インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための免疫刺激性サポニン
本発明は、腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質の投与のステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物に、ならびに薬剤の製造でのこのような医薬組成物の使用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質の投与のステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物、ならびに薬剤の製造でのこのような医薬組成物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、新生物増殖を説明するために使用される一般用語である。新生物は、一般に通常よりも高速で増殖する、組織の異常な、通常は脱分化形と見なされる。大半の場合、新生物細胞は周囲組織に浸潤し、さらに新生物細胞は体内の他の場所に転移して増殖を続ける。
【０００３】
新生物塊、腫瘍の局所および局部処置、例えば外科手術は、転移の可能性に影響を及ぼさない。従って追加の療法、例えば細胞毒性薬による処置が必要である。このような処置は概して、化学療法として公知である。
【０００４】
局所処置はもちろん、固形腫瘍処置の第１のステップである。局所処置は伝統的に、腫瘍切除によって行われる。
【０００５】
別の手法はインサイチューでの腫瘍破壊である。インサイチューでの腫瘍破壊の特徴は、腫瘍は除去されないが、壊死させられることである。原則として、照射はインサイチューでの腫瘍破壊の形であるが、腫瘍破壊の他の多くの方法が開発されている。一般的な方法は例えば、光感作化合物と続いてのレーザによるこの活性化の組合せを使用する、光線力学療法、レーザ光、マイクロ波、電流、超音波、高密度焦点式超音波による、もしくは高周波によるインサイチュー加熱、または寒冷療法：凍結により組織を壊死させることである。
【０００６】
インサイチューでの腫瘍破壊により、破壊された腫瘍塊は体内に存在したままである。腫瘍塊が体内に存在することにより、腫瘍特異性抗原に対する免疫応答を試行および構築する可能性（癌免疫療法）は未解決のままである。腫瘍特異性抗原に対するこのような免疫応答の誘発が成功することの利点は、免疫応答がしばらくの間続いて、局所腫瘍破壊の影響を受けにくい、体内の別の箇所の腫瘍局在化を最終的に排除することである。
【０００７】
しかし非自己抗原に基づくワクチン開発から公知であることに反して、腫瘍抗原に対する免疫応答の誘発は決して容易ではない。
【０００８】
基本的に、腫瘍抗原は主に、体の通常の構成要素：自己抗原である。従って免疫系はこれ自体、自己抗原の耐性状態につながる自己に対する免疫応答を下方制御する。
【０００９】
それゆえ腫瘍破壊に基づく癌免疫療法の開発は、非常に特異的な手法を必要とする。
【００１０】
実際に非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）は現在、腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答を誘発することができる免疫増強化合物の圧倒的に最も好ましい特異的な群と見なされている。
【００１１】
これらのシチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチドは、トル様受容体９（ＴＬＲ９）作用薬として作用する。ＣｐＧモチーフは、Ｔｈ１応答のこの優先的誘発および腫瘍特異性ＣＤ８−Ｔリンパ球のために突出している。ＴＬＲ９は主に、内部移行してＣｐＧモチーフに直接応答するＢ細胞および樹状細胞（ＤＣ）によって発現される。ＴＬＲ９のトリガー時に、ＤＣは成熟して、排出リンパ節に移動し、そこで抗原をＴおよびＢリンパ球に提示する。重要なことにこれらのＤＣは、腫瘍特異性ＣＴＬの効率的なプライミングに不可欠な、交差提示として公知のプロセスである、ＭＨＣクラスＩ分子に捕捉された抗原を提示する独自の能力を獲得する。このようなものとしてＣｐＧ投与は、予防環境における腫瘍増殖を防止することが報告されており、マウスで確立された腫瘍を根絶することができる。Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５３９０−５３９６（２００８））およびＲｏｕｘ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．５７：１２９１−１３００（２００８））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５３９０−５３９６（２００８））
【非特許文献２】Ｒｏｕｘ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．５７：１２９１−１３００（２００８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし特に抗ＤＮＡ抗体および自己免疫の誘発を含む、ＣｐＧ ＯＤＮの使用に関する潜在的な安全上の懸念が幾つかある。さらにより多くの量でおよびより長期間にわたって投与されるときのこの毒性、ならびにこの使用に関わる費用も懸念事項である。
【００１４】
従って、他の免疫増強化合物への要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上述の懸念事項を低減または克服する手段を提供する。
【００１６】
インサイチューでの腫瘍破壊後の腫瘍特異性抗原に対する免疫応答の誘発におけるＴＬＲ９およびこの作用薬の主要な役割を考えると、当業者はこの役割を、このような他の免疫増強化合物がＴＬＲ９作用薬としても作用する前提条件と見なす。
【００１７】
驚くべきことに、ＴＬＲ９機構に全く関係を持たないサポニンが、それにもかかわらず、腫瘍破壊後の腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答を誘発するのに非常に好適であることが今や見出された。さらになお予想外には、この有効性は、未知の機構を通じてではあるが、ＣｐＧの有効性に匹敵するか、またはＣｐＧの有効性よりもなお良好であると思われる。
【００１８】
腫瘍破壊の瞬間またはこの付近における腫瘍内または腫瘍周囲へのサポニンの投与によって、インサイチューでの腫瘍破壊後に腫瘍特異性抗原に対する非常に有意な免疫応答が誘発されることが見出された。この免疫応答は長続きして、従ってこのような細胞が体内に潜在的に存在する場合でも、転移細胞を排除するのに非常に好適である。さらにこの免疫応答は、処置の数週間後に同じ種類の腫瘍細胞が相当量で意図的に投与された場合でも、これらの増殖を防止するのに十分に強力であると思われる。
【００１９】
サポニンは今まで、例えば細菌またはウイルスワクチンにおいて非自己抗原に対するアジュバントとしてのみ記載されている。腫瘍細胞を死滅させるための、細胞毒としてのサポニンの使用は、Ｂａｃｈｒａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：５７５−５８４（２００８））によって記載されている。ＰＣＴ出願ＷＯ ２００８／０６３１２９には、腫瘍細胞の死滅のための細胞毒としての、脂質含有粒子中のサポニンの使用が記載されている。
【００２０】
