インタクトな細菌ミニセルを精製するための薬学的に適合可能な方法
本発明は、ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップを含む細菌ミニセルの精製方法を提供する。該方法は、任意により予備的な分画遠心ステップ及び１以上の濾過ステップを含んでもよい。本発明はまた、ミニセルを含有するサンプルを、親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過してミニセルを親細菌細胞から分離するステップを含む細菌ミニセルの精製方法を提供する。本発明に係る方法は、任意により、精製ミニセル調製物からのエンドトキシンの除去ステップ、及び／又は精製ミニセル調製物の抗生物質による処理ステップを１以上含んでもよい。さらに本発明は、上記方法により調製され、かつミニセル１０７、１０８、１０９、１０１０又は１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インタクトな細菌ミニセルを精製するための薬学的に適合可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミニセルは、ＤＮＡの分離をともなう細胞分裂の二分裂の際の協調を妨げることによって生じさせた大腸菌（E. coli）又はその他の細菌細胞の無核形態である。原核生物の染色体複製は、細胞中央の隔壁の形成をともなう正常な二分裂と連動している。大腸菌では、例えば、ｍｉｎＣＤなどのｍｉｎ遺伝子の突然変異によって細胞分裂中の細胞極における隔壁の形成の阻害を除去することができ、結果として正常な娘細胞と無核のミニセルの生成に至る（de Boerら, 1992; Raskin及びde Boer, 1999; Hu及びLutkenhaus, 1999; Harry, 2001）。
【０００３】
ｍｉｎオペロン突然変異の他、無核のミニセルはまた、例えば枯草菌（B. subtilis）でのｄｉｖＩＶＢ１におけるものなど、隔壁形成に影響する一定の範囲のその他の遺伝子再配列又は突然変異によっても生じる（Reeve及びCornett, 1975; Levinら, 1992）。ミニセルはまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルにおける変動によっても形成しうる。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は極性分裂及びミニセルの生成をもたらす。同様に、例えば、枯草菌のｓｍｃ突然変異（Brittonら, 1998）、枯草菌のｓｐｏＯＪ欠失（Iretonら, 1994）、大腸菌のｍｕｋＢ突然変異（Hiragaら, 1989）、及び大腸菌のｐａｒＣ突然変異（Stewart及びD'Ari, 1992）など、染色体分離の欠陥から染色体を欠くミニセルが得られる。遺伝子産物はトランス型で提供してもよい。コピー数の多いプラスミドから過剰発現される場合、例えばＣａｆＡは細胞分裂の速度を亢進し、かつ／又は複製後の染色体分配を阻害し（Okadaら, 1994）、その結果、鎖状の細胞と無核のミニセルが形成される（Wachiら, 1989; Okadaら, 1993）。
【０００４】
ミニセルは、特定の条件下で形成され、自発的に放出される他の小胞（ミニセルとは対照的に特定の遺伝子再配列又はエピソーム遺伝子発現により生じるものではない）とは異なる。このような他の小胞の例としては、小さな膜性の小胞である細菌ブレブがある（Dorwardら, 1989）。ブレブは例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）、バチルス（Bacillus）、ボルデテラ（Bordetella）、エシェリキア（Escherichia）、ナイセリア（Neisseria）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）及びシゲラ（Shigella）に由来するいくつかの細菌種で観察されている。細菌ブレブは例えば増殖環境の操作により（Katsuiら, 1982）、また、外的な膜脱安定化剤の使用により（Matsuzakiら, 1997）作り出すことができる。
【０００５】
原核細胞内でのプラスミドの複製は染色体の複製からは独立しているため、上記の異常な細胞分裂の際にプラスミドは正常な娘細胞とミニセルの双方へと分離し得る。従って、組換えｍｉｎ−大腸菌由来のミニセルは染色体以外の全ての細菌細胞成分とともに相当数のプラスミドコピーを含み、それ自体、プラスミドにコードされる遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を研究する際に用いられている。Brahmbhatt (1987)、Harlowら (1995)、及びKiharaら (1996)参照。Brahmbhatt (1987)は、例えば、大腸菌ミニセルが２０ｋｂといった大きなＤＮＡインサートをともなう組換えプラスミドを含むことができ、いずれの染色体ＤＮＡも含まず、かつ、同時に９種類以上の組換えタンパク質を発現し得ることを示した。
【０００６】
最近の特許出願ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号（全体を参照により本明細書に組み入れる）は、治療用核酸分子を含有する組換えのインタクトな（intact）ミニセルを記載している。かかるミニセルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて宿主細胞にオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを送達するための有効なベクターである。従って、これらは、転写及び／又は翻訳時に、疾患を改善又は治療する、あるいは被験体の特定の細胞型、組織又は器官に付随する形質を改変するように機能する核酸分子を導入するために特に有用である。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミニセルの用途には、特に免疫した宿主における炎症反応を誘発する可能性のある、生きた親細菌、遊離エンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸及び細胞内成分を含む）の点で、一般的に高純度のミニセル調製物が必要である。さらに、市販の医薬品におけるミニセルの使用には、国際的な認可医薬品基準のためにミニセルの精製方法が必要である。この目的のためには、ミニセル精製のための従来の方法は一般的に十分なものではない。
【０００８】
従来の技術は、（ａ）低速遠心（親細胞の生物学的負荷を低減するため）、及び（ｂ）グリセロール、スクロース又はパーコールの勾配中での差速沈降を含む。最初の分画的な低速遠心は、典型的に、上清液中のミニセルの５０％〜７０％を残しつつ親細胞を最大１００分の１に低減させる。続いて、その後の差速沈降の２回のサイクルによって、１０６〜１０７個のミニセルあたり約１個の栄養細胞という純度を有するミニセル調製物が得られる。上記のような従来の方法は、Frazer及びCurtiss (1975)により概説されており、またReeve (1979)、Clark-Curtiss及びCurtiss(1983)、並びに米国特許第４，３１１，７９７号（Khachatouriansに対して付与）に記載されている。
【０００９】
従来の精製方法により達成される純度は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける用途の全てにとって適度なものではなく、用途の中には１０６個を超えるミニセル、又はさらに１０１０個のミニセルの用量が必要なこともありうる。上記の汚染率では、これは１回用量あたり１０，０００個の生存親細胞と換算される。このような汚染レベルは、特に癌及びＡＩＤＳ患者などの免疫不全患者においては致命的となりうる。例えば、志賀菌（Shigella dysenteriae）、サルモネラ腸炎菌（Salmonella enteritidis）及びリステリア菌（Listeria monocytogenes）生物に対するＩＤ５０（感染者の５０％における感染用量）は、それぞれ約１０、１０００及び１０である。さらに、以前の研究では、親細胞の汚染レベルは異なる細菌株で変動することが報告されている（Clarke-Curtiss及びCurtiss, 1983）。この点に関し、ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載の遺伝子治療用途では、一定範囲のグラム陰性及びグラム陽性細菌の変異株に由来するミニセルを使用することができ、また生存親細菌細胞汚染が実質的にないミニセルが必要でありうる。従って、従来のミニセル精製方法では、ミニセルの生物医薬用量のｃＧＭＰ（現行の適正製造基準）製造のための品質管理を行うことはできない。
【００１０】
別の欠点として、従来の精製方法で採用されている勾配形成培地（パーコール、スクロース及びグリセロール）はｉｎ ｖｉｖｏでの使用には適合しない。パーコールは毒性であるため、「研究目的のみ」の状況に限定される。スクロースは、勾配を高浸透圧にし、それがミニセルの生理学的変化を引き起こしうる。実際、本発明者は、ミニセルがスクロース勾配中で浸透圧ショックを受け、その結果、構造上変形すると判断している。グリセロールは、粘性が高く、ミニセル懸濁液から完全に除去することが困難である。従って、これらの密度勾配培地は効果的に細胞と細胞小器官又は細胞成分とを分離するが、ヒトの臨床用途に用いられる予定の生体細胞を分離するためには適していない。
【００１１】
従来のミニセル精製技術を改善するためにいくつかの手法が開発されている。１つの手法は、染色体ｒｅｃＡ突然変異を有する親細胞を使用し、低線量の紫外線（ＵＶ）照射による処理を行うものである（Sancarら, 1979）。この手法の原理は、ＵＶ照射が、小さなプラスミドＤＮＡとは対照的に、その標的の大きなサイズのために選択的に染色体ＤＮＡを分解することである。しかしながら、遺伝子治療及びワクチン用途に使用される組換えミニセルは、突然変異を全く有しない必要があり、またＵＶ照射などの非特異的突然変異誘発法は、全てのプラスミドＤＮＡが突然変異しないということを保証するものではない。
【００１２】
ミニセル精製を改善するための別の手法は、例えばアンピシリン若しくはシクロセリンを用いることにより、又はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）要求株に対してＤＡＰを枯渇させることにより、細菌細胞壁の合成を阻害することによって行われる（Clarke-Curtiss及びCurtiss, 1983）。しかしながらこの手法にもまたいくつかの欠点がある。第１に、遺伝子治療に使用される多くの組換えプラスミドは、アンピシリン耐性マーカーを有しており、そのプラスミドを有する親細胞がアンピシリン耐性となることである。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミニセル用途は、一定範囲の種々の細菌種に由来するミニセルを使用するが、この多くはＤＡＰ要求突然変異の影響を受けない可能性がある。第３に、抗生物質の大規模使用は、抗生物質耐性細菌の発生という付随するリスクのため望ましいものではない。
【００１３】
最近、上述の懸念を解決するミニセル精製のための新規な手法が報告された（ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号）。この新規な方法は、クロスフロー濾過（供給流（feed flow）が膜表面と平行である；Forbes,1987）とデッドエンド濾過（供給流が膜表面に対して垂直である）を組み合わせて、１０−７（すなわちミニセル１０７個当たり１個未満の親細胞）を超え、そして１０−９ともなるミニセル純度を達成する。任意により、濾過の組み合わせは、低い遠心力での分画遠心を先行して行い、細菌細胞のある程度の部分を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮してもよい。
【００１４】
この濾過手順は従来のミニセル精製技術に付随する欠点を克服するものであるが、これには制限もある。第１に、クロスフロー濾過によってミニセルの顕著な損失が生じ、製造過程に付加的コストが生じる。さらに、この濾過手順によって得られるミニセル調製物は、ある程度の細菌性エンドトキシンを含有し、これがｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合に低刺激性ショックを引き起こす。最後に、この濾過方法を使用した場合にはバッチ間でミニセル純度が異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、最大のミニセル収量と純度を達成するが、生物学的に適合する培地を用いて細菌ミニセルを精製するための方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の及び他の必要性を解決するため、本発明は、ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供することを含む、細菌ミニセルの精製方法を提供する。この方法は、任意により分画遠心の予備ステップを含んでもよい。
【００１７】
本発明はまた、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心と濾過とを組み合わせる細菌ミニセルの精製方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ミニセルを含有するサンプルを、親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過して、親細菌細胞からミニセルを分離する、ミニセル精製方法を提供する。
【００１９】
また別の態様において、本発明は、（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、（ｂ）該サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供するステップ、続いて（ｃ）該サンプルを濾過して、精製されたミニセル調製物が得られるステップを含むミニセル精製方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は、任意により、精製されたミニセル調製物からエンドトキシンを除去するための１以上のステップ、及び／又は精製されたミニセル調製物を抗生物質で処理するステップを含んでもよい。
【００２１】
最後に、本発明は、上述の方法に従って調製される、精製されたミニセル調製物を提供する。好ましくは、精製されたミニセル調製物は、ミニセル１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、又は１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する。また好ましくは、精製されたミニセル調製物は、免疫された宿主において炎症反応又はエンドトキシンショックを誘発する可能性のあるエンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸、及び細胞内成分を含む）を実質的に含まない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者は、生物学的に適合する培地の使用により従来のミニセル精製が改善されることを確認している。これに関し、本発明者は一般的に使用されている密度勾配培地は、汚染物質からのミニセルの分離には有効であるが、ミニセルに対して有害な作用を及ぼすこともあることを観察している。例えば、従来の方法は一般的に３０％スクロース勾配を使用し、十分な純度を達成するためにはスクロース勾配精製を２〜３回反復して行う必要がある。これによりミニセルは最大２時間にわたって高浸透圧に晒され、ミニセルに対して浸透圧ショックが引き起こされる可能性がある。本発明者は、スクロース勾配により精製されたミニセルが、他の手段により精製されたミニセルと比較して有意に変形することがあることを見出した。おそらくこの変形は、膜の脱安定化（そのためミニセル中に過剰な液体が入る）によって生じる。また、このような膜の脱安定化とそれに付随する膜の多孔性の増大によって、サイトゾルの成分（治療用核酸を含む）がミニセルの外に漏出する可能性もある。
【００２３】
従って１つの態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心により親細菌細胞及び他の汚染物質からミニセルを分離することを含むミニセル精製方法を包含する。遠心分離後、ミニセルバンドを勾配から回収し、任意によりミニセルを密度勾配遠心のさらなるラウンドに供して純度を最大化してもよい。この方法は、ミニセル含有サンプルに対して分画遠心を行う予備ステップをさらに含んでもよい。分画遠心は、低遠心力で行う場合には、ある程度の部分の親細菌細胞を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮しうる。
【００２４】
