イオン交換クロマトグラフィーによる高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）および低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の亜分画の測定方法
【課題】高価な測定装置が必要なく、簡便で充分にＬＤＬ、ＨＤＬを複数に分画することが出来る測定方法の提供。
【解決手段】本発明は、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、ここで溶離液１、２、３の各々の塩濃度は明細書に開示の条件を満たすことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、ここで溶離液１、２、３の各々の塩濃度は明細書に開示の条件を満たすことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
試料中に含まれる高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の中の亜分画を分離測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中のリポ蛋白には、大きく分類して、比重の軽い順にカイロマイクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の５種類が知られている。ＶＬＤＬは肝臓で産生され、血液中で代謝されることによりＩＤＬを経由し、ＬＤＬとなる。ＬＤＬは抹消組織細胞に脂質を供給する。ＬＤＬには比重に異なるものが存在していることが知られており、近年、血液中に比重の高いＬＤＬが多いことは、動脈硬化を進展させる主要なリスクファクターになると考えられている（非引用文献１）。また、高脂血症の患者について、投薬前と投薬後の血清中のＬＤＬを比重、あるいは、粒子径により数種類に分けて、その濃度の変化を評価することで投薬によるリポ蛋白の代謝の改善を詳細に解析することが出来る（非特許文献２、３）。ＨＤＬは、小腸からコレステロールを含有しない粒子として産生され、血液中で抹消組織細胞やＬＤＬから余分なコレステロールを取り込み、肝臓に吸収される。このように、ＨＤＬは、産生された後にコレステロール含量が多くなることにより、徐々に比重が重くなり、粒子径も大きくなる。ＨＤＬも、ＬＤＬと同様に、高脂血症の患者の投薬前と投薬後の血清中のＨＤＬを比重、あるいは、粒子径により数種類に分けて、その濃度の変化を評価することで投薬によるリポ蛋白の代謝の改善を詳細に解析することが出来る（非特許文献２、３）。
【０００３】
このように、ＬＤＬ、ＨＤＬを更に詳細に分けて、病態やその治療の評価を行うことは重要である。その分析法としては、超遠心分離装置（非特許文献１、２）、ＮＭＲ分析装置（非特許文献３、４）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献５）、電気泳動（非特許文献６）による方法があるが、超遠心分離装置やＮＭＲ分析装置は高価な装置であり、汎用性に乏しい。また、ＮＭＲ分析装置やゲルろ過カラムや電気泳動による方法は各リポ蛋白の亜分画を分離する能力が充分でないという問題点がある。
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｂら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０６、ｐ２４１（１９９４）
【非特許文献２】Ｇｕｅｒｉｎ Ｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０、ｐ１８９（２０００）
【非特許文献３】Ｉｋｅｗａｋｉ Ｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １１、ｐ２７８（２００４）
【非特許文献４】Ｏｔｖｏｓ Ｊ Ｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６０９（２０００）
【非特許文献５】Ｏｋａｚａｋｉ Ｍら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６４７（２０００）
【非特許文献６】Ｈｏｅｆｎｅｒ Ｄ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７、ｐ２６６（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、血液中に含まれるリポ蛋白であるＬＤＬ、ＨＤＬを更に複数に分画することは重要であるが、高価な装置が必要なく、その分離する能力が充分で簡便な測定方法がこれまでなかった。本発明の目的は、高価な測定装置が必要なく、簡便で充分にＬＤＬ、ＨＤＬを複数に分画することが出来る測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果として、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、ＬＤＬを２つの分画に分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離する方法で、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低い溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって試料中に含まれる吸着力が強いＬＤＬ画分と吸着力が弱いＬＤＬ画分の２つに分離する測定方法を発明した。
【０００８】
また、ＨＤＬを２つの分画に分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低い溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって試料中に含まれる吸着力が強いＨＤＬ画分と吸着力が弱いＨＤＬ画分の２つに分離する測定方法を発明した。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、血清中に含まれるリポ蛋白であるＨＤＬおよびＬＤＬの亜分画を精度良く分離し測定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明について、詳細に説明する。
上述したように、血清中に含まれる主要なリポ蛋白としては、ＨＤＬ，ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの５種類が知られている。また、それぞれのリポ蛋白は、比重、あるいは、粒子径の差により、さらに詳細に分けられることが知られており、特にＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬについては、その各リポ蛋白の亜分画について、多くの研究報告がある。その中で、脂質代謝を理解する上で、また、動脈硬化のリスクファクターの候補として、ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を評価し、研究を進めることは重要である。
【００１１】
ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画の分離測定方法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般に行われており、分離する能力も高いが、手技が難しく、また、超遠心分離装置は高価なため、多くの研究者が実施することは出来ない。ＮＭＲやゲルろ過クロマトグラフィーによる測定方法の手技は難しくないが、どちらもＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を分離する能力は十分とは言えない。電気泳動による測定方法は、手技は難しくないが、分離する能力は十分とは言えないし、一般的に定量性という面で性能の低い測定方法である。
【００１２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施が可能で、分離した後にコレステロールと反応する市販の酵素液（例えば総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製）と混合して反応させ可視光検出器で測定することが出来て、簡便で定量性も良いことが知られている（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４、ｐ１４０４（２００３））。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析の手法を用いて、ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を分離することを試みた。まず、リニアグラディエントにより、超遠心分離法で分離し取得したＨＤＬ３（比重１．１２５ｇ／ｍｌ以上）、ＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）を測定した。ＨＤＬ２はＨＤＬ３より遅く溶出し、ＬＤＬは、ＬＤＬ２、１、３の順に溶出することがわかった（図２〜８）。しかしながら、リニアグラディエントでは分離が十分ではなかった。これらの結果を考慮し、ＨＤＬについては、ＨＤＬ３の含まれる量が多い画分とＨＤＬ２の含まれる量の多い画分の２つに、ＬＤＬについては、ＬＤＬ２の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｆ）とＬＤＬ３の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｓ）の２つに、各々３つの溶離液を用いたステップ溶出により、十分な分離を実現した（図９、１０）。
【００１３】
使用出来る陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合されたもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくは、リポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー（株）製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力の高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。
【００１４】
分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２、３又は１’、２’、３’は、塩濃度の低い順にカラムに流す。この３種類の溶離液の役割としては、ＨＤＬ亜画分を分離する場合には、溶離液１’はＨＤＬ画分を吸着させ、溶離液２’はＨＤＬ３の含まれる量が多い画分（以下、ＨＤＬ３＋）を溶出させ、溶離液３’はＨＤＬ２の含まれる量が多い画分（以下、ＨＤＬ２＋）を溶出させることにある。同様に、ＬＤＬ亜画分を分離する場合には、溶離液１はＬＤＬ画分を吸着させるとともにＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液２はＬＤＬ２の含まれる量が多い画分（以下、ＬＤＬｆ）を溶出させ、溶離液３はＬＤＬ３の含まれる量が多い画分（以下、ＬＤＬｓ）を溶出させことにある。かつ、溶離液３は、陰イオン交換カラムにおいて、ＬＤＬより溶出の遅いＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭをＬＤＬｓより溶出させない塩濃度とする。同時に溶出すると、ＬＤＬｓの精度が低下する。ＩＤＬは３型高脂血症という遺伝性の病態以外ではその量は少なくＬＤＬｓの精度に大きな支障はでないが、ＶＬＤＬやＣＭは病状の軽い高脂血症においても、ある程度存在するので、ＬＤＬｓの測定精度が著しく低下するので問題となる。ＬＤＬ１は、リニアグラディエントの実験からＬＤＬ２とＬＤＬ３の間に溶出することが確認されているので、ＬＤＬｓとＬＤＬｆの両方の画分に含まれることになる。また、溶離液１と２又は溶離液１’と２’や溶離液２と３又は溶離液２’と３’の間にＨＤＬ亜画分やＬＤＬ亜画分の分離を高めるために更に新たな塩濃度の溶離液を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件を加えたりしても良い。