しかし本発明において、サポニンは腫瘍破壊のプロセスですでに死滅した細胞と組合せて使用されるので、この細胞毒性効果は関係がない。この細胞毒性効果は何の役割も果たさないので、破壊された腫瘍に対する効果はいずれにしろ予想されない。さらに化学療法におけるサポニンの細胞毒性効果は、投与の瞬間のみに作用する。サポニンは免疫応答を確立せず、それゆえサポニンは一時的に低い代謝活性を有する転移細胞；潜伏細胞に対して作用しない。
【００２１】
インサイチューでの腫瘍破壊後の腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答の誘発におけるサポニンの役割は、これまで未知であり、上述の理由で予想できない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、またはＣｐＧ−ＯＤＮとの組合せの後の腫瘍増殖からの保護の制限を示す、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。
【図１Ｂ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、または混合された水中油型、油中水型またはアルミニウムアジュバントとの組合せの後の腫瘍増殖からの保護の制限を示す、または保護を示さない生存曲線。
【図１Ｃ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、または表示した（混合された）アジュバントとの組合せの後の腫瘍増殖からの相対保護を示す生存曲線。サポニンベースのアジュバントは、最も強力な保護を示す。
【図１Ｄ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。サポニンベースのアジュバントと組合されたアブレーションが、ＣｐＧ−ＯＤＮ同時投与と組合されるときに追加の保護を示す生存曲線。＊＝凍結と比較してｐ＜０．０５、＊＊＝凍結／ＣｐＧと比較してｐ＜０．００１。３種類の独立した実験で匹敵するデータが得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
従って本発明の第１の実施形態は、腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質を投与するステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための、医薬組成物に関し、前記免疫増強物質はサポニンである。
【００２４】
サポニンは原則として植物グリコシドの総称であり、中でもキラヤサポナリアのサポニンは最も古く、最も頻繁に使用される。
【００２５】
粗サポニンは実際には、同じ基本構造を共有するが、異なる側鎖を有するサポニンの混合物である。異なるサポニン構成要素は主に、この親水性度／疎水性度が異なる。
【００２６】
ＨＰＬＣは、粗サポニン混合物から各種のサポニン構成要素を検出および単離するのに好ましい方法である。複数の精製抽出物、例えばＱＳ−７、−１７、−１８、−２１、ＧＰＩ−０１００、ＱｕｉｌＡ、ＱｖａｃおよびＢｉｏＱは、各種の供給元から市販されている。
【００２７】
好ましくは、サポニンは、以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８またはＱＳ−２１の少なくとも１つを含む。
【００２８】
ＱｕｉｌＡおよびこの構成要素、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００、ＱＰ ＵＦ１０００なども、好ましいサポニンである。
【００２９】
それゆえ本実施形態の好ましい形は、サポニンが以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００またはＱＰ ＵＦ １０００の少なくとも１つを含む、本発明による医薬組成物に関する。
【００３０】
サポニンの別の魅力的な免疫刺激形は、いわゆる空の免疫刺激複合体（空のＩＳＣＯＭＳ）である。空の免疫刺激複合体調製物は、これらがサポニン、脂質およびコレステロールの混合物から作製されるという点でサポニンとは異なる。この調製の間に、サポニン自体よりもなお免疫増強性である小型ミセル様粒子が形成される。
【００３１】
それゆえ本実施形態の別の好ましい形は、サポニンが空の免疫刺激複合体の形である、本発明による医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明は、ヒトの医学および獣医学の分野で等しく適用できることは言うまでもない。
【００３３】
一方ではサポニンおよび他方ではＣｐＧ ＯＤＮの異なる作用機序の観点から、２つの組合せ投与のいずれの増強効果も予想できない。
【００３４】
しかし驚くべきことに、サポニンとＣｐＧ ＯＤＮの組合せ使用で強力な相乗効果があることが見出された。
【００３５】
この予想外の相乗作用が好都合なのは、この相乗作用によってサポニンと組合せて投与するときに、標準未満の量のＣｐＧ ＯＤＮを使用できることである。この相乗作用は次に、上述したＣｐＧ ＯＤＮの使用の欠点を明らかに軽減する。この観点から、ＣｐＧ ＯＤＮをサポニンと組合せて投与するという条件で、ＣｐＧ ＯＤＮの使用は再び魅力的なものとなる。
【００３６】
非自己抗原に対する免疫応答の誘発のためのアジュバントとしての、ＣｐＧと組合せたサポニンの使用はＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ＵＳ ７０４９３０２に記載されているが、上述した理由のために、自己抗原に対する相乗効果はもちろんのこと、複合効果も予想できる。
【００３７】
それゆえ本実施形態のさらに好ましい形は、ＣｐＧ ＯＤＮをさらに含む、本発明による医薬組成物に関する。
【００３８】
免疫刺激で使用するためのＣｐＧ ＯＤＮは、１９９４年から記載されている（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ＵＳ６４２９１９９）。ＣｐＧモチーフは、基本的に構造５’−Ｘ１−Ｃ−ｐＧ−Ｘ２−Ｓ’を有する。ＣｐＧモチーフ５’−Ｐｕ−Ｐｕ−ＣｐＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒは、中でも最も免疫増強性であることが公知である（Ｓｃｈｅｕｌｅ，Ｒ．Ｋ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４：１１９−１３４（２０００））。基本的に、この長さは８から８０塩基であり、ＣｐＧモチーフは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する。
【００３９】
異なる動物種における効率のわずかな相違が頻繁に見られる。単に１例として；ヒトＴＬＲ９はＣｐＧモチーフＧ−Ｔ−ＣｐＧ−Ｔ−Ｔによって最適にトリガーされるのに対して、マウスＴＬＲ９は、Ｇ−Ａ−ＣｐＧ−Ｔ−Ｔによってさらに最適にトリガーされる（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：８３１−８３５（２００３）。
【００４０】