本明細書において使用する「生物学的に適合する培地」とは、ミニセルの生理又は形態に有害な影響を及ぼさない培地を意味する。好ましくは、生物学的に適合する培地はまた、宿主細胞の生理又は宿主生物の生理に有害な影響を及ぼさない。従って、「生物学的に適合する」の意味は文脈により決定される。例えば、特定の培地はある種のミニセルには生物学的に適合するが、別のものに対しては毒性となることがある。好ましくは、生物学的に適合する培地は、等張性でありかつ非毒性である。
【００２５】
イオジキサノール（５，５’−［（２−ヒドロキシ−１−３プロパンジイル）−ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド］）の滅菌６０％（ｗ／ｖ）水溶液であるＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）は、生物学的に適合する培地の非常に好ましい例の１つである。研究者は、哺乳動物細胞及び細胞小器官、並びに膜小胞、ウイルス、タンパク質、核酸及びリポタンパク質を精製するためにＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ及び他の類似の密度勾配培地を広く使用している。これらの使用は、Density Gradient Media. Applications and Products 2002（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）において概説されている。しかしながら、このような培地は細菌由来のミニセルの精製には以前は使用されていなかった。実際、他の培地がミニセルの生理及び形態に有害な影響を及ぼすという本発明者の観察以前には、ミニセルを精製するための生物学的に適合する培地の必要性さえ認識されていなかった。
【００２６】
ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭを用いた場合、予め形成された勾配を使用することも、又は遠心によりその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で勾配を形成する（自然発生勾配）ことも可能である。予め形成された勾配は、連続的勾配又は不連続勾配でありうる。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭの予め形成された勾配は、所望の濃度の溶液を遠沈管に積層し、管の上部を密封してそれを拡散の間、横にしておくことにより溶液を拡散させることで形成することができる。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭによる等浸透圧密度勾配の調製は、ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ溶液を適当な希釈液で希釈することによる勾配溶液の調製に依存する。希釈液及び浸透圧調整剤（balancer）の選択は、実施者の通常の技能の範囲内である。
【００２７】
別の態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心と濾過ステップとを組み合わせる。例えば、密度勾配遠心は、図１に例示するように連続濾過プロセスに組み込むことができる。１つのそのような連続濾過プロセスはＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載されている。簡単に説明すると、これはクロスフロー濾過（供給流が膜表面と平行である）とデッドエンド濾過（供給流が膜表面に対して垂直である）を組み合わせるプロセスである。任意により、この組み合わせでは、低い遠心力での分画遠心を先行して行い、親細菌細胞のある程度の部分を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮しうる。また任意により、この組み合わせに続いて抗生物質処理を行って、残りの親細菌細胞を死滅させてもよい。
【００２８】
クロスフロー濾過は、フィルター孔径に依存して、親細菌細胞などの大きな汚染物質から、また、細菌ブレブ、遊離エンドトキシン、核酸、細胞破砕物及び過剰な液体などの小さな汚染物質から、ミニセルを分離することができる。大きな汚染物質からミニセルを分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、ミニセルはフィルターを通過するが、大きな細菌細胞は通らないものでなければならない。この目的では、ミニセルが直径約０．４μｍであり、細菌細胞はそれより大きいので、０．４５μｍの孔径が好ましい。ミニセルを小さい汚染物質から分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、汚染物質はフィルターを通過するが、ミニセルは通らないものでなければならない。この目的では、細胞ブレブは直径０．０５μｍ〜０．２μｍの範囲であり、その他のより小さな汚染物質は０．２μｍ未満であるので、０．２μｍの孔径が好ましい。
【００２９】
本発明におけるクロスフロー濾過の効果的な適用には典型的には、大孔径０．４５μｍ前後での少なくとも１つのステップの後、小孔径０．２μｍ前後での少なくとも１つのステップを必要とする。一連のクロスフロー濾過ステップ間又はその最中、ミニセルの回収を最大限にするためにダイアフィルトレーションを行ってもよい。ダイアフィルトレーションでは、容量を一定に保ち、限外濾過膜を用いて所望の粒子（この場合はミニセル）を保持するが、所望ではない小さな溶質と粒子は除去される。
【００３０】
クロスフロー濾過の使用は、細菌培養物などの高濃度の粒状物質を含む懸濁液にも適合し、培養液１リットル当たり１０１１〜１０１３個の細菌及びミニセル集団を含んでいてもよい。フィルターへの付着及び結果としてのミニセルの損失を最小にするため、細菌／ミニセル培養物を希釈してもよい（好ましくは、５倍〜１０倍）。また、希釈により、適宜、低ポンプ圧及び低流速の使用も可能となる。
【００３１】
クロスフロー濾過後に残った残留親細菌細胞を除去するため、デッドエンド濾過を行ってもよい。この目的では、孔径約０．４５μｍのフィルターを用いた少なくとも１回のデッドエンド濾過の使用が好ましい。
【００３２】
一実施形態において、ミニセル精製方法は、生物学的に適合する培地による密度勾配遠心と、約０．２μｍ以下の孔径の少なくとも１つのフィルターを用いる濾過ステップとを組み合わせる。
【００３３】
別の実施形態において、ミニセル精製方法は、生物学的に適合する培地による密度勾配遠心と、約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過ステップとを組み合わせる。
【００３４】
本発明者はまた、濾過の前に、親細菌細胞が糸状体となるように誘導することが、ミニセル精製を有意に改善することを発見した。ミニセル及び親細菌細胞は同じ直径（平均０．４μｍ）を有するため、細菌細胞の中には、細菌細胞の長さが少なくとも１μｍである場合でさえも、辛うじてミニセルを保持するフィルターの孔（例えば０．４５μｍのクロスフロー又はデッドエンドフィルターの孔）を通過することができるものもある。これは、長楕円形の細菌細胞がフィルターに対して垂直に位置する場合に起こる。しかしながら、端と端が連結した細菌細胞からなる細菌細胞の糸状体は、そのようなフィルターを通過することができない。
【００３５】
従って、本発明の別の態様は、濾過前に、汚染親細菌細胞が糸状体を形成するよう誘導することを必要とする。これは、ミニセル懸濁液を、親細胞においてストレス応答を誘導する環境条件に供することにより行う。このような条件は当業者に周知であり、嫌気条件、栄養制限条件及び異常な浸透圧条件が含まれる。高張性培地は、糸状体化の誘導に特に有用である。一例として、ミニセル懸濁液に、５％塩化ナトリウム（ストレス誘導剤）を含むトリプチケース・ソイ・ブロス（増殖培地）を添加することができる。このようなストレス誘導性条件下では、細胞は細胞分裂時に完全に分離することができなくなり、多数の細胞からなる長い細菌糸状体を形成する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、ミニセル純度を高めるために細菌の糸状体化を利用する。従って、一態様において、本発明は、（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、（ｂ）該ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供するステップ、続いて（ｃ）該サンプルを濾過して、精製されたミニセル調製物を得るステップを含むミニセル精製方法を提供する。
【００３７】
本発明者はさらに、エンドトキシンの除去がミニセル調製物を改善することを発見した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスの研究において、本発明者は残留エンドトキシンを含有するミニセル調製物の使用により生じる低刺激性ショックを観察した。従って、有用なミニセル調製物は、エンドトキシンを実質的に含まないことが好ましく、これはエンドトキシンを臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応若しくはエンドトキシンショックを誘導しないと考えられるレベルで含むことを意味する。
【００３８】
エンドトキシンの除去方法は当技術分野で周知である。その方法の一例は、抗リピドＡ抗体で被覆した磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ；Dynal biotech, Oslo, Norway）を使用することである。抗体で被覆した磁性ビーズを試験管中でミニセル懸濁液と混合し、抗体がリピドＡ部分を介して遊離リポ多糖（ＬＰＳ）と結合するようにインキュベートすることができる。懸濁液を含む試験管を続いて磁性スタンド（magnetic stand）に配置して、抗リピドＡ−ＬＰＳ複合体形成磁性ビーズを固定し、ミニセルを回収する。新たなビーズを用いたインキュベーションを複数サイクル行うことにより、所望の純度レベルを達成しうる。
【００３９】
ＬＰＳの深部のコア多糖部分に見出されるエピトープに結合するモノクローナル抗体もまた遊離エンドトキシンを除去するために有用である。ＬＰＳの深部のコア多糖部分は細菌膜の表面上に露出されないと考えられる。従って、ＬＰＳのこの部分に対して作製された抗体は、細菌細胞が結合したＬＰＳには結合しないはずである。使用前に、そのような抗体がＬＰＳの細胞表面に露出した成分とは交差反応しないことを確認するため試験するべきである。
【００４０】
細菌性エンドトキシンが有害な副作用を引き起こす可能性のため、好ましいミニセル精製方法はそれらを除去する１以上のステップを含む。従って、一態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心ステップの後、得られる濃縮ミニセル調製物からエンドトキシンを除去するための１以上のステップを使用するミニセル精製方法を提供する。より好ましくは、方法はさらに上記のように１以上の濾過ステップを含む。
【００４１】
本明細書に記載するミニセル精製技術は、種々の組み合わせで使用して、所望の純度の調製物を得ることができる。好ましい方法は、密度勾配遠心と濾過との組み合わせを含む。また好ましい方法は、親細菌細胞のストレス誘導型糸状体化と、それに続く濾過、及びミニセル調製物からのエンドトキシンの除去を含む。これらの技術の全てを使用する方法の一例（図１に概略を示す）は以下のとおりである。
【００４２】
ステップＡ：ミニセルを生成する細菌細胞培養物の分画遠心。このステップは、２０００ｇにて約２０分間行うことができ、大部分の親細菌細胞を除去するが、上清中にミニセルが残る
ステップＢ：等張性かつ非毒性の密度勾配培地を用いた密度勾配遠心。このステップにより、ミニセルの損失を最小限に抑えて、多くの汚染物質（親細菌細胞を含む）からミニセルが分離される。好ましくはこのステップを精製方法内で反復して行う
ステップＣ：０．４５μｍフィルターによるクロスフロー濾過によりさらに親細菌細胞汚染を低減する
ステップＤ：残留親細菌細胞のストレス誘導型糸状体化。これは、ミニセル懸濁液をいくつかのストレス誘導性環境条件のいずれかに供することにより行いうる
ステップＥ：抗生物質処理を行って親細菌細胞を死滅させる
ステップＦ：クロスフロー濾過を行って、小さな汚染物質（膜ブレブ、膜断片、細菌破砕物、核酸、培地成分などを含む）を除去し、ミニセルを濃縮する。０．２μｍフィルターを用いて、小さな汚染物質からミニセルを分離し、そして０．１μｍフィルターを用いてミニセルを濃縮しうる
ステップＧ：デッドエンド濾過を行って死滅した糸状細菌細胞を排除する。このステップでは０．４５μｍフィルターを用いうる
ステップＨ：ミニセル調製物からのエンドトキシンの除去。このステップでは抗リピドＡで被覆した磁性ビーズを使用しうる。
【００４３】
当業者であれば、本明細書に概説する原理と一致するように、これらのステップの変形を使用し、追加の精製ステップを組み込むことができる。
【００４４】
細菌ミニセルを精製するための上述した方法は、ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載のようなｉｎ ｖｉｖｏにおける用途に有用な精製されたミニセル調製物を提供する。これらの調製物は、ミニセル１０７個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、好ましくはミニセル１０８個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、より好ましくはミニセル１０９個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、さらにより好ましくはミニセル１０１０個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、なおより好ましくはミニセル１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する。好ましくは、汚染親細菌細胞はいずれも死滅し、これらの調製物は生存親細菌細胞を何ら含有しない。また好ましくは、精製されたミニセル調製物はエンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸及び細胞内成分を含む）を実質的に含まない。既に説明したように、ミニセル調製物は、その調製物が臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応若しくはエンドトキシンショックを誘導しないレベルのエンドトキシンを含有する場合に、エンドトキシンを実質的に含まない。同様に、ミニセル調製物は、それが臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応を誘導しないレベルの細胞破砕物を含有する場合に、細胞破砕物を実質的に含まない。
【００４５】
以下の例示的な例の参照は、本発明のより完全な理解を助けるためのものである。
【実施例１】
【００４６】
本発明の技術を用いない濾過法の不安定性
本実施例は、本発明の技術を用いない、ミニセルを精製するための濾過法の使用が不安定な結果を生じうることを例示する。
【００４７】
ネズミチフス菌（S. typhimurium）、大腸菌（E. coli）及び赤痢菌（Shigella flexneri）のミニセル産生変異細菌株を、細菌細胞及びミニセルのサイズを測定するために走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により解析する。高解像度走査型電子顕微鏡法のために、以下の方法に従う。細菌培養物はトリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）（BBL brand、Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australiaより購入）中で増殖させる。培養液は製造業者の説明書に従い３０ｇ／ｌで調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。液体培養物を３７℃にて振盪型インキュベーター中で一晩増殖させる。溶液を交換するため、細胞を１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、そしてボルテックス・ミキサーを用いて細胞を新しい試薬（以下に記載）中に再懸濁する。これにより、細胞からイオン及び生体材料を洗い落とし、細胞を少量の蒸留水に懸濁した状態にする。試薬の順番は、次の通りである：（ａ）蒸留水１ｍｌで再ペレット化する、（ｂ）蒸留水１ｍｌで再懸濁する、（ｃ）２５０μｌを清潔な真鍮標本プレートに載せる、（ｄ）３０℃にて一晩乾燥させる、（ｅ）顕微鏡観察の直前に、Ｘｅｎｏｓｐｕｔ無塵真空スパッタコーター中にて２ｎｍの金属クロムでコーティングする。コーティングした標本を、３キロボルトのビームエネルギーでＨｉｔａｃｈｉ Ｓ−９００電界放射型走査電子顕微鏡により検査する（University of New South Wales, NSW, Australia）。様々な倍率でのデジタル画像を、ＩｍａｇｅＳｌａｖｅデジタイザーを用いて記録する。
【００４８】
