アルコール連続生産方法
【課題】ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との最適な関係を特定して、高いエタノール生産を維持することのできる、アルコール連続生産方法を提供すること。
【解決手段】発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、 希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とする。
【解決手段】発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、 希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール連続生産方法に関し、詳しくは、従来酵母よりも高いエタノール
生産性を示すＡＭ１２菌を用いた、菌体リサイクルのないアルコール連続生産方法に関す
る。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（以下、必要によりＡＭ１２菌株と称する）からなる酵
母を用いたアルコールの生産方法が開示されており、ＡＭ１２菌は優れたアルコール生産
能とアルコール耐性、凝集沈降性を有するという記載がある。
【特許文献１】特開昭５９−１３５８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アルコールの連続生産では、発酵槽に連続的にアルコール原料を供給して酵母によりアルコール発酵を行い、一方で得られたアルコール培養液を発酵槽から引き抜いている。菌体リサイクルのないアルコール連続生産では、アルコール培養液中の菌体は発酵槽に戻されることはない。
【０００４】
発酵槽内では、アルコール原料と酵母の接触回数が多いほど反応効率が上がるので、攪拌等で完全混合することが好ましい。しかし、完全混合すれば、アルコール培養液を発酵槽から引き抜く際に、多量の酵母が一緒に抜き出されて、発酵槽内の菌体濃度が減少してしまう。
【０００５】
アルコール培養液の引き抜き量に対して、酵母の増殖量が少なければ、流出した菌体分を補うことができないので、発酵槽内に存在する酵母の菌体量が減少し、アルコール原料と酵母の接触回数は酵母の減少により大幅に低下して、アルコール生成反応の効率が低下する問題がある。
【０００６】
一方、発酵槽内を攪拌しなければ、凝集沈降性を有する酵母は沈降し、発酵槽底部に沈積してしまう。菌体は沈降が進むと、所定時間経過後は沈降領域から圧密領域に入るので、底部に菌体の層ゾーン（圧密ゾーン）が形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給すると、この層ゾーンをアルコール原料が通過して、アルコール原料と酵母の接触が生じることになるが、かかる層ゾーンでの接触では圧密されていること、及びアルコール原料に対して酵母菌体量が過剰であることからアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなる問題がある。
【０００７】
特に、ＡＭ１２菌は、高いアルコール生産性とアルコール耐性を示す一方で、菌体の増殖能力が低いという特徴があり、上記問題が顕著に見られる。
【０００８】
本発明者らは、アルコールの連続発酵方法において、希釈度を上げて更にエタノール生産量を増加させるという方法を検討した。即ち、従来使用されていた酵母では希釈度を上げてエタノール生産量を増加させても、エタノールの生産量に限界があることがわかった。
【０００９】
このため本発明者らは、従来酵母よりも高いエタノール生産性を示すＡＭ１２菌を用い
て、アルコールの連続発酵方法を行ったところ、エタノールの生産性を挙げるために連続反応槽の溶液の希釈率を上げると、菌体が一斉に反応槽から流れ出てしまい高いエタノール生産性を維持することができないという問題があることがわかった。
【００１０】
そこで、本発明の課題は、ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との最適な関係を特定して、高いエタノール生産を維持することのできる、アルコール連続生産方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の課題は、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することにある。
【００１２】
また本発明の他の課題は、以下の記載により明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【００１４】
（請求項１）
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【００１５】
（請求項２）
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【００１６】
（請求項３）
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【００１７】
（請求項４）
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【００１８】
（請求項５）
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００１９】
（請求項６）
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２０】
（請求項７）
前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２１】
（請求項８）
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２０〜４０ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２２】
（請求項９）
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との最適な関係を特定して、高いエタノール生産を維持することのできる、アルコール連続生産方法を提供することができる。
【００２４】
また、本発明によると、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２６】
本発明のアルコール連続生産方法は、発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産する方法である。
【００２７】
ここで、発酵槽下方の強制的な液流を発生させるのは、発酵原料と酵母の接触回数を増加させて発酵反応効率を上昇させるためである。しかし、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流を発生させると、菌体が舞い上がり、そのまま発酵槽から外部に発酵液と共に排出されるおそれがあるが、本発明に用いる凝集沈殿性を有する酵母は、その菌体特有の性質として凝集沈降する働きが顕著であるので、発酵槽内の液面付近では菌体濃度が低くなり、発酵槽からの菌体流出は抑制される。
【００２８】
本発明者らは、アルコール連続生産方法において、凝集沈殿性を有する酵母を用いて、発酵槽下方の強制的な液流を調整すると、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流によって菌体が舞い上がる働きと、酵母の持つ凝集沈殿性によって菌体が凝集沈降する働きとによって、その層の境目が界面として観察できることを見出した。
【００２９】
本発明において、アルコール連続生産というのは、発酵槽にアルコール原料である糖液を例えば連続的に供給しながら、一方で、生成物を例えば連続的に取り出すことをいう。従って、アルコール原料を供給するのが不連続であっても、時間当たりの供給量が一定していればよい。
【００３０】
本発明では、希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（
ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）
で表される条件下で連続生産すると、本発明酵母が高エタノール生産を維持できる。即ち、本発明はエタノール生産性と希釈率との関係を提案するものである。
【００３１】
