アルドステロンの測定法
【課題】試料中アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定に有用な方法及び化合物を提供する。
【解決手段】試料中アルドステロンの１８位をアルコキシ化した後、下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体を測定する。
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
【解決手段】試料中アルドステロンの１８位をアルコキシ化した後、下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体を測定する。
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるアルドステロンの量を液体クロマトグラフィー質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）により測定する方法及びその測定に用いる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルドステロンは、主に副腎皮質球状層で、コレステロールから１１−デオキシコルチコステロンを経て生合成されるステロイドホルモンである。その産生は、アンギオテンシンＩＩ、カリウムイオン及びＡＣＴＨによって制御されている。生理作用は、ミネラルコルチコイドとして知られていて、水・電解質代謝を司り、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系という体液の恒常性の維持を介して血圧を調節している。他方、最近ではナトリウムと協調して心肥大や心繊維化を引き起こすなどの心血管系リモデリングに対する作用も示唆されている。
アルドステロンは、血圧・電解質調節に関する病態においても重要な役割を担っている。ナトリウムイオンの再吸収並びにカリウムイオンとプロトンの排泄を促すため、大量投与すると、ナトリウムの貯留と細胞外液量の増大による循環血液量の増加を促進し、その結果として血圧が上昇するためである。
アルドステロン分泌異常による疾患として、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症等を挙げることができる。原発性アルドステロン症には副腎自体にアルドステロンの過剰産生の原因が認められるが続発性アルドステロン症は、副腎以外からの刺激によって副腎でのアルドステロンの過剰分泌が引き起こされるものである。本態性高血圧の中で、原発性アルドステロン症は全体の約５〜１０％、続発性アルドステロン症は全体の１〜２％の割合で確認されている。
原発性アルドステロン症の一般検査による鑑別は困難である。原発性アルドステロン症の病態は、副腎に腫瘍ができるアルドステロン産生腫瘍によるものが７５％であり、その半数近くがマイクロアデノーマである。この検査は、コンピュータ断層撮影（ＣｏｍｐｕｔｅｄＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＣＴ）及び核磁気共鳴画像法（ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）による副腎の画像診断で試みられるが、病変が不明瞭のため、この検査法では確定診断が困難なことが多い。他方、生化学検査では、数回繰り返した血中のアルドステロン濃度（ＰｌａｓｍａＡｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＰＡＣ）及び血漿レニン活性（Ｐｌａｓｍａ Ｒｅｎｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＰＲＡ）の比率（ＰＡＣ／ＰＲＡ）が２０以上の場合、原発性アルドステロン症と判断をする。さらに確定診断のスクリーニングとして、フロセミド２時間立位負荷試験を行い、それから得られたＰＡＣ／ＰＲＡ値が２０以上である場合に原発性アルドステロン症の診断が下される。最終的な原発性アルドステロン症の確定診断は、左右副腎静脈採血法による、血中アルドステロン濃度又は血中アルドステロン濃度／血中コルチゾール濃度比（血中Ａ／Ｆ比）により行うことが望ましく、一般的となりつつある。
この疾患は、原因を取り除けば、ほぼ治癒が可能であり、予後も良い。そのため、臨床検査において、アルドステロン濃度を正確に測定することは早期発見、早期治療に非常に有用である。
アルドステロンの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫反応法（ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＧＣ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡやＥＩＡといった免疫反応を利用した測定は、試料中に測定対象化合物と構造が類似したアルドステロン代謝物が多量に存在しているため、交差反応により定量値が大きく変動する。非特許文献１には、慢性腎不全患者の血漿をＲＩＡによる直接法で測定すると、血漿中の夾雑物とアルドステロン抗体との交差反応の影響で、ＨＰＬＣで夾雑物を除いて測定した場合と比較して、高い値が出た例が報告されている。また、抗体の特異性に加えて、キット間差による測定値の極端な乖離も報告されている。
血中アルドステロン濃度が１００ ｐｇ／ｍＬ以上であると高血圧症の割合が高いことが報告されているが、血中アルドステロン濃度は、心因的要因により変動することが知られ、近年では、非侵襲的な採取が可能な唾液を利用した臨床検査法の開発が注目を集めている。唾液試料の採取は簡便であり、唾液中アルドステロン濃度に基づく高血圧の診断が可能になれば、患者の負担も軽減する。しかしながら、唾液中アルドステロン濃度は、血清中の濃度より更に微量（数〜数十ｐｇ／ｍＬ）であると報告されていることから、測定には高感度、高特異性などの条件が必要となる。
ＧＣ−ＭＳによるアルドステロン測定もこれまでに試みられている。非特許文献２では、アルドステロンをトリメチルシリルエーテル化、メトキシ−トリメチルシリルエーテル化、アセチル−メトキシ−トリメチルシリルエーテル化及びメトキシ−ヘプタフルオロ酪酸エステル化して検出している。この文献には、１８−アルデヒド体と１８−ヘミアセタール体の違いによって、誘導体化反応が異なることが記載されている。また、非特許文献３には、試料中のアルドステロンの１８，２１位を塩酸存在下でアセタール化した後、３位をヘプタフルオロ酪酸エノールエステル化して測定する方法が記載されている。この方法の検出限界は、５０ｐｇである。また、非特許文献４には、試料中アルドステロンを３，１８−ジヘプタフルオロ酪酸エステル化し、これをＧＣ−ＭＳで測定する方法が記載されている。
ＬＣ−ＭＳによる測定は、非特許文献５に、試料中アルドステロンを大気圧化学イオン化法（ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＰｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）の陰イオンモードを用いてアルドステロンを測定する方法が記載されている。この方法では、測定範囲が１５〜５００ｐｇ／ｍＬである。非特許文献６には、エレクトロスプレーイオン化法（ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）の陰イオンモードを用いてアルドステロンを測定する方法が記載されている。この方法では、測定範囲が２１．６〜１０８０ｐｇ／ｍＬであり、定量下限値は１０．８ ｐｇ／ｍＬである。また、非特許文献７には、フォトスプレーイオン化法（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＰＩ）を用いた血清中ステロイドホルモン１２成分を同時分析することが記載されており、その測定系でアルドステロンを陰イオンモードで測定している。この方法では、定量下限値は１０ｐｇ／ｍＬである。これらＬＣ−ＭＳを用いたアルドステロン測定の報告は、アセタールの保護及び誘導体化を行うことには触れていない。
特許文献１及び特許文献２には、ステロイドホルモンの水酸基を誘導体化して、ＬＣ−ＭＳで測定する方法が記載されているが、どちらにもアルドステロンの測定については記載されていない。
【特許文献１】特開２００３−１６１７２６号公報
【特許文献２】特開２００７−１３２７４１号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１４（１９８９）２９４
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．７（１９６９）４１１