結果（ネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−株の代表的な画像を、図２Ａ〜Ｄに示してある）は、親細菌細胞は長さ０．９μｍ〜４μｍ、幅０．４μｍ〜０．５μｍの範囲であることを示している。図１の左側に概略を示した濾過ステップの後、いくつかのバッチでは残存する細菌の汚染がみられる。汚染細菌はサイズが小さく、すなわち長さが約０．９μｍである。このことは、ミニセル（図２Ａ）と大体同じ幅の小さいサイズの一部の細菌が、０．４５μｍクロスフローフィルター及びデッドエンドフィルターを通して漏出することを示している。
【実施例２】
【００４９】
小細菌の除去：細菌糸状体への変換
本実施例は、濾過に先立って細菌を糸状体へと誘導することが、ミニセル精製プロセスを改善することを実証する。
【００５０】
デッドエンドフィルターの孔径０．４５μｍよりも十分に大きい残存小サイズ親細菌を作り出すことにより、実施例１に記載の問題を解決するように研究をデザインした。細菌増殖環境中でのストレス誘導条件は、細菌細胞分裂時の完全な分離を妨げ、細菌糸状体を生じさせる。
【００５１】
本研究は、高張性細菌増殖培地（ストレス誘導剤）がネズミチフス菌及び大腸菌のミニセル産生細菌株の糸状体化を安定に誘導することを実証する。全ての細菌は、−８０℃で維持したグリセロールストックから増殖させる。ネズミチフス菌及び大腸菌株は、トリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）（BBL brand、Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australiaより購入）中で増殖させる。培養液は製造業者の説明書に従い３０ｇ／ｌで調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。液体培養物を３７℃にて振盪型インキュベーター中で一晩増殖させる。一晩培養した細菌培養物を新たなＴＳＢ中に１：５，０００で希釈し、ＯＤ６００ｎｍが０．２に到達するまで増殖させる。培養物を滅菌バイアル中の１０本の５ｍｌアリコートに分け、予めオートクレーブした滅菌ＮａＣｌを、最終ＮａＣｌ濃度（ｗ／ｖ）が０％（対照）、２％、３％、４．５％、５％、５．５％、６％、７％及び８％になるように各バイアルに加える。培養物を３７℃にて静置状態でインキュベートし、２時間、４時間、８時間及び２４時間においてサンプルを採取する。０時間の対照サンプルも、顕微鏡観察用に採取する。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、細菌／ミニセルペレットを蒸留水に再懸濁する。各サンプルの液滴をガラススライド上に置き、風乾し、加熱固定する。各サンプルを、９５％アルコール洗浄及び引き続くグラム・サフラニン液への１分間の浸漬によりグラム染色する。スライドを、ＬｅｉｃａモデルＤＭＬＢ光学顕微鏡により可視化し、それと共にＬｅｉｃａ ＤＣカメラ及びＬｅｉｃａ ＩＭ画像処理ソフトウェアにより画像解析を行う。サンプルは、倍率４０×又は１００×（油浸）にて観察する。
【００５２】
上記実験を４回繰り返し、結果の信頼性を確認し、一連の対照を用いた変型も行う。
【００５３】
結果（図３Ａ〜Ｂ及び４Ａ〜Ｂ）は、増大したＮａＣｌ濃度では、細菌細胞は端と端をつないだ２〜２０個の球状桿菌よりなる糸状体を形成することを表している。ＮａＣｌ濃度２％〜３％の範囲内では、糸状体化はまちまちであり（図３Ａ及び４Ａ）、より長いインキュベーション時間の後でもいくつかの細菌細胞は糸状体を形成しない。しかしながら、４％〜５％ＮａＣｌでは、細菌細胞は確実に糸状体に変化する（図３Ｂ及び４Ｂ）。４％〜５％ＮａＣｌでの糸状体化のための最適なインキュベーション時間は約４時間であり、２４時間までのさらなるインキュベーションは一般に必要ではない。５．５％〜８％のより高い塩濃度は糸状体形成を減少させる。ＴＳＢ寒天平板上での希釈液播種により各サンプルの生存細菌数を測定する予備的研究は、高い塩濃度（５．５％〜８％ＮａＣｌ）では相当数の細菌細胞が死滅することを示唆し、これがこれらのＮａＣｌ濃度において減少した糸状体化が観察されることの理由かもしれない。
【００５４】
細菌細胞生存率に対する種々のＮａＣｌ濃度の影響の最終的な研究は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ細菌生存率キット（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を用いて行う。このキットでは、緑色蛍光ＳＹＴＯ（登録商標）９染色及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム染色の２種類の核酸染色を用いる。これらの染色は健康な細菌細胞に浸透する能力に差がある。ＳＹＴＯ９染色は生存細菌と死滅細菌の両者を標識する。一方、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は損傷した膜を有する細菌のみに浸透し、両方の色素が存在する場合にはＳＹＴＯ９の蛍光を減少させる。従って、無傷の膜を有する生存細菌は緑色の蛍光を発し、損傷した膜を有する死滅細菌は赤色の蛍光を発する。塩誘導型糸状体化についての上述の実験を繰り返し、種々のＮａＣｌ濃度についての０時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間サンプルを取得する。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、細菌／ミニセルペレットを１００μｌのＢＳＧに再懸濁する。ＳＹＴＯ９／ＰＩの５０／５０混合液の０．５μｌを各サンプルに添加し、１５分間インキュベートする。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、ペレットを１００μｌの蒸留水に再懸濁する。各サンプルの液滴をガラススライド上に置き、風乾し、ＢａｃＬｉｇｈｔ封入オイルの油滴で覆う。各サンプルを、ＬｅｉｃａモデルＤＭＬＢ光学顕微鏡を用いて可視化し、それと共にＬｅｉｃａ ＤＣカメラ及びＬｅｉｃａデジタル画像取得ソフトウェアにより画像解析を行う。サンプルは、倍率４０×又は１００×（油浸）にて観察する。
【００５５】
結果（カラー写真は示していない）は、５．５％及びそれより高いＮａＣｌ濃度においては、相当数の細菌細胞が赤色の蛍光を発し（死滅細胞）、さらに７％及び８％のＮａＣｌ濃度では、細菌細胞のほとんど全てがインキュベーションの２時間のうちに死滅することを表している。この結果は、４時間のインキュベーション時間では、４％〜５％ＮａＣｌが糸状体化を実現する最大限界であることを示す。２時間のインキュベーション後、生存細菌細胞は糸状体へと変化する。しかしながら、インキュベーション時間が増加すると糸状体は赤色の蛍光を発し、このことは、４％〜５％ＮａＣｌでさえも細菌細胞にとっては十分なストレスであること、及びそれらが数世代の増殖の後に死滅し始めることを示唆している。このストレスは細菌細胞分裂中の完全な分離を妨げるようなので、細菌糸状体を形成させるのに足りる。このデータはまた、より高い塩濃度では糸状体化が達成されないことの理由を説明する。すなわち、該ストレスは毒性であり、細菌増殖及び細胞分裂を妨げ、さらに細胞死を引き起こす。
【実施例３】
【００５６】
インタクトなミニセルを親細菌及び他の汚染物質と分離するための生物学的に適合する密度勾配培地の使用
細菌細胞／ミニセル培養物の分画遠心後、顕著な数の細菌細胞汚染物質を、生物学的に適合する培地を用いた密度勾配遠心により除去した。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）（イオジキサノール（５，５’−［（２−ヒドロキシ−１−３プロパンジイル）−ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド］）の滅菌６０％（ｗ／ｖ）水溶液）は生物学的に適合する培地を構成する。６％〜１２％勾配を２５ｍｌポリプロピレン透明遠沈管（Livingstone International Pty Ltd, Sydney, Australia）中に調製し、ミニセル／細菌細胞懸濁液１ｍｌを各勾配の上に重層した。遠沈管を２，０００ｇにて２０分間遠心した。２３本の１ｍｌサンプルを遠沈管より回収し、倍率１００×油浸対物レンズを用いて光学顕微鏡法により解析した。結果では、図５Ａに示したように３つの主要な層が見られた。最上層は主にミニセルを含有し、細菌細胞及び細菌ブレブで汚染されていた。２番目に低い層は主として細菌細胞を有していたが、それらはミニセルよりも約２〜３倍長いようであった。ペレットは主に細菌細胞を有していた。
【００５７】
粗ミニセル懸濁液（上方のバンド；図５Ａ）を回収し、エッペンドルフチューブ中で１３，２００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。ペレットを２ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁し、上記と同様にＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。結果（図５Ｂ）では、比較的小さな細菌ペレットがあり、中間のバンドはずっと明瞭になり、そしてミニセルバンドがはっきりと現れた。遠沈管中の全領域（容量２ｍｌずつ）を上記と同様に光学顕微鏡法で解析し、ミニセルバンドがほとんど細菌汚染物を有していないようであったこと以外は、結果は同様であった。ミニセルバンドを前と同じく回収し、上記と同様に３度目のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。この処理は明瞭なバンドをもたらし（図５Ｃ）、顕微鏡により解析すると、細菌汚染物をほとんど有さず、大部分がミニセルであることが明らかになった。この実験を１０回反復し、同様の結果を得た。
【実施例４】
【００５８】
精製されたインタクトなミニセル調製物からの遊離エンドトキシンの顕著な減少
グラム陰性細菌のエンドトキシンはリポ多糖（ＬＰＳ）分子であり、リピドＡ、コアオリゴ糖及びＯ−多糖と呼ばれる３つの異なるドメインを有している。リピドＡ及びコアオリゴ糖はエンドトキシン・コアを構成し、種々のグラム陰性細菌種間で比較的保存されている。リピドＡはエンドトキシンの毒性部分であり、全てのＬＰＳでコアオリゴ糖に共有結合している（Reitschelら, 1991）。
【００５９】
残存する遊離エンドトキシンを、以下のように精製ミニセル調製物から除去した。プロテインＧで被覆した磁性ビーズ（Dynal Biotech, Oslo, Norway）を、ヤギ抗リピドＡポリクローナル抗体（Biodesign, Saco, Maine, USA）にコンジュゲートした。この抗体はネズミチフス菌ＬＰＳを含むある範囲の種々のグラム陰性細菌ＬＰＳ種と交差反応性である。コンジュゲート反応はダイナビーズ−プロテインＧ（０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ中で３回洗浄した）を抗リピドＡ抗体と共にインキュベートすることにより行った（穏やかに混合しながら４℃にてＯ／Ｎ）。過剰な抗体は、ダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ中で３回洗浄することにより除去した。コンジュゲートを３００μｌの同バッファー中に再懸濁し、５０μｌを、遊離エンドトキシン除去のために５００μｌの精製ミニセル懸濁液を処理するために用いた。共インキュベーションを４℃にて１時間行い、続いてチューブを磁石（Ｄｙｎａｌ）上に置き、ミニセル上清を回収した。この処理を新たなダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて３回行い、残存遊離エンドトキシンが最大限除去されるようにした。
【実施例５】
【００６０】
ミニセル精製手順中のインタクトなミニセル、細菌細胞及びエンドトキシン量の計測
この実験は、ミニセル回収量、親細菌数の減少及び遊離エンドトキシンの減少に関して、ミニセル精製手順の動態を確認するためにデザインした。以下に概説する完全な精製手順を３回行い、１２ステップの各々にてサンプルを回収した。各サンプルを、フローサイメトリー並びに寒天平板上での生存数カウントにより、ミニセル及び細菌細胞数について解析した。エンドトキシン単位（ＥＵ）も、ＬＡＬアッセイ（Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA, USA）により各サンプルについて測定し、これはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ（Sydney, Australia）により行われた。完全な精製プロセスを以下に簡単に説明する。
【００６１】
高コピー数プラスミド（核酸マーカー）を保持する組換えネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−株を、トリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）２５ｍｌ中で振盪しながら３７℃にて一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。その後、１ＬのＴＳＢをそれぞれ含有する６本のフラスコにＯ／Ｎ培養物２ｍｌを接種し、振盪しながら３７℃にてさらにインキュベートした（サンプル１）。培養物を、有意な数の細菌細胞を沈殿させるために卓上遠心機中で２０００ｇにて２０分間、分画遠心した。上清（サンプル２）を回収し、０．１μｍクロスフローフィルターに通すことにより濃縮した。懸濁液を、エッペンドルフ遠心機中で１３，２００ｒｐｍにて６０分間遠心分離することによりさらに濃縮し、ミニセル／細菌細胞ペレットを１６ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁した（サンプル３）。１６本の密度勾配（６％〜１２％）を、生物学的に適合する培地であるＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）を用いて２５ｍｌポリプロピレン透明遠沈管（Livingstone International Pty Ltd, Sydney, Australia）中に調製し、ミニセル／細菌細胞懸濁液１ｍｌを各勾配の上に重層した。遠沈管を２，０００ｇにて２０分間遠心し、ミニセルバンド（図５Ａ）を注射器で各遠沈管の上部から回収した。約２４ｍｌの粗ミニセル懸濁液（サンプル４）を回収し、これをエッペンドルフチューブ中で、１３，２００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。ペレットを１２ｍｌの滅菌ＢＳＧ中に再懸濁し、上記と同様にして１２のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。ミニセルバンド（図５Ｂ）を前と同じく回収し（サンプル５）、上記と同様にして４のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。この処理により各遠沈管中に明瞭な散乱性のミニセルバンド（図５Ｃ）がもたらされ、それらを回収した（サンプル６）。ミニセル懸濁液を１ＬのＴＳＢに添加し、汚染細菌細胞を再活性化するために、静置状態で３７℃にて２時間インキュベートした（サンプル７）。ＮａＣｌ（終濃度５％ｗ／ｖ）を懸濁液に加えて、生存細菌細胞にストレスを与え、細胞分裂中の隔壁形成の過程を阻害した。懸濁液を静置状態で３７℃にて２時間インキュベートし、汚染細菌細胞の大部分が細菌糸状体に変化するようにした（サンプル８）。広範なスペクトルの抗生物質であるゲンタマイシン（２００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を懸濁液に添加し、３７℃にて一晩インキュベートして全ての生存細菌細胞を死滅させた（サンプル９）。バッファー交換のために懸濁液を０．２μｍクロスフローフィルターに通し、懸濁液を滅菌ＢＳＧ中に再構築した（サンプル１０）。このプロセスにより、例えば遊離エンドトキシン、溶解した細菌及びミニセル断片、核酸並びにＴＳＢの栄養素などの０．２μｍよりも小さな全ての汚染物質が除かれた。そして０．４５μｍデッドエンドフィルターに溶液を通すことにより、ミニセル懸濁液に由来する細菌糸状体を除去した。１００ｋＤａクロスフローフィルターに通すことで懸濁液を容量５０ｍｌまで濃縮し、その後１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離してミニセルをペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁した（サンプル１１）。残存する遊離エンドトキシンは、実施例４に記載したのと同様に抗リピドＡ抗体にコンジュゲートしたダイナビーズ−プロテインＧを用いて除去した。これによりサンプル１２を得た。
【００６２】
