アレルゲン特定用標準アレルゲン及びアレルゲン検出用抗体並びにその利用
【課題】甲殻類由来の新規アレルゲンを提供する。
【解決手段】本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなる。本発明によれば、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。
【解決手段】本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなる。本発明によれば、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲン特定用標準アレルゲン及びアレルゲン検出用抗体に関し、更に、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、並びにアレルゲン感受性測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国における食物アレルギーの主な原因食物は、卵、牛乳、大豆、エビ・カニや魚類などである。年齢によって原因食物の頻度は異なり、成人ではエビ・カニなどの甲殻類によるアレルギーがもっとも高頻度に認められる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
エビ・カニなどの甲殻類によるアレルギーは即時型であり、摂食（あるいは接触）の直後から３０分以内に口腔粘膜症状（口唇のしびれ、浮腫など）、皮膚症状（蕁麻疹など）、消化器症状（吐き気、嘔吐、下痢など）や呼吸器症状（喘息、息切れなど）が出現する。ときには重篤な全身性のアナフィラキシーショックに陥ることもある（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
従来、甲殻類によるアレルギーの原因物質としては、エビトロポミオシン(TMS)やエビアルギニンキナーゼ(AK)が同定されていた（例えば、非特許文献３及び４参照。）。
【非特許文献１】Yoneyama K, Ono A. Study of food allergy among university students in Japan. Allergology International 2002; 51: 205-208.
【非特許文献２】中村 晋、飯倉洋治: 最新食物アレルギー. 永井書店 2004; 241-244.
【非特許文献３】Daul CB, Slattery M, Reese G, et al : Identification of the major brown shrimp（Penaeus aztecus）allergen as the muscle protein tropomyosin. Int Arch Allergy Immunol 1994; 105: 49-55.
【非特許文献４】Yu CJ, Lin YF, Chiang BL, Chow LP. Proteomics and immunological analysis of a novel shrimp allergen, Pen m 2. J Immunol. 2003; 170: 445-453.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
甲殻類由来の食物に対するアレルギー患者の多くは、トロポミオシン(TMS)とアルギニンキナーゼ(AK)の両方あるいはいずれかのＩｇＥ抗体を保有する。しかしながら、これらのアレルゲンに対する抗体が陰性である患者もあることから，他の未同定アレルゲンもまた発症に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００６】
したがって本発明の目的は、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、エビ尾肉（筋肉）やカニの脚肉(筋肉)に含まれるカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）がアレルゲンであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
（１）甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするアレルゲン特定用標準アレルゲン。
【００１０】
（２）前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である前記（１）記載のアレルゲン。
【００１１】
（３）前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である前記（１）又は（２）記載のアレルゲン。
【００１２】
（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを認識する抗アレルゲン抗体からなることを特徴とするアレルゲン検出用抗体。
【００１３】
（５）抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である前記（４）記載の抗体。
【００１４】
（６）試料中のアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出することを特徴とするアレルゲン混入検査方法。
【００１５】
（７）前記試料は、飲食品又はその原材料である前記（６）記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１６】
（８）前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である前記（６）又は（７）記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１７】
（９）前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である前記（６）〜（８）のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１８】
（１０）前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段が、前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段である前記（６）〜（９）のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１９】
（１１）試料中のアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を含むことを特徴とするアレルゲン混入検査用試薬。
【００２０】
（１２）前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を含有する溶液を含む前記（１１）記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【００２１】
（１３）前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を担持した担体を含む前記（１１）記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【００２２】
（１４）被験者の生体試料又はその調製物に、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするアレルゲン感受性測定方法。
【００２３】
（１５）被験者のアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを含むことを特徴とするアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２４】
（１６）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを含有する溶液を含む前記（１５）記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２５】
（１７）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを担持した担体を含む前記（１５）記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２６】
（１８）更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む前記（１５）〜（１７）のいずれか１つに記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、エビ・カニなどの甲殻類に含まれるカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）がアレルゲンであることを見出したことに基づく発明である。すなわち、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなる。
