イムノグロブリン親和性リガンド
【課題】
本発明は、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価に製造可能なイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィー用担体を提供することを課題とする。
【解決手段】
イムノグロブリン結合領域であるヘリックス１およびへリックス２のタンパク質表面に存在するリジン残基数を可能な限り減少させるとともに、へリックス３およびその周辺のタンパク質表面に可能な限りリジン残基数を増加させるアミノ酸置換、および前記リジン残基数を増加させるアミノ酸置換ならびにアスパラギン酸−プロリンの配列を排除するアミノ酸置換を行ったイムノグロブリン結合タンパク質、もしくはその多量体を、アフィニティクロマトグラフィー用担体の親和性リガンドとして用いる。
本発明は、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価に製造可能なイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィー用担体を提供することを課題とする。
【解決手段】
イムノグロブリン結合領域であるヘリックス１およびへリックス２のタンパク質表面に存在するリジン残基数を可能な限り減少させるとともに、へリックス３およびその周辺のタンパク質表面に可能な限りリジン残基数を増加させるアミノ酸置換、および前記リジン残基数を増加させるアミノ酸置換ならびにアスパラギン酸−プロリンの配列を排除するアミノ酸置換を行ったイムノグロブリン結合タンパク質、もしくはその多量体を、アフィニティクロマトグラフィー用担体の親和性リガンドとして用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリンに親和性のあるタンパク質に関するものであり、より詳しくは、アフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとしての性質が改良されたイムノグロブリン結合タンパク質の改変タンパク質に関する。また、本発明は該改変タンパク質のイムノグロブリン親和性リガンドとしての使用、ならびに、アフィニティ分離マトリックスへの使用に関する。
【０００２】
［定義］
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、天然型タンパク質の部分的断片や天然型の配列を人為的に改変した変異体を含む。「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を指し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有するタンパク質であって、イムノグロブリンと非共有結合する「イムノグロブリン結合ドメイン」を含んで成るタンパク質をいう。
【０００３】
イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつイムノグロブリン結合活性を含む機能的特性において、改変前のタンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【０００４】
「親和性リガンド」とは、特異的親和力により特定の分子と結合する性質をもつ分子のことをいい、本発明においては、イムノグロブリンを選択的に結合できるイムノグロブリン結合タンパク質を指す。なお、単に「リガンド」と呼ぶこともある。「アフィニティクロマトグラフィ用担体」とは、不溶性担体に親和性リガンドを固定化させた担体をいう。固定化とは、不溶性担体に親和性リガンドを共有結合させることをいい、これによって不溶性担体が標的分子（イムノグロブリン）の親和性吸着体となる。
またリガンドを不溶性担体に固定化する際の「イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が向上する」とは、不溶性担体への固定化反応において、リガンド分子がイムノグロブリンと結合できる方向に固定化される割合が増大することをいい、結果として固定化されたリガンドの単位分子数あたりに結合できるイムノグロブリン量が増加することを指す。
【背景技術】
【０００５】
近年バイオ関連分野における研究や製薬産業において、純度の高いタンパク質試薬やタンパク質医薬の需要は高い。高純度のタンパク質の製造方法としては、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等の様々な原理による精製過程が採用されるが、なかでもアフィニティクロマトグラフィは目的タンパク質と夾雑物を分離しつつ、目的タンパク質を濃縮する効率が極めて高い優れた方法である。アフィニティクロマトグラフィにおいては、目的のタンパク質と特異的な親和性を示す分子をリガンドとして結合させた不溶性担体に目的タンパク質を吸着させることで夾雑物と分離するが、しばしばそのリガンド分子としてタンパク質が用いられる。
【０００６】
プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であり、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインと呼ばれる相同性を有する５つのイムノグロブリン結合ドメインの繰り返し構造を有する。イムノグロブリン結合ドメインは、１個だけでイムノグロブリンに結合することが知られており（非特許文献１）、天然型のプロテインＡとならんで、アミノ酸配列が部分的に改変されたイムノグロブリン結合ドメインのみから成る組換えタンパク質もアフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとして広く利用されている。またスタフィロコッカスはプロテインＡ以外にもイムノグロブリンに結合する性質を持ったタンパク質を発現していることが知られており（特許文献１）、このタンパク質の部分構造にはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとアミノ酸配列において４５％程度の相同性をもつ領域が含まれている。しかしこのイムノグロブリン結合ドメインについて、酸性およびアルカリ性ｐＨ条件における化学的安定性等、親和性リガンドとしての有用性は不明である。
【０００７】
プロテインＡについては、ＩｇＧとの結合の特異性および結合容量、並びに天然プロテインＡを基本にした他の吸着剤と少なくとも同程度またはそれ以上の化学的安定性を有する吸着媒体を提供することを目的として、１個のシステイン残基を導入したプロテインＡ(rProtein A cys)をリガンドとして用い、これをチオエステル結合を介してアフィニティ担体に１点で固定化する技術（特許文献２）が提案されている。また、上記Protein A cysを固定化したアフィニティクロマトグラフィ担体などに代表される抗体精製用アフィニティ担体の問題点である固定化部位の化学的安定性とそれに由来する殺菌・洗浄工程における問題を解決しつつ、より高い抗体分子の吸着量を達成することを目的として、１級アミノ基を有するポリマー化合物を導入した担体にＣ末端カルボキシル基選択的にアミド結合を介して固定化する技術（特許文献３）が提案されている。
さらに、特許文献４では、例えばスタフィロコッカスのプロテインＡのＢドメインのように、免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるタンパク質から誘導できる免疫グロブリン結合タンパク質であって、１以上のアスパラギン残基がグルタミンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異し、該変異によって約１３〜１４以下のｐＨ域での化学的安定性が親分子に比べて向上した免疫グロブリン結合タンパク質、該タンパク質をリガンドとして固体担体に結合したアフィニティ分離用マトリックスが提案されており、そこに示されたアルカリ耐性付与に寄与する最良の実施形態は、２３位のアスパラギンのスレオニンへの置換および該置換と４３位のアスパラギンのグルタミン酸への置換との組み合わせである。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第ＵＳ６５４８６３９Ｂ１
【特許文献２】米国特許第ＵＳ６３９９７５０Ｂ１（特表２０００−５００６４９参照）
【特許文献３】特開２００５−１１２８２７
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０３／０８０６５５（特表２００５−５３８６９３参照）
【非特許文献１】ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
高流速やゲルの自重に耐え得る硬度といった一般的なクロマトグラフィ用担体に求められる特性に加え、抗体医薬原料としてのイムノグロブリンの製造過程に使用されるアフィニティクロマトグラフィ用担体に求められる望ましい性質として、（a）担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量が多いこと、(b)酸性ｐＨ条件でのイムノグロブリンの溶出過程におけるリガンドの漏出が少ないこと、(c)アルカリ性ｐＨ条件でのライン洗浄過程におけるイムノグロブリン結合活性の低下が小さいこと、(d)安価に製造できること、が挙げられ、特に（a）の性質はイムノグロブリンの精製コストを軽減するために重要である。これらの課題を解決するためには、適切な不溶性担体の素材やリガンドタンパク質の製造方法を選択することはもちろん重要であるが、それに加えてリガンドとして用いるイムノグロブリン結合タンパク質を改良することが極めて重要である。
【００１０】
上記（a）〜(d)の性質を向上させるための様々な検討がなされているが、これまでにリガンドタンパク質そのものの改変によるものの例としては（a）と(c)の改良が挙げられる。（a）の性質に優れた担体を作成する目的で開発されている技術（特許文献２、３）の共通点はリガンドタンパク質のＣ末端またはその付近１点で担体に固定化する点であり、ともに酸性ｐＨ条件におけるイムノグロブリンの溶出過程で切断を受けたリガンドタンパク質またはその断片が漏出しやすいという問題が残されている。また、 (b)の性質に優れた担体を作成するためには、（a）とは逆にリガンドタンパク質を多点で担体に固定する方法が有効であることが知られており、プロテインＡ分子中に存在する複数の１級アミノ基を介して担体に固定することが一般に行われている。しかし、この方法で固定するとリガンドタンパク質の配向性を制御できず、固定化されたリガンドタンパク質のなかにはイムノグロブリンと結合できない分子も含まれるため、担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量は低下する。すなわち、既存の技術においては、（a）と(b)は互いに相反する因子であり、同時にその両方を解決するための新しい技術開発が望まれている。さらに、(c)の性質に優れた担体を作成するための開示されている技術（特許文献４）において示されているものは、その化学的安定性はなお充分なものではない。また、現在市販されているイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用担体には、主として遺伝子組換え技術により製造されたプロテインＡタンパク質が用いられているが、その製造方法についてもなお改善が望まれる。
【００１１】
そこで、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質におけるアフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとしての性質が改良された、すなわち、互いに相反する（a）と(b)の性質に加え、 (c)の性質にも優れた改変タンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は該改変タンパク質のイムノグロブリン親和性リガンドとしての使用、ならびに、アフィニティ分離マトリックスへの使用、すなわち、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価に製造可能なイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
リガンドタンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定化する際に、配向性を制御しやすい一点での架橋方法を採用すると、架橋部分やペプチド鎖の切断により、リガンドタンパク質やペプチド断片が漏出し易い。一方、通常利用されるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインタンパク質をそのままリガンドとして用い、これを多点で担体に固定すると、リガンドタンパク質の漏出は起こりにくくなるが、リガンドの配向性を制御できないため単位担体量あたりのイムノグロブリン結合量が低いものとなる。本発明者らは、多点で担体に固定しても架橋の配向性を制御できる様にリガンドタンパク質を改変することで、上述の相反する要因の両立を図った。
【００１３】
スタフィロコッカスに由来するプロテインＡタンパク質１分子中には、先述の通りイムノグロブリン結合ドメインが５個存在するが、該イムノグロブリン結合ドメインは、いずれも３個のα−へリックス構造とそれらを互いに連結している２個のループ構造から構成される。イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与すると考えられている１０個のアミノ酸はいずれもＮ末端側から１番目のヘリックス（へリックス１）と２番目のヘリックス（へリックス２）上に存在している（Tashiro M.他 １９９７年 High-resolution solution NMR structure of the Z domain of staphyrococcal protein A 、Jounal of Molecular Biology 第２７２巻４号、５７３−５９０頁）。さらに該イムノグロブリン結合ドメインは、へリックス３が欠落していてもイムノグロブリンと結合できる（Melissa A.他 １９９７年、Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Proceeding Natural Academy of Sciences USA、第９４巻、１００８０−１００８５頁）。