７つの獣医種および３つの実験種についての最適なＣｐＧモチーフは、Ｒａｎｋｉｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１：３３３−３４０（２００１）によって記載されている。イヌおよびネコ免疫細胞増殖を効率的に刺激するＣｐＧモチーフは、Ｗｅｒｎｅｔｔｅ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．によってＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．８４：２２３−２３６（２００２）に記載されている。家禽におけるＣｐＧモチーフの利用は、とりわけＡｍｅｉｓｓ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１１０：２５７−２６７（２００６）によって記載されている。
【００４１】
異なるＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ ＯＤＮは容易に市販品を入手することができ、所望ならば異なるＣｐＧモチーフは容易に合成される。ＣｐＧ ＯＤＮの好適な量は、とりわけ上述の刊行物および実施例の節に見出すことができる。
【００４２】
再び上述のように、本発明がヒトの医学および獣医学の分野で等しく適用できることは言うまでもないが、ＣｐＧモチーフを本発明が使用される動物種に適合させることが（必須ではないが）勧められる。この適合は、上で要約した刊行物に基づいて容易に行うことができる。
【００４３】
原則として、腫瘍破壊のステップおよび免疫増強物質の投与のステップは、異なる瞬間にまたは同時に行うことができる。しかし理論的に、腫瘍破壊を適用する数日前、またはより良好には１週間もしくはなお２週間以上前に、免疫系を「プライミング」する目的で、腫瘍を免疫増強物質によって調整することは好ましい経路であることが予想される。
【００４４】
しかし驚くべきことに、免疫増強物質の投与が腫瘍破壊後に、腫瘍破壊後の数日以内に、腫瘍破壊後の好ましくは１日以内に、さらに好ましくは１２時間以内に、なおさらに好ましくは６時間以内に、またなおさらに好ましくは２時間以内に行われる場合、ステップの順序が逆転されるときよりも免疫刺激のレベルが良好であることが見出された。
【００４５】
免疫増強物質の投与が腫瘍破壊の約２時間前と破壊の瞬間との間に行われるときにも、非常に良好な結果が得られる。このことは、破壊が誘発した新生物塊の構造の変化のために、破壊の後に新生物塊に接近または進入するのがより困難であり得るためである。
【００４６】
腫瘍破壊の２時間前と腫瘍破壊の２時間後との間隔における免疫増強物質の投与は、周術期投与と呼ばれる。
【００４７】
従って、本実施形態の１つの好ましい形は、腫瘍破壊のステップおよび本発明による免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物に関し、前記ステップは以下の順序：
ａ．腫瘍の破壊
ｂ．免疫増強物質の投与
である。
【００４８】
本実施形態のさらに好ましい形は、上述の順序でのステップに関し、ここで免疫増強物質の投与は、この好ましい順序で腫瘍破壊後の２４時間以内、１２時間以内、またはなお６時間以内に続く。
【００４９】
また、本実施形態の別の好ましい形は、腫瘍破壊のステップおよび本発明による免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物に関し、前記ステップは：
ａ．免疫増強物質の周術期投与
ｂ．腫瘍の破壊
である。
【００５０】
免疫増強物質の投与部位に関して、以下の考慮がなされるべきである：
好ましくは、免疫増強物質は、新生物塊中に直接投与される。わずかながら好ましくないが、免疫増強物質が新生物塊周辺の１つ以上の場所に投与される、腫瘍周辺投与も可能である。別の、しかしあまり好ましくない投与は、新生物塊の排出領域への皮下投与である。最後に、好ましくは新生物塊の場所付近での静脈内投与が可能である。
【００５１】
従って免疫増強物質の前記投与は、この好ましさの低い順から、静脈内投与、新生物塊の排出領域への皮下投与、腫瘍周辺投与または腫瘍内投与によって行われる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、腫瘍破壊を受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための薬剤の製造における、本発明による医薬組成物の使用に関する。
【００５３】
本発明のまた別の実施形態は、腫瘍破壊を受けるまたは受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための周術期投与用薬剤の製造における、本発明による医薬組成物の使用に関する。
【００５４】
実施例
【実施例１】
【００５５】
マウスおよび腫瘍細胞
Ｃ５７ＢＬ／６ｎマウス（６から８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ（ドイツ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）から購入して、Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（オランダ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）にて、特定の無菌バリア条件下で維持した。飲用水および標準の実験室用ペレット食を任意に与え、マウスを特定の処置群への無作為割当ての前に、少なくとも１週間収容した。実験は、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの動物ケアガイドライン（ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ）に従って行った。
【００５６】
マウス黒色腫株化細胞Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ）を完全培地（ＭＥＭ、５％ウシ胎仔血清（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（すべてＧｉｂｃｏより）、２０μＭ β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ））中で培養した。
【００５７】
腫瘍モデルおよび凍結手術
腫瘍細胞をＰＢＳおよびマトリゲル（２：１）の混合物中に懸濁させて、総体積５０μｌ中の０．５＊１０６個の細胞を右大腿に皮下注射した。６から８ｍｍの腫瘍直径が測定されたとき（概して第９から１０日）、マウスを処置群に無作為に割当てた。冷凍アブレーション（Ｃｒｙｏ）は、イソフルラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔下で、先端が循環液体窒素流によって冷却される液体窒素冷凍アブレーションシステム（ＣＳ７６，Ｆｒｉｇｉｔｒｏｎｉｃｓ、コネチカット州、Ｓｈｅｌｔｏｎ）を使用して行った。凍結および解凍の２回の処理サイクルの間に、腫瘍は巨視的に凍結されたが、周囲の健常組織は損傷されないままであった。長期間の腫瘍保護の誘発を監視するために、冷凍アブレーションの４０日後に、１５＊１０３個のＢ１６ＯＶＡまたはＢ１６Ｆ１０細胞でマウスを再攻撃した。再攻撃は１００μｌ ＰＢＳ中で右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたとき、または腫瘍が皮膚バリアから突出したときにマウスを殺処分した。
【００５８】
アジュバント注射