【００２９】
本発明において用いられる、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、例えば、次のような方法で得ることができる。すなわち、エビ尾肉（筋肉）やカニの脚肉(筋肉)を原料にして、５〜２０倍量の０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８〜４．０）を加えてホモジナイズし、４℃で一晩抽出する。得られた抽出物を遠心後、その上清から塩析により、飽和硫安濃度５０％〜７０％の分画を回収する。その塩析物を、０．２ＭＮａＣＬ含有０．０１Ｍ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物をＮｉ（ニッケル）キレートカラムにアプライし、カラムに吸着しないカラム未吸着画分を回収する。得られたＮｉキレートカラム未吸着画分を，０．０１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物を陰イオン交換カラム（例えば、DEAEあるいはMono Ｑカラムなど）などで精製する。
【００３０】
本発明において用いられる、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、上記の方法以外の方法によっても適宜得ることができる。また、公知の技術を利用して、適宜これを濃縮、精製することができる。
【００３１】
カルシウムバインディングプロテインの由来となる甲殻類の種類に特に制限はないが、食用エビであるクルマエビ（Penaeus japonicus）、ボタンエビ（Pandalus platyceros）、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ等や、食用カニであるズワイガニ（Chionoecetes opilio）、タラバガニ（Parolithodes camtschticus）又はケガニ（Erimacrus isenbeckii）等を好ましく例示できる。
【００３２】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンにおいては、アレルゲン性、抗体産生能、抗体結合能等の特性において、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインの免疫学的特性を保持するものであれば、そのポリペプチド断片を用いることもできる。すなわち、例えば、抗原−抗体反応の特異性を決定する局所構造であるエピトープは、一般的にそのアミノ酸長は１０〜数十アミノ酸程度である。したがって、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインにもそのような免疫学的特性を保持する部分ポリペプチド断片が存在するものと考えられる。
【００３３】
なお、本発明において「免疫学的」とは、当該分野で一般に用いられる用語と同義に用いられ、ヒトに対する免疫性を利用するものだけでなく、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等、他の動物に対する免疫性を利用するものも含まれる。
【００３４】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンにおいては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００３５】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、以下のように利用することができる。
【００３６】
例えば、試料から抽出物を調製し、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを物質的指標にして、前記抽出物中のアレルゲンを検出する。前記試料としては、飲食品又はその原材料等が挙げられる。
【００３７】
これによれば、飲食品中にアレルゲンの混入があるかどうかを製造業者又はその管理者が簡便に検査することができ、これを製品のパッケージ等に表示することによって、購入者に知らしめることができる。そして、アレルギー発症履歴を有するか、発症のおそれのある消費者がその飲食品を摂取することを防止することができる。
【００３８】
また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、以下のようにも利用することができる。
【００３９】
例えば、被験者の生体試料又はその調製物に、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、該アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する。これによって、被験者のアレルゲンに対する感受性を測定し、又はアレルギー症状の病態を測定することができる。
【００４０】
被験者の生体試料又はその調製物としては、血液、血清、血漿等が挙げられる。
【００４１】
アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する手段としては、例えば、まず、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを、マイクロプレートやビーズに固相化しておき、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうちその固相に該アレルゲンを介して結合するものを、結合せずに溶液中にとどまるものから洗浄操作や、遠心操作により分離し、これをＩｇＥ抗体に対する抗体で測定する方法で行うことができる。ＩｇＥ抗体に対する抗体としては、抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体等が市販されている。
【００４２】
上記の測定方法を簡便且つ迅速にできるようにするために、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを含むアレルゲン感受性測定用試薬が提供され得る。また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンの他に必要とされる任意の試薬を更に含むアレルゲン感受性測定用試薬としても提供され得る。他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、上記抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体等の標識抗ＩｇＥ抗体が挙げられる。
【００４３】
一方、本発明のアレルゲン検出用抗体は、本発明の本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを認識する抗体であり、具体的には、抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体等として提供され得る。その調製方法としては、当該分野で周知のいずれの技術をも用いることができる。例えば、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを免疫動物に投与し、当該動物からの抗血清の採取する。免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンに対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを公知の方法で単離することができる。
【００４４】
本発明のアレルゲン検出用抗体においては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００４５】
本発明のアレルゲン検出用抗体は、以下のように利用することができる。
【００４６】
例えば、上述の、試料中のアレルゲンを検出する方法において、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段として、本発明のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段を用いることができる。
【００４７】
免疫学的検出手段はＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法等をはじめとして各種の方法が広く普及しており、当該分野の当業者であれば、公知の技術を適宜利用することに困難はない。
【００４８】
上記の検査方法を簡便且つ迅速にできるようにするために、本発明のアレルゲン検出用抗体を含むアレルゲン混入検査用試薬が提供され得る。また、本発明のアレルゲン検出用抗体の他に必要とされる任意の試薬を更に含むアレルゲン混入検査用試薬としても提供され得る。更に、他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、免疫グロブリンを認識する抗ＩｇＧ―Ｆｃフラグメント抗体等、抗ＩｇＧ２次抗体が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
