アルギン酸分解処理剤およびその製造方法
【課題】アルギン酸分解処理を簡便かつ低コストで行う手法を提供し、海藻類のバイオマス資源としての活用を促進する。
【解決手段】海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素を、イオン交換樹脂などの吸着剤に吸着させて、アルギン酸分解処理剤とする。培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることが好ましい。また、培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることが好ましい。海水塩を含む培地で菌類を培養することが好ましい。
【解決手段】海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素を、イオン交換樹脂などの吸着剤に吸着させて、アルギン酸分解処理剤とする。培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることが好ましい。また、培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることが好ましい。海水塩を含む培地で菌類を培養することが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸分解処理剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、褐藻類の細胞間を充填する粘性多糖類であり、マンヌロン酸とグルロン酸の２つのウロン酸ユニットが、１，４グルコシド結合で結合した直鎖の高分子である。アルギン酸は、水溶液にしたときに高い粘性を示すことから、増粘剤や安定化剤などとして、食品添加物、化粧品、繊維、水処理剤、製薬剤用の基材や医療用材料などに利用されている。
【０００３】
また、アルギン酸を分解させて得られる分解生成物は、植物の成長促進や人体の腸内の有用細菌であるビフィズス菌の増殖活性などの生理活性を有することが知られており、さらに、これをオリゴ糖および食物繊維として活用することに向けた研究開発も進められている。
【０００４】
しかしながら、アルギン酸水溶液は上記のように非常に粘性が高く、水溶液中のカルシウムなどと容易に金属塩を作りゲル化するためにアルギン酸を分解することが容易ではない。従来、アルギン酸の分解は、酸やアルカリを用いる方法、熱および圧力を用いる方法などで行われていたが、いずれも設備やコストなどの面で工業的に採用するには適していなかった。
【０００５】
上記従来法に代わるものとして、酵素を用いてアルギン酸を分解する方法が開発されている。この酵素分解法は、アルギン酸を特異的に分解する酵素であるアルギン酸分解酵素（主にアルギン酸リアーゼ＝アルギナーゼ）を添加して分解させる方法であり、従来法に比べて安全性や操作などの点で優れている。
【０００６】
アルギン酸リアーゼは、褐藻類に対して高い食性を示す食藻軟体類（サザエやアワビなど）の消化液中に多く含まれていることが知られている。ところが、食藻軟体類に含まれるアルギン酸リアーゼは一般に比活性が高く褐藻類アルギン酸の分解には最適と思われるものの、食藻軟体類自体が高価であるために工業的利用が難しく、現在は研究目的の利用に止まっている（J.Prot.Chem.,15,1996）。また、市販されているアルギン酸リアーゼもきわめて高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年では海藻類をバイオマス資源として活用する研究が進んでいるが、アルギン酸粘膜の存在によって本体部分のセルラーゼや利用しやすい多糖類が保護されており、実用的な活用が難しい。したがって、高粘度で難分解性である褐藻類アルギン酸をバイオマス資源としての用途に用いる場合、これを分解し低分子化する簡便な工業的技術の確立が望まれる。
【０００８】
本発明者らは、廃棄ワカメなどをバイオマス資源として利用するために、糖化分解処理として、当初は硫酸分解法や過酸化水素分解などの手法を行ってきた。しかし、薬品の使用濃度が高く、操作が危険な上に実験機材にも材質的な配慮が必要であり、しかも糖化後にこれらの酸成分や未反応薬剤を除去することに大変な手間がかかった。
【０００９】
また、原料の低分子化には成功したものの、得られた糖類の分子量が大きくばらつく上に、反応が過剰な場合には部分的に炭化してしまうことがあり、こうした処理後の成分の調整や除去までが必要になっていた。
【００１０】
そこで、酵素処理を行うべく、植物性成分の一般的な処理と同様にセルラーゼとヘミセルラーゼを組み合わせてワカメの粉砕物への適用を試みたが、全炭水化物成分に対する糖化率は１％にも及ばなかった。次に、市販のアルギン酸リアーゼ（ナガセケムテック社製）を入手し、アルギン酸リアーゼ処理の後にセルラーゼ処理を行ったところ、容易に全炭水化物成分の５０％以上の糖化率を得ることができた。
【００１１】
ところが、前述したように市販アルギン酸リアーゼはきわめて高価な試薬であり、廃棄ワカメなどのバイオマス資源化のための糖化処理に活用できるような汎用的な酵素剤製品ではない。
【００１２】
こうした実験と考察を踏まえて、本発明者らは、アルギン酸リアーゼを適用して簡便かつ安価にアルギン酸を分解することを可能にするための手法を開発するべく鋭意研究と試験を重ねてきた。
【００１３】
本発明者らは、まず、アルギン酸リアーゼの精製に使用する元の菌として、高価な食藻軟体類に代えて使用し得る他の海洋植物を模索した。前述したように、アルギン酸リアーゼは、一般的には海洋細菌類の培養とその培養液中に分泌生産される酵素の精製によって製造されており、その元の菌は、アワビ、サザエなどの高価な食藻軟体類の内臓から得てきた。しかし、本発明者らの文献調査によれば、タイの内臓、カキ、海底汚泥、佃煮工場排水や穴あき症の昆布などから得た菌類からアルギン酸リアーゼを得たという報告があった。
【００１４】
そこで、本発明者らは、容易に入手可能であり海藻も食べる食性のあるタイに注目した。また、同様に海藻食性のあるアイゴも入手できた。通常は廃棄されるこれらの腸内物からアルギン酸リアーゼを分泌する菌類を得ることができれば、酵素原料を安価に入手することができるようになり、工業的用途への道が大きく開けることになる。
【００１５】
次に、このようにして得た酵素原料の精製について考察した。前述のように従来は海洋細菌類の培養液中に分泌生産される酵素原料を精製することでアルギン酸リアーゼを製造するのが一般的な手法であり、その際の精製方法は、ほぼ確立したタンパク質の分離法同様の手順にしたがっている。つまり、アルギン酸分解リアーゼを産生する微生物を培養し、その培養液上澄みの遠心分離による粗素液の分離、イオン交換およびクロマトグラフィーなどによる精製、透析による脱塩、限外ろ過などによる濃縮、ゲルろ過などの手段を組み合わせて実施している。
【００１６】
たとえば、特開平９−９９６２号公報では、得られた培養液を遠心分離によって菌体と上澄み液に分離し、この上澄み液を硫化アンモニウムを用いた塩析によってタンパク質の沈殿を得、この沈殿物を透析処理によって脱塩して、粗酵素液を得る。この粗酵素液を陰イオンカラムクロマトグラフィーにかけて、ＮａＣｌで溶出させて活性部分を得て、限外ろ過膜によって濃縮する。次いで、ゲルクロマトグラフィーによって酵素活性部分をとり、限外ろ過膜によって濃縮する。さらなる精製には、陰イオンクロマトとゲルろ過クロマトを繰り返し行う。
【００１７】
また、特開平６−２１７７７４号公報では、粗酵素を陽イオン交換樹脂カラムに吸着させる。溶出にはリン酸バッファーのＮａＣｌ溶液を０〜０．５モルまで順次上げた濃度勾配法を適用する。溶出した酵素活性部分を限外ろ過膜によって濃縮し、これをさらにゲルろ過クロマトグラフィーにて精製を行う。この最初のイオン交換法によって、アルギン酸の分解機能が異なる酵素に分離できる。
【００１８】