【非特許文献３】Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．１１（１９７９）１１７
【非特許文献４】Ｂｉｏｌ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２０（１９９１）６５７
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２（１９９７）３０８
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８６２（２００８）１１３
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ３７２（２００６）７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、試料中に含まれるアルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法を提供することである。また、本発明の別の目的は、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定で有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とするアルドステロン測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、これまで、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、複数のステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで同時測定できることを見出していた（特開２００７−１３２７４１号）。しかし、アルドステロンは下記式に示すように、化学平衡を形成しているので、同様の操作を行うだけではＬＣ−ＭＳ測定においてピーク形状が悪く、満足な結果を得られていなかった。
本発明者らは、検討の結果、試料中のアルドステロンを試料操作の過程において、酸性条件下、アルコールと反応させ、アルドステロンを１８−アルコキシの状態に収束させ、次いで２１位水酸基をピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、ＬＣ−ＭＳ測定において良好なピーク形状を得られることを見出した。
【０００５】
【化３】
【０００６】
本発明者らは、これらの知見を基に更に鋭意検討を重ねた結果、試料中のアルドステロンの量を数ｐｇのレベルで測定することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、試料中に含まれるアルドステロンを酸性条件下、アルコールを反応させて１８−アルコキシ化し、更にピリジンカルボン酸エステル体としてＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供するものである。また、本発明は、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定において有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする測定用試薬を提供することである。
本発明を具体的に示すと以下の通りである。
１．試料中のアルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
１）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２）下記式（Ｉ）
【０００７】
【化４】
【０００８】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳによる測定法。
２．下記式（ＩＩ）
【０００９】
【化５】
【００１０】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物。
３．上記２の式（ＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定用試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料中のアルドステロンを１０ ｐｇ／ｍＬ（定量下限値）まで測定することができる。
また、本発明の測定方法における操作は、試料を、溶媒による抽出、固相抽出、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、酸性条件下にてアルコールと反応を行い、更にエステル誘導体化試薬で反応を行うというもので、極めて容易に行うことができる。そして、その反応成績体である、下記式（ＩＩ）で示される化合物は安定である。
【００１２】
【化６】
【００１３】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
このように、アルドステロンそれ自身は、溶液中で複数の形状で化学平衡を形成しているため、質量分析に基づく測定を行うことは困難であるが、アルドステロンの１８位をアルコキシ化することによって化合物が安定し、さらにピリジンカルボン酸エステル体とすることによってＬＣ−ＭＳにおける測定感度が上昇するため、本発明の方法により、試料中のアルドステロンの定量的な高感度分析が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分離部が複数結合したタンデム型の質量分析計（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化は、例えば、ＡＰＣＩ、ＥＳＩ、ＡＰＰＩ等が挙げられるが、中でも、ＥＳＩを用いることが好ましい。また、質量分離法は、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良い四重極型を使用することが好ましい。さらに、定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング（ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＩＭ）や、１つ目の質量分離部で生成したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分離部で、その前駆イオンの分解によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳｅｌｅｃｔｅｄＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＲＭ）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が向上するＳＲＭによる測定が好ましい。
また、本明細書における「アルコール」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルコールを表し、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等を挙げることができるが、より適しているのは、エタノール及びメタノールである。
本発明の測定方法においては、使用する下記式（Ｉ）
【００１５】
【化７】
【００１６】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物において、Ｒ１が水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す場合が好適である。
また、本発明の測定方法において、上記式（Ｉ）で示される化合物におけるＸはヒドロキシ基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わることのできる基を意味し、本発明において特に制限はないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。本発明において、Ｘは、ヒドロキシ基であることが好ましい。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が１〜６の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を挙げることができる。
さらに、本発明の測定方法において使用される、前記式（Ｉ）で示される化合物における−ＣＯＸの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の２位である。