完全ホスホロチオエート修飾主鎖を有するＣｐＧ １６６８（’５−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’）をＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（英国、Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ）から購入した。ＣｐＧをＰＢＳ腫瘍周辺に注射した（ｐ．ｔ．，アブレートした腫瘍を覆う１０μｌ×２回の注射に分割された３０μｇ）。以下のアジュバントを使用した（すべてＩｎｔｅｒｖｅｔ ＢＶ，Ｂｏｘｍｅｅｒによって供給された）：鉱油ベースの油中水型エマルション（マルコール５２）（１）および非鉱油ベースの油中水型エマルション（ミグリオール８４０）（１）；鉱油を使用する水中油型エマルション、スクアランを使用する水中油型エマルション（２）；およびビタミンＥアセテートを使用する水中油型エマルション（３）；マトリクスＣ ７５０μｇ／ｍｌ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）；ＱｕｉｌＡサポニン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）５００μｇ／ｍｌ；水酸化アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）０．７５％（重量／体積）；またはリン酸アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）０．７５％（重量／体積）。本明細書では、２種類の油中水型エマルションを１：１の比で混合して、３種類の水中油型エマルションを１：１：１の比で混合した。アルミニウムベースのアジュバントを１：１の比で混合して使用したが、別個にも使用した。すべての非細菌性アジュバント（またはこの混合物）をｐ．ｔ．注射した（ＣｐＧ−ＯＤＮ注射から空間的に隔離され、２０μｌ×２回の注射に分割された４０μｌ）。すべての注射はアブレーション後３０分以内に行った。
【００５９】
（１：Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２３，１０５３−１０６０，２００５，２：Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６，６６９−７１０，２００７，３：Ｒｉｊｋｅ ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ａｄｖ．Ａｖｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｅｄｓ．Ｔ．Ｆ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｎ．Ｂｕｍｓｔｅａｄ ａｎｄ Ｐ．Ｋａｉｓｅｒ ２６５−２７１，１９９５）
【００６０】
統計解析
ログランク検定を使用して、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線を解析した。
【００６１】
結果：
図１のグラフから以下の通り明らかであるように、腫瘍破壊および免疫増強物質としてのＣｐＧ ＯＤＮの投与の組合せによって、８０日後に５０％未満の生存率がもたらされる。さらに生存曲線には有意な横ばい状態はない（図１ａ）。
【００６２】
腫瘍破壊および免疫増強物質としての水中油型、油中水型、またはＡｌＯＨアジュバントの投与の組合せすべてによって、保護の低下がもたらされた（図１ｂおよび１ｃ）。
【００６３】
しかし腫瘍破壊および免疫増強物質としての、ＱｕｉｌＡの形でまたは空の免疫刺激複合体としてのサポニンの投与の組合せにより、８０日後に７５％を超える印象的な生存率がもたらされる。さらにこの場合には生存曲線に有意な横ばい状態がある（図Ｉｃ）。
【００６４】
腫瘍破壊ならびにＣｐＧおよび免疫増強物質としての、ＱｕｉｌＡの形でまたは空の免疫刺激複合体としてのサポニンの併用投与の組合せによって、８０日後に９０％を超えるなお高い生存率および生存曲線の非常に強い横ばい状態がもたらされる（図１ｄ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質の投与のステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物、ならびに薬剤の製造でのこのような医薬組成物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、新生物増殖を説明するために使用される一般用語である。新生物は、一般に通常よりも高速で増殖する、組織の異常な、通常は脱分化形と見なされる。大半の場合、新生物細胞は周囲組織に浸潤し、さらに新生物細胞は体内の他の場所に転移して増殖を続ける。
【０００３】
新生物塊、腫瘍の局所および局部処置、例えば外科手術は、転移の可能性に影響を及ぼさない。従って追加の療法、例えば細胞毒性薬による処置が必要である。このような処置は概して、化学療法として公知である。
【０００４】
局所処置はもちろん、固形腫瘍処置の第１のステップである。局所処置は伝統的に、腫瘍切除によって行われる。
【０００５】
別の手法はインサイチューでの腫瘍破壊である。インサイチューでの腫瘍破壊の特徴は、腫瘍は除去されないが、壊死させられることである。原則として、照射はインサイチューでの腫瘍破壊の形であるが、腫瘍破壊の他の多くの方法が開発されている。一般的な方法は例えば、光感作化合物と続いてのレーザによるこの活性化の組合せを使用する、光線力学療法、レーザ光、マイクロ波、電流、超音波、高密度焦点式超音波による、もしくは高周波によるインサイチュー加熱、または寒冷療法：凍結により組織を壊死させることである。
【０００６】
インサイチューでの腫瘍破壊により、破壊された腫瘍塊は体内に存在したままである。腫瘍塊が体内に存在することにより、腫瘍特異性抗原に対する免疫応答を試行および構築する可能性（癌免疫療法）は未解決のままである。腫瘍特異性抗原に対するこのような免疫応答の誘発が成功することの利点は、免疫応答がしばらくの間続いて、局所腫瘍破壊の影響を受けにくい、体内の別の箇所の腫瘍局在化を最終的に排除することである。
【０００７】
しかし非自己抗原に基づくワクチン開発から公知であることに反して、腫瘍抗原に対する免疫応答の誘発は決して容易ではない。
【０００８】
基本的に、腫瘍抗原は主に、体の通常の構成要素：自己抗原である。従って免疫系はこれ自体、自己抗原の耐性状態につながる自己に対する免疫応答を下方制御する。
【０００９】
それゆえ腫瘍破壊に基づく癌免疫療法の開発は、非常に特異的な手法を必要とする。
【００１０】
実際に非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）は現在、腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答を誘発することができる免疫増強化合物の圧倒的に最も好ましい特異的な群と見なされている。
【００１１】
これらのシチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチドは、トル様受容体９（ＴＬＲ９）作用薬として作用する。ＣｐＧモチーフは、Ｔｈ１応答のこの優先的誘発および腫瘍特異性ＣＤ８−Ｔリンパ球のために突出している。ＴＬＲ９は主に、内部移行してＣｐＧモチーフに直接応答するＢ細胞および樹状細胞（ＤＣ）によって発現される。ＴＬＲ９のトリガー時に、ＤＣは成熟して、排出リンパ節に移動し、そこで抗原をＴおよびＢリンパ球に提示する。重要なことにこれらのＤＣは、腫瘍特異性ＣＴＬの効率的なプライミングに不可欠な、交差提示として公知のプロセスである、ＭＨＣクラスＩ分子に捕捉された抗原を提示する独自の能力を獲得する。このようなものとしてＣｐＧ投与は、予防環境における腫瘍増殖を防止することが報告されており、マウスで確立された腫瘍を根絶することができる。Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５３９０−５３９６（２００８））およびＲｏｕｘ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．５７：１２９１−１３００（２００８））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５３９０−５３９６（２００８））