かかる条件下で運転する際に、発酵槽内に菌体の界面が形成されると、その界面より下の菌体濃度が高い領域は、凝集沈降による圧密領域とは異なり、界面下の菌体濃度と界面上の菌体濃度が極端に違うものであり、この界面の形成されている状態で、アルコール原料の発酵反応を阻害せず却って反応を促進することを見出した。またかかる攪拌下での界面が存在する場合には、その界面の上部の発酵液を引き抜けば菌体流出を防止でき、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、ＡＭ１２菌のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来ることを見出した。
【００３２】
なお、本発明のアルコール連続生産においては、発酵槽から菌体の流出を抑制しているが若干の菌体は流出する可能性がある。しかし、かかる菌体流出によって発酵槽内の菌体濃度が減少することは防止されている。本発明では発酵槽の上下方向で適度な濃度バランスが維持されているために発酵槽内での菌体増殖量は流出量に比べれば多く、菌体を常時発酵槽に追加していくことは基本的に意図していない。しかし、種菌として追加することはあるだろうし、若干流出した菌体を分離して発酵槽内に返送することは本発明の効果を何等阻害するものでない。
【００３３】
本発明で用いるアルコール原料は、穀物由来の原料が好ましく、例えば米、麦、イモなどは、糖濃度が高いので好ましい例として挙げられる。糖濃度としては、穀物原料の糖化反応効率の観点から、グルコース換算で１００〜３００ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは１５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である。
【００３４】
好気発酵温度は、酵母の至適発酵温度の観点から、４０℃以下が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃の範囲である。温度調節には、ヒーターおよび冷却器などの調節手段を採用できるが、格別限定されない。
【００３５】
本発明において、発酵槽内のＤＯ（溶存酸素濃度）は、０〜３ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは、０〜０．１ｐｐｍの範囲である。菌の生育状態によっては、ＤＯはなくても良い。ＤＯの調整は、空気供給量および発酵槽内攪拌翼の回転速度を増減することにより可能であり、例えばＤＯメータと空気供給量制御手段を連動させる手法を採用することもできる。
【００３６】
ｐＨは、酵母の至適ｐＨの観点から、３〜７の範囲が好ましく、より好ましくは３．５〜５．０の範囲である。ｐＨ調整手法としては、ｐＨメータで計測したデータに基づきｐＨ調整剤を連続的に供給してｐＨを調整するｐＨ制御システムを採用することができる。
【００３７】
凝集沈殿性を有する酵母としては、攪拌が行われていても、界面が形成される沈降性を備えた酵母であれば構わないが、好ましくは、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（ＡＭ１２菌）からなる酵母が用いられる。
【００３８】
ＡＭ１２菌は、工業技術院生物工業研究所 微生物工業技術研究所（現：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ））に、微工研受託番号第６７４９号として寄託されており、入手できる。
【００３９】
以下、本発明の実施の形態について図面に基づいて説明する。
【００４０】
図１において、１は糖液供給タンク、２は発酵槽である。糖液供給タンク１から糖液は供給ポンプ１０を用いて発酵槽２に供給する。
【００４１】
発酵槽２はｐＨコントローラ２０を備えており、ｐＨ測定器２１の測定値を入力して、ｐＨが下記制御条件の範囲にない場合には、ｐＨ調整ポンプ２２を稼動させて、１Ｎ−ＨＣＬおよび２Ｎ−ＮａＯＨをタンク２３から発酵槽２に供給するように構成されている。
【００４２】
また発酵槽２は温度コントローラ２４を備えており、温度測定器２５の測定温度を入力して下記制御条件の範囲を越える場合には、発酵槽２の外周に設けられる冷却管２６に冷却水を供給して冷却したり、ヒーターで加熱して温度調整できるように構成されている。
【００４３】
更に発酵槽２はＤＯコントローラ２７、ＤＯメータ２８を備えており、溶存酸素（ＤＯ）濃度は通気および発酵槽内攪拌翼２９の回転速度を増減することにより制御する。
【００４４】
３０は生産されたアルコールを取り出すアルコールポンプであり、取り出されたアルコールは精製過程へ送られる。
【００４５】
本発明で用いる酵母ＡＭ１２菌は、微好気培養（１ｐｐｍ程度のわずかな酸素供給）における以下の反応式（１）において、従来酵母と異なり、菌体（ｃｅｌｌ）増殖よりもエタノール生産が優勢であり、菌体あたりのエタノール生産が極めて高いことに起因しているものと推定される。（図２）
【００４６】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｎ２−ｓｏｕｒｃｅ＋Ｏ２→ｃｅｌｌ＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋ＣＯ２（微好気条件）
【００４７】
リサイクルのないアルコールの連続生産では、コンタミネーションの問題がなく、設備コストを低く抑えることができるという利点があるが、高いエタノール生産性を得るために希釈率を上げると増殖速度の遅いＡＭ１２菌の菌体が一斉に発酵槽外に流れ出て発酵槽２内の菌体濃度が低くなってしまうので高いエタノール生産性を維持することができなくなってしまう。
【００４８】
このため本発明では、発酵槽内でのＡＭ１２菌の増殖率と発酵槽外へのＡＭ１２菌の菌体の流出する希釈率との関係を解明し、エタノール生産を高く維持できる希釈率とＡＭ１２菌のエタノール生産性との関係を見出した。
【００４９】
本発明では、希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とする。希釈率Ｄは糖化液供給速度を培養体積で割った値である。
【００５０】
希釈率Ｄは、０．３以上になると菌体の流出が起こってしまうという問題があり、好ましい希釈率は０．１〜０．３の範囲であり、より好ましくは０．１４〜０．１８の範囲である。
【００５１】
菌体濃度ｘ（平均酵母菌体濃度）は、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２５〜３３ｇ／Ｌ、更に好ましくは２６〜３２ｇ／Ｌの範囲である。菌体濃度の測定は吸光度測定（濁度測定）によって行うことができる。
【００５２】
本発明者らはＡＭ１２菌はエタノール生産能力が大変高く、エタノール耐性も高いので、通常酵母に比べ、エタノール生産量が同希釈率でも明らかに高く推移できることを見出した。このことはＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との関係を示した図２を見ると明らかである。
【００５３】
またＡＭ１２菌菌体濃度の発酵槽内の定常値と希釈率との関係を図３に示す。
【００５４】
係数ａの範囲は８２≦ａ≦１０８が好ましく、より好ましくは８６≦ａ≦１０６、さら
に好ましくは８８≦ａ≦１０５となった。このａの範囲は、通常の酵母が満たせるもので
はない。
【００５５】
次に、上記の希釈率とエタノール生産性を実現する好ましい手法を説明する。
【００５６】
図４は、発酵槽内に界面を形成してアルコール生産する例であり、図４において、１００は発酵槽であり、アルコール原料は発酵槽１００の底部の原料供給口１１０から供給される。発酵槽1００内には凝集沈殿性を有する酵母が入れられている。
【００５７】
原料供給口１１０から発酵槽１００内に例えば連続的にアルコール原料が供給されると、酵母によってアルコール発酵され、アルコール発酵液が得られる。アルコール発酵液は、排出口１１１から引き抜かれる。なお、アルコール原料は発酵槽の底部から供給されれば供給の方法は限定されず、原料供給口１１０の設置は一例を示したに過ぎない。同様にアルコール発酵液の引き抜きも上部から引き抜くものであればその引き抜き方法は限定されない。
【００５８】
本発明において、発酵槽１００内のアルコール発酵液には、攪拌などによって液流が生じている状態であっても界面が形成されている状態でアルコール発酵を行うことを大きな特徴とする。
【００５９】
界面とは、アルコール発酵液内に観察される、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層の境目に形成される線状の境界面である。なお、線状の境界は、発酵槽を横方向から観察したときにみられるものであり、直線でなくてもよい。
