インフルエンザ感染検査薬及び検査方法
【課題】ゲル内沈降（ＡＧＰ）試験に代わる多検体処理が可能で、高感度かつ高特異性の、インフルエンザ感染検査薬および検査方法。
【解決手段】インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いるインフルエンザ感染検査薬および検査方法。好ましくは、ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加しバキュロウイルスと昆虫細胞を用いてＮＰ−Ｈisとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる。
【解決手段】インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いるインフルエンザ感染検査薬および検査方法。好ましくは、ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加しバキュロウイルスと昆虫細胞を用いてＮＰ−Ｈisとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ感染検査薬および検査方法に関する。更に詳しく言えば、迅速、高感度、多検体処理が可能な、Ａ型インフルエンザ共通抗原を用いるインフルエンザ感染検査薬および検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
家禽において重要なウイルス性疾病として、トリインフルエンザ（Avian Influenza、以下ＡＩと略称する。）が挙げられ、家畜伝染病予防法において、高病原性トリインフルエンザ（highly pathogenic avian influenza、以下ＨＰＡＩと略称する。）は法定伝染病に、低病原性トリインフルエンザ（low pathogenic avian influenza、以下ＬＰＡＩと略称する。）は届出伝染病に指定されており、これら疾病は家禽産業への脅威である。オルソミクソ科Ａ型インフルエンザウイルス属に属するトリインフルエンザウイルス（以下ＡＩＶと略称する。）は、エンベロープを有し、直径約８０〜１２０ｎｍで、マイナス一本鎖の分節ＲＮＡを持つ。このウイルスは核タンパク質（以下ＮＰと略称する。）とマトリックスタンパク質（以下Ｍと略称する。）によってＡ、Ｂ、Ｃの３種類に抗原的に分けられ、Ｂ型とＣ型のウイルスはヒトにのみ感染する。Ａ型のウイルスだけがヒト、ウマ、ブタ、その他の哺乳類および広範な種類の家禽や野生鳥類に感染する。
【０００３】
インフルエンザウイルス（Influenza virus）が産生する１１種類のウイルスタンパク質は、表面タンパク質、内部タンパク質、それに、ウイルス粒子の内部には含まれない非構造タンパク質の大きく３つに分類できる。ウイルス粒子に含まれる表面タンパク質には赤血球凝集タンパク質（以下ＨＡと略称する。）、ノイラミニダーゼ（以下ＮＡと略称する。）、マトリックス２タンパク質（以下Ｍ２と略称する。）の３種類がある。内部タンパク質にはポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ＮＰ、マトリックス１タンパク質（以下Ｍ１と略称する。）、非構造タンパク質２（非構造という名称がついているが、ウイルス粒子内に取り込まれる：以下ＮＳ２と略称する。）がある。非構造タンパク質１（以下ＮＳ１と略称する。）は、感染細胞の中で大量に産生されるが、ウイルス粒子の中には含まれない唯一のタンパク質である。表面タンパク質であるＨＡとＮＡにより血清型（亜型）がＨＡで１５タイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）、ＮＡで９タイプ（Ｎ１〜Ｎ９）に分類されている。さらに最近ではＨ１３と比較的近縁な新しいＨ１６が報告されている。このＨＡとＮＡのさまざまな組み合わせにより、数多い亜型のインフルエンザウイルスが存在する。ＡＩは病原性によってもＨＰＡＩとＬＰＡＩに分類される。ＨＰＡＩは、鶏を始めとする様々な鳥類に全身性の症状を引き起こす急性の伝染病である。その症状等は多様であるが、致死率が高く伝播力も極めて強いため、発生すると養鶏産業に重大な影響を与える。
【０００４】
従来、ＡＩＶのＨＡおよびＮＡ亜型は、１５種のＨＡと９種のＮＡから作製した抗血清を用い、それぞれ赤血球凝集抑制（hemagglutination inhibition、以下ＨＩと略称する。）試験およびノイラミニダーゼ抑制（neuraminidase inhibition、以下ＮＩと略称する。）試験により決定されてきた。近年、ヒトのインフルエンザにおいては、Ｈ１からＨ３ウイルスおよびＮ１とＮ２ウイルスの血清型の同定に、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcriptase polymerase chain reaction、以下ＲＴ−ＰＣＲと略称する。）が用いられてきている。また、Ｈ１〜Ｈ１５のプライマーを用いたＡＩＶの診断法がLeeら（Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001：非特許文献１）により報告され、日本でも採用されている。ＰＣＲは、Ａ型インフルエンザウイルスの検出において迅速かつ抗血清を必要としない効果的な方法として役立つと言われている。
【０００５】
近年、世界規模でＡＩの発生が相次ぎ、さらに２００４年１月に日本では約７９年ぶりとなるＨＰＡＩの発生が山口県で報告された。その発生に続き同年に大分県、京都府、大阪府でもＨＰＡＩの発生が見られ、これらの血清型はいずれもＨ５Ｎ１であった。さらに２００５年に入っても茨城県でＨ５Ｎ２の発生が見られるなど、ＡＩＶ感染の状況把握および発生があった場合の効果的防除対策のために重要な血清学的診断の必要性が高まっており、ＡＩの的確かつ迅速な診断法を確立することが必要とされている。
【０００６】
ところが、ＡＩＶには１６のＨＡ亜型があり、その血清学的診断には多数の抗血清（１６種類と量）および抗原が必要となるため、診断法が複雑になる。また、現行の診断法には、感度、迅速性、および特異性等で改良すべき点が多い。現在、ＡＩＶ抗体の検出の血清診断技術のために広く用いられているものはゲル内沈降（以下ＡＧＰと略称する。）試験とＨＩ試験である。ＡＧＰ試験は沈降線を形成するために抗原と抗体の両方を多く必要とし、判定に少なくとも２４時間必要とする。ＨＩ試験はＡＧＰ試験より感度が高くより迅速であるが、１６のＨＡ亜型があるため非常に手間がかかり、１検体あたりにかかる費用が高い。
【０００７】
間接ＥＬＩＳＡでは多数の検体を簡便に検査でき、Snyderら（Avian Dis. 29 :136-44. 1985：非特許文献２）によってＡＧＰ試験より感度、特異性が高いことが示されているが、非特異反応が多いとされ、比色定量のため比較的純粋な抗原とそれぞれの試験動物に対する種特異的酵素結合抗体が必要である。競合ＥＬＩＳＡは組換え抗原とモノクローナル抗体（以下ＭＡｂと略称する。）を用いることで、非特異反応を抑え、感度と特異性を高めている。その有用性はZhouら（Avian Dis.42:517-22.1998：非特許文献３）とShaferら（Avian Dis.42:28-34.1998：非特許文献４）によって証明されており、種特異的酵素結合抗体を必要としないため様々な動物種においても診断できる可能性を持っている。
【０００８】
組換えタンパク質を用いたインフルエンザ診断系の有用性はいくつか報告されている。Harmonら（J Med Virol.27:25-30.1989:非特許文献５）は大腸菌によって発現したＮＰを用いてヒトにおけるインフルエンザ抗体の検出を酵素測定法（ＥＩＡ）により行い、発現ＮＰの抗原としての有用性を示した。Voetenら（Journal of Clinical Microbiology. 3257-3531.1998:非特許文献６）は、Ａ型およびＢ型のインフルエンザＮＰを大腸菌で発現させ、それを用いたＥＬＩＳＡにより、ヒトにおけるＡ型およびＢ型インフルエンザ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの抗体推移を調べた。この実験により組換え抗原を用いたＥＬＩＳＡの特異性と迅速性が示されている。
【０００９】
Yewdellら（J Immunol.126:1814-9.1981:非特許文献７）はＭＡｂを用いてインフルエンザ感染細胞からのＮＰとＭの発現をラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡと略称する）、蛍光抗体法、凝集試験等の方法で調べ、ＮＰがＭより多く発現されていること、又はこれらの試験で検出されやすいことを示している。つまり、診断においてより多く産生される、又は検出されやすいと考られるＮＰに対するＭＡｂを用いることはインフルエンザの診断において重要である。さらに、これにより抗ＮＰ ＭＡｂを用いた診断の有用性が示され、Yewdellらによって作製されたＭＡｂはDe Boerら（Arch Virol.115:47-61.1990：非特許文献８）のＮＰ−ＥＬＩＳＡにも用いられ、迅速で様々な動物種に用いることができることが示されている。
【００１０】
バキュロウイルス発現組換えＮＰと抗ＮＰ ＭＡｂを用いた競合ＥＬＩＳＡはZhouら（非特許文献３）とShaferら（非特許文献４）によってその有用性が示されている。Zhouら（非特許文献３）は鶏、七面鳥、エミュー、ダチョウの血清を用い、競合ＥＬＩＳＡ、ＡＧＰ試験、ＨＩ試験の比較を行い、ＡＧＰ試験陰性で競合ＥＬＩＳＡ陽性かつＨＩ陽性検体を検出し、競合ＥＬＩＳＡがＡＧＰ試験より感度と特異性が高く、ＨＩ試験と同等の感度と特異性を持つことを示した。Shaferら（非特許文献４）も同様に、鶏、七面鳥、走鳥類、ウズラ、キジ、ペンギンの血清を用い、競合ＥＬＩＳＡ、ＡＧＰ試験の比較を行い、この２つの検査結果の高い相関と競合ＥＬＩＳＡの高い特異性を示した。Shaferら（非特許文献４）の競合ＥＬＩＳＡでは抗原の精製は行っていない。
【００１１】
【非特許文献１】Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001
【非特許文献２】Avian Dis.29:136-44.1985
【非特許文献３】Avian Dis.42:517-22.1998
【非特許文献４】Avian Dis.42:28-34.1998
【非特許文献５】J Med Virol.27:25-30.1989
【非特許文献６】Journal of Clinical Microbiology.3257-3531.1998
【非特許文献７】J Immunol.126:1814-9.1981
【非特許文献８】Arch Virol.115:47-61.1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らが発現を試みたＡＩＶのＮＰは、ウイルスの生活環を通していくつかの異なった機能を持つ４９８アミノ酸残基からなるタンパク質である。それは主にマイナス一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質として機能し、リボヌクレオプロテイン粒子（以下ＲＮＰｓと略称する。）内の構造タンパク質である。加えて、ＮＰは細胞質と核の間のＲＮＰｓの輸送と転写において重要な役割を担っている。ＮＰ遺伝子は1,565ｂｐで、分節５にコードされている。ＮＰはウイルス間で高く保存されており、鳥亜型の他のＮＰと９５％以上のアミノ酸配列の一致を持っている。さらに、亜型を規定するＨＡやＮＡをコードする遺伝子分節とは異なる分節上に存在するため、ＨＡとＮＡの抗原変異による影響を受けず、Ａ型インフルエンザ共通であるので診断検査に利用される重要なタンパク質である。
【００１３】
特に限定するものではないが、本発明者らは、発現系としてバキュロウイルス−昆虫細胞を用いた。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（以下ＮＰＶと略称する。）に属するAutographa california nuclear polyhedrosis virus（以下ＡｃＮＰＶと略称する。）を用いた。また、バキュロウイルス用トランスファーベクターとしてプラスミドｐＡｃＹＭ１を使用した。このベクターは、ポリヒドリン遺伝子開始コドンであるＡＴＧのＡを含むプラスミドベクター（クローニング位置付近の塩基配列はＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴ Ａ ＣＧＧＡＴＣＣＧであり、下線部は制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位）で最も高い発現効率が得られることで知られる。バキュロウイルス発現系のポイントは、ポリヒドリンと呼ばれる核内封入体構成タンパク質のプロモーターにある。発現させる遺伝子によっても異なるが、ウイルス感染末期では多いもので細胞総タンパク質の約５０％が目的タンパク質であると言われる。この系においては、真核生物である昆虫細胞中でタンパク質の合成が行われるため、大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの下等な真核生物の発現系とは異なり、タンパク質の正しい修飾が期待される。実際、シグナルペプチドの切断、リン酸化、糖鎖および脂肪酸の付加、タンパク質分解酵素による開裂などの修飾が確認されている。
【００１４】
本発明者らは、さらに、ＮＰに対するＭＡｂの作製を試みた。ポリクローナル抗体と比較して、ＭＡｂの利点は以下の３点（１）〜（３）に集約される。
（１）目的分子の抗原決定基に対して、高力価で高特異性を有する抗体が得られること、
（２）抗体産生ハイブリドーマは、他の細胞株と同様に液体窒素保存が可能であり、実験者の必要に応じて抗体の調整が可能であること、
（３）ＭＡｂの精製が容易であることである。
【００１５】
現行の診断法には、感度、迅速性、特異性等の面において改良すべき点が多く、ＡＩＶの診断基準とされているＡＧＰ試験は多検体処理に不向きで多くの抗体および抗原の量を必要とする。つまり、多検体を処理することができ、高感度かつ高特異性の診断系の開発が重要となってくる。さらに、ＡＩＶは様々な哺乳類および鳥類に感染するので、それら様々な動物種でのモニタリングも可能な方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＡＩＶ株間で保存性が高いとされるＡＩＶ ＮＰを、例えば、バキュロウイルスで発現させ、スクリーニング用抗原供給の可能性について鋭意検討し、さらに、ＡＩＶ ＮＰに対するＭＡｂを作製し、ＡＩＶの高感度検出系として競合ＥＬＩＳＡの有用性を鋭意検討し、ＮＰを用いた高感度血清学的診断系の確立を試み、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、下記１〜７に係るインフルエンザ感染検査薬、および下記８〜１４に係るインフルエンザ感染検査方法の発明である。
１． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）抗体検出抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査薬。
２． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）から単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる前記１に記載のインフルエンザ感染検査薬。
３． ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加してＮＰ−Ｈｉｓとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる前記１又は２に記載のインフルエンザ感染検査薬。
４． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる前記１〜３のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
５．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、少なくとも前記（１）の固相化抗原と
（２）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）とからなる前記１〜４のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
６． 固相化抗原がＥＬＩＳＡプレートに固相化されている前記４又は５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
７． ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる前記５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
８． インフルエンザウイルスの核タンパク質を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査方法。
９． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶから単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる前記８に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１０．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用い、少なくとも前記固相化抗原（１）と
（２）前記核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を用いる前記８又は９に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１１．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させる前記１０に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１２．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させ、次いで、
（４）前記（３）の抗ＮＰ ＭＡｂのみと反応する酵素標識抗体を加え、次いで、
（５）前記（４）の酵素標識抗体の標識酵素の酵素基質を加えたときの発色を測定する前記１１に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１３． ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる前記１０〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１４． 抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いる前記９〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いた診断系は高い感度と特異性を示した。中でも、ＭＡｂを用いる競合ＥＬＩＳＡは高い有用性を示した。競合ＥＬＩＳＡによるＡ型インフルエンザ抗体の診断にはいくつかの有利な点がある。競合ＥＬＩＳＡは多検体処理が可能なため時間を節約することができる。組換えタンパク質を用いるためウイルスを用いる必要がない。さらに、ＥＬＩＳＡプレートに抗原を固相化させ、保存しておくことで、検査を容易にし、更なる時間の短縮へとつながる。間接ＥＬＩＳＡのような純度の高い抗原の精製を必要としない。そして、様々な哺乳類および鳥類におけるモニタリングも同様の方法で検査できる可能性を持つ。
【００１９】
感度と特異性が低下しない、抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートの保存は、検査をより容易にし、他の検査機関への供給を容易とするので特に好ましい。本発明では、ＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓについてＨｉｓ−ｔａｇを利用した精製を行った。精製抗原を用いると、ＥＬＩＳＡの非特異反応を効果的に抑えることができる。しかし、精製には多くの時間を必要とし、さらに抗原の量も著しく少なくなる。非精製状態での競合ＥＬＩＳＡでは多検体処理をさらに効率よく行うことができる。本発明に係る診断系は、様々な動物種における血清を用い競合ＥＬＩＳＡを行うことにより幅広く用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ＡＩＶ ＮＰ遺伝子のクローニングは、分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株を鋳型とし、ＲＴＰＣＲ法により各分節の全長を増幅させた。ＮＰ遺伝子特異的プライマーはＮＰのＣ末端にヒスチジンタグを付加するように設計した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ2.1に挿入し、コンピテント細胞へトランスフォーメーションした。
【００２１】
ＡＩＶ ＮＰ遺伝子の発現は特に限定されないが、好ましくはバキュロウイスル発現系により行う。組換えバキュロウイルス作製は、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ ｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１に挿入後、トランスフォーメーションを行い、ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＡｃＹＭ１とＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺとのコトランスフェクションにより組換えウイルスを作製した。このウイルスをプラッククローニングし、これをＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓとした。得られたＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＳｆ９細胞に感染させ、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを発現させた。さらに、ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染細胞から、Ｎｉカラムを用いてＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを精製した。
【００２２】
本発明者らは、発現させたＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の有用性の検討を行った。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いた間接ＥＬＩＳＡでは、ＡＩＶ免疫鶏血清については、実施した血清希釈において用いた野外正常鶏血清より有意に高い値を示し、また用いた全ての野外正常鶏血清において、実施した血清希釈における非特異的陽性反応は認められなかった。さらに、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＡＧＰ試験ではＡＩＶ免疫鶏血清でのみ沈降線を形成し、野外正常鶏血清では非特異的陽性反応は認められなかった。野外ダチョウ血清においては全て陰性であった。なお、これらの結果はＲＮＰ抗原を用いた結果と同じであった。これらの結果より、発現したＮＰは、様々な検査法の抗ＡＩＶ抗体検出用抗原として広く用いることができると考えられる。
【００２３】
抗ＡＩＶ ＮＰ ＭＡｂの作製では、精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いて免疫したマウスからＭＡｂ １１Ｅ５（軽鎖κ、重鎖ＩｇＧ１）が得られた。このＭＡｂ １１Ｅ５を濃縮し、反応性を調べたところ、抗原に精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡにおいて、1.0×１０5倍希釈まで反応した。抗原にＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）と精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたウェスタンブロッティングでは共にいずれの位置にもバンドが確認できなかった。このウェスタンブロッティング陰性であったことには以下のようなことが考えられる。
【００２４】
細胞内でインフルエンザＮＰはオリゴマーとして安定している。さらに、このＮＰオリゴマーは非共有結合により結合していて、ＳＤＳ抵抗性、広い温度範囲と塩類（１Ｍ ＮａＣｌ，１Ｍ ＫＣｌ）や変性剤（８Ｍ 尿素）の存在下でも安定しているが、８０℃以上の加熱とｐＨ５以下でＮＰモノマーに解離する。つまり、抗原調整の段階での１００℃の加熱やＭＥ＋の影響により立体構造が変化した可能性がある。さらに、ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を抗原とした場合に、どの部分にもバンドが確認できなかったことと、ＥＬＩＳＡで高い反応を示した精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓにも全く反応しなかったことから、ＭＡｂ １１Ｅ５に対するＮＰのエピトープが電気泳動又は加熱による影響で変化したのではないかと考えられる。
【００２５】
本発明者らは、ＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓとＭＡｂ １１Ｅ５を用いた競合ＥＬＩＳＡの応用の検討を行った。競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＡＩＶ免疫鶏血清は全てほぼ１００％の抑制を示し、ＳＰＦ鶏血清、野外正常鶏血清、ダチョウ血清においては抑制反応は認められなかった。またＡＧＰ価２〜８である実際のＨ９Ｎ２感染鶏血清５検体はそれぞれ１００％、３４％、１００％、９１％、８０％の抑制率を示した。そこで、陰性検体の抑制率の平均値と標準偏差、また実験感染鶏血清の抑制率から、３０％以上の抑制を陽性とすることにした。
【００２６】
さらに、Ｈ１からＨ１２に対するＡＩＶ免疫鶏血清において、競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界を比較したところ、競合ＥＬＩＳＡ陽性限界／ＡＧＰ試験陽性限界は約１〜１０倍であり、ＡＧＰ試験に比べ競合ＥＬＩＳＡの方がより感度が高いことが判明した。
【００２７】
ＡＧＰ試験と競合ＥＬＩＳＡで判定結果が異なる検体が検出された。既にＡＧＰ試験により陰性と診断されている山口県でＡＩ殺処分対象となった鶏血清７５検体における競合ＥＬＩＳＡの結果では、３０％以上の抑制を示した検体が１検体あり、その抑制率は４１％であった。なお、競合ＥＬＩＳＡで３０％以上の抑制を示した検体ではA/Duck/Hokkaido/８４/０２（Ｈ５Ｎ３）を用いたＨＩ試験で血清希釈２０倍まで検出可能であり、他の検体ではＨ５に非特異的に反応した検体はなかったので、この反応はＨ５亜型特異的であることが確認された。この結果は、競合ＥＬＩＳＡがＡＩＶ感染の血清学的診断法としてＡＧＰ試験の代替法として用いることができることを示している。さらに、ＥＬＩＳＡが数値として客観的に判定できるのに対し、ＡＧＰ試験では判定が主観的なものになってしまい、明瞭な沈降線を形成しない場合に陽性を見落とす可能性がある。
【００２８】
ゲル内沈降（ＡＧＰ）試験に代わる多検体処理が可能で、高感度かつ高特異性の、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）の診断系を開発した。ＡＩＶ株間で保存性が高くＡＩの診断に有用であるとされる核タンパク質（ＮＰ）を発現し、スクリーニング用抗原の供給を可能とし、さらにＮＰに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製とそれを用いた競合ＥＬＩＳＡの有用性を明らかにした。ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）のＮＰ遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加しバキュロウイルスと昆虫細胞を用いてＮＰ−Ｈｉｓとして発現した。抗ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）はＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した。
【００２９】
ＡＩＶ免疫血清と正常血清を用いた発現ＮＰを抗原とした間接ＥＬＩＳＡ、ＡＩＶ免疫血清と正常およびダチョウ血清を用いた発現ＮＰを抗原としたＡＧＰ試験、いずれもＡＩＶ免疫血清を有意に検出し、用いた正常血清には非特異反応は認められず、また、ダチョウ血清は陰性だった。ＡＩＶ免疫血清、実験感染血清、正常およびダチョウ血清を用いた競合ＥＬＩＳＡでは陽性であるＡＩＶ免疫血清と実験感染血清では有意な競合が認められ、正常血清やダチョウ血清では競合は認められなかった。
【００３０】
さらに、ＡＩＶ免疫血清を用いて競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界を比較したところ、競合ＥＬＩＳＡの方が１〜１０倍感度が良いことが示された。そこで、ＡＩ殺処分対象血清７５検体について競合ＥＬＩＳＡを実施したところ、陽性を１検体検出した。この検体を用いた赤血球凝集抑制試験ではＨ５亜型が特異的に抑制された。これらの結果から、発現したＮＰは様々な検査法のＡＩＶ抗体検出抗原として広く用いることができ、競合ＥＬＩＳＡは短時間かつ高感度に抗ＡＩＶ抗体を検出できることから、スクリーニングにとって有用性の高い検査法であることが示された。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何らの制約を受けるものではない。
［材料および方法］
１．被検血清
ＡＩＶ（Ｈ９Ｎ２亜型）実験感染鶏血清は、独立行政法人動物衛生研究所（茨城県つくば市）から分与された。ＡＩ殺処分対象鶏血清８０検体は山口県中部家畜保健衛生所から分与された。ダチョウ血清は山形朝日オーストリッチ産業センター（山形県朝日町）から分与された。野外正常鶏血清は青森ポートリー（青森県八戸市）から分与された。ＳＰＦ鶏血清は、化学及血清療法研究所（熊本県熊本市）から分与された。抗ＡＩＶ免疫鶏血清は作製されたものを用いた。
【００３２】
２．トリインフルエンザウイルス
参照ウイルス株としてＨＡの１〜１２亜型、ＮＡの１〜９亜型を含むウイルスを用いた。これらの株は、北海道大学大学院獣医学研究科微生物学教室喜田宏教授から分与された。ＮＰ抗原作製用には、A/budgerigar/Aichi/１/７７（以下Ａ株と略称する。）を社団法人動物用生物学的製剤協会（東京都）から購入した。ＮＰ遺伝子クローニング用には、分離株A/Duck/Aomori/４７８/０２を用いた。
【００３３】
３．ＡＩＶの精製
Ａ株をリン酸緩衝生理食塩液（0.14Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，1.5ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ7.2：以下ＰＢＳと略称する。）で１０-1、１０-2、１０-3、１０-4に希釈し１０日齢の発育鶏卵（小岩井農場、岩手県雫石町）に接種した。３日後、Ａ株感染漿尿液を回収し、1,100ｘｇ、１０分間、４℃で遠心し上清を回収した。回収した上清を超遠心分離機ＬＥ−８０Ｋ（Beckman、東京都）とＳＷ２８Roter（Beckman）で80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心した。上清は捨て、ペレットを0.08%アジ化ナトリウム（以下ＮａＮ3と略記する。）添加ＰＢＳで再浮遊し３日間、４℃で保存した。ペレットをよく撹拌し30,000ｘｇ、５分間遠心した。上清を回収し、１０％となるようにショ糖を加え、さらに２０〜８０％のショ糖液を密度勾配上に重層し、80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心した。各フラクションを回収しＰＢＳを３０ｍｌ加え、80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心し、上清を捨てた。ペレットを１ｍｌの0.08％ＮａＮ3添加ＰＢＳで再浮遊し精製A/budgerigar/Aichi/１/７７とした。
【００３４】
４．ＡＧＰ試験方法
１）寒天ゲルの作製
寒天ゲルの作製は、「鶏ウイルス病の診断法」（堀内貞治.鶏ウイルス病の診断法.pp. 595-606.1982.）に従って行った。リン酸緩衝液（0.02Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4，１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ7.4）に8.0％のＮａＣｌ、1.0％のBacto-Agarを混合した。その後、１０％ＮａＮ3を1.0％加えた。シャーレに２５ｍｌの寒天を入れ、寒天が固まってからゲルパンチャー（穴５ｍｍ×７well）で寒天を切り取り、吸引して穴を作り反応用寒天平板とした。
