アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステム
【課題】
本発明は、より高精度に抗がん剤の有効性を予測することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムを提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明は、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第一パラメータと第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータと、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四のパラメータとを取得する工程と、第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供する。
本発明は、より高精度に抗がん剤の有効性を予測することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムを提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明は、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第一パラメータと第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータと、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四のパラメータとを取得する工程と、第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤＫの活性値及び発現量とグルタチオン量に基づいたアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サイクリン依存性キナーゼ（以下、「CDK」ともいう）を利用した抗がん剤治療の有効性を予測する方法が提案されている。
例えば特許文献１には、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量の比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較し、その結果に基づいて患者の抗がん剤治療の感受性を予測する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−６８８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、より高い信頼性のある抗がん剤の有効性予測をすることが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供することを目的とする。また、本発明は、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する上でより高い信頼性のある情報を生成することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第一パラメータと第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータと、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四のパラメータとを取得する工程と、第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供するものである。
また、本発明は、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測するためのシステムであって、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する取得手段と、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する第四パラメータ取得手段と、被検者の第三パラメータ及び第四パラメータと閾値とを比較する比較手段と、比較手段により得られた比較結果に基づいて、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する予測手段と、予測手段により得られた予測結果を表示装置に表示する表示手段と、を備えるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、より高い信頼性のあるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測をすることが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供することができる。また本発明によれば、CDKの活性値及び発現量とグルタチオン量に基づいて、抗がん剤治療の有効性を予測する上でより高い信頼性のある情報を生成することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムのコンピュータシステムによる一実施形態を示す図である。
【図２】アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムのコンピュータシステムにおける判定フローを示す図である。
【図３】実施例１において算出された過去患者群における測定値を示す表である。
【図４】横軸をグルタチオン量、縦軸をＣＤＫ比活性比として各検体をプロットした分布図である。
【図５】ＣＤＫ比活性比によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【図６】グルタチオン量によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【図７】ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムについて詳細に説明する。
【０００９】
[１]アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法
被検者から採取される悪性腫瘍は、例えば被検者の生体組織のうち、繊維性結合組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパ等の支持組織、上皮組織、筋組織、神経組織を構成する細胞であればよい。特に、本実施形態による判定方法に用いられる細胞としては、個体としての調和を破り、増殖の制御機構に異常を来たしている組織の腫瘍細胞のように、病理的情報を得たい細胞が好適である。例えば、乳、肺、肝臓、胃、大腸、膵臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状腺、リンパ系統、骨髄などの位置にできる腫瘍の細胞が好適な対象となる。
【００１０】
アンスラサイクリン系抗がん剤とは、アグリコンであるアンスラサイクリノンに１〜３種のアミノ酸または中性糖が結合した一群の抗生物質である。アンスラサイクリン系抗がん剤としては、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどが挙げられる。
【００１１】
サイクリン依存性キナーゼ（CDK）とは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、単独では活性を持たないが、サイクリンと結合して活性型となる。CDKは、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。CDKとしては、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンA依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられる。ここにあげた複数種のCDKから、第一のCDKと第二のCDKとを決定し、被検者から採取された悪性腫瘍の第一CDKと第二CDKの発現量及び活性値を測定する。
