イネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法
【課題】 新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができるイネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法を提供すること。
【解決手段】 イネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備するものである。これにより、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができる。
【解決手段】 イネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備するものである。これにより、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、コシヒカリと他の品種を区別する方法はあったが（例えば特許文献１参照）、コシヒカリ品種内の産地間区別を行われていない。
【０００３】
全国で栽培されているコシヒカリは、その品種としての信憑性が社会的な問題となっている。同時に、コシヒカリには産地間差があることが知られているが、それを厳密に分類する方法はこれまで開発されていない。
【特許文献１】特開２００５−２４５２４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができるイネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のイネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備する。
本発明のこのような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができる。
【０００６】
本発明のイネコシヒカリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとイネコシヒカリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動する。
【０００７】
すなわち、イネゲノムの複数の部位から、コシヒカリと他の品種を区別するＤＮＡ断片を見いだし、さらにコシヒカリ品種内の違いを検出するＤＮＡ断片により、産地間の区別を行う。ＤＮＡ断片の検出はＰＣＲ法により実施する。
【０００８】
イネのトランスポゾンを指標にして、系統特異的なＤＮＡ断片を探索した結果、コシヒカリを区別することのできる複数のＤＮＡマーカーを得、さらに新潟タイプのコシヒカリとそれ以外のコシヒカリ（福井タイプのコシヒカリ）を判別するＤＮＡマーカーを取得した。
【０００９】
本発明によるＤＮＡマーカー群は、高精度にコシヒカリを他の品種と区別することができ、コシヒカリ品種内の産地間の違い（新潟タイプと福井タイプ）を区別することができた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のこのような構成によれば、新潟産のイネコシヒカリを試料としたＰＣＲ産物のみに所定の増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が新潟産のイネコシヒカリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が新潟産のイネコシヒカリでないことを判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】新潟産のコシヒカリと福井産のコシヒカリを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態を説明する。
（プライマーセット）
【００１３】
本実施形態におけるイネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマー（primerL）と、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマー（primerR）とを具備する。
【００１４】
プライマー設計においては、イネゲノムの配列から、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別するための標的として、配列番号３に示されるの遺伝子がコードされている領域（染色体８番の位置にある）を選んだ。
配列番号３に示される遺伝子に関する付加的情報は以下のとおりである。
chr8 64561〜65265
gene Os08t0101000-01
product 新潟274 bp(福井mPing-in 704 bp)
（ＰＣＲを用いた判別方法）
試料として、新潟産のコシヒカリと福井産のコシヒカリとを使用した。
＜DNAの抽出＞
１）イネサンプルの葉をハサミで1〜2mmに刻み、1.5mlエッペンドルフチューブに入れる。
２）サンプルの入ったチューブを液体窒素の入った容器に浸してサンプルを凍結させる（2〜3分間）。
３）ホモジナイザーでサンプルを粉砕する（解凍しないよう素早く）。
粉砕されたサンプルに抽出用バッファーを400μl加え、ボルテックスミキサーを用いて懸濁する。室温に15分以上放置する（時々攪拌）。
４）等量(400μl)のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え、激しく振って混合する。
５）13000rpmで10分間遠心する（室温）。
６）マイクロピペットを使い、上清を別のチューブに移す（300μl程でよい）。
７）等量の2-プロパノールを加え、転倒操作により混和する。
８）13000rpmで10分間遠心する（室温）。９）チューブの底にペレット状のDNAを確認したら、上清をデカントで捨てる。
１０）70%エタノールを1ml加え、軽く撹拌してDNAペレットを洗う。
１１）13000rpmで5分間遠心する（室温）。
１２）マイクロピペットでエタノールを出来る限り除去した後、DNAペレットをデシケータ中で5分間減圧乾固する。
１３）50μlのTEバッファーを加えてDNAを溶解し、DNAサンプルとした。
以上のプロトコルにより各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
＜電気泳動＞
【００１５】
PCR反応液は1μMのプライマー、2.5mMの塩化マグネシウム、PCRバッファー、250μMのd-NTPおよび0.5μlのTaqポリメラーゼにDNA0.5μgを加え調製した。PCRの反応条件は変性温度94℃(30秒)、アニーリング温度をプライマーのTm値にあわせ(30秒)、伸長反応72℃(PCR産物の長さに応じて30秒より1kb)において行い、35サイクルの増幅を実施した。
【００１６】
その結果、図１左側に示すように、新潟産のコシヒカリについてのみ２７４ｂｐの位置にバンドが認められた。尚、図１右側は福井産のコシヒカリのＰＣＲ産物を電気泳動の結果である。
【００１７】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動を行うことによって、その電気泳動パターンから、試料のコシヒカリが新潟産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なコシヒカリがある場合、試料のコシヒカリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてＰＣＲによって２７４ｂｐのバンドが増幅されるのであれば新潟産と判別でき、704 bpのバンドが増幅されるのであれば新潟産ではないと判別できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、コシヒカリと他の品種を区別する方法はあったが（例えば特許文献１参照）、コシヒカリ品種内の産地間区別を行われていない。
【０００３】
全国で栽培されているコシヒカリは、その品種としての信憑性が社会的な問題となっている。同時に、コシヒカリには産地間差があることが知られているが、それを厳密に分類する方法はこれまで開発されていない。