<例１> カルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）の調製
クルマエビ（クルマエビ科クルマエビ）の尾肉、ボタンエビ（タラバエビ科ボタンエビ）の尾肉、及びズワイガニ（Chionoecetes opilio）の脚肉を原料にして、以下のようにしてカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）を調製した。
【００５１】
原料に対して５倍量の０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）を加えてホモジナイズし、４℃で一晩抽出した。得られた抽出物を遠心してその上清を取り、硫酸アンモニウムでの塩析により、飽和硫安濃度５０％〜７０％の分画を回収した。その塩析物を、０．２ＭＮａＣＬ含有０．０１Ｍ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物をＮｉ（ニッケル）キレートカラムにアプライして、カラムに吸着しない未吸着画分を回収した。得られたＮｉキレートカラム未吸着画分を、０．０１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、その透析物をＭｏｎｏ Ｑカラムにアプライして、NaCl濃度０Ｍから０．２５Ｍへの濃度勾配により溶出した。図１には、例として、クルマエビからの精製物について、ＭｏｎｏＱカラムからのタンパク質溶出プロファイルを示す。この溶出プロファイルの３２〜３５番目の画分を回収したところ、図２に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において単一バンドを呈する２２ｋＤａのタンパク質が得られた。また、ボタンエビ及びズワイガニを原料にした場合も、それぞれ２３ｋＤａ、２１ｋＤａのタンパク質が得られた。
【００５２】
上記タンパク質のトリプシン消化後のペプチド断片について、部分アミノ酸配列解析を行ったところ、表１に示すように、３つのペプチド断片についてはクルマエビ科大正エビ(Penaeus orientaris)のSarcoplasmic calcium-binding protein alpha B chain の配列と完全に一致していた。そして、１アミノ酸置換を許容した場合では、更に２つのペプチド断片が合致していた。よって、得られたタンパク質が、カルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）であることが同定できた。
【００５３】
【表１】
【００５４】
得られたカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）を、「精製ＣａＢＰ」として以下の例に用いた。
【００５５】
<例２> カルシウムバインディングプロテインのアレルゲン性
エビアレルギー患者（エビCAP RAST陽性２２例）の血清中で、カルシウムバインディングプロテインに対するＩｇＥ抗体が増加しているかどうかを調べる目的で、以下のようにして、間接ELISA法による測定を行った。このエビアレルギー患者は、エビの摂食で口唇浮腫やじん麻疹、また接触皮膚炎(調理中)などのアレルギーを発症した経験があり、その血清は、市販のアレルゲンIgE抗体検査キット（CAP-RAST）での判定で陽性であった。また、対照として、市販のアレルゲンIgE抗体検査キット（CAP-RAST）での判定で陰性であった健常者１１人の血清についても測定した。
【００５６】
上記例１で得られたクルマエビ由来の精製ＣａＢＰを、０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６で２μg/mlに調製し、９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中に約1μg含まれるように固相化した。PBST（PBS,0.05% Tween 20）で３回洗浄後、エビアレルギー患者の血清を1％BSA-PBSTで４倍に希釈して分注し、室温で３時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体（「CAP RAST FEIAキット」（商品名）、ファディア株式会社製）を１％BSA-PBSTで１５倍希釈して分注し、４℃で一晩反応させた。PBSTで３回洗浄後、0.3mM 4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシドを加え、３７℃の恒温槽中で９０分間反応させた。最後に0.1M グリシン-NaOH（pH10.2）を加えて反応を停止させた。反応後の蛍光単位（FU）を、マイクロプレートリーダー「Fluoroskan II」（商品名、米国Titertek社製）を用いて測定した。抗体陽性か陰性かの判定のためのカットオフ値は、健常者から得られた平均値にその標準偏差の４倍の値を足した値である６０蛍光単位(FU)とし、それ以上を抗体陽性とした。
【００５７】
その結果を図３に示す。図３に示すとおり、抗原としてクルマエビ由来のカルシウムバインディングプロテインを用いた場合には、エビアレルギー患者２２例のうち１３例（５９％）が抗体陽性であった。
【００５８】
以上から、一部のエビアレルギー患者の血清で、カルシウムバインディングプロテインに対するＩｇＥ抗体が増加していることが明らかとなった。したがって、カルシウムバインディングプロテインがエビアレルギー症状の原因物質のひとつであることが示唆された。
【００５９】
<例３> 抗血清の調製
常法に従い、上記例１で得られた精製ＣａＢＰをマウスや家兎に免疫して抗血清（ポリクローナル）を作製した。この抗血清は、サンドイッチＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティング、そして、イムノクロマトなどの免疫学的測定に利用できる抗体であった。
【００６０】
<例４> ＩｇＧ画分の調製
上記例３で得られた抗血清から、市販の免疫グロブリン精製用キット(商品名「アフィゲル プロテインＡ MAPS-IIキット」、米国 Bio-Rad 社製)を用いて、ＩｇＧ画分を調製し、ビオチン標識した。
【００６１】
<例５> クルマエビとボタンエビ間での交差反応性試験
上記例４で得られたクルマエビ由来の精製ＣａＢＰに対するマウス抗血清からのＩｇＧ画分（以下、「抗クルマエビＣａＢＰ抗体」という。）と、ボタンエビ由来の精製ＣａＢＰに対するマウス抗血清からのＩｇＧ画分（以下、「抗ボタンエビＣａＢＰ抗体」という。）の、それぞれの抗原に対する交差反応性について調べた。そのためのサンドイッチＥＬＩＳＡを以下の手順で行った。
（１）炭酸緩衝液(pH9. 6)で抗クルマエビＣａＢＰ抗体（または抗ボタンエビＣａＢＰ抗体）を２μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロプレートに分注、一晩静置。
（２）プレートをPBS-0.05% Tween 20（PBST）で３回洗浄後、1%ウシ血清アルブミンーPBST (BSΛ-PBST)で階段希釈した精製ＣａＢＰ（50ng−0.07ng/ml）を加えて室温６０分間反応。
（３）プレートをPBSTで洗浄後、０．２μｇ／ｍｌのビオチン標識抗クルマエビＣａＢＰ抗体（またはビオチン標識抗ボタンエビＣａＢＰ抗体）を加えて、室温６０分間反応。
（４）洗浄後、アルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジン（1 : 2000）を加え、室温６０分間反応。
（５）洗浄後、ｐ−ニトロフェニールホスフェイトを加え、室温１５分間反応。
（６）0.2M EDTAを加えて反応を停止し、405nmで吸光度を測定。
【００６２】
結果を図４に示す。図４（ａ）に示すように、抗クルマエビＣａＢＰ抗体は、ボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテインには反応せず、クルマエビ由来カルシウムバインディングプロテインとのみ反応した。一方、図４（ｂ）に示すように、抗ボタンエビＣａＢＰ抗体は、クルマエビ由来カルシウムバインディングプロテインには反応せず、ボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテインとのみ反応した。また、いずれの抗体もズワイガニ由来カルシウムバインディングプロテインには反応しなかった。
【００６３】
<例６> 各種魚介類間での交差反応性試験
他種生物間での交差反応性を更に調べるために、各種魚介類抽出液を作製し、上記例５と同様にして、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。
【００６４】