なお、前記式（Ｉ）の化合物はそのほとんどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既存の方法により容易に合成することができる。
さらに、本明細書において、下記式（ＩＩ）
【００１７】
【化８】
【００１８】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物におけるＲ１が水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合の化合物が好ましく、中でも、Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す場合の化合物が好適である。また、Ｒ２はエチル基又はメチル基を表す場合の化合物が好ましい。さらに、特に制限されるものではないが、ピリジン環が２位でカルボン酸エステルを介して結合している場合の化合物が好ましい。
本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、尿、糞、胆汁、組織、培養細胞、細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品、医薬品等が挙げられる。この中、好ましくは、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液が挙げられ、環境由来の試料としては、汚水、排水及び河川水が挙げられ、工業由来の試料としては、医薬品が挙げられる。
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、固相抽出、例えば、ウォーターズ社製Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ ＥｌｕｔＣ１８（登録商標）カートリッジ、ジーエルサイエンス社製ＩｎｅｒｔＳｅｐＰｈａｒｍａ（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のアルコキシ化及びピリジンカルボン酸エステル体化反応に供することができる。
アルコキシ化反応
上記で調製した試料に対し、酸性条件下でアルコールを反応させて、試料中に含まれるアルドステロンの１８位をアルコキシ化する。
この反応に用いる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩酸が望ましい。また、アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等が使用できるが、中でもメタノール及びエタノールが好適である。本反応に使用する酸とアルコールの量は特に制限されるものではないが、アルコール中に酸の割合が５％前後になるように調製した酸とアルコールの混合溶液を、試料１ｍＬ又は０．５ ｇにつき０．０１乃至１ｍＬの範囲内、より好ましくは０．１乃至０．５ ｍＬの範囲内で調製試料中に加えることが適している。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内とすることができるが、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５乃至２４０分の範囲内とすることができ、好ましくは１５分乃至９０分の範囲内の時間が適している。
エステル誘導体化反応
上記でアルコキシ化した後、更に前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、試料中に含まれる１８位がアルコキシ化されたアルドステロンの２１位をピリジンカルボン酸エステル体にする。
この反応は、一般に、上記でアルコキシ化した試料を、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒もしくはそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５乃至２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは１５分乃至９０分の範囲内の時間が適している。
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ ｍｇ、好ましくは１乃至５ ｍｇの範囲内で用いることができる。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ ｍｍｏｌ、好ましくは０．１乃至０．５ ｍｍｏｌの範囲内とすることができる。
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＸがヒドロキシ基を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物を予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒドロキシ基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。また、Ｘがハロゲン基を表す場合、式（Ｉ）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、以下のようにしてＬＣ−ＭＳによる測定を行う。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記反応において調製した調製物のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）等のＬＣ、さらにウォーターズ社製及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯＩＩ（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ ５０００（登録商標）等のＭＳを用いて行うことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
アルドステロン−１８−アルコキシ−２１−ピコリニルエステルの合成
アルドステロン１０ μｇをエタノール：塩酸（５：１、ｖ／ｖ）０．２５ｍＬに溶解し、２０分間室温で放置した。これに、精製水１ ｍＬを加え、あらかじめメタノール１ ｍＬ及び精製水１ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジに負荷し、精製水３ ｍＬ、５％重曹水２ ｍＬ、精製水３ｍＬ、アセトニトリル：精製水（２０：８０、ｖ／ｖ）１ ｍＬの順に固相カートリッジを洗浄した後、アセトニトリル：精製水（８０：２０、ｖ／ｖ）１ ｍＬで溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣にピコリン酸３０ ｍｇ、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物５０ ｍｇ及び４−ジメチルアミノピリジン２５ｍｇのテトラヒドロフラン１ ｍＬ溶液を５０ μＬ加え、室温で３０分静置した。反応後、５％重曹水１ ｍＬを加え、あらかじめメタノール１ｍＬ、精製水１ ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジに負荷した。そのカートリッジを精製水３ ｍＬ、５％ 塩酸溶液１ ｍＬ、精製水３ ｍＬで順次洗浄し、アセトニトリル：精製水（８０：２０、ｖ／ｖ）で目的化合物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固し、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルを得た。
また、アルドステロン１０ μｇをメタノール：塩酸（７：１、ｖ／ｖ）０．２５ｍＬに溶解し、２０分間室温で放置したものを以下、上記と同様にして処理を行い、アルドステロン−１８−メトキシ−２１−ピコリニルエステルを得た。
得られたアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル及びアルドステロン−１８−メトキシ−２１−ピコリニルエステルのＨｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−ＭＳ（ＨＲ−ＭＳ）、ＮＭＲデータを下記表１及び表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【実施例２】
【００２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度の比較
アルドステロンとアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルについて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度を比較した。