【００１５】
使用する溶離液１、２、３又は１’、２’、３’の塩濃度は、ＨＤＬ亜分画を分離する目的には、ＨＤＬ画分を陰イオン交換カラムに吸着させる溶離液１’については、ＨＤＬがリポ蛋白の中でもチャージが低く、また、ＨＤＬよりチャージの少なく陰イオン交換カラムにおいてＨＤＬより早く溶出するリポ蛋白はないので、その塩濃度は８０ｍｍｏｌ／Ｌと低い溶離液が適切である。溶離液２’は、次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことが、ＨＤＬ３の含まれる量の多いＨＤＬ亜画分を溶出するのに適切であり、溶離液３’の塩濃度は残りのＨＤＬ２の含まれる量の多いＨＤＬ亜画分を完全に溶出する、そして、次にチャージの高いリポ蛋白であるＬＤＬを溶出させない１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度が適切である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１’の塩濃度は６８ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液２’は次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３’の塩濃度に対して２１％から２７％溶離液３’より塩濃度が低く、溶離液３’の塩濃度は１４３ｍｍｏｌ／Ｌから１６３ｍｍｏｌ／Ｌとする。
【００１６】
ＬＤＬ亜分画を分離する目的には、ＬＤＬ画分を陰イオン交換カラムに吸着させる溶離液１は、ＨＤＬ画分を吸着させない、または、溶出するように、その塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌが適切であり、溶離液２は溶離液１と次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことが、ＬＤＬ２の含まれる量の多いＬＤＬ亜画分を溶出するのに適切であり、溶離液３の塩濃度はＬＤＬ３含まれる量の多いＬＤＬ亜画分を溶出する溶離液１より塩濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高いことが適切である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度は１４３ｍｍｏｌ／Ｌから１６３ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２は溶離液１と次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３の塩濃度の差に対して２２％から５２％溶離液３より塩濃度が低く、溶離液３の塩濃度は溶離液１より２５ｍｍｏｌ／Ｌから３５ｍｍｏｌ／Ｌ低くする。
【００１７】
好ましい塩として、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが上げられる。また、溶離液の塩濃度とは加えた試薬の解離しているイオンの塩濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液はｐＨ８のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約２８ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１８】
使用する溶離液には、緩衝液を加え、ｐＨを６から９に調製することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝系、ホウ酸緩衝液など、当業界において慣用のあらゆるものが使用できる。
【００１９】
本発明で得られたＨＤＬ２＋は超遠心分離法によるＨＤＬ２の値と、本発明で得られたＨＤＬ３＋は超遠心分離法によるＨＤＬ３の値と、本発明で得られたＬＤＬｆは超遠心分離法によるＬＤＬ２の値と、本発明で得られたＬＤＬｓは超遠心分離法によるＬＤＬ３の値と有為な正の相関を示すことを確認した（図１４、１８、１９、２０）。
【００２０】
また、ＨＤＬ３は、血液中で抹消組織細胞やＬＤＬから余分なコレステロールを取り込むことにより、ＨＤＬ２となり肝臓に吸収される。このことから、ＨＤＬ３の割合が多いと脂質代謝が良好であると言える。また、ＬＤＬに関しては、肝臓で作られたＶＬＤＬが血液中でＩＤＬに、続いて、ＬＤＬ１に、そして、ＬＤＬ２に酵素的に変換される。最終的に、ＬＤＬ２は肝臓で吸収される。しかし、ＬＤＬ２が速やかに肝臓で吸収されないとＬＤＬ３（ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ）が産生されると考えられているので、ＬＤＬ３の割合が多いと脂質代謝が悪いと言える。高脂血症患者において、本測定法を適用して得られた測定値を評価し、ＨＤＬ（ＨＤＬ２+とＨＤＬ３+の総和）に対するＨＤＬ２+、あるいは、ＨＤＬ３＋に対するＨＤＬ２+の値に関して、ＬＤＬ（ＬＤＬｆとＬＤＬｓの総和）に対するＬＤＬｓ、あるいは、ＬＤＬｆに対するＬＤＬｓを評価すると正の相関することが確認された（図２１〜２４）。また、ＨＤＬ（ＨＤＬ２+とＨＤＬ３+の総和）に対するＨＤＬ３＋の値に関して、ＬＤＬに対するＬＤＬｆの値を評価すると正の相関となり、ＬＤＬｆに対するＬＤＬｓを評価すると負の相関となることが確認された（図２５〜２６）。これらのことから、本発明で得られたＬＤＬ亜分画あるいはＨＤＬ亜画分の２つの測定値の、一方に対する他方の比や、２つの合計した測定値の値に対する１つの比は、脂質代謝の病態を見る１つの指標として用いることが出来る。
【実施例】
【００２１】
以下に本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
溶離液A（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。
【００２３】
溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２１．８分はＢの組成を３７．０％に固定し、２１．８分から２２．３分はＢの組成を３７．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、２２．３分から２３．８分はＢの組成を１００．０％に固定し、２３．８分から２４．３分はＢの組成を１００．０％から１０．０％へのリニアグラディエントとし、２４．３分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＨＤＬ亜画分の検討を行った。なお、本分析において、１検体の測定時間は４０分とした。なお、本測定機器のこの溶出パターンの時間の設定と実際にカラムに流れる溶離液の組成には、ポンプからカラムまでの配管容量とカラムから溶出してから反応して検出するまでに要する時間により４分のタイムラグが生じる。
【００２４】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）とＨＤＬ３（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）を測定した。健常人検体では、溶出時間９．２７分にＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１２．６０分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１６．０８分にＬＤＬが、溶出時間１９．２０分にＶＬＤＬが確認された（図２）。ＨＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１２．２９分に確認され、小さなピークが溶出時間１７．００分に確認された（図３）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＨＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１１．４２分のピークが確認された（図４）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいてＨＤＬ３はＨＤＬ２より早く溶出する性質を有することがわかった。
【００２５】
また、図２の溶出パターンを見ると、ＨＤＬ３の溶出はグラディエント条件１５％ぐらいから始まっている。図３の超遠心で分離したＨＤＬ３の試料を測定した結果では、グラディエント条件１８％ぐらいから溶出が始まっているが、この差は超遠心で分離したＨＤＬ３の試料には血清由来の蛋白が含まれないためだと考えられる。これらの結果からＨＤＬ亜分画を測定する場合のＨＤＬ全体を吸着させる溶離液（溶離液１’）は確実に吸着が起こる８％以下が好ましい。８％の時の過塩素酸ナトリウム濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ７．５の塩濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が望ましいと言える。また、ＨＤＬ２は図３からわかるように、１８％の時から溶出が開始され２８％には完全に溶出が終了する。このことから、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）は１８％の組成の溶離液（塩濃度１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を流し長い時間をかけて溶出するか、２８％の組成の溶離液（塩濃度１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）を短時間流せば良い。溶離液３’の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。
【００２６】
次に、ｐＨ８．０の溶離液を用いて、溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２２．０分はＢの組成を３７．０％に固定し、２２．０分から２６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、２６．０分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＬＤＬ亜画分の検討を行った。なお、１検体の測定時間は４０分とした。
【００２７】
健常人の血清検体と、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｍｇ／ｍｌ）とＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｍｇ／ｍｌ）とＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｍｇ／ｍｌ）を測定した。健常人検体では、溶出時間１２．８１分と１３．９１分に２つに分かれてＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１５．８９分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１９．２０分にＬＤＬが確認され、ＬＤＬと分離したピークとして確認はされていないが２２分ぐらいに溶出されている画分はＶＬＤＬと推定される（図５）。ＬＤＬ１試料を分析した際には、溶出時間として１９．８５分のピークが確認された（図６）。ＬＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１９．４９分に確認され、小さなピークが溶出時間２１．７０分に確認された（図７）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＬＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１９．９２分のピークが確認された（図８）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ＬＤＬ亜画分の溶出する順序は、ＬＤＬ２、ＬＤＬ１、ＬＤＬ３となることがわかる。