具体的には、魚介類（ズワイガニ、マグロ、真タラ、ハマグリ、スルメイカ、本シャコ、オキアミ、桜エビ、甘エビ、ボタンエビ、伊勢エビ、芝エビ、大正エビ、クルマエビ、オマールエビ）の各試料を、５倍量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でホモジナイズし、室温で６０分間攪拌した。つぎに、４℃で１０分間遠心し（１５０００ｒｐｍ）、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、魚介類抽出液とした。得られた魚介類抽出液を、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．４）で１００倍希釈し、そこに抗原処理液を１：１で加えた。これを１００℃にて２分間煮沸し、冷水中にて放熱した。そして、予め作製しておいた各サンドイッチＥＬＩＳＡに、先の試料を６００倍から３倍の段階希釈で加え、室温で１時間反応させた。抗体としては、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体、又は抗エビトロポミオシン−マウスポリクローナル抗体を用いた。
【００６５】
結果を図５に示す。図５（ａ）に示すように、抗クルマエビＣａＢＰ抗体は、クルマエビ科のクルマエビ、大正エビ、芝エビからの抽出物と反応し、その他の魚介類抽出物との反応性は確認できないか、又は弱いものであった。また、図５（ｂ）に示すように、抗ボタンエビＣａＢＰ抗体は、タラバエビ科のボタンエビ、甘エビからの抽出物と反応し、その他の魚介類抽出物との反応性は確認できないか、又は弱いものであった。一方、抗エビトロポミオシン−マウスポリクローナル抗体は、エビ抽出物だけでなく、オキアミ、ズワイガニ、シャコからの抽出物にも反応し、他種間での交差反応性が認められた。
【００６６】
以上から、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、他種エビ類間、又は他種魚介類間での交差反応性が低いアレルゲンであることが明らかとなった。
【００６７】
<例７> 加工食品中のカルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)の検出
各種の市販の加工食品のうち、原材料名に「魚介エキス」「エビ」などといった表記を含んだものを選んで、以下のようにして、食品中のカルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)を検出した。加工食品としては、「タイ風炒飯カオッパ（商品名、カゴメ株式会社）」（以下、「炒飯」という。）、「枝豆とロブスターのリゾット（商品名、カゴメ株式会社）」（以下、「リゾット」という。）、「えびせんの華（商品名、キク）」（以下、「えび煎餅」という。）、「子魚ふりかけ（商品名、株式会社大森屋）」（以下、「ふりかけ」という。）、「アミノコラーゲン（商品名、明治製菓株式会社）」（以下、「ゼリー」という。）、「シーフードヌードル（商品名、日清食品株式会社）」（以下、「ヌードル」という。）、「おすし屋さんのみそ汁（商品名、ハナマルキ株式会社）」（以下、「みそ汁」という。）、「海老シュウマイ（商品名、味の素株式会社）」（以下、「シューマイ」という。）、「海老カツ（商品名、日本水産株式会社）」（以下、「エビカツ」という。）、「ＸＯ醤（商品名、ユウキ食品株式会社）」（以下、「ＸＯ醤」という。）、「キムチ鍋の素（商品名、エバラ食品工業株式会社）」（以下、「キムチ鍋の素」という。）を用いた。
・固形物の場合：食品１０ｇに0. 2M acetate buffer (pH6.4)４０ｍｌを加えて12000rpm/3minでホモジナイズ処理し、12000rpm/lOminで遠心した後の上清２ｍｌに同量の0. 2M DTT、1% SDSを加え混和した。沸湯水中で４分間加熱し、0.22μｍの濾過フィルターで濾過して抽出液とした。
・液状または半液状の湯合：食品２ｇに２ｍｌの0. 2M DTT、1% SDS加えて混和した。沸湯水中で４分間加熱し、0.22μｍの濾過フィルターで濾過して抽出液とした。
【００６８】
上記のようにして得た抽出液について、上記例４又は例５と同様にして、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。抗体としては、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、又は上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体を用いた。なお、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果は、精製ＣａＢＰを用いて検量線を作成し、各試料の反応値を内挿し、食品１ｇ中のアレルゲンの濃度（ｎｇ／ｇ）として表わした。
【００６９】
結果を図６に示す。図６に示すように、「エビ煎餅」、「ふりかけ」、「シューマイ」、「エビカツ」、「ＸＯ醤」、「リゾット」、「炒飯」からはクルマエビ由来カルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)が検出された。また、「ふりかけ」、「シューマイ」、「エビカツ」、「ヌードル」、「リゾット」、「炒飯」からはボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)が検出された。一方、「キムチ鍋の素」、「みそ汁」、「ゼリー」からは検出されなかった。
【００７０】
以上から、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、又は上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体を、食品中の特定原材料の検出のために利用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】例１のクルマエビ由来精製物を調製する際のＭｏｎｏ Ｑカラムタンパク質溶出プロファイルを示す図表である。
【図２】例１で得られた精製物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処しクマシー染色した写真である。
【図３】例１で得られたクルマエビ由来ＣａＢＰに対して結合能を示す血清ＩｇＥを有する被験者の割合を示す図表である。
【図４】精製ＣａＢＰに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【図５】各種魚介類抽出液に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【図６】各種食品抽出液に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲン特定用標準アレルゲン及びアレルゲン検出用抗体に関し、更に、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、並びにアレルゲン感受性測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国における食物アレルギーの主な原因食物は、卵、牛乳、大豆、エビ・カニや魚類などである。年齢によって原因食物の頻度は異なり、成人ではエビ・カニなどの甲殻類によるアレルギーがもっとも高頻度に認められる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
エビ・カニなどの甲殻類によるアレルギーは即時型であり、摂食（あるいは接触）の直後から３０分以内に口腔粘膜症状（口唇のしびれ、浮腫など）、皮膚症状（蕁麻疹など）、消化器症状（吐き気、嘔吐、下痢など）や呼吸器症状（喘息、息切れなど）が出現する。ときには重篤な全身性のアナフィラキシーショックに陥ることもある（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
従来、甲殻類によるアレルギーの原因物質としては、エビトロポミオシン(TMS)やエビアルギニンキナーゼ(AK)が同定されていた（例えば、非特許文献３及び４参照。）。
【非特許文献１】Yoneyama K, Ono A. Study of food allergy among university students in Japan. Allergology International 2002; 51: 205-208.
【非特許文献２】中村 晋、飯倉洋治: 最新食物アレルギー. 永井書店 2004; 241-244.
【非特許文献３】Daul CB, Slattery M, Reese G, et al : Identification of the major brown shrimp（Penaeus aztecus）allergen as the muscle protein tropomyosin. Int Arch Allergy Immunol 1994; 105: 49-55.
