本発明は、概ね、インフルエンザウイルスに対する改善されたワクチンを生成するための材料および方法に関し、ワクチンは、同じインフルエンザＡウイルス亜型またはインフルエンザＢ株のウイルスからの赤血球凝集素遺伝子およびノイラミニダーゼ遺伝子、ならびに異なるインフルエンザＡ亜型ウイルスまたはインフルエンザＢ株のウイルスからの内部遺伝子を有する再集合体ウイルスを含んでいる。一態様において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびに内部遺伝子は、インフルエンザＡの高病原性のＨ５Ｎ１株からである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ウイルスワクチンの生成）
本出願は２００８年１２月１６日に出願された、米国仮特許出願第６１／１２２，９６１号の優先権の利益を主張し、上記米国仮特許出願は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概ね、インフルエンザウイルスに対する改善されたワクチンを生成するための材料および方法に関する。本発明は、単一株のウイルス、例えば、インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株からの赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを発現し、またインフルエンザ株からの内部遺伝子を全て有する再集合体ウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ）を提供する。赤血球凝集素遺伝子が変異されて、野生型株における赤血球凝集素遺伝子に比べて低減した病原性を示すことが企図される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
効果的なワクチンを生成するには、宿主系から高収量で生成される大量のウイルスの増殖が必要である。許容できる収量を得るために、様々な型のウイルスが様々な増殖条件を必要とする。したがって、その中でウイルスが増殖する宿主は非常に重要である。ウイルス型に応じて、ウイルスは一次組織培養細胞中、確立された細胞系中、または発育卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ ｅｇｇ）（例えば、ニワトリからの発育卵）中で増殖され得る。
【０００４】
ウイルスの宿主系として用いられる哺乳動物の細胞系のいくつかはウイルスを高収量で生成するが、このような細胞の腫瘍形成性の性質により、ワクチン生成についてのこれらの使用に対する規制上の制約が引き起こされる。実際、世界保健機関（ＷＨＯ）の該当するガイドラインは、ウイルスワクチンの生成にはほんの少数の細胞系しか認められないことを指摘している。
【０００５】
インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型の一般的な３つの型が存在し、これらはウイルスの内部タンパク質の間に血清学的交差反応性がないことによって規定される。インフルエンザＡ型ウイルスは、ウイルスの糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の抗原性の違いに基づいて亜型にさらに分類される。ヒトは、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ型の各々のウイルスに感染することによって引き起こされる疾患に感受性である。
【０００６】
現在、ヒトにおけるインフルエンザ感染の最も重要な原因は、Ｂ型、ならびにインフルエンザＡ型の亜型Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に起因し得るものである。したがって、Ｂ型、ならびにインフルエンザＡ型の亜型Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２の抗原は、現在の季節性インフルエンザのワクチン中に一般的に組み入れられるものである。現在入手可能なワクチンは、７５〜９０％の範囲の保護率を有する。しかし、汎流行感染を引き起こし得るインフルエンザ株は、例えば、典型的なインフルエンザワクチンによって保護されていないＨ５Ｎ１亜型の株である。Ｈ２、Ｈ７、およびＨ９亜型も汎流行の可能性がある。例えば、Ｋｏｏｐｍａｎｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３６３巻、５８７〜９３頁、２００４年；Ｊｏｓｅｐｈら、Ｍｄ Ｍｅｄ．、６巻、３０〜２頁、２００５年；Ｃａｍｅｒｏｎら、ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７８巻、３６〜４１頁、２０００年；およびＨｕｂｅｒら、Ｐｅｄｉａｔｒｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、２７巻（補完１０）：Ｓ１１３〜１７頁、２００８年を参照されたい。
【０００７】
弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンは、最近、米国において使用が認可されている。現在のワクチンの多くは季節性インフルエンザ感染用のものであり、インフルエンザＡの２つの成分であるＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２、ならびにインフルエンザＢの成分を含んでいる。過去数年にわたって、インフルエンザタンパク質における抗原変動および変異のため、毎年少なくとも１つの成分が変更された。ヒトインフルエンザウイルスの臨床分離株は感染患者から採取したものであり、発育鶏卵中で、高増殖のドナーウイルスの実験室に適合されたマスター株であるＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ株と再集合されている（特許文献１）。再集合の目標は、一次臨床分離株からの少なくともＨＡまたはＮＡ遺伝子を、マスター株のドナーウイルスの６個の内部遺伝子と組み換えることによって実現される候補のワクチン株の収量を増大することである。この戦略は、臨床分離株の抗原決定基に類似する抗原決定基を有する高増殖の再集合体を提供するものである（Ｗｏｏｄ， Ｊ． Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｍ． Ｓ．， Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９８年；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、２０巻、２１３頁、１９９２年）。ワクチンは、この再集合したウイルス株を発育卵中で増殖させ、次いで、精製されたウイルスを化学的手段によって不活化することによって調製される。
【０００８】
高病原性のトリインフルエンザウイルスは、トリにおける重症の呼吸器疾患および死亡率を引き起こすことができる。この特徴は、Ｈ５およびＨ７亜型のＨＡに対してのみ知られている。トリのウイルスの中にはヒトに伝染する能力があるものがあるので、これらのウイルスはヒトの健康上の懸念ともなる。トリインフルエンザウイルスの病原性は多遺伝子性の性質であるが、ＨＡタンパク質は感染において主要な役割を有することが示されている。ウイルス感染性の必要条件は、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットに対する前駆体ＨＡタンパク質（ＨＡＯ）の切断である。この切断により、ウイルスおよびエンドソームの膜の融合を担うペプチドが放出される。低病原性のウイルスは、呼吸器または消化器の細胞によって分泌されるトリプシン様プロテアーゼによってのみ活性化される表面ＨＡ分子を発現する（Ｐｅｒｄｕｅら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ、４９巻、１７３〜８６頁、１９９７年）。高病原性ウイルスの切断部位は、様々な細胞のプロテアーゼによって、特に、大部分の細胞に存在する遍在性のフューリンによって切断され得る方法において変更される（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５８巻、１〜２０頁、１９９９年；Ｓｗａｙｎｅ Ｄ．、Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ、３４巻、５５７〜６７頁、１９９７年）。高病原性株は全て、一定して、切断部位に複数の（ＲおよびＫなどの）塩基性残基を含んでいる（Ｐｅｒｄｕｅら、上述）。それゆえ、ウイルスは急速に伝播し、殆んどあらゆる器官において複製し、全身性感染を誘発することができる。
【０００９】
弱毒化したＨ５Ｎ１再集合体ウイルスは、Ｈ５Ｎ１株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を用いて、逆遺伝学（ＲＧ，Ｐａｌｅｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９３巻、１１３５４〜５８頁、１９９６年）によって、これらの遺伝子を病原性の低いウイルスからのインフルエンザウイルス内部遺伝子の残余を含む「バックボーン」ウイルス中に挿入して生成されている。しばしば用いられるバックボーンは、卵中で増殖するように高度に適合されている原型株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）の亜型Ｈ１Ｎ１に由来し、２つの表面糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）だけがＨ５Ｎ１ウイルスに由来する。これらの再集合体ウイルスは卵におけるワクチン生成用にデザインされているが、当技術分野において公知の既存の逆遺伝学の再集合体の増殖は、卵中および細胞培養物中では不十分である。例えば、Ｓｕｇｕｉｔａｎら（ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻、１５４１〜５４頁、２００６年）は、Ｈ５Ｎ１株、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３、およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を有するウイルスを産生するための、低温適応Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ（ｃａＡＡ）バックボーンの使用を記載している。これらのウイルスはインビボの弱毒化を実証したものであり、すなわちトリにおいて致死的ではなく、野生型Ｈ５Ｎ１ウイルスで再チャレンジ（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）したマウスにおいてある程度の保護効果も示した。Ｓｈｅｎｇｑｉａｎｇら（Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ、１７９巻、１１３２〜８頁、１９９９年）はまた、汎流行性のＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ株ＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびにＡｎｎ Ａｒｂｏｒ株の内部遺伝子を用いて組換えウイルスを生成した。しかし、これらのウイルスの卵中の増殖は最適未満である。
【００１０】
同様に、Ｍｉｎｇら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００６年）２２巻、７２０〜７２６頁は、とりわけＨ５Ｎ１株からの改変ＨＡ遺伝子およびＨ２Ｎ３からのＮＡ遺伝子とともに、Ｈ９Ｎ２ウイルス株からの内部遺伝子を含む再集合体ウイルスを記載した。Ｓｈｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７年）２５巻、７３７９〜７３８４頁は、とりわけＨ５Ｎ１株からの改変ＨＡおよび野生型ＮＡ遺伝子とともに、Ｈ９Ｎ２株からの内部遺伝子を有する再集合体ウイルスを記載した。Ｈｉｃｋｍａｎら、（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８９巻、２６８２〜２６９０頁、２００８年）は、とりわけＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ２株からのＨＡおよび／またはＮＡ遺伝子でレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）したＨ９Ｎ２株からのバックボーン遺伝子を含むワクチンを記載した。
【００１１】
最近の研究は、卵の設備の保全および維持のコスト、卵タンパク質からのウイルスの精製、ならびに残余の卵タンパク質に対するアレルギーなど、卵中のウイルスの増殖で通常観察される問題点を回避するために、哺乳動物細胞培養液中で増殖させたワクチンを産生することを試みている。数ある中でも、特許文献２および特許文献３は、ワクチン品質のウイルスを生成することができる細胞培養系の開発を論じている。ウイルスの増殖の改善に適合されたベロ細胞を開示し、ワクチン生成を記載しているＫｉｓｔｎｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻、９６０〜８頁、１９９８年）、ならびに、とりわけ、ベロ細胞中で増殖したホルマリン不活化されたＨ５Ｎ１全ウイルスワクチンを記載しているＥｈｒｌｉｃｈら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３５巻、２５７３〜８４頁、２００８年）も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７，０３７，７０７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１４６，８７３号明細書
【特許文献３】米国特許第７，１３２，２７１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、当技術分野において、感染を引き起こさずに宿主において良好な免疫反応を誘発することができ、哺乳動物細胞培養中で堅調な増殖を示す、以前のワクチンに比べて抗原性の増大した汎流行性、または季節性のインフルエンザワクチンを生成する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、インフルエンザウイルスに対する改善されたワクチンの生成を提供するものであり、ワクチンは、同じウイルスのインフルエンザＡ亜型またはインフルエンザＢ株からの赤血球凝集素遺伝子およびノイラミニダーゼ遺伝子、ならびに異なるインフルエンザＡ亜型またはインフルエンザＢ株からの内部遺伝子を有する再集合体ウイルスを含んでいる。一態様において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびに内部遺伝子は、インフルエンザＡの高病原性Ｈ５Ｎ１株に由来する。
【００１５】
一態様において、本発明は、第１のインフルエンザウイルスＡ亜型からの内部遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）、ならびに内部遺伝子が由来するインフルエンザウイルス亜型からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、内部遺伝子はインフルエンザＡ亜型の第１の株に由来し、ＨＡおよびＮＡ遺伝子はインフルエンザＡ亜型における第２の株に由来する、再集合体インフルエンザウイルスを提供する。ＮＳ遺伝子がＮＳ１遺伝子、ＮＳ２遺伝子、またはＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を含むことがさらに企図される。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株の内部遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスからの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、精製された再集合体インフルエンザウイルスを企図するものである。関連の一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は第１のＨ５Ｎ１クレードからであり、内部遺伝子は第２のＨ５Ｎ１クレードからである。さらなる一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびに内部遺伝子は同じクレードに由来する。ＮＳ遺伝子がＮＳ１遺伝子、ＮＳ２遺伝子、またはＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を含むことがさらに企図される。
【００１７】
別の一実施形態において、本発明は、第１のインフルエンザウイルスＢ株からの内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびに第２のインフルエンザＢ株からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、ウイルスが哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする再集合体インフルエンザウイルスを企図するものである。
【００１８】
さらなる一実施形態において、再集合体ウイルスのＨＡ遺伝子は弱毒化ウイルスを生成するように改変されている。一実施形態において、ＨＡ遺伝子は多塩基性切断部位で改変されている。またさらなる一実施形態において、ＨＡ遺伝子における多塩基性切断部位の改変は、
【００１９】
【化１】

【００２０】
の変異である。
【００２１】
別の一実施形態において、ウイルスは哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする。なおさらなる一実施形態において、哺乳動物細胞は、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、Ｌｅｄｅｒｌｅ １３０、Ｃｈａｎｇ ｌｉｖｅｒおよびＷＩ−３８；Ｕ９３７、ベロ、ＣＶ−１、ＩＭＲ−９０およびＩＭＲ−９１、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＨＥＫ、Ｈ９、ＣＥＭおよびＣＤ４発現ＨＵＴ７８、ＰｅｒＣ６、ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳＣ、およびＬＬＣ−ＭＫ２からなる群より選択される。関連の一実施形態において、哺乳動物細胞培養物はベロ細胞培養物である。
【００２２】
ある実施形態において、インフルエンザＡ亜型は、
【００２３】
【化２】

【００２４】
を含む、Ｈ１からＨ１６、およびＮ１からＮ９のあらゆる組合せを含む。いくつかの実施形態において、インフルエンザＡ亜型はＨ５Ｎ１である。
【００２５】
一実施形態において、再集合体ウイルスの内部遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下の詳細な説明にさらに詳しく記載するものに由来する。関連の一実施形態において、前記内部遺伝子は、
【００２６】
【化３】

【００２７】
からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する。特定の一実施形態において、内部遺伝子はＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである。
【００２８】
別の一実施形態において、再集合体ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下にさらに詳しく記載するものに由来する。さらなる一実施形態において、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は、
【００２９】
【化４】

【００３０】
からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する。
【００３１】
ある実施形態において、内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来する。他の実施形態において、内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は異なるウイルス株に由来する。
【００３２】
一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子はＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである。別の一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子はＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである。
【００３３】
別の一態様において、本発明は、第１のインフルエンザウイルスＡ亜型からの内部遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）、ならびに内部遺伝子が由来するインフルエンザウイルス亜型からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、内部遺伝子がインフルエンザＡ亜型の第１の株に由来し、ＨＡおよびＮＡ遺伝子がインフルエンザＡ亜型における第２の株に由来する、抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物を提供する。ＮＳ遺伝子が、ＮＳ１遺伝子、ＮＳ２遺伝子、またはＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を含むことがさらに企図される。
【００３４】
一実施形態において、抗原性再集合体インフルエンザＡウイルス組成物は、インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株に由来する内部遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＡウイルスに由来する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来する。ＮＳ遺伝子が、ＮＳ１遺伝子、ＮＳ２遺伝子、またはＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を含むことがさらに企図される。
【００３５】
さらなる一実施形態において、本発明は、第１のインフルエンザウイルスＢ株からの内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびに第２のインフルエンザＢ株からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含む抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物を提供し、ウイルスは哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする。
【００３６】
一実施形態において、組成物のＨＡ遺伝子は弱毒化ウイルスを生成するように改変されている。関連の一実施形態において、ＨＡ遺伝子は多塩基性切断部位で改変されている。
【００３７】
さらなる一実施形態において、インフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする。
【００３８】
一実施形態において、抗原組成物の内部遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下にさらに詳しく記載するものに由来する。関連の一実施形態において、前記内部遺伝子は、
【００３９】
【化５】

【００４０】
からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する。特定の一実施形態において、内部遺伝子はＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである。
【００４１】
別の一実施形態において、抗原組成物のＨＡおよびＮＡ遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下にさらに詳しく記載するものに由来する。さらなる一実施形態において、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は、
【００４２】
【化６】

【００４３】
からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する。
【００４４】
ある実施形態において、抗原組成物の内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来する。他の実施形態において、内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は異なるウイルス株に由来する。
【００４５】
一実施形態において、抗原組成物のＨＡおよびＮＡ遺伝子はＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである。別の一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子はＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである。
【００４６】
なおさらなる一実施形態において、ＨＡ遺伝子における多塩基性切断部位の改変は、
【００４７】
【化７】