ミニセル及び細菌細胞の計数は、以下のようにフローサイトメトリーにより行った。ミニセル精製手順からの各サンプルを約１０８〜１０１０個のミニセルを有するように大まかに希釈し、サンプルの２５０μｌを３．３μＭ Ｓｙｔｏ９緑色蛍光色素（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と共にインキュベートした。この色素は細菌細胞の無傷の膜及び損傷した膜を透過し、内在性の核酸に結合して、緑色蛍光を発する細菌細胞をもたらす。本発明者らの予備的研究では、この色素がミニセル膜をも透過し、緑色蛍光を発する組換えミニセルをもたらすことが示された。全てのサンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）により、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ取得・解析ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてカウントした。カウントは、緑色蛍光「ＦＬ１」トリガー（５１５〜５４５ｎｍを検出する）により、３７Ｖの閾値を用いて中間流速にて３０秒間にわたって行った。ＦＬ１のＰＭＴ電圧は５５０Ｖに設定した。側方散乱光「ＳＳＣ」のＰＭＴ電圧は５２４Ｖに設定した。適当なサンプル希釈では３０秒当たり５０００〜５００００粒子の値が返され、最終的な粒子数は５回の反復実験の平均とした。ミニセルと細菌とはＳＳＣ及び緑色蛍光におけるそれらの差異に基づいて区別した。
【００６３】
結果（図６Ａ〜Ｃ）から、精製プロセスの開始時には６Ｌの細菌／ミニセル培養物がミニセル約５×１０１２個を有しており（図６Ａ）、精製手順を通じて段階的な逸失が起こって最後には約５×１０１０個の回収量でミニセルが得られることが示された。
【００６４】
手順の開始時での親細菌細胞数（図６Ｂ）はミニセル数と同等、すなわち細菌約５×１０１２個であった。精製プロセスは、抗生物質処理の時点で１０００倍を超える細菌細胞の排除をもたらした。この時点で、ミニセル：細菌細胞の比は１００：１を上回り、従ってフローサイトメトリー計測では解析したサンプル中に細菌細胞を検出することができなかった。抗生物質処理後では、平板生存数アッセイにより解析された全てのサンプルで、生存細菌細胞が全く存在しないことが明らかになった。最終精製サンプル中のゲノムＤＮＡの存在についての定量的ＰＣＲ解析により、１０１１個の精製ミニセル中、親細菌細胞（死滅細胞）は１個未満であることが示された。
【００６５】
各サンプル中の遊離エンドトキシン計測（図６Ｃ）は、精製工程の開始時にサンプルが約１０９エンドトキシン単位（ＥＵ）を有していたことを示した。ＥＵは３回目の勾配精製ステップ後には約１０６にまで減少した（図６Ｃ；サンプル６）。ミニセル／残存細菌細胞懸濁液を塩誘導型糸状体化のためにＴＳＢ中でインキュベートするとＥＵは再び増加したが（図６Ｃ；サンプル７〜９）、続く精製ステップにおいて１０４〜１０５ＥＵまで減少した。
【００６６】
水溶液中では精製したＬＰＳは遊離ＬＰＳとして、またミセルとして見出されうることが知られている。これはリピドＡ部分が疎水性であり糖質部分（コア多糖及びＯ−多糖）は親水性であるためである。これにより、疎水性リピドＡは埋入され、親水性多糖が水性環境と相互作用しているミセルが生じる。これらのミセルは様々な分子サイズの範囲で存在することが知られており、数百万ダルトン程にも大きなものでありうる。細菌細胞又はミニセルに結合したＬＰＳは、リピドＡ部分が二重層膜中に埋もれていて、エンドトキシンではない。遊離ＬＰＳは、リピドＡ部分が哺乳動物細胞膜と相互作用することができ、それにより深刻な内毒素作用をもたらすので、エンドトキシンである。ＬＰＳミセルがｉｎ ｖｉｖｏでエンドトキシンであるかどうかは知られていない。
【００６７】
本発明のミニセルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療用途に対して有用であり、従って当該精製手順は遊離ＬＰＳ、すなわちエンドトキシンの除去に焦点を絞ったものである。しかしながら、ＬＡＬアッセイはＬＰＳの３つの形態、すなわち遊離型（エンドトキシン）、ミセル型（以下の研究はこれがエンドトキシンでないことを示唆している）及びミニセル表面結合型（エンドトキシンでない）の全てを測定する。一方で、抗リピドＡ抗体は遊離ＬＰＳのみに結合し、それを除去するようであり、なぜなら該抗体の抗原結合部位がミセル中又はインタクトなミニセル中のリピドＡに到達し得ない（抗原部位が埋もれているため）からである。
【実施例６】
【００６８】
精製ミニセル調製物中の遊離エンドトキシンレベルの測定
上記のことを実証するために、ＬＡＬアッセイによってＬＰＳのどの形態が実際に測定されるのかを確認すべく、一連のさらなる実験を行った。精製ミニセル調製物を、新たに調製したダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて遊離ＬＰＳを除去するために、順次に５回処理し、各精製段階からの以下のサンプルをＬＡＬアッセイにより解析した；（ａ）精製ミニセル懸濁液（ＬＰＳの３つの形態全て（すなわち遊離型、ミセル型及びミニセル表面膜結合型）を有すると予測される）、（ｂ）回収されたダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲート（おそらく結合した遊離型ＬＰＳを有する）、（ｃ）ダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡ処理後に１３，２００ｒｐｍでの２０分間のミニセル懸濁液の遠心分離により得られた上清（遊離型は抗リピドＡにより取り除かれているはずであり、ミニセル結合ＬＰＳはミニセルペレット中に見出されるはずなので、これはおそらくミセル型ＬＰＳを有している）、（ｄ）（ｃ）から得られたペレット（滅菌発熱物質不含ＢＳＧ中に再懸濁した）。対照の群、例えば抗リピドＡ抗体が遊離型ＬＰＳに結合してそれを除くことを確かめるためのダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて処理した精製ネズミチフス菌ＬＰＳ（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA）；希釈液が観察されるＥＵに寄与しないことを確かめるための希釈液サンプル等、も含められた。
【００６９】
結果（表１、下掲）は、予想されたように、ＬＡＬアッセイにより測定されるＥＵの大部分がミニセル表面膜結合ＬＰＳ（Ｄ列）に伴うものであり、これは実施例７のｉｎ ｖｉｖｏ研究で見られるようにエンドトキシンでない。この結果は、図６Ｃ（サンプル１２）において見られた結果と類似する。上清（Ｃ列）もまた、顕著な量のＥＵを有し、各サンプルはダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて既に処理されていたため、これはおそらくＬＰＳのミセル型である。興味深い結果がＢ列において見られ、Ｂ列は抗リピドＡ抗体処理が行われる各回で、精製ミニセル調製物において見出され得る遊離型ＬＰＳの量は２０ＥＵ〜４５ＥＵのみであることを示した。この値は非経口投与医薬品の１回放出についての現行のエンドトキシン基準（３５０ＥＵ／用量）を大いに下回る（Grandics, 2000）。
【表１】
【実施例７】
【００７０】
精製ミニセルが顕著なレベルのエンドトキシンを有していないことのｉｎ ｖｉｖｏにおける確認
精製ミニセル調製物を、上記のダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲート手順を用いてエンドトキシン除去のために順次に（３回）処理した。１０９個の精製ミニセルを有する調製物の各々（すなわち、エンドトキシン除去前、並びに１回目の、２回目の、及び３回目のエンドトキシン除去ステップ後）を６週齢メス無胸腺ヌードマウス（１群当たり５匹）の尾静脈に注射した。本実施例において用いたマウスはＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Perth, WA, Australia）から購入し、全ての動物実験は実験動物の管理及び使用の指針に従い、動物倫理委員会の承認を得て行った。実験は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ Ｐｔｙ Ｌｔｄ（Sydney, NSW, Australia）のＮＳＷ州農業省認可小動物施設中で行った。マウスを４週間にわたって注意深く観察し、あらゆる内毒素ショックの兆候（例えば発熱、昏睡、食欲及び体重の低下、並びにそれに続く死亡）を記録した。その結果、エンドトキシン除去手順なしでは、大部分のマウスがすぐに発熱し、最初の１２時間以内に昏睡状態に陥ることが示された。動物のほとんどは２週間以内に死亡した。１回目のエンドトキシン除去手順後のミニセルを投与されたマウスはより安定であり、最初の２４時間、軽い発熱を示した。しかしながら、マウスは３日後には回復した。２回及び３回のエンドトキシン除去を行った精製ミニセルを投与されたマウスは有害な副作用を全く示さず、健康なままであった。このことは、ミニセルを哺乳動物宿主体内での医薬用途に用いる場合には、遊離エンドトキシン除去の新規なステップが必須であることを示唆した。
【００７１】
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のミニセル精製技術を他のミニセル精製手順と統合することができる一つの方法を示す。
【図２】ネズミチフス菌（S. typhimurium）のｍｉｎＣＤＥ−細菌株（一定範囲の異なるサイズ）及びこの株に由来するミニセルの走査電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）小さなサイズの親細菌（長さ１．１μｍ）及びミニセル（直径０．４μｍ）を示す。（Ｂ）大きな親細菌（長さ１．３２μｍ）を示す。（Ｃ）さらに大きな親細菌（長さ１．６μｍ）を示す。（Ｄ）親細菌とミニセルとの混合物を示し、前者は長さ１μｍ〜４μｍの範囲である。
【図３Ａ】種々の時間にわたる種々のＮａＣｌ濃度を用いたインキュベーションに引き続く親ネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株の糸状体化を示す。
【図３Ｂ】ＮａＣｌの不在下で４時間にわたり増殖培地中でインキュベートしたネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株（左側の写真）と、５％ＮａＣｌの存在下での４時間のインキュベーション後に形成された細菌糸状体（右側の写真）のサイズを比較する蛍光顕微鏡写真を示す。
【図４Ａ】種々の時間にわたる種々のＮａＣｌ濃度を用いたインキュベーションに引き続く親大腸菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株の糸状体化を示す。
【図４Ｂ】ＮａＣｌの不在下で４時間にわたり増殖培地中でインキュベートした大腸菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株（左側の写真）と、５％ＮａＣｌの存在下での４時間のインキュベーション後に形成された細菌糸状体（右側の写真）のサイズを比較する蛍光顕微鏡写真を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、実施例３において説明するように、密度勾配遠心に生物学的に適合する培地（例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ）を用いたミニセルの３回の連続精製段階を示す。最初の密度勾配遠心により分離された粗ミニセル調製物（図５Ａ）によって、汚染物質、すなわち顕著な細菌ペレット及びミニセルと細菌ペレットとの間にバンドを形成する比較的小さなサイズの細菌細胞が明らかとなった。ミニセルバンドを回収し、２回目のＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配（図５Ｂ）によって処理したところ、より明りょうなミニセルバンドと、小さな細菌細胞のより鮮明なバンドと、無視できる程度の細菌ペレットが明らかとなった。ミニセルバンドを回収し、３回目のＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配（図５Ｃ）によって処理したところ、ミニセルの有意な精製が明らかとなった。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。精製プロセスにおいてサンプルを分析するために回収した種々の段階をｘ軸に示す。実験の詳細は実施例５に記載する。各値は３つのサンプルの平均であり、各サンプルは別々の精製プロセスから回収した。標準誤差バーを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インタクトな細菌ミニセルを精製するための薬学的に適合可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミニセルは、ＤＮＡの分離をともなう細胞分裂の二分裂の際の協調を妨げることによって生じさせた大腸菌（E. coli）又はその他の細菌細胞の無核形態である。原核生物の染色体複製は、細胞中央の隔壁の形成をともなう正常な二分裂と連動している。大腸菌では、例えば、ｍｉｎＣＤなどのｍｉｎ遺伝子の突然変異によって細胞分裂中の細胞極における隔壁の形成の阻害を除去することができ、結果として正常な娘細胞と無核のミニセルの生成に至る（de Boerら, 1992; Raskin及びde Boer, 1999; Hu及びLutkenhaus, 1999; Harry, 2001）。
【０００３】
ｍｉｎオペロン突然変異の他、無核のミニセルはまた、例えば枯草菌（B. subtilis）でのｄｉｖＩＶＢ１におけるものなど、隔壁形成に影響する一定の範囲のその他の遺伝子再配列又は突然変異によっても生じる（Reeve及びCornett, 1975; Levinら, 1992）。ミニセルはまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルにおける変動によっても形成しうる。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は極性分裂及びミニセルの生成をもたらす。同様に、例えば、枯草菌のｓｍｃ突然変異（Brittonら, 1998）、枯草菌のｓｐｏＯＪ欠失（Iretonら, 1994）、大腸菌のｍｕｋＢ突然変異（Hiragaら, 1989）、及び大腸菌のｐａｒＣ突然変異（Stewart及びD'Ari, 1992）など、染色体分離の欠陥から染色体を欠くミニセルが得られる。遺伝子産物はトランス型で提供してもよい。コピー数の多いプラスミドから過剰発現される場合、例えばＣａｆＡは細胞分裂の速度を亢進し、かつ／又は複製後の染色体分配を阻害し（Okadaら, 1994）、その結果、鎖状の細胞と無核のミニセルが形成される（Wachiら, 1989; Okadaら, 1993）。
【０００４】
ミニセルは、特定の条件下で形成され、自発的に放出される他の小胞（ミニセルとは対照的に特定の遺伝子再配列又はエピソーム遺伝子発現により生じるものではない）とは異なる。このような他の小胞の例としては、小さな膜性の小胞である細菌ブレブがある（Dorwardら, 1989）。ブレブは例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）、バチルス（Bacillus）、ボルデテラ（Bordetella）、エシェリキア（Escherichia）、ナイセリア（Neisseria）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）及びシゲラ（Shigella）に由来するいくつかの細菌種で観察されている。細菌ブレブは例えば増殖環境の操作により（Katsuiら, 1982）、また、外的な膜脱安定化剤の使用により（Matsuzakiら, 1997）作り出すことができる。
【０００５】
原核細胞内でのプラスミドの複製は染色体の複製からは独立しているため、上記の異常な細胞分裂の際にプラスミドは正常な娘細胞とミニセルの双方へと分離し得る。従って、組換えｍｉｎ−大腸菌由来のミニセルは染色体以外の全ての細菌細胞成分とともに相当数のプラスミドコピーを含み、それ自体、プラスミドにコードされる遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を研究する際に用いられている。Brahmbhatt (1987)、Harlowら (1995)、及びKiharaら (1996)参照。Brahmbhatt (1987)は、例えば、大腸菌ミニセルが２０ｋｂといった大きなＤＮＡインサートをともなう組換えプラスミドを含むことができ、いずれの染色体ＤＮＡも含まず、かつ、同時に９種類以上の組換えタンパク質を発現し得ることを示した。
【０００６】
最近の特許出願ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号（全体を参照により本明細書に組み入れる）は、治療用核酸分子を含有する組換えのインタクトな（intact）ミニセルを記載している。かかるミニセルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて宿主細胞にオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを送達するための有効なベクターである。従って、これらは、転写及び／又は翻訳時に、疾患を改善又は治療する、あるいは被験体の特定の細胞型、組織又は器官に付随する形質を改変するように機能する核酸分子を導入するために特に有用である。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミニセルの用途には、特に免疫した宿主における炎症反応を誘発する可能性のある、生きた親細菌、遊離エンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸及び細胞内成分を含む）の点で、一般的に高純度のミニセル調製物が必要である。さらに、市販の医薬品におけるミニセルの使用には、国際的な認可医薬品基準のためにミニセルの精製方法が必要である。この目的のためには、ミニセル精製のための従来の方法は一般的に十分なものではない。
