アレルギー疾患予防治療剤
【課題】 体内の免疫環境をＴｈ２型からＴｈ１型に誘導することにより，アレルギー反応を抑制し，アレルギー疾患を予防または治療することができる薬剤を提供すること。
【解決手段】 不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体を有効成分として含有するアレルギー疾患予防治療剤。
【解決手段】 不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体を有効成分として含有するアレルギー疾患予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，不活性化Propionibacterium acnesを有効成分として含有するアレルギー疾患の予防治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）をはじめとするアレルギー患者は，ダニやスギ花粉等の特定の抗原に対して，インターロイキン４（ＩＬ−４）やＩＬ−５といったサイトカインを放出する，Ｔｈ２型に偏った免疫反応を獲得し，アレルギーを発症している。このため，アトピー性皮膚炎における急性期皮膚病変は，Ｔヘルパー（Ｔｈ）２型サイトカインの分泌の増強と関連している（Del Prete, G. 1992, Allergy. 47: 450-455）。Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４，ＩＬ−５およびＩＬ−１３は，ヒトアレルギー性炎症の維持および増幅の鍵となるサイトカインである。アレルギー性炎症を有する患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は，ＩＬ−４，ＩＬ−５，およびＩＬ−１３を産生する能力が高いが，インターフェロン（ＩＦＮ）−γの産生が限定されていることが報告されている（Jung, T., et al., 1995, J Allergy Clin Immunol. 96: 515-527; Matsuyama, T., et al., 1999, Clin Exp Allergy. 29: 687-694; Reinhold, U., et al., 1990, Clin Exp Immunol. 79: 374-379）。さらに，内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ），ＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）およびＴｈ１７細胞が，この免疫学バランスに強く関与していることが知られている。
【０００３】
アレルギー疾患の治療には，Ｔｈ２型免疫反応を抑制する免疫抑制剤や抗ヒスタミン剤が用いられている。例えば，抗アレルギー剤「Ｔｈ２サイトカイン阻害剤（製品名：ＩＰＤカプセル等）は，ＩＬ産生を抑制し，その結果ＩｇＥ抗体の産生を抑制する。しかし，免疫系を抑制する従来の治療法では，一過性のアレルギー抑制に止まり，また，免疫系の抑制による臓器の易感染性の増加が問題となっている。したがって，体内のＴｈ２に偏った免疫環境を矯正することができるアレルギー疾患の予防／治療剤が求められている。
【０００４】
ある種の細菌，例えば，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）は強いＴｈ１型免疫応答を示すことが知られている。Ｓｕｇｉｓａｋｉら（Sugisaki H., et al., J. Dermatological Science, 55, pp. 47-52 (2009)）は，免疫反応のＰ．ａｃｎｅｓ菌体に対する重要性，およびニキビの原因における細菌学的要素の評価に関する論文であり，ニキビ患者と非ニキビ患者から採取した末梢血単核球にＰ．ａｃｎｅｓ菌体を作用させたところ，ニキビ患者の末梢血単核球において，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−８が著しく増加したこと、すなわちＴｈ１型免疫応答が誘導されたことを報告している。しかし，Ｐ．ａｃｎｅｓがＴｈ２型免疫応答を阻害しうるかどうかは不明であった。また，これまでに，アトピー性皮膚炎の治療と尋常性座瘡，特にＰ．ａｃｎｅｓとの関係は明らかにされていない。Ｙａｍａｎａｋａら（Yamanaka K., et al., J. Immunology, 165, pp 997-1003 (2000)）は，ヒトカスパーゼ１がケラチン生成細胞において過剰発現するマウスを用いて，カスパーゼ１の病態生理学的役割を調査した論文であり，当該マウスに加熱処理したＰ．ａｃｎｅｓ死菌菌体を投与したところ，ＩＦＮ−γが要因で重篤な肝障害を引起したことを報告している。この肝障害は，抗ＩＬ−１８抗体を作用させたところ阻害された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sugisaki, H. et al., J. Dermatological Science, 55, pp. 47-52 (2009)
【０００６】
【非特許文献２】Yamanaka, K. et al., J. Immunology, 165, pp. 997-1003 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，アレルギー疾患の予防および治療に有用な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓを適正量投与することによりカスパーゼ−１トランスジェニック（ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ）マウスにおいて，全身的な臓器障害をひき起こすことなく，Ｔｈ１免疫応答を誘導するとともに、Ｔｈ２型免疫応答を抑制し、かつ制御性Ｔ細胞を誘導して、急性期アレルギー疾患を改善することを見いだした。すなわち，本発明は，不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓを有効成分として含有するアレルギー疾患の予防および治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚症状を示す。
【図２】図２は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスならびに野生型（ＷＴ）マウスの顔面および胴体の臨床的特徴を示す。
【図３Ａ】図３Ａは，皮膚病変部の組織病理学的観察の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは，皮膚病変部におけるマスト細胞の数を示す。
【図４Ａ】図４Ａは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図５Ａ】図５Ａは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図６Ａ】図６Ａは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は，不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を有効成分として含有するアレルギー疾患の予防および治療剤を特徴とする。Ｐ．ａｃｎｅｓはヒト皮膚の常在菌であり，尋常性座瘡（ニキビ）の原因となる細菌である。
【００１１】
下記の実施例に具体的に記載されるように，自然にアトピー性皮膚炎を発症するモデルマウスに，適切量の加熱処理したＰ．ａｃｎｅｓ死菌菌体を投与と，皮疹の発症が抑制され，皮疹スコアーが改善されるとともに，皮膚の病理組織学的にも明らかな改善が認められた。また，全身的な免疫反応についても，Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−１３産生を顕著に抑制するとともにＴｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γを上昇させることが認められた。さらに，Ｐ．ａｃｎｅｓの投与によりＴｒｅｇ細胞が誘導され，ＩＬ−１０産生Ｔ細胞（Ｔｒ１）も誘導され，これらがＡＤ皮膚病変部に見られるアレルギー性反応の抑制に寄与していることが示唆された。アレルギー患者は，アレルギー型（Ｔｈ２型）に偏った免疫反応を獲得するという特徴がある。本発明にしたがって不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体を投与することにより，アレルギー型と拮抗するＴｈ１型へと免疫系を誘導するのみならず，Ｔｈ２型の免疫反応を抑制し，さらにＴｒｅｇを誘導することにより，アレルギー反応を抑制し，免疫系を正常な状態へ誘導することが可能となる。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓは，免疫環境をＴｈ２型からＴｈ１型に変換することにより，アレルギー性炎症の症状を緩和しうることが見いだされた。