【００６０】
各層はアルコール発酵液中に含まれる酵母菌体濃度が劇的に異なっているので、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層として認められるものである。
【００６１】
例えば、界面より上ではアルコール発酵液自体の色が観察され、濁度は低く、界面より下は酵母菌体が多いため不透明で濁度が高くなるので、ＡとＢの差が明確にわかり、目視にて界面の有無を観察することが出来る。
【００６２】
界面より上（Ａ）は、酵母菌体の濃度が極端に低い層であり、界面より下（Ｂ）は、酵母菌体の濃度が高い層である。
【００６３】
菌体濃度で定量的に表現すれば、発酵槽内のアルコール発酵液中の平均酵母菌体濃度（完全混合状態の時に測定される菌体濃度であり、発酵槽内の全酵母菌体量（乾燥重量：ｇ）を発酵槽内のアルコール発酵液量（Ｌ）で除した値に等しい）は、好ましくは２０〜４０（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは２５〜３３ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは、２６〜３２ｇ（乾燥重量）／Ｌであり、それに対して、界面より上にある、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）の酵母菌体濃度は、好ましくは１４ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、より好ましくは１０ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、更に好ましくは７ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満であり、界面より下にある酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の酵母菌体濃度は、好ましくは３１〜３８ｇ（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは３２〜３７ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは３３〜３６ｇ（乾燥重量）／Ｌである。
【００６４】
界面は、アルコール発酵液を抜き取る排出口１１１よりも下方に形成されていることが重要である。そうすると発酵槽からは、菌体濃度が低い層からアルコール発酵液が抜き取られるため、酵母菌体の流出を抑制することができる。
【００６５】
含まれる酵母菌体濃度が違うことから、当然酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）では、酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の方が、アルコール生産性は高い。そのため、界面より酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）が占める割合が高い方が生産性は向上する。
【００６６】
すなわち、界面が、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈに形成されている、あるいは酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）がアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％を占めており、発酵槽の底側（下方）に形成されていることが望ましい。
【００６７】
図４には、界面が形成される高さ方向の好ましい位置が示されている。
【００６８】
円筒状の発酵槽など、断面積が一定の発酵槽においては、界面が観察される位置は、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域が望ましい。
【００６９】
界面が０．１Ｈ〜０．８Ｈ、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域に形成されているときは、攪拌と沈降のバランスが取れている状態であり、発酵槽１００内の菌体濃度を高く維持し、かつアルコール原料との接触効率が良いので、エタノール生産性を高くすることができる。
【００７０】
界面の位置が０．１Ｈより上である場合は、ほとんど完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。
【００７１】
また、界面の位置が０．８Ｈより下である場合は発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。
【００７２】
なお、界面が観察されない状態とは、完全混合による場合、あるいは発酵槽中の菌体量が少なすぎて濃度差がわからない状態などが考えられるが、いずれも本発明のアルコール生産方法を行う上では好ましくない状態である。
【００７３】
図５は、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図である。界面は、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の境目に形成されるものであるから、発酵槽の底側（下方）に形成されている酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の割合をアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％とすることで、界面の形成される位置が規定できる。なお、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）の体積をｖ１とし、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）をｖ２とすると、Ｖ＝ｖ１＋ｖ２である。
【００７４】
体積の概念で菌体濃度が高い層を設定すると、発酵槽の断面積が一定でない形状をし、高さによる規定が難しい場合にも対応することができる。
【００７５】
本発明において、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの９０％より多くを占めるようになると、完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。
【００７６】
また、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの２０％より少ないと、発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。
【００７７】
本発明では、アルコール発酵液の供給によって生じる液流の他に、発酵槽下方に強制的な液流を発生する手段が設けられ、液流を強制的に発生させる手段は、主として攪拌機の回転によるものが好ましい。即ち、攪拌機だけでもよいし、攪拌機と空気曝気の併用のいずれでも良いが、制御の便宜性を考慮すれば攪拌機のみによることが好ましい。
【００７８】
図４や図５の例では、攪拌羽根を持つ攪拌機１１２が攪拌手段として示されている。
【００７９】
界面の位置は、上記の好ましい領域に形成されるように攪拌の強度等、連続発酵の運転条件を適宜変更することで維持できる。
【００８０】
界面は、液流によって菌体を巻き上げる働きが強くなると上昇し、巻き上げる働きが弱くなると沈降が進行するため下降する。
【００８１】
例えば、攪拌機の回転を上げれば界面は上昇する。
【００８２】
また、アルコール原料や空気の供給が多くなることによって、上昇流が起きれば界面は上昇する。
【００８３】
また、完全混合状態のときに攪拌機の回転を停止あるいは回転を下げれば界面が形成される。
【００８４】
界面の有無の観察については、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）に色相あるいは透明度の違いがあるので、目視にて観察することが出来る。
【００８５】
ステンレス製など、不透明の発酵槽の場合は、図６のように発酵槽１０１に覗き窓（観察窓）１０２を設け、界面の有無を観察することが出来る。
【００８６】