【非特許文献４】Yu CJ, Lin YF, Chiang BL, Chow LP. Proteomics and immunological analysis of a novel shrimp allergen, Pen m 2. J Immunol. 2003; 170: 445-453.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
甲殻類由来の食物に対するアレルギー患者の多くは、トロポミオシン(TMS)とアルギニンキナーゼ(AK)の両方あるいはいずれかのＩｇＥ抗体を保有する。しかしながら、これらのアレルゲンに対する抗体が陰性である患者もあることから，他の未同定アレルゲンもまた発症に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００６】
したがって本発明の目的は、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、エビ尾肉（筋肉）やカニの脚肉(筋肉)に含まれるカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）がアレルゲンであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
（１）甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするアレルゲン特定用標準アレルゲン。
【００１０】
（２）前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である前記（１）記載のアレルゲン。
【００１１】
（３）前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である前記（１）又は（２）記載のアレルゲン。
【００１２】
（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを認識する抗アレルゲン抗体からなることを特徴とするアレルゲン検出用抗体。
【００１３】
（５）抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である前記（４）記載の抗体。
【００１４】
（６）試料中のアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出することを特徴とするアレルゲン混入検査方法。
【００１５】
（７）前記試料は、飲食品又はその原材料である前記（６）記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１６】
（８）前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である前記（６）又は（７）記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１７】
（９）前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である前記（６）〜（８）のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１８】
（１０）前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段が、前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段である前記（６）〜（９）のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【００１９】
（１１）試料中のアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を含むことを特徴とするアレルゲン混入検査用試薬。
【００２０】
（１２）前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を含有する溶液を含む前記（１１）記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【００２１】
（１３）前記（４）又は（５）記載のアレルゲン検出用抗体を担持した担体を含む前記（１１）記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【００２２】
（１４）被験者の生体試料又はその調製物に、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするアレルゲン感受性測定方法。
【００２３】
（１５）被験者のアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを含むことを特徴とするアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２４】
（１６）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを含有する溶液を含む前記（１５）記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２５】
（１７）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のアレルゲンを担持した担体を含む前記（１５）記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２６】
（１８）更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む前記（１５）〜（１７）のいずれか１つに記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、甲殻類由来の新規アレルゲンを提供し、これを用いて、アレルゲン特定用標準アレルゲン、アレルゲン検出用抗体、アレルゲン混入検査方法、アレルゲン混入検査用試薬、アレルゲン感受性測定方法、及びアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、エビ・カニなどの甲殻類に含まれるカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）がアレルゲンであることを見出したことに基づく発明である。すなわち、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなる。
【００２９】
本発明において用いられる、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、例えば、次のような方法で得ることができる。すなわち、エビ尾肉（筋肉）やカニの脚肉(筋肉)を原料にして、５〜２０倍量の０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８〜４．０）を加えてホモジナイズし、４℃で一晩抽出する。得られた抽出物を遠心後、その上清から塩析により、飽和硫安濃度５０％〜７０％の分画を回収する。その塩析物を、０．２ＭＮａＣＬ含有０．０１Ｍ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物をＮｉ（ニッケル）キレートカラムにアプライし、カラムに吸着しないカラム未吸着画分を回収する。得られたＮｉキレートカラム未吸着画分を，０．０１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物を陰イオン交換カラム（例えば、DEAEあるいはMono Ｑカラムなど）などで精製する。
【００３０】
本発明において用いられる、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、上記の方法以外の方法によっても適宜得ることができる。また、公知の技術を利用して、適宜これを濃縮、精製することができる。
【００３１】
カルシウムバインディングプロテインの由来となる甲殻類の種類に特に制限はないが、食用エビであるクルマエビ（Penaeus japonicus）、ボタンエビ（Pandalus platyceros）、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ等や、食用カニであるズワイガニ（Chionoecetes opilio）、タラバガニ（Parolithodes camtschticus）又はケガニ（Erimacrus isenbeckii）等を好ましく例示できる。
【００３２】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンにおいては、アレルゲン性、抗体産生能、抗体結合能等の特性において、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインの免疫学的特性を保持するものであれば、そのポリペプチド断片を用いることもできる。すなわち、例えば、抗原−抗体反応の特異性を決定する局所構造であるエピトープは、一般的にそのアミノ酸長は１０〜数十アミノ酸程度である。したがって、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインにもそのような免疫学的特性を保持する部分ポリペプチド断片が存在するものと考えられる。
【００３３】
なお、本発明において「免疫学的」とは、当該分野で一般に用いられる用語と同義に用いられ、ヒトに対する免疫性を利用するものだけでなく、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等、他の動物に対する免疫性を利用するものも含まれる。
【００３４】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンにおいては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００３５】