【００１２】
Ｐ．ａｃｎｅｓは，通常の嫌気性菌の培養方法により培養することができる。好ましくは，Ｌ−システインおよびＴｗｅｅｎ−８０を補充したブレイン・ハート・フュージョンで培養する。培養した細菌を慣用の方法により回収して，不活性化する。不活性化とは菌体が増殖できないよう処理することをいう。不活性化は，熱処理，放射線照射，溶媒処理，凍結乾燥などにより行うことができる。
【００１３】
このようにして得られた不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体がＴｈ１型免疫を誘導し，Ｔｈ２型免疫を抑制する能力は，例えば，末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ２８抗体／抗ＣＤ３抗体で刺激して誘導したＴ細胞を不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓと接触させ，Ｔｈ１型サイトカイン（ＩＦＮγ，ＩＬ−１２など）とＴｈ２型サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１３など）の発現を調べることにより評価することができる。また，不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓが実際にアレルギー性炎症を抑制する能力は，アトピー性皮膚炎のモデル動物を用いて評価することができる。モデル動物としては，下記の実施例で使用したＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの他，ＮＣ／Ｎｇａマウスや，化学物質を皮膚に塗布したり，特定の遺伝子の発現を抑制することにより皮膚炎を発症させる種々のモデルマウスが知られており，これらのいずれを用いてもよい。
【００１４】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，当業者に公知の方法で製剤することができる。経口投与用には，上述のようにして調製した不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体を，当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより，錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することができる。非経口投与用には，不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓを当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体または賦形剤，例えば，滅菌水や生理食塩水，植物油，乳化剤，懸濁剤，界面活性剤，安定剤，香味剤，賦形剤，ベヒクル，防腐剤，結合剤などと適宜組み合わせて製剤することができる。特に，本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，ローション，軟膏，クリーム，パック，貼付剤などの形態で，皮膚外用剤として製剤化することができる。
【００１５】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，経口投与してもよく，非経口投与，例えば，注射，注入，経鼻投与，または経皮投与してもよい。好ましくは皮膚の疾患部に局所的に投与する。本発明のアレルギー疾患予防治療剤の投与量は，症状，投与経路，患者の体重および年齢，併用する他の薬剤などにより異なるが，Ｐ．ａｃｎｅｓ乾燥重量として例えば１日あたり体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲の量を投与することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１７】
１． 材料および方法
１．１ アトピー性皮膚炎（ＡＤ）マウスモデル
ＡＤのモデルとして，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスを用いた（Yamanaka K. et al., 2000, J Immunol. 165: 997-1003; Yoshimoto T. et al., 2000, Nat Immunol. 1: 132-137; Konishi H. et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 11340-11345）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスはケラチン１４プロモーターにより推進されるカスパーゼ−１のトランスジェニックマウスであり，内因性ＩＬ−１８およびＩＬ−１βを表皮に構成的に分泌し，難治性掻痒性皮膚炎を発症する。皮膚炎は顔面から始まり，次に四肢および胴体に広がる。疾患の初期では急性の浸食性病変を特徴とし，特定の無病原性（ＳＰＦ）条件下ではその後慢性の苔癬様病変を生ずる。組織病理学的には，浸潤した皮膚血管のまわりに単核細胞および皮膚線維症が認められる。マスト細胞が浸潤し，血漿ヒスタミンレベルが顕著に上昇する。これらの症状および特徴はすべてヒトのアトピー性皮膚炎の特徴と一致する。
【００１８】
１．２ Ｐ．ａｃｎｅｓ処置
Ｐ．ａｃｎｅｓは，Ｔｓｕｔｓｕｉら（Tsutsui, H., et al, J Immunol. 159: 3961-3967, 1997）の記載にしたがって調製した。簡単には，Ｐ．ａｃｎｅｓをＬ−システインおよびＴｗｅｅｎ−８０を補充したブレイン・ハート・フュージョン培地で培養した。細菌を回収して滅菌蒸留水で洗浄し，次に６０℃で６０分間加熱することにより殺菌し，凍結乾燥した。この実験では，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス（ｎ＝１０），Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス（ｎ＝９），野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）を用いた。すべてのマウスはＳＰＦ条件で維持した。４から１４週齢のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスに５０μｌの３．３％熱死滅Ｐ．ａｃｎｅｓを１週間に２回腹腔内注入した。
【００１９】
１．３ 組織病理学的実験
１４週でマウスから皮膚をサンプリングした。サンプルをパラフィンに包埋して，切片を作製し，慣用のヘマトキシリン・エオシン染色およびトルイジンブルー染色を行った。
【００２０】
１．４ 細胞の単離および培養
１４週で脾臓を摘出し，単細胞懸濁物を調製した。組織を孔径７０μｍのメッシュに通し，リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を遠心分離し，５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞サンプルをＦｉｃｏｌｌ（SIGMA, St. Louis, MO）に重層し，末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収して，１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
【００２１】
ＰＢＭＣは，１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＩＬ−１０の分析には５％のネズミ血清を用いた），２．０ｍＭのＬ−グルタミン，１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０完全培地で，２４ウエル培養プレート（Costar, New York, USA）で細胞密度２×１０６細胞／ｍｌ（１ｍｌ／ウエル）で培養した。
【００２２】