【特許文献１】特開２００５−２４５２４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができるイネコシヒカリの産地判別用プライマーセット及びイネコシヒカリの産地判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のイネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備する。
本発明のこのような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別することができる。
【０００６】
本発明のイネコシヒカリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとイネコシヒカリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動する。
【０００７】
すなわち、イネゲノムの複数の部位から、コシヒカリと他の品種を区別するＤＮＡ断片を見いだし、さらにコシヒカリ品種内の違いを検出するＤＮＡ断片により、産地間の区別を行う。ＤＮＡ断片の検出はＰＣＲ法により実施する。
【０００８】
イネのトランスポゾンを指標にして、系統特異的なＤＮＡ断片を探索した結果、コシヒカリを区別することのできる複数のＤＮＡマーカーを得、さらに新潟タイプのコシヒカリとそれ以外のコシヒカリ（福井タイプのコシヒカリ）を判別するＤＮＡマーカーを取得した。
【０００９】
本発明によるＤＮＡマーカー群は、高精度にコシヒカリを他の品種と区別することができ、コシヒカリ品種内の産地間の違い（新潟タイプと福井タイプ）を区別することができた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のこのような構成によれば、新潟産のイネコシヒカリを試料としたＰＣＲ産物のみに所定の増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が新潟産のイネコシヒカリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が新潟産のイネコシヒカリでないことを判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】新潟産のコシヒカリと福井産のコシヒカリを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態を説明する。
（プライマーセット）
【００１３】
本実施形態におけるイネコシヒカリの産地判別用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマー（primerL）と、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマー（primerR）とを具備する。
【００１４】
プライマー設計においては、イネゲノムの配列から、新潟産のコシヒカリとそれ以外のコシヒカリとを判別するための標的として、配列番号３に示されるの遺伝子がコードされている領域（染色体８番の位置にある）を選んだ。
配列番号３に示される遺伝子に関する付加的情報は以下のとおりである。
chr8 64561〜65265
gene Os08t0101000-01
product 新潟274 bp(福井mPing-in 704 bp)
（ＰＣＲを用いた判別方法）
試料として、新潟産のコシヒカリと福井産のコシヒカリとを使用した。
＜DNAの抽出＞
１）イネサンプルの葉をハサミで1〜2mmに刻み、1.5mlエッペンドルフチューブに入れる。
２）サンプルの入ったチューブを液体窒素の入った容器に浸してサンプルを凍結させる（2〜3分間）。
３）ホモジナイザーでサンプルを粉砕する（解凍しないよう素早く）。
粉砕されたサンプルに抽出用バッファーを400μl加え、ボルテックスミキサーを用いて懸濁する。室温に15分以上放置する（時々攪拌）。
４）等量(400μl)のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え、激しく振って混合する。
５）13000rpmで10分間遠心する（室温）。
６）マイクロピペットを使い、上清を別のチューブに移す（300μl程でよい）。
７）等量の2-プロパノールを加え、転倒操作により混和する。
８）13000rpmで10分間遠心する（室温）。９）チューブの底にペレット状のDNAを確認したら、上清をデカントで捨てる。
１０）70%エタノールを1ml加え、軽く撹拌してDNAペレットを洗う。
１１）13000rpmで5分間遠心する（室温）。
１２）マイクロピペットでエタノールを出来る限り除去した後、DNAペレットをデシケータ中で5分間減圧乾固する。
１３）50μlのTEバッファーを加えてDNAを溶解し、DNAサンプルとした。
以上のプロトコルにより各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
＜電気泳動＞
【００１５】
PCR反応液は1μMのプライマー、2.5mMの塩化マグネシウム、PCRバッファー、250μMのd-NTPおよび0.5μlのTaqポリメラーゼにDNA0.5μgを加え調製した。PCRの反応条件は変性温度94℃(30秒)、アニーリング温度をプライマーのTm値にあわせ(30秒)、伸長反応72℃(PCR産物の長さに応じて30秒より1kb)において行い、35サイクルの増幅を実施した。
【００１６】
その結果、図１左側に示すように、新潟産のコシヒカリについてのみ２７４ｂｐの位置にバンドが認められた。尚、図１右側は福井産のコシヒカリのＰＣＲ産物を電気泳動の結果である。
【００１７】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動を行うことによって、その電気泳動パターンから、試料のコシヒカリが新潟産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なコシヒカリがある場合、試料のコシヒカリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてＰＣＲによって２７４ｂｐのバンドが増幅されるのであれば新潟産と判別でき、704 bpのバンドが増幅されるのであれば新潟産ではないと判別できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーと
を具備するイネコシヒカリの産地判別用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットとイネコシヒカリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動するイネコシヒカリの産地判別方法。
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーと
を具備するイネコシヒカリの産地判別用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットとイネコシヒカリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動するイネコシヒカリの産地判別方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１９３７９９（Ｐ２０１１−１９３７９９Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６４２３２（Ｐ２０１０−６４２３２）
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５１１０６４０４１）株式会社同位体研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５１１０６４０４１）株式会社同位体研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
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