他に、前記界面の有無は、発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって、上下方向に位置が異なる２つ以上の濁度計を設けて菌体濃度を測定し、確認することもできる。
【００８７】
さらに、界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発光素子と受光素子を用い、発光素子からの光を界面で反射させその反射光を受光素子で受けて光量変化を求めて測定することもできる。
【実施例】
【００８８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００８９】
実施例１
＜酵母種菌培養液の調整＞
２００ｍｌフラスコにＹＰＤ培地（酵母エキス １％、ペプトン ２％、グルコース ５％、ｐＨ５．０）を１０ｍｌ入れ、滅菌処理したものに、酵母保存用プレートにストックしていた酵母をそれぞれ一白金耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、酵母を培養可能な状態に復元した。
【００９０】
２５０ｍｌフラスコにＹＰＤ培地１００ｍｌを入れ滅菌処理したものに復元した場酵母培養液１０ｍｌを接種した。３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、対数増殖期にある酵母種菌をさらに増殖させた。
【００９１】
＜ジャーファーメンタによる連続発酵＞
スタートアップ用滅菌済みＣＳＬ培地（コーンスティープリカー（ＣＳＬ） １％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ０．０１％、グルコース １０％、ｐＨ５．０）９００ｍｌの入ったジャーファーメンタに前記酵母種菌培養液１１０ｍｌを植菌した。
【００９２】
植菌は送液ポンプより行い酵母培養液を外気に触れないように接種した。
【００９３】
ジャーファーメンタ運転条件は以下のように設定した。
【００９４】
ｐＨ：５．０（２Ｎ ＮａＯＨ、ＨＣｌで調整）
通気：０．５〜１．５ｖｖｍ（コンプレッサーからの空気を、無菌フィルターを通して通気）
攪拌速度：５０〜１５０ｒｐｍ
温度：３０℃
【００９５】
開始２４時間後と４８時間後に発酵槽から培養液を採取しグルコース濃度を測定し、発酵液糖濃度が５ｇ／Ｌであることを確認した。
【００９６】
ジャーファーメンタに連続生産用滅菌済みＣＳＬ培地（ＣＳＬ １％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ０．０１％、グルコース ２０％、ｐＨ５．０）を連続的に供給すると共に、供給する培地（アルコール原料）と同じ速度で培養液（アルコール発酵液）を抜き出し、界面が形成されるように攪拌機の回転を調整しながら連続発酵を開始した（連続発酵の開始）。
【００９７】
発酵槽内のサンプルは１日おきに採取し、分析を行った。
【００９８】
なお、酵母の増殖状況、グルコース消費、およびエタノール生成量は、以下の方法で分析した。
【００９９】
酵母の増殖：濁度（ＯＤ６００ｎｍの吸光度）測定し、菌体濃度への換算係数（０．３７×ＯＤ６００ｎｍ）を用いて濃度を算出した。
グルコース消費：グルコースキット（和光純薬製 グルコーステスト−ｃ−ワコー）により測定した。
エタノール生成の経時変化：培養液のエタノール濃度分析（ＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ−２０１４、検出器ＦＩＤ）
【０１００】
この条件において、ＡＭ１２菌を用いて、希釈率０．１としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は９．７ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝９７であった。
【０１０１】
実施例２
実施例１において、希釈率０．１４としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１４．４ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝１０２．８５であった。
【０１０２】
実施例３
実施例１において、希釈率０．１８としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１７．７ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝９８．３であった。
【０１０３】
比較例１
実施例１において、使用する酵母を従来酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪＣＭ７２５５）ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）とし、希釈率を０．１としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は７．４ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０４】
比較例２
比較例１において、希釈率を０．１４としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１０．３５ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１４であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０５】
比較例３
比較例１において、希釈率を０．１８としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１３．３ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１８であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０６】
従来酵母を用いた場合では、本発明のａの範囲を満たすエタノール生産性が得られていないことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】連続エタノール発酵槽の概略図
【図２】ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との関係を示すグラフ
【図３】ＡＭ１２菌菌体濃度の発酵槽内の定常値と希釈率との関係を示すグラフ
【図４】界面が形成される好ましい位置を高さで示している場合の模式図
【図５】酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図
【図６】界面観察窓を設けた発酵槽の概略図
【符号の説明】
【０１０８】
１：糖液供給タンク
１０：供給ポンプ
２：発酵槽
２０：ｐＨコントローラ
２１：ｐＨ測定器
２２：ｐＨ調整ポンプ
２３：タンク
２４：温度コントローラ
２５：温度測定器
２６：冷却管
２７：ＤＯコントローラ
２８：ＤＯメータ
２９：攪拌翼
３０：アルコールポンプ
１００：発酵槽
１０１：発酵槽
１０２：観察窓
１１０：原料供給口
１１１：排出口
１１２：攪拌機
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール連続生産方法に関し、詳しくは、従来酵母よりも高いエタノール
生産性を示すＡＭ１２菌を用いた、菌体リサイクルのないアルコール連続生産方法に関す
る。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（以下、必要によりＡＭ１２菌株と称する）からなる酵
母を用いたアルコールの生産方法が開示されており、ＡＭ１２菌は優れたアルコール生産
能とアルコール耐性、凝集沈降性を有するという記載がある。
【特許文献１】特開昭５９−１３５８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アルコールの連続生産では、発酵槽に連続的にアルコール原料を供給して酵母によりアルコール発酵を行い、一方で得られたアルコール培養液を発酵槽から引き抜いている。菌体リサイクルのないアルコール連続生産では、アルコール培養液中の菌体は発酵槽に戻されることはない。
【０００４】
発酵槽内では、アルコール原料と酵母の接触回数が多いほど反応効率が上がるので、攪拌等で完全混合することが好ましい。しかし、完全混合すれば、アルコール培養液を発酵槽から引き抜く際に、多量の酵母が一緒に抜き出されて、発酵槽内の菌体濃度が減少してしまう。