【非特許文献２】Ｒｏｕｘ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．５７：１２９１−１３００（２００８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし特に抗ＤＮＡ抗体および自己免疫の誘発を含む、ＣｐＧ ＯＤＮの使用に関する潜在的な安全上の懸念が幾つかある。さらにより多くの量でおよびより長期間にわたって投与されるときのこの毒性、ならびにこの使用に関わる費用も懸念事項である。
【００１４】
従って、他の免疫増強化合物への要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上述の懸念事項を低減または克服する手段を提供する。
【００１６】
インサイチューでの腫瘍破壊後の腫瘍特異性抗原に対する免疫応答の誘発におけるＴＬＲ９およびこの作用薬の主要な役割を考えると、当業者はこの役割を、このような他の免疫増強化合物がＴＬＲ９作用薬としても作用する前提条件と見なす。
【００１７】
驚くべきことに、ＴＬＲ９機構に全く関係を持たないサポニンが、それにもかかわらず、腫瘍破壊後の腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答を誘発するのに非常に好適であることが今や見出された。さらになお予想外には、この有効性は、未知の機構を通じてではあるが、ＣｐＧの有効性に匹敵するか、またはＣｐＧの有効性よりもなお良好であると思われる。
【００１８】
腫瘍破壊の瞬間またはこの付近における腫瘍内または腫瘍周囲へのサポニンの投与によって、インサイチューでの腫瘍破壊後に腫瘍特異性抗原に対する非常に有意な免疫応答が誘発されることが見出された。この免疫応答は長続きして、従ってこのような細胞が体内に潜在的に存在する場合でも、転移細胞を排除するのに非常に好適である。さらにこの免疫応答は、処置の数週間後に同じ種類の腫瘍細胞が相当量で意図的に投与された場合でも、これらの増殖を防止するのに十分に強力であると思われる。
【００１９】
サポニンは今まで、例えば細菌またはウイルスワクチンにおいて非自己抗原に対するアジュバントとしてのみ記載されている。腫瘍細胞を死滅させるための、細胞毒としてのサポニンの使用は、Ｂａｃｈｒａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：５７５−５８４（２００８））によって記載されている。ＰＣＴ出願ＷＯ ２００８／０６３１２９には、腫瘍細胞の死滅のための細胞毒としての、脂質含有粒子中のサポニンの使用が記載されている。
【００２０】
しかし本発明において、サポニンは腫瘍破壊のプロセスですでに死滅した細胞と組合せて使用されるので、この細胞毒性効果は関係がない。この細胞毒性効果は何の役割も果たさないので、破壊された腫瘍に対する効果はいずれにしろ予想されない。さらに化学療法におけるサポニンの細胞毒性効果は、投与の瞬間のみに作用する。サポニンは免疫応答を確立せず、それゆえサポニンは一時的に低い代謝活性を有する転移細胞；潜伏細胞に対して作用しない。
【００２１】
インサイチューでの腫瘍破壊後の腫瘍特異性自己抗原に対する免疫応答の誘発におけるサポニンの役割は、これまで未知であり、上述の理由で予想できない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、またはＣｐＧ−ＯＤＮとの組合せの後の腫瘍増殖からの保護の制限を示す、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。
【図１Ｂ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、または混合された水中油型、油中水型またはアルミニウムアジュバントとの組合せの後の腫瘍増殖からの保護の制限を示す、または保護を示さない生存曲線。
【図１Ｃ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。アブレーションのみ、または表示した（混合された）アジュバントとの組合せの後の腫瘍増殖からの相対保護を示す生存曲線。サポニンベースのアジュバントは、最も強力な保護を示す。
【図１Ｄ】ＣｐＧ−ＯＤＮおよびサポニンベースのアジュバントと組合せたアブレーション後の強力な抗腫瘍免疫。右大腿に確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を凍結アブレーション単独によって、ＣｐＧとの組合せによって、または表示した非細菌性アジュバントとの組合せによって処置した。４０日後、未処置および無腫瘍マウスの側腹に腫瘍細胞（１５．０００Ｂ１６Ｆ１０細胞）によってｓ．ｃ．再攻撃した。腫瘍サイズを２から４日ごとに監視した。サポニンベースのアジュバントと組合されたアブレーションが、ＣｐＧ−ＯＤＮ同時投与と組合されるときに追加の保護を示す生存曲線。＊＝凍結と比較してｐ＜０．０５、＊＊＝凍結／ＣｐＧと比較してｐ＜０．００１。３種類の独立した実験で匹敵するデータが得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
従って本発明の第１の実施形態は、腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質を投与するステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための、医薬組成物に関し、前記免疫増強物質はサポニンである。
【００２４】
サポニンは原則として植物グリコシドの総称であり、中でもキラヤサポナリアのサポニンは最も古く、最も頻繁に使用される。
【００２５】
粗サポニンは実際には、同じ基本構造を共有するが、異なる側鎖を有するサポニンの混合物である。異なるサポニン構成要素は主に、この親水性度／疎水性度が異なる。
【００２６】
ＨＰＬＣは、粗サポニン混合物から各種のサポニン構成要素を検出および単離するのに好ましい方法である。複数の精製抽出物、例えばＱＳ−７、−１７、−１８、−２１、ＧＰＩ−０１００、ＱｕｉｌＡ、ＱｖａｃおよびＢｉｏＱは、各種の供給元から市販されている。
【００２７】
好ましくは、サポニンは、以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８またはＱＳ−２１の少なくとも１つを含む。
【００２８】
ＱｕｉｌＡおよびこの構成要素、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００、ＱＰ ＵＦ１０００なども、好ましいサポニンである。
【００２９】
それゆえ本実施形態の好ましい形は、サポニンが以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００またはＱＰ ＵＦ １０００の少なくとも１つを含む、本発明による医薬組成物に関する。
