および（ｂ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。また、同図の２段目に示すように、Ｎｏ．５（ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ）に対する反応の結果、（ｃ）〜（ｅ）のピークに示される、３つの生成物が確認された。そして、同図の３段目に示すように、Ｎｏ．６（ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）に対する反応の結果、（ｆ）のピークに示される、１つの生成物が確認された。さらに、同図の４段目に示すように、Ｎｏ．７（ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）に対する反応の結果、（ｇ）のピークに示される、１つの生成物が確認された。
【０１０９】
図４に、図３における前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のＭＳ分析結果およびＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。
【０１１０】
図４において、グラフ（ａ）は、上段が、図３のピーク（ａ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ａ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。図４において、グラフ（ｂ）は、図３のピーク（ｂ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ａ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図３のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．４（ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−ロイシンが転移したペプチドＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｍｅ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１１】
図４において、グラフ（ｃ）は、上段が、図３のピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｃ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。図４において、グラフ（ｄ）は、図３のピーク（ｄ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、グラフ（ｅ）は、図３のピーク（ｅ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図３のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−ＥｔにＬＬが結合したＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔであり、図３のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＬ−Ｏ−Ｅｔに２分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．５（ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ）にＬ−ロイシンが転移したペプチド ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−Ｏ−Ｅｔ、およびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１２】
図４において、グラフ（ｆ）は、上段が、図３のピーク（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｆ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｆ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．６（ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）にＬ−ロイシンが転移したジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成した。
【０１１３】
図４において、グラフ（ｇ）は、上段が、図３のピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルであり、下段が、前記ピーク（ｇ）のＭＳ／ＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析の結果、図３のピーク（ｇ）の生成物は、ＤＬ−ＤＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）であることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．７（ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ）にＤ−ロイシンが転移したジペプチドが環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）が生成した。
【０１１４】
図５に、Ｎｏ．８〜１０のアミノ酸誘導体の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、Ｎｏ．８、１０、９のアミノ酸誘導体の結果である。また、同図中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークを示す。同図の上段に示すように、Ｎｏ．８（ＬＷ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ａ）および（ｂ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。また、同図の中段に示すように、Ｎｏ．１０（ＬＹ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ｃ））のピークに示される、１つの生成物が確認された。そして、同図の下段に示すように、Ｎｏ．９（ＬＭ−Ｏ−Ｍｅ）に対する反応の結果、（ｄ）および（ｅ）のピークに示される、２つの生成物が確認された。
【０１１５】
図６に、図５における前記ピーク（ａ）〜（ｅ）のＭＳ分析結果を示す。
【０１１６】
図６において、グラフ（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、図５のピーク（ａ）およびピーク（ｂ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ａ）の生成物は、ＬＷ−ＬＷのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＷ−ＬＷ）であり、図５のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＷ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＷが連続して結合したＬＷ−ＬＷ−ＬＷ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．８（ＬＷ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−トリプトファンが転移したペプチド ＬＷ−ＬＷ−ＬＷ−Ｏ−Ｍｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＷ−ＬＷ）が生成した。
【０１１７】
図６において、グラフ（ｃ）は、図５のピーク（ｃ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＹ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＹが連続して結合したＬＹ−ＬＹ−ＬＹ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．１０（ＬＹ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−チロシンが転移したＬＹ−ＬＹ−ＬＹ−Ｏ−Ｍｅが生成した。
【０１１８】
図６において、グラフ（ｄ）および（ｅ）は、それぞれ、図５のピーク（ｄ）およびピーク（ｅ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、図５のピーク（ｄ）の生成物は、ＬＭ−ＬＭのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＭ−ＬＭ）であり、図５のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＭ−Ｏ−Ｍｅに２分子のＬＭが連続して結合したＬＭ−ＬＭ−ＬＭ−Ｏ−Ｍｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＳのアミノ酸結合活性により、Ｎｏ．９（ＬＭ−Ｏ−Ｍｅ）にＬ−メチオニンが転移したペプチド ＬＭ−ＬＭ−ＬＭ−Ｏ−Ｍｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＭ−ＬＭ）が生成した。
【０１１９】
＜実施例３＞
［酵素量］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、酵素量によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価においては、前記アミノ酸誘導体に代えて、６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦおよび０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦ−Ｏ−Ｅｔを使用し、アミノリシンＳ量を所定量（０、３．７５、７．５、１５、３０μｇ）とし、反応時間を１時間としたこと以外は、実施例２と同様にして反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。なお、前記分析において、シグマ社製の試薬ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦのリテンション時間との比較から、ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦの検出を確認した。また、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの検出は、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ２９５およびｍ／ｚ ３４２の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから確認した。そして、下記式１を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＦへの変換率を算出した。
【０１２０】
（式１）
変換率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｂ：基質として添加したＬＦ−Ｏ−Ｅｔのモル数
【０１２１】
図７（Ａ）のグラフに、酵素量による活性測定結果を示す。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、アミノリシンＳ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、アミノリシンＳ ３０μｇのとき、基質であるＬＦ−Ｏ−Ｅｔが全て、他のペプチドに転換された。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。最も生成量の多いＬＦ−ＬＦの変換率は、約３０％であった。
【０１２２】
＜実施例４＞
本発明のアミノリシンＳについて、各種要因による酵素活性への影響を評価した。
【０１２３】
［反応時間］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、反応時間によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価においては、アミノリシンＳ量を１０μｇとし、反応時間を所定時間（０、０．５、１、１．５、２、３時間）としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
【０１２４】
図７（Ｂ）のグラフに、反応時間による活性測定結果を示す。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、時間依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、反応時間が１．５時間を過ぎると、基質であるＬＦ−Ｏ−Ｅｔが全て、他のペプチドに転換された。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１２５】
［ｐＨ］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、ｐＨによるアミノ酸結合活性をへの影響を評価した。すなわち、まず、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＷ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＬＦ−ＮＨ２および１ｖ／ｖ％ ＤＭＳＯを添加した緩衝液 １００μＬに、アミノリシンＳ １０μｇを加え、３０℃で１時間反応させた。なお、前記緩衝液としては、所定ｐＨ（ｐＨ６．６、７．０、７．２、７．５および７．７）に調整した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液、または所定ｐＨ（ｐＨ７．７、７．９、８．４、８．８および９．３）に調整した０．５ｍｏｌ／Ｌのホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた。反応後、０．０５ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含む、２０ｖ／ｖ％のアセトニトリル １００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離した。上層の２０μＬを回収し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、また、ＬＦ−ＬＷの検出は、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ３３４の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから確認した。そして、ＬＦ−ＬＷの生成量を、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）における該当ピークのピーク面積から算出し、前記ピーク面積から、アミノ酸結合活性を評価した。
