イムノグロブリン結合タンパク質
【課題】例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができるイムノグロブリン結合タンパク質を提供する。
【解決手段】イムノグロブリン結合タンパク質は下記一般式（１）または（２）で表される。
Ｒ１−ｒ−Ｒ２・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
Ｒ２−ｒ−Ｒ１・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【解決手段】イムノグロブリン結合タンパク質は下記一般式（１）または（２）で表される。
Ｒ１−ｒ−Ｒ２・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
Ｒ２−ｒ−Ｒ１・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、薬学、生物学などの分野において、純度が高いタンパク質試薬が求められている。また、抗体医薬の開発の活況に伴い、純度が高いタンパク質医薬を効率良く、低コストでかつ大量に得る方法が求められている。
【０００３】
純度の高いタンパク質を製造する方法の一つとして、アフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。アフィニティクロマトグラフィーでは、目的タンパク質に特異的かつ可逆的な親和性を示す分子をリガンドとして結合させた目的物質捕捉用担体に目的タンパク質を吸着させることにより、目的タンパク質を夾雑物から分離させる。その際のリガンドとしてタンパク質が用いられることが多い。リガンドとして用いられるタンパク質としては、例えばプロテインＡが挙げられる。
【０００４】
プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であり、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインと呼ばれる相同性を有する５つのイムノグロブリン結合ドメインの繰り返し構造を有する。
【０００５】
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、１個のドメインのみでイムノグロブリンに結合することが知られている（非特許文献１）。プロテインＡについては、例えば、ＩｇＧとの結合の特異性を高めることを目的として、アミノ酸配列の改変が試みられている（特許文献１）。天然型のプロテインＡだけでなく、アミノ酸配列が部分的に改変されたイムノグロブリン結合ドメインを含む組換え型のプロテインＡも、アフィニティクロマトグラフィー用のリガンドとして広く利用されている。
【特許文献１】米国特許第５１５１３５０号明細書
【非特許文献１】ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、近年、純度の高いタンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することが求められている。
【０００７】
本発明は、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができるイムノグロブリン結合タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（１）で表される。
【０００９】
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
上記一般式（１）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことができる。
【００１０】
本発明の他の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（２）で表される。
【００１１】
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
なお、上記一般式（１）および一般式（２）において、左端がＮ末端を示し、右端がＣ末端を示すものとする。
【００１２】
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことができる。
【００１３】
上記イムノグロブリン結合タンパク質において、前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種であることができる。
【００１４】
本発明の他の一態様にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
【００１５】
本発明の他の一態様にかかる遺伝子発現系は、上記核酸を含む。
【発明の効果】
【００１６】
上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（１）または上記一般式（２）で表されることにより、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することができる。すなわち、上記イムノグロブリン結合タンパク質を当該担体におけるリガンドとして使用することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができる。これにより、目的物質の捕捉量を高めることができるため、目的物質の結合容量を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質、核酸、および遺伝子発現系について具体的に説明する。
【００１８】
１．イムノグロブリン結合タンパク質
本発明の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
【００１９】
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
本発明の他の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（２）で表される。
【００２０】
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
上記一般式（１）および上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
【００２１】
また、上記一般式（１）および上記一般式（２）において、ｒで表されるアミノ酸配列中に例えばＴＥＶプロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。
【００２２】
本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質を構成するアミノ酸の総個数は通常７０〜１０００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０〜６００であるのが好ましい。
【００２３】
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいい、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質をいう。
【００２４】
１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これらのドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。
【００２５】
また、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。ここで、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。
【００２６】
１．２．製造
本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を大量かつ経済的に取得することができる。
【００２７】
具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるため、例えば、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドベクターに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示しているようにStraphylococcus aureusのゲノムＤＮＡからＰＣＲ技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
【００２８】
また、上述したように、本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜５個）を含む多量体タンパク質であってもよい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡを所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む多量体タンパク質を容易に製造することができる。
【００２９】
１．３．用途
本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質の用途の一例としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質を担体に結合させて精製するためのリガンドが挙げられる。本発明において、「リガンド」とは、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質に特異的にかつ可逆的に結合するタンパク質をいう。ここで、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いた担体は、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、従来の担体と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質（抗体）の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