【００３０】
サポニンの別の魅力的な免疫刺激形は、いわゆる空の免疫刺激複合体（空のＩＳＣＯＭＳ）である。空の免疫刺激複合体調製物は、これらがサポニン、脂質およびコレステロールの混合物から作製されるという点でサポニンとは異なる。この調製の間に、サポニン自体よりもなお免疫増強性である小型ミセル様粒子が形成される。
【００３１】
それゆえ本実施形態の別の好ましい形は、サポニンが空の免疫刺激複合体の形である、本発明による医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明は、ヒトの医学および獣医学の分野で等しく適用できることは言うまでもない。
【００３３】
一方ではサポニンおよび他方ではＣｐＧ ＯＤＮの異なる作用機序の観点から、２つの組合せ投与のいずれの増強効果も予想できない。
【００３４】
しかし驚くべきことに、サポニンとＣｐＧ ＯＤＮの組合せ使用で強力な相乗効果があることが見出された。
【００３５】
この予想外の相乗作用が好都合なのは、この相乗作用によってサポニンと組合せて投与するときに、標準未満の量のＣｐＧ ＯＤＮを使用できることである。この相乗作用は次に、上述したＣｐＧ ＯＤＮの使用の欠点を明らかに軽減する。この観点から、ＣｐＧ ＯＤＮをサポニンと組合せて投与するという条件で、ＣｐＧ ＯＤＮの使用は再び魅力的なものとなる。
【００３６】
非自己抗原に対する免疫応答の誘発のためのアジュバントとしての、ＣｐＧと組合せたサポニンの使用はＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ＵＳ ７０４９３０２に記載されているが、上述した理由のために、自己抗原に対する相乗効果はもちろんのこと、複合効果も予想できる。
【００３７】
それゆえ本実施形態のさらに好ましい形は、ＣｐＧ ＯＤＮをさらに含む、本発明による医薬組成物に関する。
【００３８】
免疫刺激で使用するためのＣｐＧ ＯＤＮは、１９９４年から記載されている（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ＵＳ６４２９１９９）。ＣｐＧモチーフは、基本的に構造５’−Ｘ１−Ｃ−ｐＧ−Ｘ２−Ｓ’を有する。ＣｐＧモチーフ５’−Ｐｕ−Ｐｕ−ＣｐＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒは、中でも最も免疫増強性であることが公知である（Ｓｃｈｅｕｌｅ，Ｒ．Ｋ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４：１１９−１３４（２０００））。基本的に、この長さは８から８０塩基であり、ＣｐＧモチーフは少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する。
【００３９】
異なる動物種における効率のわずかな相違が頻繁に見られる。単に１例として；ヒトＴＬＲ９はＣｐＧモチーフＧ−Ｔ−ＣｐＧ−Ｔ−Ｔによって最適にトリガーされるのに対して、マウスＴＬＲ９は、Ｇ−Ａ−ＣｐＧ−Ｔ−Ｔによってさらに最適にトリガーされる（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：８３１−８３５（２００３）。
【００４０】
７つの獣医種および３つの実験種についての最適なＣｐＧモチーフは、Ｒａｎｋｉｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１：３３３−３４０（２００１）によって記載されている。イヌおよびネコ免疫細胞増殖を効率的に刺激するＣｐＧモチーフは、Ｗｅｒｎｅｔｔｅ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．によってＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．８４：２２３−２３６（２００２）に記載されている。家禽におけるＣｐＧモチーフの利用は、とりわけＡｍｅｉｓｓ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１１０：２５７−２６７（２００６）によって記載されている。
【００４１】
異なるＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ ＯＤＮは容易に市販品を入手することができ、所望ならば異なるＣｐＧモチーフは容易に合成される。ＣｐＧ ＯＤＮの好適な量は、とりわけ上述の刊行物および実施例の節に見出すことができる。
【００４２】
再び上述のように、本発明がヒトの医学および獣医学の分野で等しく適用できることは言うまでもないが、ＣｐＧモチーフを本発明が使用される動物種に適合させることが（必須ではないが）勧められる。この適合は、上で要約した刊行物に基づいて容易に行うことができる。
【００４３】
原則として、腫瘍破壊のステップおよび免疫増強物質の投与のステップは、異なる瞬間にまたは同時に行うことができる。しかし理論的に、腫瘍破壊を適用する数日前、またはより良好には１週間もしくはなお２週間以上前に、免疫系を「プライミング」する目的で、腫瘍を免疫増強物質によって調整することは好ましい経路であることが予想される。
【００４４】
しかし驚くべきことに、免疫増強物質の投与が腫瘍破壊後に、腫瘍破壊後の数日以内に、腫瘍破壊後の好ましくは１日以内に、さらに好ましくは１２時間以内に、なおさらに好ましくは６時間以内に、またなおさらに好ましくは２時間以内に行われる場合、ステップの順序が逆転されるときよりも免疫刺激のレベルが良好であることが見出された。
【００４５】
免疫増強物質の投与が腫瘍破壊の約２時間前と破壊の瞬間との間に行われるときにも、非常に良好な結果が得られる。このことは、破壊が誘発した新生物塊の構造の変化のために、破壊の後に新生物塊に接近または進入するのがより困難であり得るためである。
【００４６】
腫瘍破壊の２時間前と腫瘍破壊の２時間後との間隔における免疫増強物質の投与は、周術期投与と呼ばれる。
【００４７】
従って、本実施形態の１つの好ましい形は、腫瘍破壊のステップおよび本発明による免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物に関し、前記ステップは以下の順序：
ａ．腫瘍の破壊
ｂ．免疫増強物質の投与
である。
【００４８】
本実施形態のさらに好ましい形は、上述の順序でのステップに関し、ここで免疫増強物質の投与は、この好ましい順序で腫瘍破壊後の２４時間以内、１２時間以内、またはなお６時間以内に続く。
【００４９】
また、本実施形態の別の好ましい形は、腫瘍破壊のステップおよび本発明による免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物に関し、前記ステップは：
ａ．免疫増強物質の周術期投与
ｂ．腫瘍の破壊
である。
【００５０】
免疫増強物質の投与部位に関して、以下の考慮がなされるべきである：
好ましくは、免疫増強物質は、新生物塊中に直接投与される。わずかながら好ましくないが、免疫増強物質が新生物塊周辺の１つ以上の場所に投与される、腫瘍周辺投与も可能である。別の、しかしあまり好ましくない投与は、新生物塊の排出領域への皮下投与である。最後に、好ましくは新生物塊の場所付近での静脈内投与が可能である。
【００５１】