２）ＡＧＰ抗原
発育鶏卵培養精製Ａ株（以下ＲＮＰ抗原と称する。）を用いた。
３）ＡＧＰ試験
寒天ゲルの中央wellにＡＧＰ抗原を、陽性血清として周囲のwell １つおきに抗ＡＩＶ鶏血清を、その間に被検血清をそれぞれ３０μｌ/wellずつ入れ、室温で２日観察した。沈降線が確認された最大血清希釈倍数の逆数をＡＧＰ価とした。
【００３５】
５．ＨＩ試験（β法）
ＨＩ試験は、「ＯＩＥマニュアル」（OIE MANUAL OF DIAGNOSTIC TESTS AND VACCINES FOR TERRESTRIAL ANIMALS. HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA. OIE Terrestrial Manual. CHAPTER2.1.14.2004.）に従って行った。
１）ＨＡ試験
９６well Ｕ型マイクロプレート（９６Ｕ W/OUT LID SH MICROWELL PLATE：Nalge Nunc International, NY, USA）を用い、ウイルス液２５μｌを0.15Ｍ生理食塩水で２倍階段希釈し、さらに生理食塩水２５μｌと等量混合後、0.5％鶏赤血球液５０μｌと等量混合した。室温で１時間静置後、ＨＡの認められた最高希釈倍数の逆数をＨＡ価として判定した。ＨＩ試験（β法）では通常ＨＡ抗原４単位に対する凝集抑制価を標準としているため、ＨＡ判定陽性時の最高希釈ウイルス液を１ＨＡ単位として４ＨＡ単位抗原を決定した（国立予防衛生研究所学友会 .血清反応. pp. 192-201.1982. 改訂二版 ウイルス実験学 各論. 丸善株式会社 東京、前記「ＯＩＥマニュアル」）。
２）ＨＩ試験
被検血清２５μｌを生理食塩水で２倍階段希釈後、４ＨＡ単位抗原２５μｌと等量混合した。室温で１時間感作後、0.5％鶏赤血球液５０μｌと混合し、室温で１時間感作させて判定した。凝集抑制の最高希釈倍数の逆数をＨＩ価とした。
【００３６】
６．遺伝子操作
遺伝子操作は、主として「Molecular cloning」（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory, N. Y.1989.）に従って行った。
【００３７】
７．ＲＴ-ＰＣＲ
１）ＲＮＡ抽出
分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株の感染漿尿液0.25ｍｌにISOGEN-LS（株式会社ニッポンジーン、東京都）0.75ｍｌを加えた。続いて２００μｌクロロホルム（関東化学株式会社，東京都）を加え撹拌し、17,500ｘｇ、１５分間、４℃で遠心し、水層を回収した。さらに、３μｌのEtachinmate（株式会社ニッポンジーン）を加え、５００μｌのイソプロパノール（関東化学株式会社）を加え、転倒混和後、17,500ｘｇ、１０分間、４℃で遠心し上清を捨てた。ペレットに1,000μｌの７０％エタノール（関東化学株式会社）を加え7,700ｘｇ、２分間、４℃遠心した。ペレットを１０μｌのｄｄＨ2Ｏ（ＤＥＰＣ（関東化学株式会社）処理Ｈ2Ｏ）で再浮遊し、これをＲＮＡ抽出液とした。
【００３８】
２）プライマーの設計
以降のサブクローニングを考慮して、ＡＩＶ ＮＰ オープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦと略記する。）の両端に本来の遺伝子中には存在しない制限酵素ＢａｍＨＩ部位を、また得られるタンパク質の精製を考慮して３’末端側にはヒスチジンタグ（以下Ｈｉｓ−ｔａｇと記す。）配列を付加するよう設計した。ＡＩＶ ＮＰ遺伝子配列を参考に、ＡＩＶ ＮＰ遺伝子のＯＲＦに対し、フォワードプライマーとしてＡＩＶ ＮＰＦ：５’−ｇｇｇａｔｃｃａｃａｔｃＡＴＧｇｃｇｔｃｔｃａａｇ−３’、リバースプライマーとしてＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ：５’−ｃｇｇａｔｃＣＴＡａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｔｇｔｃａｔａｃｔｃｃｔｃｔｇｃａｔｔｇ−３’を設計した。なお、開始コドン、および終止コドンは大文字で、ＢａｍＨＩ部位（Ｇ：ＧＡＴＣＣ）を下線で示した。“ａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇ”はＨｉｓ−ｔａｇ配列部位である。
【００３９】
３）ＲＴ−ＰＣＲ
抽出したＲＮＡを鋳型として、ＡＩ特異的プライマーであるＵｎｉ１２（Hoffmannら, Arch Virol. 146:2275-2289.2001.）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより相補的ＤＮＡ（complementary ＤＮＡ：以下ｃＤＮＡと略記する。）を増幅した。GeneAmp RCA PCR core Kit（Perkin Elmer社、千葉県浦安市）を用いて、４２℃×６０分間、９９℃×５分間、３０℃×１分間の逆転写酵素反応を行った。続いて、遺伝子の増幅にはPCR Core Kit（Perkin-Elmer,MA,USA）を用いた。ＮＰ特異的プライマーを用い、変性を９４℃、プライマーのアニーリング温度を５８℃、ｃＤＮＡ合成を７２℃とし、Step１（９４℃×４分間）を１サイクル、Step２（９４℃×２０秒間、５８℃×３０秒間、７２℃×７分間）を３０サイクル、Step３（７２℃×７分間）を１サイクル行った（Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001）。
【００４０】
８．アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動には、ＴＢＥ緩衝液（0.1M Tris, 2mM EDTA,85mM Boric acid）にSeaKem GTG Agarose（宝酒造株式会社、京都府）を加え、加熱溶解後エチジウムブロマイド（以下ＥｔＢｒと略称する。）を最終濃度がそれぞれ１％、１０ｎｇ／ｍｌになるように加え、室温にてゲル化し作製した。試料を１００Ｖの定電圧で３０分から１時間泳動し、紫外線照射により核酸を検出した。ＤＮＡの長さは１００ｂｐ DNA Ladder（宝酒造株式会社）と比較して推定した。
【００４１】
９．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子のクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ法で増幅させたＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子をTA Cloning Kit（Invitrogen, CA, USA）を用いて、プラスミドベクターであるｐＣＲ2.1にライゲーションさせた。これをHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社、京都）に形質導入させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、0.12％Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：宝酒造株式会社）添加ＴＹＭ寒天培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract,0.1％glucose,10mM MgSO4・7H2O，1.5％bacto agar）上で３７℃において一晩培養した。β−ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを代謝し、青色の色素を生成するが、ＡＩＶ ＮＰ Ｈis遺伝子がベクターのＬａｃＺ領域に挿入された場合、β−ガラクトシダーゼが産生させず、白色のコロニーが認められる。このWhite-Blue Selectionを利用して、白色コロニーを選択し、一晩、ＴＹＭ液体培地（２％bacto-tryptone, 0.5％yeast extract,0.1％glucose,10mM MgSO4・7H2O）中で培養し、ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＣＲ2.1を得た。これからプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子挿入の確認を行った。抽出後ＢａｍＨＩ消化されたプラスミド遺伝子とプライマー（ＡＩＶ ＮＰＦおよびＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ）を用いてDideoxy Terminator法（Sangerら, J.Mol.Biol. 94:41.1975.）によりシーケンス反応を行った。反応には標識蛍光ジデオキシヌクレオチド（以下ｄｄＮＴＰと略称する。）を用いたDye Terminator Cycle Sequencing Kit FS（Perkin-Elmer）を使用した。９６℃×４５秒間、５０℃×３０秒間、６０℃４分間の反応を２５サイクル行い、スピンカラムによる精製後、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（Perkin-Elmer）により塩基配列を決定した。
【００４２】
１０．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓのバキュロウイルスでの発現
１）トランスファーベクターの作製
クローニングで得られたｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＣＲ2.1をＢａｍＨＩ（宝酒造株式会社、京都）で消化後、アガロースゲル電気泳動で展開し、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子フラグメントをゲルごと切り出した。フェノール処理後エタノール沈殿によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子を精製した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩで消化したバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（Matsuuraら, J. Gen. Virol. 68:1233-1250.1987.）にTakara DNA Ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いてライゲーションし、次いでHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させた。これを５０μｇ/ｍｌアンピシリン添加ＴＹＭ寒天培地上で一晩培養した。出現コロニーから５０μｇ/ｍｌアンピシリン添加ＴＹＭ液体培地にて大量培養しｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１を得た。プラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ消化後アガロースゲル電気泳動によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子の挿入を確認した。ここでｐＡｃＹＭ１のポリヒドリンプロモーターに対しＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子が正方向に挿入されていることを確認するため、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするＰＣＲ法を行った。プライマーとしてｐＡｃＹＭ１のポリヒドリンプロモーターとクローニングサイトの間に認識部位があるＢａｃ１Ｎプライマー（５’−ｔｇａｔａａｃｃａｔｃｔｃｇｃａａａ−３’）およびＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子３’末端に相補的なＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓプライマーを用いた。この方法では、ポリヒドリンプロモーターに対し正方向に挿入された場合にのみ約1,500ｂｐのバンドの位置に増幅が認められる。
【００４３】
２）バキュロウイルスおよび宿主細胞
バキュロウイルス野外株としてＡｃＮＰＶを用い、組換えウイルス作製親株にはＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ（Kittsら, Nucleic Acid Res. 18:5667-5672.1990.）を使用した。バキュロウイルスの宿主細胞としては、ヨトウガの一種Spodoptera frugiperdaの卵巣から樹立されたＩＰＬＢ−Ｓｆ２１ＡＥ（以下Ｓｆ２１細胞と略称する。）あるいはＳｆ２１細胞からクローニングされたＳｆ９細胞を用いた。Ｓｆ２１細胞は、ＴＣ−１００昆虫培地（Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA）、以下ＴＣ１００（０％）と略称、にウシ胎児血清（Fetal Calf Serum：以下ＦＣＳと略称する。）を１０％加えたＴＣ１００（１０％）で維持し、クローニングに使用した。Ｓｆ９細胞は、ＥＳＦ９２１培地（Expression System LLC,Woodland,CA,USA:以下ESF９２１と略称する。）を用い、スピンカルチャー法により２８℃条件で維持培養し、高力価ウイルス作製、大量発現に使用した。バキュロウイルスおよびＳｆ２１細胞は、NERC Institute of Virology（Oxford,UK）から分与され、Ｓｆ９細胞はExpression Systems LLC（Woodland,CA,USA）から購入した。
【００４４】
３）組換えバキュロウイルスの作製
ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＡｃＹＭ１（１０μｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｅｃｏ８１Ｉで消化し直鎖状にしたＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）１μｌにＴＣ１００（０％）を６μｌ加えた混合液（ＤＮＡ混合液）と、ＴＣ１００（０％ＦＣＳ）培地８μｌ、リポフェクチン（GIBCO BRL）８μｌとの混合液（リポフェクチン混合液）をそれぞれ室温で３０分間反応させた。次にＤＮＡ混合液とリポフェクチン混合液とを混合し室温で１５分間反応させた後、Ｓｆ２１細胞にトランスフェクトし相同組換えにより組換えウイルスを作製した。２８℃で３日間培養後、培養液を回収しＳｆ２１細胞でプラッククローニングを行った。接種３日後にニュートラルレッド３００μｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ（宝酒造株式会社）７５μｇ／ｍｌを用いてプラックを染色した。接種４日後、光学顕微鏡下で青色の色素の認められないプラックを組換えウイルスの形成したプラックとみなし、同プラックをパスツールピペットを用いてＴＣ１００（１０％）培地に回収し、プラッククローニングとした。この操作を３回繰り返し白色プラックのみを形成する組換えバキュロウイルスを獲得し、これをＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓと命名した。このＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＳｆ２１細胞で数継代し、シードウイルスとした。
【００４５】
４）タンパク質発現の確認
ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓを単層培養したＳｆ９細胞（1.5×１０6Cells）に感染の多重性（Multiplicity of infection：以下ＭＯＩと略称する。）を約５ Plaque Forming Unites（以下ＰＦＵと略称する。）／cellで接種し、ＥＳＦ９２１培地を用いて２８℃で培養し、接種１、２、３、４、５日後に細胞および上清を回収した。また、ＡｃＮＰＶあるいはネガティブコントロールとして培養液（以下Mockと略称する。）を同様に接種し、５日後に細胞と上清を回収した。細胞については、昆虫細胞用リン酸緩衝生理食塩水（0.14M NaCl,26.82mM KCl,8mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4,pH7.4:以下PBS-Acと略記する。）で洗浄後、Laemmli（Laemmli, U. K. Nature. 277:680-685.1970.）の４×サンプルバッファー（62.5ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ6.8， ２％ＳＤＳ，１０％Glycerol， 0.02％ Bromophenol blue， ５％ ２-メルカプトエタノール；以下、２Ｍｅ＋Ｂｕｆｆｅｒと略記する。）に再浮遊させた。また、培養上清については２Ｍｅ＋Ｂｕｆｆｅｒと３：１の割合で混合した。各試料を１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳを含む12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により展開した。泳動後、クマシーブリリアントブルー染色液（４５％Methanol,１０％Acetic acid,0.025％Coomassie brilliant blue）で染色（以下ＣＢＢ染色と略記する。）、もしくはウエスタンブロッディングにより解析した。
【００４６】
５）ウェスタンブロッティング解析
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ終了後、ゲルを転写緩衝液（0.02M Tris, 0.15M Glycine, 0.01%SDS,5% Methanol）で洗浄し、ウェスタンブロッティング装置ホライズブロット（アトー株式会社、東京都）を用いて、ニトロセルロース膜Hybond C Extra（Amersham, Amersham, UK）に１００ｍＡで1.5時間転写した。転写後、ニトロセルロース膜未結合部分をブロック液（１％Skim Milk Powder, 0.1％ Tween-20をPBSで溶解）でブロッキングした。ついで一次抗体として抗ポリヒスチジンマウス血清（SIGMA, St.Lois, MO, USA:以下αpolyHisと略称する。）を用い、室温で３時間反応させた。反応後、ブロック液で３回洗浄し、二次抗体を３７℃で２時間反応させた。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA）を希釈して用いた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、BM blue POD substrate（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）用いて発色させた。
【００４７】
１１．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの大量発現および精製
1.5×１０6cells/ｍｌに調整したＳｆ９細胞にＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＭＯＩ ５ ＰＦＵ／cellで接種した。接種後２４時間ごとに培養液の一部を採取して等量のトリパンブルー液と混合後、生細胞と死細胞の数をカウントした。生細胞数が5.0×１０5 cells／ｍｌを下回った時点で７００ｘｇ、１５分間遠心により細胞を沈殿させペレットを回収した。このペレットをXpress System Protein Purification Kit (Invitrogen)を用い、キット説明書に従い、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを精製した。すなわち、培養細胞５０ｍｌ分のペレットを１０ｍｌのNative Binding Bufferで再浮遊し、氷上でHandy Sonic model UR-20P（TOMY，東京都）を用い超音波による細胞の破壊を行った。続いて４℃、15,000ｘｇで２０分間遠心し、上清を回収し、２Ｍ ＮａＯＨによりｐＨを7.6〜7.8に調整した。ニッケルキレートカラムをＤＷ2で洗浄し、Native Binding Bufferで平衡後、回収したＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを含む上清をニッケルキレートカラムに入れ1時間振盪させることでＨｉｓ−ｔａｇを付加された発現タンパク質を吸着させた。吸着後のカラムをWash Bufferで洗浄し、５０、５００、1,000ｍＭの各濃度に調整したＩｍｉｄａｚｏｌｅを用いて１ｍｌずつの分画にし、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加タンパク質を溶出させた。これを12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＣＢＢ染色による確認後、タンパク質が確認された分画をＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（Amersham Pharmacia Biotech、東京都）を通して脱塩した。これを同様に12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＣＢＢ染色およびウェスタンブロッティングによる確認後、無菌濾過し、精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓとした。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓのタンパク質含有量はMicro BCA Protein Assay Reagent Kit（PIERCE,Rockford, IN, USA）を用いて測定した。
【００４８】
１２．ＮＰ抗原を用いた間接ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、Kidaら（Kidaら, Virology. 122:38-47.1982.）の方法に従い実施した。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ（９０μｇ／ｍｌ）を抗原としてＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト株式会社、東京都）に５０μｌ／wellで播き、室温で２時間もしくは４℃で２４時間静置した。抗原を回収し、抗原がコートされていないwell部分への非特異反応を防止するため、ＢＳＡ１０（Bovine serum albmin fraction Ｖ （ナカライテスク株式会社、京都府）１０ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに添加、ｐＨ7.2）を１００μｌずつ添加し、室温、１時間もしくは４℃、２４時間静置後、ＰＢＳＴ（0.05％Tween２０添加ＰＢＳ，ｐＨ7.4）で３回洗浄した。ＢＳＡ５Ｔ（ＢＳＡ fraction Ｖを５ｍｇ／ｍｌになるようＰＢＳＴに添加）で４０、１６０、６４０、２，５６０倍に希釈した被検血清を５０μｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで４回洗浄後、ＢＳＡ５Ｔで１，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗鶏ＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International，Inc. CA, USA）を５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応後、発色剤（ｐＨ4.0,0.05Ｍ Citric buffer,0.013％過酸化水素，２％ ４０ｍＭ ＡＢＴＳ）を１００μｌずつ添加し、暗室、室温で１５分後と３０分後にＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社、東京都）により４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
１３．ＮＰ抗原を用いたＡＧＰ試験
ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染昆虫細胞をDisruption buffer（0.05M Tris-HCl,0.5％ TritonX100,0.6M KCl）処理して抗原とし、ＡＧＰ試験に従い行った。
【００５０】
１４．モノクローナル抗体の作製
１）供試マウス
６週齢ＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス（日本クレア株式会社、東京都）１匹を用いた。
２）免疫抗原
モノクローナル抗体作製のための免疫源は、精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いた。精製ウイルスを最終濃度0.05％のホルマリンで不活化し、４℃で保存した。アジュバントにはフロイントコンプリートアジュバント（SIGMA）用い、ＰＢＳで４倍に希釈した精製ウイルスと等量混合し乳剤を作製した。作製した免疫源はマウスの腹腔内に２００μｌ／headで接種した。同様に処理した乳剤を同様の方法で初回免疫から２週毎に複数回追加免疫を行い、最終追加免疫３日後にマウスを解剖した。
【００５１】
３）ハイブリドーマの作製
マウスミエローマ細胞（J Immunol Methods. 35(1-2):1-21.1980:以下ＦＯ細胞と略称する。）を、ＲＰＭＩ １６４０培地（ニッスイ、東京都）に１０％ＦＣＳを添加した培地（以下１０％ＲＰＭＩ １６４０と略称する。）で、３７℃、５％ＣＯ2で静置培養した。細胞培養ルーからＦＯ細胞をはがし、１００ｘｇで８分間遠心することにより細胞を集め、１０％ＲＰＭＩ １６４０で再浮遊し２．０×１０7cell／ｍｌに調整し、融合に供した。最終免疫から３日後、マウスをエーテル麻酔下で心臓採血により安楽殺した後、その血液を３７℃、５％ＣＯ2で１時間、さらに４℃で２４時間静置した。２４時間後に血清を分離し、−２０℃で保存した。安楽殺処置後のマウス脾臓を摘出し、ディスポーザブル注射器の内筒を用い、金属メッシュ上で脾臓を圧片することにより脾臓細胞を分離した。脾臓細胞に１０％ＲＰＭＩ １６４０を加え、脾臓細胞洗浄を１００ｘｇ、８分間、２回行った。洗浄した脾臓細胞を１０％ＲＰＭＩ １６４０で1.0×１０8 cell／ｍｌに調節した。
【００５２】
４）マウスリンフォカインの作製
ハイブリドーマを増殖活性化させるため、マウスリンフォカインを作製した（KANE, M. M. and BANKS, J. N. Immunoassay Making and manipulating hybridoma cells. 5.1 Facilities and media Protocol. 11 37-40.）。抗原未接種のＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽殺後、先述と同様な方法で脾臓を分離し、分離した脾臓細胞を2.5μｌ／ｍｌ lipopolysaccharide endotoxin（SIGMA：以下ＬＰＳと略称する。）含有１０％ＲＰＭＩ １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2、４日間培養した。３９０ｘｇ、５分間で遠心後、上清を回収し、２６ｍｍ Syringe Filter 0.22μｌ（Corning Incorporated Corning,NY 14831,Germany）を用い濾過滅菌後、セラムチューブ（Greiner bio-one、Frickenhausen１,Germany）に分注し−２０℃で保存した。使用時はＨＴ培地（SIGMA）で２０倍希釈し１００μｌ／wellで用いた。
【００５３】
５）細胞融合と選択
免疫マウスの脾臓細胞を1.0×１０8cell、ＦＯ細胞を２×１０7cellに調整し、脾臓細胞：ＦＯ細胞＝５：１で混合した。１００ｘｇ、８分間遠心後、培養液を除去し、ポリエチレングリコール４０００（関東化学株式会社、埼玉：以下ＰＥＧと略称する。）溶液（8.75μＭ ＰＥＧ，１５％ジメチルスルフォキシド添加ＲＰＭＩ １６４０）0.2ｍｌを徐々に滴下しながら融合し、ハイブリドーマを作製した。
融合にあたりＨＡＴ培地（SIGMA）で細胞濃度を１０6cell／ｍｌに調整し、９６wellプレート（９６Wells w/Lid、Flat Bottom:Greiner）に１００μｌ／wellで播き、ハイブリドーマを選択した。得られたハイブリドーマに対し、北海道大学大学院獣医学研究科微生物学教室喜田宏教授から分与されたＡＩＶ抗原（A/Aichi/２/６８）と粗精製ＡＩＶ ＮＰを抗原としたＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＮＰ抗体産生ハイブリドーマを、５％リンフォカインを添加したＨＴ培地を用い限界希釈法により２回クローニングを行った。クローニング後、アイソタイプを調べ、大量培養した。
【００５４】
１５．モノクローナル抗体の確認
１）抗ＡＩＶ ＮＰ抗体検出用ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、抗原として粗精製ＡＩＶ ＮＰを、１次抗体にハイブリドーマ培養上清を、２次抗体にペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International、Inc. CA, USA）を用いて行った。
２）ウェスタンブロッティング解析
抗原としてＰＢＳ（ｐＨ7.2）で１００倍希釈した精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）と精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用い、12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とウェスタンブロッティングを行った。１次抗体として、ＭＡｂ産生ハイブリドーマ培養上清を用い、２次抗体には、ブロック液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（Transduction Laboratories,Lexington, KY, USA）を用いた。
【００５５】
１６．アイソタイプの決定
アイソタイプの決定は、Immuno pure Monoclonal Antibody Isotype kit Ｉ（PIERCE）を用い、製品マニュアルに基づいて行った。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（SUMILON）にキット附属の coating antibody solutionを ５０μｌずつ固相化後、室温で２時間もしくは４℃で２４時間静置した。溶液を取り除き１２５μｌのblocking solutionを加え３７℃で１時間静置した。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、ＭＡｂを含むハイブリドーマ培養上清と陽性対照を５０μｌずつ添加後、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、抗マウス特異的アイソタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ，ＩｇＡ，κ，λ）ウサギ血清と陰性対照として正常ウサギ血清を滴下した。陽性対照には抗マウスＩｇＧを滴下し、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清を５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ substrate solutionを加え、室温で３０分間反応させ、ＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社、東京都）により４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５６】
１７．ＭＡｂの精製および濃縮
クローニングを終了したＭＡｂ産生ハイブリドーマを大量培養フラット（INTEGRA CellLineCL 1000）（IBS INTEGRA BIOSCIENCES, INTEGRA Biosciences AG,Switzerland）を用い培養した。細胞数が約２×１０7〜４×１０7cell／ｍｌの時期に、継代し、培養上清を回収した。大量培養フラット（INTEGRA CellLineCL1000）から回収したＭＡｂ産生ハイブリドーマ培養上清から、Montage（商標） life science kits（MILLIPORE.com, MA, USA）を用いＭＡｂの精製を行った。前処理としてキット附属の0.22ｍｍマイクレス−ＧＰで産生ハイブリドーマ培養上清中の塵埃を除去した。Binding bufferを用いてPROSEP-A media plugを平衡状態にし、上清を１５０ｘｇ、２０分間遠心することでＭＡｂをPROSEP-A media plugに吸着させた。続いて、Binding bufferで５００ｘｇ、２分間の遠心を２回行いPROSEP-A media plugへの非結合タンパク質を洗浄および除去した。Elution bufferで５００ｘｇ、５分間遠心し、溶出液でPROSEP-A media plugからＭＡｂを溶出した。得られたＭＡｂに対し、Amicon Ultra 15 centrifugal Filter 30K NMWLで脱塩と濃縮を行った。そして、等量のグリセロールを添加後−２０℃で保存した。