【００１４】
タンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定する際に汎用される反応において、担体との結合反応に利用できるタンパク質側の主な活性基はシステインのチオール基、Ｎ末端アミノ酸およびリジンのアミノ基、ならびにＣ末端アミノ酸およびグルタミン酸、アスパラギン酸のカルボキシル基等である。本発明者らは、配向性を制御しつつ多点で担体に結合させるのに有利なアミノ酸残基としてリジン残基に着目し、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの三次元構造データに基づいて分子内のリジンの配置を設計した。具体的にはイムノグロブリン結合領域であるヘリックス１およびへリックス２のタンパク質表面に存在するリジン残基数を可能な限り減少させるとともに、へリックス３およびその周辺のタンパク質表面に可能な限りリジン残基数を増加させるアミノ酸置換についての検討を行なった。また本発明者らは、酸性ｐＨ条件でのイムノグロブリンの溶出過程におけるリガンドタンパク質の漏出を防ぐ目的で、酸性ｐＨ条件での切断を受けやすいと考えられるアスパラギン酸−プロリンの配列を排除する置換についての検討を行なった。
【００１５】
本発明者らは、作成した改変タンパク質について、陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動、酸性ｐＨ条件における被切断特性、クロマトグラフィ用担体に固定化したときのイムノグロブリン結合活性ならびにアルカリ性ｐＨ条件における安定性を評価し、多面的に優れたリガンドタンパク質の探索を重ねた結果、リガンドタンパク質そのものを簡便に精製できるうえに、多点で担体に固定しても高いイムノグロブリン結合活性を示し、酸性ｐＨおよびアルカリ性ｐＨ条件において極めて安定なイムノグロブリン結合タンパク質改変体の作成に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の（１）ないし（９）のイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体における改変タンパク質を要旨とする。
（１）イムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるイムノグロブリン結合タンパク質であって、配列番号１で規定されるスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインの、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、および/または、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上している、ことを特徴とする改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（１）は、配列番号１または配列番号２で示されるイムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体において、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様、ならびに、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、および、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様を包含する。
【００１７】
（２）上記（Ａ）が、３９位以降におけるリジンへの置換、および／または、リジンを付加する改変、および／または、４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変による、（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（２）は、上記（１）の（Ａ）を包含する態様において、３９位以降におけるリジンへの置換、リジンの付加、４，７，３５位に元からあるリジンの他のアミノ酸への置換、３９位以降におけるリジンへの置換とリジンの付加、３９位以降におけるリジンへの置換と４，７，３５位に元からあるリジンの他のアミノ酸への置換、３９位以降におけるリジンへの置換とリジンの付加と４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換、リジンの付加と４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換の態様を包含する。
【００１８】
（３）３９位以降におけるリジンへの置換が、４０位、４３位、４６位、５３位、５４位および５６位のアミノ酸のうちの１個ないし６個がリジンに置換されていることである、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（４）４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変が、４位、７位および３５位のアミノ酸がアラニン、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、チロシン、またはアルギニンに置換されていることである、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（５）リジンを付加する改変が、Ｃ末端に、１個ないし５個のリジンを付加する改変である、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００１９】
（６）上記（Ｂ）が、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変、または、３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変による（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（６）は、上記（１）の（Ｂ）を包含する態様において、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変、３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変と３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変の態様を包含する。
【００２０】
（７）３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変が、３７位のアミノ酸がアラニン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、ロイシン、またはイソロイシンに置換されていることである、（６）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（８）３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変が、３８位のアミノ酸がアラニン、セリン、またはスレオニンに置換されていることである、（６）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００２１】
（９）配列番号３で規定されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００２２】
また、本発明は、以下の（１０）の多量体を要旨とする。
（１０）イムノグロブリン結合タンパク質の単位が２個ないし５個連結されており、その中に（１）ないし（９）のいずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体を含むことを特徴とする多量体。
【００２３】
また、本発明は、以下の（１１）の核酸を要旨とする。
（１１）（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体をコードする核酸。
なお、「それらを含む多量体」とは「改変タンパク質またはその等機能変異体を含む多量体」を意味する。
【００２４】
また、本発明は、以下の（１２）の遺伝子発現系を要旨とする。
（１２）（１１）に記載の核酸を含む遺伝子発現系。
【００２５】
また、本発明は、以下の（１３）のアフィニティクロマトグラフィ用担体を要旨とする。
（１３）親和性リガンドとして（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体を含んで成るアフィニティクロマトグラフィ用担体。
【００２６】
また、本発明は、以下の（１４）のアフィニティカラムを要旨とする。
（１４）（１３）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を含んで成るアフィニティカラム。
【００２７】
また、本発明は、以下の（１５）のアフィニティ分離方法を要旨とする。
（１５）（１４）に記載のアフィニティカラムを用いることを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭのアフィニティ分離方法。
【００２８】
さらにまた、本発明は、以下の（１６）のプロテインチップを要旨とする。
（１６）（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体を含んで成るプロテインチップ。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、イムノグロブリン結合能が高く、化学的に安定でリガンドタンパク質の漏出が少ないアフィニティクロマトグラフィ用担体を安価に提供できる。より詳細には、プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインにおいて、１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加する改変を加えることで、該タンパク質を３９位以降のアミノ基を選択的に介して不溶性担体に固定化することができるため、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとしての配向性が改変前の分子に比べて向上することによって、（a）担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量が多いアフィニティ担体を提供できる（実施例７に記載）。またこの様な改変により該タンパク質を複数のアミノ基を介して不溶性担体に固定化でき、加えてアスパラギン酸−プロリンの配列を排除することで、(b)酸性ｐＨ条件における化学的安定性（実施例３に記載）、(c)アルカリ性ｐＨ条件における化学的安定性（実施例８に記載）を兼ね備えたアフィニティ担体を得ることができる。また本発明の改変に伴いタンパク質表面の陽電荷が増加することで、陽イオン交換クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製が容易になり、(d)安価に製造可能なリガンドタンパク質を提供できる（実施例２に記載）。
さらに、該改変タンパク質をイムノグロブリンの親和性リガンドとして使用することで、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価なイムノグロブリンのアフィニティ精製が可能となり、本発明によりイムノグロブリンを含む製品を低コストで提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えばFrederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular Biologyなどに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用できる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞より大量かつ経済的に取得することができる。具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるので、例えば所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドベクターに挿入することで、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、該タンパク質を大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われている。また改変前のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列としては、プロテインＡのいずれのドメインのものを採用しても良いが、５つのドメインのうち３９位以降にリジン残基が多いＣドメインを用いるのが好ましく、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとしての使用実績の多いＺドメインの配列を用いてもよいが、化学的安定性が増すことが既に知られている２９位のグリシンのアラニンへの置換（非特許文献１参照）を施したＣドメインの配列（配列表の配列番号１に表示）を採用するのが最も好ましい。目的のアミノ酸置換を実現するためのＤＮＡ配列の変異は、改変前のクローンＤＮＡを鋳型として、ミスマッチ塩基対を組み込む合成オリゴＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクションのプライマーとして利用するオーバーラップ伸長法や、カセット変異法等を用いて意図した部位に容易に導入することができる。