【００４８】
の変異である。
【００４９】
別の一実施形態において、抗原組成物は薬学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００５０】
一態様において、本発明は再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンを企図するものであり、ウイルスは、ｉ）表面タンパク質ＨＡをコードするポリヌクレオチドおよび表面タンパク質ＮＡをコードするポリヌクレオチド（ＨＡおよびＮＡの各々はインフルエンザウイルスＡ亜型の第１の株に由来する）、ＰＢ１をコードするポリヌクレオチド、ＰＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ２をコードするポリヌクレオチド、Ｍをコードするポリヌクレオチド、ＮＳ（ＮＳ１および／またはＮＳ２）をコードするポリヌクレオチド、ＮＰをコードするポリヌクレオチド（インフルエンザＡウイルス亜型の第２の株に由来する、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳについてのポリヌクレオチド）を含み、ポリヌクレオチドは再集合したポリヌクレオチドのビリオンへのパッケージングを可能にするように作動可能に連結されている。
【００５１】
関連の一実施形態において、本発明は再集合体インフルエンザＡウイルスを含むワクチンを提供し、ウイルスは、表面タンパク質ＨＡをコードするポリヌクレオチドおよび表面タンパク質ＮＡをコードするポリヌクレオチド（ＨＡおよびＮＡの各々はＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する）、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する、ＰＢ１をコードするポリヌクレオチド、ＰＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ２をコードするポリヌクレオチド、Ｍをコードするポリヌクレオチド、ＮＳ１をコードするポリヌクレオチド、（ＮＳ１および／またはＮＳ２、ＮＰをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ１、ＰＡ、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳに対するポリヌクレオチド）を含み、ポリヌクレオチドは再集合したポリヌクレオチドのビリオンへのパッケージングを可能にするように作動可能に連結されている。
【００５２】
関連の一実施形態において、本発明は再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンを企図するものであり、ウイルスは、表面タンパク質ＨＡをコードするポリヌクレオチドおよび表面タンパク質ＮＡをコードするポリヌクレオチド（ＨＡおよびＮＡの各々はインフルエンザＢウイルスの第１の株に由来する）、ＰＢ１をコードするポリヌクレオチド、ＰＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ２をコードするポリヌクレオチド、Ｍをコードするポリヌクレオチド、ＮＰをコードするポリヌクレオチド、ＮＳをコードするポリヌクレオチド（インフルエンザＢウイルスの第２の株に由来する、ＰＢ１、ＰＡ、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳについてのポリヌクレオチド）を含み、ポリヌクレオチドは再集合したポリヌクレオチドのビリオンへのパッケージングを可能にするように作動可能に連結されており、ウイルスは哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする。
【００５３】
一実施形態において、組成物のＨＡ遺伝子は弱毒化ウイルスを生成するように改変されている。関連の一実施形態において、ＨＡ遺伝子は多塩基性切断部位で改変されている。
【００５４】
一実施形態において、ワクチンにおける内部遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下にさらに詳しく記載するものに由来する。関連の一実施形態において、前記内部遺伝子は、Ｈ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に由来する。
【００５５】
別の一実施形態において、ワクチンにおけるＨＡおよびＮＡ遺伝子は、当技術分野において公知であるＨ５Ｎ１ウイルス、および以下にさらに詳しく記載するものに由来する。さらなる一実施形態において、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は、
【００５６】
【化８】

【００５７】
【化９】

【００５８】
からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する。
【００５９】
ある実施形態において、ワクチンにおける内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来する。他の実施形態において、内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子は異なるウイルス株に由来する。
【００６０】
一実施形態において、ワクチンにおけるＨＡおよびＮＡ遺伝子は、Ｈ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである。別の一実施形態において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は、Ｈ５Ｎ１株Ａ／ｌｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである。
【００６１】
なおさらなる一実施形態において、ＨＡ遺伝子における多塩基性切断部位の改変は、
【００６２】
【化１０】

【００６３】
の変異である。
【００６４】
別の一実施形態において、ワクチンはアジュバントをさらに含む。例示のアジュバントには、それだけには限定されないが、サポニン、非イオン性洗剤、植物油、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＩＳＣＯＭ、ナノビーズ、スクアレン、およびブロック共重合体が含まれ、これらは単独で、または組み合わせて使用することが企図される。
【００６５】
さらなる一実施形態において、ワクチンは不活化ワクチンである。不活化は、それだけには限定されないが、ホルムアルデヒド、ＵＶ照射、グルタルアルデヒド、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、およびβ−プロピオラクトンを含めた、当技術分野において公知の方法および薬剤を用いて行われることが企図される。ワクチンを弱毒化生ウイルスワクチンとして投与することも企図される。
【００６６】
一実施形態において、ワクチンはＨＡ１μｇから７５μｇまでのＨＡ含量を含む。さらなる一実施形態において、ワクチンは１ワクチンあたり１μｇから３０μｇまでのＨＡ含量を含む。関連の実施形態において、必要に応じて、ＨＡ１μｇ、３μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、または最高ＨＡ１００μｇのあらゆる量のワクチンの投与量を投与する。したがって、ワクチンの単回投与量は、赤血球凝集素約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１μｇ、約２２μｇ、約２３μｇ、約２４μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、約１００μｇ、および１００μｇを超えて有するものを含む（同じ量または異なる量の赤血球凝集素の単回または複数回投与量において提供される）。
【００６７】
別の一実施形態において、本発明は、本明細書に記載するウイルス、抗原組成物、またはワクチンを、少なくとも１つのＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス株の感染から被験体を保護するのに有効な量において投与することを含む、被験体における、少なくとも１つの汎流行のインフルエンザウイルス株に対する免疫反応を誘発するための方法を提供する。関連の一態様において、本発明は、本明細書に記載するウイルス、抗原組成物、またはワクチンを、少なくとも１つのインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢウイルス株の感染から被験体を保護するのに有効な量において投与することを含む、被験体における、少なくとも１つの季節性インフルエンザウイルス株に対する免疫反応を誘発するための方法を企図するものである。
【００６８】
さらなる一態様において、本発明は、本明細書に記載するウイルス、抗原組成物、またはワクチンの有効量を被験体に投与することを含む、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスによる被験体の感染を防ぐための方法を企図するものである。別の一態様において、本発明は、本明細書に記載するウイルス、抗原組成物、またはワクチンの有効量を被験体に投与することを含む、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢウイルスによる被験体の感染を防ぐための方法を企図するものである。
【００６９】
一実施形態において、本発明の方法において有用なワクチンは、ＨＡ１μｇから７５μｇまでのＨＡ含量を含む。別の一実施形態において、ワクチンは、１ワクチンあたり１μｇから３０μｇのＨＡ含量を含む。関連の実施形態において、必要に応じて、ＨＡ１μｇ、３μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、または最高ＨＡ１００μｇのあらゆる量のワクチン投与量を投与する。したがって、ワクチンの単回投与量は、赤血球凝集素約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１μｇ、約２２μｇ、約２３μｇ、約２４μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、約１００μｇ、および１００μｇを超えて有するものを含む（同じ量または異なる量の赤血球凝集素が単回または複数回投与量において提供される）。
【００７０】
別の一態様において、本発明は、再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンを作製する方法を提供し、該ウイルスは、インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株の内部遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスからの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来し、ＨＡ遺伝子は弱毒化ＨＡ遺伝子を生成するように多塩基性切断部位で改変され、方法は再集合体ウイルスの増殖に適する条件下で哺乳動物細胞中にウイルスをトランスフェクトすることを含む。関連の一実施形態において、本明細書に記載するワクチンを作製する方法は、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢ型の季節性インフルエンザ株を含むワクチンを作製するのに有用である。
【００７１】
一実施形態において、哺乳動物細胞は、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、Ｌｅｄｅｒｌｅ １３０、Ｃｈａｎｇ ｌｉｖｅｒおよびＷＩ−３８；Ｕ９３７、ベロ、ＣＶ−１、ＩＭＲ−９０およびＩＭＲ−９１、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＨＥＫ、Ｈ９、ＣＥＭおよびＣＤ４発現ＨＵＴ７８、ＰｅｒＣ６、ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳＣ、およびＬＬＣ−ＭＫ２からなる群より選択される。関連の一実施形態において、哺乳動物細胞はベロ細胞である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、上記に記載するウイルスおよび組成物は、インフルエンザの内部遺伝子６個全てを欠くことがさらに企図される。一実施形態において、再集合体ウイルスは、インフルエンザウイルスの内部遺伝子２個、３個、４個、または５個を含む。例えば、一実施形態において、再集合体ウイルスおよび／またはその組成物および／またはワクチンは、ＮＳ１遺伝子の全てまたは部分を欠く。
【００７３】
なお別の一態様において、本発明は、任意のインフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルス株を用いて行われることが企図される。一実施形態において、再集合体ウイルスは、インフルエンザＡからの８個のインフルエンザ遺伝子の任意の組合せを有していてよい。関連の一実施形態において、再集合体ウイルスは、インフルエンザＢウイルスからのインフルエンザ遺伝子８個の任意の組合せを有していてよい。
【００７４】
本発明から除外されるのは、それだけには限定されないが、米国特許第４，５５２，７５８号、同第７，０３７，７０７号、同第７，６０１，３５６号、同第７，５６６，４５８号、同第７，５２７，８００号、同第７，５１０，７１９号、同第７，５０４，１０９号、同第７，４６５，４５６号、および同第７，４５９，１６２号；米国特許公開第２００９０２９７５５４号、同第２００９０２４６２２５号、同第２００９０２０８５２７号、同第２００９０１７５９０９号、同第２００９０１７５９０８号、同第２００９０１７５９０７号、同第２００９０１３６５３０号、同第２００８００６９８２１号、同第２００８００５７０８１号、同第２００６０２５２１３２号、同第２００６０１５３８７２号、同第２００６０１１０４０６号、同第２００５０１５８３４２号、同第２００５００４２２２９号、および同第２００７０１７２９２９号；国際特許公開ＷＯ２００８／１５７５８３号、ＷＯ２００８／０２１９５９、ＷＯ２００７／０４８０８９、ＷＯ２００６／０９８９０１、ＷＯ２００６／０６３０５３、ＷＯ２００６／０４１８１９、ＷＯ２００５／１１６２６０、ＷＯ２００５／１１６２５８、ＷＯ２００５／１１５４４８、ＷＯ２００５／０６２８２０、ＷＯ２００３／０９１４０１を含めた、本明細書に参照される任意の以前の公開において、先に開示されたか、または、例えば、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）およびＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６などのバックボーンを用いて生成された、第１の亜型の１株からの内部遺伝子および同じ亜型の異なる株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する任意のウイルス（インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ）、ならびに組換えウイルスにおいてインフルエンザＡ亜型の１株からの内部遺伝子および同じ亜型の異なる株のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含むことがある、ＦＬＵＭＩＳＴ^ＴＭワクチンに有用であるとその中で同定された任意のウイルスである。このような文書は全て、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００７５】
一実施形態において、本発明はまた、インフルエンザ亜型の第１の株のバックボーン、ならびに同じインフルエンザ亜型の第２の株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む、天然に存在する再集合体ウイルスを除外するものである。本明細書で用いられる「天然に存在する再集合体ウイルス」という用語は、外部の供給源からの介入なしに、ウイルス宿主などの天然の環境中で組み換わる再集合体ウイルスを意味する。
【００７６】
さらなる一実施形態において、本発明は、バックボーンとして第１のインフルエンザＡまたはＢ亜型からの改変された内部遺伝子を１つまたは複数（例えば、変異したＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）、ならびに、例えば、米国特許公開第２００７０１７２９２９号において例示される、インフルエンザウイルスの同じ株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する再集合体ウイルスを除外するものである。しかし、本発明は、一インフルエンザ亜型のバックボーン株の改変された内部遺伝子、ならびに同じ亜型であるが異なる株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含むウイルスが本発明の範囲内に含まれることを企図するものである。
【００７７】
なお別の一実施形態において、本発明は、バックボーン／ドナー株として、例えば、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６、および当技術分野において公知の他のものなど、低温適応ウイルスを用いて産生された再集合体ウイルス（ここで、内部のバックボーン遺伝子は第１の亜型からであり、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じ亜型の異なる株からである）を除外するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１−１】図１は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図１−２】図１は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図１−３】図１は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図１−４】図１は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図１−５】図１は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図２−１】図２は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図２−２】図２は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図２−３】図２は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図２−４】図２は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図２−５】図２は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−１】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−２】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−３】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−４】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−５】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図３−６】図３は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−１】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−２】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−３】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−４】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−５】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【図４−６】図４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３に由来する非コード領域を用いた、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列、および他の内部遺伝子の配列の改変を示す図である。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに由来する配列は下線付きである。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
（詳細な説明）
本発明は、様々なインフルエンザ株に由来する、両方ともウイルスの構造タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにウイルス内部遺伝子［ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ（ＮＳ１、ＮＳ２）、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰ］を有する再集合体ウイルスを含む、改善されたワクチンを提供する。本発明のワクチンは、ウイルスの内部遺伝子が特定のインフルエンザ株に由来し、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じ株に由来するが、内部遺伝子が由来する株は、ＨＡおよびＮＡ遺伝子が由来するインフルエンザＡ亜型またはインフルエンザＢ株とは異なるインフルエンザＡ亜型またはインフルエンザＢ株であるものである。一態様において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じインフルエンザＡ亜型に由来し、別の一態様において、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は異なるインフルエンザＡ亜型に由来する。本発明を、Ｈ５Ｎ１ワクチンおよび抗原組成物を特に参照して一貫して例証するが、記載通りに構築されるあらゆるインフルエンザ株が本発明に含まれることが理解される。本発明のワクチンは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ株に対するワクチンを含む。インフルエンザＡ株は、ＨＡ亜型１６個およびＮＡ亜型９個を含む。再集合体ウイルスは細胞培養物中で効率的に増殖することができ、これは発育卵における伝統的な増殖方法を凌ぐ改善された生成方法である。
【００８０】
別段の定義がなされなければ、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参照は、当業者に、本発明において用いられる用語の多くの一般的定義を提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４年）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編集、１９８８年）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら、（編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１年）。
【００８１】
本明細書に引用する各出版物、特許出願、特許、および他の参照は、本開示と相反しない程度まで、その全文が参照によって組み入れられる。
【００８２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、明らかに文脈が特に規定しなければ複数への言及を含むことをここで指摘する。
【００８３】
本明細書で用いられる以下の用語は、特に特定しなければ、これらに帰する意味を有する。
【００８４】
「再集合体ウイルス」という用語は、目的のウイルス株からの抗原タンパク質をコードする遺伝子セグメント（例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子）が、異なる株のウイルスからのウイルスのポリメラーゼ複合体（ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ）遺伝子、または他の同様な遺伝子（例えば、Ｍ遺伝子およびＮＳ遺伝子を含めた非糖タンパク質遺伝子、ならびに核タンパク質（ＮＰ）遺伝子）をコードする遺伝子セグメントと組み合わされたウイルスである。本明細書で用いられる「株」は、所定の種、例えば、インフルエンザＡまたはＢ種、およびインフルエンザＡウイルスの亜型の特定のウイルス改変体を意味する。例えば、ウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４はインフルエンザＡウイルス、Ｈ５Ｎ１亜型であり、株名Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４である。
【００８５】
「に由来する」という用語は、野生型の、または天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列から変更、または変異されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の全てまたは部分を意味し、野生型の配列に由来するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それがもはや野生型配列と同じ配列を有さないように、１つまたは複数の塩基またはアミノ酸が変更されている。
【００８６】
本明細書で用いられる「亜型」という用語は、ウイルス株において発現されるＨＡおよびＮＡ遺伝子に基づいて亜型に分けることができるインフルエンザＡ株内の様々なウイルスを意味する。インフルエンザＡ亜型の命名法はＨＡ亜型（例えば、亜型は当技術分野において公知の１６個の異なるＨＡ遺伝子のいずれか１つである）、およびＮＡ亜型（例えば、当技術分野において公知の９個の異なるＮＡ遺伝子のいずれか）に基づく。例示の亜型には、それだけには限定されないが、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、および当技術分野において公知の非常に多くのものが含まれる。
【００８７】
本明細書で用いられる「クレード」という用語は、存在するインフルエンザＡＨ５Ｎ１ウイルスの異なるカテゴリー化を意味する。Ｈ５Ｎ１クレードにおけるウイルスは一般的に関連しているが、正確なウイルスゲノムを共有していない。当技術分野において、例えば、クレード１、クレード２、クレード３、クレード４、クレード５、クレード６、およびクレード７と呼ばれる、Ｈ５Ｎ１亜型の少なくとも７つの異なるクレードが存在する。クレード２はサブクレードにさらに分類される。
【００８８】
「抗原組成物」という用語は、免疫系を刺激し、宿主または被験体の免疫反応を誘発する材料を含む組成物を意味する。「免疫反応を誘発する」という用語は、抗原などの刺激への反応における、インビボの免疫細胞の刺激を意味する。免疫反応は、細胞性免疫反応（例えば、Ｔ細胞およびマクロファージの刺激）ならびに体液性免疫反応（例えば、Ｂ細胞および補体の刺激、ならびに抗体の生成）の両方からなる。細胞性免疫反応と体液性免疫反応とは相互に排他的ではなく、一方または両方が、本明細書に記載する抗原組成物、ウイルス、またはワクチンによって刺激されることが企図される。免疫反応は、それだけには限定されないが、抗体免疫アッセイ、増殖アッセイ、および詳細な説明においてさらに詳しく記載されている他のものを含む、当技術分野において周知の技術を用いて測定することができる。
【００８９】
「弱毒化」という用語は、（野生型ウイルスに比べて）毒力の減少を示すウイルスまたは抗原組成物を記載するのに用いられる。改変されたＨＡは、野生型ＨＡから改変されており、野生型ＨＡタンパク質よりも低い程度で切断されるタンパク質をコードし、ウイルスの増殖の低減をもたらすＨＡ遺伝子である。弱毒化ウイルスは、常にではないが通常、鼻腔内投与される。弱毒化ウイルスの投与は、本明細書に記載する任意の経路によることが企図される。
【００９０】
本明細書で用いられる「不活化」という用語は、「死滅させた」または「死滅した」ウイルスとして当技術分野においてやはり公知であるウイルスを記載する。不活化ウイルスは、ウイルスが任意の方法で予め弱毒化されているか否かに関わらず、毒性の性質のない全体のウイルスであり、「生」ウイルスから生成される。不活化ウイルスは、常にではないが通常、筋肉内注射によって投与される。不活化ウイルスの投与は、本明細書に記載する任意の経路によることが企図される。
【００９１】
本明細書で用いられる「ワクチン」という用語は、被験体においてウイルスに対する免疫性を確立するのに有用である、本明細書に記載する再集合体ウイルスを含む組成物を意味する。ワクチンは、薬学的に許容されるキャリアおよび／またはアジュバントを含むことが企図される。ワクチンは予防的または治療的であることが企図される。「予防的」処置は、疾患の徴候を表さず、または初期の徴候のみを表す被験体に、病状を発症する危険性を低減する目的で施す処置である。本発明の化合物を、病状を発症する可能性を低減するための、または発症した場合は病状の重症度を最小にするための予防的処置として与えてよい。「治療的」処置は、病状の徴候または症状を表す被験体に、これらの徴候または症状を低減、または排除する目的で施す処置である。徴候または症状は、生化学的、細胞上、組織学的、機能的、主観的、または客観的であってよい。
【００９２】
ポリペプチドの「フラグメント」は、全長のポリペプチドまたはタンパク質発現生成物より小さいポリペプチドのあらゆる部分を意味する。一態様において、フラグメントは、１つまたは複数のアミノ酸残基が、全長のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去された、全長のポリペプチドの欠失類似体である。したがって、「フラグメント」は、以下に記載する欠失類似体のサブセットである。
【００９３】
「類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）」、「類似体（ａｎａｌｏｇ）」、または「誘導体」は、交換可能に用いられ、実質的に構造が類似しており、ある場合には異なる程度であるが、天然に存在する分子と同じ生物学的活性を有する化合物（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を意味する。類似体は、（ｉ）ポリペプチドの１つもしくは複数の末端、および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つもしくは複数の内部領域の１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失（ｉｉ）ポリペプチドの１つもしくは複数の末端（典型的には「付加」類似体）、および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つもしくは複数の内部領域（典型的には「挿入」類似体）の１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加、あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における他のアミノ酸への１つまたは複数のアミノ酸の置換、を含む１つまたは複数の変異に基づいて、類似体が由来する天然に存在するポリペプチドに比べて、そのアミノ酸配列の組成が異なる。本発明の再集合体ウイルスが、任意の１つまたは１つを超えるＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ（Ｍ１およびＭ２）、ＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）、ならびにＮＰ遺伝子を含む、ウイルス遺伝子の類似体を含むことが企図される。
【００９４】
一態様において、類似体は、野生型もしくは天然に存在する配列、例えばペプチドに、約７０％の配列類似性を示すが、１００％未満の配列類似性を示す。一態様において、このような類似体または誘導体は、限定的なものではなく例示として、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン、およびノルバリンを含めた非天然のアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基を含む。別の一態様において、このような類似体または誘導体は、１つもしくは複数のＤ−アミノ酸残基からなり、または２つもしくはそれを超えるアミノ酸残基間に非ペプチドインターリンケージ（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）を含んでいる。一実施形態において、類似体または誘導体はポリペプチドのフラグメントであってよく、フラグメントは野生型ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸の長さにわたって実質的に相同（すなわち、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％相同）である。
【００９５】
置換は、置換されるアミノ酸、およびそれを置換するアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づいて、保存的または非保存的である。このタイプの置換は、当技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示の保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年）７１〜７７頁］に記載されており、以下に記載するものである。
【００９６】
【化１１】