【０１２６】
図８のグラフに、ｐＨによる活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ｐＨであり、縦軸は、前記ＬＦ−ＬＷの生成量を示す。また、同図において、白丸（○）のスポットは、リン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．６〜７．７の測定結果であり、白三角（△）のスポットは、ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ７．７〜９．３の測定結果である。同図に示すように、アミノリシンＳは、ｐＨ６．６〜８．８で酵素活性が確認され、至適ｐＨは、７．７であった。
【０１２７】
［ＤＭＳＯ］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、ＤＭＳＯによるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価において、前記ＬＦの濃度を４０ｍｍｏｌ／Ｌとし、アミノリシンＳ量を１０μｇとし、ＤＭＳＯを所定濃度（５、１０、１５、２０ｖ／ｖ％）としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。そして、得られた反応液を、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦの検出は、実施例３と同様にして行った。また、下記式２を用いて、ＬＦ−ＬＦの生成量から、比活性（％）を算出した。
【０１２８】
（式２）
比活性（％）＝（Ｃ／Ｄ）×１００
Ｃ：各濃度のＤＭＳＯ添加区における生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｄ：ＤＭＳＯ添加濃度５％における生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１２９】
図９のグラフに、ＤＭＳＯによる活性測定結果を示す。同図において、横軸は、反応液中のＤＭＳＯ濃度（ｖ／ｖ％）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図に示すように、ＤＭＳＯ ５体積％添加時と比較して、ＤＭＳＯ １０体積％添加時は約９５％、ＤＭＳＯ １５体積％添加時は約９０％、ＤＭＳＯ ２０体積％添加時は約６０％の比活性を有した。すなわち、本発明のアミノリシンＳは、高濃度のＤＭＳＯ条件下も、高い酵素活性を示した。
【０１３０】
［温度］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、処理温度によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。すなわち、まず、アミノリシンＳ ５０μｇを添加した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを、所定温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０℃）で１時間処理し、処理液を調製した。そして、前記リン酸ナトリウム緩衝液９０μＬに、アミノリシンＳに代えて前記処理液１０μＬを添加したこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。得られた反応液１０μＬを回収し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析に供した。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦの検出は、実施例３と同様にして行った。また、下記式３を用いて、ＬＦ−ＬＦの生成量から、比活性（％）を算出した。
【０１３１】
（式３）
比活性（％）＝（Ｅ／Ｆ）×１００
Ｅ：各温度で処理した酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｆ：未加熱処理の酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１３２】
図１０（Ａ）のグラフに、耐熱性の測定結果を示す。同図において、横軸は、処理温度（℃）であり、縦軸は、前記比活性（％）である。前述のように、各温度で１時間処理した後の酵素を用いて、その残存活性を測定した。同図に示すように、アミノリシンＳは、２０〜５０℃の処理間で酵素活性が９０％以上保持され、６０℃処理においても６０％以上の酵素活性が保持された。この結果から、本発明のアミノリシンＳは、高い耐熱性を有することが明らかとなった。
【０１３３】
［高温処理時間］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、高温処理時間によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。前記アミノリシンＳ ５０μｇを添加した０．５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを、５０℃で所定時間（０、１、２、３、４、５時間）処理したこと以外は、前記処理温度によるアミノ酸結合活性への影響の評価と同様にして、処理液を反応させ、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。そして、ＬＦ−ＬＦの生成量から、下記式４を用いて比活性（％）を算出した。
【０１３４】
（式４）
比活性（％）＝（Ｇ／Ｈ）×１００
Ｇ：各温度で処理した酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
Ｈ：未加熱処理の酵素を用いた反応による生成ＬＦ−ＬＦのモル数
【０１３５】
図１０（Ｂ）のグラフに、高温処理時間による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、処理時間（時間）であり、縦軸は、前記比活性（％）である。同図に示すように、アミノリシンＳは、５０℃で５時間処理後も、４０％以上の酵素活性が確認された。
【０１３６】
［アミノ酸濃度］
本発明のアミノリシンＳについて、以下のようにして、アミノ酸の濃度によるアミノ酸結合活性への影響を評価した。本評価において、前記アミノ酸誘導体に代えて、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと、ＬＦまたはＬＷとを使用し、反応時間を１時間としたこと以外は、実施例２と同様にして反応を行い、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。反応液における濃度は、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＦまたはＬＷを所定濃度（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。なお、前記分析において、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−Ｏ−ＥｔおよびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔは、実施例３と同様にして検出した。ＬＦ−ＬＷは、ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ ３３４の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから検出した。また、各ペプチドの生成量は、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）における該当ピークのピーク面積から算出した。そして、前述の式１を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＦへの変換率を算出した。また、下記式５を用いて、ＬＦ−Ｏ−ＥｔからＬＦ−ＬＷへの変換率を算出した。
【０１３７】
（式５）
変換率（％）＝（Ｉ／Ｊ）×１００
Ｉ：生成ＬＦ−ＬＷのモル数
Ｊ：基質として添加したＬＦ−Ｏ−Ｅｔのモル数
【０１３８】
図１１（Ａ）のグラフに、ＬＦ濃度による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ＬＦの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、左端の縦軸は、各ペプチドの生成量を示すピーク面積であり、右端の縦軸は、前記変換率（％）である。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＦであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、ＬＦ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、ＬＦ濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌのとき、ＬＦ−ＬＦの生成量が最も高かった。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＦ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１３９】
図１１（Ｂ）のグラフに、ＬＷ濃度による活性測定結果を示す。同図において、横軸は、ＬＷの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、左端の縦軸は、各ペプチドの生成量を示すピーク面積であり、右端の縦軸は、前記変換率（％）である。同図において、黒丸（●）のスポットは、ＬＦ−ＬＷであり、白丸（○）のスポットは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、黒三角のスポットは、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔであり、白三角（△）のスポットは、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔである。同図に示すように、ＬＷ濃度依存的に、ＬＦ−ＬＷ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）およびＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの生成が確認された。そして、ＬＷ濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌのとき、ＬＦ−ＬＷの生成量が最も高かった。なお、各ペプチドの生成量は、ＬＦ−ＬＷ、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）、ＬＦ−ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの順に多かった。
【０１４０】
＜実施例５＞
［遊離アミノ酸のアシル受容体評価］
アシル受容体として、下記表２記載の遊離アミノ酸を用い、以下のようにして、アミノリシンＳによるアミノ酸結合反応を行い、生成物を分析した。前記ＬＦに代えて、６０ｍｍｏｌ／Ｌの前記遊離アミノ酸を用い、アミノリシンＳを１０μｇとし、反応時間を１５時間としたこと以外は、実施例３と同様にして、前記遊離アミノ酸とＬＦ−Ｏ−Ｅｔとを反応させ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行い、各ペプチドを検出した。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
前記表２記載の、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−アリルグリシンおよび（Ｒ）−α−プロパルギルグリシンについて、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１４３】
図１２に、前述の７つの化合物の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）であり、上から順に、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−アリルグリシン、（Ｒ）−α−プロパルギルグリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンの結果である。分析の結果、同図において、ピーク（ａ）〜（ｇ）は、ジペプチドであり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であった。
【０１４４】
図１３に、図１２における前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のＭＳ分析結果を示す。図１３において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図１２のピーク（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。グラフ（ａ）〜（ｇ）中の構造化学式は、各ピークのジペプチドである。
【０１４５】
＜実施例６＞
［ベンジルエステルアミノ酸誘導体の評価］
アミノ酸誘導体として、下記表３のベンジルエステルアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、アミノリシンＳによるアミノ酸結合反応を行い、生成物を分析した。前記ＬＦ−Ｏ−Ｅｔの濃度を２．５ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記ＬＦに代えて、２．５ｍｍｏｌ／Ｌの下記ベンジルエステルアミノ酸誘導体を用い、アミノリシンＳを１０μｇとし、前記ＤＭＳＯ濃度を１ｖ／ｖ％とし、反応時間を１５時間としたこと以外は、実施例３と同様にして反応させた。反応後、ＤＭＳＯ ２００μＬを加えて反応を停止させ、上層の１０μＬを回収したこと以外は、実施例３と同様にして、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