前述したように、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいとわかった。このことは、ＨＤＬ画分を吸着、もしくは、溶出させて、なおかつ、ＬＤＬ画分を吸着させるための溶離液（溶離液１）も同様に１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。実際に図５から８を見ると、ＬＤＬの溶出は約３０％（塩濃度は、過塩素酸濃度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ８．０の塩濃度は２８ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で約１８０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。）から始まっている。また、ＬＤＬ画分をすべて溶出するための溶離液（溶離液３）は、ＬＤＬ画分の溶出する溶離液の塩濃度が図６〜８から３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）となり、３０％程度の溶離液を長時間流すか、あるいは、３４％程度の溶離液を短時間流すかのどちらかを選択する。このことから、溶離液３の濃度は、３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）が好ましい濃度となり、溶離液１との差はおおむね２０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、溶離液のｐＨは８．０として、検討を行った。
溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２７．８％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を２９．５％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３３．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を４３．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を６３．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。
【００２９】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）、ＨＤＬ３（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）、ＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｍｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（比重１．００６〜１．０１９ｍｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（比重０．９３０〜１．００６ｍｇ／ｍｌ）、ＣＭ（比重０．９３０ｍｇ／ｍｌ以下）を測定した。
【００３０】
ＨＤＬ３試料については、溶出時間５．９分に主たるピークが見られ、溶出時間８．４分にマイナーなピークが確認され、ＨＤＬ２試料については、溶出時間８．５分にピークが確認された（図９）。ＬＤＬ３試料は、溶出時間１２．９分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ２試料は、溶出時間１２．１分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．０分と１８．８分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ１試料は、溶出時間１２．３分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認された（図９）。ＩＤＬ試料は、溶出時間１８．６分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．９分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間２２．０分に主たるピークが見られ、溶出時間２５．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、ピークは確認されなかった（図９）。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間６．７分、８．６分、１２．１分、１５．２分、１８．８分、２１．９分、２５．２分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図９）。
【００３１】
次に、高脂血症患者検体においても、同様の検討を行った。各画分の分析結果から、高脂血症患者の血清検体において見られる溶出時間６．５分、８．５分、１１．８分、１５．１分、１８．８分、２２．０分、２５．１分のピークは、それぞれ、健常人血清と同様に、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図１０）。
【００３２】
このように、溶離液Ｂ８％（過塩素酸ナトリウム４０ｍｍｏｌ／ｌ）において、リポ蛋白画分を吸着させ、溶離液Ｂ１９％（過塩素酸ナトリウム９５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ３を多く含むＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ２を多く含むＨＤＬ画分を溶出させることが出来る。そして、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ画分がすべて溶出した後に、溶離液Ｂ２７．８％（過塩素酸ナトリウム１３９ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ２を多く含むＬＤＬｆ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２９．５％（過塩素酸ナトリウム１４７．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ３を多く含むＬＤＬｓ画分を溶出させることが出来る。その後、溶離液Ｂ３３．０％（過塩素酸ナトリウム１６５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＩＤＬ画分を、溶離液Ｂ４３．０％（過塩素酸ナトリウム２１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＶＬＤＬ画分を、溶離液Ｂ６３．０％（過塩素酸ナトリウム３１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＣＭ画分を溶出する。以上のように、ステップ溶出を用いることにより、ＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの７つのリポ蛋白分画を良好に分離し測定することが出来る。
以上の結果から、ステップ溶出によるＨＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件は、溶離液１が塩濃度６８ｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ８％）以下であり、溶離液２が溶離液３より塩濃度が２２．４％（溶離液３が溶離液Ｂ２４．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ１９％である。）低く、溶離液３が１４３〜１６３ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）である。また、ステップ溶出によるＬＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件は、溶離液１がＨＤＬ亜画分の溶離液３と同じく、塩濃度１４３〜１６３ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）であり、溶離液２が溶離液１と３の塩濃度の差の３４％溶離液３より低く（溶離液３が溶離液Ｂ２９．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ２７．８％である。）、溶離液３が１７８〜１８８ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ３０〜３２％）であり、よって、溶離液１より２５〜３５ｍｍｍｏｌ／Ｌ高い。
【００３３】
（実施例３）
実施例２と同じ条件で、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの溶出条件を検討することを目的として、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．０〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。高脂血症患者２名の血清試料を用いた。結果を表１と２に示す。また、そのＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）の変動を図１１に示した。図１１から、溶離液Ｂ２６．３％（過塩素酸ナトリウム１３１．５ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。溶離液Ｂ２６．３％でＬＤＬｆ画分を溶出する前の溶離液はＢ２４．５％であり、ＬＤＬｓ画分を溶出する溶離液はＢ２９．５％であるので、ＬＤＬ亜画分を溶出する条件として、２番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として３．２％であり、１番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として５％であるので、その割合（低下率）は６４％である。このことから、安定して測定するには、２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率としては少なくとも６４％以下である必要がある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
また、ＬＤＬ３の含量はＬＤＬ全体の５〜３０％程度とわかっており、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量が適当となるＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）は、５．３〜４３％となる。このことを考慮すると、ＬＤＬｆを溶出する塩濃度はＢ２８．７％以下であり、これは、上記のように算出すると２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率１６％である。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜６０％といえ、さらに安定的に値を得るための好ましい塩濃度はＢ２６．９〜２８．４％であるので、低下率としては２２〜５２％である。
【００３７】
実施例２と同じ条件で、ＨＤＬ３＋とＨＤＬ２＋の溶出条件を検討することを目的として、高脂血症患者１名の血清試料を用いて、ＨＤＬ２＋を溶出する溶離液をＢ１６．６〜１９．９％（過塩素酸ナトリウム８３〜９９．５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。結果を表３に示す。また、そのＨＤＬ２/ＨＤＬ３の比率（％）の変動を図１２に示した。図１２から、溶離液Ｂ１７．８％（過塩素酸ナトリウム８９ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。また、溶離液をＢ１７．８％以上に高めた場合には緩やかに値が低下することがわかる。ＨＤＬ２の含有量の多い画分のピークが小さくなると測定再現性が低下するので、ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比率（％）として３０％以上が適切と言える。なお、この高脂血症患者の血清中には、超遠心分離法によりＨＤＬ２とＨＤＬ３の含量が同程度であることを確認している。これらの結果から、ＨＤＬ３の含有量の多い画分（ＨＤＬ３＋）を溶出する適切な溶離液はＢ１７．８〜１９．３％である。ＨＤＬ２＋を溶出するために用いた溶離液（３番目の溶離液）はＢ２４．５％であるので、２番目に流す溶離液の塩濃度は３番目に流す溶離液の塩濃度より２１．２〜２７．３％低いことになる。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜３０％といえる。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（実施例４）