【００３０】
２．核酸
本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
【００３１】
本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【００３２】
３．遺伝子発現系
本発明の他の一実施形態にかかる遺伝子発現系は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸を含む。本実施形態にかかる遺伝子発現系として、例えば、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。好ましいベクターとしては、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。
また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００３３】
４．実施例
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例および比較例中の「％」および「部」は特記しない限り、それぞれ質量％および質量部であることを示している。
【００３４】
４．１．実施例１（イムノグロブリン結合タンパク質の調製）
後述する調製例１〜４により、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ（配列番号１）、ＳＰＡＣ（配列番号２）、ＳＰＡＫＫ（配列番号３）、ＳＰＡＴＫ（配列番号４）、ＳＰＡ２Ｋ（配列番号５）、ＳＰＡ３Ｋ（配列番号６）、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃ（配列番号７）、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｎ（配列番号８））を調製した。
【００３５】
なお、図１および図２において、Ｒ１、Ｒ２およびｒは上記一般式（１）または上記一般式（２）におけるＲ１、Ｒ２およびｒに対応し、ｒ中の下線部はＴＥＶプロテアーゼ切断部位を示し、Ｒ２中の下線部はインタードメインリンカーまたはＣ末端リンカー（ドメインｔ）、表２参照）を示す。
【００３６】
これらのタンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１および図２に示すアミノ酸配列を有することが確認された。
【００３７】
４．１．１．調製例１（ＰＣＲ増幅および制限酵素の消化）
Straphylococcus aureus（ＡＴＣＣ， １０８３２）由来のプロテインＡ（Ｄドメイン＋Ａドメイン）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。プライマー（表２参照）は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
【００３８】
表１に示されるように、ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡＫＫ、およびＳＰＡＴＫをそれぞれコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（New-England Bio Lab製）によって消化されて、ベクターｐＥＴＭ−１１（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
【００３９】
また、表１に示されるように、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮをコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されて、ベクターｐＥＴＭ−１０（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
【００４０】
さらに、表１に示されるように、Ｃ末端にヒスタグを有するイムノグロブリン結合タンパク質であるＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃを形成するために、ベクターｐＥＴ２９（図３参照、Novagen社製）が用いられた。このベクターｐＥＴ２９に用いられる制限酵素はＮｄｅＩ（New-England Bio Lab製）およびＸｈｏＩ（New-England Bio Lab製）であった。
【００４１】
なお、図３に示される３種類の発現ベクターはすべて、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００４２】
また、図３に示されるイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列において、「Ｔｅｖ」はＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼ認識部位（アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＧ）を示す。ＴＥＶプロテアーゼはアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを認識し、ＱとＣの間を切断する。
【００４３】
上記制限酵素は、ＳＰＡＫの挿入配列に基づく１対のプライマーを設計することにより導入された。また、ＰＣＲ増幅は、表２に示されるプライマー（配列番号９〜１７）を用いて行われた。
【００４４】
なお、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得ることもできる。本実施例では、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得た。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
Straphylococcus aureusのgenomic ＤＮＡテンプレート（５００ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、各プライマー５ｐｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液（Fermentas製）５μｌ、およびＰｆｕポリメラーゼ（Fermentas製）（５ユニット／μｌ）１μｌを含むＰＣＲ増幅溶液に滅菌水を加えて、最終的な液の体積を５０μｌとした。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである：９４℃で１分、次に９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分の３０サイクル、最後に７２℃で１０分。このＰＣＲ反応をＰＸ２ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ装置（Thermo Electron Corporation製）にて行った。
【００４８】
４．１．２．調製例２（ライゲーションおよび形質転換）
制限酵素で消化されたＤＮＡフラグメントのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolab製）１００−２００ユニット／ｍｌおよび５×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いて１２℃で１２−１６時間行われた。プラスミドの形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−α株細胞（New England Biolab製）を使用した。
【００４９】
４．１．３．調製例３（プラスミドＤＮＡの調製および配列解析）
陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット（Mini Prep Kit）（キアゲン（Qiagen）社製）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡについて、挿入されたＤＮＡフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer（Applied Biosystems製）で配列解析を行った。
【００５０】
４．１．４．調製例４（イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製）
組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（STRATAGENE製）内にて１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。
【００５１】
４．２．実施例２（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化）
４．２．１．固定化例１
グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート共重合体からなる多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）を懸濁重合により作製した。ＰＢの平均粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ２／ｇであった。４００ｍｇのＰＢ、３６ｍｇのＳＰＡＫが１６ｍＬのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）に分散した混合液を調製し、４℃で２４時間転倒混和し、ＳＰＡＫをＰＢに結合させた。次いで、１０％メルカプトエタノール水溶液０．８ｍＬを添加して４℃で６時間転倒混和し、残余のエポキシ基をブロッキングし、２０％エタノール水溶液で洗浄して、３８０ｍｇのＳＰＡＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫ−ＰＢ）を得た。