サイトカイン産生をインビトロで刺激するために，細胞の培養開始時に培養液に１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ｅ抗体（BD Pharmingen, San Jose, CA），２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ２８抗体（BD Pharmingen）および１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Biolegend, San Diego, CA）を加えて，３７℃，５％ＣＯ２雰囲気下で８時間インキュベーションした。
【００２３】
１．５ 細胞表面抗原および細胞内サイトカインの染色
細胞表面抗原および細胞内サイトカインは，Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol and Intracellular Cytokine Staining Protocol（BioLegend）のプロトコルにしたがって染色した。簡単には，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−４，ＩＬ−１７の検出用には，刺激した細胞をＰＥ／Ｃｙ５抗マウスＣＤ４（BioLegend）で染色した。洗浄した後，細胞をFixation Buffer（BioLegend）中で固定し，Permeabilization Wash Buffer（BioLegend）に再懸濁した後，ＰＥコンジュゲート化抗マウスＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−４，またはＦＩＴＣコンジュゲート化ＩＦＮ−γで染色した。ＩＬ−１０の検出用には，刺激した細胞をＦＩＴＣ抗−マウスＣＤ４（BioLegend）およびＰＥコンジュゲート化抗マウスＩＬ−１０（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）で染色した。蛍光プロファイルは，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BDbiosciences, San Jose, CA）を用いるフローサイトメトリにより分析した。
【００２４】
１．６ ＦｏｘＰ３の細胞内染色
細胞を最初にＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４およびＰＥ／Ｃｙ５抗マウスＣＤ２５で染色し，ＦｏｘＰ３Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍｓｏｌｕｔｉｏｎ（BioLegend）中で固定した。次に細胞をＰＥコンジュゲート化抗マウスＦｏｘＰ３抗体（BioLegend）で染色した。蛍光プロファイルは，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリにより分析した。
【００２５】
１．７ サイトカインｍＲＮＡ発現の分析
ｍＲＮＡは，脾臓細胞に由来するＰＢＭＣまたは耳の皮膚からＩｓｏｇｅｎ（Nippon Gene, Tokyo, Japan）を用いて，製造元の指針にしたがって抽出した。１ｍｌのホモジネートを２００μｌのクロロホルムと混合した後，遠心分離した。水性相を分離し，０．５ｍｌの２−プロパノールと混合してＲＮＡを沈殿させた。遠心分離した後，沈殿物を７５％エタノール（Nacalai Tesque）で洗浄し，ＲＮＡを４０μｌのＲＮａｓｅフリー水に溶解した。濃度は２６０ｎｍの吸光度に基づいて計算し，電気泳動により質を確認した。ｃＤＮＡは，２μｇのｍＲＮＡからＡｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（ABI, Foster City, CA, USA）を用いて，製造元の指針にしたがって合成した。
【００２６】
脾臓細胞および皮膚病変部における転写活性は，定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。１μｇのｃＤＮＡ，９００ｎｍｏｌの各プライマー，および２５０ｎｍｏｌのＴａｑＭａｎプローブを含む２５μｌの反応混合物を，１２．５μｌのＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）と混合した。ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２ｐ３５，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１３，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，ＩＬ−２３ｐ１９，ＩＬ−１７ＡＲ，ＭＩＰ２，Ｔ−ｂｅｔ，ＧＡＴＡ３，ＩＦＮ−γ，およびＧＡＰＤＨ（ＡＢＩ）について，サイトカイン転写産物についての定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ΔδＣｔ法を用いて転写産物のレベルをＧＡＰＤＨに対して標準化し，対照マウスについて検出されたレベルに対して何倍の誘導であるかを計算した。
【００２７】
１．８統計学的分析
統計学的分析は，Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストを用いて行った。結果は平均±ＳＤで示す。各図中，＊はＰ＜０．０５を，＊＊はＰ＜０．０１を，＊＊＊はＰ＜０．００１を，＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。
【００２８】
２． 結果
疾患部皮膚の表面積および全身の表面積を，８週から１４週まで２週間ごとに調べ，疾患部皮膚表面積の，全身表面積に対するパーセントとして評価した。結果を図１に示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスは，８週で顔面からびらん性皮膚炎を発症し，次にこれは急速に耳および頸部に広がった。皮膚病変部の面積のパーセンテージは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１ＴｇマウスではＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスより低かった。
【００２９】
Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスならびに野生型マウスの１４週における顔面および胴体の臨床的特徴を図２に示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは顔面および胴体に顕著な皮膚炎が認められた。びらん性病変部の上皮形成に続き，毛が消失した苔癬様皮膚炎および多発性皮膚潰瘍が生じた。耳および眼瞼は変形し，顔面の体毛は喪失し，多数の瘢痕をもつ皮膚のみが残った。マウスは皮膚病変部を激しく掻いた。これに対し，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置マウスでは，皮膚炎の程度が抑制され，眼周囲領域に限定されていた。
【００３０】
これらの結果から，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置により，皮膚症状が改善されたことがわかる。
【００３１】
皮膚病変部の組織病理学的観察の結果を図３Ａに示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスは，１４週齢で，皮膚病変部において顕著な炎症性反応を示した。表皮は角質増殖症を伴う表皮肥厚を示し，病変部のケラチノサイトは核濃縮を伴う好酸性壊死を示した。真皮には，顕著な線維症を伴う有意な単核細胞浸潤が認められた。Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは，皮膚病変部に軽い炎症性反応または表皮肥厚があった。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは，組織病理学的変化，例えば，炎症性細胞浸潤，表皮肥厚および重症の浮腫が抑制されていた。
【００３２】