前記表３記載の、アミノ酸部分が、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン、Ｄ−バリンおよびＤ−フェニルアラニンのベンジルエステルアミノ酸誘導体について、アミノリシンＳとの反応による生成物が確認された。
【０１４８】
図１４に、前述の６つの化合物の反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、縦軸は、測定波長２１０ｎｍにおける相対強度であり、上から順に、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＬＬ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＬ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＶ−Ｏ−Ｂｚｌ、ＤＦ−Ｏ−Ｂｚｌの結果である。分析の結果、同図において、ピーク（ａ）〜（ｆ）は、一方のペプチドのみがＬＦであるシクロジペプチドであり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であった。
【０１４９】
図１５に、図１４のピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳ分析結果を示す。図１５において、グラフ（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、図１４のピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルである。ＭＳ分析の結果、ピーク（ａ）は、ＬＦとＬＹのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＹ）であり、ピーク（ｂ）は、ＬＦとＤＹのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＹ）であり、ピーク（ｃ）は、ＬＦとＬＬのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＬ）であり、ピーク（ｄ）は、ＬＦとＤＬのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＬ）であり、ピーク（ｅ）は、ＬＦとＤＶのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＶ）であり、ピーク（ｆ）は、ＬＦとＤＦのジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＤＦ）であった。このように、アミノリシンＳによる、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと、Ｌ−アミノ酸型またはＤ−アミノ酸型のベンジルエステル誘導体との結合反応が、確認された。
【０１５０】
＜実施例７＞
［生成したシクロジペプチドの分析］
実施例６において、ＬＦ−Ｏ−Ｅｔと前記ＬＹ−Ｏ−ＢｚｌまたはＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌとの反応から得られた生成物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０１５１】
まず、図１６（Ａ）のグラフに、前記ベンジルエステルアミノ酸誘導体として、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌを使用した反応液、および、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌの反応液のトータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図において、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、測定波長２１０ｎｍにおける相対強度である。また、同図において、上段のチャートが、ＬＹ−Ｏ−Ｂｚｌの結果であり、下段のチャートが、ＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌの結果である。なお、同図において、線Ｘは、ＬＹ−Ｏ−ＢｚｌまたはＤＹ−Ｏ−Ｂｚｌを用いた結果であり、線Ｙは、アミノリシンＳを添加していないコントロールの結果である。同図に示すように、前記分析の結果、ピーク（ａ）および（ｂ）の生成物が確認された。そして、ＭＳ分析により、前記ピーク（ａ）は、シクロ（ＬＦ−ＬＹ）であり、前記ピーク（ｂ）は、シクロ（ＬＦ−ＤＹ）であり、アスタリスク直下のピークは、シクロ（ＬＦ−ＬＦ）であることが確認された。
【０１５２】
つぎに、図１６（Ｂ）のグラフに、図１６（Ａ）のピーク（ａ）およびピーク（ｂ）のＭＳ/ＭＳスペクトルプロファイルを、それぞれ示す。同図において、上段のチャートが、図１６（Ａ）のピーク（ａ）の結果であり、下段のチャートが、図１６（Ａ）のピーク（ｂ）の結果である。図１６（Ｂ）の上段に示すように、ＭＳ／ＭＳ分析により、図１６（Ａ）のピーク（ａ）は、さらに、ピーク（ａ）〜（ｇ）に分離され、図１６（Ｂ）の下段に示すように、図１６（Ａ）のピーク（ｂ）は、さらに、前記上段と同じピーク（ａ）〜（ｇ）に分離された。図１６（Ｂ）において、ピーク（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、２８３．１、２６５．９、２３７．８であり、ジケトピペラジン骨格に特徴的なイオンピークであり、ピーク（ｄ）および（ｆ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、２０５．１、１２０．０であり、トリプロファンに特徴的なイオンピークであり、ピーク（ｅ）および（ｇ）は、ｍ／ｚ値が、それぞれ、１３６．０、１０６．８であり、チロシンに特徴的なイオンピークであった。
【０１５３】
図１７に、前記ＭＳ／ＭＳスペクトルから推定される、図１６（Ｂ）の前記ピーク（ａ）〜（ｇ）のイオンを示す。
【０１５４】
＜参考例＞
［アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性評価］
実施例１で精製したアミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの酵素活性を、下記表４のパラニトロアニリド誘導体を基質として使用し、以下のようにして測定した。まず、前記パラニトロアニリド誘導体を含む５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、前記アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴ １．０μｇを加え、３７℃で、５分間反応させた。分光光度計（Ｕ２８００、日立製作所製）を用い、４０５ｎｍの測定波長で、前記反応液の吸光度を連続的に５分間測定した。下記式６を用いて、比活性（％）を算出した。
【０１５５】
（式６）
比活性（％）＝（Ｋ／Ｌ）×１００
Ｋ：各基質を添加した系における遊離パラニトロアニリドのモル数
Ｌ：Ａｌａ−ｐＮＡを基質とした系における遊離パラニトロアニリドのモル数
【０１５６】
【表４】
【０１５７】
図１８のグラフに、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴの活性測定結果を示す。同図において、縦軸は、比活性（％）であり、横軸は、各種基質である。なお、前記横軸には、各種基質のアミノ酸部分の省略形のみ表記している。同図に示すように、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴは、フェニルアラニン、アラニン、プロリン、グリシン、アルギニン、メチオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リジンまたはアスパラギンをジペプチドのＮ末端から遊離させ、特に、フェニルアラニン、アラニンおよびプロリンに対し、高い酵素活性を有した。このように、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴは、幅広いアミノ酸に対するアミノペプチダーゼ活性が確認された。また、いずれの基質を用いた場合にも、アミノペプチダーゼＳ９ＡＰ−ＳＴによるアミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０１５８】
＜実施例８＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０由来アミノ酸転移酵素（以下、「ｓｃＰＡＰ１４２７０」という。）を、以下のようにして作製した。
【０１５９】
［ｐａｐ１４２７０遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）由来プロリルアミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「ｐａｐ１４２７０遺伝子」という）をクローニングした。
【０１６０】
ストレプトマイセス・サーモルテウス・サブスピーシーズ・フスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｕｓｃｕｓ）ＮＢＲＣ１４２７０の菌体より、前記ホップウッドらの方法によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、プロリルアミノペプチダーゼと推定される遺伝子の保存領域から、以下に示す配列番号９のセンスプライマー４および配列番号１０のアンチセンスプライマー４を合成した。前記プロリルアミノペプチダーゼと推定される遺伝子としては、前述のストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ ３１４４、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ５１２２およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のＳＧＲ ２４０７を用いた。なお、下記プライマーの配列において、Ｗは、アデニンまたはチミンを表し、Ｓは、グアニンまたはシトシンを表す。
【０１６１】
センスプライマー４：（配列番号９）
５′−ＣＡＧＷＳＳＴＴＣＧＧＳＧＧＳＴＴＣＴＧＣ−３′
アンチセンスプライマー４：（配列番号１０）
５′−ＡＣＧＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡ−３′
【０１６２】
下記組成のＰＣＲ反応液についてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させた。なお、下記センスプライマーとしては、前記センスプライマー４を用い、下記アンチセンスプライマーとしては、前記アンチセンスプライマー４を用いた。前記ＰＣＲは、９４℃で１分処理後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で９０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で５分間処理して行った。
【０１６３】
（ＰＣＲ反応液）
０．１μｇ／Ｌ ゲノムＤＮＡ
１０μｍｏｌ／Ｌ センスプライマー
１０μｍｏｌ／Ｌ アンチセンスプライマー
０．０４２Ｕ／μＬ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（タカラバイオ社製）
ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（タカラバイオ社製）
【０１６４】
増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＣｐｏｌＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を用いて抽出した。前記ゲノムＤＮＡおよびプライマーに代えて、この抽出したＤＮＡ、下記センスプライマー５およびアンチセンスプライマー５を用いた以外は、前述と同様にしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片（約２ｋｂｐ）を、下記センスプライマー５およびアンチセンスプライマー５を用いてシークエンスし、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の塩基配列を決定した。なお、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の全塩基配列は、ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ.ｎｉｇ.ａｃ.ｊｐ/）にアクセッション番号ＡＢ５１９６４５として登録されている。
【０１６５】
センスプライマー５：（配列番号１１）
５′−ＡＡＣＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣ−３′
アンチセンスプライマー５：（配列番号１２）
５′−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧＡＣＡ−３′
【０１６６】