【０００５】
アルコール培養液の引き抜き量に対して、酵母の増殖量が少なければ、流出した菌体分を補うことができないので、発酵槽内に存在する酵母の菌体量が減少し、アルコール原料と酵母の接触回数は酵母の減少により大幅に低下して、アルコール生成反応の効率が低下する問題がある。
【０００６】
一方、発酵槽内を攪拌しなければ、凝集沈降性を有する酵母は沈降し、発酵槽底部に沈積してしまう。菌体は沈降が進むと、所定時間経過後は沈降領域から圧密領域に入るので、底部に菌体の層ゾーン（圧密ゾーン）が形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給すると、この層ゾーンをアルコール原料が通過して、アルコール原料と酵母の接触が生じることになるが、かかる層ゾーンでの接触では圧密されていること、及びアルコール原料に対して酵母菌体量が過剰であることからアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなる問題がある。
【０００７】
特に、ＡＭ１２菌は、高いアルコール生産性とアルコール耐性を示す一方で、菌体の増殖能力が低いという特徴があり、上記問題が顕著に見られる。
【０００８】
本発明者らは、アルコールの連続発酵方法において、希釈度を上げて更にエタノール生産量を増加させるという方法を検討した。即ち、従来使用されていた酵母では希釈度を上げてエタノール生産量を増加させても、エタノールの生産量に限界があることがわかった。
【０００９】
このため本発明者らは、従来酵母よりも高いエタノール生産性を示すＡＭ１２菌を用い
て、アルコールの連続発酵方法を行ったところ、エタノールの生産性を挙げるために連続反応槽の溶液の希釈率を上げると、菌体が一斉に反応槽から流れ出てしまい高いエタノール生産性を維持することができないという問題があることがわかった。
【００１０】
そこで、本発明の課題は、ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との最適な関係を特定して、高いエタノール生産を維持することのできる、アルコール連続生産方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の課題は、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することにある。
【００１２】
また本発明の他の課題は、以下の記載により明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【００１４】
（請求項１）
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【００１５】
（請求項２）
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【００１６】
（請求項３）
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【００１７】
（請求項４）
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【００１８】
（請求項５）
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００１９】
（請求項６）
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２０】
（請求項７）
前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２１】
（請求項８）
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２０〜４０ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【００２２】
（請求項９）
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との最適な関係を特定して、高いエタノール生産を維持することのできる、アルコール連続生産方法を提供することができる。
【００２４】
また、本発明によると、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２６】
本発明のアルコール連続生産方法は、発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産する方法である。
【００２７】
ここで、発酵槽下方の強制的な液流を発生させるのは、発酵原料と酵母の接触回数を増加させて発酵反応効率を上昇させるためである。しかし、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流を発生させると、菌体が舞い上がり、そのまま発酵槽から外部に発酵液と共に排出されるおそれがあるが、本発明に用いる凝集沈殿性を有する酵母は、その菌体特有の性質として凝集沈降する働きが顕著であるので、発酵槽内の液面付近では菌体濃度が低くなり、発酵槽からの菌体流出は抑制される。
【００２８】
本発明者らは、アルコール連続生産方法において、凝集沈殿性を有する酵母を用いて、発酵槽下方の強制的な液流を調整すると、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流によって菌体が舞い上がる働きと、酵母の持つ凝集沈殿性によって菌体が凝集沈降する働きとによって、その層の境目が界面として観察できることを見出した。
【００２９】
本発明において、アルコール連続生産というのは、発酵槽にアルコール原料である糖液を例えば連続的に供給しながら、一方で、生成物を例えば連続的に取り出すことをいう。従って、アルコール原料を供給するのが不連続であっても、時間当たりの供給量が一定していればよい。
【００３０】
本発明では、希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（
ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）
で表される条件下で連続生産すると、本発明酵母が高エタノール生産を維持できる。即ち、本発明はエタノール生産性と希釈率との関係を提案するものである。
【００３１】
かかる条件下で運転する際に、発酵槽内に菌体の界面が形成されると、その界面より下の菌体濃度が高い領域は、凝集沈降による圧密領域とは異なり、界面下の菌体濃度と界面上の菌体濃度が極端に違うものであり、この界面の形成されている状態で、アルコール原料の発酵反応を阻害せず却って反応を促進することを見出した。またかかる攪拌下での界面が存在する場合には、その界面の上部の発酵液を引き抜けば菌体流出を防止でき、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、ＡＭ１２菌のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来ることを見出した。
【００３２】
なお、本発明のアルコール連続生産においては、発酵槽から菌体の流出を抑制しているが若干の菌体は流出する可能性がある。しかし、かかる菌体流出によって発酵槽内の菌体濃度が減少することは防止されている。本発明では発酵槽の上下方向で適度な濃度バランスが維持されているために発酵槽内での菌体増殖量は流出量に比べれば多く、菌体を常時発酵槽に追加していくことは基本的に意図していない。しかし、種菌として追加することはあるだろうし、若干流出した菌体を分離して発酵槽内に返送することは本発明の効果を何等阻害するものでない。
【００３３】
本発明で用いるアルコール原料は、穀物由来の原料が好ましく、例えば米、麦、イモなどは、糖濃度が高いので好ましい例として挙げられる。糖濃度としては、穀物原料の糖化反応効率の観点から、グルコース換算で１００〜３００ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは１５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である。
【００３４】
好気発酵温度は、酵母の至適発酵温度の観点から、４０℃以下が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃の範囲である。温度調節には、ヒーターおよび冷却器などの調節手段を採用できるが、格別限定されない。