皮膚病変部におけるマスト細胞の存在は，Ｔｈ２型皮膚炎と密接に関連していることが知られているため，トルイジンブルー染色によりマスト細胞の数を調べた（図３Ｂ）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚病変部ではトルイジンブルー陽性細胞の割合が増加しており，皮膚のマスト細胞浸潤を示していた。これに対し，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照マウスの皮膚病変部は，限定された数のマスト細胞を示し，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較してマスト細胞浸潤が有意に減少していた（図３Ｂ）。
【００３３】
脾臓細胞におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現を調べるために，定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図４Ａ−Ｄに示す。
【００３４】
Ｔｈ１サイトカインｍＲＮＡであるＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２Ｐ３５，Ｌ−１２ｐ４０，およびＴ−ｂｅｔのｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓで処理したＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて，未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型マウスと比較して有意に増加していた（図４Ａ）。一方，Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４，ＩＬ−１３，およびＧＡＴＡ３のｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓによる処置後でも変わらなかった（図４Ｂ）。Ｔｈ１７サイトカインカスケードに関与するＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，およびＩＬ−２３ｐ１９のｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスおよび未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの両方で増加していた（図４Ｃ）。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現レベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照と比較して有意に増加していた（図４Ｄ）。
【００３５】
次に，脾臓細胞の細胞内サイトカイン分布をフローサイトメトリにより分析した。結果を図５に示す。Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの脾臓ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋，ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋，およびＩＦＮ−γ＋リンパ球のパーセンテージは，未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較して増加していた（図５Ａ，５Ｂ，５Ｃ）。一方，ＩＬ−４＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージは，３群で変わらなかった（図５Ｄ）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団（ｎＴｒｅｇ）のパーセンテージは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較して有意に増加していた（図５Ｅ）。ＩＬ−１７＋ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｈ１７）およびＩＬ−１０＋ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｒ１）はＰ．ａｃｎｅｓ処置の後にわずかに増加していた（図５Ｆ，５Ｇ）。
【００３６】
さらに，皮膚病変部における各サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを調べた。結果を図６に示す。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照と比較して有意に増加しており，これは脾臓細胞で観察された上述の結果と一致した（図６Ａ）。一方，ＩＬ−４，ＩＬ−１３，およびＧＡＴＡ３のｍＲＮＡレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１ＴｇマウスとＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスとの間で変化がなかった（図６Ｂ）。また，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，２３ｍＲＮＡのレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚病変部において有意差はなかった。ＩＬ−１７ＡレセプターのメッセンジャーはＰ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて減少しており，ＭＩＰ２転写産物のレベルはＰ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較してわずかに低下していた（図６Ｃ）。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡレベルはＰ．ａｃｎｅｓ処置によって変わらなかった（図６Ｄ）。
【００３７】
以上の結果をまとめると，ＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現はＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの脾臓細胞および皮膚病変部で増加していたが，これはＰ．ａｃｎｅｓ処置によって変わらなかった。このことは，Ｐ．ａｃｎｅｓの投与が強いＴｈ１型免疫応答を誘導することによりＴｈ２−サイトカイン優性アポトーシス炎症の発症を阻害したことを示す。また，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置マウスにおいてＴＧＦ−βの発現が上昇していること，およびＰ．ａｃｎｅｓ処置マウスの脾臓細胞においてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが増加していることが示された。ＴＧＦ−βは，Ｔｒｅｇにより産生される重要な制御性サイトカインであり，Ｔｒｅｇ産生はＴＧＦ−βにより増加することが報告されている。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置によってがＴｒｅｇ細胞が誘導されたことが示された。さらに，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置によりＩＬ−１０産生Ｔ細胞（Ｔｒ１）も誘導された。これらの結果は，Ｐ．ａｃｎｅｓが内在性制御性ＴｒｅｇおよびＴｒ１の両方を誘導し，これらがＡＤ皮膚病変部に見られるアレルギー性反応の抑制に寄与している可能性を示す。
【００３８】