さらに、プロテインＡ由来のイムノグロブリン結合タンパク質をイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドとして利用する際には、従来より２個以上、望ましくは４個程度のイムノグロブリン結合ドメインを連結した多量体タンパク質が製造され、使用されている。本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質についても、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、望ましくは４個程度を連結した多量体タンパク質として製造され、利用されることが好ましい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、一個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡを意図する数だけ直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミド上に挿入して利用することで、イムノグロブリン結合ドメインの単位が２個またはそれ以上連結された多量体タンパク質を容易に製造することが可能である。
【００３１】
本発明の改変タンパク質をコードする核酸配列が挿入される発現ベクターとしては、宿主細胞において複製可能であるプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターをも用いることができる。例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用するのがよい。例えば大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせまたはｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。
【００３２】
本発明の改変タンパク質は、培養された細胞を遠心分離等により集め、これを超音波やフレンチプレスなどを用いた処理にて破砕することで、可溶性画分中に回収することができる。該改変タンパク質の精製は、公知の分離、精製技術を適切に組み合わせて行なうことができる。具体的には、塩析法、透析法、限外濾過法等の分離技術に加え、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ等の精製方法が挙げられる。本発明の改変タンパク質は、表面の負電荷を減少させ正電荷を増加させる改変が施されており、大腸菌等の宿主細胞由来の多くの夾雑タンパク質に比べて等電点が高いという特徴を有するので、精製過程においてイオン交換クロマトグラフィの採用が特に望ましい。
【００３３】
本発明の改変タンパク質をイムノグロブリンの親和性リガンドとして結合させる不溶性担体としては、例えば、キトサン、デキストランなどの天然の高分子材料、ビニルポリマー、高度架橋アガロース、ポリイミドなどの合成ポリマー類などが挙げられる。また別の形態ではシリカなどの無機担体でもよい。通常、リガンドタンパク質は、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシル／トレシルクロリド、カルボジイミド、グルタールアルデヒド、ヒドラジンのようなカップリング剤やカルボキシルまたはチオール活性化担体等によって、担体上に固定される。このようなカップリング反応は、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている（例えば、Jansson, J.C.およびRyden, L.,「Protein purification」、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ ０−４７１−１８６２６−０）。本発明のリガンドタンパク質は、空間的にリガンドの配向性を制御できるように配置された複数のアミノ基を介して担体に結合させることを特徴とするものであり、該タンパク質の固定化にはトレシル基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基など、タンパク質のアミノ基と反応して共有結合を形成できる活性基を有する担体を用いることができる。市販の担体としては、トヨパールＡＦ−トレシル−６５０、トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０、トヨパールＡＦ−カルボキシ−６５０、トヨパールＡＦ−ホルミル−６５０（以上、東ソー株式会社）、ＮＨＳ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）などが挙げられる。
【００３４】
このようにして作成された本発明のアフィニティ担体は適切なカラムにつめてＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどイムノグロブリンを単離、精製する過程におけるアフィニティクロマトグラフィに利用できる。
【００３５】
また別の実施形態においては、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質はキャピラリー、チップあるいはフィルター等の基材に固定化された形でイムノグロブリンを結合させる目的にも用いることができる。この際の基材への固定化反応についてはアフィニティクロマトグラフィ用担体への固定化と同様にタンパク質のアミノ基と反応して共有結合を形成できる活性基との反応を採用することが望ましい。
【００３６】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
まずＨｉｓ−ｔａｇ付加タンパク質として発現された改変タンパク質について、陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動から精製操作の簡便性を評価するとともに、精製された改変タンパク質を用いて酸性ｐＨ条件での安定性を評価した。次にＨｉｓ−ｔａｇを付加しない改変タンパク質を作成し精製してクロマトグラフィ用担体に固定化し、得られたアフィニティクロマトグラフィ用ゲルを用いてイムノグロブリンの結合活性ならびにアルカリ性ｐＨ条件における安定性を評価した。
【実施例１】
【００３７】
［Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの構築］
まず、４本の合成オリゴヌクレオチドから得た２対の２本鎖ＤＮＡ断片をつなぎ合わせ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて図１に示す配列（配列表の配列番号４）のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９プラスミド（株式会社ニッポンジーン）上にクローン化し、ｐＵＣ／ＡＳＲ１を得た。
次にこのプラスミド上のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩの制限酵素切断部位間に６本の合成オリゴヌクレオチドから得た３対の２本鎖ＤＮＡ断片を、ＡｆｌＩＩ−ＮｈｅＩの制限酵素切断部位間に４本の合成オリゴヌクレオチドから得た２対の２本鎖ＤＮＡ断片を順に繋ぎ合わせてクローン化し、図２に示すイムノグロブリン結合タンパク質（Ｃドメインの２９位のグリシンがアラニンに置換されたタンパク質（配列表の配列番号１に相当；以後ＳＰＡＣ’という）のＤＮＡ配列（配列表の配列番号５および６）を含んだプラスミド、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’を得た。
次に、このプラスミドよりＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてタンパク質をコードしているｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＥＴ−９ａプラスミド（メルク株式会社）上に組み込んで、ＳＰＡＣ’の発現プラスミド、ｐＥＴ／ＳＰＡＣ’を得た（図３）。
次に１ヶ所のアミノ酸が置換された変異体をコードするプラスミドを構築するために、表１に示す合成オリゴヌクレオチドのペアをプライマーとして、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミドを鋳型としたＰＣＲを行い、それぞれ目的の変異を含んだｃＤＮＡフラグメントを調製した。ＰＣＲの酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用い、装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ株式会社）を用いた。
次いでこれらのフラグメントをそれぞれ表１に示した制限酵素を利用して、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミド上に組替え、Ｖ４０Ｋ、Ｅ４３Ｋ、Ａ４６Ｋ、Ｄ５３Ｋ、Ａ５４Ｋ、Ａ５６ＫおよびＣ末端にリジンが３個挿入された５９−６１Ｋ変異体のプラスミドを作成した。
こうして得た１ヶ所のアミノ酸置換の変異体プラスミドを鋳型としたＰＣＲによって、複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製し、これらフラグメントをそれぞれ表１に示した制限酵素を利用して、別の部位に変異を有するプラスミド上に組換え、２ヶ所以上のアミノ酸が置換されたプラスミドを構築した。
アミノ酸置換変位体プラスミド構築に利用したＰＣＲプライマーの組み合わせ、鋳型およびサブクローニングベクターとして用いたプラスミド、ならびにＤＮＡフラグメントの組換えに利用した制限酵素を表１に示す。各プライマーの配列番号は配列表の配列番号を表す。
各発現プラスミドにおける組み換えタンパク質をコードする部分の核酸配列はＣＥＱ８０００型ＤＮＡシーケンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて確認した。
【００３８】
【表１】
【実施例２】
【００３９】
［Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製過程の検討］
構築した各発現プラスミドにて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換し、それぞれ改変タンパク質を発現する菌株を得た。
各々の大腸菌株を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とするタンパク質を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を集めた。
次に集めた大腸菌を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、さらに遠心分離によって目的のタンパク質を上清に回収した。
この試料溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ＭＣ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、ＳＰ−５ＰＷカラム（７．５×７５ｍｍ；東ソー株式会社）にアプライし、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を移動相として１ｍＬ／分の流速で、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配にて目的タンパク質を溶出させた。
図４に、イムノグロブリン結合タンパク質のリジンを３個ないし５個増加させた改変タンパク質の陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動を示した。リジン残基が増加し陽電荷が増加することで、イムノグロブリン結合タンパク質の陽イオン交換カラムへの結合力が増大し、より高い塩濃度で溶出することが確認され、その結果、リジンの導入改変体が、大腸菌由来の夾雑タンパク質と容易に分離できることがわかった。
尚、本検討に用いたイムノグロブリン結合タンパク質にはＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されているが、Ｈｉｓ−ｔａｇを持たないＳＰＡＣ’は、Ｈｉｓ−ｔａｇが付加されているタンパク質よりもｐＫａが１程度低いことから、イムノグロブリン親和性リガンドとして使用されるＨｉｓ−ｔａｇを持たない改変タンパク質を精製する際には、本発明の改変による陽電荷が増加する効果は、より大きくなる。すなわち、図４は本発明のイムノグロブリン親和性リガンドが、従来品に比べてその製造工程を飛躍的に簡素化、低コスト化できるものであることを示している。
【実施例３】
【００４０】
［アスパラギン酸−プロリンの配列を排除した改変イムノグロブリン結合タンパク質の酸性ｐＨ条件での安定性の検討］
実施例２に従って精製したＳＰＡＣ’および３７位のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換した改変イムノグロブリン結合タンパク質を、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で水または５０％ぎ酸中、３７℃にて２４時間保温した。
処理後の溶液を０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルで５０倍希釈し、ＮＰ２０チップに希釈液１μＬをスポットし、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）にて解析した。
図５に示す様に、酸性ｐＨ条件において処理したＳＰＡＣ’の試料では、３７−３８位のアスパラギン酸−プロリン間での切断によって生じるペプチド断片が質量分析で検出されたが、３７位改変体を処理した改変体の試料からは切断された断片は全く検出されなかった。すなわち、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質は酸性ｐＨ条件において３７−３８位のアスパラギン酸−プロリン間での切断を受けやすく、この欠点は本発明の３７位のアミノ酸置換により解消されることが示された。
【実施例４】
【００４１】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの構築］
最初に作成したＨｉｓ−ｔａｇ付加改変イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを鋳型とし、Ｃ末端部分にＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たないプライマーを設計し、これを使用したＰＣＲによってＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たない目的のＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した後、ｐＥＴ−９ａプラスミドに組み込んでＨｉｓ−ｔａｇの無い改変イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを作成した。
次にＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たない改変体発現プラスミドを鋳型とし、表２に示すプライマーを用いてオーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にて４位、７位および３５位のアミノ酸置換をもたらす変異を導入し、同様にｐＥＴ−９ａプラスミドに組み込んで目的の発現プラスミドを作成した。さらに得られた変異体プラスミドを鋳型とし、別の位置に変異をもたらすプライマーを用いたＰＣＲによって、複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製した。また３５位以前の部分と以降の部分に変異を導入したｃＤＮＡ断片を組み合わせたオーバーラップ伸張法にて、２ヶ所ないし１０ヶ所のアミノ酸が置換された改変体発現プラスミドを構築した。
各プライマーの配列番号は配列表の配列番号を表す。
【００４２】
【表２】
【実施例５】
【００４３】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製］
構築したＨｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの核酸配列が目的通りであることを確認した後、各プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換し、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質を発現させたときと同様の培養を行って目的のタンパク質を発現した大腸菌を得た。
得られた大腸菌を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕した後、遠心分離によって目的のタンパク質を上清に回収した。
この試料溶液に０．２Ｍ 酢酸を添加して溶液のｐＨを改変タンパク質の理論的等電点よりも０．６程度低く調整した後、再度遠心分離を行って目的のタンパク質を上清に回収し、この溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ＭＣ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、トヨパールゲルＳＰ−５５０Ｃ充填カラム（５ｍＬ；東ソー株式会社）にアプライし、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）または５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を移動相として、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配にて目的タンパク質を溶出させて精製した。
精製タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認し、タンパク質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ピアスバイオテクノロジー株式会社）を用いて決定した。
本操作により、いずれの改変イムノグロブリン結合タンパク質も培養液１ｌあたり約２００ｍｇの精製品を得ることができた。
【実施例６】
【００４４】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しない改変イムノグロブリン結合タンパク質のクロマトグラフィ用担体への固定化］
精製された本発明のイムノグロブリン親和性リガンド溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ゲル（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いてゲル濾過することで、緩衝液をリガンド固定化反応に用いる緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．３））に置換した。
リガンド固定化反応は、洗浄後のＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４−ＦＦゲル（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に対して、２ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したリガンド溶液をゲルと等容量加え、２５℃にて４時間振とうして行った。
固定化反応終了後、反応液の上清を回収し、これをＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー株式会社）にアプライし、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を移動相としたゲル濾過クロマトグラフィにおいて２８０ｎｍの吸光度にて未反応のリガンドタンパク質を検出して未反応のリガンド量を測定し、ゲルに固定化されたリガンド量を決定した。
その結果、本発明のイムノグロブリン親和性リガンド全てについて、本条件下で固定化反応に使用した量の９９％以上がゲルに固定化されたことを確認することができた。
リガンド固定化反応後のゲルは、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ エタノールアミン溶液（ｐＨ ８．３）中で２５℃にて１時間振とうすることで、未反応のＮＨＳ活性化基をブロッキングし、次いで０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ４．０）と０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ エタノールアミン溶液（ｐＨ ８．３）とで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝生理食塩水（以後ＰＢＳという）にて３回洗浄した後にイムノグロブリン結合量の測定に使用した。
【実施例７】
【００４５】
［改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルのイムノグロブリン結合量の測定］
リガンドを固定化したゲルに対し、等容量の４０ｍｇ／ｍＬヒトイムノグロブリン（シグマ社）のＰＢＳ溶液を加え、２５℃にて１時間振とうしてイムノグロブリンをゲルに吸着させた。次にゲルをＰＢＳにて３回洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ ２．８）中で２５℃にて１０分間振とうしてイムノグロブリンをゲルから溶出させた。
溶出液に１／２０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１３．８（１ｇ−１ｃｍ−１）の比吸光係数をもとにアフィニティゲルに吸着したイムノグロブリン量を求めた。
ゲル１ｍｌあたりのイムノグロブリン吸着量（ｍｇ）を固定化されたリガンド量（ｍｇ）で除した値（ＩｇＧ／リガンド比）を指標として、本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質を親和性リガンドとして用いたときのイムノグロブリン結合活性を評価した結果を図６に示した。
イムノグロブリン結合活性において現時点で本発明の最良の実施形態は、スタフィロコッカスプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの４位、７位および３５位のリジンをリジン以外のアミノ酸に置換し、さらにヘリックス３のタンパク質表面である４０位、４３位、４６位、５３位および５６位のアミノ酸のうち３個ないし５個をリジンに置換する改変、およびこれに加えてＣ末端部にリジンを３個付加する改変を施した改変タンパク質であり、これらの改変体を親和性リガンドとして用いたアフィニティゲルは、改変前のＳＰＡＣ’ドメインを用いたものに比べて最大３．５倍のイムノグロブリン結合活性を示した。
本発明に包含されるアミノ酸配列の改変のうち、３５位のリジンをリジン以外のアミノ酸に置換する改変は、得られたタンパク質を親和性リガンドとして固定化したゲルへのイムノグロブリン吸着量を増加させる効果が極めて高く、なかでもアルギニンまたはグルタミンへの置換が最も効果的であった。この結果は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが３５位の近辺でゲルに固定化されると、その分子はイムノグロブリンを結合する活性が著しく低下することを示している。なお、スタフィロコッカス由来の別のたんぱく質であってプロテインＡとは異なるイムノグロブリン結合タンパク質（特許文献１に記載）には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとアミノ酸配列において４５％程度の相同性をもつ領域が含まれており、この配列の３５位に相当する位置にはアルギニンが存在している。しかしながら、この類似ドメインにおけるイムノグロブリン結合領域と推測される１−３８位には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとは全く異なる３カ所、特に３２位にもリジンが存在することに加え、３９位以降に存在するリジンの数がプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに比べて少く、１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合がプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのそれよりもさらに低いため、リジン残基を介して担体に固定化する場合に良好な配向性を保持することは極めて困難であることが容易に推察される。すなわち、本発明の改変タンパク質が特許文献１に記載のタンパク質に比べて、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとして著しく有用な構造的および機能的特徴を有していることは明らかである。
【実施例８】
【００４６】
［改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルのアルカリ性ｐＨ条件での安定性の検討］
改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルを０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で２５℃にて一定時間保温し、ＰＢＳで３回洗浄後、実施例７の方法に従いイムノグロブリン結合量を測定した。
アルカリ性ｐＨ条件で処理した後のイムノグロブリン結合量を各処理時間ごとに測定し、アルカリ性ｐＨ条件で処理する前のイムノグロブリン結合量を１００％としたときの残存率を図７に示した。
この結果は、スタフィロコッカスプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、へリックス３のタンパク質表面におけるリジン残基を増加させた本発明のイムノグロブリン親和性リガンドはアフィニティゲルに固定化された形で、アルカリ性ｐＨ条件下での処理に対して改変前のリガンドより安定であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィ用担体は、安価で、イムノグロブリンを結合する能力が高く、リガンドタンパク質の漏出が少ない。すなわち、本発明は、安価で高品質なイムノグロブリンの製造過程、診断に使用される抗体固定化チップやマイクロプレートならびに安全性の高いイムノグロブリン除去用血液浄化システム等の構築に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ｐＵＣＡＳＲ１プラスミドの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの核酸配列を示す図面である。
【図２】ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミド上に構築されたイムノグロブリン結合タンパク質をコードする核酸およびアミノ酸配列を示す図面である。
【図３】イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを構築する手順を表した図面である。
【図４】イムノグロブリン結合タンパク質改変体の陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動を示した図面である。
【図５】イムノグロブリン結合タンパク質を酸性ｐＨ条件で処理したときの被切断特性を比較した図面である。
【図６】クロマトグラフィ用担体に親和性リガンドとして固定化したときのイムノグロブリン結合タンパク質のＩｇＧ結合能を比較した図面である。
【図７】イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルをアルカリ性ｐＨ条件で処理したときの残存活性を比較した図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリンに親和性のあるタンパク質に関するものであり、より詳しくは、アフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとしての性質が改良されたイムノグロブリン結合タンパク質の改変タンパク質に関する。また、本発明は該改変タンパク質のイムノグロブリン親和性リガンドとしての使用、ならびに、アフィニティ分離マトリックスへの使用に関する。
【０００２】
［定義］
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、天然型タンパク質の部分的断片や天然型の配列を人為的に改変した変異体を含む。「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を指し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有するタンパク質であって、イムノグロブリンと非共有結合する「イムノグロブリン結合ドメイン」を含んで成るタンパク質をいう。