実施例２と同じ条件で、高脂血症患者１７名の血清試料を測定し、評価した。結果を表４〜表６に示す。なお、表に記載した濃度の単位はすべてｍｇ／ｄｌである。本発明によるＬＤＬｆの値と超遠心分離法によるＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３の値を比較したところ（図１３〜１５）、ＬＤＬ２と特に有為な正の相関を示した（図１４）。また、ＬＤＬｓの値と超遠心分離法によるＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３の値を比較したところ（図１６〜１８）、ＬＤＬ３と特に有為な正の相関を示した（図１８）。本発明によるＨＤＬ２、ＨＤＬ３の値は、それぞれ、超遠心分離法によるＨＤＬ２、ＨＤＬ３の値と有為な正の相関を示した（図１９、２０）。このように、本発明で分離された、ＨＤＬ亜画分（ＨＤＬ２とＨＤＬ３）、ＬＤＬ亜画分（ＬＤＬｆとＬＤＬｓ）は、すべて、超遠心分離法で得られた各画分に多く含まれるリポ蛋白画分と有為な正の相関を示すことから、病態の把握や投薬治療の評価に用いることが出来ると言える。
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】
また、血清中のＨＤＬ２の量は脂質代謝の停滞を評価することが出来るが、本発明におけるＨＤＬ３＋に対するＨＤＬ２＋の比率（％）（ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋）、あるいは、ＨＤＬ全体の量に対するＨＤＬ２＋の比率（％）（ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌ）は、脂質代謝が悪いと増加することが知られているＬＤＬ３（ｓｍａｌｌ ｄｅｎｃｅ ＬＤＬ）と相関のあるＬＤＬｓのＬＤＬ全体の量に対する比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌ）、あるいは、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｓの比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆ）と有為な正の相関を示した（図２１〜２４）。また、本発明におけるＨＤＬ全体の量に対するＨＤＬ３＋の比率（％）（ＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌ）は、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｓの比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆ）と有為な正の相関を示し、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｆの比率（％）（ＬＤＬｆ/ＬＤＬｆ）と有為な負の相関を示した（図２５、２６）。
【００４４】
これらのこと、本発明で得られたＨＤＬ２＋、ＨＤＬ３＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓに関して、ＨＤＬ２＋とＨＤＬ３＋の比率、ＨＤＬ２＋あるいはＨＤＬ３＋のＨＤＬ全体の量に対する比率、ＬＤＬｓとＬＤＬｆの比率、ＬＤＬｓあるいはＬＤＬｆのＬＤＬ全体の量に対する比率は、病態の把握や投薬治療の指標として用いることが出来る。
【００４５】
（実施例５）
実施例３で記述したＬＤＬｓとＬＤＬｆの比率、ＬＤＬｓあるいはＬＤＬｆのＬＤＬ全体の量に対する比率について、ＬＤＬ亜分画への溶出条件の影響を確認するために、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．５〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２７．５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表７、８）。３つの高脂血症患者の血清試料を用いた。すべての溶出条件において、ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２１が一番高く、２番目にＮｏ．１８が高く、１番低いのがＮｏ．１９となった。ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．１９が一番高く、２番目にＮｏ．１８が高く、１番低いのがＮｏ．２１となった。このように、溶出条件を変えても、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの値が変化することから、ＬＤＬｆの中のＬＤＬ２の含量、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量に変動はあることが示されているものの、その比率の大小の順に変化はなく、どの条件においてもこれら比率は同様の指標として用いることが出来ると言える。
【００４６】
【表７】
【００４７】
【表８】
【００４８】
実施例３で記述したＨＤＬ２＋とＨＤＬ３＋の比率、ＨＤＬ２＋あるいはＨＤＬ３＋のＨＤＬ全体の量に対する比率について、ＨＤＬ亜分画への溶出条件の影響を確認するために、ＨＤＬ３＋を溶出する溶離液をＢ１６．９〜１９．９%（過塩素酸ナトリウム８４．５〜９９．５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表９、１０）。２つの高脂血症患者の血清試料を用いた。すべての溶出条件において、ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋とＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２０に比べＮｏ．２１の方が高く、ＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２０に比べＮｏ．２１の方が低かった。このように、溶出条件を変えても、その比率の大小の順に変化はなく、どの条件においてもこれら比率は同様に病態の把握や投薬治療の指標として用いることが出来ると言える。
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例に用いた装置
【図２】実施例１の結果（健常人血清）
【図３】実施例１の結果（ＨＤＬ２試料）
【図４】実施例１の結果（ＨＤＬ３試料）
【図５】実施例１の結果（健常人血清）
【図６】実施例１の結果（ＬＤＬ１試料）
【図７】実施例１の結果（ＬＤＬ２試料）
【図８】実施例１の結果（ＬＤＬ３試料）
【図９】実施例２の結果（健常人血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）
【図１０】実施例２の結果（高脂血症患者血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）
【図１１】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＬＤＬｆの溶出条件の検討）
【図１２】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＨＤＬ３の溶出条件の検討）
【図１３】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ１の比較）
【図１４】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ２の比較）
【図１５】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ３の比較）
【図１６】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ１の比較）
【図１７】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ２の比較）
【図１８】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ３の比較）
【図１９】実施例４の結果（本発明によるＨＤＬ２＋と超遠心分離法によるＨＤＬ２の比較）
【図２０】実施例４の結果（本発明によるＨＤＬ３＋と超遠心分離法によるＨＤＬ３の比較）
【図２１】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比較）
【図２２】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比較）
【図２３】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２４】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２５】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２６】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【符号の説明】
【００５２】
１ 溶離液A
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【技術分野】
【０００１】
試料中に含まれる高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の中の亜分画を分離測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中のリポ蛋白には、大きく分類して、比重の軽い順にカイロマイクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の５種類が知られている。ＶＬＤＬは肝臓で産生され、血液中で代謝されることによりＩＤＬを経由し、ＬＤＬとなる。ＬＤＬは抹消組織細胞に脂質を供給する。ＬＤＬには比重に異なるものが存在していることが知られており、近年、血液中に比重の高いＬＤＬが多いことは、動脈硬化を進展させる主要なリスクファクターになると考えられている（非引用文献１）。また、高脂血症の患者について、投薬前と投薬後の血清中のＬＤＬを比重、あるいは、粒子径により数種類に分けて、その濃度の変化を評価することで投薬によるリポ蛋白の代謝の改善を詳細に解析することが出来る（非特許文献２、３）。ＨＤＬは、小腸からコレステロールを含有しない粒子として産生され、血液中で抹消組織細胞やＬＤＬから余分なコレステロールを取り込み、肝臓に吸収される。このように、ＨＤＬは、産生された後にコレステロール含量が多くなることにより、徐々に比重が重くなり、粒子径も大きくなる。ＨＤＬも、ＬＤＬと同様に、高脂血症の患者の投薬前と投薬後の血清中のＨＤＬを比重、あるいは、粒子径により数種類に分けて、その濃度の変化を評価することで投薬によるリポ蛋白の代謝の改善を詳細に解析することが出来る（非特許文献２、３）。
【０００３】
このように、ＬＤＬ、ＨＤＬを更に詳細に分けて、病態やその治療の評価を行うことは重要である。その分析法としては、超遠心分離装置（非特許文献１、２）、ＮＭＲ分析装置（非特許文献３、４）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献５）、電気泳動（非特許文献６）による方法があるが、超遠心分離装置やＮＭＲ分析装置は高価な装置であり、汎用性に乏しい。また、ＮＭＲ分析装置やゲルろ過カラムや電気泳動による方法は各リポ蛋白の亜分画を分離する能力が充分でないという問題点がある。