【００３５】
本発明において、発酵槽内のＤＯ（溶存酸素濃度）は、０〜３ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは、０〜０．１ｐｐｍの範囲である。菌の生育状態によっては、ＤＯはなくても良い。ＤＯの調整は、空気供給量および発酵槽内攪拌翼の回転速度を増減することにより可能であり、例えばＤＯメータと空気供給量制御手段を連動させる手法を採用することもできる。
【００３６】
ｐＨは、酵母の至適ｐＨの観点から、３〜７の範囲が好ましく、より好ましくは３．５〜５．０の範囲である。ｐＨ調整手法としては、ｐＨメータで計測したデータに基づきｐＨ調整剤を連続的に供給してｐＨを調整するｐＨ制御システムを採用することができる。
【００３７】
凝集沈殿性を有する酵母としては、攪拌が行われていても、界面が形成される沈降性を備えた酵母であれば構わないが、好ましくは、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（ＡＭ１２菌）からなる酵母が用いられる。
【００３８】
ＡＭ１２菌は、工業技術院生物工業研究所 微生物工業技術研究所（現：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ））に、微工研受託番号第６７４９号として寄託されており、入手できる。
【００３９】
以下、本発明の実施の形態について図面に基づいて説明する。
【００４０】
図１において、１は糖液供給タンク、２は発酵槽である。糖液供給タンク１から糖液は供給ポンプ１０を用いて発酵槽２に供給する。
【００４１】
発酵槽２はｐＨコントローラ２０を備えており、ｐＨ測定器２１の測定値を入力して、ｐＨが下記制御条件の範囲にない場合には、ｐＨ調整ポンプ２２を稼動させて、１Ｎ−ＨＣＬおよび２Ｎ−ＮａＯＨをタンク２３から発酵槽２に供給するように構成されている。
【００４２】
また発酵槽２は温度コントローラ２４を備えており、温度測定器２５の測定温度を入力して下記制御条件の範囲を越える場合には、発酵槽２の外周に設けられる冷却管２６に冷却水を供給して冷却したり、ヒーターで加熱して温度調整できるように構成されている。
【００４３】
更に発酵槽２はＤＯコントローラ２７、ＤＯメータ２８を備えており、溶存酸素（ＤＯ）濃度は通気および発酵槽内攪拌翼２９の回転速度を増減することにより制御する。
【００４４】
３０は生産されたアルコールを取り出すアルコールポンプであり、取り出されたアルコールは精製過程へ送られる。
【００４５】
本発明で用いる酵母ＡＭ１２菌は、微好気培養（１ｐｐｍ程度のわずかな酸素供給）における以下の反応式（１）において、従来酵母と異なり、菌体（ｃｅｌｌ）増殖よりもエタノール生産が優勢であり、菌体あたりのエタノール生産が極めて高いことに起因しているものと推定される。（図２）
【００４６】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｎ２−ｓｏｕｒｃｅ＋Ｏ２→ｃｅｌｌ＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋ＣＯ２（微好気条件）
【００４７】
リサイクルのないアルコールの連続生産では、コンタミネーションの問題がなく、設備コストを低く抑えることができるという利点があるが、高いエタノール生産性を得るために希釈率を上げると増殖速度の遅いＡＭ１２菌の菌体が一斉に発酵槽外に流れ出て発酵槽２内の菌体濃度が低くなってしまうので高いエタノール生産性を維持することができなくなってしまう。
【００４８】
このため本発明では、発酵槽内でのＡＭ１２菌の増殖率と発酵槽外へのＡＭ１２菌の菌体の流出する希釈率との関係を解明し、エタノール生産を高く維持できる希釈率とＡＭ１２菌のエタノール生産性との関係を見出した。
【００４９】
本発明では、希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とする。希釈率Ｄは糖化液供給速度を培養体積で割った値である。
【００５０】
希釈率Ｄは、０．３以上になると菌体の流出が起こってしまうという問題があり、好ましい希釈率は０．１〜０．３の範囲であり、より好ましくは０．１４〜０．１８の範囲である。
【００５１】
菌体濃度ｘ（平均酵母菌体濃度）は、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２５〜３３ｇ／Ｌ、更に好ましくは２６〜３２ｇ／Ｌの範囲である。菌体濃度の測定は吸光度測定（濁度測定）によって行うことができる。
【００５２】
本発明者らはＡＭ１２菌はエタノール生産能力が大変高く、エタノール耐性も高いので、通常酵母に比べ、エタノール生産量が同希釈率でも明らかに高く推移できることを見出した。このことはＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との関係を示した図２を見ると明らかである。
【００５３】
またＡＭ１２菌菌体濃度の発酵槽内の定常値と希釈率との関係を図３に示す。
【００５４】
係数ａの範囲は８２≦ａ≦１０８が好ましく、より好ましくは８６≦ａ≦１０６、さら
に好ましくは８８≦ａ≦１０５となった。このａの範囲は、通常の酵母が満たせるもので
はない。
【００５５】
次に、上記の希釈率とエタノール生産性を実現する好ましい手法を説明する。
【００５６】
図４は、発酵槽内に界面を形成してアルコール生産する例であり、図４において、１００は発酵槽であり、アルコール原料は発酵槽１００の底部の原料供給口１１０から供給される。発酵槽1００内には凝集沈殿性を有する酵母が入れられている。
【００５７】
原料供給口１１０から発酵槽１００内に例えば連続的にアルコール原料が供給されると、酵母によってアルコール発酵され、アルコール発酵液が得られる。アルコール発酵液は、排出口１１１から引き抜かれる。なお、アルコール原料は発酵槽の底部から供給されれば供給の方法は限定されず、原料供給口１１０の設置は一例を示したに過ぎない。同様にアルコール発酵液の引き抜きも上部から引き抜くものであればその引き抜き方法は限定されない。
【００５８】
本発明において、発酵槽１００内のアルコール発酵液には、攪拌などによって液流が生じている状態であっても界面が形成されている状態でアルコール発酵を行うことを大きな特徴とする。
【００５９】
界面とは、アルコール発酵液内に観察される、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層の境目に形成される線状の境界面である。なお、線状の境界は、発酵槽を横方向から観察したときにみられるものであり、直線でなくてもよい。
【００６０】
各層はアルコール発酵液中に含まれる酵母菌体濃度が劇的に異なっているので、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層として認められるものである。
【００６１】
例えば、界面より上ではアルコール発酵液自体の色が観察され、濁度は低く、界面より下は酵母菌体が多いため不透明で濁度が高くなるので、ＡとＢの差が明確にわかり、目視にて界面の有無を観察することが出来る。
【００６２】
界面より上（Ａ）は、酵母菌体の濃度が極端に低い層であり、界面より下（Ｂ）は、酵母菌体の濃度が高い層である。
【００６３】
菌体濃度で定量的に表現すれば、発酵槽内のアルコール発酵液中の平均酵母菌体濃度（完全混合状態の時に測定される菌体濃度であり、発酵槽内の全酵母菌体量（乾燥重量：ｇ）を発酵槽内のアルコール発酵液量（Ｌ）で除した値に等しい）は、好ましくは２０〜４０（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは２５〜３３ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは、２６〜３２ｇ（乾燥重量）／Ｌであり、それに対して、界面より上にある、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）の酵母菌体濃度は、好ましくは１４ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、より好ましくは１０ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、更に好ましくは７ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満であり、界面より下にある酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の酵母菌体濃度は、好ましくは３１〜３８ｇ（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは３２〜３７ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは３３〜３６ｇ（乾燥重量）／Ｌである。