以上のことから，Ｐ．ａｃｎｅｓがアトピー性皮膚炎においてＴｈ２優位のサイトカイン環境を緩和し，Ｔｒｅｇ細胞の生成を誘導するのに有効であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，アトピー性皮膚炎を始めとして様々なアレルギー疾患に対する予防および治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，不活性化Propionibacterium acnesを有効成分として含有するアレルギー疾患の予防治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）をはじめとするアレルギー患者は，ダニやスギ花粉等の特定の抗原に対して，インターロイキン４（ＩＬ−４）やＩＬ−５といったサイトカインを放出する，Ｔｈ２型に偏った免疫反応を獲得し，アレルギーを発症している。このため，アトピー性皮膚炎における急性期皮膚病変は，Ｔヘルパー（Ｔｈ）２型サイトカインの分泌の増強と関連している（Del Prete, G. 1992, Allergy. 47: 450-455）。Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４，ＩＬ−５およびＩＬ−１３は，ヒトアレルギー性炎症の維持および増幅の鍵となるサイトカインである。アレルギー性炎症を有する患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は，ＩＬ−４，ＩＬ−５，およびＩＬ−１３を産生する能力が高いが，インターフェロン（ＩＦＮ）−γの産生が限定されていることが報告されている（Jung, T., et al., 1995, J Allergy Clin Immunol. 96: 515-527; Matsuyama, T., et al., 1999, Clin Exp Allergy. 29: 687-694; Reinhold, U., et al., 1990, Clin Exp Immunol. 79: 374-379）。さらに，内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ），ＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）およびＴｈ１７細胞が，この免疫学バランスに強く関与していることが知られている。
【０００３】
アレルギー疾患の治療には，Ｔｈ２型免疫反応を抑制する免疫抑制剤や抗ヒスタミン剤が用いられている。例えば，抗アレルギー剤「Ｔｈ２サイトカイン阻害剤（製品名：ＩＰＤカプセル等）は，ＩＬ産生を抑制し，その結果ＩｇＥ抗体の産生を抑制する。しかし，免疫系を抑制する従来の治療法では，一過性のアレルギー抑制に止まり，また，免疫系の抑制による臓器の易感染性の増加が問題となっている。したがって，体内のＴｈ２に偏った免疫環境を矯正することができるアレルギー疾患の予防／治療剤が求められている。
【０００４】
ある種の細菌，例えば，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）は強いＴｈ１型免疫応答を示すことが知られている。Ｓｕｇｉｓａｋｉら（Sugisaki H., et al., J. Dermatological Science, 55, pp. 47-52 (2009)）は，免疫反応のＰ．ａｃｎｅｓ菌体に対する重要性，およびニキビの原因における細菌学的要素の評価に関する論文であり，ニキビ患者と非ニキビ患者から採取した末梢血単核球にＰ．ａｃｎｅｓ菌体を作用させたところ，ニキビ患者の末梢血単核球において，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−８が著しく増加したこと、すなわちＴｈ１型免疫応答が誘導されたことを報告している。しかし，Ｐ．ａｃｎｅｓがＴｈ２型免疫応答を阻害しうるかどうかは不明であった。また，これまでに，アトピー性皮膚炎の治療と尋常性座瘡，特にＰ．ａｃｎｅｓとの関係は明らかにされていない。Ｙａｍａｎａｋａら（Yamanaka K., et al., J. Immunology, 165, pp 997-1003 (2000)）は，ヒトカスパーゼ１がケラチン生成細胞において過剰発現するマウスを用いて，カスパーゼ１の病態生理学的役割を調査した論文であり，当該マウスに加熱処理したＰ．ａｃｎｅｓ死菌菌体を投与したところ，ＩＦＮ−γが要因で重篤な肝障害を引起したことを報告している。この肝障害は，抗ＩＬ−１８抗体を作用させたところ阻害された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sugisaki, H. et al., J. Dermatological Science, 55, pp. 47-52 (2009)
【０００６】
【非特許文献２】Yamanaka, K. et al., J. Immunology, 165, pp. 997-1003 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，アレルギー疾患の予防および治療に有用な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓを適正量投与することによりカスパーゼ−１トランスジェニック（ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ）マウスにおいて，全身的な臓器障害をひき起こすことなく，Ｔｈ１免疫応答を誘導するとともに、Ｔｈ２型免疫応答を抑制し、かつ制御性Ｔ細胞を誘導して、急性期アレルギー疾患を改善することを見いだした。すなわち，本発明は，不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓを有効成分として含有するアレルギー疾患の予防および治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚症状を示す。
【図２】図２は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスならびに野生型（ＷＴ）マウスの顔面および胴体の臨床的特徴を示す。
【図３Ａ】図３Ａは，皮膚病変部の組織病理学的観察の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは，皮膚病変部におけるマスト細胞の数を示す。
【図４Ａ】図４Ａは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは，脾臓細胞における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図５Ａ】図５Ａは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは，脾臓細胞における各種サイトカインのフローサイトメトリ分析を示す。
【図６Ａ】図６Ａは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは，皮膚病変部における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は，不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を有効成分として含有するアレルギー疾患の予防および治療剤を特徴とする。Ｐ．ａｃｎｅｓはヒト皮膚の常在菌であり，尋常性座瘡（ニキビ）の原因となる細菌である。
【００１１】
下記の実施例に具体的に記載されるように，自然にアトピー性皮膚炎を発症するモデルマウスに，適切量の加熱処理したＰ．ａｃｎｅｓ死菌菌体を投与と，皮疹の発症が抑制され，皮疹スコアーが改善されるとともに，皮膚の病理組織学的にも明らかな改善が認められた。また，全身的な免疫反応についても，Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−１３産生を顕著に抑制するとともにＴｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γを上昇させることが認められた。さらに，Ｐ．ａｃｎｅｓの投与によりＴｒｅｇ細胞が誘導され，ＩＬ−１０産生Ｔ細胞（Ｔｒ１）も誘導され，これらがＡＤ皮膚病変部に見られるアレルギー性反応の抑制に寄与していることが示唆された。アレルギー患者は，アレルギー型（Ｔｈ２型）に偏った免疫反応を獲得するという特徴がある。本発明にしたがって不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体を投与することにより，アレルギー型と拮抗するＴｈ１型へと免疫系を誘導するのみならず，Ｔｈ２型の免疫反応を抑制し，さらにＴｒｅｇを誘導することにより，アレルギー反応を抑制し，免疫系を正常な状態へ誘導することが可能となる。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓは，免疫環境をＴｈ２型からＴｈ１型に変換することにより，アレルギー性炎症の症状を緩和しうることが見いだされた。
【００１２】
Ｐ．ａｃｎｅｓは，通常の嫌気性菌の培養方法により培養することができる。好ましくは，Ｌ−システインおよびＴｗｅｅｎ−８０を補充したブレイン・ハート・フュージョンで培養する。培養した細菌を慣用の方法により回収して，不活性化する。不活性化とは菌体が増殖できないよう処理することをいう。不活性化は，熱処理，放射線照射，溶媒処理，凍結乾燥などにより行うことができる。
【００１３】