また、高粘性の粗酵素溶液はカラムクロマトグラフィーが困難であることを考慮して、特開２０００−３４２２７８号公報では、バッチ法によって陰イオン交換を行っている。すなわち、５０ｍＭ緩衝液に平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースに試料を加えて数分間撹拌し、その後グラスフィルターに移して吸引ろ過を行う。ろ液の酵素活性が無くなるまでＮａＣｌの濃度を徐々に上げていき、酵素活性のある画分を集めて、それを限外ろ過濃縮し、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、ｐＨ６〜８のｐＨ勾配をかけたところ、活性は素通り画分にのみ認められたと記載されている。
【００１９】
つまり、従来公知のアルギン酸リアーゼ精製方法は、適切な培地（たとえばZobellやDavisなど）においてアルギン酸リアーゼ産生菌を培養し、培養液中の酵素タンパク質を硫酸アンモニウム塩析によって回収・濃縮し、陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂による吸着を行い、この担体をクロマト溶出にかけて活性部分を収集し、さらにゲルろ過によるクロマトグラフィー分離を２〜４回繰り返すことによって、精製を行うものであった。
【００２０】
この精製方法では、カラムに充填してからその吸着剤より溶出させるので、フラクションコレクターを用いて、試料分離のために多くの試験管を使い、しかもクロマトグラフィーに約１０時間もの長時間を要するものであって、時間と手間が何度も繰り返し必要である。
【００２１】
さらに、この繰り返しのクロマト操作ごとに、酵素の純度は向上するもののアルギン酸リアーゼの活性が低下していき、通常市販されている酵素剤では、培養した培地液における酵素活性総量の２０％以下まで低下してしまうことが分かった。
【００２２】
また、アルギン酸分解リアーゼの分解性には、アルギン酸を構成するマンヌロン酸とグルロン酸の２通りのウロン酸ユニットに対して作用することから、マンヌロン酸ユニット分解型、グルクロン酸ユニット分解型、およびこれらの両方を並行分解する型の３種類がある。アルギン酸分解リアーゼ酵素の精製に関する前記従来技術の中にはそれらを分離することまでも研究するものがあるが、こうしたアルギン酸分解酵素の分類やそのための精製操作は、本発明者らにとってはアルギン酸分解活性を低下させるばかりか、分解機能の多様性を狭めてしまうことになるために必要のないことと考えられた。
【００２３】
このように煩雑な操作を通じて精製を行っているために市販のアルギナーゼは高価になり、バイオマスの活用のような工業的な糖化処理に使用できるような経済性を持つものにならない。
【００２４】
したがって、本発明の課題は、海洋資源のバイオマス活用などの工業的糖化処理にも有意に使用することができるような経済性に優れた新規なアルギン酸分解処理剤およびその製造方法を提供することである。
【００２５】
本発明の他の課題は、現在ではほとんどが廃棄処理されている魚介類の有効利用の道を開き、そこから得た菌類の培養液中に得られる酵素のアルギン酸分解活性に着目してアルギン酸分解処理に用いることである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記課題を解決するため、請求項１に係る本発明は、アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものであることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤である。
【００２７】
請求項２に係る本発明は、請求項１記載のアルギン酸分解処理剤において、前記アルギン酸分解酵素は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素であることを特徴とする。
【００２８】
請求項３に係る本発明は、請求項１または２記載のアルギン酸分解処理剤において、前記吸着剤は、イオン交換樹脂であることを特徴とする。
【００２９】
請求項４に係る本発明は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類を培養してアルギン酸分解活性を有する酵素を含む培養液を取り、この培養液を吸着剤に吸着させることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤の製造方法である。
【００３０】
請求項５に係る本発明は、請求項４記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、前記培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることを特徴とする。
【００３１】
請求項６に係る本発明は、請求項４または５記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、前記培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることを特徴とする。
【００３２】
請求項7に係る本発明は、請求項４ないし６のいずれか記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、海水塩を含む培地で前記菌類を培養することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものを直接的にアルギン酸分解処理に用いることができるので、従来の酵素精製に伴う煩雑な工程を必要とせず、安価に処理剤を製造可能である。
【００３４】
また、本発明によれば、これまで多くの精製手段を経て手間と時間がかかって活性が低下してきたばかりか、アルギン酸分解酵素の種類までも分離して純粋化してしまい、総体的な分解活性を低下させていたと言う問題も解消し、広い適用範囲においてアルギン酸を効果的かつ低コストで分解処理を行うことができる。
【００３５】
さらに、アルギン酸分解酵素の由来物質としてアワビやサザエなどの高価な食藻軟体類を用いることなく、タイなど海藻類の食性がある魚貝類の内臓という廃棄物を起源としてアルギン酸分解酵素を得ることができるので、より一層安価に処理剤を製造することができる効果がある。
【００３６】
アルギン酸分解酵素の培養液を吸着させる吸着剤には、一般にタンパク質の分離精製に用いられるカチオンまたはアニオンのイオン交換樹脂（IRC-50，IRA-96S，Q-Wephrose，DEAE-セルロース，CM-トヨパール，SP-トヨパール（「トヨパール」は登録商標）など）や、合成吸着剤（XAD-4，XAD-7など）を用いることができるが、特にイオン交換樹脂からなる吸着剤を用いるとアルギン酸分解酵素を良好に吸着させることができる。
【００３７】
さらには、アルギン酸分解酵素の培養液を透析処理して脱塩すること、アルギン酸分解酵素の培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすること、および／または、海水塩を含む培地で菌類を培養することによっても、アルギン酸分解酵素の吸着剤に対する吸着性を向上させる効果が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその技術的な範囲を限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
この実施例では、アルギン酸分解酵素を分泌する菌類の選定を行った。新鮮なマダイとアイゴの内臓から腸管を丁寧に取り出し、内容物をビーカーにとり、これを滅菌した純水で２倍に希釈し、アルギナーゼ酵素を分泌する菌類を得るための元試料とした。
【００４０】
下記培地組成物を純水で溶解して得たZobell2216E（ｐＨ７．５） の寒天培地をシャーレに準備して、上記の試料（タイの腸管内容物とアイゴの腸管内容物）の各０．１ｍｌずつを、３〜５枚のZobell2216E シャーレ上に５〜６点の点滴を行い、これらのシャーレを３０℃で５日間の静置培養後、各培地上のコロニーを観察してアルギン酸分解性の酵素を判別した。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
ＮａＣｌ：３％
ＫＣｌ：０．０７％
ＭｇＳＯ４：０．２６％
ＭＧＣｌ２：０．５％
ＫＨ２ＰＯ４：０．２６％
イーストエキス：０．１％
ポリペプトン：０．５％
【００４１】