【０００３】
イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつイムノグロブリン結合活性を含む機能的特性において、改変前のタンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【０００４】
「親和性リガンド」とは、特異的親和力により特定の分子と結合する性質をもつ分子のことをいい、本発明においては、イムノグロブリンを選択的に結合できるイムノグロブリン結合タンパク質を指す。なお、単に「リガンド」と呼ぶこともある。「アフィニティクロマトグラフィ用担体」とは、不溶性担体に親和性リガンドを固定化させた担体をいう。固定化とは、不溶性担体に親和性リガンドを共有結合させることをいい、これによって不溶性担体が標的分子（イムノグロブリン）の親和性吸着体となる。
またリガンドを不溶性担体に固定化する際の「イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が向上する」とは、不溶性担体への固定化反応において、リガンド分子がイムノグロブリンと結合できる方向に固定化される割合が増大することをいい、結果として固定化されたリガンドの単位分子数あたりに結合できるイムノグロブリン量が増加することを指す。
【背景技術】
【０００５】
近年バイオ関連分野における研究や製薬産業において、純度の高いタンパク質試薬やタンパク質医薬の需要は高い。高純度のタンパク質の製造方法としては、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等の様々な原理による精製過程が採用されるが、なかでもアフィニティクロマトグラフィは目的タンパク質と夾雑物を分離しつつ、目的タンパク質を濃縮する効率が極めて高い優れた方法である。アフィニティクロマトグラフィにおいては、目的のタンパク質と特異的な親和性を示す分子をリガンドとして結合させた不溶性担体に目的タンパク質を吸着させることで夾雑物と分離するが、しばしばそのリガンド分子としてタンパク質が用いられる。
【０００６】
プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であり、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインと呼ばれる相同性を有する５つのイムノグロブリン結合ドメインの繰り返し構造を有する。イムノグロブリン結合ドメインは、１個だけでイムノグロブリンに結合することが知られており（非特許文献１）、天然型のプロテインＡとならんで、アミノ酸配列が部分的に改変されたイムノグロブリン結合ドメインのみから成る組換えタンパク質もアフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとして広く利用されている。またスタフィロコッカスはプロテインＡ以外にもイムノグロブリンに結合する性質を持ったタンパク質を発現していることが知られており（特許文献１）、このタンパク質の部分構造にはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとアミノ酸配列において４５％程度の相同性をもつ領域が含まれている。しかしこのイムノグロブリン結合ドメインについて、酸性およびアルカリ性ｐＨ条件における化学的安定性等、親和性リガンドとしての有用性は不明である。
【０００７】
プロテインＡについては、ＩｇＧとの結合の特異性および結合容量、並びに天然プロテインＡを基本にした他の吸着剤と少なくとも同程度またはそれ以上の化学的安定性を有する吸着媒体を提供することを目的として、１個のシステイン残基を導入したプロテインＡ(rProtein A cys)をリガンドとして用い、これをチオエステル結合を介してアフィニティ担体に１点で固定化する技術（特許文献２）が提案されている。また、上記Protein A cysを固定化したアフィニティクロマトグラフィ担体などに代表される抗体精製用アフィニティ担体の問題点である固定化部位の化学的安定性とそれに由来する殺菌・洗浄工程における問題を解決しつつ、より高い抗体分子の吸着量を達成することを目的として、１級アミノ基を有するポリマー化合物を導入した担体にＣ末端カルボキシル基選択的にアミド結合を介して固定化する技術（特許文献３）が提案されている。
さらに、特許文献４では、例えばスタフィロコッカスのプロテインＡのＢドメインのように、免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるタンパク質から誘導できる免疫グロブリン結合タンパク質であって、１以上のアスパラギン残基がグルタミンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異し、該変異によって約１３〜１４以下のｐＨ域での化学的安定性が親分子に比べて向上した免疫グロブリン結合タンパク質、該タンパク質をリガンドとして固体担体に結合したアフィニティ分離用マトリックスが提案されており、そこに示されたアルカリ耐性付与に寄与する最良の実施形態は、２３位のアスパラギンのスレオニンへの置換および該置換と４３位のアスパラギンのグルタミン酸への置換との組み合わせである。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第ＵＳ６５４８６３９Ｂ１
【特許文献２】米国特許第ＵＳ６３９９７５０Ｂ１（特表２０００−５００６４９参照）
【特許文献３】特開２００５−１１２８２７
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０３／０８０６５５（特表２００５−５３８６９３参照）
【非特許文献１】ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
高流速やゲルの自重に耐え得る硬度といった一般的なクロマトグラフィ用担体に求められる特性に加え、抗体医薬原料としてのイムノグロブリンの製造過程に使用されるアフィニティクロマトグラフィ用担体に求められる望ましい性質として、（a）担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量が多いこと、(b)酸性ｐＨ条件でのイムノグロブリンの溶出過程におけるリガンドの漏出が少ないこと、(c)アルカリ性ｐＨ条件でのライン洗浄過程におけるイムノグロブリン結合活性の低下が小さいこと、(d)安価に製造できること、が挙げられ、特に（a）の性質はイムノグロブリンの精製コストを軽減するために重要である。これらの課題を解決するためには、適切な不溶性担体の素材やリガンドタンパク質の製造方法を選択することはもちろん重要であるが、それに加えてリガンドとして用いるイムノグロブリン結合タンパク質を改良することが極めて重要である。
【００１０】
上記（a）〜(d)の性質を向上させるための様々な検討がなされているが、これまでにリガンドタンパク質そのものの改変によるものの例としては（a）と(c)の改良が挙げられる。（a）の性質に優れた担体を作成する目的で開発されている技術（特許文献２、３）の共通点はリガンドタンパク質のＣ末端またはその付近１点で担体に固定化する点であり、ともに酸性ｐＨ条件におけるイムノグロブリンの溶出過程で切断を受けたリガンドタンパク質またはその断片が漏出しやすいという問題が残されている。また、 (b)の性質に優れた担体を作成するためには、（a）とは逆にリガンドタンパク質を多点で担体に固定する方法が有効であることが知られており、プロテインＡ分子中に存在する複数の１級アミノ基を介して担体に固定することが一般に行われている。しかし、この方法で固定するとリガンドタンパク質の配向性を制御できず、固定化されたリガンドタンパク質のなかにはイムノグロブリンと結合できない分子も含まれるため、担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量は低下する。すなわち、既存の技術においては、（a）と(b)は互いに相反する因子であり、同時にその両方を解決するための新しい技術開発が望まれている。さらに、(c)の性質に優れた担体を作成するための開示されている技術（特許文献４）において示されているものは、その化学的安定性はなお充分なものではない。また、現在市販されているイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用担体には、主として遺伝子組換え技術により製造されたプロテインＡタンパク質が用いられているが、その製造方法についてもなお改善が望まれる。
【００１１】
そこで、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質におけるアフィニティクロマトグラフィ用の親和性リガンドとしての性質が改良された、すなわち、互いに相反する（a）と(b)の性質に加え、 (c)の性質にも優れた改変タンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は該改変タンパク質のイムノグロブリン親和性リガンドとしての使用、ならびに、アフィニティ分離マトリックスへの使用、すなわち、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価に製造可能なイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
リガンドタンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定化する際に、配向性を制御しやすい一点での架橋方法を採用すると、架橋部分やペプチド鎖の切断により、リガンドタンパク質やペプチド断片が漏出し易い。一方、通常利用されるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインタンパク質をそのままリガンドとして用い、これを多点で担体に固定すると、リガンドタンパク質の漏出は起こりにくくなるが、リガンドの配向性を制御できないため単位担体量あたりのイムノグロブリン結合量が低いものとなる。本発明者らは、多点で担体に固定しても架橋の配向性を制御できる様にリガンドタンパク質を改変することで、上述の相反する要因の両立を図った。
【００１３】
スタフィロコッカスに由来するプロテインＡタンパク質１分子中には、先述の通りイムノグロブリン結合ドメインが５個存在するが、該イムノグロブリン結合ドメインは、いずれも３個のα−へリックス構造とそれらを互いに連結している２個のループ構造から構成される。イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与すると考えられている１０個のアミノ酸はいずれもＮ末端側から１番目のヘリックス（へリックス１）と２番目のヘリックス（へリックス２）上に存在している（Tashiro M.他 １９９７年 High-resolution solution NMR structure of the Z domain of staphyrococcal protein A 、Jounal of Molecular Biology 第２７２巻４号、５７３−５９０頁）。さらに該イムノグロブリン結合ドメインは、へリックス３が欠落していてもイムノグロブリンと結合できる（Melissa A.他 １９９７年、Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Proceeding Natural Academy of Sciences USA、第９４巻、１００８０−１００８５頁）。
【００１４】
タンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定する際に汎用される反応において、担体との結合反応に利用できるタンパク質側の主な活性基はシステインのチオール基、Ｎ末端アミノ酸およびリジンのアミノ基、ならびにＣ末端アミノ酸およびグルタミン酸、アスパラギン酸のカルボキシル基等である。本発明者らは、配向性を制御しつつ多点で担体に結合させるのに有利なアミノ酸残基としてリジン残基に着目し、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの三次元構造データに基づいて分子内のリジンの配置を設計した。具体的にはイムノグロブリン結合領域であるヘリックス１およびへリックス２のタンパク質表面に存在するリジン残基数を可能な限り減少させるとともに、へリックス３およびその周辺のタンパク質表面に可能な限りリジン残基数を増加させるアミノ酸置換についての検討を行なった。また本発明者らは、酸性ｐＨ条件でのイムノグロブリンの溶出過程におけるリガンドタンパク質の漏出を防ぐ目的で、酸性ｐＨ条件での切断を受けやすいと考えられるアスパラギン酸−プロリンの配列を排除する置換についての検討を行なった。
【００１５】
本発明者らは、作成した改変タンパク質について、陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動、酸性ｐＨ条件における被切断特性、クロマトグラフィ用担体に固定化したときのイムノグロブリン結合活性ならびにアルカリ性ｐＨ条件における安定性を評価し、多面的に優れたリガンドタンパク質の探索を重ねた結果、リガンドタンパク質そのものを簡便に精製できるうえに、多点で担体に固定しても高いイムノグロブリン結合活性を示し、酸性ｐＨおよびアルカリ性ｐＨ条件において極めて安定なイムノグロブリン結合タンパク質改変体の作成に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の（１）ないし（９）のイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体における改変タンパク質を要旨とする。