【００５２】
４．２．２．比較固定化例１
５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴのバーファー（ｐＨ８．０）中、ＴＥＶプロテアーゼで消化されたＳＰＡＫをＮｉ−ＮＡＴカラムに通過させて、ＳＰＡＫのヒスタグ部位が切断された粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを回収した。この粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバーファー（ｐＨ７．５）中で１２ｈ透析して、粒子への結合実験用ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを調製した。ＳＰＡＫｗｏＨｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＳＰＡＫｗｏｈｉｓ（全アミノ酸配列）（配列番号１８）
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
次に、上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＫｗｏＨｉｓ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢ）を得た。
【００５３】
４．３．実施例３（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合量の測定）
４．３．１．測定例１
ＳＰＡＫ−ＰＢを内径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのカラムに充填し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の結合容量を測定した。ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量およびＳＰＡＫ−ＰＢ体積から結合容量を求めたところ、３０ｍｇ／ｍＬであった。
【００５４】
４．３．２．比較測定例１
上記測定例１で、ＳＰＡＫ−ＰＢの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢを使用した以外は、測定例１と同様にして、ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量を求めたところ、６ｍｇ／ｍＬであった。
【００５５】
本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡＫＫ、ＳＰＡＴＫ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃ、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、３種類の発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１、ｐＥＴＭ−１０およびｐＥＴ２９）にそれぞれ挿入された、本発明の実施例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、薬学、生物学などの分野において、純度が高いタンパク質試薬が求められている。また、抗体医薬の開発の活況に伴い、純度が高いタンパク質医薬を効率良く、低コストでかつ大量に得る方法が求められている。
【０００３】
純度の高いタンパク質を製造する方法の一つとして、アフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。アフィニティクロマトグラフィーでは、目的タンパク質に特異的かつ可逆的な親和性を示す分子をリガンドとして結合させた目的物質捕捉用担体に目的タンパク質を吸着させることにより、目的タンパク質を夾雑物から分離させる。その際のリガンドとしてタンパク質が用いられることが多い。リガンドとして用いられるタンパク質としては、例えばプロテインＡが挙げられる。
【０００４】
プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であり、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインと呼ばれる相同性を有する５つのイムノグロブリン結合ドメインの繰り返し構造を有する。
【０００５】
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、１個のドメインのみでイムノグロブリンに結合することが知られている（非特許文献１）。プロテインＡについては、例えば、ＩｇＧとの結合の特異性を高めることを目的として、アミノ酸配列の改変が試みられている（特許文献１）。天然型のプロテインＡだけでなく、アミノ酸配列が部分的に改変されたイムノグロブリン結合ドメインを含む組換え型のプロテインＡも、アフィニティクロマトグラフィー用のリガンドとして広く利用されている。
【特許文献１】米国特許第５１５１３５０号明細書
【非特許文献１】ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、近年、純度の高いタンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することが求められている。
【０００７】
本発明は、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができるイムノグロブリン結合タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（１）で表される。
【０００９】
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
上記一般式（１）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことができる。
【００１０】
本発明の他の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（２）で表される。
【００１１】
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
なお、上記一般式（１）および一般式（２）において、左端がＮ末端を示し、右端がＣ末端を示すものとする。
【００１２】
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことができる。
【００１３】
上記イムノグロブリン結合タンパク質において、前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種であることができる。
【００１４】
本発明の他の一態様にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
【００１５】
本発明の他の一態様にかかる遺伝子発現系は、上記核酸を含む。
【発明の効果】
【００１６】
上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（１）または上記一般式（２）で表されることにより、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することができる。すなわち、上記イムノグロブリン結合タンパク質を当該担体におけるリガンドとして使用することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができる。これにより、目的物質の捕捉量を高めることができるため、目的物質の結合容量を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質、核酸、および遺伝子発現系について具体的に説明する。
【００１８】
１．イムノグロブリン結合タンパク質
本発明の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
【００１９】
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
本発明の他の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（２）で表される。
【００２０】
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
上記一般式（１）および上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
【００２１】
また、上記一般式（１）および上記一般式（２）において、ｒで表されるアミノ酸配列中に例えばＴＥＶプロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。
【００２２】
本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質を構成するアミノ酸の総個数は通常７０〜１０００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０〜６００であるのが好ましい。
【００２３】
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいい、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質をいう。
【００２４】
１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これらのドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。