【００５７】
１８．競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡはZhouら（Zhouら, Avian Dis. 42:757-761.1998.;Zhouら,Avian Dis. 42 : 517-22. 1998）とShaferら（Shaferら,Avian Dis.42:28-34.1998）の方法に従って行った。抗原としてＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ（５０μｌ／well）をＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（SUMILON）に２時間、室温又は４℃、２４時間シートさせた。抗原を回収したのち、wellをＢＳＡ１０ １００μｌ／wellによって２時間、室温又は４℃、２４時間ブロッキングした。WellをＰＢＳＴによって３回洗浄した。希釈した供試血清とブランクとコントロールとしてＢＳＡ５Ｔをそれぞれ５０μｌ／well添加し、３７℃、２０分間反応させた。血清を除去することなしに、ＰＢＳで20,000倍希釈されたＭＡｂをブランクwellを除き５０μｌ／well、ブランクwellにはＢＳＡ５Ｔをそれぞれ５０μｌ／well添加し、３７℃、１時間反応させた。WellをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＢＳＡ５Ｔで1,000倍希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International）を５０μｌ／well添加し、３７℃、１時間反応させた。WellをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μｌ／wellの発色剤（ｐＨ4.0，0.05Ｍ Citric buffer，0.013％過酸化水素，２％ ４０ｍＭ ＡＢＴＳ）を添加し、３７℃、３０分間反応させた。３０分後、ＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社）を用い４０５ｎｍ（ＯＤ405）で測定した。コントロール（ＭＡｂのみ）と比較したサンプル血清の抑制率は、正しい値を得るためにブランク値の平均を引いた後に算出され、それは全ての供試血清値とコントロールの値から引かれた。その公式は、１００−（１００×［供試血清値−ブランク値（ＢＳＡ５Ｔ）／コントロール値（ＭＡｂのみ）−ブランク値（ＢＳＡ５Ｔ）］）である。抑制率３０％以上を陽性とした。さらに、３０％以上の抑制を示した最大血清希釈倍数の逆数を競合ＥＬＩＳＡ価とした。
【００５８】
［結果］
１．ＡＩＶ ＮＰＨｉｓ遺伝子の作製
分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株の感染漿尿液からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として、ＡＩ特異的プライマーであるUni１２を用いたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。そのｃＤＮＡに対し、ＮＰ特異的プライマーであるＡＩＶ ＮＰＦとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓを設計し、これらを用いてＰＣＲを行ったところ、ＮＰの全長と考えられる約1,500塩基対の増幅を確認した。
得られたＰＣＲ産物をTA Cloning Kitを用いてｐＣＲ2.1にライゲーションし、コンピテント細胞である大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。White-Blue Selectionを利用して目的遺伝子の挿入されているホワイトコロニーを選択し、増菌培養を行った。得られた大腸菌からプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ladder（宝酒造株式会社）と比較したところ、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子と推定される約1,500ｂｐとベクターと推定される約3,900ｂｐの２本のバンドが認められた。さらに、プライマー（ＡＩＶ ＮＰＦとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ）を用いたＰＣＲにより、５’末端および３’末端から約５００残基の塩基配列の一致を確認した。全長ＮＰの配列決定は行っていない。
【００５９】
２．トランスファーベクターの構築
ＡＩＶＮＰ Ｈｉｓ−ｐＣＲ2.1をＢａｍＨＩで消化し、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを含む断片をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１にTakara DNA Ligation Kitを用いてライゲーションした。さらにコンピテントセルにトランスフォーメーションし、大腸菌からプラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドをＢａｍＨＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１，５００ｂｐの挿入遺伝子と約10,000ｂｐのｐＡｃＹＭ１ベクターのＤＮＡが確認された。この約1,500ｂｐのバンドが認められたプラスミドについて、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子が、ポリヒドリンプロモーターに対して正方向に挿入されていることを確認するために、Ｂａｃ１ＮプライマーとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓを用いてＰＣＲを行い、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。約1,500ｂｐのバンドの増幅が正方向に挿入されたことを示し、1,500ｂｐの増幅が認められたうちの一つのプラスミドをｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１とし、以下の発現実験に用いた。
【００６０】
３．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ発現組換えバキュロウイルスの作製
プラスミドｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１とＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ ＤＮＡをコトランスフェクションし、培養上清を、Ｘ−ｇａｌ存在下でプラッククローニングを行った。White-Blue Selection により白色を示したプラックを３回プラッククローニングし、Ｓｆ２１細胞で数継代後、高力価ウイルスを得、シードウイルスとした。プラックアッセイの結果、このシードウイルスの力価は2.0×１０8ＰＦＵ／ｍｌであった。これを組換えバキュロウイルスＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓとした。
【００６１】
４．組換えＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの発現の確認
得られたＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓを1.5×１０6cell／ｍｌ ３００ｍｌのＳｆ９細胞にＭＯＩを５ＰＦＵ／cellで接種し、5.0×１０5cell／ｍｌを下回った時点で回収した。αpolyHisを用いたウェスタンブロッティングでは、ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染細胞で約５６ｋＤａのバンドが認められ、ＡｃＮＰＶ感染細胞およびＭｏｃｋでは特異的バンドは認められなかった。
【００６２】
５．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの大量培養および精製
大量培養し、Ｎｉカラムを用いて精製を行った。Ｎｉカラムに吸着させたＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓをImidazoleで溶出後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開しＣＢＢ染色で確認した。５００ｍＭで溶出させた際、約５６ｋＤａのバンドが認められた分画についてプールし、ＰＤ１０カラムを通して脱塩し、同様にＣＢＢ染色およびウェスタンブロッティングを行った。ここで約５６ｋＤａのバンドが認められた分画を再度プールし、0.45μｍフィルターでろ過し、精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓとした。タンパク定量の結果、１００ｍｌのＳｆ９細胞培養ペレットから９０μｇ／ｍｌ、総タンパク量２７０μｇの精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓが得られた。
【００６３】
６．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡ
ＡＩＶ免疫鶏血清１２検体については、実施した血清希釈４０倍、１６０倍、６４０倍、２５６０倍において、用いた野外正常鶏血清１０検体より有意に高い値を示した。また、用いた全ての野外正常鶏血清において、実施した血清希釈における非特異的陽性反応は認められなかった。なお、陽性域は野外正常鶏血清の平均値と標準偏差から算出し、野外正常鶏血清における値に、その標準偏差の３倍を加えた値以上の反応を陽性とした。
【００６４】
７．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＡＧＰ試験
ＡＩＶ免疫鶏血清１２検体でのみ沈降線を確認することができ、野外鶏血清１６４検体では非特異的陽性反応は認められなかった。野外ダチョウ血清４４８検体では全て陰性であった。これらの結果はＲＮＰ抗原を用いた試験結果と同様であった。
【００６５】
８．抗ＡＩＶ ＮＰ ＭＡｂの作製と同定
精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いて免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞から１０種類のＭＡｂ産生ハイブリドーマが得られた。そのうち培養上清がＡＩＶ ＮＰ抗原に反応する８種類はＮＰに反応するＭＡｂを産生するハイブリドーマとみなし、ＡＩＶ抗原（A/Aichi/２/６８）には反応するがＡＩＶ ＮＰ抗原には反応しない２種類は他のタンパク質に反応するＭＡｂを産生するハイブリドーマであるとみなした。なお、これらＭＡｂのアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＭであった。目的とするＮＰと反応するＩｇＧは１１Ｅ５と６Ｅ１０に確認され、６Ｅ１０については限界希釈法を用いて５回クローニングを行ったが、軽鎖κ、重鎖ＩｇＭおよびＩｇＧ２ａの２種類のＭＡｂ産生ハイブリドーマが混在していた。これ以上の分離は時間的に困難と考え、細胞を液体窒素で凍結保存した。１１Ｅ５については軽鎖κ、重鎖ＩｇＧ１であった。
【００６６】
９．ＭＡｂ １１Ｅ５の大量培養と精製および濃縮
クローニングが終了したＭＡｂ産生ハイブリドーマ１１Ｅ５をINTEGRA CellLineCL 1000によって大量培養し、３０ｍｌの培養上清を得た。さらに、Montage（商標） life science kits（MILLIPORE.com, MA, USA）を用い培養上清を精製した結果、４００μｌの濃縮されたＭＡｂ １１Ｅ５が得られた。
【００６７】
１０．ＭＡｂ １１Ｅ５の反応性
抗原に精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡにおいて、濃縮前ＭＡｂ １１Ｅ５では1.0×１０3倍希釈、濃縮後ＭＡｂ １１Ｅ５では1.0×１０5倍希釈まで反応した。抗原としてＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）あるいは精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを抗原としたウェスタンブロッティング解析ではともにいずれの位置にもバンドが確認できなかった。つまり、ウェスタンブロッティング解析には反応しなかった。
【００６８】
１１．ＭＡｂ １１Ｅ５を用いた競合ＥＬＩＳＡ
供試血清について、ＡＩＶ免疫鶏血清は１００倍希釈、その他の血清は５倍希釈でＥＬＩＳＡに用いた。ＡＩＶ免疫鶏血清を用いた試験ではブランク平均値が0.218、コントロール平均値が1.311、Ｈ４Ｎ５免疫血清値が0.201、Ｈ５Ｎ３免疫血清値が0.23、Ｈ９Ｎ２免疫血清値が0.194、Ｈ１１Ｎ６免疫血清値が0.204であった。ＳＰＦ鶏血清ではブランク平均値が0.137、コントロール平均値が1.046、検体１が1.035、検体２が1.045、検体３が0.993であった。これらを既に示した公式にあてはめ抑制率を計算すると、
Ｈ４Ｎ５免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.201‐0.218／1.311‐0.218］）＝101.5％、Ｈ５Ｎ３免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.23‐0.218／1.311‐0.218］）＝98.8572％、Ｈ９Ｎ２免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.194‐0.218／1.311‐0.218］）＝102.1％、Ｈ１１Ｎ６免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.204‐0.218／1.311‐0.218］）＝101.2％、ＳＰＦ血清検体１抑制率（％）＝100‐（100×［1.035‐0.137／1.046‐0.137］）＝1.174％、ＳＰＦ血清検体２抑制率（％）＝100‐（100×［1.045‐0.137／1.046‐0.137］）＝0.073％、ＳＰＦ血清検体３抑制率（％）＝100‐（100×［0.993‐0.137／1.046‐0.137］）＝5.798％となり、他の検体についても同様の計算を行った。ＡＩＶ免疫鶏血清７検体は全てほぼ１００％（平均抑制率99.8％、標準偏差0.432）の抑制を示し、ＳＰＦ鶏血清２５検体（平均抑制率1.805％、標準偏差3.655）、野外正常鶏血清４３検体（平均抑制率7.462％、標準偏差3.969）、ダチョウ血清３１１検体（平均抑制率4.833％、標準偏差4.683）においては抑制反応は認められなかった。またＡＧＰ価２〜８である実際のＨ９Ｎ２感染鶏血清５検体はそれぞれ１００％、３４％、１００％、９１％、８０％の抑制率を示した。そこで、陰性検体の抑制率の平均値と標準偏差、また実験感染鶏血清の抑制率から、３０％以上の抑制を陽性とすることとした。
【００６９】
１２．競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界の比較
Ｈ１からＨ１２に対するＡＩＶ免疫鶏血清において、競合ＥＬＩＳＡでは血清希釈約１００倍から５００倍（競合ＥＬＩＳＡ価１００〜５００）まで検出可能であり、ＡＧＰ試験では約１０倍から２５０倍（ＡＧＰ価１０〜２５０）まで検出可能であった（表１）。つまり、競合ＥＬＩＳＡ陽性限界／ＡＧＰ試験陽性限界は約１〜１０倍であった。
【００７０】
【表１】
【００７１】
１３．感染血清の検出