【００９７】
あるいは、例示の保存的置換をすぐ下に記載する。
【００９８】
【化１２】

【００９９】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その天然の環境から取り出されたウイルスまたは抗原組成物を意味する。したがって、単離された生物学的材料には、いくつかのまたは全ての細胞成分、すなわち天然の材料が天然に存在する細胞の成分（例えば、細胞質成分または膜成分）がない。一態様において、ウイルスまたは抗原組成物が細胞抽出物または上清中に存在する場合、ウイルスまたは抗原成分は単離されたとみなされる。核酸分子の場合、単離された核酸は、ＰＣＲ生成物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限フラグメントを含んでいる。
【０１００】
本明細書で用いられる「精製された」という用語は、それから組成物が得られる内因性材料を含めた、非関連の材料すなわち夾雑物の存在を低減または排除する条件下で単離されたウイルスまたは抗原組成物を意味する。例示として、制限的なものではないが、精製されたビリオンには、組織培養物もしくは卵タンパク質、および非特異的な病原体を含めた、宿主細胞または培養物成分が実質的にない。様々な実施形態において、夾雑物が本質的にない精製された材料は、少なくとも５０％純粋であり、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当技術分野において公知の他の方法によって評価することができる。
【０１０１】
「薬学的組成物」という用語は、ヒトおよび哺乳動物を含む被験体動物に投与するのに適する組成物を意味する。薬学的組成物は、薬理学的有効量の本発明のウイルスまたは抗原組成物を含み、薬学的に許容されるキャリアも含んでいる。薬学的組成物は、有効成分、および薬学的に許容されるキャリアを構成する不活性成分、ならびにあらゆる２つまたはそれを超える成分の組合せ、複合体形成、または凝集に、直接的または間接的に起因するあらゆる生成物を含む組成物を包含する。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物または結合体、および薬学的に許容されるキャリアを混合することによって作製されるあらゆる組成物を包含する。
【０１０２】
「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、あらゆる全ての臨床上有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、バッファー、および賦形剤、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、デキストロースまたはマンニトールの５％水溶液、およびエマルジョン、例えば、油／水または水／油エマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤および／またはアジュバントを含む。適切な薬学的キャリアおよび処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、１９９５年）に記載されている。組成物に有用な薬学的キャリアは、有効薬剤を投与する意図された様式による。典型的な投与様式には、それだけには限定されないが、経腸（例えば、経口）、あるいは非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、または経粘膜投与）が含まれる。「薬学的に許容される塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含めた、薬学的使用のために化合物または結合体中に処方することができる塩である。
【０１０３】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、生物学的にまたは他の点で望ましくないことがない材料を意味する。すなわち、該材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに、またはそれが含まれる組成物のいかなる成分とも有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができ、あるいは、以下に記載する、当技術分野において周知の経路を用いて投与した場合に、該材料は、生物学的にまたは他の点で望ましくないことがない。
【０１０４】
（インフルエンザ遺伝子）
インフルエンザウイルスは、分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、オルトミクソウイルス科に属する。インフルエンザＡウイルスは、９個の構造タンパク質からなり、調節的機能を有する１個の非構造ＮＳ１タンパク質をさらにコードしている。インフルエンザウイルスの分節型ゲノムは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、赤血球凝集素（サブユニットＨＡ１およびＨＡ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を含む、少なくとも１０個のポリペプチドをコードする８個のマイナス鎖ＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）遺伝子セグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ）を含んでいる（Ｋｒｕｇら、Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｒ． Ｍ． Ｋｒｕｇ編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、８９〜１５２頁）。
【０１０５】
広範囲に及ぶ疾患を引き起こすインフルエンザウイルスの能力は、抗原の変更を行うことによって免疫系を回避するその能力によるものであり、これは宿主が動物のインフルエンザウイルスとヒトのインフルエンザウイルスの両方に同時に感染したときに生じると考えられている。宿主における変異および再集合中に、ウイルスは、別のウイルスからのＨＡおよび／またはＮＡ表面タンパク質遺伝子をそのゲノム中に組み込み、それによって新しいインフルエンザ亜型を生成し、免疫系を回避することができる。
【０１０６】
（赤血球凝集素）
ＨＡは、アミノ酸およそ５６０個を含み、全ウイルスタンパク質の２５％を表す、ウイルスの表面糖タンパク質である。これは、感染の初期段階において、ウイルス粒子の宿主細胞への付着および宿主細胞中への侵入を担う。１６個のＨＡ亜型が知られており、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６亜型と分類されている。
【０１０７】
ウイルスのＨＡ０前駆体のＨＡ１およびＨＡ２サブフラグメントへの切断は、ウイルスが細胞に感染するために必要なステップである。このように、宿主細胞における新しいウイルス粒子が新しい細胞に感染することができるビリオンに変換されるために、切断が必要とされる。切断は、内在性ＨＡ０膜タンパク質が、感染した細胞の小胞体から原形質膜に輸送される間に起こることが知られている。輸送の過程において、赤血球凝集素は、前駆体ＨＡのアミノ末端フラグメントＨＡ１およびカルボキシ末端ＨＡ２へのタンパク分解性切断を含めた、一続きの翻訳時修飾および翻訳後修飾を受ける。一次組織培養物または確立された細胞系中でインフルエンザ株を増殖させる上での主な困難の１つは、宿主細胞におけるインフルエンザ赤血球凝集素のタンパク分解性の切断活性化に対する必要性から生じる。
【０１０８】
非切断のＨＡは、ウイルスが細胞表面上のノイラミン酸含有受容体に付着するのを媒介し得ることが知られているが、感染サイクルにおける次の段階である融合の能力はない。ＨＡ２の疎水性アミノ末端が標的細胞中に挿入され得るように、切断によるＨＡ２の疎水性アミノ末端の曝露が必要とされ、その結果ウイルスと標的細胞の膜との間に架橋が形成されると報告されている。この過程の後、２つの膜が融合し、ウイルスが標的細胞中に侵入する。
【０１０９】
ＨＡのタンパク分解性の活性化は、トリプシン様エンドプロテアーゼによるアルギニン残基の切断を伴うが、この酵素はカルシウム依存性であり最適ｐＨが中性である細胞内酵素であることが多い。活性化型のプロテアーゼは細胞酵素であるので、感染した細胞型が、ＨＡが切断されるか否かを決定する。哺乳動物のインフルエンザウイルス、および非病原性のトリインフルエンザウイルスのＨＡは、限られた数の細胞型においてのみタンパク分解性の切断を受けやすい。一方、Ｈ５およびＨ７亜型の中でも病原性のトリウイルスのＨＡは、広範囲の様々な宿主細胞中に存在するプロテアーゼによって切断される。したがって、ウイルスの病原性の性質と相関する赤血球凝集素切断性における相違に起因する、宿主範囲における相違が存在する。
【０１１０】
切断性における相違は、ＨＡの切断部位のアミノ酸配列における相違によるものである。配列分析により、非病原性トリインフルエンザウイルスおよび全ての哺乳動物のインフルエンザウイルスのＨＡ分子のＨＡ１およびＨＡ２フラグメントは、１個のアルギニンによって連結されていることが示されている。これとは対照的に、病原性のトリ株は切断部位に一連のいくつかの塩基性アミノ酸を有しており、共通因子はリジン−アルギニンまたはアルギニン−アルギニンである（例えば、ＲＲＲＫ（配列番号１５））。全てのインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、同じ一般的メカニズムによって切断され、塩基性アミノ酸の排除をもたらす。
【０１１１】
（ノイラミニダーゼ）
ノイラミニダーゼは、インフルエンザＡウイルスの第２の膜糖タンパク質である。ウイルスのＮＡの存在は、感染性のウイルスからの多面的な防御免疫反応を産生するのに重要であることが示されている。ＮＡは、１４１３個のヌクレオチドの遺伝子によってコードされる、アミノ酸４１３個のタンパク質である。インフルエンザウイルスでは９つの異なるＮＡの亜型が同定されており（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９）、これらは全て野鳥に見出されている。ＮＡは、感染した細胞の表面上の炭水化物部分から末端のノイラミン酸（シアル酸とも呼ばれる）残基を切断することによって、ウイルスのＨＡに対する細胞受容体の破壊に関与している。ＮＡはまた、ウイルスタンパク質からシアル酸残基を切断し、ウイルスの凝集を防いでいる。このメカニズムを用いて、ＮＡは、新しく形成したウイルス粒子が細胞膜に沿って蓄積するのを防ぐことによって、また粘膜表面上に存在する粘液を通したウイルスの輸送を促進することによって、ウイルスの子孫の放出を促進すると仮定されている。ＮＡは抗原の変動をもたらす重要な抗原決定基である。
【０１１２】
ノイラミニダーゼの化学的インヒビターを投与すると、ウイルスの感染の重症度および伝播を制限する。ノイラミニダーゼのインヒビターは、ウイルスが宿主細胞から出芽するのを防ぐことによって、インフルエンザ感染と戦う。ＮＡインヒビターの例には、それだけには限定されないが、吸入によって投与するザナミビル、経口投与するオセルタミビル、および非経口投与するペラミビルが含まれる。
【０１１３】
（インフルエンザの内部遺伝子）
表面タンパク質ＨＡおよびＮＡの他に、インフルエンザウイルスは６個のさらなる内部遺伝子を含んでおり、これらは、ポリメラーゼ遺伝子ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ、マトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２、核タンパク質（ＮＰ）、ならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２を含む、８個の異なるタンパク質を生じる（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．、１４巻（１）、１２９〜４９頁、２００１年）。
【０１１４】
子孫のビリオンへのパッケージングのために、ウイルスのＲＮＡは、インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質および核外輸送タンパク質と会合して、３個のインフルエンザウイルスのポリメラーゼタンパク質、核タンパク質（ＮＰ）、およびウイルスのＲＮＡから構成されるリボ核タンパク質複合体として、核から輸送される（Ｍａｒｓｈら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８２巻、２２９５〜２３０４頁、２００８年）。エンベロープ内に位置するＭ１タンパク質は、アセンブリーおよび出芽において機能すると考えられている。
【０１１５】
限られた数のＭ２タンパク質がビリオンに統合される（Ｚｅｂｅｄｅｅ， Ｊ．、Ｖｉｒｏｌ．、６２巻、２７６２〜２７７２頁、１９８８年）。これらは、Ｈ＋イオンチャンネル活性を有する四量体を形成し、エンドソーム中の低ｐＨによって活性化されるとビリオン内部を酸性化し、その脱外被を促進する（Ｐｉｎｔｏら、Ｃｅｌｌ、６９巻、５１７〜５２８頁、１９９２年）。アマンタジンは、Ｍ２イオンチャンネル活性を妨害することによってウイルス感染を防ぎ、したがってウイルスの脱外被を阻害する抗インフルエンザ薬である。
【０１１６】
非構造タンパク質であるＮＳ１タンパク質は、スプライシングおよび核のｍＲＮＡの核外輸送の制御、ならびに輸送の刺激を含む、複数の機能を有する。ＮＳ１ノックアウトウイルスは生存可能であったが、インターフェロン非欠損細胞において親ウイルスほど効率的に増殖しなかったので、ＮＳ１の主な機能は宿主のインターフェロン活性に対抗することと考えられる（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５２巻、３２４〜３３０頁、１９９８年）。
【０１１７】
ＮＳ２タンパク質は、ウイルス粒子中に検出されている。ウイルス粒子中のＮＳ２タンパク質の平均数は、１３０〜２００分子であると推定されていた。インビトロの結合アッセイは、Ｍ１とＮＳ２との間の直接的なタンパク質−タンパク質の接触を示している。ＮＳ２−Ｍ１複合体は、ウイルスが感染した細胞溶解物中の免疫沈降によってやはり検出された（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６巻、２４９〜５５頁、１９９３年）。ＮＳ２タンパク質は、ビリオン中に存在することが知られており（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．、１１６巻、６９〜８０頁、１９９１年；Ｙａｓｕｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６巻、２４９〜２５５頁、１９９３年）、Ｍ１タンパク質との相互作用によって核からのＲＮＰの搬出において役割を果たすと考えられている（Ｗａｒｄら、Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．、１４０巻、２０６７〜２０７３頁、１９９５年）。
【０１１８】
（逆遺伝学と再集合体ウイルス）
特定の核酸およびタンパク質を単離し、改変するための技術は、当業者には周知である。本発明にしたがって、当業者の範囲内である、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年（本明細書における「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編集、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、１９９４年を参照されたい。これらの技術は、変異を含むＰＣＲ生成物を産生するために、変更されたヌクレオチドと一緒にオリゴヌクレオチドを用いた、部位特異的変異誘発を含んでいる。
【０１１９】
一態様において、本発明は、本明細書に記載し、当技術分野において公知である逆遺伝学法による、トリインフルエンザウイルスおよびそのワクチンの産生に基づくものである。
【０１２０】
インフルエンザウイルスのＲＮＡ転写のメカニズムは独特である（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．、１４巻（１）、１２９〜４９頁、２００１年）。細胞のｍＲＮＡから５’キャップがウイルスのエンドヌクレアーゼによって切断され、ウイルスのトランスクリプターゼによって転写のためのプライマーとして用いられる（Ｋｒｕｇら、Ｃｅｌｌ、１８巻、３２９〜３３４頁、１９７９年）。８個のＲＮＡセグメントのうち６個がモノシストロニックな方法でｍＲＮＡ中に転写され、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡに翻訳される。対照的に、２つのＲＮＡセグメントは、スプライシングによって２つのｍＲＮＡに各々転写される。ＭおよびＮＳ遺伝子の両方について、コーディングｍＲＮＡが様々な読み枠において翻訳され、それぞれＭ１およびＭ２タンパク質、ならびにＮＳ１およびＮＳ２タンパク質を産生する。高濃度の遊離ＮＰが、ｍＲＮＡ合成から相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）およびウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の合成への移行を引き起こす（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２巻、２２８５〜２２９０頁、１９８８年）。新しく合成されたｖＲＮＡは核においてＮＰとキャプシド形成し（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）、ウイルスｍＲＮＡの二次的な転写に対するテンプレートとして機能する。
【０１２１】
最近開発された逆遺伝学のシステムにより、インフルエンザウイルスゲノムの操作が可能になった（Ｐａｌｅｓｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻、１１３５４〜５８頁、１９９６年；ＮｅｕｍａｎｎおよびＫａｗａｏｋａ、Ａｄｖ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５３巻、２６５頁、１９９９年；Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９６巻、９３４５頁、１９９９年；Ｆｏｄｏｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７３巻、９６７９頁、１９９９年）。インフルエンザウイルスの状況における逆遺伝学は、マイナス鎖のＲＮＡゲノムを有する生物体を組換え生成するために、マイナス鎖のＲＮＡをｃＤＮＡへと操作するメカニズムである。逆遺伝学の技術は、ウイルスのポリメラーゼによるウイルスＲＮＡの認識に、および成熟したビリオンを産生するのに必要なシグナルをパッケージングするのに不可欠であるマイナス鎖ウイルスの非コード領域を含む、合成の組換えウイルスＲＮＡの調製を伴う。組換えＲＮＡは、組換えＤＮＡテンプレートから合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体とインビトロで再構成されて、細胞をトランスフェクトするのに用いることができる組換えリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。米国特許第６，０２２，７２６号および同第６，００１，６３４号を参照されたい。
【０１２２】
これらの組換え方法により、ポリペプチドのアミノ酸配列に対する特異的な変更を有するインフルエンザウイルス型を生成するのが可能になる。例えば、所望の置換を含むＨＡ分子は、組換えインフルエンザウイルスの一部であってよい。一方法において、組換えインフルエンザウイルスは、「プラスミドオンリー（ｐｌａｓｍｉｄ ｏｎｌｙ）」系などの遺伝子操作方法によって作製される（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻、３１６５頁、２００２年）。
【０１２３】
組換えウイルスを産生するための別の一方法において、８個のプラスミド系が用いられ、この場合マイナス鎖のＲＮＡがｐｏｌ Ｉプロモーターから発現され、ポリメラーゼ複合体タンパク質の共発現により、感染性のインフルエンザＡウイルスの形成がもたらされる（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９７巻、６１０８〜１３頁、２０００年）。この技術により、インフルエンザの汎流行の場合に用いるためのｃＤＮＡからのキメラのワクチンの迅速な生成が可能になり、病原性株を弱毒化する可能性がもたらされ（Ｓｕｂｂａｒａｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３０５巻、１９２〜２００頁、２００３年）、同時に、６：２の立体配置（すなわち、内部遺伝子６個、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子２個（各遺伝子１個））に対して再集合体ウイルスをスクリーニングする必要性が除かれる。米国特許第７，０３７，７０７号も参照されたい。
【０１２４】
一実施形態において、Ｈ５Ｎ１など、高病原性のインフルエンザウイルスの場合、ウイルスの高病原性の性質の原因となるＨＡの多塩基性切断部位を部位特異的変異誘発によって除去してウイルスを弱毒化し、ウイルスの分類をＢＳＬ−３からＢＳＬ−２に変える。さらに、原型のドナー株の内部遺伝子の１つまたは複数を他の亜型のウイルスの遺伝子によって置換して増殖の性質をさらに改善する。
【０１２５】
高増殖の性質をＨ５Ｎ１野生型ウイルスの免疫学的利点と組み合わせているこのようなウイルスは、生成のための時間を節約するものであり、一態様において、バックボーンとしてＶｉｅｔｎａｍまたはＩｎｄｏｎｅｓｉａなどのＨ５Ｎ１ウイルスからの６個の内部遺伝子、ならびに実際のＨ５Ｎ１汎流行（様）株のＨＡ（弱毒化のための変異した切断部位を有する）およびＮＡを有する６：２の再集合体である。高い増殖の可能性を有する再集合体ウイルスの別の一例は、ＶｉｅｔｎａｍまたはＩｎｄｏｎｅｓｉａなどのＨ５Ｎ１ウイルスからの５個の内部遺伝子、バックボーンとしてＨ１Ｎ１株のＰＢ２（細胞培養物中の増殖を改善するため）、ならびに実際のＨ５Ｎ１汎流行株のＨＡ（弱毒化のための変異した切断部位を有する）およびＮＡを有する、５：１：２の再集合体である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、再集合体ウイルスは、遺伝子操作されたウイルスを産生するためのヘルパーウイルス系の使用を記載しているＰａｌｅｓｅら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３巻、１１３５４〜５８頁、１９９６年）の方法を用いて調製される。一実施形態において、ウイルスはインフルエンザヘルパーウイルス法を用いて産生される。例えば、６：２再集合体を構築するために、弱毒化ＶＮ１２０３ウイルスを、ニワトリＥｇｙｐｔ株などの第２のＨ５Ｎ１株からのＨＡおよびＮＡを導入するためのヘルパーウイルスとして用いてもよい（Ａｌｙら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．、５２巻、２６９〜７７頁、２００８年）。トランスフェクタントウイルスの選択を、ヘルパーＨＡまたはＮＡタンパク質に対する中和抗体を用いて行う（例えば、上述、Ｐａｌｅｓｅらの図２を参照されたい）。
【０１２７】
本明細書に記載する、２つの例示の弱毒化Ｈ５Ｎ１再集合体は、Ｈ５Ｎ１クレード１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のバックボーン、すなわち６個の内部遺伝子（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ）を有し、１つはＨ５Ｎ１クレード１Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３株の変異したＨＡおよびＮＡ、ならびに異なるクレード（例えばクレード２株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）のＨ５Ｎ１ウイルスの変異したＨＡおよびＮＡを含んでいる。これら２つの弱毒化ＲＧ再集合体は、標準のベロ細胞（ウシ胎仔血清を含む）または血清タンパク質を含まないベロ細胞において高増殖の可能性を有する。これらの再集合体ウイルスはまた、全てのＨ５Ｎ１タンパク質、すなわち核タンパク質および細胞性免疫の誘発を主に担っているマトリックスタンパク質を含んでいるので、既存のＲＧ Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８再集合体に比べて増強されたＨ５Ｎ１特異的免疫反応を誘発する可能性も有する。これらのＨ５Ｎ１特異的な細胞性免疫反応はまた、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびメモリー細胞を特異的に誘発することによって広範な免疫反応を誘発する能力も有し、結果として改善されたブースター効果をもたらすことがある。この結果は、卵に適応させた季節性株の亜型Ｈ１Ｎ１に由来する内部タンパク質を有する既存のＨ５Ｎ１／ＰＲ８再集合体には当てはまらない（これは、強力なＨ５Ｎ１特異的細胞性免疫反応を誘発しない）。
【０１２８】
多数のＨ５Ｎ１株が当技術分野において同定されており、その各々が本発明に適合する。例えば、数ある中で、Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、２００５年２月、７９巻（４）、２１９１〜８頁；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０３巻、２８４５〜５０頁、２００６年；Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１４巻、１２９〜４９頁、２００１年、およびＣａｕｔｈｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、６５９２〜９頁、２０００年を参照されたい（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７９巻、３６９２〜０２頁、２００５年を参照されたい）。
【０１２９】
本発明において有用であるトリＨ５Ｎ１インフルエンザ株の例には、それだけには限定されないが、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（ＣＤＣ♯２００４７０６２８０）（ＶＮ１２０３）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（ＣＤＣ♯２００５７４０１９９）（ＩＮ５／０５）、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／Ｒ０４０５０５０／２００７（Ｈ５Ｎ１）（ＣａｍＲ０４）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）（ＡＨ１／０５）Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／０１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（ＴＴ０１）（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ Ｄｒｕｇｓ．、２２巻、２７９〜９２頁、２００８年を参照されたい）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５０−９２／９１（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１４巻、１２９〜４９頁、２００１年を参照されたい）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｅｎｇｌａｎｄ／８７−９２ＢＦＣ／９１（Ｈ５Ｎ１）（Ｌｏｎｄｔら、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、３６巻、３４７〜３５０頁、２００７年）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０３（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２２０／９７（例えば、Ｔｕｍｐｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７６巻、６３４４〜５５頁、２００２年を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／５９ （Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、上述を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、上述を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎａｋｏｍ−Ｐａｔｏｍ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／ＣＵ−Ｋ２／２００４（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ａｎｗａｒら、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌ．、６巻、１６１〜８頁、２００６年；Ｖｉｓｅｓｈａｋｕｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．、３２８巻、１６９〜７６頁、２００４年を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３１．２／２００２（Ｈ５Ｎ１）、（例えば、Ａｎｗａｒら、上述を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ５８／０４（Ｈ５Ｎ１）、（例えば、Ａｎｗａｒら、上述を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３８／２００４（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ａｎｗａｒら、上述を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０００／９７（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｓｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、３０２巻、３７７〜８３頁、２００３年を参照されたい）、ニワトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３１７．５／０１ならびにアヒルインフルエンザウイルス株Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｎｙａｎｇ／ＡＶＬ−１／０１（例えば、Ｔｕｍｐｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７６巻、６３４４〜５５頁、２００２年を参照されたい）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｈａｔａｙ／２００４／（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ａｎｗａｒら、上述を参照されたい）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／ＥＳ／０３（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／ＥＳＤ１／０３ （Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８２１／０２（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７９巻、３６９２〜０２頁、２００５年を参照されたい）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｃｈｉｎａ／Ｅ３１９−２／０３（Ｌｅｅら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２４巻、１９３〜２０１頁、２００７年を参照されたい）、シラサギインフルエンザウイルスＡ／ｅｇｒｅｔ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／７５７．２／０２（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７９巻、３６９２〜０２頁、２００５年を参照されたい）、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、６５９２〜９頁、２０００年を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−４／９９（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、上述を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−６／９９（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、上述を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−８／９９（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、上述を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−１０／９９、（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、上述を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｑｕａｉｌ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３６／０４（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ａｎｗａｒら、上述を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｓｗａｎ／Ｉｔａｌｙ／１７９／０６（Ｈ５Ｎ１）（例えば、Ｔｅｒｒｅｇｉｎｏら、Ｖｅｔ Ｒｅｃ．、１５８巻、４９１頁、２００６年を参照されたい）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）（ＨＫ１５６）（例えば、Ｃａｕｔｈｅｎら、上述を参照されたい）、ならびにトリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１）（ＨＫ２１３）（例えば、Ｓｈｉｎｙａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７９巻、９９２６〜３２頁、２００５年を参照されたい）、ならびにＬｅｅら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、１４巻、４８７〜９０頁、２００８年に公開されているものが含まれる。
【０１３０】
Ｈ５Ｎ１株からの内部遺伝子ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子を知った上で、一代替の実施形態において、これらの遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知であり日常的に行われている技術によって合成されることが理解される。
【０１３１】
別の一実施形態において、他のインフルエンザＡ亜型のインフルエンザウイルス、およびインフルエンザＢウイルスが、本発明の方法および組成物において有用である。例えば、あらゆるＨ１からＨ１６亜型を含めた任意のＨＡ亜型を有するインフルエンザＡウイルスが企図される。なおさらなる一実施形態において、ＮＡ亜型のＮ１からＮ９の任意のものを有するインフルエンザウイルスが、本発明には有用であることが企図される。
【０１３２】
ある実施形態において、再集合体を産生する場合、ＨＡおよびＮＡ亜型は同じ株に由来し、バックボーンは同じ亜型のインフルエンザウイルスに由来することが企図される。例示の組合せには、それだけには限定されないが、例えば、異なるＨ３Ｎ２ウイルス株からのＨ３およびＮ２遺伝子を有するＨ３Ｎ２バックボーン、または異なるＨ１５Ｎ８ウイルス株からのＨ１５およびＮ８遺伝子を有するＨ１５Ｎ８バックボーンが含まれる。以下：
【０１３３】
【化１３】

【０１３４】
のインフルエンザＡ亜型の任意のものが本発明において有用であることがさらに企図される。以下の亜型のインフルエンザＡウイルス：
【０１３５】
【化１４】

【０１３６】
が、以前に同定されている。表１は、再集合体ウイルスを産生するのに有用なインフルエンザＡ株からの、例示のＨＡおよびＮＡ遺伝子を列挙するものである。
【０１３７】
【表１−１】