【００１２】
ＣＤＫ活性値とは、特定のサイクリンと結合して、そのサイクリンをリン酸化する基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をU（ユニット）で表す）をいう。なお、前記ＣＤＫがリン酸化する基質としては、例えば、活性型ＣＤＫ１及び活性型ＣＤＫ２については、ヒストンＨ１が挙げられ、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６については、Ｒｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）が挙げられる。ＣＤＫ活性値は、慣用のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。具体的には、測定試料の細胞溶解液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、試料と、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、３２Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。
この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００１３】
活性測定に供する試料は、測定対象となる悪性腫瘍を含む組織の可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、試料は目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００１４】
ＣＤＫ発現量とは、測定対象となる悪性腫瘍を含む組織の細胞可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００１５】
第一パラメータは第一CDKの活性値及び発現量から得られるパラメータであり、第二パラメータは第二CDKの活性値及び発現量から得られるパラメータである。これらパラメータとしては、活性値及び発現量の何れかを単独で用いてもよいし、活性値と発現量とを加減乗除などして計算される値を用いても良いが、活性値と発現量との比を用いることが好ましい。活性値と発現量との比としては、活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）、発現量を活性値で除することにより得られる値（発現量／活性値＝比活性の逆数）などを用いることができる。
【００１６】
第三パラメータとしては、第一パラメータと第二パラメータとを加減乗除などして計算される値を用いることができるが、第一パラメータと第二パラメータとの比を用いることが好ましい。第一パラメータと第二パラメータの比としては、第一パラメータを第二パラメータで除することにより得られる値、第二パラメータを第一パラメータで除することにより得られる値などを用いることができる。
【００１７】
第四パラメータは被検者から採取された悪性腫瘍のグルタチオン量から得られるパラメータである。グルタチオン量を測定する方法としては従来公知の方法で測定でき、例えば、Glutathione Assay Kit（Calbiochem社）等のキットを用いて測定することができる。
具体的に説明すると、反応基質である4-chloro-1-methyl-7-trifluoromethyl-quinolinium methylsulfateがグルタチオンなどのメルカプタン類と反応し、メルカプタン結合型のチオエーテルが生成される。これらチオエーテルのうち、グルタチオン結合型チオエーテルのみがアルカリ条件下で脱離反応を起こし、チオンを生成する。生成したチオンの吸収波長は４００ｎｍであり、この吸光度からチオン量を定量し、サンプル中に含まれていたグルタチオン量を算出する。
【００１８】
グルタチオンは、グリシン、シスチン、グルタミン酸のトリペプチドであり、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節に関与しているとされる。例えば、グルタチオンは解毒作用に関与し、体内の有害物質がグルタチオンと結合し（グルタチオン抱合）、グルタミン酸とグリシンが切れることにより、メルカプツール酸となって排泄される。
このグルタチオンとアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測との関係は、以下２つのメカニズムが示唆されている。
（１）アンスラサイクリン系抗がん剤は、酸化ストレスを細胞に与え、殺細胞効果を示すことが知られているが、グルタチオンはこの殺細胞効果を減弱させる働きがあると考えられている。
（２）アンスラサイクリン系抗がん剤はグルタチオン抱合を受けることにより細胞外に排出されると考えられている。
以上のメカニズムから、グルタチオン量を測定することによりアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測の指標になることが示唆される。
【００１９】
アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程では、第三パラメータ及び第四パラメータと予め設定された閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する。
閾値とは、抗がん剤の種類、癌の種類により適宜設定される値である。具体的には、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の有無を判定する場合、複数の患者から採取されたがん細胞のうち摘出手術後の再発の有無が既知の細胞について第三パラメータを算出し、算出された値から患者から患者集団に対してアンスラサイクリン系抗がん剤による治療が有効であった症例と、有効でなかった症例とに区別しうるような値を閾値とすることができる。第四パラメータにおいても同様に閾値を設定することができる。
このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値を設定することにより、信頼性の高い抗がん剤治療の有効性予測が可能となる。
【００２０】
［２］アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム
本発明における、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムは、コンピュータにおいて実行することができる。以下、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を実施するための一実施形態であるコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。
【００２１】
図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
図２は、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により被検者から採取した悪性腫瘍のＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性（以下ＣＤＫ比活性比ともいう）及びグルタチオン量が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。
ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性（以下ＣＤＫ比活性比ともいう）に対応する閾値、及びグルタチオン量に対応する閾値を呼び出して、これらの閾値とパラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。