化合物それぞれ２０ ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬを調製し、これらをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。そして、得られたクロマトグラムより、Ｓ／Ｎ比を算出した。その結果を下記表３に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
上記測定結果より、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルは、非誘導体であるアルドステロンそれ自身で測定するよりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることが確認された。
【実施例３】
【００２６】
アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル測定の再現性
以下に述べる方法で、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル測定の日内再現性を確認した。また、日を変えて同様の試験を３回行い、日差再現性の確認をした。
３−１）検量線の作成
アルドステロンの濃度を求める際に、次のようにして検量線を作成した。すなわち、アルドステロンのそれぞれ０、１、５、２０、１００、５００及び１０００ｐｇ／５０ μＬのエタノール溶液に、内標準物質としてアルドステロン−２Ｈ７エタノール溶液を１００ｐｇ／５０ μＬ添加した。そこへ酢酸エチルを３ｍＬ加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
下記３−３）から３−４）に従い処理をしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定により含有量を求めた。どの検量線においてもアルドステロン１〜１０００ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）の範囲において、測定対象物ピーク面積値／内標準物質ピーク面積値比と濃度との関係が、相関係数０．９９以上と良好な直線性を示した。
３−２）試料の調製
活性炭処理した血清１ ｍＬにアルドステロンの標準品を下記表６及び７に示した濃度及び内標準としてアルドステロン−２Ｈ７を１００ｐｇ／５０ μＬを添加した。そこへ酢酸エチルを３ｍＬ加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
３−３）エトキシ化
残留物にエタノール：塩酸（５：１、ｖ／ｖ）を０．２５ ｍＬ加え、よく振り混ぜた後、室温で３０分間放置した。反応後、５％重曹水１ ｍＬ、酢酸エチル３ｍＬを加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
３−４）ピリジンカルボン酸エステル誘導体化
上記で得られた残留物にピコリン酸５０ ｍｇ、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物５０ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン２０ ｍｇのテトラヒドロフラン１ ｍＬ溶液を５０μＬ、トリエチルアミンを１０ μＬ加え、混合し、５０℃で１５分放置した。反応後、５％ 塩酸１ｍＬを加え、あらかじめメタノール６ ｍＬ、精製水３ ｍＬでコンディショニングした、ＩｎｅｒｔＳｅｐＰｈａｒｍａに負荷した。そのカートリッジを精製水１ ｍＬ、５％ 重曹水１ ｍＬ、アセトニトリル：精製水（３０：７０）２．５ ｍＬで順次洗浄後、アセトニトリル：精製水（８０：２０）１．５ｍＬで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣をアセトニトリル：精製水（４０：６０）０．１ｍＬで溶解し、そのうち０．０２ ｍＬを下記表４及び５に示した条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に供した。
その結果を下記表６及び７に示す。
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
上記の結果より、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルは１〜１０００ ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）まで再現性良く測定できることが確認された。
【実施例４】
【００３２】
実施例４：健常人血清中のアルドステロン測定
４−１）：試料の調製
健常者１４例より血清０．２ ｍＬを採取し、これに内標準物質としてアルドステロン−２Ｈ７を１００ｐｇ／５０ μＬ添加し、酢酸エチル３ｍＬを加えて振とうした後、酢酸エチル層を凍結分離し、減圧下で溶媒を留去した。
その後、上記実施例３の３−３）及び３−４）記載の方法でエトキシ化及びピリジンカルボン酸エステル誘導体化を行った。なお、検量線は上記実施例３−１）と同様の方法で作成した。
４−２）：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
上記４−１）で得たアセトニトリル溶液０．１ ｍＬのうち、その０．０２ｍＬを上記表３及び４で示した条件に則りＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定し、血清中のアルドステロン濃度を求めた。その結果を下記表８に示す。
【００３３】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法によれば、試料中のアルドステロンの有無を検出したり、アルドステロンの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生などの分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】はアルドステロン標準品を１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル化したときの１〜１０００ ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）までの検量線を示す。
【図２】はアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルの前駆イオンマススペクトルである。
【図３】はアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルのプロダクトイオンマススペクトルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるアルドステロンの量を液体クロマトグラフィー質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）により測定する方法及びその測定に用いる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルドステロンは、主に副腎皮質球状層で、コレステロールから１１−デオキシコルチコステロンを経て生合成されるステロイドホルモンである。その産生は、アンギオテンシンＩＩ、カリウムイオン及びＡＣＴＨによって制御されている。生理作用は、ミネラルコルチコイドとして知られていて、水・電解質代謝を司り、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系という体液の恒常性の維持を介して血圧を調節している。他方、最近ではナトリウムと協調して心肥大や心繊維化を引き起こすなどの心血管系リモデリングに対する作用も示唆されている。
アルドステロンは、血圧・電解質調節に関する病態においても重要な役割を担っている。ナトリウムイオンの再吸収並びにカリウムイオンとプロトンの排泄を促すため、大量投与すると、ナトリウムの貯留と細胞外液量の増大による循環血液量の増加を促進し、その結果として血圧が上昇するためである。
アルドステロン分泌異常による疾患として、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症等を挙げることができる。原発性アルドステロン症には副腎自体にアルドステロンの過剰産生の原因が認められるが続発性アルドステロン症は、副腎以外からの刺激によって副腎でのアルドステロンの過剰分泌が引き起こされるものである。本態性高血圧の中で、原発性アルドステロン症は全体の約５〜１０％、続発性アルドステロン症は全体の１〜２％の割合で確認されている。