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｂら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０６、ｐ２４１（１９９４）
【非特許文献２】Ｇｕｅｒｉｎ Ｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０、ｐ１８９（２０００）
【非特許文献３】Ｉｋｅｗａｋｉ Ｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １１、ｐ２７８（２００４）
【非特許文献４】Ｏｔｖｏｓ Ｊ Ｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６０９（２０００）
【非特許文献５】Ｏｋａｚａｋｉ Ｍら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６４７（２０００）
【非特許文献６】Ｈｏｅｆｎｅｒ Ｄ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７、ｐ２６６（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、血液中に含まれるリポ蛋白であるＬＤＬ、ＨＤＬを更に複数に分画することは重要であるが、高価な装置が必要なく、その分離する能力が充分で簡便な測定方法がこれまでなかった。本発明の目的は、高価な測定装置が必要なく、簡便で充分にＬＤＬ、ＨＤＬを複数に分画することが出来る測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果として、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、ＬＤＬを２つの分画に分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離する方法で、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低い溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって試料中に含まれる吸着力が強いＬＤＬ画分と吸着力が弱いＬＤＬ画分の２つに分離する測定方法を発明した。
【０００８】
また、ＨＤＬを２つの分画に分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低い溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって試料中に含まれる吸着力が強いＨＤＬ画分と吸着力が弱いＨＤＬ画分の２つに分離する測定方法を発明した。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、血清中に含まれるリポ蛋白であるＨＤＬおよびＬＤＬの亜分画を精度良く分離し測定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明について、詳細に説明する。
上述したように、血清中に含まれる主要なリポ蛋白としては、ＨＤＬ，ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの５種類が知られている。また、それぞれのリポ蛋白は、比重、あるいは、粒子径の差により、さらに詳細に分けられることが知られており、特にＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬについては、その各リポ蛋白の亜分画について、多くの研究報告がある。その中で、脂質代謝を理解する上で、また、動脈硬化のリスクファクターの候補として、ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を評価し、研究を進めることは重要である。
【００１１】
ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画の分離測定方法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般に行われており、分離する能力も高いが、手技が難しく、また、超遠心分離装置は高価なため、多くの研究者が実施することは出来ない。ＮＭＲやゲルろ過クロマトグラフィーによる測定方法の手技は難しくないが、どちらもＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を分離する能力は十分とは言えない。電気泳動による測定方法は、手技は難しくないが、分離する能力は十分とは言えないし、一般的に定量性という面で性能の低い測定方法である。
【００１２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施が可能で、分離した後にコレステロールと反応する市販の酵素液（例えば総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製）と混合して反応させ可視光検出器で測定することが出来て、簡便で定量性も良いことが知られている（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４、ｐ１４０４（２００３））。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析の手法を用いて、ＨＤＬ、ＬＤＬの亜分画を分離することを試みた。まず、リニアグラディエントにより、超遠心分離法で分離し取得したＨＤＬ３（比重１．１２５ｇ／ｍｌ以上）、ＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）を測定した。ＨＤＬ２はＨＤＬ３より遅く溶出し、ＬＤＬは、ＬＤＬ２、１、３の順に溶出することがわかった（図２〜８）。しかしながら、リニアグラディエントでは分離が十分ではなかった。これらの結果を考慮し、ＨＤＬについては、ＨＤＬ３の含まれる量が多い画分とＨＤＬ２の含まれる量の多い画分の２つに、ＬＤＬについては、ＬＤＬ２の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｆ）とＬＤＬ３の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｓ）の２つに、各々３つの溶離液を用いたステップ溶出により、十分な分離を実現した（図９、１０）。
【００１３】
使用出来る陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合されたもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくは、リポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー（株）製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力の高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。
【００１４】
分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２、３又は１’、２’、３’は、塩濃度の低い順にカラムに流す。この３種類の溶離液の役割としては、ＨＤＬ亜画分を分離する場合には、溶離液１’はＨＤＬ画分を吸着させ、溶離液２’はＨＤＬ３の含まれる量が多い画分（以下、ＨＤＬ３＋）を溶出させ、溶離液３’はＨＤＬ２の含まれる量が多い画分（以下、ＨＤＬ２＋）を溶出させることにある。同様に、ＬＤＬ亜画分を分離する場合には、溶離液１はＬＤＬ画分を吸着させるとともにＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液２はＬＤＬ２の含まれる量が多い画分（以下、ＬＤＬｆ）を溶出させ、溶離液３はＬＤＬ３の含まれる量が多い画分（以下、ＬＤＬｓ）を溶出させことにある。かつ、溶離液３は、陰イオン交換カラムにおいて、ＬＤＬより溶出の遅いＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭをＬＤＬｓより溶出させない塩濃度とする。同時に溶出すると、ＬＤＬｓの精度が低下する。ＩＤＬは３型高脂血症という遺伝性の病態以外ではその量は少なくＬＤＬｓの精度に大きな支障はでないが、ＶＬＤＬやＣＭは病状の軽い高脂血症においても、ある程度存在するので、ＬＤＬｓの測定精度が著しく低下するので問題となる。ＬＤＬ１は、リニアグラディエントの実験からＬＤＬ２とＬＤＬ３の間に溶出することが確認されているので、ＬＤＬｓとＬＤＬｆの両方の画分に含まれることになる。また、溶離液１と２又は溶離液１’と２’や溶離液２と３又は溶離液２’と３’の間にＨＤＬ亜画分やＬＤＬ亜画分の分離を高めるために更に新たな塩濃度の溶離液を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件を加えたりしても良い。
【００１５】
使用する溶離液１、２、３又は１’、２’、３’の塩濃度は、ＨＤＬ亜分画を分離する目的には、ＨＤＬ画分を陰イオン交換カラムに吸着させる溶離液１’については、ＨＤＬがリポ蛋白の中でもチャージが低く、また、ＨＤＬよりチャージの少なく陰イオン交換カラムにおいてＨＤＬより早く溶出するリポ蛋白はないので、その塩濃度は８０ｍｍｏｌ／Ｌと低い溶離液が適切である。溶離液２’は、次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことが、ＨＤＬ３の含まれる量の多いＨＤＬ亜画分を溶出するのに適切であり、溶離液３’の塩濃度は残りのＨＤＬ２の含まれる量の多いＨＤＬ亜画分を完全に溶出する、そして、次にチャージの高いリポ蛋白であるＬＤＬを溶出させない１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度が適切である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１’の塩濃度は６８ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液２’は次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３’の塩濃度に対して２１％から２７％溶離液３’より塩濃度が低く、溶離液３’の塩濃度は１４３ｍｍｏｌ／Ｌから１６３ｍｍｏｌ／Ｌとする。
【００１６】
ＬＤＬ亜分画を分離する目的には、ＬＤＬ画分を陰イオン交換カラムに吸着させる溶離液１は、ＨＤＬ画分を吸着させない、または、溶出するように、その塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌが適切であり、溶離液２は溶離液１と次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことが、ＬＤＬ２の含まれる量の多いＬＤＬ亜画分を溶出するのに適切であり、溶離液３の塩濃度はＬＤＬ３含まれる量の多いＬＤＬ亜画分を溶出する溶離液１より塩濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高いことが適切である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度は１４３ｍｍｏｌ／Ｌから１６３ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２は溶離液１と次に陰イオン交換カラムに流す溶離液３の塩濃度の差に対して２２％から５２％溶離液３より塩濃度が低く、溶離液３の塩濃度は溶離液１より２５ｍｍｏｌ／Ｌから３５ｍｍｏｌ／Ｌ低くする。
【００１７】
好ましい塩として、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが上げられる。また、溶離液の塩濃度とは加えた試薬の解離しているイオンの塩濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液はｐＨ８のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約２８ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１８】