（１）イムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるイムノグロブリン結合タンパク質であって、配列番号１で規定されるスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインの、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、および/または、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上している、ことを特徴とする改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（１）は、配列番号１または配列番号２で示されるイムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体において、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様、ならびに、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、および、（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上していることを特徴とする改変タンパク質の態様を包含する。
【００１７】
（２）上記（Ａ）が、３９位以降におけるリジンへの置換、および／または、リジンを付加する改変、および／または、４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変による、（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（２）は、上記（１）の（Ａ）を包含する態様において、３９位以降におけるリジンへの置換、リジンの付加、４，７，３５位に元からあるリジンの他のアミノ酸への置換、３９位以降におけるリジンへの置換とリジンの付加、３９位以降におけるリジンへの置換と４，７，３５位に元からあるリジンの他のアミノ酸への置換、３９位以降におけるリジンへの置換とリジンの付加と４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換、リジンの付加と４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換の態様を包含する。
【００１８】
（３）３９位以降におけるリジンへの置換が、４０位、４３位、４６位、５３位、５４位および５６位のアミノ酸のうちの１個ないし６個がリジンに置換されていることである、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（４）４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変が、４位、７位および３５位のアミノ酸がアラニン、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、チロシン、またはアルギニンに置換されていることである、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（５）リジンを付加する改変が、Ｃ末端に、１個ないし５個のリジンを付加する改変である、（２）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００１９】
（６）上記（Ｂ）が、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変、または、３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変による（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
上記（６）は、上記（１）の（Ｂ）を包含する態様において、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変、３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変、３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変と３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変の態様を包含する。
【００２０】
（７）３７位のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する改変が、３７位のアミノ酸がアラニン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、ロイシン、またはイソロイシンに置換されていることである、（６）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
（８）３８位のプロリンをプロリン以外のアミノ酸に置換する改変が、３８位のアミノ酸がアラニン、セリン、またはスレオニンに置換されていることである、（６）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００２１】
（９）配列番号３で規定されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする（１）に記載の改変タンパク質またはその等機能変異体。
【００２２】
また、本発明は、以下の（１０）の多量体を要旨とする。
（１０）イムノグロブリン結合タンパク質の単位が２個ないし５個連結されており、その中に（１）ないし（９）のいずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体を含むことを特徴とする多量体。
【００２３】
また、本発明は、以下の（１１）の核酸を要旨とする。
（１１）（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体をコードする核酸。
なお、「それらを含む多量体」とは「改変タンパク質またはその等機能変異体を含む多量体」を意味する。
【００２４】
また、本発明は、以下の（１２）の遺伝子発現系を要旨とする。
（１２）（１１）に記載の核酸を含む遺伝子発現系。
【００２５】
また、本発明は、以下の（１３）のアフィニティクロマトグラフィ用担体を要旨とする。
（１３）親和性リガンドとして（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体を含んで成るアフィニティクロマトグラフィ用担体。
【００２６】
また、本発明は、以下の（１４）のアフィニティカラムを要旨とする。
（１４）（１３）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を含んで成るアフィニティカラム。
【００２７】
また、本発明は、以下の（１５）のアフィニティ分離方法を要旨とする。
（１５）（１４）に記載のアフィニティカラムを用いることを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭのアフィニティ分離方法。
【００２８】
さらにまた、本発明は、以下の（１６）のプロテインチップを要旨とする。
（１６）（１）ないし（１０）いずれかに記載の改変タンパク質またはその等機能変異体、またはそれらを含む多量体を含んで成るプロテインチップ。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、イムノグロブリン結合能が高く、化学的に安定でリガンドタンパク質の漏出が少ないアフィニティクロマトグラフィ用担体を安価に提供できる。より詳細には、プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインにおいて、１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加する改変を加えることで、該タンパク質を３９位以降のアミノ基を選択的に介して不溶性担体に固定化することができるため、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとしての配向性が改変前の分子に比べて向上することによって、（a）担体の単位重量もしくは単位体積あたりのイムノグロブリン結合量が多いアフィニティ担体を提供できる（実施例７に記載）。またこの様な改変により該タンパク質を複数のアミノ基を介して不溶性担体に固定化でき、加えてアスパラギン酸−プロリンの配列を排除することで、(b)酸性ｐＨ条件における化学的安定性（実施例３に記載）、(c)アルカリ性ｐＨ条件における化学的安定性（実施例８に記載）を兼ね備えたアフィニティ担体を得ることができる。また本発明の改変に伴いタンパク質表面の陽電荷が増加することで、陽イオン交換クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製が容易になり、(d)安価に製造可能なリガンドタンパク質を提供できる（実施例２に記載）。
さらに、該改変タンパク質をイムノグロブリンの親和性リガンドとして使用することで、高いイムノグロブリン結合能と化学的安定性を兼ね備え、かつ安価なイムノグロブリンのアフィニティ精製が可能となり、本発明によりイムノグロブリンを含む製品を低コストで提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えばFrederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular Biologyなどに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用できる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞より大量かつ経済的に取得することができる。具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるので、例えば所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドベクターに挿入することで、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、該タンパク質を大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われている。また改変前のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列としては、プロテインＡのいずれのドメインのものを採用しても良いが、５つのドメインのうち３９位以降にリジン残基が多いＣドメインを用いるのが好ましく、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとしての使用実績の多いＺドメインの配列を用いてもよいが、化学的安定性が増すことが既に知られている２９位のグリシンのアラニンへの置換（非特許文献１参照）を施したＣドメインの配列（配列表の配列番号１に表示）を採用するのが最も好ましい。目的のアミノ酸置換を実現するためのＤＮＡ配列の変異は、改変前のクローンＤＮＡを鋳型として、ミスマッチ塩基対を組み込む合成オリゴＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクションのプライマーとして利用するオーバーラップ伸長法や、カセット変異法等を用いて意図した部位に容易に導入することができる。
さらに、プロテインＡ由来のイムノグロブリン結合タンパク質をイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドとして利用する際には、従来より２個以上、望ましくは４個程度のイムノグロブリン結合ドメインを連結した多量体タンパク質が製造され、使用されている。本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質についても、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、望ましくは４個程度を連結した多量体タンパク質として製造され、利用されることが好ましい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、一個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡを意図する数だけ直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミド上に挿入して利用することで、イムノグロブリン結合ドメインの単位が２個またはそれ以上連結された多量体タンパク質を容易に製造することが可能である。
【００３１】
本発明の改変タンパク質をコードする核酸配列が挿入される発現ベクターとしては、宿主細胞において複製可能であるプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターをも用いることができる。例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用するのがよい。例えば大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせまたはｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。
【００３２】
本発明の改変タンパク質は、培養された細胞を遠心分離等により集め、これを超音波やフレンチプレスなどを用いた処理にて破砕することで、可溶性画分中に回収することができる。該改変タンパク質の精製は、公知の分離、精製技術を適切に組み合わせて行なうことができる。具体的には、塩析法、透析法、限外濾過法等の分離技術に加え、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ等の精製方法が挙げられる。本発明の改変タンパク質は、表面の負電荷を減少させ正電荷を増加させる改変が施されており、大腸菌等の宿主細胞由来の多くの夾雑タンパク質に比べて等電点が高いという特徴を有するので、精製過程においてイオン交換クロマトグラフィの採用が特に望ましい。
【００３３】