【００２５】
また、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。ここで、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。
【００２６】
１．２．製造
本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を大量かつ経済的に取得することができる。
【００２７】
具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるため、例えば、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドベクターに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示しているようにStraphylococcus aureusのゲノムＤＮＡからＰＣＲ技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
【００２８】
また、上述したように、本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜５個）を含む多量体タンパク質であってもよい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡを所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む多量体タンパク質を容易に製造することができる。
【００２９】
１．３．用途
本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質の用途の一例としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質を担体に結合させて精製するためのリガンドが挙げられる。本発明において、「リガンド」とは、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質に特異的にかつ可逆的に結合するタンパク質をいう。ここで、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いた担体は、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、従来の担体と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質（抗体）の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
【００３０】
２．核酸
本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
【００３１】
本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【００３２】
３．遺伝子発現系
本発明の他の一実施形態にかかる遺伝子発現系は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸を含む。本実施形態にかかる遺伝子発現系として、例えば、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。好ましいベクターとしては、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。
また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００３３】
４．実施例
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例および比較例中の「％」および「部」は特記しない限り、それぞれ質量％および質量部であることを示している。
【００３４】
４．１．実施例１（イムノグロブリン結合タンパク質の調製）
後述する調製例１〜４により、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ（配列番号１）、ＳＰＡＣ（配列番号２）、ＳＰＡＫＫ（配列番号３）、ＳＰＡＴＫ（配列番号４）、ＳＰＡ２Ｋ（配列番号５）、ＳＰＡ３Ｋ（配列番号６）、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃ（配列番号７）、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｎ（配列番号８））を調製した。
【００３５】
なお、図１および図２において、Ｒ１、Ｒ２およびｒは上記一般式（１）または上記一般式（２）におけるＲ１、Ｒ２およびｒに対応し、ｒ中の下線部はＴＥＶプロテアーゼ切断部位を示し、Ｒ２中の下線部はインタードメインリンカーまたはＣ末端リンカー（ドメインｔ）、表２参照）を示す。
【００３６】
これらのタンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１および図２に示すアミノ酸配列を有することが確認された。
【００３７】
４．１．１．調製例１（ＰＣＲ増幅および制限酵素の消化）
Straphylococcus aureus（ＡＴＣＣ， １０８３２）由来のプロテインＡ（Ｄドメイン＋Ａドメイン）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。プライマー（表２参照）は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
【００３８】
表１に示されるように、ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡＫＫ、およびＳＰＡＴＫをそれぞれコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（New-England Bio Lab製）によって消化されて、ベクターｐＥＴＭ−１１（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
【００３９】
また、表１に示されるように、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮをコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されて、ベクターｐＥＴＭ−１０（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
【００４０】
さらに、表１に示されるように、Ｃ末端にヒスタグを有するイムノグロブリン結合タンパク質であるＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃを形成するために、ベクターｐＥＴ２９（図３参照、Novagen社製）が用いられた。このベクターｐＥＴ２９に用いられる制限酵素はＮｄｅＩ（New-England Bio Lab製）およびＸｈｏＩ（New-England Bio Lab製）であった。
【００４１】
なお、図３に示される３種類の発現ベクターはすべて、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００４２】
また、図３に示されるイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列において、「Ｔｅｖ」はＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼ認識部位（アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＧ）を示す。ＴＥＶプロテアーゼはアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを認識し、ＱとＣの間を切断する。
【００４３】
上記制限酵素は、ＳＰＡＫの挿入配列に基づく１対のプライマーを設計することにより導入された。また、ＰＣＲ増幅は、表２に示されるプライマー（配列番号９〜１７）を用いて行われた。
【００４４】
なお、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得ることもできる。本実施例では、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得た。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
Straphylococcus aureusのgenomic ＤＮＡテンプレート（５００ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、各プライマー５ｐｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液（Fermentas製）５μｌ、およびＰｆｕポリメラーゼ（Fermentas製）（５ユニット／μｌ）１μｌを含むＰＣＲ増幅溶液に滅菌水を加えて、最終的な液の体積を５０μｌとした。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである：９４℃で１分、次に９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分の３０サイクル、最後に７２℃で１０分。このＰＣＲ反応をＰＸ２ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ装置（Thermo Electron Corporation製）にて行った。
【００４８】
４．１．２．調製例２（ライゲーションおよび形質転換）
制限酵素で消化されたＤＮＡフラグメントのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolab製）１００−２００ユニット／ｍｌおよび５×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いて１２℃で１２−１６時間行われた。プラスミドの形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−α株細胞（New England Biolab製）を使用した。
【００４９】
４．１．３．調製例３（プラスミドＤＮＡの調製および配列解析）
陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット（Mini Prep Kit）（キアゲン（Qiagen）社製）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡについて、挿入されたＤＮＡフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer（Applied Biosystems製）で配列解析を行った。
【００５０】
４．１．４．調製例４（イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製）
組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（STRATAGENE製）内にて１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。
【００５１】
４．２．実施例２（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化）
４．２．１．固定化例１
グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート共重合体からなる多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）を懸濁重合により作製した。ＰＢの平均粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ２／ｇであった。４００ｍｇのＰＢ、３６ｍｇのＳＰＡＫが１６ｍＬのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）に分散した混合液を調製し、４℃で２４時間転倒混和し、ＳＰＡＫをＰＢに結合させた。次いで、１０％メルカプトエタノール水溶液０．８ｍＬを添加して４℃で６時間転倒混和し、残余のエポキシ基をブロッキングし、２０％エタノール水溶液で洗浄して、３８０ｍｇのＳＰＡＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫ−ＰＢ）を得た。
【００５２】
４．２．２．比較固定化例１
５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴのバーファー（ｐＨ８．０）中、ＴＥＶプロテアーゼで消化されたＳＰＡＫをＮｉ−ＮＡＴカラムに通過させて、ＳＰＡＫのヒスタグ部位が切断された粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを回収した。この粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバーファー（ｐＨ７．５）中で１２ｈ透析して、粒子への結合実験用ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを調製した。ＳＰＡＫｗｏＨｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＳＰＡＫｗｏｈｉｓ（全アミノ酸配列）（配列番号１８）
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
次に、上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＫｗｏＨｉｓ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢ）を得た。
【００５３】
４．３．実施例３（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合量の測定）
４．３．１．測定例１
ＳＰＡＫ−ＰＢを内径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのカラムに充填し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の結合容量を測定した。ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量およびＳＰＡＫ−ＰＢ体積から結合容量を求めたところ、３０ｍｇ／ｍＬであった。
【００５４】
４．３．２．比較測定例１
上記測定例１で、ＳＰＡＫ−ＰＢの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢを使用した以外は、測定例１と同様にして、ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ−ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量を求めたところ、６ｍｇ／ｍＬであった。
【００５５】
本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡＫＫ、ＳＰＡＴＫ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｃ、ＳＰＡ−Ｈｉｓ−Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、３種類の発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１、ｐＥＴＭ−１０およびｐＥＴ２９）にそれぞれ挿入された、本発明の実施例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【請求項２】
上記一般式（１）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含む、請求項１に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項３】
下記一般式（２）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【請求項４】
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含む、請求項３に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項５】
前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む遺伝子発現系。
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
Ｒ１−ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【請求項２】
上記一般式（１）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含む、請求項１に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項３】
下記一般式（２）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
Ｒ２−ｒ−Ｒ１ ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【請求項４】
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含む、請求項３に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項５】
前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む遺伝子発現系。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１３５７７７（Ｐ２０１１−１３５７７７Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４６１８４（Ｐ２００８−２４６１８４）
【出願日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（０００００４１７８）ＪＳＲ株式会社 (3,320)
【出願人】（５０８２８８７００）ザ ユニバーシティ オブ ウエスタン オンタリオ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ
【住所又は居所原語表記】１１５１ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｏｎｔａｒｉｏ Ｎ６Ａ ３Ｋ７， Ｃａｎａｄａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（０００００４１７８）ＪＳＲ株式会社 (3,320)
【出願人】（５０８２８８７００）ザ ユニバーシティ オブ ウエスタン オンタリオ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ
【住所又は居所原語表記】１１５１ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｏｎｔａｒｉｏ Ｎ６Ａ ３Ｋ７， Ｃａｎａｄａ
【Ｆターム（参考）】
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