【０００８】
従来の技術は、（ａ）低速遠心（親細胞の生物学的負荷を低減するため）、及び（ｂ）グリセロール、スクロース又はパーコールの勾配中での差速沈降を含む。最初の分画的な低速遠心は、典型的に、上清液中のミニセルの５０％〜７０％を残しつつ親細胞を最大１００分の１に低減させる。続いて、その後の差速沈降の２回のサイクルによって、１０６〜１０７個のミニセルあたり約１個の栄養細胞という純度を有するミニセル調製物が得られる。上記のような従来の方法は、Frazer及びCurtiss (1975)により概説されており、またReeve (1979)、Clark-Curtiss及びCurtiss(1983)、並びに米国特許第４，３１１，７９７号（Khachatouriansに対して付与）に記載されている。
【０００９】
従来の精製方法により達成される純度は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける用途の全てにとって適度なものではなく、用途の中には１０６個を超えるミニセル、又はさらに１０１０個のミニセルの用量が必要なこともありうる。上記の汚染率では、これは１回用量あたり１０，０００個の生存親細胞と換算される。このような汚染レベルは、特に癌及びＡＩＤＳ患者などの免疫不全患者においては致命的となりうる。例えば、志賀菌（Shigella dysenteriae）、サルモネラ腸炎菌（Salmonella enteritidis）及びリステリア菌（Listeria monocytogenes）生物に対するＩＤ５０（感染者の５０％における感染用量）は、それぞれ約１０、１０００及び１０である。さらに、以前の研究では、親細胞の汚染レベルは異なる細菌株で変動することが報告されている（Clarke-Curtiss及びCurtiss, 1983）。この点に関し、ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載の遺伝子治療用途では、一定範囲のグラム陰性及びグラム陽性細菌の変異株に由来するミニセルを使用することができ、また生存親細菌細胞汚染が実質的にないミニセルが必要でありうる。従って、従来のミニセル精製方法では、ミニセルの生物医薬用量のｃＧＭＰ（現行の適正製造基準）製造のための品質管理を行うことはできない。
【００１０】
別の欠点として、従来の精製方法で採用されている勾配形成培地（パーコール、スクロース及びグリセロール）はｉｎ ｖｉｖｏでの使用には適合しない。パーコールは毒性であるため、「研究目的のみ」の状況に限定される。スクロースは、勾配を高浸透圧にし、それがミニセルの生理学的変化を引き起こしうる。実際、本発明者は、ミニセルがスクロース勾配中で浸透圧ショックを受け、その結果、構造上変形すると判断している。グリセロールは、粘性が高く、ミニセル懸濁液から完全に除去することが困難である。従って、これらの密度勾配培地は効果的に細胞と細胞小器官又は細胞成分とを分離するが、ヒトの臨床用途に用いられる予定の生体細胞を分離するためには適していない。
【００１１】
従来のミニセル精製技術を改善するためにいくつかの手法が開発されている。１つの手法は、染色体ｒｅｃＡ突然変異を有する親細胞を使用し、低線量の紫外線（ＵＶ）照射による処理を行うものである（Sancarら, 1979）。この手法の原理は、ＵＶ照射が、小さなプラスミドＤＮＡとは対照的に、その標的の大きなサイズのために選択的に染色体ＤＮＡを分解することである。しかしながら、遺伝子治療及びワクチン用途に使用される組換えミニセルは、突然変異を全く有しない必要があり、またＵＶ照射などの非特異的突然変異誘発法は、全てのプラスミドＤＮＡが突然変異しないということを保証するものではない。
【００１２】
ミニセル精製を改善するための別の手法は、例えばアンピシリン若しくはシクロセリンを用いることにより、又はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）要求株に対してＤＡＰを枯渇させることにより、細菌細胞壁の合成を阻害することによって行われる（Clarke-Curtiss及びCurtiss, 1983）。しかしながらこの手法にもまたいくつかの欠点がある。第１に、遺伝子治療に使用される多くの組換えプラスミドは、アンピシリン耐性マーカーを有しており、そのプラスミドを有する親細胞がアンピシリン耐性となることである。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミニセル用途は、一定範囲の種々の細菌種に由来するミニセルを使用するが、この多くはＤＡＰ要求突然変異の影響を受けない可能性がある。第３に、抗生物質の大規模使用は、抗生物質耐性細菌の発生という付随するリスクのため望ましいものではない。
【００１３】
最近、上述の懸念を解決するミニセル精製のための新規な手法が報告された（ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号）。この新規な方法は、クロスフロー濾過（供給流（feed flow）が膜表面と平行である；Forbes,1987）とデッドエンド濾過（供給流が膜表面に対して垂直である）を組み合わせて、１０−７（すなわちミニセル１０７個当たり１個未満の親細胞）を超え、そして１０−９ともなるミニセル純度を達成する。任意により、濾過の組み合わせは、低い遠心力での分画遠心を先行して行い、細菌細胞のある程度の部分を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮してもよい。
【００１４】
この濾過手順は従来のミニセル精製技術に付随する欠点を克服するものであるが、これには制限もある。第１に、クロスフロー濾過によってミニセルの顕著な損失が生じ、製造過程に付加的コストが生じる。さらに、この濾過手順によって得られるミニセル調製物は、ある程度の細菌性エンドトキシンを含有し、これがｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合に低刺激性ショックを引き起こす。最後に、この濾過方法を使用した場合にはバッチ間でミニセル純度が異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、最大のミニセル収量と純度を達成するが、生物学的に適合する培地を用いて細菌ミニセルを精製するための方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の及び他の必要性を解決するため、本発明は、ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供することを含む、細菌ミニセルの精製方法を提供する。この方法は、任意により分画遠心の予備ステップを含んでもよい。
【００１７】
本発明はまた、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心と濾過とを組み合わせる細菌ミニセルの精製方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ミニセルを含有するサンプルを、親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過して、親細菌細胞からミニセルを分離する、ミニセル精製方法を提供する。
【００１９】
また別の態様において、本発明は、（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、（ｂ）該サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供するステップ、続いて（ｃ）該サンプルを濾過して、精製されたミニセル調製物が得られるステップを含むミニセル精製方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は、任意により、精製されたミニセル調製物からエンドトキシンを除去するための１以上のステップ、及び／又は精製されたミニセル調製物を抗生物質で処理するステップを含んでもよい。
【００２１】
最後に、本発明は、上述の方法に従って調製される、精製されたミニセル調製物を提供する。好ましくは、精製されたミニセル調製物は、ミニセル１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、又は１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する。また好ましくは、精製されたミニセル調製物は、免疫された宿主において炎症反応又はエンドトキシンショックを誘発する可能性のあるエンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸、及び細胞内成分を含む）を実質的に含まない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者は、生物学的に適合する培地の使用により従来のミニセル精製が改善されることを確認している。これに関し、本発明者は一般的に使用されている密度勾配培地は、汚染物質からのミニセルの分離には有効であるが、ミニセルに対して有害な作用を及ぼすこともあることを観察している。例えば、従来の方法は一般的に３０％スクロース勾配を使用し、十分な純度を達成するためにはスクロース勾配精製を２〜３回反復して行う必要がある。これによりミニセルは最大２時間にわたって高浸透圧に晒され、ミニセルに対して浸透圧ショックが引き起こされる可能性がある。本発明者は、スクロース勾配により精製されたミニセルが、他の手段により精製されたミニセルと比較して有意に変形することがあることを見出した。おそらくこの変形は、膜の脱安定化（そのためミニセル中に過剰な液体が入る）によって生じる。また、このような膜の脱安定化とそれに付随する膜の多孔性の増大によって、サイトゾルの成分（治療用核酸を含む）がミニセルの外に漏出する可能性もある。
【００２３】
従って１つの態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心により親細菌細胞及び他の汚染物質からミニセルを分離することを含むミニセル精製方法を包含する。遠心分離後、ミニセルバンドを勾配から回収し、任意によりミニセルを密度勾配遠心のさらなるラウンドに供して純度を最大化してもよい。この方法は、ミニセル含有サンプルに対して分画遠心を行う予備ステップをさらに含んでもよい。分画遠心は、低遠心力で行う場合には、ある程度の部分の親細菌細胞を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮しうる。
【００２４】
本明細書において使用する「生物学的に適合する培地」とは、ミニセルの生理又は形態に有害な影響を及ぼさない培地を意味する。好ましくは、生物学的に適合する培地はまた、宿主細胞の生理又は宿主生物の生理に有害な影響を及ぼさない。従って、「生物学的に適合する」の意味は文脈により決定される。例えば、特定の培地はある種のミニセルには生物学的に適合するが、別のものに対しては毒性となることがある。好ましくは、生物学的に適合する培地は、等張性でありかつ非毒性である。
【００２５】
イオジキサノール（５，５’−［（２−ヒドロキシ−１−３プロパンジイル）−ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド］）の滅菌６０％（ｗ／ｖ）水溶液であるＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）は、生物学的に適合する培地の非常に好ましい例の１つである。研究者は、哺乳動物細胞及び細胞小器官、並びに膜小胞、ウイルス、タンパク質、核酸及びリポタンパク質を精製するためにＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ及び他の類似の密度勾配培地を広く使用している。これらの使用は、Density Gradient Media. Applications and Products 2002（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）において概説されている。しかしながら、このような培地は細菌由来のミニセルの精製には以前は使用されていなかった。実際、他の培地がミニセルの生理及び形態に有害な影響を及ぼすという本発明者の観察以前には、ミニセルを精製するための生物学的に適合する培地の必要性さえ認識されていなかった。
【００２６】
ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭを用いた場合、予め形成された勾配を使用することも、又は遠心によりその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で勾配を形成する（自然発生勾配）ことも可能である。予め形成された勾配は、連続的勾配又は不連続勾配でありうる。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭの予め形成された勾配は、所望の濃度の溶液を遠沈管に積層し、管の上部を密封してそれを拡散の間、横にしておくことにより溶液を拡散させることで形成することができる。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭによる等浸透圧密度勾配の調製は、ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ溶液を適当な希釈液で希釈することによる勾配溶液の調製に依存する。希釈液及び浸透圧調整剤（balancer）の選択は、実施者の通常の技能の範囲内である。
【００２７】
別の態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心と濾過ステップとを組み合わせる。例えば、密度勾配遠心は、図１に例示するように連続濾過プロセスに組み込むことができる。１つのそのような連続濾過プロセスはＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載されている。簡単に説明すると、これはクロスフロー濾過（供給流が膜表面と平行である）とデッドエンド濾過（供給流が膜表面に対して垂直である）を組み合わせるプロセスである。任意により、この組み合わせでは、低い遠心力での分画遠心を先行して行い、親細菌細胞のある程度の部分を除去し、それにより上清をミニセルについて濃縮しうる。また任意により、この組み合わせに続いて抗生物質処理を行って、残りの親細菌細胞を死滅させてもよい。
【００２８】
クロスフロー濾過は、フィルター孔径に依存して、親細菌細胞などの大きな汚染物質から、また、細菌ブレブ、遊離エンドトキシン、核酸、細胞破砕物及び過剰な液体などの小さな汚染物質から、ミニセルを分離することができる。大きな汚染物質からミニセルを分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、ミニセルはフィルターを通過するが、大きな細菌細胞は通らないものでなければならない。この目的では、ミニセルが直径約０．４μｍであり、細菌細胞はそれより大きいので、０．４５μｍの孔径が好ましい。ミニセルを小さい汚染物質から分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、汚染物質はフィルターを通過するが、ミニセルは通らないものでなければならない。この目的では、細胞ブレブは直径０．０５μｍ〜０．２μｍの範囲であり、その他のより小さな汚染物質は０．２μｍ未満であるので、０．２μｍの孔径が好ましい。
【００２９】
本発明におけるクロスフロー濾過の効果的な適用には典型的には、大孔径０．４５μｍ前後での少なくとも１つのステップの後、小孔径０．２μｍ前後での少なくとも１つのステップを必要とする。一連のクロスフロー濾過ステップ間又はその最中、ミニセルの回収を最大限にするためにダイアフィルトレーションを行ってもよい。ダイアフィルトレーションでは、容量を一定に保ち、限外濾過膜を用いて所望の粒子（この場合はミニセル）を保持するが、所望ではない小さな溶質と粒子は除去される。
【００３０】
クロスフロー濾過の使用は、細菌培養物などの高濃度の粒状物質を含む懸濁液にも適合し、培養液１リットル当たり１０１１〜１０１３個の細菌及びミニセル集団を含んでいてもよい。フィルターへの付着及び結果としてのミニセルの損失を最小にするため、細菌／ミニセル培養物を希釈してもよい（好ましくは、５倍〜１０倍）。また、希釈により、適宜、低ポンプ圧及び低流速の使用も可能となる。
【００３１】
クロスフロー濾過後に残った残留親細菌細胞を除去するため、デッドエンド濾過を行ってもよい。この目的では、孔径約０．４５μｍのフィルターを用いた少なくとも１回のデッドエンド濾過の使用が好ましい。
【００３２】
一実施形態において、ミニセル精製方法は、生物学的に適合する培地による密度勾配遠心と、約０．２μｍ以下の孔径の少なくとも１つのフィルターを用いる濾過ステップとを組み合わせる。