本発明の改変タンパク質をイムノグロブリンの親和性リガンドとして結合させる不溶性担体としては、例えば、キトサン、デキストランなどの天然の高分子材料、ビニルポリマー、高度架橋アガロース、ポリイミドなどの合成ポリマー類などが挙げられる。また別の形態ではシリカなどの無機担体でもよい。通常、リガンドタンパク質は、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシル／トレシルクロリド、カルボジイミド、グルタールアルデヒド、ヒドラジンのようなカップリング剤やカルボキシルまたはチオール活性化担体等によって、担体上に固定される。このようなカップリング反応は、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている（例えば、Jansson, J.C.およびRyden, L.,「Protein purification」、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ ０−４７１−１８６２６−０）。本発明のリガンドタンパク質は、空間的にリガンドの配向性を制御できるように配置された複数のアミノ基を介して担体に結合させることを特徴とするものであり、該タンパク質の固定化にはトレシル基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基など、タンパク質のアミノ基と反応して共有結合を形成できる活性基を有する担体を用いることができる。市販の担体としては、トヨパールＡＦ−トレシル−６５０、トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０、トヨパールＡＦ−カルボキシ−６５０、トヨパールＡＦ−ホルミル−６５０（以上、東ソー株式会社）、ＮＨＳ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）などが挙げられる。
【００３４】
このようにして作成された本発明のアフィニティ担体は適切なカラムにつめてＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどイムノグロブリンを単離、精製する過程におけるアフィニティクロマトグラフィに利用できる。
【００３５】
また別の実施形態においては、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質はキャピラリー、チップあるいはフィルター等の基材に固定化された形でイムノグロブリンを結合させる目的にも用いることができる。この際の基材への固定化反応についてはアフィニティクロマトグラフィ用担体への固定化と同様にタンパク質のアミノ基と反応して共有結合を形成できる活性基との反応を採用することが望ましい。
【００３６】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
まずＨｉｓ−ｔａｇ付加タンパク質として発現された改変タンパク質について、陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動から精製操作の簡便性を評価するとともに、精製された改変タンパク質を用いて酸性ｐＨ条件での安定性を評価した。次にＨｉｓ−ｔａｇを付加しない改変タンパク質を作成し精製してクロマトグラフィ用担体に固定化し、得られたアフィニティクロマトグラフィ用ゲルを用いてイムノグロブリンの結合活性ならびにアルカリ性ｐＨ条件における安定性を評価した。
【実施例１】
【００３７】
［Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの構築］
まず、４本の合成オリゴヌクレオチドから得た２対の２本鎖ＤＮＡ断片をつなぎ合わせ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて図１に示す配列（配列表の配列番号４）のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９プラスミド（株式会社ニッポンジーン）上にクローン化し、ｐＵＣ／ＡＳＲ１を得た。
次にこのプラスミド上のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩの制限酵素切断部位間に６本の合成オリゴヌクレオチドから得た３対の２本鎖ＤＮＡ断片を、ＡｆｌＩＩ−ＮｈｅＩの制限酵素切断部位間に４本の合成オリゴヌクレオチドから得た２対の２本鎖ＤＮＡ断片を順に繋ぎ合わせてクローン化し、図２に示すイムノグロブリン結合タンパク質（Ｃドメインの２９位のグリシンがアラニンに置換されたタンパク質（配列表の配列番号１に相当；以後ＳＰＡＣ’という）のＤＮＡ配列（配列表の配列番号５および６）を含んだプラスミド、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’を得た。
次に、このプラスミドよりＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてタンパク質をコードしているｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＥＴ−９ａプラスミド（メルク株式会社）上に組み込んで、ＳＰＡＣ’の発現プラスミド、ｐＥＴ／ＳＰＡＣ’を得た（図３）。
次に１ヶ所のアミノ酸が置換された変異体をコードするプラスミドを構築するために、表１に示す合成オリゴヌクレオチドのペアをプライマーとして、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミドを鋳型としたＰＣＲを行い、それぞれ目的の変異を含んだｃＤＮＡフラグメントを調製した。ＰＣＲの酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用い、装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ株式会社）を用いた。
次いでこれらのフラグメントをそれぞれ表１に示した制限酵素を利用して、ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミド上に組替え、Ｖ４０Ｋ、Ｅ４３Ｋ、Ａ４６Ｋ、Ｄ５３Ｋ、Ａ５４Ｋ、Ａ５６ＫおよびＣ末端にリジンが３個挿入された５９−６１Ｋ変異体のプラスミドを作成した。
こうして得た１ヶ所のアミノ酸置換の変異体プラスミドを鋳型としたＰＣＲによって、複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製し、これらフラグメントをそれぞれ表１に示した制限酵素を利用して、別の部位に変異を有するプラスミド上に組換え、２ヶ所以上のアミノ酸が置換されたプラスミドを構築した。
アミノ酸置換変位体プラスミド構築に利用したＰＣＲプライマーの組み合わせ、鋳型およびサブクローニングベクターとして用いたプラスミド、ならびにＤＮＡフラグメントの組換えに利用した制限酵素を表１に示す。各プライマーの配列番号は配列表の配列番号を表す。
各発現プラスミドにおける組み換えタンパク質をコードする部分の核酸配列はＣＥＱ８０００型ＤＮＡシーケンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて確認した。
【００３８】
【表１】
【実施例２】
【００３９】
［Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製過程の検討］
構築した各発現プラスミドにて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換し、それぞれ改変タンパク質を発現する菌株を得た。
各々の大腸菌株を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とするタンパク質を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を集めた。
次に集めた大腸菌を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、さらに遠心分離によって目的のタンパク質を上清に回収した。
この試料溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ＭＣ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、ＳＰ−５ＰＷカラム（７．５×７５ｍｍ；東ソー株式会社）にアプライし、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を移動相として１ｍＬ／分の流速で、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配にて目的タンパク質を溶出させた。
図４に、イムノグロブリン結合タンパク質のリジンを３個ないし５個増加させた改変タンパク質の陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動を示した。リジン残基が増加し陽電荷が増加することで、イムノグロブリン結合タンパク質の陽イオン交換カラムへの結合力が増大し、より高い塩濃度で溶出することが確認され、その結果、リジンの導入改変体が、大腸菌由来の夾雑タンパク質と容易に分離できることがわかった。
尚、本検討に用いたイムノグロブリン結合タンパク質にはＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されているが、Ｈｉｓ−ｔａｇを持たないＳＰＡＣ’は、Ｈｉｓ−ｔａｇが付加されているタンパク質よりもｐＫａが１程度低いことから、イムノグロブリン親和性リガンドとして使用されるＨｉｓ−ｔａｇを持たない改変タンパク質を精製する際には、本発明の改変による陽電荷が増加する効果は、より大きくなる。すなわち、図４は本発明のイムノグロブリン親和性リガンドが、従来品に比べてその製造工程を飛躍的に簡素化、低コスト化できるものであることを示している。
【実施例３】
【００４０】
［アスパラギン酸−プロリンの配列を排除した改変イムノグロブリン結合タンパク質の酸性ｐＨ条件での安定性の検討］
実施例２に従って精製したＳＰＡＣ’および３７位のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換した改変イムノグロブリン結合タンパク質を、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で水または５０％ぎ酸中、３７℃にて２４時間保温した。
処理後の溶液を０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルで５０倍希釈し、ＮＰ２０チップに希釈液１μＬをスポットし、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）にて解析した。
図５に示す様に、酸性ｐＨ条件において処理したＳＰＡＣ’の試料では、３７−３８位のアスパラギン酸−プロリン間での切断によって生じるペプチド断片が質量分析で検出されたが、３７位改変体を処理した改変体の試料からは切断された断片は全く検出されなかった。すなわち、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質は酸性ｐＨ条件において３７−３８位のアスパラギン酸−プロリン間での切断を受けやすく、この欠点は本発明の３７位のアミノ酸置換により解消されることが示された。
【実施例４】
【００４１】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの構築］
最初に作成したＨｉｓ−ｔａｇ付加改変イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを鋳型とし、Ｃ末端部分にＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たないプライマーを設計し、これを使用したＰＣＲによってＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たない目的のＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した後、ｐＥＴ−９ａプラスミドに組み込んでＨｉｓ−ｔａｇの無い改変イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを作成した。
次にＨｉｓ−ｔａｇをコードする配列を持たない改変体発現プラスミドを鋳型とし、表２に示すプライマーを用いてオーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にて４位、７位および３５位のアミノ酸置換をもたらす変異を導入し、同様にｐＥＴ−９ａプラスミドに組み込んで目的の発現プラスミドを作成した。さらに得られた変異体プラスミドを鋳型とし、別の位置に変異をもたらすプライマーを用いたＰＣＲによって、複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製した。また３５位以前の部分と以降の部分に変異を導入したｃＤＮＡ断片を組み合わせたオーバーラップ伸張法にて、２ヶ所ないし１０ヶ所のアミノ酸が置換された改変体発現プラスミドを構築した。
各プライマーの配列番号は配列表の配列番号を表す。
【００４２】
【表２】
【実施例５】
【００４３】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製］
構築したＨｉｓ−ｔａｇを付加しないイムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドの核酸配列が目的通りであることを確認した後、各プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換し、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加イムノグロブリン結合タンパク質を発現させたときと同様の培養を行って目的のタンパク質を発現した大腸菌を得た。
得られた大腸菌を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕した後、遠心分離によって目的のタンパク質を上清に回収した。
この試料溶液に０．２Ｍ 酢酸を添加して溶液のｐＨを改変タンパク質の理論的等電点よりも０．６程度低く調整した後、再度遠心分離を行って目的のタンパク質を上清に回収し、この溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ＭＣ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、トヨパールゲルＳＰ−５５０Ｃ充填カラム（５ｍＬ；東ソー株式会社）にアプライし、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）または５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を移動相として、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配にて目的タンパク質を溶出させて精製した。