既に山口県中部家畜保健衛生所においてＡＧＰ試験陰性と診断されたＡＩ殺処分対象の鶏血清７５検体における競合ＥＬＩＳＡでは、３０％以上の抑制を示した検体が１検体でその抑制率は４１％、２０〜３０％の抑制を示した検体が１検体でその抑制率は２１％、１５〜２０％の抑制を示した検体が３検体、１０〜１５％の抑制を示した検体が９検体、５〜１０％の抑制を示した検体が２８検体、抑制が５％以下であった検体が３３検体であった（表２）。なお、３０％以上の抑制を示した検体についてA/Duck/Hokkaido/８４/０２（Ｈ５Ｎ３）を用いたＨＩ試験を実施したところ、血清希釈２０倍までＨ５亜型特異的抑制が確認された。
【００７２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明に係る競合ＥＬＩＳＡのCut 0ff値の設定を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ感染検査薬および検査方法に関する。更に詳しく言えば、迅速、高感度、多検体処理が可能な、Ａ型インフルエンザ共通抗原を用いるインフルエンザ感染検査薬および検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
家禽において重要なウイルス性疾病として、トリインフルエンザ（Avian Influenza、以下ＡＩと略称する。）が挙げられ、家畜伝染病予防法において、高病原性トリインフルエンザ（highly pathogenic avian influenza、以下ＨＰＡＩと略称する。）は法定伝染病に、低病原性トリインフルエンザ（low pathogenic avian influenza、以下ＬＰＡＩと略称する。）は届出伝染病に指定されており、これら疾病は家禽産業への脅威である。オルソミクソ科Ａ型インフルエンザウイルス属に属するトリインフルエンザウイルス（以下ＡＩＶと略称する。）は、エンベロープを有し、直径約８０〜１２０ｎｍで、マイナス一本鎖の分節ＲＮＡを持つ。このウイルスは核タンパク質（以下ＮＰと略称する。）とマトリックスタンパク質（以下Ｍと略称する。）によってＡ、Ｂ、Ｃの３種類に抗原的に分けられ、Ｂ型とＣ型のウイルスはヒトにのみ感染する。Ａ型のウイルスだけがヒト、ウマ、ブタ、その他の哺乳類および広範な種類の家禽や野生鳥類に感染する。
【０００３】
インフルエンザウイルス（Influenza virus）が産生する１１種類のウイルスタンパク質は、表面タンパク質、内部タンパク質、それに、ウイルス粒子の内部には含まれない非構造タンパク質の大きく３つに分類できる。ウイルス粒子に含まれる表面タンパク質には赤血球凝集タンパク質（以下ＨＡと略称する。）、ノイラミニダーゼ（以下ＮＡと略称する。）、マトリックス２タンパク質（以下Ｍ２と略称する。）の３種類がある。内部タンパク質にはポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ＮＰ、マトリックス１タンパク質（以下Ｍ１と略称する。）、非構造タンパク質２（非構造という名称がついているが、ウイルス粒子内に取り込まれる：以下ＮＳ２と略称する。）がある。非構造タンパク質１（以下ＮＳ１と略称する。）は、感染細胞の中で大量に産生されるが、ウイルス粒子の中には含まれない唯一のタンパク質である。表面タンパク質であるＨＡとＮＡにより血清型（亜型）がＨＡで１５タイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）、ＮＡで９タイプ（Ｎ１〜Ｎ９）に分類されている。さらに最近ではＨ１３と比較的近縁な新しいＨ１６が報告されている。このＨＡとＮＡのさまざまな組み合わせにより、数多い亜型のインフルエンザウイルスが存在する。ＡＩは病原性によってもＨＰＡＩとＬＰＡＩに分類される。ＨＰＡＩは、鶏を始めとする様々な鳥類に全身性の症状を引き起こす急性の伝染病である。その症状等は多様であるが、致死率が高く伝播力も極めて強いため、発生すると養鶏産業に重大な影響を与える。
【０００４】
従来、ＡＩＶのＨＡおよびＮＡ亜型は、１５種のＨＡと９種のＮＡから作製した抗血清を用い、それぞれ赤血球凝集抑制（hemagglutination inhibition、以下ＨＩと略称する。）試験およびノイラミニダーゼ抑制（neuraminidase inhibition、以下ＮＩと略称する。）試験により決定されてきた。近年、ヒトのインフルエンザにおいては、Ｈ１からＨ３ウイルスおよびＮ１とＮ２ウイルスの血清型の同定に、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcriptase polymerase chain reaction、以下ＲＴ−ＰＣＲと略称する。）が用いられてきている。また、Ｈ１〜Ｈ１５のプライマーを用いたＡＩＶの診断法がLeeら（Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001：非特許文献１）により報告され、日本でも採用されている。ＰＣＲは、Ａ型インフルエンザウイルスの検出において迅速かつ抗血清を必要としない効果的な方法として役立つと言われている。
【０００５】
近年、世界規模でＡＩの発生が相次ぎ、さらに２００４年１月に日本では約７９年ぶりとなるＨＰＡＩの発生が山口県で報告された。その発生に続き同年に大分県、京都府、大阪府でもＨＰＡＩの発生が見られ、これらの血清型はいずれもＨ５Ｎ１であった。さらに２００５年に入っても茨城県でＨ５Ｎ２の発生が見られるなど、ＡＩＶ感染の状況把握および発生があった場合の効果的防除対策のために重要な血清学的診断の必要性が高まっており、ＡＩの的確かつ迅速な診断法を確立することが必要とされている。
【０００６】
ところが、ＡＩＶには１６のＨＡ亜型があり、その血清学的診断には多数の抗血清（１６種類と量）および抗原が必要となるため、診断法が複雑になる。また、現行の診断法には、感度、迅速性、および特異性等で改良すべき点が多い。現在、ＡＩＶ抗体の検出の血清診断技術のために広く用いられているものはゲル内沈降（以下ＡＧＰと略称する。）試験とＨＩ試験である。ＡＧＰ試験は沈降線を形成するために抗原と抗体の両方を多く必要とし、判定に少なくとも２４時間必要とする。ＨＩ試験はＡＧＰ試験より感度が高くより迅速であるが、１６のＨＡ亜型があるため非常に手間がかかり、１検体あたりにかかる費用が高い。
【０００７】
間接ＥＬＩＳＡでは多数の検体を簡便に検査でき、Snyderら（Avian Dis. 29 :136-44. 1985：非特許文献２）によってＡＧＰ試験より感度、特異性が高いことが示されているが、非特異反応が多いとされ、比色定量のため比較的純粋な抗原とそれぞれの試験動物に対する種特異的酵素結合抗体が必要である。競合ＥＬＩＳＡは組換え抗原とモノクローナル抗体（以下ＭＡｂと略称する。）を用いることで、非特異反応を抑え、感度と特異性を高めている。その有用性はZhouら（Avian Dis.42:517-22.1998：非特許文献３）とShaferら（Avian Dis.42:28-34.1998：非特許文献４）によって証明されており、種特異的酵素結合抗体を必要としないため様々な動物種においても診断できる可能性を持っている。
【０００８】
組換えタンパク質を用いたインフルエンザ診断系の有用性はいくつか報告されている。Harmonら（J Med Virol.27:25-30.1989:非特許文献５）は大腸菌によって発現したＮＰを用いてヒトにおけるインフルエンザ抗体の検出を酵素測定法（ＥＩＡ）により行い、発現ＮＰの抗原としての有用性を示した。Voetenら（Journal of Clinical Microbiology. 3257-3531.1998:非特許文献６）は、Ａ型およびＢ型のインフルエンザＮＰを大腸菌で発現させ、それを用いたＥＬＩＳＡにより、ヒトにおけるＡ型およびＢ型インフルエンザ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの抗体推移を調べた。この実験により組換え抗原を用いたＥＬＩＳＡの特異性と迅速性が示されている。
【０００９】
Yewdellら（J Immunol.126:1814-9.1981:非特許文献７）はＭＡｂを用いてインフルエンザ感染細胞からのＮＰとＭの発現をラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡと略称する）、蛍光抗体法、凝集試験等の方法で調べ、ＮＰがＭより多く発現されていること、又はこれらの試験で検出されやすいことを示している。つまり、診断においてより多く産生される、又は検出されやすいと考られるＮＰに対するＭＡｂを用いることはインフルエンザの診断において重要である。さらに、これにより抗ＮＰ ＭＡｂを用いた診断の有用性が示され、Yewdellらによって作製されたＭＡｂはDe Boerら（Arch Virol.115:47-61.1990：非特許文献８）のＮＰ−ＥＬＩＳＡにも用いられ、迅速で様々な動物種に用いることができることが示されている。
【００１０】
バキュロウイルス発現組換えＮＰと抗ＮＰ ＭＡｂを用いた競合ＥＬＩＳＡはZhouら（非特許文献３）とShaferら（非特許文献４）によってその有用性が示されている。Zhouら（非特許文献３）は鶏、七面鳥、エミュー、ダチョウの血清を用い、競合ＥＬＩＳＡ、ＡＧＰ試験、ＨＩ試験の比較を行い、ＡＧＰ試験陰性で競合ＥＬＩＳＡ陽性かつＨＩ陽性検体を検出し、競合ＥＬＩＳＡがＡＧＰ試験より感度と特異性が高く、ＨＩ試験と同等の感度と特異性を持つことを示した。Shaferら（非特許文献４）も同様に、鶏、七面鳥、走鳥類、ウズラ、キジ、ペンギンの血清を用い、競合ＥＬＩＳＡ、ＡＧＰ試験の比較を行い、この２つの検査結果の高い相関と競合ＥＬＩＳＡの高い特異性を示した。Shaferら（非特許文献４）の競合ＥＬＩＳＡでは抗原の精製は行っていない。
【００１１】
【非特許文献１】Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001
【非特許文献２】Avian Dis.29:136-44.1985
【非特許文献３】Avian Dis.42:517-22.1998
【非特許文献４】Avian Dis.42:28-34.1998
【非特許文献５】J Med Virol.27:25-30.1989
【非特許文献６】Journal of Clinical Microbiology.3257-3531.1998
【非特許文献７】J Immunol.126:1814-9.1981
【非特許文献８】Arch Virol.115:47-61.1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らが発現を試みたＡＩＶのＮＰは、ウイルスの生活環を通していくつかの異なった機能を持つ４９８アミノ酸残基からなるタンパク質である。それは主にマイナス一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質として機能し、リボヌクレオプロテイン粒子（以下ＲＮＰｓと略称する。）内の構造タンパク質である。加えて、ＮＰは細胞質と核の間のＲＮＰｓの輸送と転写において重要な役割を担っている。ＮＰ遺伝子は1,565ｂｐで、分節５にコードされている。ＮＰはウイルス間で高く保存されており、鳥亜型の他のＮＰと９５％以上のアミノ酸配列の一致を持っている。さらに、亜型を規定するＨＡやＮＡをコードする遺伝子分節とは異なる分節上に存在するため、ＨＡとＮＡの抗原変異による影響を受けず、Ａ型インフルエンザ共通であるので診断検査に利用される重要なタンパク質である。
【００１３】
特に限定するものではないが、本発明者らは、発現系としてバキュロウイルス−昆虫細胞を用いた。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（以下ＮＰＶと略称する。）に属するAutographa california nuclear polyhedrosis virus（以下ＡｃＮＰＶと略称する。）を用いた。また、バキュロウイルス用トランスファーベクターとしてプラスミドｐＡｃＹＭ１を使用した。このベクターは、ポリヒドリン遺伝子開始コドンであるＡＴＧのＡを含むプラスミドベクター（クローニング位置付近の塩基配列はＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴ Ａ ＣＧＧＡＴＣＣＧであり、下線部は制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位）で最も高い発現効率が得られることで知られる。バキュロウイルス発現系のポイントは、ポリヒドリンと呼ばれる核内封入体構成タンパク質のプロモーターにある。発現させる遺伝子によっても異なるが、ウイルス感染末期では多いもので細胞総タンパク質の約５０％が目的タンパク質であると言われる。この系においては、真核生物である昆虫細胞中でタンパク質の合成が行われるため、大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの下等な真核生物の発現系とは異なり、タンパク質の正しい修飾が期待される。実際、シグナルペプチドの切断、リン酸化、糖鎖および脂肪酸の付加、タンパク質分解酵素による開裂などの修飾が確認されている。
【００１４】
本発明者らは、さらに、ＮＰに対するＭＡｂの作製を試みた。ポリクローナル抗体と比較して、ＭＡｂの利点は以下の３点（１）〜（３）に集約される。
（１）目的分子の抗原決定基に対して、高力価で高特異性を有する抗体が得られること、
（２）抗体産生ハイブリドーマは、他の細胞株と同様に液体窒素保存が可能であり、実験者の必要に応じて抗体の調整が可能であること、
（３）ＭＡｂの精製が容易であることである。
【００１５】
現行の診断法には、感度、迅速性、特異性等の面において改良すべき点が多く、ＡＩＶの診断基準とされているＡＧＰ試験は多検体処理に不向きで多くの抗体および抗原の量を必要とする。つまり、多検体を処理することができ、高感度かつ高特異性の診断系の開発が重要となってくる。さらに、ＡＩＶは様々な哺乳類および鳥類に感染するので、それら様々な動物種でのモニタリングも可能な方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＡＩＶ株間で保存性が高いとされるＡＩＶ ＮＰを、例えば、バキュロウイルスで発現させ、スクリーニング用抗原供給の可能性について鋭意検討し、さらに、ＡＩＶ ＮＰに対するＭＡｂを作製し、ＡＩＶの高感度検出系として競合ＥＬＩＳＡの有用性を鋭意検討し、ＮＰを用いた高感度血清学的診断系の確立を試み、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、下記１〜７に係るインフルエンザ感染検査薬、および下記８〜１４に係るインフルエンザ感染検査方法の発明である。
１． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）抗体検出抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査薬。
２． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）から単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる前記１に記載のインフルエンザ感染検査薬。
３． ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加してＮＰ−Ｈｉｓとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる前記１又は２に記載のインフルエンザ感染検査薬。
４． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる前記１〜３のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
５．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、少なくとも前記（１）の固相化抗原と
（２）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）とからなる前記１〜４のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
６． 固相化抗原がＥＬＩＳＡプレートに固相化されている前記４又は５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
７． ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる前記５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
８． インフルエンザウイルスの核タンパク質を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査方法。
９． インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶから単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる前記８に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１０．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用い、少なくとも前記固相化抗原（１）と
（２）前記核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を用いる前記８又は９に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１１．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させる前記１０に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１２．（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させ、次いで、
（４）前記（３）の抗ＮＰ ＭＡｂのみと反応する酵素標識抗体を加え、次いで、
（５）前記（４）の酵素標識抗体の標識酵素の酵素基質を加えたときの発色を測定する前記１１に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１３． ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる前記１０〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
１４． 抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いる前記９〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いた診断系は高い感度と特異性を示した。中でも、ＭＡｂを用いる競合ＥＬＩＳＡは高い有用性を示した。競合ＥＬＩＳＡによるＡ型インフルエンザ抗体の診断にはいくつかの有利な点がある。競合ＥＬＩＳＡは多検体処理が可能なため時間を節約することができる。組換えタンパク質を用いるためウイルスを用いる必要がない。さらに、ＥＬＩＳＡプレートに抗原を固相化させ、保存しておくことで、検査を容易にし、更なる時間の短縮へとつながる。間接ＥＬＩＳＡのような純度の高い抗原の精製を必要としない。そして、様々な哺乳類および鳥類におけるモニタリングも同様の方法で検査できる可能性を持つ。
【００１９】
感度と特異性が低下しない、抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートの保存は、検査をより容易にし、他の検査機関への供給を容易とするので特に好ましい。本発明では、ＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓについてＨｉｓ−ｔａｇを利用した精製を行った。精製抗原を用いると、ＥＬＩＳＡの非特異反応を効果的に抑えることができる。しかし、精製には多くの時間を必要とし、さらに抗原の量も著しく少なくなる。非精製状態での競合ＥＬＩＳＡでは多検体処理をさらに効率よく行うことができる。本発明に係る診断系は、様々な動物種における血清を用い競合ＥＬＩＳＡを行うことにより幅広く用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ＡＩＶ ＮＰ遺伝子のクローニングは、分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株を鋳型とし、ＲＴＰＣＲ法により各分節の全長を増幅させた。ＮＰ遺伝子特異的プライマーはＮＰのＣ末端にヒスチジンタグを付加するように設計した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ2.1に挿入し、コンピテント細胞へトランスフォーメーションした。
【００２１】
ＡＩＶ ＮＰ遺伝子の発現は特に限定されないが、好ましくはバキュロウイスル発現系により行う。組換えバキュロウイルス作製は、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ ｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１に挿入後、トランスフォーメーションを行い、ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＡｃＹＭ１とＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺとのコトランスフェクションにより組換えウイルスを作製した。このウイルスをプラッククローニングし、これをＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓとした。得られたＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＳｆ９細胞に感染させ、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを発現させた。さらに、ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染細胞から、Ｎｉカラムを用いてＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを精製した。
【００２２】
本発明者らは、発現させたＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の有用性の検討を行った。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いた間接ＥＬＩＳＡでは、ＡＩＶ免疫鶏血清については、実施した血清希釈において用いた野外正常鶏血清より有意に高い値を示し、また用いた全ての野外正常鶏血清において、実施した血清希釈における非特異的陽性反応は認められなかった。さらに、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＡＧＰ試験ではＡＩＶ免疫鶏血清でのみ沈降線を形成し、野外正常鶏血清では非特異的陽性反応は認められなかった。野外ダチョウ血清においては全て陰性であった。なお、これらの結果はＲＮＰ抗原を用いた結果と同じであった。これらの結果より、発現したＮＰは、様々な検査法の抗ＡＩＶ抗体検出用抗原として広く用いることができると考えられる。
【００２３】
抗ＡＩＶ ＮＰ ＭＡｂの作製では、精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いて免疫したマウスからＭＡｂ １１Ｅ５（軽鎖κ、重鎖ＩｇＧ１）が得られた。このＭＡｂ １１Ｅ５を濃縮し、反応性を調べたところ、抗原に精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡにおいて、1.0×１０5倍希釈まで反応した。抗原にＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）と精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたウェスタンブロッティングでは共にいずれの位置にもバンドが確認できなかった。このウェスタンブロッティング陰性であったことには以下のようなことが考えられる。
【００２４】
細胞内でインフルエンザＮＰはオリゴマーとして安定している。さらに、このＮＰオリゴマーは非共有結合により結合していて、ＳＤＳ抵抗性、広い温度範囲と塩類（１Ｍ ＮａＣｌ，１Ｍ ＫＣｌ）や変性剤（８Ｍ 尿素）の存在下でも安定しているが、８０℃以上の加熱とｐＨ５以下でＮＰモノマーに解離する。つまり、抗原調整の段階での１００℃の加熱やＭＥ＋の影響により立体構造が変化した可能性がある。さらに、ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を抗原とした場合に、どの部分にもバンドが確認できなかったことと、ＥＬＩＳＡで高い反応を示した精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓにも全く反応しなかったことから、ＭＡｂ １１Ｅ５に対するＮＰのエピトープが電気泳動又は加熱による影響で変化したのではないかと考えられる。
【００２５】
本発明者らは、ＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓとＭＡｂ １１Ｅ５を用いた競合ＥＬＩＳＡの応用の検討を行った。競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＡＩＶ免疫鶏血清は全てほぼ１００％の抑制を示し、ＳＰＦ鶏血清、野外正常鶏血清、ダチョウ血清においては抑制反応は認められなかった。またＡＧＰ価２〜８である実際のＨ９Ｎ２感染鶏血清５検体はそれぞれ１００％、３４％、１００％、９１％、８０％の抑制率を示した。そこで、陰性検体の抑制率の平均値と標準偏差、また実験感染鶏血清の抑制率から、３０％以上の抑制を陽性とすることにした。
【００２６】
さらに、Ｈ１からＨ１２に対するＡＩＶ免疫鶏血清において、競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界を比較したところ、競合ＥＬＩＳＡ陽性限界／ＡＧＰ試験陽性限界は約１〜１０倍であり、ＡＧＰ試験に比べ競合ＥＬＩＳＡの方がより感度が高いことが判明した。
【００２７】
ＡＧＰ試験と競合ＥＬＩＳＡで判定結果が異なる検体が検出された。既にＡＧＰ試験により陰性と診断されている山口県でＡＩ殺処分対象となった鶏血清７５検体における競合ＥＬＩＳＡの結果では、３０％以上の抑制を示した検体が１検体あり、その抑制率は４１％であった。なお、競合ＥＬＩＳＡで３０％以上の抑制を示した検体ではA/Duck/Hokkaido/８４/０２（Ｈ５Ｎ３）を用いたＨＩ試験で血清希釈２０倍まで検出可能であり、他の検体ではＨ５に非特異的に反応した検体はなかったので、この反応はＨ５亜型特異的であることが確認された。この結果は、競合ＥＬＩＳＡがＡＩＶ感染の血清学的診断法としてＡＧＰ試験の代替法として用いることができることを示している。さらに、ＥＬＩＳＡが数値として客観的に判定できるのに対し、ＡＧＰ試験では判定が主観的なものになってしまい、明瞭な沈降線を形成しない場合に陽性を見落とす可能性がある。
【００２８】
ゲル内沈降（ＡＧＰ）試験に代わる多検体処理が可能で、高感度かつ高特異性の、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）の診断系を開発した。ＡＩＶ株間で保存性が高くＡＩの診断に有用であるとされる核タンパク質（ＮＰ）を発現し、スクリーニング用抗原の供給を可能とし、さらにＮＰに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製とそれを用いた競合ＥＬＩＳＡの有用性を明らかにした。ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）のＮＰ遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加しバキュロウイルスと昆虫細胞を用いてＮＰ−Ｈｉｓとして発現した。抗ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）はＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した。
【００２９】
ＡＩＶ免疫血清と正常血清を用いた発現ＮＰを抗原とした間接ＥＬＩＳＡ、ＡＩＶ免疫血清と正常およびダチョウ血清を用いた発現ＮＰを抗原としたＡＧＰ試験、いずれもＡＩＶ免疫血清を有意に検出し、用いた正常血清には非特異反応は認められず、また、ダチョウ血清は陰性だった。ＡＩＶ免疫血清、実験感染血清、正常およびダチョウ血清を用いた競合ＥＬＩＳＡでは陽性であるＡＩＶ免疫血清と実験感染血清では有意な競合が認められ、正常血清やダチョウ血清では競合は認められなかった。
【００３０】
さらに、ＡＩＶ免疫血清を用いて競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界を比較したところ、競合ＥＬＩＳＡの方が１〜１０倍感度が良いことが示された。そこで、ＡＩ殺処分対象血清７５検体について競合ＥＬＩＳＡを実施したところ、陽性を１検体検出した。この検体を用いた赤血球凝集抑制試験ではＨ５亜型が特異的に抑制された。これらの結果から、発現したＮＰは様々な検査法のＡＩＶ抗体検出抗原として広く用いることができ、競合ＥＬＩＳＡは短時間かつ高感度に抗ＡＩＶ抗体を検出できることから、スクリーニングにとって有用性の高い検査法であることが示された。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何らの制約を受けるものではない。
［材料および方法］
１．被検血清
ＡＩＶ（Ｈ９Ｎ２亜型）実験感染鶏血清は、独立行政法人動物衛生研究所（茨城県つくば市）から分与された。ＡＩ殺処分対象鶏血清８０検体は山口県中部家畜保健衛生所から分与された。ダチョウ血清は山形朝日オーストリッチ産業センター（山形県朝日町）から分与された。野外正常鶏血清は青森ポートリー（青森県八戸市）から分与された。ＳＰＦ鶏血清は、化学及血清療法研究所（熊本県熊本市）から分与された。抗ＡＩＶ免疫鶏血清は作製されたものを用いた。
【００３２】
２．トリインフルエンザウイルス
参照ウイルス株としてＨＡの１〜１２亜型、ＮＡの１〜９亜型を含むウイルスを用いた。これらの株は、北海道大学大学院獣医学研究科微生物学教室喜田宏教授から分与された。ＮＰ抗原作製用には、A/budgerigar/Aichi/１/７７（以下Ａ株と略称する。）を社団法人動物用生物学的製剤協会（東京都）から購入した。ＮＰ遺伝子クローニング用には、分離株A/Duck/Aomori/４７８/０２を用いた。
【００３３】
３．ＡＩＶの精製
Ａ株をリン酸緩衝生理食塩液（0.14Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，1.5ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ7.2：以下ＰＢＳと略称する。）で１０-1、１０-2、１０-3、１０-4に希釈し１０日齢の発育鶏卵（小岩井農場、岩手県雫石町）に接種した。３日後、Ａ株感染漿尿液を回収し、1,100ｘｇ、１０分間、４℃で遠心し上清を回収した。回収した上清を超遠心分離機ＬＥ−８０Ｋ（Beckman、東京都）とＳＷ２８Roter（Beckman）で80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心した。上清は捨て、ペレットを0.08%アジ化ナトリウム（以下ＮａＮ3と略記する。）添加ＰＢＳで再浮遊し３日間、４℃で保存した。ペレットをよく撹拌し30,000ｘｇ、５分間遠心した。上清を回収し、１０％となるようにショ糖を加え、さらに２０〜８０％のショ糖液を密度勾配上に重層し、80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心した。各フラクションを回収しＰＢＳを３０ｍｌ加え、80,000ｘｇ、９０分間、４℃で遠心し、上清を捨てた。ペレットを１ｍｌの0.08％ＮａＮ3添加ＰＢＳで再浮遊し精製A/budgerigar/Aichi/１/７７とした。
【００３４】
４．ＡＧＰ試験方法
１）寒天ゲルの作製
寒天ゲルの作製は、「鶏ウイルス病の診断法」（堀内貞治.鶏ウイルス病の診断法.pp. 595-606.1982.）に従って行った。リン酸緩衝液（0.02Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4，１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ7.4）に8.0％のＮａＣｌ、1.0％のBacto-Agarを混合した。その後、１０％ＮａＮ3を1.0％加えた。シャーレに２５ｍｌの寒天を入れ、寒天が固まってからゲルパンチャー（穴５ｍｍ×７well）で寒天を切り取り、吸引して穴を作り反応用寒天平板とした。
２）ＡＧＰ抗原
発育鶏卵培養精製Ａ株（以下ＲＮＰ抗原と称する。）を用いた。
３）ＡＧＰ試験
寒天ゲルの中央wellにＡＧＰ抗原を、陽性血清として周囲のwell １つおきに抗ＡＩＶ鶏血清を、その間に被検血清をそれぞれ３０μｌ/wellずつ入れ、室温で２日観察した。沈降線が確認された最大血清希釈倍数の逆数をＡＧＰ価とした。