次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０aは、ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく且つグルタチオン量が閾値以下である場合には、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して「感受性あり」と予測する。
ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく且つグルタチオン量が閾値を越える場合、ＣＤＫ比活性比が閾値以下であり且つグルタチオン量が閾値越える場合、及びＣＤＫ比活性比が閾値以下であり且つグルタチオン量が閾値以下である場合には、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して「感受性なし」（非感受性）と予測する。
そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の感受性有無の予測結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００２２】
なお、上記実施形態においては、パラメータデータを、入力デバイス１３０を用いて入力し、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得したが、これに限定されるものではない。例えば、発現量や活性値を測定する測定装置等から入出力インターフェイス１１０ｆを介してパラメータデータを取得するようにしてもよい。また、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の発現量及び活性値を入力デバイス１３０により入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれら入力された値からＣＤＫ比活性比を算出して、パラメータデータを取得するようにしてもよい。
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法
過去患者群の検体として、乳がんの腫瘍組織２０症例を入手した。この２０症例は、検体採取後化学療法としてアンスラサイクリン系抗がん剤の投与を受けた症例であり、投与後のがんの再発の有無が既知の症例である。
【００２５】
〔１〕測定用試料の調製
アンスラサイクリン系抗がん剤治療を受けた乳癌患者20名（患者１〜20）から摘出した腫瘍細胞塊20検体を用いて、下記の手順で測定用試料１〜20を調製した。
まず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように、緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）と腫瘍細胞塊とを、チューブに収容した。
そして電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を測定用試料として用いた。
【００２６】
〔２〕ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。ウェルに洗浄液Ｂ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにビオチン化した抗ウサギＩｇＧ−Ｂ抗体（二次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノールで５分間濯ぎ、２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザによって分析、測定した。測定値は、検量線をもとに算出した。
検量線は、０．００５％のノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより検量線を作成したものである。
そして、ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００２７】
〔３〕ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらに測定用試料を添加した。測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。ここに抗ＣＤＫ１抗体２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズを加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０及び５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．０）を含む）で三回洗浄し、１５μｌの溶解緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１１０μｇ、５ｍＭのＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間震蕩してキナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．２）及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを添加して９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。尚、ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で一時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで三回洗浄した。洗浄後、蛍光イメージアナライザを用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。活性値は、検量線に基づいて算出された。
ここで検量線は、二種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。従って、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ１抗体ではなく、抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【００２８】
〔４〕ＣＤＫ比活性及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比（ＣＤＫ比活性比）の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ１の比活性及びＣＤＫ２の比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
そして、得られたＣＤＫ１の比活性及びＣＤＫ２の比活性から、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比（ＣＤＫ比活性比）を算出した。
このようにして得られたＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性、及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比を図３に表示している。
【００２９】
〔５〕グルタチオン量の算出
グルタチオン量の算出は、Glutathione Assay Kit (Calbiochem社 Cat. No.354102)を用いて以下の方法により算出した。
（１）緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように、腫瘍細胞塊に緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）を加えた。
（２）緩衝液中の組織細胞塊１５０μg（２０−３００μＬ）に最終ボリューム９００μＬになるように５％メタ燐酸を加えた。
（３）不溶画分を遠心分離により除去し（３０００ｘＧ、４℃、１０分間）、その上清を回収しサンプルとした。
（４）市販の上述のキットに付属してあるＳｏｌｕｔｉｏｎＲ１を（３）のサンプルに加え、混合した。