精製タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認し、タンパク質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ピアスバイオテクノロジー株式会社）を用いて決定した。
本操作により、いずれの改変イムノグロブリン結合タンパク質も培養液１ｌあたり約２００ｍｇの精製品を得ることができた。
【実施例６】
【００４４】
［Ｈｉｓ−ｔａｇを付加しない改変イムノグロブリン結合タンパク質のクロマトグラフィ用担体への固定化］
精製された本発明のイムノグロブリン親和性リガンド溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ゲル（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いてゲル濾過することで、緩衝液をリガンド固定化反応に用いる緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．３））に置換した。
リガンド固定化反応は、洗浄後のＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４−ＦＦゲル（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に対して、２ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したリガンド溶液をゲルと等容量加え、２５℃にて４時間振とうして行った。
固定化反応終了後、反応液の上清を回収し、これをＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー株式会社）にアプライし、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を移動相としたゲル濾過クロマトグラフィにおいて２８０ｎｍの吸光度にて未反応のリガンドタンパク質を検出して未反応のリガンド量を測定し、ゲルに固定化されたリガンド量を決定した。
その結果、本発明のイムノグロブリン親和性リガンド全てについて、本条件下で固定化反応に使用した量の９９％以上がゲルに固定化されたことを確認することができた。
リガンド固定化反応後のゲルは、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ エタノールアミン溶液（ｐＨ ８．３）中で２５℃にて１時間振とうすることで、未反応のＮＨＳ活性化基をブロッキングし、次いで０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ４．０）と０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ エタノールアミン溶液（ｐＨ ８．３）とで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝生理食塩水（以後ＰＢＳという）にて３回洗浄した後にイムノグロブリン結合量の測定に使用した。
【実施例７】
【００４５】
［改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルのイムノグロブリン結合量の測定］
リガンドを固定化したゲルに対し、等容量の４０ｍｇ／ｍＬヒトイムノグロブリン（シグマ社）のＰＢＳ溶液を加え、２５℃にて１時間振とうしてイムノグロブリンをゲルに吸着させた。次にゲルをＰＢＳにて３回洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ ２．８）中で２５℃にて１０分間振とうしてイムノグロブリンをゲルから溶出させた。
溶出液に１／２０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１３．８（１ｇ−１ｃｍ−１）の比吸光係数をもとにアフィニティゲルに吸着したイムノグロブリン量を求めた。
ゲル１ｍｌあたりのイムノグロブリン吸着量（ｍｇ）を固定化されたリガンド量（ｍｇ）で除した値（ＩｇＧ／リガンド比）を指標として、本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質を親和性リガンドとして用いたときのイムノグロブリン結合活性を評価した結果を図６に示した。
イムノグロブリン結合活性において現時点で本発明の最良の実施形態は、スタフィロコッカスプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの４位、７位および３５位のリジンをリジン以外のアミノ酸に置換し、さらにヘリックス３のタンパク質表面である４０位、４３位、４６位、５３位および５６位のアミノ酸のうち３個ないし５個をリジンに置換する改変、およびこれに加えてＣ末端部にリジンを３個付加する改変を施した改変タンパク質であり、これらの改変体を親和性リガンドとして用いたアフィニティゲルは、改変前のＳＰＡＣ’ドメインを用いたものに比べて最大３．５倍のイムノグロブリン結合活性を示した。
本発明に包含されるアミノ酸配列の改変のうち、３５位のリジンをリジン以外のアミノ酸に置換する改変は、得られたタンパク質を親和性リガンドとして固定化したゲルへのイムノグロブリン吸着量を増加させる効果が極めて高く、なかでもアルギニンまたはグルタミンへの置換が最も効果的であった。この結果は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが３５位の近辺でゲルに固定化されると、その分子はイムノグロブリンを結合する活性が著しく低下することを示している。なお、スタフィロコッカス由来の別のたんぱく質であってプロテインＡとは異なるイムノグロブリン結合タンパク質（特許文献１に記載）には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとアミノ酸配列において４５％程度の相同性をもつ領域が含まれており、この配列の３５位に相当する位置にはアルギニンが存在している。しかしながら、この類似ドメインにおけるイムノグロブリン結合領域と推測される１−３８位には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとは全く異なる３カ所、特に３２位にもリジンが存在することに加え、３９位以降に存在するリジンの数がプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに比べて少く、１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合がプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのそれよりもさらに低いため、リジン残基を介して担体に固定化する場合に良好な配向性を保持することは極めて困難であることが容易に推察される。すなわち、本発明の改変タンパク質が特許文献１に記載のタンパク質に比べて、イムノグロブリンに対する親和性リガンドとして著しく有用な構造的および機能的特徴を有していることは明らかである。
【実施例８】
【００４６】
［改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルのアルカリ性ｐＨ条件での安定性の検討］
改変イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルを０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で２５℃にて一定時間保温し、ＰＢＳで３回洗浄後、実施例７の方法に従いイムノグロブリン結合量を測定した。
アルカリ性ｐＨ条件で処理した後のイムノグロブリン結合量を各処理時間ごとに測定し、アルカリ性ｐＨ条件で処理する前のイムノグロブリン結合量を１００％としたときの残存率を図７に示した。
この結果は、スタフィロコッカスプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、へリックス３のタンパク質表面におけるリジン残基を増加させた本発明のイムノグロブリン親和性リガンドはアフィニティゲルに固定化された形で、アルカリ性ｐＨ条件下での処理に対して改変前のリガンドより安定であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィ用担体は、安価で、イムノグロブリンを結合する能力が高く、リガンドタンパク質の漏出が少ない。すなわち、本発明は、安価で高品質なイムノグロブリンの製造過程、診断に使用される抗体固定化チップやマイクロプレートならびに安全性の高いイムノグロブリン除去用血液浄化システム等の構築に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ｐＵＣＡＳＲ１プラスミドの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの核酸配列を示す図面である。
【図２】ｐＵＣ／ＳＰＡＣ’プラスミド上に構築されたイムノグロブリン結合タンパク質をコードする核酸およびアミノ酸配列を示す図面である。
【図３】イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを構築する手順を表した図面である。
【図４】イムノグロブリン結合タンパク質改変体の陽イオン交換クロマトグラフィにおける挙動を示した図面である。
【図５】イムノグロブリン結合タンパク質を酸性ｐＨ条件で処理したときの被切断特性を比較した図面である。
【図６】クロマトグラフィ用担体に親和性リガンドとして固定化したときのイムノグロブリン結合タンパク質のＩｇＧ結合能を比較した図面である。
【図７】イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティゲルをアルカリ性ｐＨ条件で処理したときの残存活性を比較した図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性リガンドとしての、イムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるイムノグロブリン結合タンパク質であって、配列番号１で規定されるスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインの、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、または、前記（Ａ）および（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上している、ことを特徴とする改変タンパク質またはそれらを含む多量体の固定化物。
【請求項２】
上記（Ａ）が、３９位以降におけるリジンへの置換、および／または、リジンを付加する改変、および／または、４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変による、請求項１に記載の固定化物。
【請求項３】
アフィニティクロマトグラフィ用担体である請求項１または２記載の固定化物。
【請求項４】
プロテインチップである請求項１または２記載の固定化物。
【請求項１】
親和性リガンドとしての、イムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができるイムノグロブリン結合タンパク質であって、配列番号１で規定されるスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡのＣドメインの改変体または配列番号２で規定されるＺドメインの、（Ａ）１−３８位のリジン数に対する３９位以降のリジン数の割合が改変前の分子よりも増加していることにより、該タンパク質を自らのアミノ基を介して不溶性担体に固定化する際に、イムノグロブリンに対する親和性を保持するための配向性が改変前の分子に比べて向上している、または、前記（Ａ）および（Ｂ）アスパラギン酸−プロリンの配列を排除することにより、酸性ｐＨ条件における化学的安定性が改変前の分子に比べて向上している、ことを特徴とする改変タンパク質またはそれらを含む多量体の固定化物。
【請求項２】
上記（Ａ）が、３９位以降におけるリジンへの置換、および／または、リジンを付加する改変、および／または、４，７，３５位に元からあるリジンを他のアミノ酸へ置換する改変による、請求項１に記載の固定化物。
【請求項３】
アフィニティクロマトグラフィ用担体である請求項１または２記載の固定化物。
【請求項４】
プロテインチップである請求項１または２記載の固定化物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２１４３５０（Ｐ２００８−２１４３５０Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７５６４７（Ｐ２００８−７５６４７）
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【分割の表示】特願２００７−４０７７２（Ｐ２００７−４０７７２）の分割
【原出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（３０６００５９５２）プロテノバ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【分割の表示】特願２００７−４０７７２（Ｐ２００７−４０７７２）の分割
【原出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（３０６００５９５２）プロテノバ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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