シャーレ上に点在するコロニーが培地を溶解していることを目視で判別できるものは、その一部を採取してZobell2216Eの液体培地の試験管に取った。判別しにくいものについては、採取した後の寒天培地のシャーレに対し１０％塩化カルシウムの７０％エタノール水溶液を噴霧した。アルギン酸を分解した菌類のコロニーの周辺には溶解した透明ゾーンが目視で明確に分かるほどの環状に現れる。こうして、タイからは２点、アイゴから１点の菌体サンプルを取ることができた。
【実施例２】
【００４２】
この実施例では菌類の分離を行った。実施例１で得た菌体サンプルの液体培養液を３０℃で５日間静置培養を行い、その培養液を、発明者の調合による下記培地組成物を純水で溶解して得た培地（ｐＨ７．０）の寒天培地シャーレ上に０．５ｍｌずつ塗布し、再び３０℃で３日間培養した。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
リン酸水素２カリウム：０．２％
硫酸アンモニウム：０．２％
イーストエキス：０．２％
ポリペプトン：０．２％
人工海水塩：４％
寒天：１．５％（寒天培地の場合）
【００４３】
なお、ここで用いた人工海水塩（富田製薬製SF-1）に含まれる主な塩類は表１に示す通りである。
【表１】
【００４４】
シャーレ上に点在する菌のコロニーが目視で明らかに培地を溶解していることが確認できたもののみを上記と同一構成の液体培地に移し、菌体原液とした。タイからは５点、アイゴからは３点の菌体原液を得た。ただし、この菌体原液が単独の菌からなるものであるか、あるいは複数の菌体の混在であるかは、後のアルギン酸の分解性のみが重要となるために、ここでは確認していない。
【００４５】
これらの菌体原液を３０℃で３日間培養した。
【実施例３】
【００４６】
実施例２で得た菌体原液８点の液体培地から各々上澄み液と底部液を取り、アルギン酸分解活性試験に供した。すなわち、０．２％アルギン酸ナトリウム１．８ｍｌ、５０ｍＭリン酸バッファー緩衝液（ｐＨ７）０．６ｍｌの反応液を３０℃でインキュベートし、そこに各菌体原液試料０．６ｍｌを加えて、酵素反応を行わせた。アルギン酸分解酵素の作用によりアルギン酸が分解して生成するウロン酸の二重結合（２３５ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００４７】
その結果を表２に示す。
【表２】
【００４８】
この中から、最も高いアルギン酸分解性を示したＴ３と次に高いアルギン酸分解性を示したＴ２の２点を以降の試験用に選抜した。
【実施例４】
【００４９】
実施例３で選抜した２点の培養液Ｔ２，Ｔ３が菌体外酵素を含むことを確認するために、以下の方法で試験を行った。これら培養液Ｔ２，Ｔ３の各々について上澄み液と底部液を取り、遠心分離アンプルに限外ろ過膜（１００ＫＣＭＷ）がセットされたＶｉｖａｓｐｉｎ５００のキットを用いて、遠心分離にかけて各々の透過液と濃縮液を得た。
【００５０】
その結果を表３に示す。
【表３】
【００５１】
培養液の底部液には菌体の塊や培地の消化物などの比重の大きいものが含まれているのに対し、上澄み液には菌体から菌対外に分泌された物質が浮遊ないし溶解していると考えられる。また、魚介類から得られるアルギナーゼの分子量は大きくても６０Ｋ付近であることが知られているので、該アルギナーゼは上記限外ろ過膜を透過した透過液に含まれるはずである。表３の結果は、Ｔ２，Ｔ３のいずれについても上澄み液の透過液がアルギン酸分解活性を有することを示している。したがって、これらの菌体が菌体外酵素を生産している、つまり菌対外分泌性の酵素であることが確認された。このことは、菌体破砕などの負荷処理を行わずに、上澄み液から酵素を回収できることを示している。
【００５２】
なお、濃縮液側の分解性が高いのは、菌体内に残存した酵素と培養液中のアルギン酸と反応中あるいは結合中の酵素の複合体が高分子であるために濃縮側に残って高い分解性を示したものと推察する。
【実施例５】
【００５３】
吸着剤のアルギン酸分解活性を評価する試験を行った。前処理を経て１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）に浸漬しておいた７種類（表４）の吸着剤各０．４ｍｌを、バイオ・ラッド・ラボラトリー社のディスポーザブルカラム１０ｍｌに取り、底部にキャップをした後、市販のアルギナーゼ（ナガセケムテック社製）０．０２ｇを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）６ｍｌに溶解して得た酵素液０．４ｍｌを注入し、さらに１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）０．４ｍｌを加えて良く撹拌した後に、４℃の低温室に３時間静置した。その後、同バッファー１２ｍｌを各吸着剤に通液して洗浄し、その液（ろ液）をアルギン酸分解活性試験用に採取した。また、各吸着剤を底部密栓カラムに入れたまま、アルギン酸分解活性測定用の反応液を注入し３０℃で１０分間１８０ｒｐｍの振とう機にて反応させて、酵素が吸着した状態の吸着剤をアルギン酸分解活性試験に供した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
その結果を表５に示す。
【表５】
【００５６】
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４について、吸着剤を素通りしたろ液より吸着剤の方が格段に優れたアルギン酸分解活性を示しているので、アルギン酸分解リアーゼが吸着剤に吸着保持され、そのままでアルギン酸を効果的に分解できることが判明した。また、Ｎｏ．６およびＮｏ．7の吸着剤はクロマトゲルろ過用のものであることからろ過性と沈降性がきわめて悪く、この用途に適していないことが確認できた。
【００５７】
なお、Ｎｏ．５は、この試験では吸着剤のアルギン酸分解活性を確認することができなかったが、ろ液の分解活性が低いことから、酵素を吸着している可能性を窺わせるものであるため、次の実施例６で再度試験を行うことにした。
【実施例６】
【００５８】
吸着剤の再使用によるアルギン酸分解活性を評価する試験を行った。実施例５で用いた吸着剤のうち酵素反応を示したＮｏ．１〜Ｎｏ．４の吸着剤と、追試験用にＮｏ．５の吸着剤とを対象として、これらを２ｍｌの同バッファーで洗浄した後に４℃の低温室で２日間静置して、再度、実施例５と同様にしてアルギン酸分解活性反応試験を行った。また、比較対照として、吸着剤Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５について、何も吸着させていない剤（ブランク）のアルギン酸分解活性反応も同様にして試験した。
【００５９】
その結果を表６に示す。
【表６】
【００６０】
表６が示す結果から、吸着剤Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４は再使用によってもアルギナーゼを吸着・保有した状態でアルギン酸分解を行うことが判明した。なお、イオン交換性機能のある吸着剤には、わずかのアルギン酸分解性がある。
【００６１】
なお、表５および表６の最下段に示される酵素液は、市販のアルギン酸リアーゼを正確に０．０２ｇ取って５ｍｌのリン酸バッファーに溶解した０．２％濃度の酵素液であり、その酵素剤としての力価２９，０００ｕ／ｇから計算すると酵素力価は１１．６ｕ／ｍｌとなるが、表５，表６での測定値では若干の誤差が生じている。いずれにしても、本発明の実施例となる吸着剤Ｎｏ.１〜４（表５）および再使用吸着剤Ｎｏ.１〜４（表６）はいずれも市販アルギン酸リアーゼの酵素液より優れた酵素活性を示している。
【００６２】
ところで、ｐＨの酵素分解への影響は、ナガセエンザイム株式会社のアルギン酸リアーゼ資料によれば、ｐＨ５〜７．５程度までは安定的であるが、ｐＨ８を超えると急激に分解活性が低下するとされている。陰イオンクロマト剤や弱アニオン交換樹脂では、反応後のｐＨは明らかに８より高いが、本試験では、反応の有無を判定する目的であるために、他の文献などで実施しているようなpHによる補正は実施していない。よって、次の実施例７以降からはｐＨの計測を省略することとした。
【実施例７】
【００６３】