（５）市販の上述のキットに付属してあるＳｏｌｕｔｉｏｎＲ２を（４）の溶液に加え、混合した。
（６）遮光し室温で１０分放置した後、波長４００ｎｍで吸光度を測定した。
（７）検量線を作成し、グルタチオン量を算出した。なお、検量線は、０〜１００μｍｏｌ／Ｌをカバーする濃度の違うグルタチオン溶液を６種用意し、それらを用いて作成されたものである。この検量線を用いて、サンプル中のグルタチオン濃度、即ちグルタチオン量を算出した。
このようにして得られたグルタチオン量（単位 micro g/L）を、表のグルタチオンの欄に表示している。
【００３０】
〔６〕閾値の設定及びアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測
図３は上記方法により得られた値を表にしたものである。図４は、図３の数値を元に、横軸にグルタチオン量、縦軸にＣＤＫ比活性比を軸として各検体をプロット（両軸対数表記）した分布図である。
図４において、各検体は、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量それぞれの変数に対して設定された閾値によって、四つの群に分類される。ここでは、ＣＤＫ比活性比の閾値を４．２とし、グルタチオン量の閾値を２６．９とした。
図４において、ＣＤＫ比活性比の値が閾値より大きいと、アンスラサイクリン感受性だと考える。また、グルタチオン量の値が閾値より小さいと、アンスラサイクリン感受性だと考える。従って、ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく、且つグルタチオン量が閾値より小さいとき、最も高い精度でアンスラサイクリン感受性群であると判定できる。このように、過去患者群のＣＤＫ比活性比とグルタチオン量をグラフ化することで、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を四分類化することが可能となる。
よって、被検者から採取された悪性腫瘍におけるＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量を上記方法にて測定し、得られた値を上記分布図と比較することで、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の有無を判定することが可能となる。
以上より、ＣＤＫの比活性の比と閾値との比較結果及びグルタチオン量と閾値との比較結果とを組み合わせることにより、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の程度の異なる四群に分類することができ、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測できる。また、この予測結果を、悪性腫瘍患者の治療方針を決定する際の指標とすることができる。
【００３１】
（実施例２）ＣＤＫ比活性及びグルタチオン量におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法の検証
アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を検証するために、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群と非感受性群に分類された２群間において、累積再発確率をカプランマイヤー法により解析した。なお、実施例１で作成した図３の２０症例を用いて解析を行い、感受性群、非感受性群の分類は実施例１の閾値を用いた。
ＣＤＫ比活性比のみによってアンスラサイクリン系抗がん剤感受性群と非感受性群とに分類し、カプランマイヤー法により得られた生存曲線を図５に示す。また同様に、グルタチオン量のみによって分類し得られた生存曲線を図６に、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって分類し得られた生存曲線を図７に示す。なお、実線はアンスラサイクリン系抗がん剤の非感受性群、破線はアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性群を示しており、Ｐ値はログランク検定による２群間の有意確率である。
【００３２】
（結果）
ＣＤＫ比活性比のみによる解析（図５）、及びグルタチオン量のみによる解析（図６）で感受性群を予測するよりも、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって感受性群を予測した場合（図７）の方が、感受性群であると予測された群の累積生存率が、非感受性群であると予測された群よりも、有意に高かった。このことより、従来のＣＤＫ比活性比のみによる解析よりも、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量による解析の方が、より高い信頼性のある抗がん剤の有効性予測をすることが可能であり、実施例１図４の左上の領域に該当する被検者に対して、アンスラサイクリン系抗がん剤が有効であることが示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤＫの活性値及び発現量とグルタチオン量に基づいたアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サイクリン依存性キナーゼ（以下、「CDK」ともいう）を利用した抗がん剤治療の有効性を予測する方法が提案されている。
例えば特許文献１には、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量の比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較し、その結果に基づいて患者の抗がん剤治療の感受性を予測する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−６８８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、より高い信頼性のある抗がん剤の有効性予測をすることが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供することを目的とする。また、本発明は、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する上でより高い信頼性のある情報を生成することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第一パラメータと第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータと、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四のパラメータとを取得する工程と、第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供するものである。
また、本発明は、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測するためのシステムであって、被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する取得手段と、前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する第四パラメータ取得手段と、被検者の第三パラメータ及び第四パラメータと閾値とを比較する比較手段と、比較手段により得られた比較結果に基づいて、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する予測手段と、予測手段により得られた予測結果を表示装置に表示する表示手段と、を備えるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、より高い信頼性のあるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測をすることが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を提供することができる。また本発明によれば、CDKの活性値及び発現量とグルタチオン量に基づいて、抗がん剤治療の有効性を予測する上でより高い信頼性のある情報を生成することが可能なアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムのコンピュータシステムによる一実施形態を示す図である。