前記ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびプライマーに代えて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、下記センスプライマー６および下記アンチセンスプライマー６を用いた以外は前述と同様にして、ＰＣＲを行い、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。なお、前記センスプライマー６は、ＮｄｅｌＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ：下線部の塩基は開始コドンである）を含み、前記アンチセンスプライマー６は、停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトを含んだ。ＰＣＲクローニングキット（商品名「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）」、インビトロジェン社製）を用いて、得られたＤＮＡ断片をクローニングおよびシークエンスし、塩基配列を決定した。そして、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、前記ＤＮＡ断片を消化し、前記ＰＡＰ１４２７０をコードするＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＴ ２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに導入し、前記ＰＡＰ１４２７０を発現する発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０を得た。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅＸｃｅｌｌ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０を、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ−２（ＤＥ３）（メルク社製）に導入し、形質転換体を得た。
【０１６７】
センスプライマー６：（配列番号１３）
５′−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＧ−３′
アンチセンスプライマー６：（配列番号１４）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧ−３′
【０１６８】
［ＰＡＰ１４２７０の発現］
つぎに、以下のようにして、前記ＰＡＰ１４２７０を過剰発現させた。
【０１６９】
まず、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（メルク社製）を用いて、製品付属の培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ）５０ｍＬに、前記形質転換体を植菌し、２５℃、回転数１８０ｒｐｍの条件下で、４８時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、Ｅｌｅｓｔｉｎ ＮＰ０３５ＳＰ（ネパジーン社製）を用いて、５分間隔で１分間欠し、合計４５分間、最大出力で超音波処理した。得られた無細胞抽出物（細胞除去抽出物）を、コバルトアフィニティ製レジン（Ｔａｌｏｎ（登録商標）、クロンテック社製）を用いて、製品付属の使用説明書に従い精製した。精製タンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質であることを確認した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、前記タンパク質の濃度を測定した。
【０１７０】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、以下のようにして、前記ＰＡＰ１４２７０の変異タンパク質（以下、「ｓｃＰＡＰ１４２７０」という）を構築した。
【０１７１】
まず、前記ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびプライマーに代えて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、下記センスプライマー７および下記アンチセンスプライマー７を用いた以外は前述と同様にして、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ＰＡＰ１４２７０をＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー７の配列は、前記ｐａｐ１４２７０遺伝子の全塩基配列における４３０番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、４２４−４４４番目の塩基配列に相当する。また、前記ＰＣＲは、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒および６８℃で７分を１サイクルとして３０サイクル繰り返して行った。
【０１７２】
センスプライマー７：（配列番号１５）
５′−ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣ−３′
アンチセンスプライマー７：（配列番号１６）
５′−ＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＣＣ−３′
【０１７３】
増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＤｐｎＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を用いて抽出した。エタノール沈殿後、取扱説明書に従って、得られた沈殿物をＪＭ１０９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ、東洋紡社製）にトランスフェクトした。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅＸｃｅｌｌ（バイオ−ラッド・ラボラトリー社製）を用いて、抽出プラスミド（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＥｘｔｒａｃｔＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）をＲｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ−２（ＤＥ３）（メルク社製）に導入し、変異ＰＡＰ１４２７０（ｓｃＰＡＰ１４２７０）の発現プラスミドｐＥＴ２８−ｓｃＰＡＰ１４２７０を得た。
【０１７４】
前記発現プラスミドｐＥＴ２８−ｓｃＰＡＰ１４２７０を用いた以外は、前記ＰＡＰ１４２７０と同様にして、形質転換体を作製し、ｓｃＰＡＰ１４２７０を過剰発現させて、精製した。精製したタンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質（ｓｃＰＡＰ１４２７０）であることを確認した。前記ｓｃＰＡＰ１４２７０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は、約４５ｋＤａであった。前記ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸配列を、配列番号１７に示し、前記アミノ酸配列をコードするｓｃＰＡＰ１４２７０遺伝子の塩基配列を、配列番号１８に示す。配列番号１７に示すアミノ酸配列において、１４４番目のシステインは、野生型のセリンから置換されている。配列番号１８に示す前記ｓｃＰＡＰ１４２７０遺伝子の塩基配列において、４３０番目のチミンは、野生型のアデニンから置換されている。
【０１７５】
＜実施例９＞
［プロリンペプチド生成測定］
本例では、プロリンベンジルエステル（Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ）を基質として用い、以下のようにして、実施例８のｓｃＰＡＰ１４２７０によるペプチド生成を測定した。
【０１７６】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）５０μＬに、ｓｃＰＡＰ１４２７０ ８．７μｇを含む酵素液４０μＬ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ プロリンベンジルエステル（バッケムＡＧ社製）５μＬおよびＤＭＳＯ ５μＬを加え、３７℃、９００ｒｐｍで３時間反応させた。反応終了後、メタノール２００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離（１００００ｒｐｍ、約１１０００×ｇ）した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＬＳ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＬＳ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。そして、各ペプチドの生成量を、ＭＳ分析により得られる、指定された分子量のイオン強度が示す面積から算出した。
【０１７７】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有メタノール、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：５％溶媒Ｂ
同 ５−３０分後：溶媒Ｂ濃度を５％から５０％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ３０−３５分後：５０％溶媒Ｂ
同 ３５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を５０％から８０％に変化させる
直線勾配グラジェント
検出条件：ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０１７８】
プロリンベンジルエステルを用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、プロリンベンジルエステルと、ｓｃＰＡＰ１４２７０との反応による生成物が確認された。
【０１７９】
図１９のグラフに、プロリンベンジルエステルを含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、プロリンベンジルエステル（Ｐ−ＯＢｚｌ）を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。
【０１８０】
図２０に、図１９における前記ピーク（ａ）〜（ｆ）のＭＳ分析結果を示す。以下、プロリンを「Ｐ」で示す。
【０１８１】
図２０において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は、それぞれ、図１９のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｃ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）およびピーク（ｆ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図２０（ａ）〜（ｆ）に示すＭＳ分析の結果から、図１９のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図１９のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌであり、図１９のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ２−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ３−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ４−ＯＢｚｌ」ということもある）であり、図１９のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（以下、「Ｐ５−ＯＢｚｌ」ということもある）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｐ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、５種類のペプチドＰ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。なお、図２０の各グラフ中の［Ｍ＋Ｈ］＋の値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いたｍ／ｚ値である。また、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＰＡＰ１４２７０を用いた場合には、アミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０１８２】
［ｐＨ］
ｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、ｐＨによるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、基質として、プロリンベンジルエステルを用い、前記緩衝液として、各所定ｐＨに調整したクエン酸−リン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ３．５−１１．５）を用いた以外は、前記プロリンペプチド生成測定と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８３】
図２１のグラフに、各ｐＨにおけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、ｐＨであり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、シクロ（Ｐ−Ｐ）はｐＨ８．５、Ｐ２−ＯＢｚｌはｐＨ６．５、Ｐ３−ＯＢｚｌはｐＨ８．５、Ｐ４−ＯＢｚｌはｐＨ８．５、Ｐ５−ＯＢｚｌはｐＨ９．５において、それぞれ最も生成量が高かった。このように、ｐＨにより、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８４】
［酵素量］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、酵素量によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、前記酵素液中のｓｃＰＡＰ１４２７０量を、所定濃度（０．５５、１．０９、２．１９、４．３８、８．７５、１７．５および３５μｇ）とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８５】
図２２のグラフに、各酵素量におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、酵素量（μｇ）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、０．５５〜８．７５μｇの酵素量では、シクロ（Ｐ−Ｐ）、Ｐ３−ＯＢｚｌ、Ｐ４−ＯＢｚｌの順に生成量が多く、Ｐ５−ＯＢｚｌは、ほとんど生成されなかった。これに対して、１７．５〜３５μｇの酵素量では、Ｐ３−ＯＢｚｌおよびＰ４−ＯＢｚｌに比べて、シクロ（Ｐ−Ｐ）およびＰ５−ＯＢｚｌの生成量が多かった。このように、反応系中の酵素量により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８６】