【００３３】
別の実施形態において、ミニセル精製方法は、生物学的に適合する培地による密度勾配遠心と、約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過ステップとを組み合わせる。
【００３４】
本発明者はまた、濾過の前に、親細菌細胞が糸状体となるように誘導することが、ミニセル精製を有意に改善することを発見した。ミニセル及び親細菌細胞は同じ直径（平均０．４μｍ）を有するため、細菌細胞の中には、細菌細胞の長さが少なくとも１μｍである場合でさえも、辛うじてミニセルを保持するフィルターの孔（例えば０．４５μｍのクロスフロー又はデッドエンドフィルターの孔）を通過することができるものもある。これは、長楕円形の細菌細胞がフィルターに対して垂直に位置する場合に起こる。しかしながら、端と端が連結した細菌細胞からなる細菌細胞の糸状体は、そのようなフィルターを通過することができない。
【００３５】
従って、本発明の別の態様は、濾過前に、汚染親細菌細胞が糸状体を形成するよう誘導することを必要とする。これは、ミニセル懸濁液を、親細胞においてストレス応答を誘導する環境条件に供することにより行う。このような条件は当業者に周知であり、嫌気条件、栄養制限条件及び異常な浸透圧条件が含まれる。高張性培地は、糸状体化の誘導に特に有用である。一例として、ミニセル懸濁液に、５％塩化ナトリウム（ストレス誘導剤）を含むトリプチケース・ソイ・ブロス（増殖培地）を添加することができる。このようなストレス誘導性条件下では、細胞は細胞分裂時に完全に分離することができなくなり、多数の細胞からなる長い細菌糸状体を形成する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、ミニセル純度を高めるために細菌の糸状体化を利用する。従って、一態様において、本発明は、（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、（ｂ）該ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供するステップ、続いて（ｃ）該サンプルを濾過して、精製されたミニセル調製物を得るステップを含むミニセル精製方法を提供する。
【００３７】
本発明者はさらに、エンドトキシンの除去がミニセル調製物を改善することを発見した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスの研究において、本発明者は残留エンドトキシンを含有するミニセル調製物の使用により生じる低刺激性ショックを観察した。従って、有用なミニセル調製物は、エンドトキシンを実質的に含まないことが好ましく、これはエンドトキシンを臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応若しくはエンドトキシンショックを誘導しないと考えられるレベルで含むことを意味する。
【００３８】
エンドトキシンの除去方法は当技術分野で周知である。その方法の一例は、抗リピドＡ抗体で被覆した磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ；Dynal biotech, Oslo, Norway）を使用することである。抗体で被覆した磁性ビーズを試験管中でミニセル懸濁液と混合し、抗体がリピドＡ部分を介して遊離リポ多糖（ＬＰＳ）と結合するようにインキュベートすることができる。懸濁液を含む試験管を続いて磁性スタンド（magnetic stand）に配置して、抗リピドＡ−ＬＰＳ複合体形成磁性ビーズを固定し、ミニセルを回収する。新たなビーズを用いたインキュベーションを複数サイクル行うことにより、所望の純度レベルを達成しうる。
【００３９】
ＬＰＳの深部のコア多糖部分に見出されるエピトープに結合するモノクローナル抗体もまた遊離エンドトキシンを除去するために有用である。ＬＰＳの深部のコア多糖部分は細菌膜の表面上に露出されないと考えられる。従って、ＬＰＳのこの部分に対して作製された抗体は、細菌細胞が結合したＬＰＳには結合しないはずである。使用前に、そのような抗体がＬＰＳの細胞表面に露出した成分とは交差反応しないことを確認するため試験するべきである。
【００４０】
細菌性エンドトキシンが有害な副作用を引き起こす可能性のため、好ましいミニセル精製方法はそれらを除去する１以上のステップを含む。従って、一態様において、本発明は、生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心ステップの後、得られる濃縮ミニセル調製物からエンドトキシンを除去するための１以上のステップを使用するミニセル精製方法を提供する。より好ましくは、方法はさらに上記のように１以上の濾過ステップを含む。
【００４１】
本明細書に記載するミニセル精製技術は、種々の組み合わせで使用して、所望の純度の調製物を得ることができる。好ましい方法は、密度勾配遠心と濾過との組み合わせを含む。また好ましい方法は、親細菌細胞のストレス誘導型糸状体化と、それに続く濾過、及びミニセル調製物からのエンドトキシンの除去を含む。これらの技術の全てを使用する方法の一例（図１に概略を示す）は以下のとおりである。
【００４２】
ステップＡ：ミニセルを生成する細菌細胞培養物の分画遠心。このステップは、２０００ｇにて約２０分間行うことができ、大部分の親細菌細胞を除去するが、上清中にミニセルが残る
ステップＢ：等張性かつ非毒性の密度勾配培地を用いた密度勾配遠心。このステップにより、ミニセルの損失を最小限に抑えて、多くの汚染物質（親細菌細胞を含む）からミニセルが分離される。好ましくはこのステップを精製方法内で反復して行う
ステップＣ：０．４５μｍフィルターによるクロスフロー濾過によりさらに親細菌細胞汚染を低減する
ステップＤ：残留親細菌細胞のストレス誘導型糸状体化。これは、ミニセル懸濁液をいくつかのストレス誘導性環境条件のいずれかに供することにより行いうる
ステップＥ：抗生物質処理を行って親細菌細胞を死滅させる
ステップＦ：クロスフロー濾過を行って、小さな汚染物質（膜ブレブ、膜断片、細菌破砕物、核酸、培地成分などを含む）を除去し、ミニセルを濃縮する。０．２μｍフィルターを用いて、小さな汚染物質からミニセルを分離し、そして０．１μｍフィルターを用いてミニセルを濃縮しうる
ステップＧ：デッドエンド濾過を行って死滅した糸状細菌細胞を排除する。このステップでは０．４５μｍフィルターを用いうる
ステップＨ：ミニセル調製物からのエンドトキシンの除去。このステップでは抗リピドＡで被覆した磁性ビーズを使用しうる。
【００４３】
当業者であれば、本明細書に概説する原理と一致するように、これらのステップの変形を使用し、追加の精製ステップを組み込むことができる。
【００４４】
細菌ミニセルを精製するための上述した方法は、ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４６３２号に記載のようなｉｎ ｖｉｖｏにおける用途に有用な精製されたミニセル調製物を提供する。これらの調製物は、ミニセル１０７個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、好ましくはミニセル１０８個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、より好ましくはミニセル１０９個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、さらにより好ましくはミニセル１０１０個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞、なおより好ましくはミニセル１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する。好ましくは、汚染親細菌細胞はいずれも死滅し、これらの調製物は生存親細菌細胞を何ら含有しない。また好ましくは、精製されたミニセル調製物はエンドトキシン及び細胞破砕物（死滅親細菌、膜断片、核酸及び細胞内成分を含む）を実質的に含まない。既に説明したように、ミニセル調製物は、その調製物が臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応若しくはエンドトキシンショックを誘導しないレベルのエンドトキシンを含有する場合に、エンドトキシンを実質的に含まない。同様に、ミニセル調製物は、それが臨床上有意ではないレベル、又は患者において炎症反応を誘導しないレベルの細胞破砕物を含有する場合に、細胞破砕物を実質的に含まない。
【００４５】
以下の例示的な例の参照は、本発明のより完全な理解を助けるためのものである。
【実施例１】
【００４６】
本発明の技術を用いない濾過法の不安定性
本実施例は、本発明の技術を用いない、ミニセルを精製するための濾過法の使用が不安定な結果を生じうることを例示する。
【００４７】
ネズミチフス菌（S. typhimurium）、大腸菌（E. coli）及び赤痢菌（Shigella flexneri）のミニセル産生変異細菌株を、細菌細胞及びミニセルのサイズを測定するために走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により解析する。高解像度走査型電子顕微鏡法のために、以下の方法に従う。細菌培養物はトリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）（BBL brand、Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australiaより購入）中で増殖させる。培養液は製造業者の説明書に従い３０ｇ／ｌで調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。液体培養物を３７℃にて振盪型インキュベーター中で一晩増殖させる。溶液を交換するため、細胞を１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、そしてボルテックス・ミキサーを用いて細胞を新しい試薬（以下に記載）中に再懸濁する。これにより、細胞からイオン及び生体材料を洗い落とし、細胞を少量の蒸留水に懸濁した状態にする。試薬の順番は、次の通りである：（ａ）蒸留水１ｍｌで再ペレット化する、（ｂ）蒸留水１ｍｌで再懸濁する、（ｃ）２５０μｌを清潔な真鍮標本プレートに載せる、（ｄ）３０℃にて一晩乾燥させる、（ｅ）顕微鏡観察の直前に、Ｘｅｎｏｓｐｕｔ無塵真空スパッタコーター中にて２ｎｍの金属クロムでコーティングする。コーティングした標本を、３キロボルトのビームエネルギーでＨｉｔａｃｈｉ Ｓ−９００電界放射型走査電子顕微鏡により検査する（University of New South Wales, NSW, Australia）。様々な倍率でのデジタル画像を、ＩｍａｇｅＳｌａｖｅデジタイザーを用いて記録する。
【００４８】
結果（ネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−株の代表的な画像を、図２Ａ〜Ｄに示してある）は、親細菌細胞は長さ０．９μｍ〜４μｍ、幅０．４μｍ〜０．５μｍの範囲であることを示している。図１の左側に概略を示した濾過ステップの後、いくつかのバッチでは残存する細菌の汚染がみられる。汚染細菌はサイズが小さく、すなわち長さが約０．９μｍである。このことは、ミニセル（図２Ａ）と大体同じ幅の小さいサイズの一部の細菌が、０．４５μｍクロスフローフィルター及びデッドエンドフィルターを通して漏出することを示している。
【実施例２】
【００４９】
小細菌の除去：細菌糸状体への変換
本実施例は、濾過に先立って細菌を糸状体へと誘導することが、ミニセル精製プロセスを改善することを実証する。
【００５０】
デッドエンドフィルターの孔径０．４５μｍよりも十分に大きい残存小サイズ親細菌を作り出すことにより、実施例１に記載の問題を解決するように研究をデザインした。細菌増殖環境中でのストレス誘導条件は、細菌細胞分裂時の完全な分離を妨げ、細菌糸状体を生じさせる。
【００５１】
本研究は、高張性細菌増殖培地（ストレス誘導剤）がネズミチフス菌及び大腸菌のミニセル産生細菌株の糸状体化を安定に誘導することを実証する。全ての細菌は、−８０℃で維持したグリセロールストックから増殖させる。ネズミチフス菌及び大腸菌株は、トリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）（BBL brand、Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australiaより購入）中で増殖させる。培養液は製造業者の説明書に従い３０ｇ／ｌで調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。液体培養物を３７℃にて振盪型インキュベーター中で一晩増殖させる。一晩培養した細菌培養物を新たなＴＳＢ中に１：５，０００で希釈し、ＯＤ６００ｎｍが０．２に到達するまで増殖させる。培養物を滅菌バイアル中の１０本の５ｍｌアリコートに分け、予めオートクレーブした滅菌ＮａＣｌを、最終ＮａＣｌ濃度（ｗ／ｖ）が０％（対照）、２％、３％、４．５％、５％、５．５％、６％、７％及び８％になるように各バイアルに加える。培養物を３７℃にて静置状態でインキュベートし、２時間、４時間、８時間及び２４時間においてサンプルを採取する。０時間の対照サンプルも、顕微鏡観察用に採取する。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、細菌／ミニセルペレットを蒸留水に再懸濁する。各サンプルの液滴をガラススライド上に置き、風乾し、加熱固定する。各サンプルを、９５％アルコール洗浄及び引き続くグラム・サフラニン液への１分間の浸漬によりグラム染色する。スライドを、ＬｅｉｃａモデルＤＭＬＢ光学顕微鏡により可視化し、それと共にＬｅｉｃａ ＤＣカメラ及びＬｅｉｃａ ＩＭ画像処理ソフトウェアにより画像解析を行う。サンプルは、倍率４０×又は１００×（油浸）にて観察する。
【００５２】
上記実験を４回繰り返し、結果の信頼性を確認し、一連の対照を用いた変型も行う。
【００５３】
結果（図３Ａ〜Ｂ及び４Ａ〜Ｂ）は、増大したＮａＣｌ濃度では、細菌細胞は端と端をつないだ２〜２０個の球状桿菌よりなる糸状体を形成することを表している。ＮａＣｌ濃度２％〜３％の範囲内では、糸状体化はまちまちであり（図３Ａ及び４Ａ）、より長いインキュベーション時間の後でもいくつかの細菌細胞は糸状体を形成しない。しかしながら、４％〜５％ＮａＣｌでは、細菌細胞は確実に糸状体に変化する（図３Ｂ及び４Ｂ）。４％〜５％ＮａＣｌでの糸状体化のための最適なインキュベーション時間は約４時間であり、２４時間までのさらなるインキュベーションは一般に必要ではない。５．５％〜８％のより高い塩濃度は糸状体形成を減少させる。ＴＳＢ寒天平板上での希釈液播種により各サンプルの生存細菌数を測定する予備的研究は、高い塩濃度（５．５％〜８％ＮａＣｌ）では相当数の細菌細胞が死滅することを示唆し、これがこれらのＮａＣｌ濃度において減少した糸状体化が観察されることの理由かもしれない。
【００５４】
細菌細胞生存率に対する種々のＮａＣｌ濃度の影響の最終的な研究は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ細菌生存率キット（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を用いて行う。このキットでは、緑色蛍光ＳＹＴＯ（登録商標）９染色及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム染色の２種類の核酸染色を用いる。これらの染色は健康な細菌細胞に浸透する能力に差がある。ＳＹＴＯ９染色は生存細菌と死滅細菌の両者を標識する。一方、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は損傷した膜を有する細菌のみに浸透し、両方の色素が存在する場合にはＳＹＴＯ９の蛍光を減少させる。従って、無傷の膜を有する生存細菌は緑色の蛍光を発し、損傷した膜を有する死滅細菌は赤色の蛍光を発する。塩誘導型糸状体化についての上述の実験を繰り返し、種々のＮａＣｌ濃度についての０時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間サンプルを取得する。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、細菌／ミニセルペレットを１００μｌのＢＳＧに再懸濁する。ＳＹＴＯ９／ＰＩの５０／５０混合液の０．５μｌを各サンプルに添加し、１５分間インキュベートする。サンプルを１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、ペレットを１００μｌの蒸留水に再懸濁する。各サンプルの液滴をガラススライド上に置き、風乾し、ＢａｃＬｉｇｈｔ封入オイルの油滴で覆う。各サンプルを、ＬｅｉｃａモデルＤＭＬＢ光学顕微鏡を用いて可視化し、それと共にＬｅｉｃａ ＤＣカメラ及びＬｅｉｃａデジタル画像取得ソフトウェアにより画像解析を行う。サンプルは、倍率４０×又は１００×（油浸）にて観察する。
【００５５】