本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、以下のように利用することができる。
【００３６】
例えば、試料から抽出物を調製し、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを物質的指標にして、前記抽出物中のアレルゲンを検出する。前記試料としては、飲食品又はその原材料等が挙げられる。
【００３７】
これによれば、飲食品中にアレルゲンの混入があるかどうかを製造業者又はその管理者が簡便に検査することができ、これを製品のパッケージ等に表示することによって、購入者に知らしめることができる。そして、アレルギー発症履歴を有するか、発症のおそれのある消費者がその飲食品を摂取することを防止することができる。
【００３８】
また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンは、以下のようにも利用することができる。
【００３９】
例えば、被験者の生体試料又はその調製物に、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、該アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する。これによって、被験者のアレルゲンに対する感受性を測定し、又はアレルギー症状の病態を測定することができる。
【００４０】
被験者の生体試料又はその調製物としては、血液、血清、血漿等が挙げられる。
【００４１】
アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する手段としては、例えば、まず、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを、マイクロプレートやビーズに固相化しておき、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうちその固相に該アレルゲンを介して結合するものを、結合せずに溶液中にとどまるものから洗浄操作や、遠心操作により分離し、これをＩｇＥ抗体に対する抗体で測定する方法で行うことができる。ＩｇＥ抗体に対する抗体としては、抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体等が市販されている。
【００４２】
上記の測定方法を簡便且つ迅速にできるようにするために、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを含むアレルゲン感受性測定用試薬が提供され得る。また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンの他に必要とされる任意の試薬を更に含むアレルゲン感受性測定用試薬としても提供され得る。他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、上記抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体等の標識抗ＩｇＥ抗体が挙げられる。
【００４３】
一方、本発明のアレルゲン検出用抗体は、本発明の本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを認識する抗体であり、具体的には、抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体等として提供され得る。その調製方法としては、当該分野で周知のいずれの技術をも用いることができる。例えば、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンを免疫動物に投与し、当該動物からの抗血清の採取する。免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。また、本発明のアレルゲン特定用標準アレルゲンに対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを公知の方法で単離することができる。
【００４４】
本発明のアレルゲン検出用抗体においては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００４５】
本発明のアレルゲン検出用抗体は、以下のように利用することができる。
【００４６】
例えば、上述の、試料中のアレルゲンを検出する方法において、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段として、本発明のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段を用いることができる。
【００４７】
免疫学的検出手段はＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法等をはじめとして各種の方法が広く普及しており、当該分野の当業者であれば、公知の技術を適宜利用することに困難はない。
【００４８】
上記の検査方法を簡便且つ迅速にできるようにするために、本発明のアレルゲン検出用抗体を含むアレルゲン混入検査用試薬が提供され得る。また、本発明のアレルゲン検出用抗体の他に必要とされる任意の試薬を更に含むアレルゲン混入検査用試薬としても提供され得る。更に、他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、免疫グロブリンを認識する抗ＩｇＧ―Ｆｃフラグメント抗体等、抗ＩｇＧ２次抗体が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
<例１> カルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）の調製
クルマエビ（クルマエビ科クルマエビ）の尾肉、ボタンエビ（タラバエビ科ボタンエビ）の尾肉、及びズワイガニ（Chionoecetes opilio）の脚肉を原料にして、以下のようにしてカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）を調製した。
【００５１】
原料に対して５倍量の０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）を加えてホモジナイズし、４℃で一晩抽出した。得られた抽出物を遠心してその上清を取り、硫酸アンモニウムでの塩析により、飽和硫安濃度５０％〜７０％の分画を回収した。その塩析物を、０．２ＭＮａＣＬ含有０．０１Ｍ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、透析物をＮｉ（ニッケル）キレートカラムにアプライして、カラムに吸着しない未吸着画分を回収した。得られたＮｉキレートカラム未吸着画分を、０．０１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、４℃で一晩透析し、その透析物をＭｏｎｏ Ｑカラムにアプライして、NaCl濃度０Ｍから０．２５Ｍへの濃度勾配により溶出した。図１には、例として、クルマエビからの精製物について、ＭｏｎｏＱカラムからのタンパク質溶出プロファイルを示す。この溶出プロファイルの３２〜３５番目の画分を回収したところ、図２に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において単一バンドを呈する２２ｋＤａのタンパク質が得られた。また、ボタンエビ及びズワイガニを原料にした場合も、それぞれ２３ｋＤａ、２１ｋＤａのタンパク質が得られた。
【００５２】
上記タンパク質のトリプシン消化後のペプチド断片について、部分アミノ酸配列解析を行ったところ、表１に示すように、３つのペプチド断片についてはクルマエビ科大正エビ(Penaeus orientaris)のSarcoplasmic calcium-binding protein alpha B chain の配列と完全に一致していた。そして、１アミノ酸置換を許容した場合では、更に２つのペプチド断片が合致していた。よって、得られたタンパク質が、カルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）であることが同定できた。
【００５３】
【表１】
【００５４】
得られたカルシウムバインディングプロテイン（ＣａＢＰ）を、「精製ＣａＢＰ」として以下の例に用いた。
【００５５】
<例２> カルシウムバインディングプロテインのアレルゲン性
エビアレルギー患者（エビCAP RAST陽性２２例）の血清中で、カルシウムバインディングプロテインに対するＩｇＥ抗体が増加しているかどうかを調べる目的で、以下のようにして、間接ELISA法による測定を行った。このエビアレルギー患者は、エビの摂食で口唇浮腫やじん麻疹、また接触皮膚炎(調理中)などのアレルギーを発症した経験があり、その血清は、市販のアレルゲンIgE抗体検査キット（CAP-RAST）での判定で陽性であった。また、対照として、市販のアレルゲンIgE抗体検査キット（CAP-RAST）での判定で陰性であった健常者１１人の血清についても測定した。
【００５６】
上記例１で得られたクルマエビ由来の精製ＣａＢＰを、０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６で２μg/mlに調製し、９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中に約1μg含まれるように固相化した。PBST（PBS,0.05% Tween 20）で３回洗浄後、エビアレルギー患者の血清を1％BSA-PBSTで４倍に希釈して分注し、室温で３時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、抗ヒトIgE-β-ガラクトシダーゼ標識抗体（「CAP RAST FEIAキット」（商品名）、ファディア株式会社製）を１％BSA-PBSTで１５倍希釈して分注し、４℃で一晩反応させた。PBSTで３回洗浄後、0.3mM 4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシドを加え、３７℃の恒温槽中で９０分間反応させた。最後に0.1M グリシン-NaOH（pH10.2）を加えて反応を停止させた。反応後の蛍光単位（FU）を、マイクロプレートリーダー「Fluoroskan II」（商品名、米国Titertek社製）を用いて測定した。抗体陽性か陰性かの判定のためのカットオフ値は、健常者から得られた平均値にその標準偏差の４倍の値を足した値である６０蛍光単位(FU)とし、それ以上を抗体陽性とした。