［基質濃度］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、基質濃度によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、プロリンベンジルエステル量を、所定濃度（５、１０、２５、５０および１００ｍｍｏｌ／Ｌ）とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８７】
図２３のグラフに、各基質濃度におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、６．２５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの基質濃度では、シクロ（Ｐ−Ｐ）の生成量が最も多く、Ｐ３−ＯＢｚｌおよびＰ４−ＯＢｚｌの生成量が次に多かった。これに対して、Ｐ２−ＯＢｚｌおよびＰ５−ＯＢｚｌは、生成量が少なかった。このように、反応系中の基質濃度により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１８８】
［反応時間］
本発明のｓｃＰＡＰ１４２７０について、以下のようにして、反応時間によるペプチド生成への影響を評価した。本評価においては、所定（０．５、１、１．５、３、６、１２および２４時間）の反応時間とした以外は、前記プロリンペプチド生成評価と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１８９】
図２４のグラフに、各反応時間におけるペプチド生成結果を示す。同図において、横軸は、反応時間（時間）であり、縦軸は、ピーク面積（ペプチド生成量の相対値）を示す。また、同図において、黒丸（●）は、シクロ（Ｐ−Ｐ）の結果であり、白丸（○）は、Ｐ−ＯＢｚｌの結果であり、黒三角は、Ｐ２−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（■）は、Ｐ３−ＯＢｚｌの結果であり、黒四角（◆）は、Ｐ４−ＯＢｚｌの結果であり、×は、Ｐ５−ＯＢｚｌの結果である。同図に示すように、０．５〜３時間においては、Ｐ２−ＯＢｚｌ、Ｐ４−ＯＢｚｌおよびＰ５−ＯＢｚｌに比べて、シクロ（Ｐ−Ｐ）およびＰ３−ＯＢｚｌの生成量が高かった。これに対して、６〜２４時間においては、シクロ（Ｐ−Ｐ）の生成量が高く、その他のペプチドは減少した。このように、反応時間により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。
【０１９０】
＜実施例１０＞
［へテロオリゴペプチド生成測定］
本例では、アシル供与体として、プロリンベンジルエステル（Ｐ−ＯＢｚｌ）を用い、アシル受容体として、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を用い、以下のようにして、実施例８のｓｃＰＡＰ１４２７０によるペプチド生成を測定した。なお、前記アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、アルギニン、ヒスチジン、バリン、ヒドロキシプロリン、トレオニン、グリシン、リシン、アラニン、システイン、プロリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを用いた。また、前記アミノ酸誘導体としては、アミノ酸ベンジルエステル、アミノ酸メチルエステルおよびアミノ酸エチルエステルを用いた。本測定では、前記ＤＭＳＯに代えて、前記アシル受容体 ５μＬを所定濃度で添加して反応させた以外は、実施例８と同様にして、ＬＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド生成量を算出した。
【０１９１】
図２５〜２７のグラフに、前記アシル受容体のうち、下記表５記載のアミノ酸誘導体を含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。図２５〜２７のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。なお、図２５〜２７の各グラフ中のｍ／ｚ値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いた［Ｍ＋Ｈ］＋の値である。
【０１９２】
【表５】
【０１９３】
図２５（Ａ）中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トリプトファンベンジルエステル（Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ、Ｗ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｇ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＹのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｗ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｗ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ａ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｗ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｗ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｗ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｗ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｗ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９４】
図２５（Ｂ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トリプトファンメチルエステル（Ｔｒｐ−ＯＭｅ、Ｗ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｗ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｗ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｗ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｗ−ＯＭｅと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９５】
図２５（Ｃ）中の（ａ）〜（ｈ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、フェニルアラニンエチルエステル（Ｐｈｅ−ＯＥｔ、Ｆ−ＯＥｔ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｈ）のピークに示される、８つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｆ−ＯＥｔであり、図２５（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｆ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｆ−ＯＥｔにＰが結合したＰ−Ｆ−ＯＥｔ（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｃ）のピーク（ｈ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｆ−ＯＥｔのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｆ−ＯＥｔおよびシクロ（Ｐ−Ｆ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９６】
図２５（Ｄ）中の（ａ）〜（ｇ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、チロシンベンジルエステル（Ｔｙｒ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｇ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＹのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｙ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｙ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｙ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｙ−ＯＢｚｌ（Ｐ−Ｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｄ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｙ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｙ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｙ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９７】
図２５（Ｅ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、チロシンメチルエステル（Ｔｙｒ−ＯＭｅ、Ｙ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｅ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｙ−ＯＭｅであり、図２５（Ｅ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｙ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｙ−ＯＭｅ（Ｐ−Ｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｅ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｙ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｙ−ＯＭｅと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９８】
図２５（Ｆ）中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、イソロイシンベンジルエステル（Ｉｌｅ−ＯＢｚｌ、Ｉ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｅ）のピークに示される、５つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２５（Ｆ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｉ−ＯＢｚｌであり、図２５（Ｆ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２５（Ｆ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｉ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｉ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｉ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｗ−ＯＢｚｌと、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０１９９】
図２６（Ａ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、ロイシンベンジルエステル（Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｌ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｌ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｌ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｌ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｌ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｌ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２００】
図２６（Ｂ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、ロイシンメチルエステル（Ｌｅｕ−ＯＭｅ、Ｌ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｌ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｌ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｌ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｌ−ＯＭｅおよびシクロ（Ｐ−Ｌ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０１】