結果（カラー写真は示していない）は、５．５％及びそれより高いＮａＣｌ濃度においては、相当数の細菌細胞が赤色の蛍光を発し（死滅細胞）、さらに７％及び８％のＮａＣｌ濃度では、細菌細胞のほとんど全てがインキュベーションの２時間のうちに死滅することを表している。この結果は、４時間のインキュベーション時間では、４％〜５％ＮａＣｌが糸状体化を実現する最大限界であることを示す。２時間のインキュベーション後、生存細菌細胞は糸状体へと変化する。しかしながら、インキュベーション時間が増加すると糸状体は赤色の蛍光を発し、このことは、４％〜５％ＮａＣｌでさえも細菌細胞にとっては十分なストレスであること、及びそれらが数世代の増殖の後に死滅し始めることを示唆している。このストレスは細菌細胞分裂中の完全な分離を妨げるようなので、細菌糸状体を形成させるのに足りる。このデータはまた、より高い塩濃度では糸状体化が達成されないことの理由を説明する。すなわち、該ストレスは毒性であり、細菌増殖及び細胞分裂を妨げ、さらに細胞死を引き起こす。
【実施例３】
【００５６】
インタクトなミニセルを親細菌及び他の汚染物質と分離するための生物学的に適合する密度勾配培地の使用
細菌細胞／ミニセル培養物の分画遠心後、顕著な数の細菌細胞汚染物質を、生物学的に適合する培地を用いた密度勾配遠心により除去した。ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）（イオジキサノール（５，５’−［（２−ヒドロキシ−１−３プロパンジイル）−ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド］）の滅菌６０％（ｗ／ｖ）水溶液）は生物学的に適合する培地を構成する。６％〜１２％勾配を２５ｍｌポリプロピレン透明遠沈管（Livingstone International Pty Ltd, Sydney, Australia）中に調製し、ミニセル／細菌細胞懸濁液１ｍｌを各勾配の上に重層した。遠沈管を２，０００ｇにて２０分間遠心した。２３本の１ｍｌサンプルを遠沈管より回収し、倍率１００×油浸対物レンズを用いて光学顕微鏡法により解析した。結果では、図５Ａに示したように３つの主要な層が見られた。最上層は主にミニセルを含有し、細菌細胞及び細菌ブレブで汚染されていた。２番目に低い層は主として細菌細胞を有していたが、それらはミニセルよりも約２〜３倍長いようであった。ペレットは主に細菌細胞を有していた。
【００５７】
粗ミニセル懸濁液（上方のバンド；図５Ａ）を回収し、エッペンドルフチューブ中で１３，２００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。ペレットを２ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁し、上記と同様にＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。結果（図５Ｂ）では、比較的小さな細菌ペレットがあり、中間のバンドはずっと明瞭になり、そしてミニセルバンドがはっきりと現れた。遠沈管中の全領域（容量２ｍｌずつ）を上記と同様に光学顕微鏡法で解析し、ミニセルバンドがほとんど細菌汚染物を有していないようであったこと以外は、結果は同様であった。ミニセルバンドを前と同じく回収し、上記と同様に３度目のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。この処理は明瞭なバンドをもたらし（図５Ｃ）、顕微鏡により解析すると、細菌汚染物をほとんど有さず、大部分がミニセルであることが明らかになった。この実験を１０回反復し、同様の結果を得た。
【実施例４】
【００５８】
精製されたインタクトなミニセル調製物からの遊離エンドトキシンの顕著な減少
グラム陰性細菌のエンドトキシンはリポ多糖（ＬＰＳ）分子であり、リピドＡ、コアオリゴ糖及びＯ−多糖と呼ばれる３つの異なるドメインを有している。リピドＡ及びコアオリゴ糖はエンドトキシン・コアを構成し、種々のグラム陰性細菌種間で比較的保存されている。リピドＡはエンドトキシンの毒性部分であり、全てのＬＰＳでコアオリゴ糖に共有結合している（Reitschelら, 1991）。
【００５９】
残存する遊離エンドトキシンを、以下のように精製ミニセル調製物から除去した。プロテインＧで被覆した磁性ビーズ（Dynal Biotech, Oslo, Norway）を、ヤギ抗リピドＡポリクローナル抗体（Biodesign, Saco, Maine, USA）にコンジュゲートした。この抗体はネズミチフス菌ＬＰＳを含むある範囲の種々のグラム陰性細菌ＬＰＳ種と交差反応性である。コンジュゲート反応はダイナビーズ−プロテインＧ（０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ中で３回洗浄した）を抗リピドＡ抗体と共にインキュベートすることにより行った（穏やかに混合しながら４℃にてＯ／Ｎ）。過剰な抗体は、ダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ中で３回洗浄することにより除去した。コンジュゲートを３００μｌの同バッファー中に再懸濁し、５０μｌを、遊離エンドトキシン除去のために５００μｌの精製ミニセル懸濁液を処理するために用いた。共インキュベーションを４℃にて１時間行い、続いてチューブを磁石（Ｄｙｎａｌ）上に置き、ミニセル上清を回収した。この処理を新たなダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて３回行い、残存遊離エンドトキシンが最大限除去されるようにした。
【実施例５】
【００６０】
ミニセル精製手順中のインタクトなミニセル、細菌細胞及びエンドトキシン量の計測
この実験は、ミニセル回収量、親細菌数の減少及び遊離エンドトキシンの減少に関して、ミニセル精製手順の動態を確認するためにデザインした。以下に概説する完全な精製手順を３回行い、１２ステップの各々にてサンプルを回収した。各サンプルを、フローサイメトリー並びに寒天平板上での生存数カウントにより、ミニセル及び細菌細胞数について解析した。エンドトキシン単位（ＥＵ）も、ＬＡＬアッセイ（Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA, USA）により各サンプルについて測定し、これはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ（Sydney, Australia）により行われた。完全な精製プロセスを以下に簡単に説明する。
【００６１】
高コピー数プラスミド（核酸マーカー）を保持する組換えネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−株を、トリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）２５ｍｌ中で振盪しながら３７℃にて一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。その後、１ＬのＴＳＢをそれぞれ含有する６本のフラスコにＯ／Ｎ培養物２ｍｌを接種し、振盪しながら３７℃にてさらにインキュベートした（サンプル１）。培養物を、有意な数の細菌細胞を沈殿させるために卓上遠心機中で２０００ｇにて２０分間、分画遠心した。上清（サンプル２）を回収し、０．１μｍクロスフローフィルターに通すことにより濃縮した。懸濁液を、エッペンドルフ遠心機中で１３，２００ｒｐｍにて６０分間遠心分離することによりさらに濃縮し、ミニセル／細菌細胞ペレットを１６ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁した（サンプル３）。１６本の密度勾配（６％〜１２％）を、生物学的に適合する培地であるＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Axis-Shield PLC, Dundee, Scotland）を用いて２５ｍｌポリプロピレン透明遠沈管（Livingstone International Pty Ltd, Sydney, Australia）中に調製し、ミニセル／細菌細胞懸濁液１ｍｌを各勾配の上に重層した。遠沈管を２，０００ｇにて２０分間遠心し、ミニセルバンド（図５Ａ）を注射器で各遠沈管の上部から回収した。約２４ｍｌの粗ミニセル懸濁液（サンプル４）を回収し、これをエッペンドルフチューブ中で、１３，２００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。ペレットを１２ｍｌの滅菌ＢＳＧ中に再懸濁し、上記と同様にして１２のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。ミニセルバンド（図５Ｂ）を前と同じく回収し（サンプル５）、上記と同様にして４のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ勾配で再処理した。この処理により各遠沈管中に明瞭な散乱性のミニセルバンド（図５Ｃ）がもたらされ、それらを回収した（サンプル６）。ミニセル懸濁液を１ＬのＴＳＢに添加し、汚染細菌細胞を再活性化するために、静置状態で３７℃にて２時間インキュベートした（サンプル７）。ＮａＣｌ（終濃度５％ｗ／ｖ）を懸濁液に加えて、生存細菌細胞にストレスを与え、細胞分裂中の隔壁形成の過程を阻害した。懸濁液を静置状態で３７℃にて２時間インキュベートし、汚染細菌細胞の大部分が細菌糸状体に変化するようにした（サンプル８）。広範なスペクトルの抗生物質であるゲンタマイシン（２００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を懸濁液に添加し、３７℃にて一晩インキュベートして全ての生存細菌細胞を死滅させた（サンプル９）。バッファー交換のために懸濁液を０．２μｍクロスフローフィルターに通し、懸濁液を滅菌ＢＳＧ中に再構築した（サンプル１０）。このプロセスにより、例えば遊離エンドトキシン、溶解した細菌及びミニセル断片、核酸並びにＴＳＢの栄養素などの０．２μｍよりも小さな全ての汚染物質が除かれた。そして０．４５μｍデッドエンドフィルターに溶液を通すことにより、ミニセル懸濁液に由来する細菌糸状体を除去した。１００ｋＤａクロスフローフィルターに通すことで懸濁液を容量５０ｍｌまで濃縮し、その後１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離してミニセルをペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍｌの滅菌ＢＳＧに再懸濁した（サンプル１１）。残存する遊離エンドトキシンは、実施例４に記載したのと同様に抗リピドＡ抗体にコンジュゲートしたダイナビーズ−プロテインＧを用いて除去した。これによりサンプル１２を得た。
【００６２】
ミニセル及び細菌細胞の計数は、以下のようにフローサイトメトリーにより行った。ミニセル精製手順からの各サンプルを約１０８〜１０１０個のミニセルを有するように大まかに希釈し、サンプルの２５０μｌを３．３μＭ Ｓｙｔｏ９緑色蛍光色素（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と共にインキュベートした。この色素は細菌細胞の無傷の膜及び損傷した膜を透過し、内在性の核酸に結合して、緑色蛍光を発する細菌細胞をもたらす。本発明者らの予備的研究では、この色素がミニセル膜をも透過し、緑色蛍光を発する組換えミニセルをもたらすことが示された。全てのサンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）により、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ取得・解析ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてカウントした。カウントは、緑色蛍光「ＦＬ１」トリガー（５１５〜５４５ｎｍを検出する）により、３７Ｖの閾値を用いて中間流速にて３０秒間にわたって行った。ＦＬ１のＰＭＴ電圧は５５０Ｖに設定した。側方散乱光「ＳＳＣ」のＰＭＴ電圧は５２４Ｖに設定した。適当なサンプル希釈では３０秒当たり５０００〜５００００粒子の値が返され、最終的な粒子数は５回の反復実験の平均とした。ミニセルと細菌とはＳＳＣ及び緑色蛍光におけるそれらの差異に基づいて区別した。
【００６３】
結果（図６Ａ〜Ｃ）から、精製プロセスの開始時には６Ｌの細菌／ミニセル培養物がミニセル約５×１０１２個を有しており（図６Ａ）、精製手順を通じて段階的な逸失が起こって最後には約５×１０１０個の回収量でミニセルが得られることが示された。
【００６４】
手順の開始時での親細菌細胞数（図６Ｂ）はミニセル数と同等、すなわち細菌約５×１０１２個であった。精製プロセスは、抗生物質処理の時点で１０００倍を超える細菌細胞の排除をもたらした。この時点で、ミニセル：細菌細胞の比は１００：１を上回り、従ってフローサイトメトリー計測では解析したサンプル中に細菌細胞を検出することができなかった。抗生物質処理後では、平板生存数アッセイにより解析された全てのサンプルで、生存細菌細胞が全く存在しないことが明らかになった。最終精製サンプル中のゲノムＤＮＡの存在についての定量的ＰＣＲ解析により、１０１１個の精製ミニセル中、親細菌細胞（死滅細胞）は１個未満であることが示された。
【００６５】
各サンプル中の遊離エンドトキシン計測（図６Ｃ）は、精製工程の開始時にサンプルが約１０９エンドトキシン単位（ＥＵ）を有していたことを示した。ＥＵは３回目の勾配精製ステップ後には約１０６にまで減少した（図６Ｃ；サンプル６）。ミニセル／残存細菌細胞懸濁液を塩誘導型糸状体化のためにＴＳＢ中でインキュベートするとＥＵは再び増加したが（図６Ｃ；サンプル７〜９）、続く精製ステップにおいて１０４〜１０５ＥＵまで減少した。
【００６６】
水溶液中では精製したＬＰＳは遊離ＬＰＳとして、またミセルとして見出されうることが知られている。これはリピドＡ部分が疎水性であり糖質部分（コア多糖及びＯ−多糖）は親水性であるためである。これにより、疎水性リピドＡは埋入され、親水性多糖が水性環境と相互作用しているミセルが生じる。これらのミセルは様々な分子サイズの範囲で存在することが知られており、数百万ダルトン程にも大きなものでありうる。細菌細胞又はミニセルに結合したＬＰＳは、リピドＡ部分が二重層膜中に埋もれていて、エンドトキシンではない。遊離ＬＰＳは、リピドＡ部分が哺乳動物細胞膜と相互作用することができ、それにより深刻な内毒素作用をもたらすので、エンドトキシンである。ＬＰＳミセルがｉｎ ｖｉｖｏでエンドトキシンであるかどうかは知られていない。
【００６７】
本発明のミニセルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療用途に対して有用であり、従って当該精製手順は遊離ＬＰＳ、すなわちエンドトキシンの除去に焦点を絞ったものである。しかしながら、ＬＡＬアッセイはＬＰＳの３つの形態、すなわち遊離型（エンドトキシン）、ミセル型（以下の研究はこれがエンドトキシンでないことを示唆している）及びミニセル表面結合型（エンドトキシンでない）の全てを測定する。一方で、抗リピドＡ抗体は遊離ＬＰＳのみに結合し、それを除去するようであり、なぜなら該抗体の抗原結合部位がミセル中又はインタクトなミニセル中のリピドＡに到達し得ない（抗原部位が埋もれているため）からである。
【実施例６】
【００６８】
精製ミニセル調製物中の遊離エンドトキシンレベルの測定
上記のことを実証するために、ＬＡＬアッセイによってＬＰＳのどの形態が実際に測定されるのかを確認すべく、一連のさらなる実験を行った。精製ミニセル調製物を、新たに調製したダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて遊離ＬＰＳを除去するために、順次に５回処理し、各精製段階からの以下のサンプルをＬＡＬアッセイにより解析した；（ａ）精製ミニセル懸濁液（ＬＰＳの３つの形態全て（すなわち遊離型、ミセル型及びミニセル表面膜結合型）を有すると予測される）、（ｂ）回収されたダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲート（おそらく結合した遊離型ＬＰＳを有する）、（ｃ）ダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡ処理後に１３，２００ｒｐｍでの２０分間のミニセル懸濁液の遠心分離により得られた上清（遊離型は抗リピドＡにより取り除かれているはずであり、ミニセル結合ＬＰＳはミニセルペレット中に見出されるはずなので、これはおそらくミセル型ＬＰＳを有している）、（ｄ）（ｃ）から得られたペレット（滅菌発熱物質不含ＢＳＧ中に再懸濁した）。対照の群、例えば抗リピドＡ抗体が遊離型ＬＰＳに結合してそれを除くことを確かめるためのダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて処理した精製ネズミチフス菌ＬＰＳ（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA）；希釈液が観察されるＥＵに寄与しないことを確かめるための希釈液サンプル等、も含められた。
【００６９】