このようにして得られた不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体がＴｈ１型免疫を誘導し，Ｔｈ２型免疫を抑制する能力は，例えば，末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ２８抗体／抗ＣＤ３抗体で刺激して誘導したＴ細胞を不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓと接触させ，Ｔｈ１型サイトカイン（ＩＦＮγ，ＩＬ−１２など）とＴｈ２型サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１３など）の発現を調べることにより評価することができる。また，不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓが実際にアレルギー性炎症を抑制する能力は，アトピー性皮膚炎のモデル動物を用いて評価することができる。モデル動物としては，下記の実施例で使用したＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの他，ＮＣ／Ｎｇａマウスや，化学物質を皮膚に塗布したり，特定の遺伝子の発現を抑制することにより皮膚炎を発症させる種々のモデルマウスが知られており，これらのいずれを用いてもよい。
【００１４】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，当業者に公知の方法で製剤することができる。経口投与用には，上述のようにして調製した不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓ菌体を，当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより，錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することができる。非経口投与用には，不活性化Ｐ．ａｃｎｅｓを当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体または賦形剤，例えば，滅菌水や生理食塩水，植物油，乳化剤，懸濁剤，界面活性剤，安定剤，香味剤，賦形剤，ベヒクル，防腐剤，結合剤などと適宜組み合わせて製剤することができる。特に，本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，ローション，軟膏，クリーム，パック，貼付剤などの形態で，皮膚外用剤として製剤化することができる。
【００１５】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，経口投与してもよく，非経口投与，例えば，注射，注入，経鼻投与，または経皮投与してもよい。好ましくは皮膚の疾患部に局所的に投与する。本発明のアレルギー疾患予防治療剤の投与量は，症状，投与経路，患者の体重および年齢，併用する他の薬剤などにより異なるが，Ｐ．ａｃｎｅｓ乾燥重量として例えば１日あたり体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲の量を投与することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１７】
１． 材料および方法
１．１ アトピー性皮膚炎（ＡＤ）マウスモデル
ＡＤのモデルとして，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスを用いた（Yamanaka K. et al., 2000, J Immunol. 165: 997-1003; Yoshimoto T. et al., 2000, Nat Immunol. 1: 132-137; Konishi H. et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 11340-11345）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスはケラチン１４プロモーターにより推進されるカスパーゼ−１のトランスジェニックマウスであり，内因性ＩＬ−１８およびＩＬ−１βを表皮に構成的に分泌し，難治性掻痒性皮膚炎を発症する。皮膚炎は顔面から始まり，次に四肢および胴体に広がる。疾患の初期では急性の浸食性病変を特徴とし，特定の無病原性（ＳＰＦ）条件下ではその後慢性の苔癬様病変を生ずる。組織病理学的には，浸潤した皮膚血管のまわりに単核細胞および皮膚線維症が認められる。マスト細胞が浸潤し，血漿ヒスタミンレベルが顕著に上昇する。これらの症状および特徴はすべてヒトのアトピー性皮膚炎の特徴と一致する。
【００１８】
１．２ Ｐ．ａｃｎｅｓ処置
Ｐ．ａｃｎｅｓは，Ｔｓｕｔｓｕｉら（Tsutsui, H., et al, J Immunol. 159: 3961-3967, 1997）の記載にしたがって調製した。簡単には，Ｐ．ａｃｎｅｓをＬ−システインおよびＴｗｅｅｎ−８０を補充したブレイン・ハート・フュージョン培地で培養した。細菌を回収して滅菌蒸留水で洗浄し，次に６０℃で６０分間加熱することにより殺菌し，凍結乾燥した。この実験では，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス（ｎ＝１０），Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス（ｎ＝９），野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）を用いた。すべてのマウスはＳＰＦ条件で維持した。４から１４週齢のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスに５０μｌの３．３％熱死滅Ｐ．ａｃｎｅｓを１週間に２回腹腔内注入した。
【００１９】
１．３ 組織病理学的実験
１４週でマウスから皮膚をサンプリングした。サンプルをパラフィンに包埋して，切片を作製し，慣用のヘマトキシリン・エオシン染色およびトルイジンブルー染色を行った。
【００２０】
１．４ 細胞の単離および培養
１４週で脾臓を摘出し，単細胞懸濁物を調製した。組織を孔径７０μｍのメッシュに通し，リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を遠心分離し，５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞サンプルをＦｉｃｏｌｌ（SIGMA, St. Louis, MO）に重層し，末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収して，１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
【００２１】
ＰＢＭＣは，１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＩＬ−１０の分析には５％のネズミ血清を用いた），２．０ｍＭのＬ−グルタミン，１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０完全培地で，２４ウエル培養プレート（Costar, New York, USA）で細胞密度２×１０６細胞／ｍｌ（１ｍｌ／ウエル）で培養した。
【００２２】
サイトカイン産生をインビトロで刺激するために，細胞の培養開始時に培養液に１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ｅ抗体（BD Pharmingen, San Jose, CA），２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ２８抗体（BD Pharmingen）および１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Biolegend, San Diego, CA）を加えて，３７℃，５％ＣＯ２雰囲気下で８時間インキュベーションした。
【００２３】
１．５ 細胞表面抗原および細胞内サイトカインの染色