【０１３８】
【表１−２】

【０１３９】
【表１−３】

【０１４０】
企図されるさらなるインフルエンザＡおよびＢウイルスには、それだけには限定されないが、
【０１４１】
【化１５】

【０１４２】
、およびあらゆる上記のウイルスに対する同様の性質を有するウイルスが含まれる。参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００９００１０９６２号は、本発明において有用なインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルスを記載している。
【０１４３】
インフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１株を含む、同定されたインフルエンザＡ株のリストは、世界保健機関（ＷＨＯ）および米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のインフルエンザＡおよびＨ５Ｎ１亜型のデータベースから入手可能である。米国国立医学図書館によって維持されている国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースはまた、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ種の同定されているウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子の長さおよび配列を記載する、最新のデータベースをやはり維持している。これらの機構によって列挙されている株、ならびに他の商用および学術用データベース、または文献出版物に記載され、および当技術分野において公知であるウイルス株が、本発明における使用に企図される。今後同定され、単離されるさらなるインフルエンザＡおよびインフルエンザＢ株も、本発明において有用であることがやはり企図される。したがって、本明細書において特に例示されるあらゆるＨ５Ｎ１株、および当技術分野において公知であり、または後に発見されるＨ５Ｎ１株が、本発明の再集合体ウイルス、抗原組成物、ワクチン、および方法に適合する。
【０１４４】
本発明の新規性、および当技術分野において先に開示された再集合体ウイルスからの本発明の差別化を強調すると、本発明から特に除外されるのは、それだけには限定されないが、米国特許第４，５５２，７５８号、同第７，０３７，７０７号、同第７，６０１，３５６号、同第７，５６６，４５８号、同第７，５２７，８００号、同第７，５１０，７１９号、同第７，５０４，１０９号、同第７，４６５，４５６号、同第７，４５９，１６２号；米国特許公開第２００９０２９７５５４号、同第２００９０２４６２２５号、同第２００９０２０８５２７号、同第２００９０１７５９０９号、同第２００９０１７５９０８号、同第２００９０１７５９０７号、同第２００９０１３６５３０号、同第２００８００６９８２１号、同第２００８００５７０８１号、同第２００６０２５２１３２号、同第２００６０１５３８７２号、同第２００６０１１０４０６号、同第２００５０１５８３４２号、同第２００５００４２２２９号、および同第２００７０１７２９２９号；国際特許公開ＷＯ２００８／１５７５８３、ＷＯ２００８／０２１９５９、ＷＯ２００７／０４８０８９、ＷＯ２００６／０９８９０１、ＷＯ２００６／０６３０５３、ＷＯ２００６／０４１８１９、ＷＯ２００５／１１６２６０、ＷＯ２００５／１１６２５８、ＷＯ２００５／１１５４４８、ＷＯ２００５／０６２８２０、ＷＯ２００３／０９１４０１を含めた、本明細書に参照される任意の以前の公開において、先に開示されたか、または、例えば、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）およびＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６などのバックボーンを用いて生成された、１つの株からの内部遺伝子および同じ亜型の異なる株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する任意のウイルス（インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ）、ならびに組換えウイルスにおいてインフルエンザＡ亜型の１株からの内部遺伝子および同じ亜型のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含むことがある、ＦＬＵＭＩＳＴ^ＴＭワクチンに有用であるとその中で同定された任意のウイルスである。このような文書は全て、その全文が本明細書に参照によって組み入れられる。
【０１４５】
一実施形態において、本発明は、また、インフルエンザ亜型の第１の株のバックボーン、ならびに同じインフルエンザ亜型の第２の株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む、天然に存在する再集合体ウイルスを除外するものである。本明細書で用いられる「天然に存在する再集合体ウイルス」という用語は、外部の供給源からの介入なしに天然の環境中で組み換わる再集合体ウイルスを意味する。
【０１４６】
さらなる一実施形態において、本発明は、バックボーンとして第１のインフルエンザＡまたはＢ亜型からの改変された内部遺伝子を１つまたは複数（例えば、変異体のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、もしくはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）、ならびに例えば、米国特許公開第２００７０１７２９２９号において例示される、インフルエンザウイルスの同じ株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する再集合体ウイルスを除外するものである。しかし、本発明は、一インフルエンザ亜型のバックボーン株の改変された内部遺伝子、ならびに同じ亜型であるが異なる株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含むウイルスが本発明の範囲内に含まれることを企図するものである。
【０１４７】
なお別の一実施形態において、本発明は、バックボーン／ドナー株として、例えば、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６、および当技術分野において公知の他のものなど、低温適応ウイルスを用いて産生された再集合体ウイルス（ここで、内部のバックボーン遺伝子は第１の亜型からであり、ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じ亜型の異なる株からである）を除外するものである。
【０１４８】
（細胞系）
典型的なインフルエンザウイルスは、ニワトリの卵中で増殖するように適応されているが、卵培養物を維持するための費用は、細胞培養物中でウイルスを増殖させるより著しく大きい。ワクチン用にインフルエンザウイルスを増殖させようと慣例的なニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）培養物を用いたが、これらはニワトリの胚全体のプロテアーゼ活性のいくつかだけをもたらし、それゆえ限られた範囲のインフルエンザウイルス株が複製される。ＣＥＣ培養物を調製するための標準的な手順は、頭部および内部の器官の除去、ならびに複数のトリプシン処理ステップを伴う。これらの手順は、特に、数々のインフルエンザ株を複製することが示されている、脳、心臓、肺、肝臓、および腎臓の細胞の喪失をもたらす（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、６９巻、２１５５〜２１６４頁、１９８８年）。したがって、標準的な手順は、支持することができるウイルス株の点で制限される、線維芽細胞から主になる高度に選択された細胞集団をもたらす。
【０１４９】
インフルエンザウイルス生成における改善は、ニワトリ培養物および哺乳動物細胞系の両方において試みられてきた。例えば、標準的な細胞培養物におけるいくつかのインフルエンザＡ株の複製の制限は、組織培地にトリプシンを加えることによって改善され得ると報告されている。例えば、トリプシンの添加は、ＣＥＣ培養物中で増殖する様々な株の感染力を大幅に増大する（Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８巻、４４０〜４５４頁、１９７５年）。さらに、Ｓｔｉｅｎｅｋｅ−Ｇｒｏｂｅｒら（ＥＭＢＯ Ｊ．、１１巻、２４０７〜２４１４頁、１９９２年）は、フューリン様プロテアーゼとしてＭＤＢＫ細胞におけるＨＡ活性化酵素を同定した。このような酵素はヒトおよびマウスの組織から単離されており、真核生物のサブチリシン様エンドプロテアーゼの新しいファミリーを構成する。Ｋａｔｚら（Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１６０巻、１９１〜９８頁、１９８９年）は、ＭＤＣＫ細胞および発育卵の羊膜腔中のインフルエンザＨ３Ｎ２の増殖の特徴を比較し、ＭＤＣＫ細胞から得られたインフルエンザの力価は発育卵に匹敵し、ＭＤＣＫ増殖したウイルスはインビボで抗原性の増大を生じたことを示した。しかし、ＭＤＣＫ細胞を用いると問題点が存在する。例えば、ＭＤＣＫ細胞はヒトのワクチンを生成するのに認可されている細胞系ではなく、手順は、ウイルスがＭＤＣＫ細胞系において増大し連続的に継代されることを必要とする。
【０１５０】
ウイルス増殖およびワクチン生成の改善に適応されたベロ細胞は、本明細書に参照によって組み入れられる、米国特許第６，１４６，８７３号およびＫｉｓｔｎｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻、９６０〜８頁、１９９８年）に記載されている。ベロ細胞は、世界保健機関にしたがってワクチンを生成するのに承認されている細胞系である。一実施形態において、本発明のウイルスは、以下の実施例に記載するように、ベロ細胞中で増殖する。
【０１５１】
さらなる哺乳動物の細胞系が、ウイルスの培養および増殖に有用である。ワクチンを調製するためのウイルスを培養するのに有用な例示の哺乳動物細胞には、それだけには限定されないが、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、Ｌｅｄｅｒｌｅ １３０、Ｃｈａｎｇ ｌｉｖｅｒおよびＷＩ−３８（ヒト線維芽細胞）；Ｕ９３７（ヒト単球）；ベロおよびＣＶ−１（アフリカミドリザル）：ＩＭＲ−９０およびＩＭＲ−９１（平滑筋の特徴を有するヒト肺線維芽細胞）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＨＥＫ（ヒト胎児の腎臓）、Ｈ９、ＣＥＭおよびＣＤ４発現ＨＵＴ７８（ヒトＴ細胞）：ＰｅｒＣ６（ヒト網膜芽細胞）；ＢＨＫ−２１細胞（仔ハムスター腎）、ＢＳＣ（サル腎細胞）およびＬＬＣ−ＭＫ２（サル腎臓）が含まれる。
【０１５２】
（ワクチン）
組織培養調製物から得た所望のウイルス株を用いてワクチンを生成することが企図される。それだけには限定されないが、弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、およびスプリットワクチンを含めた、多くのタイプのウイルスのワクチンが知られている。
【０１５３】
弱毒化ワクチンは、病原性を低減するいくつかのやり方で変更され、もはや疾患を引き起こさない生のウイルスワクチンである。弱毒化ウイルスは、度重なる世代についての組織培養物における増殖および病原性に関与する遺伝子を変異させるか、または除去するための遺伝子操作を含めたいくつかの方法で生成される。例えば、一実施形態において、病原性に関与するか、または疾患の出現に関与すると同定されたウイルスの遺伝子および／またはタンパク質は、ウイルスが細胞に感染し、細胞内で複製することが依然としてできるが、疾患を引き起こすことができないように変異、または変えられる。この一例は、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位を変異させることである。ウイルスの弱毒化は、外来のエピトープをウイルス遺伝子のセグメント（例えばＮＡ遺伝子）中に挿入し（Ｊ Ｖｉｒｏｌ、６６巻、４６４７〜４６５３頁、１９９２年）、それによってゲノムの正常な機能を妨害することによってやはり成功している。ウイルスはまた、当技術分野において周知の低温適応法を用いて弱毒化される。例えば、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスを弱毒化するための方法を論じる、Ｍａａｓｓａｂら、Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ、９巻、２３７〜４４頁、１９９９年、ならびにＭＤＣＫ細胞中で増殖する低温適応したインフルエンザウイルスを記載する、Ｇｈｅｎｄｏｎら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２３巻、４６７８〜８４頁、２００５年）を参照されたい。
【０１５４】
ウイルスを弱毒化するためのさらなる方法は、ＮＳ１遺伝子を欠く再集合体ウイルスの構築を含む。例えば、機能的なＮＳ１遺伝子を欠く弱毒化ウイルスを開示する、米国特許第６，４６８，５４４号、同第６，５７３，０７９号、同第６，６６９，９４３号、および同第６，８６６，８５３号、ならびに米国特許公開第２００３０１５７１３１号および同第２００４０１０９８７７号（これら各々の開示は本明細書に参照によって組み入れられる）を参照されたい。ＮＳ１遺伝子は、ウイルスにおいてＮＳ１遺伝子の機能的な発現がないように、完全に欠失されるか、もしくは部分的に欠失されるか、または変異によって変更されてよい。ＮＳ１遺伝子を欠くウイルス粒子は、野生型ウイルスに比べて弱毒化された表現型を示す。
【０１５５】
弱毒化ウイルスを生成した後、標準的な方法を用いてワクチンを調製する。ウイルスを、当技術分野において公知の標準的な方法を用いて、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、高速（超）遠心分離、またはショ糖勾配を用いて精製する。
【０１５６】
サブユニットワクチンは死滅ワクチンである。サブユニットワクチンの生成は、免疫系を活性化するウイルスの部分を単離することを伴う。インフルエンザの場合は、精製したＨＡおよびＮＡを用いてサブユニットワクチンを調製するが、サブユニットワクチンを生成するのにウイルスタンパク質の任意の混合が用いられる。一般的に、ＨＡなどのウイルスタンパク質は組換えウイルスの形態から抽出され、異なる株からのこれらのウイルスタンパク質の混合を含むようにサブユニットワクチンは処方される。
【０１５７】
スプリットワクチンは、エンベロープで覆われたウイルスを、エンベロープ中のタンパク質を可溶化するための洗剤で処理することによって生成される、死滅ワクチンである。インフルエンザウイルスの場合は、ＨＡおよびＮＡを可溶化する。一実施形態において、スプリットワクチンを生成するために非イオン性洗剤を用いる。非イオン性洗剤の例には、それだけには限定されないが、ノナノイル−Ｎ−メチルフカミド（Ｍｅｇａ９）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、オクチルグルコシド、ジギトニン、Ｃ１２Ｅ８、ルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、およびＴｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、８０、または１２０）が含まれる。
【０１５８】
不活化ウイルスワクチンは、収集したウイルスを不活化し、哺乳動物における免疫反応を誘発するためのワクチンとして用いるのに知られている方法を用いてこれを処方することによって調製される。不活化は、それだけには限定されないが、ホルムアルデヒド、ＵＶ照射、グルタルアルデヒド、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、およびβ−プロピオラクトンを含む薬剤を用いて行われる。不活化剤は、溶液中の実質的に全てのウイルス粒子を不活化するのに十分に高い濃度で用いられる。例示のためには、制限なく、ガンマ線照射でのウイルスの不活化は米国特許第６，２５４，８７３号に記載されており、ホルマリンでの不活化は米国特許第６，２５４，８７３号および米国特許第６，６３５，２４６号に記載されており、ホルムアルデヒドでの不活化はＪＥ−ＶＡＸ（登録商標）、Ｃｏｕｃｈら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、１９９７年、１７６巻（補完１）、Ｓ３８〜４４頁における日本脳炎ウイルスワクチンに対して記載されており、可視光線による光線力学的不活化はＷａｌｌｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９６３年、９１巻、６７７〜６８２頁に記載されており、ＵＶ光線での不活化はＷＯ／２００８／０３９４９４に記載されており、塩素の不活化はＲｉｃｅ ＥＷら、Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ［インターネット上で連続（ｓｅｒｉａｌ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）］２００７年１０月に記載されており、水不溶性、疎水性ポリカチオンでの不活化、例えば、表面上に塗布したＮ，Ｎ−ドデシルメチル−ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、Ｈａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０３巻、１７６６７〜１７６７１頁、２００６年に記載されており、熱不活化はＴｈｏｍａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、７０巻、６７４〜６８０頁に記載されており、βプロピオラクトンでの不活化（Ｉｎｆｌｅｘａｌ ＶおよびＦｌｕｖｉｒｉｎの生成に用いるものとして）はＥＵＲＯＰＥＡＮ ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＯＥＩＡ ５．０に記載されており、バイナリーエチレンイミンによる不活化は米国特許第６，８０３，０４１号に記載されている。各々のこれらの文書の開示は、ウイルス不活化のこれらの教示について、参照によって組み入れられる。不活化ステップ中、サブユニットの精製および／またはスプリット（ｓｐｌｉｔ）を、ウイルスを細胞培養物から精製する前または精製後に行うことが企図される。例えば、不活化ウイルスワクチンの生成は、細胞材料の除去、ウイルスの不活化、精製、およびウイルスエンベロープの可溶化を伴うことがある。一実施形態において、本明細書に記載する再集合体ウイルスは、Ｋｉｓｔｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５巻、６０２８〜３６頁、２００７年に記載されているベロ細胞から増殖、単離される。
【０１５９】
次いで、ワクチンを、当技術分野において公知の標準的なアジュバントおよびワクチン調製物を用いて調製する。アジュバントには、それだけには限定されないが、単独または組み合わせて用いることが企図される、サポニン、非イオン性洗剤、植物油、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＩＳＣＯＭ、ナノビーズ、スクアレン、ならびにブロック共重合体が含まれる。
【０１６０】