【００６４】
界面は、アルコール発酵液を抜き取る排出口１１１よりも下方に形成されていることが重要である。そうすると発酵槽からは、菌体濃度が低い層からアルコール発酵液が抜き取られるため、酵母菌体の流出を抑制することができる。
【００６５】
含まれる酵母菌体濃度が違うことから、当然酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）では、酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の方が、アルコール生産性は高い。そのため、界面より酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）が占める割合が高い方が生産性は向上する。
【００６６】
すなわち、界面が、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈに形成されている、あるいは酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）がアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％を占めており、発酵槽の底側（下方）に形成されていることが望ましい。
【００６７】
図４には、界面が形成される高さ方向の好ましい位置が示されている。
【００６８】
円筒状の発酵槽など、断面積が一定の発酵槽においては、界面が観察される位置は、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域が望ましい。
【００６９】
界面が０．１Ｈ〜０．８Ｈ、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域に形成されているときは、攪拌と沈降のバランスが取れている状態であり、発酵槽１００内の菌体濃度を高く維持し、かつアルコール原料との接触効率が良いので、エタノール生産性を高くすることができる。
【００７０】
界面の位置が０．１Ｈより上である場合は、ほとんど完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。
【００７１】
また、界面の位置が０．８Ｈより下である場合は発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。
【００７２】
なお、界面が観察されない状態とは、完全混合による場合、あるいは発酵槽中の菌体量が少なすぎて濃度差がわからない状態などが考えられるが、いずれも本発明のアルコール生産方法を行う上では好ましくない状態である。
【００７３】
図５は、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図である。界面は、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の境目に形成されるものであるから、発酵槽の底側（下方）に形成されている酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の割合をアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％とすることで、界面の形成される位置が規定できる。なお、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）の体積をｖ１とし、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）をｖ２とすると、Ｖ＝ｖ１＋ｖ２である。
【００７４】
体積の概念で菌体濃度が高い層を設定すると、発酵槽の断面積が一定でない形状をし、高さによる規定が難しい場合にも対応することができる。
【００７５】
本発明において、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの９０％より多くを占めるようになると、完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。
【００７６】
また、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの２０％より少ないと、発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。
【００７７】
本発明では、アルコール発酵液の供給によって生じる液流の他に、発酵槽下方に強制的な液流を発生する手段が設けられ、液流を強制的に発生させる手段は、主として攪拌機の回転によるものが好ましい。即ち、攪拌機だけでもよいし、攪拌機と空気曝気の併用のいずれでも良いが、制御の便宜性を考慮すれば攪拌機のみによることが好ましい。
【００７８】
図４や図５の例では、攪拌羽根を持つ攪拌機１１２が攪拌手段として示されている。
【００７９】
界面の位置は、上記の好ましい領域に形成されるように攪拌の強度等、連続発酵の運転条件を適宜変更することで維持できる。
【００８０】
界面は、液流によって菌体を巻き上げる働きが強くなると上昇し、巻き上げる働きが弱くなると沈降が進行するため下降する。
【００８１】
例えば、攪拌機の回転を上げれば界面は上昇する。
【００８２】
また、アルコール原料や空気の供給が多くなることによって、上昇流が起きれば界面は上昇する。
【００８３】
また、完全混合状態のときに攪拌機の回転を停止あるいは回転を下げれば界面が形成される。
【００８４】
界面の有無の観察については、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）に色相あるいは透明度の違いがあるので、目視にて観察することが出来る。
【００８５】
ステンレス製など、不透明の発酵槽の場合は、図６のように発酵槽１０１に覗き窓（観察窓）１０２を設け、界面の有無を観察することが出来る。
【００８６】
他に、前記界面の有無は、発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって、上下方向に位置が異なる２つ以上の濁度計を設けて菌体濃度を測定し、確認することもできる。
【００８７】
さらに、界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発光素子と受光素子を用い、発光素子からの光を界面で反射させその反射光を受光素子で受けて光量変化を求めて測定することもできる。
【実施例】
【００８８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００８９】
実施例１
＜酵母種菌培養液の調整＞
２００ｍｌフラスコにＹＰＤ培地（酵母エキス １％、ペプトン ２％、グルコース ５％、ｐＨ５．０）を１０ｍｌ入れ、滅菌処理したものに、酵母保存用プレートにストックしていた酵母をそれぞれ一白金耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、酵母を培養可能な状態に復元した。
【００９０】
２５０ｍｌフラスコにＹＰＤ培地１００ｍｌを入れ滅菌処理したものに復元した場酵母培養液１０ｍｌを接種した。３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、対数増殖期にある酵母種菌をさらに増殖させた。
【００９１】
＜ジャーファーメンタによる連続発酵＞
スタートアップ用滅菌済みＣＳＬ培地（コーンスティープリカー（ＣＳＬ） １％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ０．０１％、グルコース １０％、ｐＨ５．０）９００ｍｌの入ったジャーファーメンタに前記酵母種菌培養液１１０ｍｌを植菌した。
【００９２】
植菌は送液ポンプより行い酵母培養液を外気に触れないように接種した。
【００９３】
ジャーファーメンタ運転条件は以下のように設定した。
【００９４】
ｐＨ：５．０（２Ｎ ＮａＯＨ、ＨＣｌで調整）
通気：０．５〜１．５ｖｖｍ（コンプレッサーからの空気を、無菌フィルターを通して通気）