使用する溶離液には、緩衝液を加え、ｐＨを６から９に調製することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝系、ホウ酸緩衝液など、当業界において慣用のあらゆるものが使用できる。
【００１９】
本発明で得られたＨＤＬ２＋は超遠心分離法によるＨＤＬ２の値と、本発明で得られたＨＤＬ３＋は超遠心分離法によるＨＤＬ３の値と、本発明で得られたＬＤＬｆは超遠心分離法によるＬＤＬ２の値と、本発明で得られたＬＤＬｓは超遠心分離法によるＬＤＬ３の値と有為な正の相関を示すことを確認した（図１４、１８、１９、２０）。
【００２０】
また、ＨＤＬ３は、血液中で抹消組織細胞やＬＤＬから余分なコレステロールを取り込むことにより、ＨＤＬ２となり肝臓に吸収される。このことから、ＨＤＬ３の割合が多いと脂質代謝が良好であると言える。また、ＬＤＬに関しては、肝臓で作られたＶＬＤＬが血液中でＩＤＬに、続いて、ＬＤＬ１に、そして、ＬＤＬ２に酵素的に変換される。最終的に、ＬＤＬ２は肝臓で吸収される。しかし、ＬＤＬ２が速やかに肝臓で吸収されないとＬＤＬ３（ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ）が産生されると考えられているので、ＬＤＬ３の割合が多いと脂質代謝が悪いと言える。高脂血症患者において、本測定法を適用して得られた測定値を評価し、ＨＤＬ（ＨＤＬ２+とＨＤＬ３+の総和）に対するＨＤＬ２+、あるいは、ＨＤＬ３＋に対するＨＤＬ２+の値に関して、ＬＤＬ（ＬＤＬｆとＬＤＬｓの総和）に対するＬＤＬｓ、あるいは、ＬＤＬｆに対するＬＤＬｓを評価すると正の相関することが確認された（図２１〜２４）。また、ＨＤＬ（ＨＤＬ２+とＨＤＬ３+の総和）に対するＨＤＬ３＋の値に関して、ＬＤＬに対するＬＤＬｆの値を評価すると正の相関となり、ＬＤＬｆに対するＬＤＬｓを評価すると負の相関となることが確認された（図２５〜２６）。これらのことから、本発明で得られたＬＤＬ亜分画あるいはＨＤＬ亜画分の２つの測定値の、一方に対する他方の比や、２つの合計した測定値の値に対する１つの比は、脂質代謝の病態を見る１つの指標として用いることが出来る。
【実施例】
【００２１】
以下に本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
溶離液A（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。
【００２３】
溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２１．８分はＢの組成を３７．０％に固定し、２１．８分から２２．３分はＢの組成を３７．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、２２．３分から２３．８分はＢの組成を１００．０％に固定し、２３．８分から２４．３分はＢの組成を１００．０％から１０．０％へのリニアグラディエントとし、２４．３分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＨＤＬ亜画分の検討を行った。なお、本分析において、１検体の測定時間は４０分とした。なお、本測定機器のこの溶出パターンの時間の設定と実際にカラムに流れる溶離液の組成には、ポンプからカラムまでの配管容量とカラムから溶出してから反応して検出するまでに要する時間により４分のタイムラグが生じる。
【００２４】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）とＨＤＬ３（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）を測定した。健常人検体では、溶出時間９．２７分にＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１２．６０分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１６．０８分にＬＤＬが、溶出時間１９．２０分にＶＬＤＬが確認された（図２）。ＨＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１２．２９分に確認され、小さなピークが溶出時間１７．００分に確認された（図３）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＨＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１１．４２分のピークが確認された（図４）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいてＨＤＬ３はＨＤＬ２より早く溶出する性質を有することがわかった。
【００２５】
また、図２の溶出パターンを見ると、ＨＤＬ３の溶出はグラディエント条件１５％ぐらいから始まっている。図３の超遠心で分離したＨＤＬ３の試料を測定した結果では、グラディエント条件１８％ぐらいから溶出が始まっているが、この差は超遠心で分離したＨＤＬ３の試料には血清由来の蛋白が含まれないためだと考えられる。これらの結果からＨＤＬ亜分画を測定する場合のＨＤＬ全体を吸着させる溶離液（溶離液１’）は確実に吸着が起こる８％以下が好ましい。８％の時の過塩素酸ナトリウム濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ７．５の塩濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が望ましいと言える。また、ＨＤＬ２は図３からわかるように、１８％の時から溶出が開始され２８％には完全に溶出が終了する。このことから、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）は１８％の組成の溶離液（塩濃度１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を流し長い時間をかけて溶出するか、２８％の組成の溶離液（塩濃度１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）を短時間流せば良い。溶離液３’の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。
【００２６】
次に、ｐＨ８．０の溶離液を用いて、溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２２．０分はＢの組成を３７．０％に固定し、２２．０分から２６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、２６．０分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＬＤＬ亜画分の検討を行った。なお、１検体の測定時間は４０分とした。
【００２７】
健常人の血清検体と、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｍｇ／ｍｌ）とＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｍｇ／ｍｌ）とＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｍｇ／ｍｌ）を測定した。健常人検体では、溶出時間１２．８１分と１３．９１分に２つに分かれてＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１５．８９分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１９．２０分にＬＤＬが確認され、ＬＤＬと分離したピークとして確認はされていないが２２分ぐらいに溶出されている画分はＶＬＤＬと推定される（図５）。ＬＤＬ１試料を分析した際には、溶出時間として１９．８５分のピークが確認された（図６）。ＬＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１９．４９分に確認され、小さなピークが溶出時間２１．７０分に確認された（図７）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＬＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１９．９２分のピークが確認された（図８）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ＬＤＬ亜画分の溶出する順序は、ＬＤＬ２、ＬＤＬ１、ＬＤＬ３となることがわかる。
前述したように、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいとわかった。このことは、ＨＤＬ画分を吸着、もしくは、溶出させて、なおかつ、ＬＤＬ画分を吸着させるための溶離液（溶離液１）も同様に１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。実際に図５から８を見ると、ＬＤＬの溶出は約３０％（塩濃度は、過塩素酸濃度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ８．０の塩濃度は２８ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で約１８０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。）から始まっている。また、ＬＤＬ画分をすべて溶出するための溶離液（溶離液３）は、ＬＤＬ画分の溶出する溶離液の塩濃度が図６〜８から３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）となり、３０％程度の溶離液を長時間流すか、あるいは、３４％程度の溶離液を短時間流すかのどちらかを選択する。このことから、溶離液３の濃度は、３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）が好ましい濃度となり、溶離液１との差はおおむね２０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、溶離液のｐＨは８．０として、検討を行った。
溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２７．８％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を２９．５％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３３．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を４３．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を６３．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。
【００２９】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（比重１．０６３〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）、ＨＤＬ３（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）、ＬＤＬ１（比重１．０１９〜１．０３５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（比重１．０３５〜１．０４５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（比重１．０４５〜１．０６３ｍｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（比重１．００６〜１．０１９ｍｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（比重０．９３０〜１．００６ｍｇ／ｍｌ）、ＣＭ（比重０．９３０ｍｇ／ｍｌ以下）を測定した。