【図２】アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムのコンピュータシステムにおける判定フローを示す図である。
【図３】実施例１において算出された過去患者群における測定値を示す表である。
【図４】横軸をグルタチオン量、縦軸をＣＤＫ比活性比として各検体をプロットした分布図である。
【図５】ＣＤＫ比活性比によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【図６】グルタチオン量によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【図７】ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群、非感受性群に分類した場合の生存曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法及びそのシステムについて詳細に説明する。
【０００９】
[１]アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法
被検者から採取される悪性腫瘍は、例えば被検者の生体組織のうち、繊維性結合組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパ等の支持組織、上皮組織、筋組織、神経組織を構成する細胞であればよい。特に、本実施形態による判定方法に用いられる細胞としては、個体としての調和を破り、増殖の制御機構に異常を来たしている組織の腫瘍細胞のように、病理的情報を得たい細胞が好適である。例えば、乳、肺、肝臓、胃、大腸、膵臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状腺、リンパ系統、骨髄などの位置にできる腫瘍の細胞が好適な対象となる。
【００１０】
アンスラサイクリン系抗がん剤とは、アグリコンであるアンスラサイクリノンに１〜３種のアミノ酸または中性糖が結合した一群の抗生物質である。アンスラサイクリン系抗がん剤としては、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどが挙げられる。
【００１１】
サイクリン依存性キナーゼ（CDK）とは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、単独では活性を持たないが、サイクリンと結合して活性型となる。CDKは、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。CDKとしては、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンA依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられる。ここにあげた複数種のCDKから、第一のCDKと第二のCDKとを決定し、被検者から採取された悪性腫瘍の第一CDKと第二CDKの発現量及び活性値を測定する。
【００１２】
ＣＤＫ活性値とは、特定のサイクリンと結合して、そのサイクリンをリン酸化する基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をU（ユニット）で表す）をいう。なお、前記ＣＤＫがリン酸化する基質としては、例えば、活性型ＣＤＫ１及び活性型ＣＤＫ２については、ヒストンＨ１が挙げられ、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６については、Ｒｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）が挙げられる。ＣＤＫ活性値は、慣用のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。具体的には、測定試料の細胞溶解液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、試料と、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、３２Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。
この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００１３】
活性測定に供する試料は、測定対象となる悪性腫瘍を含む組織の可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、試料は目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００１４】
ＣＤＫ発現量とは、測定対象となる悪性腫瘍を含む組織の細胞可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００１５】
第一パラメータは第一CDKの活性値及び発現量から得られるパラメータであり、第二パラメータは第二CDKの活性値及び発現量から得られるパラメータである。これらパラメータとしては、活性値及び発現量の何れかを単独で用いてもよいし、活性値と発現量とを加減乗除などして計算される値を用いても良いが、活性値と発現量との比を用いることが好ましい。活性値と発現量との比としては、活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）、発現量を活性値で除することにより得られる値（発現量／活性値＝比活性の逆数）などを用いることができる。
【００１６】
第三パラメータとしては、第一パラメータと第二パラメータとを加減乗除などして計算される値を用いることができるが、第一パラメータと第二パラメータとの比を用いることが好ましい。第一パラメータと第二パラメータの比としては、第一パラメータを第二パラメータで除することにより得られる値、第二パラメータを第一パラメータで除することにより得られる値などを用いることができる。
【００１７】
第四パラメータは被検者から採取された悪性腫瘍のグルタチオン量から得られるパラメータである。グルタチオン量を測定する方法としては従来公知の方法で測定でき、例えば、Glutathione Assay Kit（Calbiochem社）等のキットを用いて測定することができる。
具体的に説明すると、反応基質である4-chloro-1-methyl-7-trifluoromethyl-quinolinium methylsulfateがグルタチオンなどのメルカプタン類と反応し、メルカプタン結合型のチオエーテルが生成される。これらチオエーテルのうち、グルタチオン結合型チオエーテルのみがアルカリ条件下で脱離反応を起こし、チオンを生成する。生成したチオンの吸収波長は４００ｎｍであり、この吸光度からチオン量を定量し、サンプル中に含まれていたグルタチオン量を算出する。
【００１８】
グルタチオンは、グリシン、シスチン、グルタミン酸のトリペプチドであり、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節に関与しているとされる。例えば、グルタチオンは解毒作用に関与し、体内の有害物質がグルタチオンと結合し（グルタチオン抱合）、グルタミン酸とグリシンが切れることにより、メルカプツール酸となって排泄される。
このグルタチオンとアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測との関係は、以下２つのメカニズムが示唆されている。
（１）アンスラサイクリン系抗がん剤は、酸化ストレスを細胞に与え、殺細胞効果を示すことが知られているが、グルタチオンはこの殺細胞効果を減弱させる働きがあると考えられている。
（２）アンスラサイクリン系抗がん剤はグルタチオン抱合を受けることにより細胞外に排出されると考えられている。
以上のメカニズムから、グルタチオン量を測定することによりアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測の指標になることが示唆される。
【００１９】
アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程では、第三パラメータ及び第四パラメータと予め設定された閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する。
閾値とは、抗がん剤の種類、癌の種類により適宜設定される値である。具体的には、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の有無を判定する場合、複数の患者から採取されたがん細胞のうち摘出手術後の再発の有無が既知の細胞について第三パラメータを算出し、算出された値から患者から患者集団に対してアンスラサイクリン系抗がん剤による治療が有効であった症例と、有効でなかった症例とに区別しうるような値を閾値とすることができる。第四パラメータにおいても同様に閾値を設定することができる。
このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値を設定することにより、信頼性の高い抗がん剤治療の有効性予測が可能となる。
【００２０】
［２］アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム
本発明における、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システムは、コンピュータにおいて実行することができる。以下、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を実施するための一実施形態であるコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。
【００２１】
図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
図２は、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により被検者から採取した悪性腫瘍のＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性（以下ＣＤＫ比活性比ともいう）及びグルタチオン量が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。
ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性（以下ＣＤＫ比活性比ともいう）に対応する閾値、及びグルタチオン量に対応する閾値を呼び出して、これらの閾値とパラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。
次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０aは、ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく且つグルタチオン量が閾値以下である場合には、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して「感受性あり」と予測する。
ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく且つグルタチオン量が閾値を越える場合、ＣＤＫ比活性比が閾値以下であり且つグルタチオン量が閾値越える場合、及びＣＤＫ比活性比が閾値以下であり且つグルタチオン量が閾値以下である場合には、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して「感受性なし」（非感受性）と予測する。
そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の感受性有無の予測結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００２２】
なお、上記実施形態においては、パラメータデータを、入力デバイス１３０を用いて入力し、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得したが、これに限定されるものではない。例えば、発現量や活性値を測定する測定装置等から入出力インターフェイス１１０ｆを介してパラメータデータを取得するようにしてもよい。また、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の発現量及び活性値を入力デバイス１３０により入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれら入力された値からＣＤＫ比活性比を算出して、パラメータデータを取得するようにしてもよい。
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法
過去患者群の検体として、乳がんの腫瘍組織２０症例を入手した。この２０症例は、検体採取後化学療法としてアンスラサイクリン系抗がん剤の投与を受けた症例であり、投与後のがんの再発の有無が既知の症例である。
【００２５】
〔１〕測定用試料の調製
アンスラサイクリン系抗がん剤治療を受けた乳癌患者20名（患者１〜20）から摘出した腫瘍細胞塊20検体を用いて、下記の手順で測定用試料１〜20を調製した。
まず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように、緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）と腫瘍細胞塊とを、チューブに収容した。
そして電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を測定用試料として用いた。
【００２６】
〔２〕ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。ウェルに洗浄液Ｂ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにビオチン化した抗ウサギＩｇＧ−Ｂ抗体（二次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノールで５分間濯ぎ、２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザによって分析、測定した。測定値は、検量線をもとに算出した。
検量線は、０．００５％のノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより検量線を作成したものである。
そして、ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００２７】