細胞表面抗原および細胞内サイトカインは，Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol and Intracellular Cytokine Staining Protocol（BioLegend）のプロトコルにしたがって染色した。簡単には，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−４，ＩＬ−１７の検出用には，刺激した細胞をＰＥ／Ｃｙ５抗マウスＣＤ４（BioLegend）で染色した。洗浄した後，細胞をFixation Buffer（BioLegend）中で固定し，Permeabilization Wash Buffer（BioLegend）に再懸濁した後，ＰＥコンジュゲート化抗マウスＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−４，またはＦＩＴＣコンジュゲート化ＩＦＮ−γで染色した。ＩＬ−１０の検出用には，刺激した細胞をＦＩＴＣ抗−マウスＣＤ４（BioLegend）およびＰＥコンジュゲート化抗マウスＩＬ−１０（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）で染色した。蛍光プロファイルは，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BDbiosciences, San Jose, CA）を用いるフローサイトメトリにより分析した。
【００２４】
１．６ ＦｏｘＰ３の細胞内染色
細胞を最初にＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４およびＰＥ／Ｃｙ５抗マウスＣＤ２５で染色し，ＦｏｘＰ３Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍｓｏｌｕｔｉｏｎ（BioLegend）中で固定した。次に細胞をＰＥコンジュゲート化抗マウスＦｏｘＰ３抗体（BioLegend）で染色した。蛍光プロファイルは，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリにより分析した。
【００２５】
１．７ サイトカインｍＲＮＡ発現の分析
ｍＲＮＡは，脾臓細胞に由来するＰＢＭＣまたは耳の皮膚からＩｓｏｇｅｎ（Nippon Gene, Tokyo, Japan）を用いて，製造元の指針にしたがって抽出した。１ｍｌのホモジネートを２００μｌのクロロホルムと混合した後，遠心分離した。水性相を分離し，０．５ｍｌの２−プロパノールと混合してＲＮＡを沈殿させた。遠心分離した後，沈殿物を７５％エタノール（Nacalai Tesque）で洗浄し，ＲＮＡを４０μｌのＲＮａｓｅフリー水に溶解した。濃度は２６０ｎｍの吸光度に基づいて計算し，電気泳動により質を確認した。ｃＤＮＡは，２μｇのｍＲＮＡからＡｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（ABI, Foster City, CA, USA）を用いて，製造元の指針にしたがって合成した。
【００２６】
脾臓細胞および皮膚病変部における転写活性は，定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。１μｇのｃＤＮＡ，９００ｎｍｏｌの各プライマー，および２５０ｎｍｏｌのＴａｑＭａｎプローブを含む２５μｌの反応混合物を，１２．５μｌのＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）と混合した。ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２ｐ３５，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１３，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，ＩＬ−２３ｐ１９，ＩＬ−１７ＡＲ，ＭＩＰ２，Ｔ−ｂｅｔ，ＧＡＴＡ３，ＩＦＮ−γ，およびＧＡＰＤＨ（ＡＢＩ）について，サイトカイン転写産物についての定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ΔδＣｔ法を用いて転写産物のレベルをＧＡＰＤＨに対して標準化し，対照マウスについて検出されたレベルに対して何倍の誘導であるかを計算した。
【００２７】
１．８統計学的分析
統計学的分析は，Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストを用いて行った。結果は平均±ＳＤで示す。各図中，＊はＰ＜０．０５を，＊＊はＰ＜０．０１を，＊＊＊はＰ＜０．００１を，＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。
【００２８】
２． 結果
疾患部皮膚の表面積および全身の表面積を，８週から１４週まで２週間ごとに調べ，疾患部皮膚表面積の，全身表面積に対するパーセントとして評価した。結果を図１に示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスは，８週で顔面からびらん性皮膚炎を発症し，次にこれは急速に耳および頸部に広がった。皮膚病変部の面積のパーセンテージは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１ＴｇマウスではＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスより低かった。
【００２９】
Ｐ．ａｃｎｅｓ処置および未処置のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスならびに野生型マウスの１４週における顔面および胴体の臨床的特徴を図２に示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは顔面および胴体に顕著な皮膚炎が認められた。びらん性病変部の上皮形成に続き，毛が消失した苔癬様皮膚炎および多発性皮膚潰瘍が生じた。耳および眼瞼は変形し，顔面の体毛は喪失し，多数の瘢痕をもつ皮膚のみが残った。マウスは皮膚病変部を激しく掻いた。これに対し，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置マウスでは，皮膚炎の程度が抑制され，眼周囲領域に限定されていた。
【００３０】
これらの結果から，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置により，皮膚症状が改善されたことがわかる。
【００３１】
皮膚病変部の組織病理学的観察の結果を図３Ａに示す。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスは，１４週齢で，皮膚病変部において顕著な炎症性反応を示した。表皮は角質増殖症を伴う表皮肥厚を示し，病変部のケラチノサイトは核濃縮を伴う好酸性壊死を示した。真皮には，顕著な線維症を伴う有意な単核細胞浸潤が認められた。Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは，皮膚病変部に軽い炎症性反応または表皮肥厚があった。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは，組織病理学的変化，例えば，炎症性細胞浸潤，表皮肥厚および重症の浮腫が抑制されていた。
【００３２】
皮膚病変部におけるマスト細胞の存在は，Ｔｈ２型皮膚炎と密接に関連していることが知られているため，トルイジンブルー染色によりマスト細胞の数を調べた（図３Ｂ）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚病変部ではトルイジンブルー陽性細胞の割合が増加しており，皮膚のマスト細胞浸潤を示していた。これに対し，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照マウスの皮膚病変部は，限定された数のマスト細胞を示し，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較してマスト細胞浸潤が有意に減少していた（図３Ｂ）。
【００３３】
脾臓細胞におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現を調べるために，定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図４Ａ−Ｄに示す。
【００３４】