図２６（Ｃ）中の（ａ）〜（ｄ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、メチオニンメチルエステル（Ｍｅｔ−ＯＭｅ、Ｍ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｄ）のピークに示される、４つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｍ−ＯＭｅであり、図２６（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｍ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｍ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＯＭｅ）であり、図２６（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｍ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｍ−ＯＭｅと、２種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０２】
図２６（Ｄ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、アラニンベンジルエステル（Ａｌａ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＡのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ａ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ａ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ａ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ａ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ａ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ａ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ａ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０３】
図２６（Ｅ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、リシンベンジルエステル（Ｌｙｓ−ＯＢｚｌ、Ｋ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｅ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｋ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｅ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｋ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｋ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｅ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｋ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｌ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０４】
図２６（Ｆ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、グリシンベンジルエステル（Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ、Ｇ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２６（Ｆ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＧのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｇ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｇ−ＯＢｚｌであり、図２６（Ｆ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｇ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｇ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２６（Ｆ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｇ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｇ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｇ）と、３種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０５】
図２７（Ａ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、トレオニンベンジルエステル（Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ、Ｔ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｔ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｔ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｔ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｔ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｔ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０６】
図２７（Ｂ）中の（ａ）〜（ｅ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、バリンベンジルエステル（Ｖａｌ−ＯＢｚｌ、Ｖ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｅ）のピークに示される、５つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｂ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｖ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ｂ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｂ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｖ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｖ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｖ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｖ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０７】
図２７（Ｃ）中の（ａ）〜（ｆ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、セリンベンジルエステル（Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ、Ｓ−ＯＢｚｌ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｆ）のピークに示される、６つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｃ）のピーク（ａ）の生成物は、Ｓ−ＯＢｚｌであり、図２７（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｓ−ＯＢｚｌにＰが結合したＰ−Ｓ−ＯＢｚｌ（Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｃ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｓ−ＯＢｚｌのＣ末端側にプロリンが転移したペプチドＰ−Ｓ−ＯＢｚｌと、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０８】
図２７（Ｄ）中の（ａ）〜（ｈ）は、検出された各ピークである。同図に示すように、アシル受容体として、フェニルアラニンメチルエステル（Ｐｈｅ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ）を用いた反応の結果、（ａ）〜（ｈ）のピークに示される、７つの生成物が確認された。ＭＳ分析の結果、図２７（Ｄ）のピーク（ａ）の生成物は、フェニルアラニン（Ｆ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｂ）の生成物は、Ｐ−ＰのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｐ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｃ）の生成物は、Ｆ−ＯＭｅであり、図２７（Ｄ）のピーク（ｄ）の生成物は、Ｆ−ＯＭｅにＰが結合したＰ−Ｆ−ＯＭｅ（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｅ）の生成物は、Ｐ−ＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（Ｐ−Ｆ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｆ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに２分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ３−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｇ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに３分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ４−ＯＢｚｌ）であり、図２７（Ｄ）のピーク（ｈ）の生成物は、Ｐ−ＯＢｚｌに４分子のＰが連続して結合したＰ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ（Ｐ５−ＯＢｚｌ）であることが示された。すなわち、ｓｃＰＡＰ１４２７０のアミノ酸結合活性により、Ｆ−ＯＭｅのＣ末端側にプロリンが転移した、２種類のペプチドＰ−Ｆ−ＯＭｅおよびシクロ（Ｐ―Ｆ）と、４種類のプロリンペプチドＰ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＯＢｚｌおよびシクロ（Ｐ−Ｐ）が生成した。
【０２０９】
図２８に、前記各アシル受容体のｌｏｇＰ値と生成したジペプチドエステルとの関係を示す。同図において、横軸は、前記各アシル受容体のアミノ酸部分の番号であり、縦軸は、ｌｏｇＰである。なお、前記アミノ酸部分の番号は、同図中に示すアミノ酸の番号に対応する。また、同図において、白丸（○）のプロットは、アミノ酸ベンジルエステルの結果であり、白四角（□）のプロットは、アミノ酸メチルエステルの結果であり、白三角（△）のプロットは、アミノ酸エチルエステルの結果であり、白菱形（◇）のプロットは、遊離アミノ酸の結果である。なお、ヘテロプロリンペプチドが生成された誘導体の結果は、前記プロットの色を白から黒に変えている。なお、前記へテロプロリンペプチドは、アシル受容体にプロリンが結合したペプチド（Ｐ−Ｘ−ＯＹ、Ｘ＝アミノ酸、Ｙ＝Ｂｚｌ、ＭｅまたはＥｔ）である。また、同図中の文字「ｃ」は、シクロペプチドの生成を示し、アスタリスクは、反応液中のプロリンベンジルエステル濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌであることを示す。
【０２１０】
図２８に示すように、前記アシル受容体として、Ｓ−ＯＢｚｌ、Ｖ−ＯＢｚｌ、Ｔ−ＯＢｚｌ、Ｇ−ＯＢｚｌ、Ｋ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ、Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｍ−ＯＭｅ、Ｌ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＭｅ、Ｉ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＢｚｌ、Ｙ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＥｔ、Ｗ−ＯＢｚｌおよびＷ−ＯＭｅを用いた場合には、前記ヘテロプロリンペプチドが生成した。このうち、Ｇ−ＯＢｚｌ、Ａ−ＯＢｚｌ、Ｐ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＢｚｌ、Ｌ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＭｅ、Ｆ−ＯＥｔおよびＷ−ＯＢｚｌを用いた場合には、シクロペプチドが生成した。このように、アシル受容体の種類により、生成するペプチドの種類を制御できることが示された。なお、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＰＡＰ１４２７０は、いずれのアシル受容体を用いた場合にも、アミノ酸転移反応を示さなかった。
【０２１１】
＜実施例１１＞
本例では、活性中心をシステインに置換した、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８由来アミノペプチダーゼ（以下、「アミノリシンＡ」という。）を、以下のようにして作製した。
【０２１２】
［Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子のクローニング］