【００５７】
その結果を図３に示す。図３に示すとおり、抗原としてクルマエビ由来のカルシウムバインディングプロテインを用いた場合には、エビアレルギー患者２２例のうち１３例（５９％）が抗体陽性であった。
【００５８】
以上から、一部のエビアレルギー患者の血清で、カルシウムバインディングプロテインに対するＩｇＥ抗体が増加していることが明らかとなった。したがって、カルシウムバインディングプロテインがエビアレルギー症状の原因物質のひとつであることが示唆された。
【００５９】
<例３> 抗血清の調製
常法に従い、上記例１で得られた精製ＣａＢＰをマウスや家兎に免疫して抗血清（ポリクローナル）を作製した。この抗血清は、サンドイッチＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティング、そして、イムノクロマトなどの免疫学的測定に利用できる抗体であった。
【００６０】
<例４> ＩｇＧ画分の調製
上記例３で得られた抗血清から、市販の免疫グロブリン精製用キット(商品名「アフィゲル プロテインＡ MAPS-IIキット」、米国 Bio-Rad 社製)を用いて、ＩｇＧ画分を調製し、ビオチン標識した。
【００６１】
<例５> クルマエビとボタンエビ間での交差反応性試験
上記例４で得られたクルマエビ由来の精製ＣａＢＰに対するマウス抗血清からのＩｇＧ画分（以下、「抗クルマエビＣａＢＰ抗体」という。）と、ボタンエビ由来の精製ＣａＢＰに対するマウス抗血清からのＩｇＧ画分（以下、「抗ボタンエビＣａＢＰ抗体」という。）の、それぞれの抗原に対する交差反応性について調べた。そのためのサンドイッチＥＬＩＳＡを以下の手順で行った。
（１）炭酸緩衝液(pH9. 6)で抗クルマエビＣａＢＰ抗体（または抗ボタンエビＣａＢＰ抗体）を２μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロプレートに分注、一晩静置。
（２）プレートをPBS-0.05% Tween 20（PBST）で３回洗浄後、1%ウシ血清アルブミンーPBST (BSΛ-PBST)で階段希釈した精製ＣａＢＰ（50ng−0.07ng/ml）を加えて室温６０分間反応。
（３）プレートをPBSTで洗浄後、０．２μｇ／ｍｌのビオチン標識抗クルマエビＣａＢＰ抗体（またはビオチン標識抗ボタンエビＣａＢＰ抗体）を加えて、室温６０分間反応。
（４）洗浄後、アルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジン（1 : 2000）を加え、室温６０分間反応。
（５）洗浄後、ｐ−ニトロフェニールホスフェイトを加え、室温１５分間反応。
（６）0.2M EDTAを加えて反応を停止し、405nmで吸光度を測定。
【００６２】
結果を図４に示す。図４（ａ）に示すように、抗クルマエビＣａＢＰ抗体は、ボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテインには反応せず、クルマエビ由来カルシウムバインディングプロテインとのみ反応した。一方、図４（ｂ）に示すように、抗ボタンエビＣａＢＰ抗体は、クルマエビ由来カルシウムバインディングプロテインには反応せず、ボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテインとのみ反応した。また、いずれの抗体もズワイガニ由来カルシウムバインディングプロテインには反応しなかった。
【００６３】
<例６> 各種魚介類間での交差反応性試験
他種生物間での交差反応性を更に調べるために、各種魚介類抽出液を作製し、上記例５と同様にして、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。
【００６４】
具体的には、魚介類（ズワイガニ、マグロ、真タラ、ハマグリ、スルメイカ、本シャコ、オキアミ、桜エビ、甘エビ、ボタンエビ、伊勢エビ、芝エビ、大正エビ、クルマエビ、オマールエビ）の各試料を、５倍量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でホモジナイズし、室温で６０分間攪拌した。つぎに、４℃で１０分間遠心し（１５０００ｒｐｍ）、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、魚介類抽出液とした。得られた魚介類抽出液を、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．４）で１００倍希釈し、そこに抗原処理液を１：１で加えた。これを１００℃にて２分間煮沸し、冷水中にて放熱した。そして、予め作製しておいた各サンドイッチＥＬＩＳＡに、先の試料を６００倍から３倍の段階希釈で加え、室温で１時間反応させた。抗体としては、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体、又は抗エビトロポミオシン−マウスポリクローナル抗体を用いた。
【００６５】
結果を図５に示す。図５（ａ）に示すように、抗クルマエビＣａＢＰ抗体は、クルマエビ科のクルマエビ、大正エビ、芝エビからの抽出物と反応し、その他の魚介類抽出物との反応性は確認できないか、又は弱いものであった。また、図５（ｂ）に示すように、抗ボタンエビＣａＢＰ抗体は、タラバエビ科のボタンエビ、甘エビからの抽出物と反応し、その他の魚介類抽出物との反応性は確認できないか、又は弱いものであった。一方、抗エビトロポミオシン−マウスポリクローナル抗体は、エビ抽出物だけでなく、オキアミ、ズワイガニ、シャコからの抽出物にも反応し、他種間での交差反応性が認められた。
【００６６】
以上から、甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテインは、他種エビ類間、又は他種魚介類間での交差反応性が低いアレルゲンであることが明らかとなった。
【００６７】
<例７> 加工食品中のカルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)の検出
各種の市販の加工食品のうち、原材料名に「魚介エキス」「エビ」などといった表記を含んだものを選んで、以下のようにして、食品中のカルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)を検出した。加工食品としては、「タイ風炒飯カオッパ（商品名、カゴメ株式会社）」（以下、「炒飯」という。）、「枝豆とロブスターのリゾット（商品名、カゴメ株式会社）」（以下、「リゾット」という。）、「えびせんの華（商品名、キク）」（以下、「えび煎餅」という。）、「子魚ふりかけ（商品名、株式会社大森屋）」（以下、「ふりかけ」という。）、「アミノコラーゲン（商品名、明治製菓株式会社）」（以下、「ゼリー」という。）、「シーフードヌードル（商品名、日清食品株式会社）」（以下、「ヌードル」という。）、「おすし屋さんのみそ汁（商品名、ハナマルキ株式会社）」（以下、「みそ汁」という。）、「海老シュウマイ（商品名、味の素株式会社）」（以下、「シューマイ」という。）、「海老カツ（商品名、日本水産株式会社）」（以下、「エビカツ」という。）、「ＸＯ醤（商品名、ユウキ食品株式会社）」（以下、「ＸＯ醤」という。）、「キムチ鍋の素（商品名、エバラ食品工業株式会社）」（以下、「キムチ鍋の素」という。）を用いた。
・固形物の場合：食品１０ｇに0. 2M acetate buffer (pH6.4)４０ｍｌを加えて12000rpm/3minでホモジナイズ処理し、12000rpm/lOminで遠心した後の上清２ｍｌに同量の0. 2M DTT、1% SDSを加え混和した。沸湯水中で４分間加熱し、0.22μｍの濾過フィルターで濾過して抽出液とした。
・液状または半液状の湯合：食品２ｇに２ｍｌの0. 2M DTT、1% SDS加えて混和した。沸湯水中で４分間加熱し、0.22μｍの濾過フィルターで濾過して抽出液とした。
【００６８】
上記のようにして得た抽出液について、上記例４又は例５と同様にして、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。抗体としては、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、又は上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体を用いた。なお、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果は、精製ＣａＢＰを用いて検量線を作成し、各試料の反応値を内挿し、食品１ｇ中のアレルゲンの濃度（ｎｇ／ｇ）として表わした。
【００６９】
結果を図６に示す。図６に示すように、「エビ煎餅」、「ふりかけ」、「シューマイ」、「エビカツ」、「ＸＯ醤」、「リゾット」、「炒飯」からはクルマエビ由来カルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)が検出された。また、「ふりかけ」、「シューマイ」、「エビカツ」、「ヌードル」、「リゾット」、「炒飯」からはボタンエビ由来カルシウムバインディングプロテイン(ＣａＢＰ)が検出された。一方、「キムチ鍋の素」、「みそ汁」、「ゼリー」からは検出されなかった。
【００７０】