アルギン酸分解リアーゼ吸着に対する塩濃度の影響を評価するための試験を行った。発明者の調合による下記培地組成物を純水で溶解して得た培地（ｐＨ７．０）シャーレ上にＴ３の菌体原液（表２）を０．５ｍｌずつ塗布したものを、３０℃で３日間培養し、その培養液を取り、２日間かけて１０ｍＭリン酸バッファーに透析膜：三光純薬社製ＵＣ１８−３２を用いて透析を行ったものと、透析を行わずに３０℃で５日間培養し続けたものから取った培養液とを対象として、実施例５と同様にして酵素を吸着剤に吸着させた。吸着剤は代表としてＮｏ．１のIRC-50-Na（弱カチオン交換樹脂）およびＮｏ．２のIRA-96S-CL（弱アニオン交換樹脂）（いずれも表４参照）を用いた。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
リン酸水素２カリウム：０．２％
硫酸アンモニウム：０．２％
イーストエキス：０．２％
ポリペプトン：０．２％
人工海水塩：２％
【００６４】
塩濃度の指標として電気導電率を計測したところ、透析をせずに５日間培養した培養液は２５ｍＳ／ｃｍ、透析した培養液は５．８ｍＳ／ｃｍを示した。この透析培養液の電気導電率は、塩濃度０．２％以下に相当するものであった。
【００６５】
透析の有無によるアルギン酸分解活性への影響は表７に示す通りであった。
【表７】
【００６６】
この結果から、透析によって脱塩処理することにより、アルギン酸リアーゼが吸着剤に確実に吸着され、濃縮されてきわめて高いアルギン酸分解活性を示すことが明らかになった。
【実施例８】
【００６７】
アルギナーゼ分解酵素産生菌を生育させる培地について検討した。まず、実施例７で用いた培地（ただし人工海水塩：４％）において各要素を一つずつ含まない培地を用意し、それら各培地で実施例７と同様にしてＴ３の菌体原液（表２）を培養し、それら培養液の上澄み液と底部液の各々を取ってアルギン酸分解活性試験に供した。この試験の目的は、アルギナーゼ酵素分解酵素を産生させる菌の育成において各培地要素の重要性を把握することにある。
【００６８】
その結果を表８に示す。
【表８】
【００６９】
この試験では菌体原液としてＴ３のみを対象としているので確たる結果を導くことは困難であるが、所要のアルギン酸分解活性を持つ酵素を培養するためには、培地に少なくともポリペプトンと人工海水塩を含むことが必要であると推測できた。表８の結果は、アルギン酸が無くても分解酵素を生産できることを示しており、これは多くの文献などで書かれていることとは異なっているが、すでにアルギン酸分解酵素の生産性が確認されている菌ならばアルギン酸による生育の選択圧は必要ないのかも知れない。
【実施例９】
【００７０】
次に、実施例８で得た結果から、リン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムは重要性が低いものと判断して、基礎培地からこれらを削除した上で、塩濃度／種類によって酵素生産性がどのように変化するかを試験した。
【００７１】
その試験条件および結果は表９に示す通りである。
【表９】
【００７２】
表９から、リン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地によって生産された酵素も高いアルギン酸分解活性を示しており、これらは本酵素生産にとっては重要な因子でないことが分かった。また、海水成分中に酵素生産または酵素活性の発揮に関与する因子が多く含まれていると推察された。
【実施例１０】
【００７３】
実施例９の試験結果から、培地に含まれる人工海水成分が有意に作用していることが推認されたので、次に、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、人工海水塩濃度を変化させて培養し、培養後のアルギン酸分解活性および電気伝導率を計測した。
その試験条件および結果は表１０に示す通りである。
【表１０】
【００７４】
最も高いアルギン酸分解活性を示したのは塩濃度０．２％の培地であったが、塩濃度４．０％の培地でも十分なアルギン酸分解活性があることが分かった。同時に、塩濃度０％では本発明で使用するに適した培地とは言えず、微量であっても人工海水塩が必須因子であることも分かった。なお、試験対象としたＴ３菌は、この結果から見て混合種の菌類である可能性が高い。
【実施例１１】
【００７５】
実施例９および実施例１０の試験結果から、人工海水塩を含む培地で菌を培養することが好ましいことが確認されたが、表１から明らかなように、用いた人工海水塩には多くの塩類が含まれており、それらの塩類は酵素活性に対する効果も様々であり（特開平６−２１７７７４号公報の表１には各種金属塩のアルギン酸分解酵素活性に対する影響が様々に異なることが示されている）、また、カルシウム塩によるアルギン酸の凝固作用も懸念されるため、人工海水塩として酵素活性化作用を一概に評価することには躊躇がある。そこで、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、ＮａＣｌ濃度を変化させて培養し、培養後のアルギン酸分解活性および電気伝導率を計測した。
【００７６】
その結果を表１１に示す。
【表１１】
【００７７】
実施例１０の試験結果とは若干異なるが、ＮａＣｌ濃度についても、０．１％〜４．０％の幅広い範囲で十分に高いアルギン酸分解活性を示すが、０％では満足できる結果が得られないと言うことについてはほぼ同様の結果が得られた。
【００７８】
なお、試験対象としたＴ３菌は、実施例１０および実施例１１の結果から見て混合種の菌類である可能性が高い。このＴ３の菌には、塩類の要求に対して２通りの性質があり、通常の海水濃度でアルギン酸分解酵素を生産するだけでなく、０．１％や０．２％と言った非常に低い塩濃度でもアルギン酸分解酵素を生産し得ることが分かった。このような性質を有する菌であれば、吸着剤への吸着に対して最適化が容易となる。
【実施例１２】
【００７９】
ここでは、食塩濃度の酵素吸着性に対する影響を試験した。実施例１１と同様に、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、ＮａＣｌ濃度を０〜０．４％の範囲内で変化させて培養し、その培養液を実施例５と同様にして酵素を吸着剤に吸着させた。吸着剤についても同様に代表としてＮｏ．１のIRC-50-Na（弱カチオン交換樹脂）およびＮｏ．２のIRA-96S-CL（弱アニオン交換樹脂）（いずれも表４参照）を用いた。
【００８０】
その結果を表１２および図１３に示す。
【表１２】
【表１３】
これらの表に示される結果から、特にＮａＣｌ濃度０．２％以下の培地で培養したアルギン酸分解酵素が吸着剤に対して良好な吸着性を有することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により提供されるアルギン酸分解処理剤は、褐藻類廃棄部分や雑海藻類の分解、海藻エキスの製造、海藻の糖化利用、海藻のバイオマス利用や海藻飼料の製造などの各種用途に活用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸分解処理剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、褐藻類の細胞間を充填する粘性多糖類であり、マンヌロン酸とグルロン酸の２つのウロン酸ユニットが、１，４グルコシド結合で結合した直鎖の高分子である。アルギン酸は、水溶液にしたときに高い粘性を示すことから、増粘剤や安定化剤などとして、食品添加物、化粧品、繊維、水処理剤、製薬剤用の基材や医療用材料などに利用されている。
【０００３】
また、アルギン酸を分解させて得られる分解生成物は、植物の成長促進や人体の腸内の有用細菌であるビフィズス菌の増殖活性などの生理活性を有することが知られており、さらに、これをオリゴ糖および食物繊維として活用することに向けた研究開発も進められている。
【０００４】
しかしながら、アルギン酸水溶液は上記のように非常に粘性が高く、水溶液中のカルシウムなどと容易に金属塩を作りゲル化するためにアルギン酸を分解することが容易ではない。従来、アルギン酸の分解は、酸やアルカリを用いる方法、熱および圧力を用いる方法などで行われていたが、いずれも設備やコストなどの面で工業的に採用するには適していなかった。
【０００５】