ＩＳＣＯＭは、最初にＭｏｒｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ、３０８巻、４５７〜４６０頁、１９８４年）において記載された免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）についての頭字語である。ＩＳＣＯＭは新規なワクチン送達系であり、慣例的なアジュバントとは異なる。ＩＳＣＯＭは２つの方法において形成される。いくつかの実施形態において、抗原を、その処方中に構造中に物理的に取り込む。他の実施形態において、ＩＳＣＯＭ−マトリックス（例えば、Ｉｓｃｏｎｏｖａとして供給される）は抗原を含まないが、免疫化前にエンドユーザーによって選択される抗原と混合される。混合後、抗原はＩＳＣＯＭ−マトリックスと一緒に溶液中に存在するが、構造中に物理的に組み入れられない。
【０１６１】
一実施形態において、アジュバントは水中油型エマルジョンである。水中油型エマルジョンは当技術分野において周知であり、アジュバント組成物として有用であると示唆されている（ＥＰ３９９８４３、ＷＯ９５／１７２１０、米国特許公開第２００８００１４２１７号）。一実施形態において、代謝可能な油が、抗原組成物または単離されたウイルスの総容積の０．５％から２０％（最終濃度）の量で、総容積の１．０％から１０％の量で、または総容積の２．０％から６．０％の量で存在する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、アジュバントとして有用な水中油型エマルジョン系は、小型油滴のサイズを有する。ある実施形態において、液滴のサイズは、直径１２０ｎｍから７５０ｎｍ、または１２０ｎｍから６００ｎｍの範囲である。
【０１６３】
任意の水中油型組成物がヒトの投与に適するものであるために、エマルジョン系の油相は代謝可能な油を含んでいる。油は、レシピエントに毒性ではなく、代謝によって変換されることが可能である、任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であってよい。木の実、種子、および穀物が植物油の一般的な供給源である。合成油も本発明の一部分であり、例えばＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含むことができる。とりわけ適切な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油中に大量に、ならびにオリーブ油、コムギ胚種油、米ぬか油、およびイースト中に少量見出される不飽和油であり、本発明における使用にとりわけ適切な油である。スクアレンはコレステロールの生合成における中間体であるという事実のために代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ、第１０版、エントリー番号８６１９）。水中油型エマルジョンに有用な例示の油には、それだけには限定されないが、ステロール、トコール、およびα−トコフェロールが含まれる。
【０１６４】
さらなる実施形態において、免疫系の刺激物をワクチンおよび／または薬学的組成物に加える。免疫刺激物には、単独または組み合わせて用いられる、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン；リンパ球、単球、またはリンパ器官からの細胞の細胞培養物からの上清；植物からの細胞調製物および／または抽出物；細菌（例えば、ＢＣＧ、マイコバクテリウム、コリネバクテリウム）、寄生体、またはマイトジェンからの細胞調製物および、または抽出物；ならびに他のウイルスまたは他の供給源に由来する新規な核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）；ブロック共重合体、ナノビーズ、または当技術分野において公知の他の化合物が含まれる。
【０１６５】
アジュバントおよび他の免疫刺激物の特定の例には、それだけには限定されないが、リゾレシチン、配糖体（例えば、サポニンおよびサポニン誘導体、例えばＱｕｉｌ Ａ（ＱＳ７およびＱＳ２１）またはＧＰＩ−０１００）、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＤＤＡ）、四級炭化水素アンモニウムハロゲン化物、プルロニックポリオール、ポリアニオンおよび多原子イオン、ポリアクリル酸、非イオン性ブロック重合体（例えば、プルロニックＦ−１２７）、ならびに３Ｄ−ＭＰＬ（３ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）が含まれる。例えば、米国特許公開第２００８０１８７５４６号および第２００８００１４２１７号を参照されたい。
【０１６６】
（免疫アッセイ）
本発明の再集合体ウイルス、抗原組成物、またはワクチンの抗原性および免疫反応の誘発を検出するのに有用である、抗原に対する抗体の免疫特異的な結合を検出するための様々な技術が、当技術分野において知られている。抗原と抗体との間の相互作用を検出する初期の方法は、ゲル中の沈降による複合体の検出および分析を伴うものであった。抗原−抗体結合対を検出するさらなる方法には、放射ヨウ素標識された検出抗体またはプロテインＡなどのＩｇＧと反応性である放射ヨウ素標識されたタンパク質の使用が含まれる。これらの初期の方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７０巻、１６６〜１９８頁、１９８０年において概観されるように、当業者には周知である。
【０１６７】
血清学的アッセイは、インフルエンザ診断の判定において、ならびにウイルス株の疫学および抗原性に関する調査研究において広く用いられている。とりわけ、赤血球凝集素阻害（ＨＩまたはＨＡＩ）アッセイは広く用いられている（Ｍｅｉｓｎｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８２巻、５０７９〜８３頁、２００８年；Ｃｏｕｃｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５巻、７６５６〜６３頁、２００７年）。ＨＩアッセイは、改変されたＨＡ分子の抗原性を示すため、および非改変のＨＡタンパク質よりも抗原性があるか、または抗原性がないと、改変されたＨＡタンパク質を特徴付けるのを支援するためにやはり有用である。
【０１６８】
ＨＩアッセイは、血清試料からの抗体が標準化された対照と結合する能力を決定する。ＨＩアッセイにおいて、血清試料の段階希釈物（力価）を標準量の赤血球と混合し、これらが複合体に会合するのを肉眼的に検出する。目に見える複合体をもたらす最低レベルの力価測定した血清がアッセイ結果である。
【０１６９】
試料中のＨＡ抗原のレベルを決定する一元放射拡散（ＳＲＤ）アッセイは、Ｗｏｏｄら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、５巻、２３７〜４７頁、１９９７年）によって開発された。ＳＲＤアッセイは、ＨＡ特異的抗体が抗原に結合したときの対照の抗原および試験抗原（例えば、ワクチン）の拡散部位のゾーンを比較するものである。
【０１７０】
ＳＲＤアッセイ、および上記に記載し、当技術分野において公知である他のアッセイを、予め決定された量のＨＡ抗原を含むワクチンを調製するため、ワクチン試料中のＨＡの量を決定するのに用いてもよい。
【０１７１】
（薬学的処方物および投与）
ワクチン組成物の投与は、一般的に予防目的である。組成物を予防的に投与することにより、後に続く任意の感染の防止または弱毒化がもたらされる。「薬学的に許容される」組成物は、レシピエント患者によって許容されるものである。有効量のワクチンを投与することが企図される。「有効量」は、十分な体液性免疫または細胞性免疫を誘発するなど、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。これはワクチンのタイプ、レシピエントの年齢、性別、健康、および体重に依存してよい。所望の生物学的効果の例には、それだけには限定されないが、無症状の提示、症状における低減、組織または鼻汁中のウイルス力価における低減、インフルエンザウイルスによる感染からの完全な保護、およびインフルエンザウイルスによる感染からの部分的な保護が含まれる。
【０１７２】
本発明のワクチンまたは組成物は、その存在が、感染性のインフルエンザウイルスの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの１次的または２次的な体液性免疫反応または細胞性免疫反応を増強する、レシピエント患者の生理状態における検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に重大である。ワクチン組成物は、ウイルス感染から保護するために投与される。「保護」は絶対的である必要はなく、すなわち、対照の集団または患者のセットに比べて統計的に有意な改善がある場合、インフルエンザ感染が全面的に防止、または根絶される必要はない。保護は、インフルエンザウイルス感染の症状の重症度または症状の開始の急速さを低減することに限定されることがある。
【０１７３】
一実施形態において、本発明の弱毒化または不活化ワクチン組成物は、感染の開始前に（予想される感染を防止もしくは弱毒化するために）、または実際の感染の開始後のいずれかに提供され、それによってウイルス感染に対して保護するものである。
【０１７４】
一態様において、本発明の方法は、薬学的組成物を投与するステップを含む。ウイルス、抗原組成物、またはワクチンを、吸入、鼻腔内、経口、および非経口を含む、当技術分野において公知の任意の手段において投与する。非経口投与経路の例には、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下投与が含まれる。
【０１７５】
一実施形態において、インフルエンザワクチンの投与は、１投与量あたりの赤血球凝集素単位（ＨＡＵ）の数に基づく。１ＨＡＵは、ニワトリ赤血球での標準的な赤血球凝集素アッセイにおいて５０％の凝集を達成するのに必要とされる抗原の量と定義される。本明細書に記載するトリインフルエンザウイルスワクチンは、約１０ｎｇ〜約１μｇの間、約２０ｎｇ〜約５００ｎｇの間、約５０ｎｇ〜約２５０ｎｇの間、約７５ｎｇ〜約２００ｎｇの間、約１００ｎｇ、約１２５ｎｇ、約１５０ｎｇ、または約１７５ｎｇのＨＡ単位（ＨＡＵ）を含む処方物において有効である。関連の一実施形態において、不活化ウイルスを含むワクチン組成物は、約０．１から約２００μｇの赤血球凝集素タンパク質／ｍｌに対応するウイルスの量、またはその中のあらゆる範囲もしくは値を含む。関連の一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ウイルスが弱毒化されている場合、約１０^２から１０^９プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ、またはその中のあらゆる範囲もしくは値を含む。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、約１０^２、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、または約１０^９ＰＦＵ／ｍｌを含む。ワクチン組成物が、１０^２から約１０^４ＰＦＵ／ｍｌ、約１０^４から約１０^６ＰＦＵ／ｍｌ、または約１０^６から約１０^９ＰＦＵ／ｍｌを含むことがさらに企図される。
【０１７６】
別の一態様において、不活化インフルエンザワクチンは、一元放射拡散（ＳＲＤ）アッセイによって定量され（Ｋｉｓｔｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７年）２５巻、６０２８〜３６頁、およびＷｏｏｄら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．（１９９７年）５巻、２３７〜２４７頁参照）、赤血球凝集素のマイクログラム（１ｍｌあたりまたは１投与量あたり）において表される。一実施形態において、季節性ワクチンの投与量は、１株あたり１５μｇであり、３投与量中合計で４５μｇである。（前）汎流行性ワクチンでは、投与量は典型的にはアジュバントによる。一態様において、投与量範囲は１ワクチンあたり１μｇから１５μｇであり、いくつかの調製物では１ワクチンあたり最高７５μｇが有用である。一実施形態において、ＨＡ１μｇから１００μｇの投与量のワクチン投与量を投与する。さらなる一実施形態において、ワクチンは、１ワクチンあたり１μｇから３０μｇのＨＡ含量を含む。関連の実施形態において、ＨＡ１μｇ、３μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、もしくは３０μｇ、または必要に応じて最高１００μｇまでのあらゆる量のワクチン投与量を投与する。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与量をワクチン調製物に用いるアジュバントに基づいて調節することが企図される。
【０１７７】
したがって、ワクチンの１回投与量は、赤血球凝集素約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１μｇ、約２２μｇ、約２３μｇ、約２４μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、約１００μｇ、および１００μｇを超えて有するものを含む（同量または異なる量の赤血球凝集素の１回投与量または複数回投与量において提供される）。
【０１７８】
ある実施形態において、ウイルスまたは抗原組成物を、ワクチン投与に企図されるのと同様のＨＡ単位またはｐｆｕを含む投与量において投与することがさらに企図される。
【０１７９】
溶液として投与する場合、ワクチンを水溶液の形態において調製する。このような処方物は当技術分野において公知であり、好適な溶媒中に抗原および他の好適な添加剤を溶解することによって調製される。このような溶媒には、例えば、水、生理食塩水、エタノール、エチレングリコール、およびグリセロールが含まれる。適切な添加剤には、認可されている色素、および抗菌性の保存剤、例えば、チメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）が含まれる。このような溶液は、標準的な方法を用いて、例えば、部分的に加水分解されたゼラチン、ソルビトール、または細胞培地の添加によって安定化してもよく、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、および／もしくはリン酸二水素カリウム、またはＴＲＩＳなどの試薬を用いて、標準的な方法を用いて緩衝化してもよい。液体処方物は懸濁物およびエマルジョンも含むことができる。懸濁物の調製は、例えば、コロイドミルの使用を含み、エマルジョンの調製は、例えば、ホモジナイザーの使用を含む。
【０１８０】
一実施形態において、ワクチンキャリアがポリマー性の遅延放出系であることが企図される。合成ポリマーは、当技術分野において周知の技術を用いて抗原の制御された放出をもたらすためのワクチンの処方物において有用である。
【０１８１】
本発明のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であるものとされる以下の実施例から明らかとなる。
【実施例】
【０１８２】
（実施例）
（実施例１）
（逆遺伝学による、改変された切断部位を有する弱毒化Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株の産生）
ウイルス株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）は、致死性のヒトインフルエンザ症例から単離された高病原性株である。この株を弱毒化するために、ＨＡ切断部位の多塩基性の一続きのアミノ酸（ＲＲＲＫ（配列番号１５））を除去した。Ｈｏｒｉｍｏｔｏら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、３６６９〜７６頁、２００６年）によって記載されている通りに、ポリメラーゼのスタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）による多塩基性アミノ酸の再形成を防ぐために、さらなる置換（Ｒ→ＴおよびＫ→Ｔ）を導入した。この改変により、高病原性のトリインフルエンザウイルスの主な病原性要因が低減され、低病原性の表現型に変換された。
【０１８３】
１３４継代のベロ細胞をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ、英国）から得た。ベロ細胞を、Ｌ−グルタミン４ｍＭを補ったＯＰＴＩ−ＰＲＯ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）培地中で培養した。
【０１８４】
ウイルスを、トリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）５μｇ／ｍｌを含むＯＰＴＩ−ＰＲＯ（登録商標）培地中のベロ細胞において、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させた。ウイルスの感染力価を、標準のＴＣＩＤ５０分析によって決定した。赤血球凝集素アッセイを、ニワトリ赤血球の０．５％懸濁物で行った。トリプシンあり、またはなしのウイルスの増殖を、４ｍＭ Ｌ−グルタミン；５μｇ／ｍｌトリプシン、０．０１％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、０．６％寒天（Ｓｉｇｍａ）を含むＯＰＴＩ−ＰＲＯ（登録商標）培地中ベロ細胞上の標準のプラークアッセイ試験によって決定し、プラーク形成単位（ｐｆｕ）において表した。
【０１８５】
ＨＡタンパク質中に改変された切断部位を有するウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）を構築した。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメントに対応するｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＨＡについてＡＹ８１８１３５、ＮＡについてＡＹ８１８１４１、ＭについてＡＹ８１８１４４、ＮＰについてＡＹ８１８１３８、ＮＳについてＡＹ８１８１４７、ＰＡについてＡＹ８１８１３２、ＰＢ１についてＡＹ８１８１２９、およびＰＢ２についてＡＹ８１８１２６）において公開されている配列にしたがってＧｅｎｅａｒｔＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成した。
【０１８６】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４のセグメントについてのウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）は部分的にのみ入手可能であったので、それぞれのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３セグメントに由来するＮＣＲをＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のコード配列に加えた（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３についてのアクセッション番号：ＨＡ：ＡＢ２１２０５４；ＮＡ：ＡＢ２１２０５６；Ｍ：ＡＢ２１２０５７；ＮＰ：ＡＢ２１２０５５；ＮＳ：ＡＢ２１２０５８；ＰＡ：ＡＢ２１２０５３；ＰＢ１：ＡＢ２１２０５２；ＰＢ２：ＡＢ２１２０５０）。
【０１８７】
高病原性株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ多塩基性切断部位を、低病原性Ｈ５株に見出されるトリプシン依存性配列ＴＥＴＲ／ＧＬＦによって置き換えた（図１）。ＨＡ遺伝子の改変には、ＨＡ切断部位の一続きの塩基性アミノ酸の除去、ならびに野生型表現型への可能な復帰を防ぐための、近接する塩基性アミノ酸のアルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）のスレオニン（Ｔ）への置換、
【０１８８】
【化１６】