原発性アルドステロン症の一般検査による鑑別は困難である。原発性アルドステロン症の病態は、副腎に腫瘍ができるアルドステロン産生腫瘍によるものが７５％であり、その半数近くがマイクロアデノーマである。この検査は、コンピュータ断層撮影（ＣｏｍｐｕｔｅｄＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＣＴ）及び核磁気共鳴画像法（ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）による副腎の画像診断で試みられるが、病変が不明瞭のため、この検査法では確定診断が困難なことが多い。他方、生化学検査では、数回繰り返した血中のアルドステロン濃度（ＰｌａｓｍａＡｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＰＡＣ）及び血漿レニン活性（Ｐｌａｓｍａ Ｒｅｎｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＰＲＡ）の比率（ＰＡＣ／ＰＲＡ）が２０以上の場合、原発性アルドステロン症と判断をする。さらに確定診断のスクリーニングとして、フロセミド２時間立位負荷試験を行い、それから得られたＰＡＣ／ＰＲＡ値が２０以上である場合に原発性アルドステロン症の診断が下される。最終的な原発性アルドステロン症の確定診断は、左右副腎静脈採血法による、血中アルドステロン濃度又は血中アルドステロン濃度／血中コルチゾール濃度比（血中Ａ／Ｆ比）により行うことが望ましく、一般的となりつつある。
この疾患は、原因を取り除けば、ほぼ治癒が可能であり、予後も良い。そのため、臨床検査において、アルドステロン濃度を正確に測定することは早期発見、早期治療に非常に有用である。
アルドステロンの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫反応法（ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＧＣ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡやＥＩＡといった免疫反応を利用した測定は、試料中に測定対象化合物と構造が類似したアルドステロン代謝物が多量に存在しているため、交差反応により定量値が大きく変動する。非特許文献１には、慢性腎不全患者の血漿をＲＩＡによる直接法で測定すると、血漿中の夾雑物とアルドステロン抗体との交差反応の影響で、ＨＰＬＣで夾雑物を除いて測定した場合と比較して、高い値が出た例が報告されている。また、抗体の特異性に加えて、キット間差による測定値の極端な乖離も報告されている。
血中アルドステロン濃度が１００ ｐｇ／ｍＬ以上であると高血圧症の割合が高いことが報告されているが、血中アルドステロン濃度は、心因的要因により変動することが知られ、近年では、非侵襲的な採取が可能な唾液を利用した臨床検査法の開発が注目を集めている。唾液試料の採取は簡便であり、唾液中アルドステロン濃度に基づく高血圧の診断が可能になれば、患者の負担も軽減する。しかしながら、唾液中アルドステロン濃度は、血清中の濃度より更に微量（数〜数十ｐｇ／ｍＬ）であると報告されていることから、測定には高感度、高特異性などの条件が必要となる。
ＧＣ−ＭＳによるアルドステロン測定もこれまでに試みられている。非特許文献２では、アルドステロンをトリメチルシリルエーテル化、メトキシ−トリメチルシリルエーテル化、アセチル−メトキシ−トリメチルシリルエーテル化及びメトキシ−ヘプタフルオロ酪酸エステル化して検出している。この文献には、１８−アルデヒド体と１８−ヘミアセタール体の違いによって、誘導体化反応が異なることが記載されている。また、非特許文献３には、試料中のアルドステロンの１８，２１位を塩酸存在下でアセタール化した後、３位をヘプタフルオロ酪酸エノールエステル化して測定する方法が記載されている。この方法の検出限界は、５０ｐｇである。また、非特許文献４には、試料中アルドステロンを３，１８−ジヘプタフルオロ酪酸エステル化し、これをＧＣ−ＭＳで測定する方法が記載されている。
ＬＣ−ＭＳによる測定は、非特許文献５に、試料中アルドステロンを大気圧化学イオン化法（ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＰｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）の陰イオンモードを用いてアルドステロンを測定する方法が記載されている。この方法では、測定範囲が１５〜５００ｐｇ／ｍＬである。非特許文献６には、エレクトロスプレーイオン化法（ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）の陰イオンモードを用いてアルドステロンを測定する方法が記載されている。この方法では、測定範囲が２１．６〜１０８０ｐｇ／ｍＬであり、定量下限値は１０．８ ｐｇ／ｍＬである。また、非特許文献７には、フォトスプレーイオン化法（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＰＩ）を用いた血清中ステロイドホルモン１２成分を同時分析することが記載されており、その測定系でアルドステロンを陰イオンモードで測定している。この方法では、定量下限値は１０ｐｇ／ｍＬである。これらＬＣ−ＭＳを用いたアルドステロン測定の報告は、アセタールの保護及び誘導体化を行うことには触れていない。
特許文献１及び特許文献２には、ステロイドホルモンの水酸基を誘導体化して、ＬＣ−ＭＳで測定する方法が記載されているが、どちらにもアルドステロンの測定については記載されていない。
【特許文献１】特開２００３−１６１７２６号公報
【特許文献２】特開２００７−１３２７４１号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１４（１９８９）２９４
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．７（１９６９）４１１
【非特許文献３】Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．１１（１９７９）１１７
【非特許文献４】Ｂｉｏｌ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２０（１９９１）６５７
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２（１９９７）３０８
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８６２（２００８）１１３
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ３７２（２００６）７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、試料中に含まれるアルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法を提供することである。また、本発明の別の目的は、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定で有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とするアルドステロン測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、これまで、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、複数のステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで同時測定できることを見出していた（特開２００７−１３２７４１号）。しかし、アルドステロンは下記式に示すように、化学平衡を形成しているので、同様の操作を行うだけではＬＣ−ＭＳ測定においてピーク形状が悪く、満足な結果を得られていなかった。
本発明者らは、検討の結果、試料中のアルドステロンを試料操作の過程において、酸性条件下、アルコールと反応させ、アルドステロンを１８−アルコキシの状態に収束させ、次いで２１位水酸基をピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、ＬＣ−ＭＳ測定において良好なピーク形状を得られることを見出した。
【０００５】
【化３】
【０００６】