上記従来法に代わるものとして、酵素を用いてアルギン酸を分解する方法が開発されている。この酵素分解法は、アルギン酸を特異的に分解する酵素であるアルギン酸分解酵素（主にアルギン酸リアーゼ＝アルギナーゼ）を添加して分解させる方法であり、従来法に比べて安全性や操作などの点で優れている。
【０００６】
アルギン酸リアーゼは、褐藻類に対して高い食性を示す食藻軟体類（サザエやアワビなど）の消化液中に多く含まれていることが知られている。ところが、食藻軟体類に含まれるアルギン酸リアーゼは一般に比活性が高く褐藻類アルギン酸の分解には最適と思われるものの、食藻軟体類自体が高価であるために工業的利用が難しく、現在は研究目的の利用に止まっている（J.Prot.Chem.,15,1996）。また、市販されているアルギン酸リアーゼもきわめて高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年では海藻類をバイオマス資源として活用する研究が進んでいるが、アルギン酸粘膜の存在によって本体部分のセルラーゼや利用しやすい多糖類が保護されており、実用的な活用が難しい。したがって、高粘度で難分解性である褐藻類アルギン酸をバイオマス資源としての用途に用いる場合、これを分解し低分子化する簡便な工業的技術の確立が望まれる。
【０００８】
本発明者らは、廃棄ワカメなどをバイオマス資源として利用するために、糖化分解処理として、当初は硫酸分解法や過酸化水素分解などの手法を行ってきた。しかし、薬品の使用濃度が高く、操作が危険な上に実験機材にも材質的な配慮が必要であり、しかも糖化後にこれらの酸成分や未反応薬剤を除去することに大変な手間がかかった。
【０００９】
また、原料の低分子化には成功したものの、得られた糖類の分子量が大きくばらつく上に、反応が過剰な場合には部分的に炭化してしまうことがあり、こうした処理後の成分の調整や除去までが必要になっていた。
【００１０】
そこで、酵素処理を行うべく、植物性成分の一般的な処理と同様にセルラーゼとヘミセルラーゼを組み合わせてワカメの粉砕物への適用を試みたが、全炭水化物成分に対する糖化率は１％にも及ばなかった。次に、市販のアルギン酸リアーゼ（ナガセケムテック社製）を入手し、アルギン酸リアーゼ処理の後にセルラーゼ処理を行ったところ、容易に全炭水化物成分の５０％以上の糖化率を得ることができた。
【００１１】
ところが、前述したように市販アルギン酸リアーゼはきわめて高価な試薬であり、廃棄ワカメなどのバイオマス資源化のための糖化処理に活用できるような汎用的な酵素剤製品ではない。
【００１２】
こうした実験と考察を踏まえて、本発明者らは、アルギン酸リアーゼを適用して簡便かつ安価にアルギン酸を分解することを可能にするための手法を開発するべく鋭意研究と試験を重ねてきた。
【００１３】
本発明者らは、まず、アルギン酸リアーゼの精製に使用する元の菌として、高価な食藻軟体類に代えて使用し得る他の海洋植物を模索した。前述したように、アルギン酸リアーゼは、一般的には海洋細菌類の培養とその培養液中に分泌生産される酵素の精製によって製造されており、その元の菌は、アワビ、サザエなどの高価な食藻軟体類の内臓から得てきた。しかし、本発明者らの文献調査によれば、タイの内臓、カキ、海底汚泥、佃煮工場排水や穴あき症の昆布などから得た菌類からアルギン酸リアーゼを得たという報告があった。
【００１４】
そこで、本発明者らは、容易に入手可能であり海藻も食べる食性のあるタイに注目した。また、同様に海藻食性のあるアイゴも入手できた。通常は廃棄されるこれらの腸内物からアルギン酸リアーゼを分泌する菌類を得ることができれば、酵素原料を安価に入手することができるようになり、工業的用途への道が大きく開けることになる。
【００１５】
次に、このようにして得た酵素原料の精製について考察した。前述のように従来は海洋細菌類の培養液中に分泌生産される酵素原料を精製することでアルギン酸リアーゼを製造するのが一般的な手法であり、その際の精製方法は、ほぼ確立したタンパク質の分離法同様の手順にしたがっている。つまり、アルギン酸分解リアーゼを産生する微生物を培養し、その培養液上澄みの遠心分離による粗素液の分離、イオン交換およびクロマトグラフィーなどによる精製、透析による脱塩、限外ろ過などによる濃縮、ゲルろ過などの手段を組み合わせて実施している。
【００１６】
たとえば、特開平９−９９６２号公報では、得られた培養液を遠心分離によって菌体と上澄み液に分離し、この上澄み液を硫化アンモニウムを用いた塩析によってタンパク質の沈殿を得、この沈殿物を透析処理によって脱塩して、粗酵素液を得る。この粗酵素液を陰イオンカラムクロマトグラフィーにかけて、ＮａＣｌで溶出させて活性部分を得て、限外ろ過膜によって濃縮する。次いで、ゲルクロマトグラフィーによって酵素活性部分をとり、限外ろ過膜によって濃縮する。さらなる精製には、陰イオンクロマトとゲルろ過クロマトを繰り返し行う。
【００１７】
また、特開平６−２１７７７４号公報では、粗酵素を陽イオン交換樹脂カラムに吸着させる。溶出にはリン酸バッファーのＮａＣｌ溶液を０〜０．５モルまで順次上げた濃度勾配法を適用する。溶出した酵素活性部分を限外ろ過膜によって濃縮し、これをさらにゲルろ過クロマトグラフィーにて精製を行う。この最初のイオン交換法によって、アルギン酸の分解機能が異なる酵素に分離できる。
【００１８】
また、高粘性の粗酵素溶液はカラムクロマトグラフィーが困難であることを考慮して、特開２０００−３４２２７８号公報では、バッチ法によって陰イオン交換を行っている。すなわち、５０ｍＭ緩衝液に平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースに試料を加えて数分間撹拌し、その後グラスフィルターに移して吸引ろ過を行う。ろ液の酵素活性が無くなるまでＮａＣｌの濃度を徐々に上げていき、酵素活性のある画分を集めて、それを限外ろ過濃縮し、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、ｐＨ６〜８のｐＨ勾配をかけたところ、活性は素通り画分にのみ認められたと記載されている。
【００１９】
つまり、従来公知のアルギン酸リアーゼ精製方法は、適切な培地（たとえばZobellやDavisなど）においてアルギン酸リアーゼ産生菌を培養し、培養液中の酵素タンパク質を硫酸アンモニウム塩析によって回収・濃縮し、陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂による吸着を行い、この担体をクロマト溶出にかけて活性部分を収集し、さらにゲルろ過によるクロマトグラフィー分離を２〜４回繰り返すことによって、精製を行うものであった。
【００２０】
この精製方法では、カラムに充填してからその吸着剤より溶出させるので、フラクションコレクターを用いて、試料分離のために多くの試験管を使い、しかもクロマトグラフィーに約１０時間もの長時間を要するものであって、時間と手間が何度も繰り返し必要である。
【００２１】
さらに、この繰り返しのクロマト操作ごとに、酵素の純度は向上するもののアルギン酸リアーゼの活性が低下していき、通常市販されている酵素剤では、培養した培地液における酵素活性総量の２０％以下まで低下してしまうことが分かった。
【００２２】
また、アルギン酸分解リアーゼの分解性には、アルギン酸を構成するマンヌロン酸とグルロン酸の２通りのウロン酸ユニットに対して作用することから、マンヌロン酸ユニット分解型、グルクロン酸ユニット分解型、およびこれらの両方を並行分解する型の３種類がある。アルギン酸分解リアーゼ酵素の精製に関する前記従来技術の中にはそれらを分離することまでも研究するものがあるが、こうしたアルギン酸分解酵素の分類やそのための精製操作は、本発明者らにとってはアルギン酸分解活性を低下させるばかりか、分解機能の多様性を狭めてしまうことになるために必要のないことと考えられた。
【００２３】
このように煩雑な操作を通じて精製を行っているために市販のアルギナーゼは高価になり、バイオマスの活用のような工業的な糖化処理に使用できるような経済性を持つものにならない。
【００２４】
したがって、本発明の課題は、海洋資源のバイオマス活用などの工業的糖化処理にも有意に使用することができるような経済性に優れた新規なアルギン酸分解処理剤およびその製造方法を提供することである。
【００２５】