【０１８９】
が含まれていた。
【０１９０】
図１は、ウイルス遺伝子のＨＡ切断部位のヌクレオチド配列の改変を示す。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３に由来するＮＣＲは図１において下線付きである。ゲノムフラグメントのｃＤＮＡのコピーをＰＣＲによって得、そのＰＣＲ生成物をベロ細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクションは、ウイルスの完全なゲノムを含む８個のｃＤＮＡを用いてＨｏｆｆｍａｎｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）、９７巻、６１０８〜１１３頁、２０００年）の方法にしたがって行った。
【０１９１】
トランスフェクトしたベロ細胞を、６ウエルプレート中血清含有トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中に接種した。細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクション６時間後、培地を、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１μｇ／ｍｌトリプシンを補った無血清ＯＰＴＩ−ＰＲＯ（登録商標）培地によって置き換えた。２４時間後、トリプシン１０μｇを含むさらなる無血清培地を上清に加えた。７２時間後、上清を収集し、新鮮ベロ細胞でのもう１つのさらなる継代（ブラインド継代）に用いた。この継代のインキュベーションを、１００％細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生が観察されるまで続け、次いで上清を収集した。得られたウイルスをＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔまたはａｔｔＶＮ１２０３と名付けた。
【０１９２】
レスキューされたウイルスの連続したウイルスの２継代を、限外希釈においてベロ細胞上で行った。この目的では、２４ウエルプレートのコンフルエントのベロ細胞に、４回繰返して作製した、１０倍希釈の収集したウイルスを感染させた。２日間で、希釈（−５）の２つのウエルを収集し、第２ステップに用いた。第２ステップを同じ方法で行った。希釈（−６）の２日後に収集したウイルスを、ウイルスストックの生成に用いた。コンフルエントの単層のベロ細胞を有するＴ１５０ｃｍ^２Ｒｏｕｘフラスコに、感染多重度（ｍｏｉ）０．０００５を用いて最終継代において収集したウイルスを感染させた。室温で３０分間インキュベートした後、接種物を除去し、トリプシン５μｇ／ｍｌを補った無血清培地５０ｍｌを加えた。４８時間で１００％ＣＰＥが発生し、上清を収集し、１６０ｇで１０分間遠心分離することによって澄明化し、クライオ（Ｃｒｙｏ）チューブ中１ｍｌでアリコートをとり、−８０℃で凍結させた。
【０１９３】
ベロ細胞上で生成されたＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４−ＨＡａｔｔウイルスストックの感染力価を、ベロ細胞上ＴＣＩＤ５０アッセイを用いた力価測定によって決定した。独立した力価測定を２回行った。結果を表２に示す。卵中の増殖に比べて、ベロ細胞生成からのウイルス力価はおよそ１０倍高かった。
【０１９４】
【表２】