結果（表１、下掲）は、予想されたように、ＬＡＬアッセイにより測定されるＥＵの大部分がミニセル表面膜結合ＬＰＳ（Ｄ列）に伴うものであり、これは実施例７のｉｎ ｖｉｖｏ研究で見られるようにエンドトキシンでない。この結果は、図６Ｃ（サンプル１２）において見られた結果と類似する。上清（Ｃ列）もまた、顕著な量のＥＵを有し、各サンプルはダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲートを用いて既に処理されていたため、これはおそらくＬＰＳのミセル型である。興味深い結果がＢ列において見られ、Ｂ列は抗リピドＡ抗体処理が行われる各回で、精製ミニセル調製物において見出され得る遊離型ＬＰＳの量は２０ＥＵ〜４５ＥＵのみであることを示した。この値は非経口投与医薬品の１回放出についての現行のエンドトキシン基準（３５０ＥＵ／用量）を大いに下回る（Grandics, 2000）。
【表１】
【実施例７】
【００７０】
精製ミニセルが顕著なレベルのエンドトキシンを有していないことのｉｎ ｖｉｖｏにおける確認
精製ミニセル調製物を、上記のダイナビーズ−プロテインＧ／抗リピドＡコンジュゲート手順を用いてエンドトキシン除去のために順次に（３回）処理した。１０９個の精製ミニセルを有する調製物の各々（すなわち、エンドトキシン除去前、並びに１回目の、２回目の、及び３回目のエンドトキシン除去ステップ後）を６週齢メス無胸腺ヌードマウス（１群当たり５匹）の尾静脈に注射した。本実施例において用いたマウスはＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Perth, WA, Australia）から購入し、全ての動物実験は実験動物の管理及び使用の指針に従い、動物倫理委員会の承認を得て行った。実験は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ Ｐｔｙ Ｌｔｄ（Sydney, NSW, Australia）のＮＳＷ州農業省認可小動物施設中で行った。マウスを４週間にわたって注意深く観察し、あらゆる内毒素ショックの兆候（例えば発熱、昏睡、食欲及び体重の低下、並びにそれに続く死亡）を記録した。その結果、エンドトキシン除去手順なしでは、大部分のマウスがすぐに発熱し、最初の１２時間以内に昏睡状態に陥ることが示された。動物のほとんどは２週間以内に死亡した。１回目のエンドトキシン除去手順後のミニセルを投与されたマウスはより安定であり、最初の２４時間、軽い発熱を示した。しかしながら、マウスは３日後には回復した。２回及び３回のエンドトキシン除去を行った精製ミニセルを投与されたマウスは有害な副作用を全く示さず、健康なままであった。このことは、ミニセルを哺乳動物宿主体内での医薬用途に用いる場合には、遊離エンドトキシン除去の新規なステップが必須であることを示唆した。
【００７１】
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のミニセル精製技術を他のミニセル精製手順と統合することができる一つの方法を示す。
【図２】ネズミチフス菌（S. typhimurium）のｍｉｎＣＤＥ−細菌株（一定範囲の異なるサイズ）及びこの株に由来するミニセルの走査電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）小さなサイズの親細菌（長さ１．１μｍ）及びミニセル（直径０．４μｍ）を示す。（Ｂ）大きな親細菌（長さ１．３２μｍ）を示す。（Ｃ）さらに大きな親細菌（長さ１．６μｍ）を示す。（Ｄ）親細菌とミニセルとの混合物を示し、前者は長さ１μｍ〜４μｍの範囲である。
【図３Ａ】種々の時間にわたる種々のＮａＣｌ濃度を用いたインキュベーションに引き続く親ネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株の糸状体化を示す。
【図３Ｂ】ＮａＣｌの不在下で４時間にわたり増殖培地中でインキュベートしたネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株（左側の写真）と、５％ＮａＣｌの存在下での４時間のインキュベーション後に形成された細菌糸状体（右側の写真）のサイズを比較する蛍光顕微鏡写真を示す。
【図４Ａ】種々の時間にわたる種々のＮａＣｌ濃度を用いたインキュベーションに引き続く親大腸菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株の糸状体化を示す。
【図４Ｂ】ＮａＣｌの不在下で４時間にわたり増殖培地中でインキュベートした大腸菌ｍｉｎＣＤＥ−細菌株（左側の写真）と、５％ＮａＣｌの存在下での４時間のインキュベーション後に形成された細菌糸状体（右側の写真）のサイズを比較する蛍光顕微鏡写真を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、実施例３において説明するように、密度勾配遠心に生物学的に適合する培地（例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ）を用いたミニセルの３回の連続精製段階を示す。最初の密度勾配遠心により分離された粗ミニセル調製物（図５Ａ）によって、汚染物質、すなわち顕著な細菌ペレット及びミニセルと細菌ペレットとの間にバンドを形成する比較的小さなサイズの細菌細胞が明らかとなった。ミニセルバンドを回収し、２回目のＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配（図５Ｂ）によって処理したところ、より明りょうなミニセルバンドと、小さな細菌細胞のより鮮明なバンドと、無視できる程度の細菌ペレットが明らかとなった。ミニセルバンドを回収し、３回目のＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配（図５Ｃ）によって処理したところ、ミニセルの有意な精製が明らかとなった。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。精製プロセスにおいてサンプルを分析するために回収した種々の段階をｘ軸に示す。実験の詳細は実施例５に記載する。各値は３つのサンプルの平均であり、各サンプルは別々の精製プロセスから回収した。標準誤差バーを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、ミニセル精製手順のステップの間のミニセル（図６Ａ）、生存細菌細胞（図６Ｂ）及びエンドトキシン（ＥＵ；図６Ｃ）の数をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップを含み、それにより該サンプル中の汚染物質からミニセルが分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項２】
ミニセル含有サンプルに対して分画遠心を実施する予備ステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ミニセル含有サンプルを濾過するステップを少なくとも１回さらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ミニセル含有サンプルの濾過ステップが、少なくとも１つの約０．２μｍ以下の孔径のフィルターを用いる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ミニセル含有サンプルの濾過ステップが、約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
精製されたミニセル調製物を抗生物質で処理するステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
培地が等張性かつ非毒性である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
培地が本質的にイオジキサノール及び水からなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ミニセルを含有するサンプルを、親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップを含み、それによりミニセルが親細菌細胞から分離される、精製方法。
【請求項１０】
条件が、異常な浸透圧条件、嫌気条件又は栄養制限条件である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
サンプルを高張性培地中でインキュベートする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
濾過ステップが約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、及び
（ｂ）ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップ
を含み、それによりミニセルが該サンプル中の汚染物質から分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項１４】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項１記載の精製方法。
【請求項１５】
エンドトキシン除去ステップが抗リピドＡ抗体を用いる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ：
（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、
（ｂ）該ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップ、及び
（ｃ）該サンプルからエンドトキシンを除去するステップ
を含み、それによりミニセルが該サンプル中の汚染物質から分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項１９】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０７個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２０】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０８個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２１】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０９個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２２】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０１０個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２３】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２４】
エンドトキシンを実質的に含まないミニセル調製物。
【請求項２５】
細胞破砕物を実質的に含まないミニセル調製物。
【請求項１】
ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップを含み、それにより該サンプル中の汚染物質からミニセルが分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項２】
ミニセル含有サンプルに対して分画遠心を実施する予備ステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ミニセル含有サンプルを濾過するステップを少なくとも１回さらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ミニセル含有サンプルの濾過ステップが、少なくとも１つの約０．２μｍ以下の孔径のフィルターを用いる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ミニセル含有サンプルの濾過ステップが、約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
精製されたミニセル調製物を抗生物質で処理するステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
培地が等張性かつ非毒性である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
培地が本質的にイオジキサノール及び水からなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ミニセルを含有するサンプルを、親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップを含み、それによりミニセルが親細菌細胞から分離される、精製方法。
【請求項１０】
条件が、異常な浸透圧条件、嫌気条件又は栄養制限条件である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
サンプルを高張性培地中でインキュベートする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
濾過ステップが約０．４５μｍの孔径のフィルターを用いたデッドエンド濾過である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、及び
（ｂ）ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップ
を含み、それによりミニセルが該サンプル中の汚染物質から分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項１４】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項１記載の精製方法。
【請求項１５】
エンドトキシン除去ステップが抗リピドＡ抗体を用いる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
ミニセル含有サンプルからエンドトキシンを除去するステップをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ：
（ａ）ミニセルを含有するサンプルを生物学的に適合する培地中での密度勾配遠心に供するステップ、
（ｂ）該ミニセル含有サンプルを親細菌細胞が糸状体となるよう誘導する条件に供し、続いて該サンプルを濾過するステップ、及び
（ｃ）該サンプルからエンドトキシンを除去するステップ
を含み、それによりミニセルが該サンプル中の汚染物質から分離されて精製されたミニセル調製物が得られる、精製方法。
【請求項１９】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０７個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２０】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０８個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２１】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０９個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２２】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０１０個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２３】
請求項１記載の方法により調製され、かつミニセル１０１１個当たり約１個未満の汚染親細菌細胞を含有する、精製されたミニセル調製物。
【請求項２４】
エンドトキシンを実質的に含まないミニセル調製物。
【請求項２５】
細胞破砕物を実質的に含まないミニセル調製物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５２０２０１（Ｐ２００７−５２０２０１Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６５７３（Ｐ２００６−５１６５７３）
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２０９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５０７
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０４１４６５２３）エンジェネイック モレキュラー デリバリー ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２０９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５０７
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０４１４６５２３）エンジェネイック モレキュラー デリバリー ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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