【００３０】
ＨＤＬ３試料については、溶出時間５．９分に主たるピークが見られ、溶出時間８．４分にマイナーなピークが確認され、ＨＤＬ２試料については、溶出時間８．５分にピークが確認された（図９）。ＬＤＬ３試料は、溶出時間１２．９分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ２試料は、溶出時間１２．１分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．０分と１８．８分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ１試料は、溶出時間１２．３分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認された（図９）。ＩＤＬ試料は、溶出時間１８．６分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．９分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間２２．０分に主たるピークが見られ、溶出時間２５．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、ピークは確認されなかった（図９）。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間６．７分、８．６分、１２．１分、１５．２分、１８．８分、２１．９分、２５．２分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図９）。
【００３１】
次に、高脂血症患者検体においても、同様の検討を行った。各画分の分析結果から、高脂血症患者の血清検体において見られる溶出時間６．５分、８．５分、１１．８分、１５．１分、１８．８分、２２．０分、２５．１分のピークは、それぞれ、健常人血清と同様に、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図１０）。
【００３２】
このように、溶離液Ｂ８％（過塩素酸ナトリウム４０ｍｍｏｌ／ｌ）において、リポ蛋白画分を吸着させ、溶離液Ｂ１９％（過塩素酸ナトリウム９５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ３を多く含むＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ２を多く含むＨＤＬ画分を溶出させることが出来る。そして、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ画分がすべて溶出した後に、溶離液Ｂ２７．８％（過塩素酸ナトリウム１３９ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ２を多く含むＬＤＬｆ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２９．５％（過塩素酸ナトリウム１４７．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ３を多く含むＬＤＬｓ画分を溶出させることが出来る。その後、溶離液Ｂ３３．０％（過塩素酸ナトリウム１６５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＩＤＬ画分を、溶離液Ｂ４３．０％（過塩素酸ナトリウム２１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＶＬＤＬ画分を、溶離液Ｂ６３．０％（過塩素酸ナトリウム３１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＣＭ画分を溶出する。以上のように、ステップ溶出を用いることにより、ＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの７つのリポ蛋白分画を良好に分離し測定することが出来る。
以上の結果から、ステップ溶出によるＨＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件は、溶離液１が塩濃度６８ｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ８％）以下であり、溶離液２が溶離液３より塩濃度が２２．４％（溶離液３が溶離液Ｂ２４．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ１９％である。）低く、溶離液３が１４３〜１６３ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）である。また、ステップ溶出によるＬＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件は、溶離液１がＨＤＬ亜画分の溶離液３と同じく、塩濃度１４３〜１６３ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）であり、溶離液２が溶離液１と３の塩濃度の差の３４％溶離液３より低く（溶離液３が溶離液Ｂ２９．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ２７．８％である。）、溶離液３が１７８〜１８８ｍｍｍｏｌ／Ｌ（溶離液Ｂ３０〜３２％）であり、よって、溶離液１より２５〜３５ｍｍｍｏｌ／Ｌ高い。
【００３３】
（実施例３）
実施例２と同じ条件で、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの溶出条件を検討することを目的として、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．０〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。高脂血症患者２名の血清試料を用いた。結果を表１と２に示す。また、そのＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）の変動を図１１に示した。図１１から、溶離液Ｂ２６．３％（過塩素酸ナトリウム１３１．５ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。溶離液Ｂ２６．３％でＬＤＬｆ画分を溶出する前の溶離液はＢ２４．５％であり、ＬＤＬｓ画分を溶出する溶離液はＢ２９．５％であるので、ＬＤＬ亜画分を溶出する条件として、２番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として３．２％であり、１番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として５％であるので、その割合（低下率）は６４％である。このことから、安定して測定するには、２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率としては少なくとも６４％以下である必要がある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
また、ＬＤＬ３の含量はＬＤＬ全体の５〜３０％程度とわかっており、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量が適当となるＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）は、５．３〜４３％となる。このことを考慮すると、ＬＤＬｆを溶出する塩濃度はＢ２８．７％以下であり、これは、上記のように算出すると２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率１６％である。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜６０％といえ、さらに安定的に値を得るための好ましい塩濃度はＢ２６．９〜２８．４％であるので、低下率としては２２〜５２％である。
【００３７】
実施例２と同じ条件で、ＨＤＬ３＋とＨＤＬ２＋の溶出条件を検討することを目的として、高脂血症患者１名の血清試料を用いて、ＨＤＬ２＋を溶出する溶離液をＢ１６．６〜１９．９％（過塩素酸ナトリウム８３〜９９．５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。結果を表３に示す。また、そのＨＤＬ２/ＨＤＬ３の比率（％）の変動を図１２に示した。図１２から、溶離液Ｂ１７．８％（過塩素酸ナトリウム８９ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。また、溶離液をＢ１７．８％以上に高めた場合には緩やかに値が低下することがわかる。ＨＤＬ２の含有量の多い画分のピークが小さくなると測定再現性が低下するので、ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比率（％）として３０％以上が適切と言える。なお、この高脂血症患者の血清中には、超遠心分離法によりＨＤＬ２とＨＤＬ３の含量が同程度であることを確認している。これらの結果から、ＨＤＬ３の含有量の多い画分（ＨＤＬ３＋）を溶出する適切な溶離液はＢ１７．８〜１９．３％である。ＨＤＬ２＋を溶出するために用いた溶離液（３番目の溶離液）はＢ２４．５％であるので、２番目に流す溶離液の塩濃度は３番目に流す溶離液の塩濃度より２１．２〜２７．３％低いことになる。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜３０％といえる。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（実施例４）
実施例２と同じ条件で、高脂血症患者１７名の血清試料を測定し、評価した。結果を表４〜表６に示す。なお、表に記載した濃度の単位はすべてｍｇ／ｄｌである。本発明によるＬＤＬｆの値と超遠心分離法によるＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３の値を比較したところ（図１３〜１５）、ＬＤＬ２と特に有為な正の相関を示した（図１４）。また、ＬＤＬｓの値と超遠心分離法によるＬＤＬ１、ＬＤＬ２、ＬＤＬ３の値を比較したところ（図１６〜１８）、ＬＤＬ３と特に有為な正の相関を示した（図１８）。本発明によるＨＤＬ２、ＨＤＬ３の値は、それぞれ、超遠心分離法によるＨＤＬ２、ＨＤＬ３の値と有為な正の相関を示した（図１９、２０）。このように、本発明で分離された、ＨＤＬ亜画分（ＨＤＬ２とＨＤＬ３）、ＬＤＬ亜画分（ＬＤＬｆとＬＤＬｓ）は、すべて、超遠心分離法で得られた各画分に多く含まれるリポ蛋白画分と有為な正の相関を示すことから、病態の把握や投薬治療の評価に用いることが出来ると言える。
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】
また、血清中のＨＤＬ２の量は脂質代謝の停滞を評価することが出来るが、本発明におけるＨＤＬ３＋に対するＨＤＬ２＋の比率（％）（ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋）、あるいは、ＨＤＬ全体の量に対するＨＤＬ２＋の比率（％）（ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌ）は、脂質代謝が悪いと増加することが知られているＬＤＬ３（ｓｍａｌｌ ｄｅｎｃｅ ＬＤＬ）と相関のあるＬＤＬｓのＬＤＬ全体の量に対する比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌ）、あるいは、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｓの比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆ）と有為な正の相関を示した（図２１〜２４）。また、本発明におけるＨＤＬ全体の量に対するＨＤＬ３＋の比率（％）（ＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌ）は、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｓの比率（％）（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆ）と有為な正の相関を示し、ＬＤＬ全体に対するＬＤＬｆの比率（％）（ＬＤＬｆ/ＬＤＬｆ）と有為な負の相関を示した（図２５、２６）。