【０１９５】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡ遺伝子の配列を、ＨＡ切断部位で多塩基性の一続きのアミノ酸を除去する方法において操作した。この改変により、ヒトに対していかなる脅威も示さない低病原性の表現型に変換された。
【０１９６】
得られたＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔ株の低病原性の表現型を確認するために、トリプシンなしでプラークを生成する能力を決定した。トリプシン存在下のベロ細胞上のプラークアッセイにおいて、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔウイルスはプラークを生成した（力価２×１０^７ＰＦＵ／ｍｌ）。これとは対照的に、トリプシンの非存在下ではウイルスはプラークを形成せず、ウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔの非病原性の表現型を実証した。レスキューされたウイルスのクローニングされた配列に対する同一性を確認するために、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列を検証した。あらゆる配列決定された遺伝子に変化は見られなかった。
【０１９７】
これらの結果は、インフルエンザのＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）株からの内部遺伝子（バックボーン）、ならびに同じウイルスからの弱毒化ＨＡおよび野生型ＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスは、細胞培養物における増殖に適応し、野生型のウイルスに比べて抗原性の低減を示すことを実証している。
【０１９８】
（実施例２）
（逆遺伝学による、改変された切断部位を有する弱毒化Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ ２：６トランスフェクタント）の産生）
ウイルス株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）は、致死性のヒトインフルエンザ症例から単離された高病原性株である。この株を弱毒化するために、ＨＡ切断部位の多塩基性の一続きのアミノ酸（ＲＲＫＫ（配列番号２１））を除去した。多塩基性アミノ酸の再形成を防ぐために、さらなる置換（Ｒ→ＴおよびＳ→Ｔ）を導入した（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、３６６９〜７６頁、２００６年）。この改変により、高病原性トリインフルエンザウイルスの主な病原性要因が低減され、低病原性の表現型に変換されるはずである。
【０１９９】
細胞培養およびウイルスの増殖を、上記に記載した通りに行った。ＨＡタンパク質中に改変された切断部位を有するウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）様を構築した。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡおよびＮＡ、ならびにＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメントに対応するｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＨＡについてＩＳＤＮ１２５８７３、ＮＡについてＩＳＤＮ１２５８７５、ＭについてＡＹ８１８１４４、ＮＰについてＡＹ８１８１３８、ＮＳについてＡＹ８１８１４７、ＰＡＴについてＡＹ８１８１３２、ＰＢ１についてＡＹ８１８１２９、およびＰＢ２についてＡＹ８１８１２６）において公開されている配列にしたがってＧｅｎｅａｒｔＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成した。
【０２００】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４セグメントについてのウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）は部分的にのみ入手可能であったので、それぞれのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３セグメントに由来するＮＣＲを、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５およびＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４コード配列（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３についてのアクセッション番号ＨＡ：ＡＢ２１２０５４；ＮＡ：ＡＢ２１２０５６；Ｍ：ＡＢ２１２０５７；ＮＰ：ＡＢ２１２０５５；ＮＳ：ＡＢ２１２０５８；ＰＡ：ＡＢ２１２０５３；ＰＢ１：ＡＢ２１２０５２；ＰＢ２：ＡＢ２１２０５０）に加えた。高病原性株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ多塩基性切断部位を、低病原性Ｈ５株に見出されるトリプシン依存性配列ＴＥＴＲ／ＧＬＦによって置き換えた（図２）。ＨＡ遺伝子の改変には、ＨＡ切断部位の一続きの塩基性アミノ酸の除去、ならびに
【０２０１】
【化１７】

【０２０２】
のような、野生型表現型への可能な復帰を防ぐための、近接する塩基性アミノ酸ＲおよびＳのＴへの置換が含まれていた。図２はＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡ切断部位およびウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の改変を示す。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３に由来するＮＣＲは下線付きである。
【０２０３】
ゲノムのフラグメントのｃＤＮＡのコピーをＰＣＲによって得、そのＰＣＲ生成物をベロ細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクトしたベロ細胞を、血清含有トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中、６ウエルプレート中に接種した。細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの６時間後、培地を、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１μｇ／ｍｌトリプシンを補った無血清ＯＰＴＩＰＲＯ（登録商標）培地によって置き換えた。２４時間後、トリプシン１０μｇを含むさらなる無血清培地を上清に加えた。７２時間後、上清を収集し、新鮮ベロ細胞でのもう１つのさらなる継代（ブラインド継代）に用いた。この継代のインキュベーションを１００％細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生するまで維持し、次いで上清を収集した。得られたウイルスをＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔまたはＲＧ−ａｔｔＶＮ１２０３／ＩＮ５／０５と名付けた。
【０２０４】
レスキューされたウイルスの連続したウイルスの２継代を、限外希釈においてベロ細胞上で行った。この目的では、２４ウエルプレートのコンフルエントのベロ細胞に、４回繰返して作製した、１０倍希釈の収集したウイルスを感染させた。２日後、希釈（−６）の２つのウエルを収集し、第２ステップに用い、第２ステップを同じ方法で行った。希釈（−６）の２日後に収集したウイルスを、ウイルスストックの生成に用いた。コンフルエントの単層のベロ細胞を有するＴ１５０ｃｍ^２Ｒｏｕｘフラスコに、ｍｏｉ０．０００５を用いて最終継代において収集したウイルスを感染させた。室温で３０分間インキュベートした後、接種物を除去し、トリプシン５μｇ／ｍｌを補った無血清培地５０ｍｌを加えた。４８時間後１００％ＣＰＥが発生し、上清を収集し、１６０ｇで１０分間遠心分離することによって澄明化し、クライオチューブ中１ｍｌでアリコートをとり、−８０℃で凍結させた。
【０２０５】
ベロ細胞上で生成されたＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔウイルスストックの感染力価を、ベロ細胞上ＴＣＩＤ５０アッセイを用いた力価測定によって推定した。独立した力価測定を２回行った。結果を表３に示す。
【０２０６】
【表３】

【０２０７】
Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡ遺伝子の配列を、ＨＡ切断部位の多塩基性の一続きのアミノ酸を除去するための方法で操作した。この改変により、ヒトに対していかなる脅威も示さない低病原性の表現型に変換された。得られたＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔ株の低病原性の表現型を確認するために、トリプシンなしでプラークを生成する能力を決定した。トリプシン存在下のベロ細胞上のプラークアッセイにおいて、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔウイルスはプラークを生成した（力価３×１０^７ＰＦＵ／ｍｌ）。これとは対照的に、トリプシンの非存在下ではウイルスはプラークを形成せず、ウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔの非病原性の表現型を確証した。
【０２０８】
レスキューされたウイルスのクローニングされた配列に対する同一性を確認するために、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列を検証した。あらゆる配列決定された遺伝子に変化は見られなかった。
【０２０９】
これらの結果は、インフルエンザのＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）株からの内部遺伝子（バックボーン）、ならびに異なるインフルエンザＨ５Ｎ１株（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）からの弱毒化ＨＡおよび野生型ＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスは、細胞培養物における増殖に適応し、野生型のウイルスに比べて抗原性の低減を示すことを実証している。
【０２１０】
次いで、ベロ細胞培養物中の弱毒化ウイルスの増殖を、ベロ細胞中の卵に適応させた逆遺伝学ウイルスの増殖と比べた。
【０２１１】
インフルエンザ株ＣＤＣ ＲＧ Ｉｎｄｏ／０５／２００５は、ＰＲ８バックボーン（ＰＲ８に由来する６個の内部遺伝子）、ならびにＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する６：２逆遺伝学株である。この株は卵に適応されており、慣例的な（卵由来の）不活化Ｈ５Ｎ１ワクチンについてのベースである。ＣＤＣ ＲＧ Ｉｎｄｏ株を、３２℃と３７℃の２つの異なる温度で、ベロ細胞中で０．０１から０．０００１の感染多重度（ＭＯＩ）で３回継代した。力価を表４に示す。最初のｌｏｇ力価は、６．４〜６．７（３２℃）および５．８〜６．８（３７℃）の範囲であった。３継代後、力価は幾分高く、３２℃で７．１〜７．２、および３７℃で６．５〜７．４であった。このように最初の力価は低く、継代によりごくわずかに力価は改善した。
【０２１２】
【表４】

【０２１３】
新しいインフルエンザウイルスＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔウイルスは、８．７１ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの平均力価に増殖した。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔウイルスの力価は８．８８ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった（実施例１および２）。匹敵する、卵に適応させた株ＣＤＣ ＲＧ Ｉｎｄｏ／０５／２００５と比べると、新しい株は、卵に適応させたウイルスよりも少なくとも２ｌｏｇステップ高く増殖した。
【０２１４】
（実施例３）
（再集合体ウイルスの安全性および有効性）
再集合体ウイルスの安全性および有効性を決定するために、マウスおよびニワトリにおいてインビボ試験を行った。１０〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）を、表４Ａおよび４Ｂに示す通り、漸増投与量のウイルスで鼻腔内チャレンジした（臨床症状：ｒ、毛並みの乱れ；ｈ、身体を丸める；ｍ、つやがない（無気力）；ｄ、死亡；ＡＳＴ＝死亡までの平均時間）。
【０２１５】
第１のマウス実験において（表５Ａ）、マウスを２週間の期間にわたって臨床的にモニタリングした。ウイルスＲＧ−ａｔｔＶＮ１２０３または６：２ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ再集合体でチャレンジした後、主な臨床症状は観察されなかった。大部分のマウスが臨床症状を全く示さず、何匹かのマウスが第１週以内に毛並みの乱れを有し、第２週に完全に回復した。
【０２１６】
第２のマウス実験において（表５Ｂ）、投与量を、鼻腔内投与で、動物１匹あたり最高１×１０^６ＴＣＩＤ５０に増大した。今回は、信頼できる病気の指標である体重減少（ＷＬ）をモニタリングした。Ｈ５Ｎ１ベースのＲＧウイルスにＷＬは観察されず、マウスは全て生存し、このことは、毒性がないことを示した。野生型チャレンジの対照である、ＶＮ１２０３およびＩＮ５／０５ Ｈ５Ｎ１野生型株は、６から８日以内にマウスを死亡させた。
【０２１７】
ニワトリにおける再集合体ウイルスの安全性を試験するために、表５Ｃおよび５Ｄに示す通り、７日齢のニワトリ（Ｓｐａｆａｓ、ハンガリー）を漸増投与量のウイルスでチャレンジした。動物を２週間の期間にわたって臨床的にモニタリングした。
【０２１８】
表５Ｃに示すように、動物１匹あたり１×１０^５および１×１０^６ＴＣＩＤ５０の投与量で鼻腔内チャレンジした全てのニワトリにおいて、Ｈ５Ｎ１ベースのＲＧウイルスで主な臨床症状を観察できなかった。予想通り、ＣＤＣ（ＰＲ８をベースにした前汎流行シードウイルス株である、ＣＤＣ ＲＧ Ｉｎｄｏ／０５／２００５）から得られたＢＳＬ−２対照ウイルスは、ニワトリに対してやはり無毒性であり、非病原性であった。
【０２１９】
第２の適用経路を用いてこの結果を確認するために、ニワトリを、１羽あたり１×１０^６ＴＣＩＤ５０の投与量の筋肉内注射（表５Ｄ）によってチャレンジした。ニワトリに対して無毒性であることが知られている２つの対照ウイルスである、ＣＤＣ ＲＧ Ｉｎｄｏ／０５／２００５およびＮＩＢＲＧ−１４（それぞれＩＮ５／０５、ならびにＶＮ１１９４ＨＡおよびＮＡ遺伝子とのＰＲ８ベースの再集合体）が含まれた。チャレンジ後、体重減少は観察できなかった。全ての動物が、対照動物であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でチャレンジしたニワトリに匹敵して体重増加した。同じ実験において、ニワトリを、高病原性のＨ５Ｎ１野生型ウイルスＩＮ５／０５で鼻腔内チャレンジした。チャレンジ後２日以内に、ニワトリは全て過急性に死亡した（表５Ｄ）。
【０２２０】
これらのインビボの実験は、ＨＡ遺伝子における多塩基性切断部位を改変すると、Ｈ５Ｎ１ウイルスを強力に弱毒化することを確証している。
【０２２１】
【表５】

【０２２２】
（実施例４）
（逆遺伝学による、改変された切断部位を有する弱毒化Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５株の産生）
ウイルス株Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）は、致死性のトリインフルエンザ症例から単離された高病原性株である。この株を弱毒化するために、ＨＡ切断部位の多塩基性の一続きのアミノ酸（ＲＲＲＫ（配列番号１５））を除去した。多塩基性アミノ酸の再形成を防ぐために、さらなる置換（Ｒ→ＴおよびＫ→Ｔ）を導入した（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、３６６９〜７６頁、２００６年）。この改変により、高病原性のトリインフルエンザウイルスの主な病原性要因が低減され、低病原性の表現型に転換されるはずである。
【０２２３】
細胞培養およびウイルスの増殖を、上記に記載した通りに行った。ＨＡタンパク質中に改変された切断部位を有するウイルスＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）様を構築した。Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５のＨＡおよびＮＡ、ならびにＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメントに対応するｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＨＡについてＤＱ４０７５１９、ＮＡについてＥＦ６１９９７３、ＭについてＥＦ５４１４５３、ＮＰについてＡＹ８１８１３８、ＮＳについてＥＦ５４１４５６、ＰＡについてＡＹ８１８１３２、ＰＢ１についてＡＹ８１８１２９、およびＰＢ２についてＡＹ８１８１２６）において公開されている配列にしたがってＧｅｎｅａｒｔＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成した。
【０２２４】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４のセグメントについてのウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）は部分的にのみ入手可能であるので、それぞれのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３セグメントに由来するＮＣＲを、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５およびＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４コード配列（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３についてのアクセッション番号ＨＡ：ＡＢ２１２０５４；ＮＡ：ＡＢ２１２０５６；Ｍ：ＡＢ２１２０５７；ＮＰ：ＡＢ２１２０５５；ＮＳ：ＡＢ２１２０５８；ＰＡ：ＡＢ２１２０５３；ＰＢ１：ＡＢ２１２０５２；ＰＢ２：ＡＢ２１２０５０）に加えた。高病原性株Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５のＨＡ多塩基性切断部位を、低病原性Ｈ５株に見出されるトリプシン依存性配列ＴＥＴＲ／ＧＬＦ（配列番号１９を参照されたい）によって置き換えた（図３）。ＨＡ遺伝子の改変には、ＨＡ切断部位の一続きの塩基性アミノ酸の除去、ならびに
【０２２５】
【化１８】

【０２２６】
のような、野生型表現型への可能な復帰を防ぐための、近接する塩基性アミノ酸ＲおよびＫのＴへの置換が含まれていた。図３はＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５のＨＡ切断部位およびウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の改変を示す。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３に由来するＮＣＲは下線付きである。
【０２２７】
ゲノムのフラグメントのｃＤＮＡのコピーをＰＣＲによって得、そのＰＣＲ生成物をベロ細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクトしたベロ細胞を、血清含有トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中、６ウエルプレートに接種した。細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクション６時間後、培地を、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１μｇ／ｍｌトリプシン、および０．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢを補った無血清ＯＰＴＩＰＲＯ（登録商標）培地で置き換えた。２４時間後、トリプシン１０μｇを含むさらなる無血清培地を上清に加えた。７２時間後、上清を収集し、新鮮ベロ細胞上のさらなる２継代（ブラインド継代）に用いた。この継代のインキュベーションを１００％細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生するまで維持し、次いで上清を収集した。得られたウイルスをＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔまたはＲＧ−ａｔｔＶＮ１２０３／ＴＴ／１／０５と名付けた。
【０２２８】
Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５ウイルスストックを上記に記載した通りに生成した。ベロ細胞上で生成されたＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡａｔｔウイルスストックの感染力価を、ベロ細胞上ＴＣＩＤ５０アッセイを用いた力価測定によって推定した。独立した力価測定を２回行った。結果を表６に示す。
【０２２９】
【表６】