従って免疫増強物質の前記投与は、この好ましさの低い順から、静脈内投与、新生物塊の排出領域への皮下投与、腫瘍周辺投与または腫瘍内投与によって行われる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、腫瘍破壊を受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための薬剤の製造における、本発明による医薬組成物の使用に関する。
【００５３】
本発明のまた別の実施形態は、腫瘍破壊を受けるまたは受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための周術期投与用薬剤の製造における、本発明による医薬組成物の使用に関する。
【００５４】
実施例
【実施例１】
【００５５】
マウスおよび腫瘍細胞
Ｃ５７ＢＬ／６ｎマウス（６から８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ（ドイツ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）から購入して、Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（オランダ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）にて、特定の無菌バリア条件下で維持した。飲用水および標準の実験室用ペレット食を任意に与え、マウスを特定の処置群への無作為割当ての前に、少なくとも１週間収容した。実験は、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの動物ケアガイドライン（ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ）に従って行った。
【００５６】
マウス黒色腫株化細胞Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ）を完全培地（ＭＥＭ、５％ウシ胎仔血清（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（すべてＧｉｂｃｏより）、２０μＭ β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ））中で培養した。
【００５７】
腫瘍モデルおよび凍結手術
腫瘍細胞をＰＢＳおよびマトリゲル（２：１）の混合物中に懸濁させて、総体積５０μｌ中の０．５＊１０６個の細胞を右大腿に皮下注射した。６から８ｍｍの腫瘍直径が測定されたとき（概して第９から１０日）、マウスを処置群に無作為に割当てた。冷凍アブレーション（Ｃｒｙｏ）は、イソフルラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔下で、先端が循環液体窒素流によって冷却される液体窒素冷凍アブレーションシステム（ＣＳ７６，Ｆｒｉｇｉｔｒｏｎｉｃｓ、コネチカット州、Ｓｈｅｌｔｏｎ）を使用して行った。凍結および解凍の２回の処理サイクルの間に、腫瘍は巨視的に凍結されたが、周囲の健常組織は損傷されないままであった。長期間の腫瘍保護の誘発を監視するために、冷凍アブレーションの４０日後に、１５＊１０３個のＢ１６ＯＶＡまたはＢ１６Ｆ１０細胞でマウスを再攻撃した。再攻撃は１００μｌ ＰＢＳ中で右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたとき、または腫瘍が皮膚バリアから突出したときにマウスを殺処分した。
【００５８】
アジュバント注射
完全ホスホロチオエート修飾主鎖を有するＣｐＧ １６６８（’５−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’）をＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（英国、Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ）から購入した。ＣｐＧをＰＢＳ腫瘍周辺に注射した（ｐ．ｔ．，アブレートした腫瘍を覆う１０μｌ×２回の注射に分割された３０μｇ）。以下のアジュバントを使用した（すべてＩｎｔｅｒｖｅｔ ＢＶ，Ｂｏｘｍｅｅｒによって供給された）：鉱油ベースの油中水型エマルション（マルコール５２）（１）および非鉱油ベースの油中水型エマルション（ミグリオール８４０）（１）；鉱油を使用する水中油型エマルション、スクアランを使用する水中油型エマルション（２）；およびビタミンＥアセテートを使用する水中油型エマルション（３）；マトリクスＣ ７５０μｇ／ｍｌ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）；ＱｕｉｌＡサポニン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）５００μｇ／ｍｌ；水酸化アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）０．７５％（重量／体積）；またはリン酸アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）０．７５％（重量／体積）。本明細書では、２種類の油中水型エマルションを１：１の比で混合して、３種類の水中油型エマルションを１：１：１の比で混合した。アルミニウムベースのアジュバントを１：１の比で混合して使用したが、別個にも使用した。すべての非細菌性アジュバント（またはこの混合物）をｐ．ｔ．注射した（ＣｐＧ−ＯＤＮ注射から空間的に隔離され、２０μｌ×２回の注射に分割された４０μｌ）。すべての注射はアブレーション後３０分以内に行った。
【００５９】
（１：Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２３，１０５３−１０６０，２００５，２：Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６，６６９−７１０，２００７，３：Ｒｉｊｋｅ ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ａｄｖ．Ａｖｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｅｄｓ．Ｔ．Ｆ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｎ．Ｂｕｍｓｔｅａｄ ａｎｄ Ｐ．Ｋａｉｓｅｒ ２６５−２７１，１９９５）
【００６０】
統計解析
ログランク検定を使用して、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線を解析した。
【００６１】
結果：
図１のグラフから以下の通り明らかであるように、腫瘍破壊および免疫増強物質としてのＣｐＧ ＯＤＮの投与の組合せによって、８０日後に５０％未満の生存率がもたらされる。さらに生存曲線には有意な横ばい状態はない（図１ａ）。
【００６２】
腫瘍破壊および免疫増強物質としての水中油型、油中水型、またはＡｌＯＨアジュバントの投与の組合せすべてによって、保護の低下がもたらされた（図１ｂおよび１ｃ）。
【００６３】
しかし腫瘍破壊および免疫増強物質としての、ＱｕｉｌＡの形でまたは空の免疫刺激複合体としてのサポニンの投与の組合せにより、８０日後に７５％を超える印象的な生存率がもたらされる。さらにこの場合には生存曲線に有意な横ばい状態がある（図Ｉｃ）。
【００６４】