まず、以下のようにして、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来アミノペプチダーゼ遺伝子（以下、「Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子」という）をクローニングした。
【０２１３】
アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ４３０６８の菌体より、前記ホップウッドらの方法によりゲノムＤＮＡを調製した。他方、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の他の菌株における、アミノペプチダーゼと推定される遺伝子の保存領域から、下記センスプライマー８およびアンチセンスプライマー８を合成した。前記アミノペプチダーゼと推定される遺伝子としては、ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＶ ３１４４、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳＣＯ ５１２２およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のＳＧＲ ２４０７を用いた。
【０２１４】
センスプライマー８：（配列番号１９）
５′−ＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＣＴＣＣＧＴＡ−３′
アンチセンスプライマー８：（配列番号２０）
５′−ＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧ−３′
【０２１５】
前記ＡＴＣＣ４３０６８のゲノムＤＮＡ、前記センスプライマー８およびアンチセンスプライマー８を用いた以外は、実施例８と同様にして、ＰＣＲを行い、クローニングおよびシークエンスし、前記Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を用いて、実施例８と同様にして、発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ９−ＡＣＡＰを作製し、形質転換体を得た。そして、前記形質転換体を用いた以外は、実施例８と同様にして、前記Ｓ９−ＡＣＡＰを過剰発現させた。なお、前記Ｓ９−ＡＣＡＰ遺伝子の全塩基配列および前記Ｓ９−ＡＣＡＰのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪデータベースのＡ．Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ １１Ｂ ゲノムプロジェクトのローカスタグＡｃｅｌ＿１４８９（http://gib.genes.nig.ac.jp/single/main.php?spid=Acel_11B）に開示されている。
【０２１６】
［変異タンパク質の構築］
つぎに、下記センスプライマー９を用いた以外は、実施例８と同様にして、前記発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ９−ＡＣＡＰをＰＣＲに供した。なお、下記センスプライマー９の配列は、前記Ｓ９−ＡＣＡＰの全塩基配列における１４７１番目のＡ（アデニン）をＴ（チミン）に変更した、１４５６−１４８５番目の塩基配列に相当する。得られたＤＮＡ断片を用いた以外は、実施例８と同様にして、発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ４９１Ｃを作製した。
【０２１７】
センスプライマー９：（配列番号２１）
５′−ＧＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧ−３′
【０２１８】
前記発現プラスミドｐＥＴ２８−Ｓ４９１Ｃを用いた以外は、実施例８と同様にして、アミノリシンＡを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を、還元条件下、クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて分析し、単一のタンパク質（アミノリシンＡ）であることを確認した。前記アミノリシンＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は、約７０ｋＤａであった。前記アミノリシンＡのアミノ酸配列を、配列番号２２に示し、前記アミノ酸配列をコードするアミノリシンＡ遺伝子の塩基配列を、配列番号２３に示す。配列番号２２に示すアミノ酸配列において、４９１番目のシステインは、野生型のセリンから置換されている。配列番号２３に示す塩基配列において、１４７１番目のチミンは、野生型のアデニンから置換されている。
【０２１９】
＜実施例１２＞
［ホモオリゴペプチド生成分析］
本例では、下記表６のアミノ酸誘導体を基質として用い、以下のようにして、実施例９のアミノリシンＡによるペプチド生成を分析した。
【０２２０】
【表６】
【０２２１】
まず、０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、アミノリシンＡ １０μｇ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ アミノ酸誘導体および１０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯを加え、反応液 １００μＬを調製した。この反応液を、５０℃、９００ｒｐｍで６時間反応させた。反応終了後、１０ｖ／ｖ％ ギ酸／メタノール／ＤＭＳＯ混合液（容積比１：１：１）３００μＬを加えて反応を停止させ、遠心分離（１０００ｒｐｍ）した。遠心分離後、上層２０μＬを採取し、ＬＳ／ＭＳ分析に供した。なお、前記ＬＳ／ＭＳ分析は、下記に示す分析条件で行った。そして、各ペプチドの生成量を、ＵＶクロマトグラム（測定波長２１０ｎｍ）におけるピーク面積から算出した。
【０２２２】
（分析条件）
分析機器：２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ウォーターズ社製）、
２４８７ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
（ウォーターズ社製）、
ＡＰＩ ２０００（商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
（アプライドバイオシステム社製）
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製、５ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ）
移動相： 溶媒Ａ：０．１体積％ギ酸含有水、
溶媒Ｂ：０．１体積％ギ酸含有メタノール、
流速０．２ｍＬ／分
ＬＣ条件：移動開始０−５分後：２０％溶媒Ｂ
同 ５−４０分後：溶媒Ｂ濃度を２０％から９９％に変化させる
直線勾配グラジェント
同 ４０−４５分後：９９％溶媒Ｂ
検出条件：ＵＶ２１０ｎｍの吸収
【０２２３】
前記表６のアミノ酸誘導体を用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。すなわち、アミノ酸誘導体と、アミノリシンＡとの反応による生成物が確認された。
【０２２４】
図２９のグラフに、前記表６のアミノ酸誘導体を含む反応液における、トータルイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図において、（Ａ）は、ＬＦ−ＮＨ２の結果であり、（Ｂ）は、ＬＦ−ＯＭｅの結果であり、（Ｃ）は、ＬＦ−ＯＥｔの結果であり、（Ｄ）は、ＤＦ−ＯＭｅの結果であり、（Ｅ）は、ＤＦ−ＯＢｚｌの結果であり、（Ｆ）は、ＬＬ−ＯＢｚｌの結果であり、（Ｇ）は、ＤＬ−ＯＢｚｌの結果である。同図中の（ａ）〜（ｚ６）は、検出された各ピークである。同図に示すように、前記アミノ酸誘導体を基質とする反応の結果、（ａ）〜（ｙ）のピークに示される、２５の生成物が確認された。図３０〜３４に、図２９における前記ピーク（ａ）〜（ｚ６）のＭＳ分析結果を示す。なお、図３０〜３４の各グラフ中の［Ｍ＋Ｈ］＋の値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ペプチドの確認に用いたｍ／ｚ値である。
【０２２５】
図３０において、グラフ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ、図２９（Ａ）のピーク（ａ）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｃ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｅ）、ピーク（ｆ）およびピーク（ｇ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３０（ａ）〜（ｇ）に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ａ）のピーク（ａ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２にＬＦが結合したＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｃ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｄ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｅ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であり、図２９（Ａ）のピーク（ｆ）の生成物は、４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ａ）のピーク（ｇ）の生成物は、ＬＦ−ＮＨ２に４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２であることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＮＨ２のＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、７種類のペプチドＬＦ−ＬＦ，ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦおよびＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＮＨ２が生成した。
【０２２６】
図３１において、グラフ（ｚ１）、（ｂ）、（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｆ）、（ｊ）および（ｋ）は、それぞれ、図２９（Ｂ）のピーク（ｚ１）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｄ）、ピーク（ｈ）、ピーク（ｉ）、ピーク（ｆ）、ピーク（ｊ）およびピーク（ｋ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３１に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｂ）のピーク（ｚ１）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅ（基質）であり、図２９（Ｂ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｄ）の生成物は、３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図２９（Ｂ）のピーク（ｉ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｆ）の生成物は、４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｊ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであり、図２９（Ｂ）のピーク（ｋ）の生成物は、ＬＦ−ＯＭｅに４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＯＭｅのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、６種類のペプチドＬＦ−ＬＦ，ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＭｅおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０２２７】
図３２において、グラフ（ｚ２）、（ｂ）、（ｈ）、（ｌ）、（ｍ）および（ｎ）は、それぞれ、図２９（Ｃ）のピーク（ｚ１）、ピーク（ｂ）、ピーク（ｈ）、ピーク（ｌ）、ピーク（ｍ）およびピーク（ｎ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３２に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｃ）のピーク（ｚ２）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔ（基質）であり、図２９（Ｃ）のピーク（ｂ）の生成物は、ＬＦにＬＦが結合したＬＦ−ＬＦであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｈ）の生成物は、ＬＦ−ＬＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）であり、図２９（Ｃ）のピーク（ｌ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに２分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｍ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに３分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであり、図２９（Ｃ）のピーク（ｎ）の生成物は、ＬＦ−ＯＥｔに４分子のＬＦが連続して結合したＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＦ−ＯＥｔのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、６種類のペプチドＬＦ−ＬＦ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔ、ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＬＦ−ＯＥｔおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＦ−ＬＦ）が生成した。