【０２３０】
クローニングされた配列に対する、レスキューされたウイルスの同一性を確認するために、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列を検証した。配列決定したいかなる遺伝子にも変化は見られなかった。
【０２３１】
これらの結果は、インフルエンザのＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）株からの内部遺伝子（バックボーン）、ならびに異なるインフルエンザＨ５Ｎ１株（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５）からの弱毒化ＨＡおよび野生型ＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスは、細胞培養物における増殖に適応することを実証している。
【０２３２】
（実施例５）
（逆遺伝学による、改変された切断部位を有する弱毒化Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５株の産生）
ウイルス株Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５（Ｈ５Ｎ１）は、中国における致死性のヒトインフルエンザ症例から単離された高病原性株である。この株を弱毒化するために、ＨＡ切断部位の多塩基性の一続きのアミノ酸（ＲＲＲＫ（配列番号１５））を除去した。多塩基性アミノ酸の再形成を防ぐために、さらなる置換（Ｌ→Ｑ、Ｒ→Ｔ、およびＫ→Ｔ）を導入した（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、３６６９〜７６頁、２００６年）。この改変により、高病原性のトリインフルエンザウイルスの主な病原性要因が低減され、低病原性の表現型に転換されるはずである。
【０２３３】
細胞培養およびウイルスの増殖を、上記に記載した通りに行った。ＨＡタンパク質中に改変された切断部位を有するウイルスＡ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５（Ｈ５Ｎ１）様を構築した。Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５のＨＡおよびＮＡ、ならびにＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメントに対応するｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＨＡについてＤＱ３７１９２８、ＮＡについてＥＵ１２８２３９、ＭについてＥＦ５４１４５３、ＮＰについてＡＹ８１８１３８、ＮＳについてＥＦ５４１４５６、ＰＡについてＡＹ８１８１３２、ＰＢ１についてＡＹ８１８１２９、およびＰＢ２についてＡＹ８１８１２６）において公開されている配列にしたがってＧｅｎｅａｒｔＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成した。
【０２３４】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４セグメントについてのウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）は部分的にのみ入手可能であったので、それぞれのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３セグメントに由来するＮＣＲを、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５およびＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４コード配列（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３についてのアクセッション番号ＨＡ：ＡＢ２１２０５４；ＮＡ：ＡＢ２１２０５６；Ｍ：ＡＢ２１２０５７；ＮＰ：ＡＢ２１２０５５；ＮＳ：ＡＢ２１２０５８；ＰＡ：ＡＢ２１２０５３；ＰＢ１：ＡＢ２１２０５２；ＰＢ２：ＡＢ２１２０５０）に加えた。高病原性株Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５のＨＡ多塩基性切断部位を、低病原性Ｈ５株に見出されるトリプシン依存性配列ＴＥＴＲ／ＧＬＦによって置き換えた（図４）。ＨＡ遺伝子の改変には、ＨＡ切断部位の一続きの塩基性アミノ酸の除去、ならびに
【０２３５】
【化１９】

【０２３６】
のような、野生型表現型への可能な復帰を防ぐための、近接する塩基性アミノ酸ＬのＱへの、ならびにＲおよびＫのＴへの置換が含まれていた。図４はＡ／Ａｎｈｕｉ／１／０５のＨＡ切断部位およびウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の改変を示す。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３に由来するＮＣＲは下線付きである。
【０２３７】
ゲノムのフラグメントのｃＤＮＡのコピーをＰＣＲによって得、そのＰＣＲ生成物をベロ細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクトしたベロ細胞を、血清含有トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中、６ウエルプレートに接種した。細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクション６時間後、培地を、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１μｇ／ｍｌトリプシン、および０．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンを補った無血清ＯＰＴＩＰＲＯ（登録商標）培地で置き換えた。２４時間後、トリプシン１０μｇを含むさらなる無血清培地を上清に加えた。７２時間後、上清を収集し、新鮮ベロ細胞上のさらなる２継代に用いた。この継代のインキュベーションを１００％細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生するまで維持し、次いで上清を収集した。得られたウイルスをＡ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５（Ｈ５Ｎ１）−ＨＡｔｔまたはＰＧ−ａｔｔＶＮ１２０３／ＡＨ／１／０５と名付けた。
【０２３８】
Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／０５ウイルスストックを上記に記載した通りに生成した。ベロ細胞上で生成されたＲＧ−ａｔｔＶＮ１２０３／ＡＨ／１／０５ウイルスストックの感染力価を、ベロ細胞上ＴＣＩＤ５０アッセイを用いて力価測定によって推定した。独立した力価測定を２回行った。結果を表７に示す。
【０２３９】
【表７】

【０２４０】
クローニングされた配列に対してレスキューされたウイルスの同一性を確認するために、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列を検証した。配列決定したいかなる遺伝子にも変化は見られなかった。
【０２４１】
これらの結果は、インフルエンザのＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）株からの内部遺伝子（バックボーン）、ならびに異なるインフルエンザＨ５Ｎ１株（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５）からの弱毒化ＨＡおよび野生型ＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスは、細胞培養物における増殖に適応することを実証している。
【０２４２】
（実施例６）
（インビボの再集合体ウイルスワクチンの投与）
Ｈ５Ｎ１内部遺伝子、ならびにＨＡおよびＮＡ遺伝子を発現する組換え再集合体ウイルス（全ウイルス）のインビボの有効性を決定するために、当技術分野において周知の技術を用いて、ウイルスを被験体動物に投与した。例えば、Ｋｉｓｔｎｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２５巻、６０２８〜３６頁、２００７年）は、全不活化Ｈ５Ｎ１ウイルス株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４を含むウイルスワクチンの被験体マウスへの投与、および、生ウイルスで再チャレンジしたときの、マウスを感染から保護するワクチンの能力の評価を記載している。
【０２４３】
さらに、Ｅｈｒｌｉｃｈら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３５８巻、２５７３〜８４頁、２００８年）は、Ｈ５Ｎ１汎流行性インフルエンザ株に対するワクチンを投与することを含む、ヒト患者における臨床試験を記載している。各投与量が、ミョウバンアジュバント有りの赤血球凝集素抗原３．７５μｇ、７．５μｇ、１５μｇ、もしくは３０μｇ、またはアジュバントなしのＨＡ抗原７．５μｇもしくは１５μｇを含む、不活化した全Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４を含む２投与量のワクチンを（２１日離して）被験体に投与した。ベースラインにおいて、ならびに２１日目および４２日目に血清学的分析を行った。Ｅｈｒｌｉｃｈは、ワクチンが宿主被験体における免疫反応を誘発し、宿主がいくつかの異なるウイルス株での感染から保護されることを実証した。
【０２４４】
本発明の再構成体ウイルス、抗原組成物、またはワクチンは、上記に記載した技術を用いて、または当技術分野において公知の他の技術を用いて投与される。
【０２４５】
上記の例示の実施例に記載したように、本発明における多数の改変および変形が生じることが当業者には予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に表す制限だけが、本発明に対して課されるべきである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のインフルエンザウイルスＡ亜型からの内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびに前記内部遺伝子セグメントが由来する前記インフルエンザウイルス亜型からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、前記内部遺伝子セグメントはインフルエンザＡ亜型の第１の株に由来し、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は前記インフルエンザＡ亜型における第２の株に由来する、再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項２】
インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株の内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスからの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、請求項１に記載の精製した再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項３】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が第１のＨ５Ｎ１クレードからであり、前記内部遺伝子が第２のＨ５Ｎ１クレードからである、請求項２に記載の再集合体ウイルス。
【請求項４】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびに前記内部遺伝子が同じＨ５Ｎ１クレードからである、請求項２に記載の再集合体ウイルス。
【請求項５】
前記ＨＡ遺伝子が弱毒化ウイルスを生成するように改変されている、請求項１または請求項２に記載の再集合体ウイルス。
【請求項６】
前記ＨＡ遺伝子が多塩基性切断部位で改変されている、請求項５に記載のウイルス。
【請求項７】
哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする、請求項１または請求項２に記載のウイルス。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、Ｌｅｄｅｒｌｅ １３０、Ｃｈａｎｇ ｌｉｖｅｒおよびＷＩ−３８；Ｕ９３７、ベロ、ＣＶ−１、ＩＭＲ−９０およびＩＭＲ−９１、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＨＥＫ、Ｈ９、ＣＥＭおよびＣＤ４発現ＨＵＴ７８、ＰｅｒＣ６、ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳＣ、およびＬＬＣ−ＭＫ２からなる群より選択される、請求項７に記載のウイルス。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞培養物がベロ細胞培養物である、請求項７に記載のウイルス。
【請求項１０】
前記内部遺伝子が、
【化２０】

【化２１】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１１】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が、
【化２２】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１２】
前記内部遺伝子、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１３】
前記内部遺伝子、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が異なるウイルス株に由来する、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１４】
前記内部遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１５】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１６】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１７】
前記多塩基性切断部位の改変が、
【化２３】

の変異である、請求項１から１６のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１８】
第１のインフルエンザウイルスＡ亜型からの内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびに前記内部遺伝子セグメントが由来する前記インフルエンザウイルス亜型からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、前記内部遺伝子セグメントはインフルエンザＡ亜型の第１の株に由来し、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は前記インフルエンザＡ亜型における第２の株に由来する、抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物。
【請求項１９】
前記抗原組成物が、インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株に由来する内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスに由来する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含み、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、請求項１８に記載の抗原性再集合体ウイルス組成物。
【請求項２０】
前記ＨＡ遺伝子が弱毒化ウイルスを生成するように改変されている、請求項１８または請求項１９に記載の抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物。
【請求項２１】
前記ＨＡ遺伝子が多塩基性切断部位で改変されている、請求項２０に記載の抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物。
【請求項２２】
前記インフルエンザウイルスが哺乳動物細胞培養物中で増殖する能力を特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物ウイルス。
【請求項２３】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が、
【化２４】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項１９に記載の抗原組成物。
【請求項２４】
前記内部遺伝子が、
【化２５】

【化２６】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項１９に記載の抗原組成物。
【請求項２５】
前記内部遺伝子セグメント、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、請求項１８に記載の抗原組成物。
【請求項２６】
前記内部遺伝子セグメント、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が異なるウイルス株に由来する、請求項１８に記載の抗原組成物。
【請求項２７】
前記内部遺伝子セグメントがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項２８】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項２９】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項３０】
前記多塩基性切断部位の改変が、
【化２７】

の変異である、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項３１】
薬学的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項３２】
再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンであって、前記ウイルスは、
表面タンパク質ＨＡをコードするポリヌクレオチドおよび表面タンパク質ＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、ＨＡおよびＮＡは各々、インフルエンザウイルスＡ亜型の第１の株に由来する、ポリヌクレオチド；ＰＢ１をコードするポリヌクレオチド、ＰＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ２をコードするポリヌクレオチド、Ｍをコードするポリヌクレオチド、ＮＰをコードするポリヌクレオチド、ＮＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＰＢ１、ＰＡ、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰおよびＮＳについての前記ポリヌクレオチドは、インフルエンザＡウイルス亜型の第２の株に由来する、ポリヌクレオチド
を含み、前記ポリヌクレオチドは、再集合したポリヌクレオチドのビリオンへのパッケージングを可能にするように作動可能に連結されている、ワクチン。
【請求項３３】
請求項３２に記載の再集合体インフルエンザＡウイルスを含むワクチンであって、前記ウイルスが、
表面タンパク質ＨＡをコードするポリヌクレオチドおよび表面タンパク質ＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、ＨＡおよびＮＡの各々はＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する、ポリヌクレオチド；ＰＢ１をコードするポリヌクレオチド、ＰＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＢ２をコードするポリヌクレオチド、Ｍをコードするポリヌクレオチド、ＮＰをコードするポリヌクレオチド、ＮＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＰＢ１、ＰＡ、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰおよびＮＳについての前記ポリヌクレオチドは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する、ポリヌクレオチド
を含み、前記ポリヌクレオチドが、再集合したポリヌクレオチドのビリオンへのパッケージングを可能にするように作動可能に連結されている、ワクチン。
【請求項３４】
前記ＨＡ遺伝子が弱毒化ウイルスを生成するように改変されている、請求項３２または請求項３３に記載の抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物。
【請求項３５】
前記ＨＡ遺伝子が多塩基性切断部位で改変されている、請求項３４に記載の抗原性再集合体インフルエンザウイルス組成物。
【請求項３６】
前記内部遺伝子が、
【化２８】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３７】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が、
【化２９】

からなる群より選択されるＨ５Ｎ１株に由来する、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３８】
前記内部遺伝子セグメント、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が同じウイルス株に由来する、請求項３２または３３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３９】
前記内部遺伝子セグメント、ならびに前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子が異なるウイルス株に由来する、請求項３２または３３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４０】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からである、請求項３２から３９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４１】
前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子がＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５からである、請求項３２から３９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４２】
前記ＨＡが前記多塩基性切断部位で
【化３０】

の変異によって改変されている、請求項３２から４１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４３】
アジュバントをさらに含む、請求項３２から４２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４４】
前記ワクチンが不活化ワクチンである、請求項３２から４３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４５】
ＨＡ１μｇから１００μｇのＨＡ含量を含む、請求項３２から４４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４６】
被験体における、少なくとも１つの汎流行のインフルエンザウイルス株に対する免疫反応を誘発するための方法であって、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の抗原組成物、または請求項３２から４５のいずれか一項に記載のワクチンを、少なくとも１つのＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス株の感染から前記被験体を保護するのに有効な量において投与することを含む、方法。
【請求項４７】
インフルエンザウイルスによる被験体の感染を防ぐための方法であって、有効量の、請求項１から１７のいずれか一項に記載のウイルス、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の抗原組成物、または請求項３２から４５のいずれか一項に記載のワクチンを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４８】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスによる被験体の感染を防ぐための方法であって、有効量の、請求項１から１７のいずれか一項に記載のウイルス、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の抗原組成物、または請求項３２から４５のいずれか一項に記載のワクチンを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４９】
前記ワクチンがＨＡ１μｇから１００μｇのＨＡ含量を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ワクチンがＨＡ１μｇから３０μｇのＨＡ含量を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ワクチンがＨＡ１μｇから１５μｇを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ワクチンがＨＡ単位１０ｎｇから１μｇのＨＡ含量を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
インフルエンザＡのＨ５Ｎ１株の内部遺伝子セグメントＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ、ＮＰ、およびＮＳ、ならびにＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスからの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を含む再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンを作製する方法であって、前記ＨＡおよびＮＡ遺伝子は同じウイルス株に由来し、前記ＨＡ遺伝子は弱毒化ＨＡ遺伝子を生成するように多塩基性切断部位で改変されており、前記方法は、前記再集合体ウイルスの増殖に適する条件下で哺乳動物細胞中に、前記ウイルスをトランスフェクトすることを含む、方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、Ｌｅｄｅｒｌｅ １３０、Ｃｈａｎｇ ｌｉｖｅｒおよびＷＩ−３８；Ｕ９３７、ベロ、ＣＶ−１、ＩＭＲ−９０およびＩＭＲ−９１、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＨＥＫ、Ｈ９、ＣＥＭおよびＣＤ４発現ＨＵＴ７８、ＰｅｒＣ６、ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳＣ、およびＬＬＣ−ＭＫ２からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物細胞がベロ細胞である、請求項５３に記載の方法。

【図１−１】

【図１−２】

【図１−３】

【図１−４】

【図１−５】

【図２−１】

【図２−２】

【図２−３】

【図２−４】

【図２−５】

【図３−１】

【図３−２】

【図３−３】

【図３−４】

【図３−５】

【図３−６】

【図４−１】

【図４−２】

【図４−３】

【図４−４】

【図４−５】

【図４−６】

【公表番号】特表２０１２−５１１９１４（Ｐ２０１２−５１１９１４Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０９８４（Ｐ２０１１−５４０９８４）
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８３２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７７９８６
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ　ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ　Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】