本発明の他の課題は、現在ではほとんどが廃棄処理されている魚介類の有効利用の道を開き、そこから得た菌類の培養液中に得られる酵素のアルギン酸分解活性に着目してアルギン酸分解処理に用いることである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記課題を解決するため、請求項１に係る本発明は、アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものであることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤である。
【００２７】
請求項２に係る本発明は、請求項１記載のアルギン酸分解処理剤において、前記アルギン酸分解酵素は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素であることを特徴とする。
【００２８】
請求項３に係る本発明は、請求項１または２記載のアルギン酸分解処理剤において、前記吸着剤は、イオン交換樹脂であることを特徴とする。
【００２９】
請求項４に係る本発明は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類を培養してアルギン酸分解活性を有する酵素を含む培養液を取り、この培養液を吸着剤に吸着させることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤の製造方法である。
【００３０】
請求項５に係る本発明は、請求項４記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、前記培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることを特徴とする。
【００３１】
請求項６に係る本発明は、請求項４または５記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、前記培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることを特徴とする。
【００３２】
請求項7に係る本発明は、請求項４ないし６のいずれか記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法において、海水塩を含む培地で前記菌類を培養することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものを直接的にアルギン酸分解処理に用いることができるので、従来の酵素精製に伴う煩雑な工程を必要とせず、安価に処理剤を製造可能である。
【００３４】
また、本発明によれば、これまで多くの精製手段を経て手間と時間がかかって活性が低下してきたばかりか、アルギン酸分解酵素の種類までも分離して純粋化してしまい、総体的な分解活性を低下させていたと言う問題も解消し、広い適用範囲においてアルギン酸を効果的かつ低コストで分解処理を行うことができる。
【００３５】
さらに、アルギン酸分解酵素の由来物質としてアワビやサザエなどの高価な食藻軟体類を用いることなく、タイなど海藻類の食性がある魚貝類の内臓という廃棄物を起源としてアルギン酸分解酵素を得ることができるので、より一層安価に処理剤を製造することができる効果がある。
【００３６】
アルギン酸分解酵素の培養液を吸着させる吸着剤には、一般にタンパク質の分離精製に用いられるカチオンまたはアニオンのイオン交換樹脂（IRC-50，IRA-96S，Q-Wephrose，DEAE-セルロース，CM-トヨパール，SP-トヨパール（「トヨパール」は登録商標）など）や、合成吸着剤（XAD-4，XAD-7など）を用いることができるが、特にイオン交換樹脂からなる吸着剤を用いるとアルギン酸分解酵素を良好に吸着させることができる。
【００３７】
さらには、アルギン酸分解酵素の培養液を透析処理して脱塩すること、アルギン酸分解酵素の培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすること、および／または、海水塩を含む培地で菌類を培養することによっても、アルギン酸分解酵素の吸着剤に対する吸着性を向上させる効果が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその技術的な範囲を限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
この実施例では、アルギン酸分解酵素を分泌する菌類の選定を行った。新鮮なマダイとアイゴの内臓から腸管を丁寧に取り出し、内容物をビーカーにとり、これを滅菌した純水で２倍に希釈し、アルギナーゼ酵素を分泌する菌類を得るための元試料とした。
【００４０】
下記培地組成物を純水で溶解して得たZobell2216E（ｐＨ７．５） の寒天培地をシャーレに準備して、上記の試料（タイの腸管内容物とアイゴの腸管内容物）の各０．１ｍｌずつを、３〜５枚のZobell2216E シャーレ上に５〜６点の点滴を行い、これらのシャーレを３０℃で５日間の静置培養後、各培地上のコロニーを観察してアルギン酸分解性の酵素を判別した。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
ＮａＣｌ：３％
ＫＣｌ：０．０７％
ＭｇＳＯ４：０．２６％
ＭＧＣｌ２：０．５％
ＫＨ２ＰＯ４：０．２６％
イーストエキス：０．１％
ポリペプトン：０．５％
【００４１】
シャーレ上に点在するコロニーが培地を溶解していることを目視で判別できるものは、その一部を採取してZobell2216Eの液体培地の試験管に取った。判別しにくいものについては、採取した後の寒天培地のシャーレに対し１０％塩化カルシウムの７０％エタノール水溶液を噴霧した。アルギン酸を分解した菌類のコロニーの周辺には溶解した透明ゾーンが目視で明確に分かるほどの環状に現れる。こうして、タイからは２点、アイゴから１点の菌体サンプルを取ることができた。
【実施例２】
【００４２】
この実施例では菌類の分離を行った。実施例１で得た菌体サンプルの液体培養液を３０℃で５日間静置培養を行い、その培養液を、発明者の調合による下記培地組成物を純水で溶解して得た培地（ｐＨ７．０）の寒天培地シャーレ上に０．５ｍｌずつ塗布し、再び３０℃で３日間培養した。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
リン酸水素２カリウム：０．２％
硫酸アンモニウム：０．２％
イーストエキス：０．２％
ポリペプトン：０．２％
人工海水塩：４％
寒天：１．５％（寒天培地の場合）
【００４３】
なお、ここで用いた人工海水塩（富田製薬製SF-1）に含まれる主な塩類は表１に示す通りである。
【表１】
【００４４】
シャーレ上に点在する菌のコロニーが目視で明らかに培地を溶解していることが確認できたもののみを上記と同一構成の液体培地に移し、菌体原液とした。タイからは５点、アイゴからは３点の菌体原液を得た。ただし、この菌体原液が単独の菌からなるものであるか、あるいは複数の菌体の混在であるかは、後のアルギン酸の分解性のみが重要となるために、ここでは確認していない。
【００４５】
これらの菌体原液を３０℃で３日間培養した。
【実施例３】
【００４６】
実施例２で得た菌体原液８点の液体培地から各々上澄み液と底部液を取り、アルギン酸分解活性試験に供した。すなわち、０．２％アルギン酸ナトリウム１．８ｍｌ、５０ｍＭリン酸バッファー緩衝液（ｐＨ７）０．６ｍｌの反応液を３０℃でインキュベートし、そこに各菌体原液試料０．６ｍｌを加えて、酵素反応を行わせた。アルギン酸分解酵素の作用によりアルギン酸が分解して生成するウロン酸の二重結合（２３５ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００４７】
その結果を表２に示す。
【表２】
【００４８】
この中から、最も高いアルギン酸分解性を示したＴ３と次に高いアルギン酸分解性を示したＴ２の２点を以降の試験用に選抜した。
【実施例４】
【００４９】