【０２２８】
図３３において、グラフ（ｚ３）、（ｚ４）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）および（ｒ）は、それぞれ、図２９（Ｄ）および（Ｅ）のピーク（ｚ３）、（ｚ４）、ピーク（ｏ）、ピーク（ｐ）、ピーク（ｑ）およびピーク（ｒ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３３に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｄ）のピーク（ｚ３）の生成物は、ＤＦ−ＯＭｅ（基質）であり、図２９（Ｅ）のピーク（ｚ４）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｄ）および（Ｅ）のピーク（ｏ）の生成物は、ＤＦ−ＤＦのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＦ−ＤＦ）であり、図２９（Ｅ）のピーク（ｐ）の生成物は、ＤＦにＤＦが結合したＤＦ−ＤＦであり、図２９（Ｅ）のピーク（ｑ）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌにＤＦが結合したＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｅ）のピーク（ｒ）の生成物は、ＤＦ−ＯＢｚｌに２分子のＤＦが連続して結合したＤＦ−ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＤＦ−ＯＢｚｌのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＤＦ−ＤＦ，ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌ、ＤＦ−ＤＦ−ＤＦ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＤＦ−ＤＦ）が生成した。
【０２２９】
図３４において、グラフ（ｚ５）、（ｚ６）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）および（ｙ）は、それぞれ、図２９（Ｆ）および（Ｇ）のピーク（ｚ５）、ピーク（ｚ６）、ピーク（ｓ）、ピーク（ｔ）、ピーク（ｕ）、ピーク（ｖ）、ピーク（ｗ）、ピーク（ｘ）およびピーク（ｙ）のＭＳスペクトルプロファイルである。図３４に示すＭＳ分析の結果から、図２９（Ｆ）のピーク（ｚ５）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｇ）のピーク（ｚ６）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌ（基質）であり、図２９（Ｆ）のピーク（ｓ）の生成物は、ＬＬ−ＬＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）であり、図２９（Ｆ）のピーク（ｔ）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌに３分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｆ）のピーク（ｕ）の生成物は、ＬＬ−ＯＢｚｌに４分子のＬＬが連続して結合したＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｖ）の生成物は、ＤＬにＤＬが結合したＤＬ−ＤＬであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｗ）の生成物は、ＤＬ−ＤＬのＣ末端とＮ末端とが結合により環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）であり、図２９（Ｇ）のピーク（ｘ）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌにＤＬが結合したＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌであり、図２９（Ｇ）のピーク（ｙ）の生成物は、ＤＬ−ＯＢｚｌに２分子のＤＬが連続して結合したＤＬ−ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌであることが示された。すなわち、アミノリシンＡのアミノ酸結合活性により、ＬＬ−ＯＢｚｌのＣ末端側にロイシンが転移した、２種類のペプチド、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌ、ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＬＬ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＬＬ−ＬＬ）が生成し、ＤＬ−ＯＢｚｌのＣ末端側にフェニルアラニンが転移した、３種類のペプチドＤＬ−ＤＬ、ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌ、ＤＬ−ＤＬ−ＤＬ−ＯＢｚｌおよびジペプチドが環化したシクロ（ＤＬ−ＤＬ）が生成した。
【０２３０】
なお、非置換型酵素であるアミノペプチダーゼＳ９−ＡＣＡＰを用いた場合には、アミノ酸転移反応は確認されなかった。
【０２３１】
＜実施例１３＞
［へテロオリゴペプチド生成評価］
本例では、アシル供与体として、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ プロリンメチルエステルを用い、アシル受容体として、２２．５ｍｍｏｌ／Ｌ アミンを用い、５ｖ／ｖ％ギ酸 ２００μＬを用いて反応を停止した以外は、実施例１１と同様にして、ペプチド生成を評価した。下記表７に、前記アミン（アミノ酸）を示す。
【０２３２】
【表７】
【０２３３】
前記表７のアミンを用いた反応液のトータルイオンクロマトグラムにおいて、新たなピークが検出された。前記ピークには、プロリンおよびメチオニン残基を有するヘテロジペプチドのピークが含まれた。すなわち、プロリンメチルエステルと前記アミンと前記アミノリシンＡとの反応による、ヘテロオリゴペプチドの生成が確認された。
【０２３４】
図３５のグラフに、プロリンメチルエステルおよび前記表７のアミンを含む反応液における、前記へテロジペプチドのイオンクロマトグラム結果を示す。同図のグラフにおいて、横軸は、リテンション時間（分）であり、縦軸は、イオン強度を示す１秒あたりのイオンカウント（ｃ．ｐ．ｓ．）である。同図中の矢印は、検出されたヘテロジペプチド（Ｆ−Ｘ、Ｘはアミン由来のアミノ酸残基）のピークである。同図に示すように、前記アミンを基質とする反応の結果、矢印のピークに示される、１５のヘテロジペプチドが確認された。下記表８に、生成した各ヘテロジペプチドを示す。なお、同図中のｍ／ｚ値は、前記ＬＳ／ＭＳ分析において、各ヘテロジペプチドの確認に用いた［Ｍ＋Ｈ］＋の値である。なお、本例の反応では、アスタリスクのピークに示される、シクロ（Ｆ−Ｆ）も確認された（ｍ／ｚ＝２９５）。
【０２３５】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２３６】
本発明によれば、組換アミノ酸転移酵素を用いるため、酵素を、低コストで、簡便にかつ高収率で得ることが可能である。このため、例えば、オリゴペプチドの酵素合成法を、実用化（工業化）することも容易になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、
活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、
前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つの残基である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素である請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１記載のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、
前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする組換アミノ酸転移酵素。
【請求項５】
下記に示す反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒する請求項４記載の組換アミノ酸転移酵素。
反応（１）
【化１】
前記反応（１）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）または水酸基（−ＯＨ）であり、
Ｒ１は、
【化２】
であり、基質である各アミド化合物において、ＸおよびＲ１は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。
反応（２）
【化３】
前記反応（２）において、Ｙは、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはエトキシ基（−ＯＥｔ）であり、
Ｒ２は、
【化４】
であり、基質である各アミド化合物において、Ｒ２は、同一でもよく、異なってもよい。
反応（３）
【化５】
前記反応（３）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、
Ｒ３およびＲ３’は、
【化６】
であり、基質である各アミド化合物において、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。
反応（４）
【化７】
前記反応（４）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、
Ｒ４は、
【化８】
である。
反応（５）
【化９】
反応（６）
【化１０】
前記反応（６）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
反応（７）
【化１１】
前記反応（７）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
反応（８）
【化１２】
前記反応（８）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
【請求項１】
組換アミノ酸転移酵素のスクリーニング方法であって、
活性中心のセリン残基が、セリン残基以外のアミノ酸残基に置換された組換アミノ酸転移酵素を提供する工程と、
前記組換アミノ酸転移酵素の酵素反応を調べ、前記酵素反応が新規な酵素反応であるか否かを判定する工程とを含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記置換されたセリン以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つの残基である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素である請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１記載のスクリーニング方法によって得られた組換アミノ酸転移酵素であって、
前記置換されたセリン残基以外のアミノ酸残基が、システイン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される一つのアミノ酸残基であり、前記提供されるアミノ酸転移酵素が、アミノペプチダーゼの活性中心のセリン残基を他のアミノ酸に置換して得られる酵素であることを特徴とする組換アミノ酸転移酵素。
【請求項５】
下記に示す反応（１）〜（８）の少なくとも一つの反応を触媒する請求項４記載の組換アミノ酸転移酵素。
反応（１）
【化１】
前記反応（１）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）または水酸基（−ＯＨ）であり、
Ｒ１は、
【化２】
であり、基質である各アミド化合物において、ＸおよびＲ１は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。
反応（２）
【化３】
前記反応（２）において、Ｙは、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはエトキシ基（−ＯＥｔ）であり、
Ｒ２は、
【化４】
であり、基質である各アミド化合物において、Ｒ２は、同一でもよく、異なってもよい。
反応（３）
【化５】
前記反応（３）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、
Ｒ３およびＲ３’は、
【化６】
であり、基質である各アミド化合物において、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ同一でもよく、異なってもよい。
反応（４）
【化７】
前記反応（４）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）であり、
Ｒ４は、
【化８】
である。
反応（５）
【化９】
反応（６）
【化１０】
前記反応（６）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
反応（７）
【化１１】
前記反応（７）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
反応（８）
【化１２】
前記反応（８）において、Ｘは、メトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンゾキシ基（−ＯＢｚｌ）またはアミノ基（−ＮＨ２）である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２０１０−２３３５６４（Ｐ２０１０−２３３５６４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４８４３６（Ｐ２０１０−４８４３６）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
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