腫瘍破壊ならびにＣｐＧおよび免疫増強物質としての、ＱｕｉｌＡの形でまたは空の免疫刺激複合体としてのサポニンの併用投与の組合せによって、８０日後に９０％を超えるなお高い生存率および生存曲線の非常に強い横ばい状態がもたらされる（図１ｄ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質を投与するステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記免疫増強物質がサポニンであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記サポニンが以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００またはＱＰ ＵＦ １０００の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記サポニンが空の免疫刺激複合体の形であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
加えて前記医薬組成物がＣｐＧ ＯＤＮを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍破壊のステップおよび請求項１から４に記載の免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記ステップが以下の順序：
ａ．腫瘍の破壊
ｂ．免疫増強物質の投与
であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項６】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後２４時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後１２時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後６時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍破壊のステップおよび請求項１から４に記載の免疫増強物質の投与のステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記ステップが：
ａ．免疫増強物質の周術期投与
ｂ．腫瘍の破壊
である、医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫増強物質の前記投与部位がこの好ましさの低い順から、静脈内、新生物塊の排出領域への皮下、腫瘍周辺または腫瘍内である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍破壊を受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための薬剤の製造における、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
腫瘍破壊を受けるまたは受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための周術期投与用薬剤の製造における、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１】
腫瘍破壊のステップおよび免疫刺激量の免疫増強物質を投与するステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記免疫増強物質がサポニンであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記サポニンが以下の構成要素：ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、Ｖａｘ Ｓａｐ、ＳｕｐｅｒＳａｐ、ＧＰＩ−０１００またはＱＰ ＵＦ １０００の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記サポニンが空の免疫刺激複合体の形であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
加えて前記医薬組成物がＣｐＧ ＯＤＮを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍破壊のステップおよび請求項１から４に記載の免疫増強物質の投与のステップを含む、インサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記ステップが以下の順序：
ａ．腫瘍の破壊
ｂ．免疫増強物質の投与
であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項６】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後２４時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後１２時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記免疫増強物質投与ステップが腫瘍破壊後６時間以内に続くことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍破壊のステップおよび請求項１から４に記載の免疫増強物質の投与のステップを含むインサイチュー腫瘍破壊療法で使用するための医薬組成物であって、前記ステップが：
ａ．免疫増強物質の周術期投与
ｂ．腫瘍の破壊
である、医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫増強物質の前記投与部位がこの好ましさの低い順から、静脈内、新生物塊の排出領域への皮下、腫瘍周辺または腫瘍内である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍破壊を受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための薬剤の製造における、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
腫瘍破壊を受けるまたは受けた、癌に罹患している哺乳動物の処置のための周術期投与用薬剤の製造における、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５１３４４４（Ｐ２０１２−５１３４４４Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２８０８（Ｐ２０１１−５４２８０８）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７７２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２７４３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【出願人】（５１１１５３３１２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７７２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２７４３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【出願人】（５１１１５３３１２）
【Ｆターム（参考）】
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