実施例３で選抜した２点の培養液Ｔ２，Ｔ３が菌体外酵素を含むことを確認するために、以下の方法で試験を行った。これら培養液Ｔ２，Ｔ３の各々について上澄み液と底部液を取り、遠心分離アンプルに限外ろ過膜（１００ＫＣＭＷ）がセットされたＶｉｖａｓｐｉｎ５００のキットを用いて、遠心分離にかけて各々の透過液と濃縮液を得た。
【００５０】
その結果を表３に示す。
【表３】
【００５１】
培養液の底部液には菌体の塊や培地の消化物などの比重の大きいものが含まれているのに対し、上澄み液には菌体から菌対外に分泌された物質が浮遊ないし溶解していると考えられる。また、魚介類から得られるアルギナーゼの分子量は大きくても６０Ｋ付近であることが知られているので、該アルギナーゼは上記限外ろ過膜を透過した透過液に含まれるはずである。表３の結果は、Ｔ２，Ｔ３のいずれについても上澄み液の透過液がアルギン酸分解活性を有することを示している。したがって、これらの菌体が菌体外酵素を生産している、つまり菌対外分泌性の酵素であることが確認された。このことは、菌体破砕などの負荷処理を行わずに、上澄み液から酵素を回収できることを示している。
【００５２】
なお、濃縮液側の分解性が高いのは、菌体内に残存した酵素と培養液中のアルギン酸と反応中あるいは結合中の酵素の複合体が高分子であるために濃縮側に残って高い分解性を示したものと推察する。
【実施例５】
【００５３】
吸着剤のアルギン酸分解活性を評価する試験を行った。前処理を経て１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）に浸漬しておいた７種類（表４）の吸着剤各０．４ｍｌを、バイオ・ラッド・ラボラトリー社のディスポーザブルカラム１０ｍｌに取り、底部にキャップをした後、市販のアルギナーゼ（ナガセケムテック社製）０．０２ｇを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）６ｍｌに溶解して得た酵素液０．４ｍｌを注入し、さらに１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）０．４ｍｌを加えて良く撹拌した後に、４℃の低温室に３時間静置した。その後、同バッファー１２ｍｌを各吸着剤に通液して洗浄し、その液（ろ液）をアルギン酸分解活性試験用に採取した。また、各吸着剤を底部密栓カラムに入れたまま、アルギン酸分解活性測定用の反応液を注入し３０℃で１０分間１８０ｒｐｍの振とう機にて反応させて、酵素が吸着した状態の吸着剤をアルギン酸分解活性試験に供した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
その結果を表５に示す。
【表５】
【００５６】
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４について、吸着剤を素通りしたろ液より吸着剤の方が格段に優れたアルギン酸分解活性を示しているので、アルギン酸分解リアーゼが吸着剤に吸着保持され、そのままでアルギン酸を効果的に分解できることが判明した。また、Ｎｏ．６およびＮｏ．7の吸着剤はクロマトゲルろ過用のものであることからろ過性と沈降性がきわめて悪く、この用途に適していないことが確認できた。
【００５７】
なお、Ｎｏ．５は、この試験では吸着剤のアルギン酸分解活性を確認することができなかったが、ろ液の分解活性が低いことから、酵素を吸着している可能性を窺わせるものであるため、次の実施例６で再度試験を行うことにした。
【実施例６】
【００５８】
吸着剤の再使用によるアルギン酸分解活性を評価する試験を行った。実施例５で用いた吸着剤のうち酵素反応を示したＮｏ．１〜Ｎｏ．４の吸着剤と、追試験用にＮｏ．５の吸着剤とを対象として、これらを２ｍｌの同バッファーで洗浄した後に４℃の低温室で２日間静置して、再度、実施例５と同様にしてアルギン酸分解活性反応試験を行った。また、比較対照として、吸着剤Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５について、何も吸着させていない剤（ブランク）のアルギン酸分解活性反応も同様にして試験した。
【００５９】
その結果を表６に示す。
【表６】
【００６０】
表６が示す結果から、吸着剤Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４は再使用によってもアルギナーゼを吸着・保有した状態でアルギン酸分解を行うことが判明した。なお、イオン交換性機能のある吸着剤には、わずかのアルギン酸分解性がある。
【００６１】
なお、表５および表６の最下段に示される酵素液は、市販のアルギン酸リアーゼを正確に０．０２ｇ取って５ｍｌのリン酸バッファーに溶解した０．２％濃度の酵素液であり、その酵素剤としての力価２９，０００ｕ／ｇから計算すると酵素力価は１１．６ｕ／ｍｌとなるが、表５，表６での測定値では若干の誤差が生じている。いずれにしても、本発明の実施例となる吸着剤Ｎｏ.１〜４（表５）および再使用吸着剤Ｎｏ.１〜４（表６）はいずれも市販アルギン酸リアーゼの酵素液より優れた酵素活性を示している。
【００６２】
ところで、ｐＨの酵素分解への影響は、ナガセエンザイム株式会社のアルギン酸リアーゼ資料によれば、ｐＨ５〜７．５程度までは安定的であるが、ｐＨ８を超えると急激に分解活性が低下するとされている。陰イオンクロマト剤や弱アニオン交換樹脂では、反応後のｐＨは明らかに８より高いが、本試験では、反応の有無を判定する目的であるために、他の文献などで実施しているようなpHによる補正は実施していない。よって、次の実施例７以降からはｐＨの計測を省略することとした。
【実施例７】
【００６３】
アルギン酸分解リアーゼ吸着に対する塩濃度の影響を評価するための試験を行った。発明者の調合による下記培地組成物を純水で溶解して得た培地（ｐＨ７．０）シャーレ上にＴ３の菌体原液（表２）を０．５ｍｌずつ塗布したものを、３０℃で３日間培養し、その培養液を取り、２日間かけて１０ｍＭリン酸バッファーに透析膜：三光純薬社製ＵＣ１８−３２を用いて透析を行ったものと、透析を行わずに３０℃で５日間培養し続けたものから取った培養液とを対象として、実施例５と同様にして酵素を吸着剤に吸着させた。吸着剤は代表としてＮｏ．１のIRC-50-Na（弱カチオン交換樹脂）およびＮｏ．２のIRA-96S-CL（弱アニオン交換樹脂）（いずれも表４参照）を用いた。
アルギン酸ナトリウム：０．２％
リン酸水素２カリウム：０．２％
硫酸アンモニウム：０．２％
イーストエキス：０．２％
ポリペプトン：０．２％
人工海水塩：２％
【００６４】
塩濃度の指標として電気導電率を計測したところ、透析をせずに５日間培養した培養液は２５ｍＳ／ｃｍ、透析した培養液は５．８ｍＳ／ｃｍを示した。この透析培養液の電気導電率は、塩濃度０．２％以下に相当するものであった。
【００６５】
透析の有無によるアルギン酸分解活性への影響は表７に示す通りであった。
【表７】
【００６６】
この結果から、透析によって脱塩処理することにより、アルギン酸リアーゼが吸着剤に確実に吸着され、濃縮されてきわめて高いアルギン酸分解活性を示すことが明らかになった。
【実施例８】
【００６７】
アルギナーゼ分解酵素産生菌を生育させる培地について検討した。まず、実施例７で用いた培地（ただし人工海水塩：４％）において各要素を一つずつ含まない培地を用意し、それら各培地で実施例７と同様にしてＴ３の菌体原液（表２）を培養し、それら培養液の上澄み液と底部液の各々を取ってアルギン酸分解活性試験に供した。この試験の目的は、アルギナーゼ酵素分解酵素を産生させる菌の育成において各培地要素の重要性を把握することにある。
【００６８】
その結果を表８に示す。
【表８】
【００６９】
この試験では菌体原液としてＴ３のみを対象としているので確たる結果を導くことは困難であるが、所要のアルギン酸分解活性を持つ酵素を培養するためには、培地に少なくともポリペプトンと人工海水塩を含むことが必要であると推測できた。表８の結果は、アルギン酸が無くても分解酵素を生産できることを示しており、これは多くの文献などで書かれていることとは異なっているが、すでにアルギン酸分解酵素の生産性が確認されている菌ならばアルギン酸による生育の選択圧は必要ないのかも知れない。
【実施例９】
【００７０】
次に、実施例８で得た結果から、リン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムは重要性が低いものと判断して、基礎培地からこれらを削除した上で、塩濃度／種類によって酵素生産性がどのように変化するかを試験した。