【００４４】
これらのこと、本発明で得られたＨＤＬ２＋、ＨＤＬ３＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓに関して、ＨＤＬ２＋とＨＤＬ３＋の比率、ＨＤＬ２＋あるいはＨＤＬ３＋のＨＤＬ全体の量に対する比率、ＬＤＬｓとＬＤＬｆの比率、ＬＤＬｓあるいはＬＤＬｆのＬＤＬ全体の量に対する比率は、病態の把握や投薬治療の指標として用いることが出来る。
【００４５】
（実施例５）
実施例３で記述したＬＤＬｓとＬＤＬｆの比率、ＬＤＬｓあるいはＬＤＬｆのＬＤＬ全体の量に対する比率について、ＬＤＬ亜分画への溶出条件の影響を確認するために、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．５〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２７．５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表７、８）。３つの高脂血症患者の血清試料を用いた。すべての溶出条件において、ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２１が一番高く、２番目にＮｏ．１８が高く、１番低いのがＮｏ．１９となった。ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．１９が一番高く、２番目にＮｏ．１８が高く、１番低いのがＮｏ．２１となった。このように、溶出条件を変えても、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの値が変化することから、ＬＤＬｆの中のＬＤＬ２の含量、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量に変動はあることが示されているものの、その比率の大小の順に変化はなく、どの条件においてもこれら比率は同様の指標として用いることが出来ると言える。
【００４６】
【表７】
【００４７】
【表８】
【００４８】
実施例３で記述したＨＤＬ２＋とＨＤＬ３＋の比率、ＨＤＬ２＋あるいはＨＤＬ３＋のＨＤＬ全体の量に対する比率について、ＨＤＬ亜分画への溶出条件の影響を確認するために、ＨＤＬ３＋を溶出する溶離液をＢ１６．９〜１９．９%（過塩素酸ナトリウム８４．５〜９９．５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表９、１０）。２つの高脂血症患者の血清試料を用いた。すべての溶出条件において、ＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋とＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２０に比べＮｏ．２１の方が高く、ＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの値はＮｏ．２０に比べＮｏ．２１の方が低かった。このように、溶出条件を変えても、その比率の大小の順に変化はなく、どの条件においてもこれら比率は同様に病態の把握や投薬治療の指標として用いることが出来ると言える。
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例に用いた装置
【図２】実施例１の結果（健常人血清）
【図３】実施例１の結果（ＨＤＬ２試料）
【図４】実施例１の結果（ＨＤＬ３試料）
【図５】実施例１の結果（健常人血清）
【図６】実施例１の結果（ＬＤＬ１試料）
【図７】実施例１の結果（ＬＤＬ２試料）
【図８】実施例１の結果（ＬＤＬ３試料）
【図９】実施例２の結果（健常人血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）
【図１０】実施例２の結果（高脂血症患者血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）
【図１１】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＬＤＬｆの溶出条件の検討）
【図１２】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＨＤＬ３の溶出条件の検討）
【図１３】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ１の比較）
【図１４】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ２の比較）
【図１５】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｆと超遠心分離法によるＬＤＬ３の比較）
【図１６】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ１の比較）
【図１７】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ２の比較）
【図１８】実施例４の結果（本発明によるＬＤＬｓと超遠心分離法によるＬＤＬ３の比較）
【図１９】実施例４の結果（本発明によるＨＤＬ２＋と超遠心分離法によるＨＤＬ２の比較）
【図２０】実施例４の結果（本発明によるＨＤＬ３＋と超遠心分離法によるＨＤＬ３の比較）
【図２１】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比較）
【図２２】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ３＋の比較）
【図２３】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２４】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ２＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２５】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬｆとＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【図２６】実施例４の結果（ＬＤＬｓ/ＬＤＬ ｔｏｔａｌとＨＤＬ３＋/ＨＤＬ ｔｏｔａｌの比較）
【符号の説明】
【００５２】
１ 溶離液A
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法。
【請求項２】
ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法により、当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つのＬＤＬ画分の定量値を得、一方の値に対する他方の値の比を、あるいは、これら２つの値を合計したＬＤＬ画分の値に対する一方のＬＤＬ画分の比を、脂質代謝の病態を見る指標として用いる方法。
【請求項３】
ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＨＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことを特徴とする、ＨＤＬ亜分画の測定方法。
【請求項４】
ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＨＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことを特徴とする、ＨＤＬ亜分画の測定方法により、当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つのＨＤＬ画分の定量値を得、一方の値に対する他方の値の比を、あるいは、これら２つの値を合計したＨＤＬ画分の値に対する一方のＨDL画分の比を、脂質代謝の病態を見る指標として用いる方法。
【請求項１】
ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法。
【請求項２】
ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＬＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＬＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１は塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度は溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して２０％から６０％溶離液３より塩濃度が低いことを特徴とする、ＬＤＬ亜分画の測定方法により、当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つのＬＤＬ画分の定量値を得、一方の値に対する他方の値の比を、あるいは、これら２つの値を合計したＬＤＬ画分の値に対する一方のＬＤＬ画分の比を、脂質代謝の病態を見る指標として用いる方法。
【請求項３】
ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＨＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことを特徴とする、ＨＤＬ亜分画の測定方法。
【請求項４】
ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）を吸着させるための溶離液（溶離液１’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２’）、ＨＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３’）の塩濃度の異なる溶離液を溶離液１’、２’、３’の順に陰イオン交換カラムに流すことによりＨＤＬを当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つに分離することでＨＤＬ亜分画を測定する方法であって、溶離液１’は塩濃度が８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、溶離液３’の塩濃度は１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２’は溶離液３’の塩濃度に対して２０％から３０％溶離液３’より塩濃度が低いことを特徴とする、ＨＤＬ亜分画の測定方法により、当該陰イオン交換カラムに対し吸着力の弱い分画と強い分画の２つのＨＤＬ画分の定量値を得、一方の値に対する他方の値の比を、あるいは、これら２つの値を合計したＨＤＬ画分の値に対する一方のＨDL画分の比を、脂質代謝の病態を見る指標として用いる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
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【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２００８−５８２６６（Ｐ２００８−５８２６６Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３８８１５（Ｐ２００６−２３８８１５）
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
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