攪拌速度：５０〜１５０ｒｐｍ
温度：３０℃
【００９５】
開始２４時間後と４８時間後に発酵槽から培養液を採取しグルコース濃度を測定し、発酵液糖濃度が５ｇ／Ｌであることを確認した。
【００９６】
ジャーファーメンタに連続生産用滅菌済みＣＳＬ培地（ＣＳＬ １％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ０．０１％、グルコース ２０％、ｐＨ５．０）を連続的に供給すると共に、供給する培地（アルコール原料）と同じ速度で培養液（アルコール発酵液）を抜き出し、界面が形成されるように攪拌機の回転を調整しながら連続発酵を開始した（連続発酵の開始）。
【００９７】
発酵槽内のサンプルは１日おきに採取し、分析を行った。
【００９８】
なお、酵母の増殖状況、グルコース消費、およびエタノール生成量は、以下の方法で分析した。
【００９９】
酵母の増殖：濁度（ＯＤ６００ｎｍの吸光度）測定し、菌体濃度への換算係数（０．３７×ＯＤ６００ｎｍ）を用いて濃度を算出した。
グルコース消費：グルコースキット（和光純薬製 グルコーステスト−ｃ−ワコー）により測定した。
エタノール生成の経時変化：培養液のエタノール濃度分析（ＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ−２０１４、検出器ＦＩＤ）
【０１００】
この条件において、ＡＭ１２菌を用いて、希釈率０．１としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は９．７ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝９７であった。
【０１０１】
実施例２
実施例１において、希釈率０．１４としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１４．４ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝１０２．８５であった。
【０１０２】
実施例３
実施例１において、希釈率０．１８としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１７．７ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝９８．３であった。
【０１０３】
比較例１
実施例１において、使用する酵母を従来酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪＣＭ７２５５）ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）とし、希釈率を０．１としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は７．４ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０４】
比較例２
比較例１において、希釈率を０．１４としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１０．３５ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１４であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０５】
比較例３
比較例１において、希釈率を０．１８としてエタノール生産を行ったところ、エタノール生産性は１３．３ｇ・Ｌ／ｈであった。これをＪ＝ａＤに代入してａを求めるとａ＝０．１８であり、本発明の範囲から外れていた。
【０１０６】
従来酵母を用いた場合では、本発明のａの範囲を満たすエタノール生産性が得られていないことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】連続エタノール発酵槽の概略図
【図２】ＡＭ１２菌のエタノール生産性と希釈率との関係を示すグラフ
【図３】ＡＭ１２菌菌体濃度の発酵槽内の定常値と希釈率との関係を示すグラフ
【図４】界面が形成される好ましい位置を高さで示している場合の模式図
【図５】酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図
【図６】界面観察窓を設けた発酵槽の概略図
【符号の説明】
【０１０８】
１：糖液供給タンク
１０：供給ポンプ
２：発酵槽
２０：ｐＨコントローラ
２１：ｐＨ測定器
２２：ｐＨ調整ポンプ
２３：タンク
２４：温度コントローラ
２５：温度測定器
２６：冷却管
２７：ＤＯコントローラ
２８：ＤＯメータ
２９：攪拌翼
３０：アルコールポンプ
１００：発酵槽
１０１：発酵槽
１０２：観察窓
１１０：原料供給口
１１１：排出口
１１２：攪拌機
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）
がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【請求項２】
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【請求項３】
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【請求項４】
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【請求項５】
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項６】
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項７】
前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項８】
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２０〜４０ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項９】
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項１】
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行う際に、発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
希釈率Ｄ（ｈ−１）が、０＜Ｄ≦０．３の範囲で、エタノール生産性Ｊ（ｇ／Ｌ・ｈ）
がＪ＝ａＤ（但し、ａは係数であり、かつ８２≦ａ≦１０８の範囲である）で表されることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【請求項２】
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【請求項３】
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【請求項４】
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【請求項５】
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項６】
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項７】
前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項８】
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２０〜４０ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項９】
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２７１９５３（Ｐ２００８−２７１９５３Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７７７６４（Ｐ２００８−７７７６４）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
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