本発明者らは、これらの知見を基に更に鋭意検討を重ねた結果、試料中のアルドステロンの量を数ｐｇのレベルで測定することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、試料中に含まれるアルドステロンを酸性条件下、アルコールを反応させて１８−アルコキシ化し、更にピリジンカルボン酸エステル体としてＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供するものである。また、本発明は、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定において有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする測定用試薬を提供することである。
本発明を具体的に示すと以下の通りである。
１．試料中のアルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
１）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２）下記式（Ｉ）
【０００７】
【化４】
【０００８】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳによる測定法。
２．下記式（ＩＩ）
【０００９】
【化５】
【００１０】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物。
３．上記２の式（ＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定用試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料中のアルドステロンを１０ ｐｇ／ｍＬ（定量下限値）まで測定することができる。
また、本発明の測定方法における操作は、試料を、溶媒による抽出、固相抽出、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、酸性条件下にてアルコールと反応を行い、更にエステル誘導体化試薬で反応を行うというもので、極めて容易に行うことができる。そして、その反応成績体である、下記式（ＩＩ）で示される化合物は安定である。
【００１２】
【化６】
【００１３】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
このように、アルドステロンそれ自身は、溶液中で複数の形状で化学平衡を形成しているため、質量分析に基づく測定を行うことは困難であるが、アルドステロンの１８位をアルコキシ化することによって化合物が安定し、さらにピリジンカルボン酸エステル体とすることによってＬＣ−ＭＳにおける測定感度が上昇するため、本発明の方法により、試料中のアルドステロンの定量的な高感度分析が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分離部が複数結合したタンデム型の質量分析計（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化は、例えば、ＡＰＣＩ、ＥＳＩ、ＡＰＰＩ等が挙げられるが、中でも、ＥＳＩを用いることが好ましい。また、質量分離法は、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良い四重極型を使用することが好ましい。さらに、定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング（ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＩＭ）や、１つ目の質量分離部で生成したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分離部で、その前駆イオンの分解によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳｅｌｅｃｔｅｄＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＲＭ）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が向上するＳＲＭによる測定が好ましい。
また、本明細書における「アルコール」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルコールを表し、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等を挙げることができるが、より適しているのは、エタノール及びメタノールである。
本発明の測定方法においては、使用する下記式（Ｉ）
【００１５】
【化７】
【００１６】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物において、Ｒ１が水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す場合が好適である。
また、本発明の測定方法において、上記式（Ｉ）で示される化合物におけるＸはヒドロキシ基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わることのできる基を意味し、本発明において特に制限はないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。本発明において、Ｘは、ヒドロキシ基であることが好ましい。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が１〜６の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を挙げることができる。
さらに、本発明の測定方法において使用される、前記式（Ｉ）で示される化合物における−ＣＯＸの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の２位である。
なお、前記式（Ｉ）の化合物はそのほとんどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既存の方法により容易に合成することができる。
さらに、本明細書において、下記式（ＩＩ）
【００１７】
【化８】
【００１８】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物におけるＲ１が水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合の化合物が好ましく、中でも、Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す場合の化合物が好適である。また、Ｒ２はエチル基又はメチル基を表す場合の化合物が好ましい。さらに、特に制限されるものではないが、ピリジン環が２位でカルボン酸エステルを介して結合している場合の化合物が好ましい。
本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、尿、糞、胆汁、組織、培養細胞、細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品、医薬品等が挙げられる。この中、好ましくは、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液が挙げられ、環境由来の試料としては、汚水、排水及び河川水が挙げられ、工業由来の試料としては、医薬品が挙げられる。
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、固相抽出、例えば、ウォーターズ社製Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ ＥｌｕｔＣ１８（登録商標）カートリッジ、ジーエルサイエンス社製ＩｎｅｒｔＳｅｐＰｈａｒｍａ（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のアルコキシ化及びピリジンカルボン酸エステル体化反応に供することができる。
アルコキシ化反応
上記で調製した試料に対し、酸性条件下でアルコールを反応させて、試料中に含まれるアルドステロンの１８位をアルコキシ化する。