以上から、上記抗クルマエビＣａＢＰ抗体、又は上記抗ボタンエビＣａＢＰ抗体を、食品中の特定原材料の検出のために利用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】例１のクルマエビ由来精製物を調製する際のＭｏｎｏ Ｑカラムタンパク質溶出プロファイルを示す図表である。
【図２】例１で得られた精製物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処しクマシー染色した写真である。
【図３】例１で得られたクルマエビ由来ＣａＢＰに対して結合能を示す血清ＩｇＥを有する被験者の割合を示す図表である。
【図４】精製ＣａＢＰに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【図５】各種魚介類抽出液に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【図６】各種食品抽出液に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするアレルゲン特定用標準アレルゲン。
【請求項２】
前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である請求項１記載のアレルゲン。
【請求項３】
前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である請求項１又は２記載のアレルゲン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを認識する抗アレルゲン抗体からなることを特徴とするアレルゲン検出用抗体。
【請求項５】
抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である請求項４記載の抗体。
【請求項６】
試料中のアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出することを特徴とするアレルゲン混入検査方法。
【請求項７】
前記試料は、飲食品又はその原材料である請求項６記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項８】
前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である請求項６又は７記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項９】
前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である請求項６〜８のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項１０】
前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段が、請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段である請求項６〜９のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項１１】
試料中のアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を含むことを特徴とするアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１２】
請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を含有する溶液を含む請求項１１記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１３】
請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を担持した担体を含む請求項１１記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１４】
被験者の生体試料又はその調製物に、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするアレルゲン感受性測定方法。
【請求項１５】
被験者のアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを含むことを特徴とするアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを含有する溶液を含む請求項１５記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを担持した担体を含む請求項１５記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１８】
更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１】
甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするアレルゲン特定用標準アレルゲン。
【請求項２】
前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である請求項１記載のアレルゲン。
【請求項３】
前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である請求項１又は２記載のアレルゲン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを認識する抗アレルゲン抗体からなることを特徴とするアレルゲン検出用抗体。
【請求項５】
抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である請求項４記載の抗体。
【請求項６】
試料中のアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出することを特徴とするアレルゲン混入検査方法。
【請求項７】
前記試料は、飲食品又はその原材料である請求項６記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項８】
前記カルシウムバインディングプロテインは、エビ類又はカニ類由来である請求項６又は７記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項９】
前記カルシウムバインディングプロテインは、クルマエビ、ボタンエビ、大正エビ、芝エビ、甘エビ、伊勢エビ、オマールエビ、ズワイガニ、タラバガニ、又はケガニ由来である請求項６〜８のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項１０】
前記抽出物中の甲殻類由来のカルシウムバインディングプロテイン又はそのポリペプチド断片を検出する手段が、請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を用いた免疫学的検出手段である請求項６〜９のいずれか１つに記載のアレルゲン混入検査方法。
【請求項１１】
試料中のアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を含むことを特徴とするアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１２】
請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を含有する溶液を含む請求項１１記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１３】
請求項４又は５記載のアレルゲン検出用抗体を担持した担体を含む請求項１１記載のアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１４】
被験者の生体試料又はその調製物に、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするアレルゲン感受性測定方法。
【請求項１５】
被験者のアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを含むことを特徴とするアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを含有する溶液を含む請求項１５記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲンを担持した担体を含む請求項１５記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１８】
更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のアレルゲン感受性測定用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２３６８０９（Ｐ２００９−２３６８０９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８５３９７（Ｐ２００８−８５３９７）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月３０日 社団法人日本アレルギー学会発行の「アレルギー 第５７回日本アレルギー学会秋季学術大会号 第５６巻 第８・９号」に発表
【出願人】（５０７１６１９８３）ＩＴＥＡ株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月３０日 社団法人日本アレルギー学会発行の「アレルギー 第５７回日本アレルギー学会秋季学術大会号 第５６巻 第８・９号」に発表
【出願人】（５０７１６１９８３）ＩＴＥＡ株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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