〔３〕ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらに測定用試料を添加した。測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。ここに抗ＣＤＫ１抗体２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズを加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０及び５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．０）を含む）で三回洗浄し、１５μｌの溶解緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１１０μｇ、５ｍＭのＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間震蕩してキナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．２）及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを添加して９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。尚、ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で一時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで三回洗浄した。洗浄後、蛍光イメージアナライザを用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。活性値は、検量線に基づいて算出された。
ここで検量線は、二種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。従って、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ１抗体ではなく、抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【００２８】
〔４〕ＣＤＫ比活性及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比（ＣＤＫ比活性比）の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ１の比活性及びＣＤＫ２の比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
そして、得られたＣＤＫ１の比活性及びＣＤＫ２の比活性から、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比（ＣＤＫ比活性比）を算出した。
このようにして得られたＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性、及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比を図３に表示している。
【００２９】
〔５〕グルタチオン量の算出
グルタチオン量の算出は、Glutathione Assay Kit (Calbiochem社 Cat. No.354102)を用いて以下の方法により算出した。
（１）緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように、腫瘍細胞塊に緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）を加えた。
（２）緩衝液中の組織細胞塊１５０μg（２０−３００μＬ）に最終ボリューム９００μＬになるように５％メタ燐酸を加えた。
（３）不溶画分を遠心分離により除去し（３０００ｘＧ、４℃、１０分間）、その上清を回収しサンプルとした。
（４）市販の上述のキットに付属してあるＳｏｌｕｔｉｏｎＲ１を（３）のサンプルに加え、混合した。
（５）市販の上述のキットに付属してあるＳｏｌｕｔｉｏｎＲ２を（４）の溶液に加え、混合した。
（６）遮光し室温で１０分放置した後、波長４００ｎｍで吸光度を測定した。
（７）検量線を作成し、グルタチオン量を算出した。なお、検量線は、０〜１００μｍｏｌ／Ｌをカバーする濃度の違うグルタチオン溶液を６種用意し、それらを用いて作成されたものである。この検量線を用いて、サンプル中のグルタチオン濃度、即ちグルタチオン量を算出した。
このようにして得られたグルタチオン量（単位 micro g/L）を、表のグルタチオンの欄に表示している。
【００３０】
〔６〕閾値の設定及びアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測
図３は上記方法により得られた値を表にしたものである。図４は、図３の数値を元に、横軸にグルタチオン量、縦軸にＣＤＫ比活性比を軸として各検体をプロット（両軸対数表記）した分布図である。
図４において、各検体は、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量それぞれの変数に対して設定された閾値によって、四つの群に分類される。ここでは、ＣＤＫ比活性比の閾値を４．２とし、グルタチオン量の閾値を２６．９とした。
図４において、ＣＤＫ比活性比の値が閾値より大きいと、アンスラサイクリン感受性だと考える。また、グルタチオン量の値が閾値より小さいと、アンスラサイクリン感受性だと考える。従って、ＣＤＫ比活性比が閾値より大きく、且つグルタチオン量が閾値より小さいとき、最も高い精度でアンスラサイクリン感受性群であると判定できる。このように、過去患者群のＣＤＫ比活性比とグルタチオン量をグラフ化することで、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を四分類化することが可能となる。
よって、被検者から採取された悪性腫瘍におけるＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量を上記方法にて測定し、得られた値を上記分布図と比較することで、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の有無を判定することが可能となる。
以上より、ＣＤＫの比活性の比と閾値との比較結果及びグルタチオン量と閾値との比較結果とを組み合わせることにより、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性の程度の異なる四群に分類することができ、アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測できる。また、この予測結果を、悪性腫瘍患者の治療方針を決定する際の指標とすることができる。
【００３１】
（実施例２）ＣＤＫ比活性及びグルタチオン量におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法の検証
アンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法を検証するために、アンスラサイクリン系抗がん剤感受性群と非感受性群に分類された２群間において、累積再発確率をカプランマイヤー法により解析した。なお、実施例１で作成した図３の２０症例を用いて解析を行い、感受性群、非感受性群の分類は実施例１の閾値を用いた。
ＣＤＫ比活性比のみによってアンスラサイクリン系抗がん剤感受性群と非感受性群とに分類し、カプランマイヤー法により得られた生存曲線を図５に示す。また同様に、グルタチオン量のみによって分類し得られた生存曲線を図６に、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって分類し得られた生存曲線を図７に示す。なお、実線はアンスラサイクリン系抗がん剤の非感受性群、破線はアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性群を示しており、Ｐ値はログランク検定による２群間の有意確率である。
【００３２】
（結果）