この反応に用いる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩酸が望ましい。また、アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等が使用できるが、中でもメタノール及びエタノールが好適である。本反応に使用する酸とアルコールの量は特に制限されるものではないが、アルコール中に酸の割合が５％前後になるように調製した酸とアルコールの混合溶液を、試料１ｍＬ又は０．５ ｇにつき０．０１乃至１ｍＬの範囲内、より好ましくは０．１乃至０．５ ｍＬの範囲内で調製試料中に加えることが適している。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内とすることができるが、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５乃至２４０分の範囲内とすることができ、好ましくは１５分乃至９０分の範囲内の時間が適している。
エステル誘導体化反応
上記でアルコキシ化した後、更に前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、試料中に含まれる１８位がアルコキシ化されたアルドステロンの２１位をピリジンカルボン酸エステル体にする。
この反応は、一般に、上記でアルコキシ化した試料を、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒もしくはそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５乃至２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは１５分乃至９０分の範囲内の時間が適している。
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ ｍｇ、好ましくは１乃至５ ｍｇの範囲内で用いることができる。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ ｍｍｏｌ、好ましくは０．１乃至０．５ ｍｍｏｌの範囲内とすることができる。
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＸがヒドロキシ基を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物を予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒドロキシ基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。また、Ｘがハロゲン基を表す場合、式（Ｉ）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、以下のようにしてＬＣ−ＭＳによる測定を行う。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記反応において調製した調製物のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）等のＬＣ、さらにウォーターズ社製及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯＩＩ（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ ５０００（登録商標）等のＭＳを用いて行うことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
アルドステロン−１８−アルコキシ−２１−ピコリニルエステルの合成
アルドステロン１０ μｇをエタノール：塩酸（５：１、ｖ／ｖ）０．２５ｍＬに溶解し、２０分間室温で放置した。これに、精製水１ ｍＬを加え、あらかじめメタノール１ ｍＬ及び精製水１ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジに負荷し、精製水３ ｍＬ、５％重曹水２ ｍＬ、精製水３ｍＬ、アセトニトリル：精製水（２０：８０、ｖ／ｖ）１ ｍＬの順に固相カートリッジを洗浄した後、アセトニトリル：精製水（８０：２０、ｖ／ｖ）１ ｍＬで溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣にピコリン酸３０ ｍｇ、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物５０ ｍｇ及び４−ジメチルアミノピリジン２５ｍｇのテトラヒドロフラン１ ｍＬ溶液を５０ μＬ加え、室温で３０分静置した。反応後、５％重曹水１ ｍＬを加え、あらかじめメタノール１ｍＬ、精製水１ ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジに負荷した。そのカートリッジを精製水３ ｍＬ、５％ 塩酸溶液１ ｍＬ、精製水３ ｍＬで順次洗浄し、アセトニトリル：精製水（８０：２０、ｖ／ｖ）で目的化合物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固し、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルを得た。
また、アルドステロン１０ μｇをメタノール：塩酸（７：１、ｖ／ｖ）０．２５ｍＬに溶解し、２０分間室温で放置したものを以下、上記と同様にして処理を行い、アルドステロン−１８−メトキシ−２１−ピコリニルエステルを得た。
得られたアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル及びアルドステロン−１８−メトキシ−２１−ピコリニルエステルのＨｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−ＭＳ（ＨＲ−ＭＳ）、ＮＭＲデータを下記表１及び表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【実施例２】
【００２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度の比較
アルドステロンとアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルについて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度を比較した。
化合物それぞれ２０ ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬを調製し、これらをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。そして、得られたクロマトグラムより、Ｓ／Ｎ比を算出した。その結果を下記表３に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
上記測定結果より、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルは、非誘導体であるアルドステロンそれ自身で測定するよりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることが確認された。
【実施例３】
【００２６】
アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル測定の再現性
以下に述べる方法で、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル測定の日内再現性を確認した。また、日を変えて同様の試験を３回行い、日差再現性の確認をした。
３−１）検量線の作成
アルドステロンの濃度を求める際に、次のようにして検量線を作成した。すなわち、アルドステロンのそれぞれ０、１、５、２０、１００、５００及び１０００ｐｇ／５０ μＬのエタノール溶液に、内標準物質としてアルドステロン−２Ｈ７エタノール溶液を１００ｐｇ／５０ μＬ添加した。そこへ酢酸エチルを３ｍＬ加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
下記３−３）から３−４）に従い処理をしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定により含有量を求めた。どの検量線においてもアルドステロン１〜１０００ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）の範囲において、測定対象物ピーク面積値／内標準物質ピーク面積値比と濃度との関係が、相関係数０．９９以上と良好な直線性を示した。
３−２）試料の調製
活性炭処理した血清１ ｍＬにアルドステロンの標準品を下記表６及び７に示した濃度及び内標準としてアルドステロン−２Ｈ７を１００ｐｇ／５０ μＬを添加した。そこへ酢酸エチルを３ｍＬ加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
３−３）エトキシ化