Ｔｈ１サイトカインｍＲＮＡであるＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２Ｐ３５，Ｌ−１２ｐ４０，およびＴ−ｂｅｔのｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓで処理したＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて，未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型マウスと比較して有意に増加していた（図４Ａ）。一方，Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４，ＩＬ−１３，およびＧＡＴＡ３のｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓによる処置後でも変わらなかった（図４Ｂ）。Ｔｈ１７サイトカインカスケードに関与するＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，およびＩＬ−２３ｐ１９のｍＲＮＡの発現は，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスおよび未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの両方で増加していた（図４Ｃ）。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現レベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて，ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照と比較して有意に増加していた（図４Ｄ）。
【００３５】
次に，脾臓細胞の細胞内サイトカイン分布をフローサイトメトリにより分析した。結果を図５に示す。Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの脾臓ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋，ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋，およびＩＦＮ−γ＋リンパ球のパーセンテージは，未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較して増加していた（図５Ａ，５Ｂ，５Ｃ）。一方，ＩＬ−４＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージは，３群で変わらなかった（図５Ｄ）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団（ｎＴｒｅｇ）のパーセンテージは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較して有意に増加していた（図５Ｅ）。ＩＬ−１７＋ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｈ１７）およびＩＬ−１０＋ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｒ１）はＰ．ａｃｎｅｓ処置の後にわずかに増加していた（図５Ｆ，５Ｇ）。
【００３６】
さらに，皮膚病変部における各サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを調べた。結果を図６に示す。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは野生型対照と比較して有意に増加しており，これは脾臓細胞で観察された上述の結果と一致した（図６Ａ）。一方，ＩＬ−４，ＩＬ−１３，およびＧＡＴＡ３のｍＲＮＡレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１ＴｇマウスとＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスとの間で変化がなかった（図６Ｂ）。また，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−２２，２３ｍＲＮＡのレベルは，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚病変部において有意差はなかった。ＩＬ−１７ＡレセプターのメッセンジャーはＰ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスまたは未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて減少しており，ＭＩＰ２転写産物のレベルはＰ．ａｃｎｅｓ処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスにおいて未処置ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスと比較してわずかに低下していた（図６Ｃ）。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡレベルはＰ．ａｃｎｅｓ処置によって変わらなかった（図６Ｄ）。
【００３７】
以上の結果をまとめると，ＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現はＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの脾臓細胞および皮膚病変部で増加していたが，これはＰ．ａｃｎｅｓ処置によって変わらなかった。このことは，Ｐ．ａｃｎｅｓの投与が強いＴｈ１型免疫応答を誘導することによりＴｈ２−サイトカイン優性アポトーシス炎症の発症を阻害したことを示す。また，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置マウスにおいてＴＧＦ−βの発現が上昇していること，およびＰ．ａｃｎｅｓ処置マウスの脾臓細胞においてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが増加していることが示された。ＴＧＦ−βは，Ｔｒｅｇにより産生される重要な制御性サイトカインであり，Ｔｒｅｇ産生はＴＧＦ−βにより増加することが報告されている。すなわち，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置によってがＴｒｅｇ細胞が誘導されたことが示された。さらに，Ｐ．ａｃｎｅｓ処置によりＩＬ−１０産生Ｔ細胞（Ｔｒ１）も誘導された。これらの結果は，Ｐ．ａｃｎｅｓが内在性制御性ＴｒｅｇおよびＴｒ１の両方を誘導し，これらがＡＤ皮膚病変部に見られるアレルギー性反応の抑制に寄与している可能性を示す。
【００３８】
以上のことから，Ｐ．ａｃｎｅｓがアトピー性皮膚炎においてＴｈ２優位のサイトカイン環境を緩和し，Ｔｒｅｇ細胞の生成を誘導するのに有効であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のアレルギー疾患予防治療剤は，アトピー性皮膚炎を始めとして様々なアレルギー疾患に対する予防および治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体を有効成分として含有するアレルギー疾患予防治療剤。
【請求項２】
不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体が熱処理により不活性化された菌体である，請求項１記載のアレルギー疾患予防治療剤。
【請求項１】
不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体を有効成分として含有するアレルギー疾患予防治療剤。
【請求項２】
不活性化Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌体が熱処理により不活性化された菌体である，請求項１記載のアレルギー疾患予防治療剤。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【公開番号】特開２０１１−７４０３８（Ｐ２０１１−７４０３８Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２９３８６（Ｐ２００９−２２９３８６）
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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