ＣＤＫ比活性比のみによる解析（図５）、及びグルタチオン量のみによる解析（図６）で感受性群を予測するよりも、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量によって感受性群を予測した場合（図７）の方が、感受性群であると予測された群の累積生存率が、非感受性群であると予測された群よりも、有意に高かった。このことより、従来のＣＤＫ比活性比のみによる解析よりも、ＣＤＫ比活性比及びグルタチオン量による解析の方が、より高い信頼性のある抗がん剤の有効性予測をすることが可能であり、実施例１図４の左上の領域に該当する被検者に対して、アンスラサイクリン系抗がん剤が有効であることが示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する工程と、
前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する工程と、
第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、
を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項２】
第一パラメータが、第一ＣＤＫの比活性である、請求項１に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項３】
第二パラメータが、第二ＣＤＫの比活性である、請求項１又は２のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項４】
第三パラメータが、第一パラメータと第二パラメータとの比である、請求項１〜３のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項５】
判定工程は、悪性腫瘍をアンスラサイクリン系抗がん剤に対する感受性の程度が異なる少なくとも二群のいずれかに分類する、１〜４のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項６】
第三パラメータを第一の閾値と比較する第一比較工程と、第四パラメータを第二の閾値と比較する第二比較工程とをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項７】
判定工程は、第一比較工程及び第二比較工程の結果に基づいて判定される、請求項６に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項８】
被検者に対するアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測するためのシステムであって、
被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する取得手段と、
前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する第四パラメータ取得手段と、
被検者の第三パラメータ及び第四パラメータと閾値とを比較する比較手段と、
比較手段により得られた比較結果に基づいて、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する予測手段と、
予測手段により得られた予測結果を表示装置に表示する表示手段と、
を備えることを特徴とするアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム。
【請求項９】
悪性腫瘍を摘出後アンスラサイクリン系抗がん剤が投与されたがん患者において、がん患者から摘出された悪性腫瘍の第三パラメータ及び第四パラメータと、当該がん患者の悪性腫瘍摘出後の再発に関する情報とを比較することによって、再発リスクの異なる少なくとも２群に分けることが可能な閾値を記憶する記憶手段をさらに備える、請求項８に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム。
【請求項１】
被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する工程と、
前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する工程と、
第三パラメータ及び第四パラメータに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性を判定する工程と、
を含むアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項２】
第一パラメータが、第一ＣＤＫの比活性である、請求項１に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項３】
第二パラメータが、第二ＣＤＫの比活性である、請求項１又は２のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項４】
第三パラメータが、第一パラメータと第二パラメータとの比である、請求項１〜３のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項５】
判定工程は、悪性腫瘍をアンスラサイクリン系抗がん剤に対する感受性の程度が異なる少なくとも二群のいずれかに分類する、１〜４のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項６】
第三パラメータを第一の閾値と比較する第一比較工程と、第四パラメータを第二の閾値と比較する第二比較工程とをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項７】
判定工程は、第一比較工程及び第二比較工程の結果に基づいて判定される、請求項６に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測方法。
【請求項８】
被検者に対するアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測するためのシステムであって、
被検者から採取した悪性腫瘍の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを取得する取得手段と、
前記悪性腫瘍のグルタチオン量から得られる第四パラメータを取得する第四パラメータ取得手段と、
被検者の第三パラメータ及び第四パラメータと閾値とを比較する比較手段と、
比較手段により得られた比較結果に基づいて、被検者におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性を予測する予測手段と、
予測手段により得られた予測結果を表示装置に表示する表示手段と、
を備えることを特徴とするアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム。
【請求項９】
悪性腫瘍を摘出後アンスラサイクリン系抗がん剤が投与されたがん患者において、がん患者から摘出された悪性腫瘍の第三パラメータ及び第四パラメータと、当該がん患者の悪性腫瘍摘出後の再発に関する情報とを比較することによって、再発リスクの異なる少なくとも２群に分けることが可能な閾値を記憶する記憶手段をさらに備える、請求項８に記載のアンスラサイクリン系抗がん剤の有効性予測システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２２７０５８（Ｐ２０１０−２２７０５８Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８０６５２（Ｐ２００９−８０６５２）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本癌学会 刊行物名 第６７回日本癌学会学術総会記事 発行年月日 平成２０年９月３０日
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本癌学会 刊行物名 第６７回日本癌学会学術総会記事 発行年月日 平成２０年９月３０日
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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