【００７１】
その試験条件および結果は表９に示す通りである。
【表９】
【００７２】
表９から、リン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地によって生産された酵素も高いアルギン酸分解活性を示しており、これらは本酵素生産にとっては重要な因子でないことが分かった。また、海水成分中に酵素生産または酵素活性の発揮に関与する因子が多く含まれていると推察された。
【実施例１０】
【００７３】
実施例９の試験結果から、培地に含まれる人工海水成分が有意に作用していることが推認されたので、次に、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、人工海水塩濃度を変化させて培養し、培養後のアルギン酸分解活性および電気伝導率を計測した。
その試験条件および結果は表１０に示す通りである。
【表１０】
【００７４】
最も高いアルギン酸分解活性を示したのは塩濃度０．２％の培地であったが、塩濃度４．０％の培地でも十分なアルギン酸分解活性があることが分かった。同時に、塩濃度０％では本発明で使用するに適した培地とは言えず、微量であっても人工海水塩が必須因子であることも分かった。なお、試験対象としたＴ３菌は、この結果から見て混合種の菌類である可能性が高い。
【実施例１１】
【００７５】
実施例９および実施例１０の試験結果から、人工海水塩を含む培地で菌を培養することが好ましいことが確認されたが、表１から明らかなように、用いた人工海水塩には多くの塩類が含まれており、それらの塩類は酵素活性に対する効果も様々であり（特開平６−２１７７７４号公報の表１には各種金属塩のアルギン酸分解酵素活性に対する影響が様々に異なることが示されている）、また、カルシウム塩によるアルギン酸の凝固作用も懸念されるため、人工海水塩として酵素活性化作用を一概に評価することには躊躇がある。そこで、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、ＮａＣｌ濃度を変化させて培養し、培養後のアルギン酸分解活性および電気伝導率を計測した。
【００７６】
その結果を表１１に示す。
【表１１】
【００７７】
実施例１０の試験結果とは若干異なるが、ＮａＣｌ濃度についても、０．１％〜４．０％の幅広い範囲で十分に高いアルギン酸分解活性を示すが、０％では満足できる結果が得られないと言うことについてはほぼ同様の結果が得られた。
【００７８】
なお、試験対象としたＴ３菌は、実施例１０および実施例１１の結果から見て混合種の菌類である可能性が高い。このＴ３の菌には、塩類の要求に対して２通りの性質があり、通常の海水濃度でアルギン酸分解酵素を生産するだけでなく、０．１％や０．２％と言った非常に低い塩濃度でもアルギン酸分解酵素を生産し得ることが分かった。このような性質を有する菌であれば、吸着剤への吸着に対して最適化が容易となる。
【実施例１２】
【００７９】
ここでは、食塩濃度の酵素吸着性に対する影響を試験した。実施例１１と同様に、重要性の低いリン酸水素２カリウムと硫酸アンモニウムを除いた培地において、ＮａＣｌ濃度を０〜０．４％の範囲内で変化させて培養し、その培養液を実施例５と同様にして酵素を吸着剤に吸着させた。吸着剤についても同様に代表としてＮｏ．１のIRC-50-Na（弱カチオン交換樹脂）およびＮｏ．２のIRA-96S-CL（弱アニオン交換樹脂）（いずれも表４参照）を用いた。
【００８０】
その結果を表１２および図１３に示す。
【表１２】
【表１３】
これらの表に示される結果から、特にＮａＣｌ濃度０．２％以下の培地で培養したアルギン酸分解酵素が吸着剤に対して良好な吸着性を有することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により提供されるアルギン酸分解処理剤は、褐藻類廃棄部分や雑海藻類の分解、海藻エキスの製造、海藻の糖化利用、海藻のバイオマス利用や海藻飼料の製造などの各種用途に活用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものであることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤。
【請求項２】
前記アルギン酸分解酵素は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素であることを特徴とする、請求項１記載のアルギン酸分解処理剤。
【請求項３】
前記吸着剤は、イオン交換樹脂であることを特徴とする、請求項１または２記載のアルギン酸分解処理剤。
【請求項４】
海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類を培養してアルギン酸分解活性を有する酵素を含む培養液を取り、この培養液を吸着剤に吸着させることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項５】
前記培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることを特徴とする、請求項４記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項６】
前記培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることを特徴とする、請求項４または５記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項７】
海水塩を含む培地で前記菌類を培養することを特徴とする、請求項４ないし６のいずれか記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項１】
アルギン酸分解酵素を吸着剤に吸着させたものであることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤。
【請求項２】
前記アルギン酸分解酵素は、海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類の培養液中に得られる酵素であることを特徴とする、請求項１記載のアルギン酸分解処理剤。
【請求項３】
前記吸着剤は、イオン交換樹脂であることを特徴とする、請求項１または２記載のアルギン酸分解処理剤。
【請求項４】
海藻類の食性がある魚貝類の腸管内から得た菌類を培養してアルギン酸分解活性を有する酵素を含む培養液を取り、この培養液を吸着剤に吸着させることを特徴とする、アルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項５】
前記培養液を透析処理して脱塩した後に、吸着剤に吸着させることを特徴とする、請求項４記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項６】
前記培養液において塩類の含有量を塩化ナトリウム濃度で０．２％以下とすることを特徴とする、請求項４または５記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【請求項７】
海水塩を含む培地で前記菌類を培養することを特徴とする、請求項４ないし６のいずれか記載のアルギン酸分解処理剤の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−２１１９３５（Ｐ２０１１−２１１９３５Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８１６０６（Ｐ２０１０−８１６０６）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０７３１８５８７）株式会社ジェイ・エヌ・シー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０７３１８５８７）株式会社ジェイ・エヌ・シー (2)
【Ｆターム（参考）】
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