残留物にエタノール：塩酸（５：１、ｖ／ｖ）を０．２５ ｍＬ加え、よく振り混ぜた後、室温で３０分間放置した。反応後、５％重曹水１ ｍＬ、酢酸エチル３ｍＬを加え、１０分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
３−４）ピリジンカルボン酸エステル誘導体化
上記で得られた残留物にピコリン酸５０ ｍｇ、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物５０ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン２０ ｍｇのテトラヒドロフラン１ ｍＬ溶液を５０μＬ、トリエチルアミンを１０ μＬ加え、混合し、５０℃で１５分放置した。反応後、５％ 塩酸１ｍＬを加え、あらかじめメタノール６ ｍＬ、精製水３ ｍＬでコンディショニングした、ＩｎｅｒｔＳｅｐＰｈａｒｍａに負荷した。そのカートリッジを精製水１ ｍＬ、５％ 重曹水１ ｍＬ、アセトニトリル：精製水（３０：７０）２．５ ｍＬで順次洗浄後、アセトニトリル：精製水（８０：２０）１．５ｍＬで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣をアセトニトリル：精製水（４０：６０）０．１ｍＬで溶解し、そのうち０．０２ ｍＬを下記表４及び５に示した条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に供した。
その結果を下記表６及び７に示す。
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
上記の結果より、アルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルは１〜１０００ ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）まで再現性良く測定できることが確認された。
【実施例４】
【００３２】
実施例４：健常人血清中のアルドステロン測定
４−１）：試料の調製
健常者１４例より血清０．２ ｍＬを採取し、これに内標準物質としてアルドステロン−２Ｈ７を１００ｐｇ／５０ μＬ添加し、酢酸エチル３ｍＬを加えて振とうした後、酢酸エチル層を凍結分離し、減圧下で溶媒を留去した。
その後、上記実施例３の３−３）及び３−４）記載の方法でエトキシ化及びピリジンカルボン酸エステル誘導体化を行った。なお、検量線は上記実施例３−１）と同様の方法で作成した。
４−２）：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
上記４−１）で得たアセトニトリル溶液０．１ ｍＬのうち、その０．０２ｍＬを上記表３及び４で示した条件に則りＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定し、血清中のアルドステロン濃度を求めた。その結果を下記表８に示す。
【００３３】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法によれば、試料中のアルドステロンの有無を検出したり、アルドステロンの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生などの分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】はアルドステロン標準品を１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステル化したときの１〜１０００ ｐｇ／ｔｕｂｅ（１０〜１００００ ｐｇ／ｍＬ）までの検量線を示す。
【図２】はアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルの前駆イオンマススペクトルである。
【図３】はアルドステロン−１８−エトキシ−２１−ピコリニルエステルのプロダクトイオンマススペクトルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
１）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２）下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す、請求項１に記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項３】
ＣＯＸの置換位置がピリジン環の２位である、請求項１又は２に記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項４】
アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１〜３のいずれかに記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項５】
試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物。
【請求項７】
R１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ２がエチル基又はメチル基を表す、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ピリジン環が２位でカルボン酸エステルを介して結合している、請求項６又は７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項６の式（ＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、アルドステロンのＬＣ−ＭＳ測定用試薬。
【請求項１】
試料中アルドステロンのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
１）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２）下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表す、請求項１に記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項３】
ＣＯＸの置換位置がピリジン環の２位である、請求項１又は２に記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項４】
アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１〜３のいずれかに記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項５】
試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のＬＣ−ＭＳによる測定法。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示される化合物。
【請求項７】
R１が水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ２がエチル基又はメチル基を表す、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ピリジン環が２位でカルボン酸エステルを介して結合している、請求項６又は７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項６の式（ＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、アルドステロンのＬＣ−ＭＳ測定用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−７８５９０（Ｐ２０１０−７８５９０Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１６５８８（Ｐ２００９−１１６５８８）
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社あすか製薬メディカル (6)
【出願人】（５０８１４５４４７）
【出願人】（５０８１４５４５８）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社あすか製薬メディカル (6)
【出願人】（５０８１４５４４７）
【出願人】（５０８１４５４５８）
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