【００３５】
５．ＨＩ試験（β法）
ＨＩ試験は、「ＯＩＥマニュアル」（OIE MANUAL OF DIAGNOSTIC TESTS AND VACCINES FOR TERRESTRIAL ANIMALS. HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA. OIE Terrestrial Manual. CHAPTER2.1.14.2004.）に従って行った。
１）ＨＡ試験
９６well Ｕ型マイクロプレート（９６Ｕ W/OUT LID SH MICROWELL PLATE：Nalge Nunc International, NY, USA）を用い、ウイルス液２５μｌを0.15Ｍ生理食塩水で２倍階段希釈し、さらに生理食塩水２５μｌと等量混合後、0.5％鶏赤血球液５０μｌと等量混合した。室温で１時間静置後、ＨＡの認められた最高希釈倍数の逆数をＨＡ価として判定した。ＨＩ試験（β法）では通常ＨＡ抗原４単位に対する凝集抑制価を標準としているため、ＨＡ判定陽性時の最高希釈ウイルス液を１ＨＡ単位として４ＨＡ単位抗原を決定した（国立予防衛生研究所学友会 .血清反応. pp. 192-201.1982. 改訂二版 ウイルス実験学 各論. 丸善株式会社 東京、前記「ＯＩＥマニュアル」）。
２）ＨＩ試験
被検血清２５μｌを生理食塩水で２倍階段希釈後、４ＨＡ単位抗原２５μｌと等量混合した。室温で１時間感作後、0.5％鶏赤血球液５０μｌと混合し、室温で１時間感作させて判定した。凝集抑制の最高希釈倍数の逆数をＨＩ価とした。
【００３６】
６．遺伝子操作
遺伝子操作は、主として「Molecular cloning」（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory, N. Y.1989.）に従って行った。
【００３７】
７．ＲＴ-ＰＣＲ
１）ＲＮＡ抽出
分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株の感染漿尿液0.25ｍｌにISOGEN-LS（株式会社ニッポンジーン、東京都）0.75ｍｌを加えた。続いて２００μｌクロロホルム（関東化学株式会社，東京都）を加え撹拌し、17,500ｘｇ、１５分間、４℃で遠心し、水層を回収した。さらに、３μｌのEtachinmate（株式会社ニッポンジーン）を加え、５００μｌのイソプロパノール（関東化学株式会社）を加え、転倒混和後、17,500ｘｇ、１０分間、４℃で遠心し上清を捨てた。ペレットに1,000μｌの７０％エタノール（関東化学株式会社）を加え7,700ｘｇ、２分間、４℃遠心した。ペレットを１０μｌのｄｄＨ2Ｏ（ＤＥＰＣ（関東化学株式会社）処理Ｈ2Ｏ）で再浮遊し、これをＲＮＡ抽出液とした。
【００３８】
２）プライマーの設計
以降のサブクローニングを考慮して、ＡＩＶ ＮＰ オープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦと略記する。）の両端に本来の遺伝子中には存在しない制限酵素ＢａｍＨＩ部位を、また得られるタンパク質の精製を考慮して３’末端側にはヒスチジンタグ（以下Ｈｉｓ−ｔａｇと記す。）配列を付加するよう設計した。ＡＩＶ ＮＰ遺伝子配列を参考に、ＡＩＶ ＮＰ遺伝子のＯＲＦに対し、フォワードプライマーとしてＡＩＶ ＮＰＦ：５’−ｇｇｇａｔｃｃａｃａｔｃＡＴＧｇｃｇｔｃｔｃａａｇ−３’、リバースプライマーとしてＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ：５’−ｃｇｇａｔｃＣＴＡａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｔｇｔｃａｔａｃｔｃｃｔｃｔｇｃａｔｔｇ−３’を設計した。なお、開始コドン、および終止コドンは大文字で、ＢａｍＨＩ部位（Ｇ：ＧＡＴＣＣ）を下線で示した。“ａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇ”はＨｉｓ−ｔａｇ配列部位である。
【００３９】
３）ＲＴ−ＰＣＲ
抽出したＲＮＡを鋳型として、ＡＩ特異的プライマーであるＵｎｉ１２（Hoffmannら, Arch Virol. 146:2275-2289.2001.）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより相補的ＤＮＡ（complementary ＤＮＡ：以下ｃＤＮＡと略記する。）を増幅した。GeneAmp RCA PCR core Kit（Perkin Elmer社、千葉県浦安市）を用いて、４２℃×６０分間、９９℃×５分間、３０℃×１分間の逆転写酵素反応を行った。続いて、遺伝子の増幅にはPCR Core Kit（Perkin-Elmer,MA,USA）を用いた。ＮＰ特異的プライマーを用い、変性を９４℃、プライマーのアニーリング温度を５８℃、ｃＤＮＡ合成を７２℃とし、Step１（９４℃×４分間）を１サイクル、Step２（９４℃×２０秒間、５８℃×３０秒間、７２℃×７分間）を３０サイクル、Step３（７２℃×７分間）を１サイクル行った（Journal of Virological Methods. 97:13-22.2001）。
【００４０】
８．アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動には、ＴＢＥ緩衝液（0.1M Tris, 2mM EDTA,85mM Boric acid）にSeaKem GTG Agarose（宝酒造株式会社、京都府）を加え、加熱溶解後エチジウムブロマイド（以下ＥｔＢｒと略称する。）を最終濃度がそれぞれ１％、１０ｎｇ／ｍｌになるように加え、室温にてゲル化し作製した。試料を１００Ｖの定電圧で３０分から１時間泳動し、紫外線照射により核酸を検出した。ＤＮＡの長さは１００ｂｐ DNA Ladder（宝酒造株式会社）と比較して推定した。
【００４１】
９．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子のクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ法で増幅させたＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子をTA Cloning Kit（Invitrogen, CA, USA）を用いて、プラスミドベクターであるｐＣＲ2.1にライゲーションさせた。これをHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社、京都）に形質導入させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、0.12％Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：宝酒造株式会社）添加ＴＹＭ寒天培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract,0.1％glucose,10mM MgSO4・7H2O，1.5％bacto agar）上で３７℃において一晩培養した。β−ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを代謝し、青色の色素を生成するが、ＡＩＶ ＮＰ Ｈis遺伝子がベクターのＬａｃＺ領域に挿入された場合、β−ガラクトシダーゼが産生させず、白色のコロニーが認められる。このWhite-Blue Selectionを利用して、白色コロニーを選択し、一晩、ＴＹＭ液体培地（２％bacto-tryptone, 0.5％yeast extract,0.1％glucose,10mM MgSO4・7H2O）中で培養し、ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＣＲ2.1を得た。これからプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子挿入の確認を行った。抽出後ＢａｍＨＩ消化されたプラスミド遺伝子とプライマー（ＡＩＶ ＮＰＦおよびＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ）を用いてDideoxy Terminator法（Sangerら, J.Mol.Biol. 94:41.1975.）によりシーケンス反応を行った。反応には標識蛍光ジデオキシヌクレオチド（以下ｄｄＮＴＰと略称する。）を用いたDye Terminator Cycle Sequencing Kit FS（Perkin-Elmer）を使用した。９６℃×４５秒間、５０℃×３０秒間、６０℃４分間の反応を２５サイクル行い、スピンカラムによる精製後、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（Perkin-Elmer）により塩基配列を決定した。
【００４２】
１０．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓのバキュロウイルスでの発現
１）トランスファーベクターの作製
クローニングで得られたｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＣＲ2.1をＢａｍＨＩ（宝酒造株式会社、京都）で消化後、アガロースゲル電気泳動で展開し、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子フラグメントをゲルごと切り出した。フェノール処理後エタノール沈殿によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子を精製した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩで消化したバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（Matsuuraら, J. Gen. Virol. 68:1233-1250.1987.）にTakara DNA Ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いてライゲーションし、次いでHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させた。これを５０μｇ/ｍｌアンピシリン添加ＴＹＭ寒天培地上で一晩培養した。出現コロニーから５０μｇ/ｍｌアンピシリン添加ＴＹＭ液体培地にて大量培養しｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１を得た。プラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ消化後アガロースゲル電気泳動によりＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子の挿入を確認した。ここでｐＡｃＹＭ１のポリヒドリンプロモーターに対しＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子が正方向に挿入されていることを確認するため、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするＰＣＲ法を行った。プライマーとしてｐＡｃＹＭ１のポリヒドリンプロモーターとクローニングサイトの間に認識部位があるＢａｃ１Ｎプライマー（５’−ｔｇａｔａａｃｃａｔｃｔｃｇｃａａａ−３’）およびＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子３’末端に相補的なＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓプライマーを用いた。この方法では、ポリヒドリンプロモーターに対し正方向に挿入された場合にのみ約1,500ｂｐのバンドの位置に増幅が認められる。
【００４３】
２）バキュロウイルスおよび宿主細胞
バキュロウイルス野外株としてＡｃＮＰＶを用い、組換えウイルス作製親株にはＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ（Kittsら, Nucleic Acid Res. 18:5667-5672.1990.）を使用した。バキュロウイルスの宿主細胞としては、ヨトウガの一種Spodoptera frugiperdaの卵巣から樹立されたＩＰＬＢ−Ｓｆ２１ＡＥ（以下Ｓｆ２１細胞と略称する。）あるいはＳｆ２１細胞からクローニングされたＳｆ９細胞を用いた。Ｓｆ２１細胞は、ＴＣ−１００昆虫培地（Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA）、以下ＴＣ１００（０％）と略称、にウシ胎児血清（Fetal Calf Serum：以下ＦＣＳと略称する。）を１０％加えたＴＣ１００（１０％）で維持し、クローニングに使用した。Ｓｆ９細胞は、ＥＳＦ９２１培地（Expression System LLC,Woodland,CA,USA:以下ESF９２１と略称する。）を用い、スピンカルチャー法により２８℃条件で維持培養し、高力価ウイルス作製、大量発現に使用した。バキュロウイルスおよびＳｆ２１細胞は、NERC Institute of Virology（Oxford,UK）から分与され、Ｓｆ９細胞はExpression Systems LLC（Woodland,CA,USA）から購入した。
【００４４】
３）組換えバキュロウイルスの作製
ｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ-ｐＡｃＹＭ１（１０μｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｅｃｏ８１Ｉで消化し直鎖状にしたＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）１μｌにＴＣ１００（０％）を６μｌ加えた混合液（ＤＮＡ混合液）と、ＴＣ１００（０％ＦＣＳ）培地８μｌ、リポフェクチン（GIBCO BRL）８μｌとの混合液（リポフェクチン混合液）をそれぞれ室温で３０分間反応させた。次にＤＮＡ混合液とリポフェクチン混合液とを混合し室温で１５分間反応させた後、Ｓｆ２１細胞にトランスフェクトし相同組換えにより組換えウイルスを作製した。２８℃で３日間培養後、培養液を回収しＳｆ２１細胞でプラッククローニングを行った。接種３日後にニュートラルレッド３００μｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ（宝酒造株式会社）７５μｇ／ｍｌを用いてプラックを染色した。接種４日後、光学顕微鏡下で青色の色素の認められないプラックを組換えウイルスの形成したプラックとみなし、同プラックをパスツールピペットを用いてＴＣ１００（１０％）培地に回収し、プラッククローニングとした。この操作を３回繰り返し白色プラックのみを形成する組換えバキュロウイルスを獲得し、これをＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓと命名した。このＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＳｆ２１細胞で数継代し、シードウイルスとした。
【００４５】
４）タンパク質発現の確認
ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓを単層培養したＳｆ９細胞（1.5×１０6Cells）に感染の多重性（Multiplicity of infection：以下ＭＯＩと略称する。）を約５ Plaque Forming Unites（以下ＰＦＵと略称する。）／cellで接種し、ＥＳＦ９２１培地を用いて２８℃で培養し、接種１、２、３、４、５日後に細胞および上清を回収した。また、ＡｃＮＰＶあるいはネガティブコントロールとして培養液（以下Mockと略称する。）を同様に接種し、５日後に細胞と上清を回収した。細胞については、昆虫細胞用リン酸緩衝生理食塩水（0.14M NaCl,26.82mM KCl,8mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4,pH7.4:以下PBS-Acと略記する。）で洗浄後、Laemmli（Laemmli, U. K. Nature. 277:680-685.1970.）の４×サンプルバッファー（62.5ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ6.8， ２％ＳＤＳ，１０％Glycerol， 0.02％ Bromophenol blue， ５％ ２-メルカプトエタノール；以下、２Ｍｅ＋Ｂｕｆｆｅｒと略記する。）に再浮遊させた。また、培養上清については２Ｍｅ＋Ｂｕｆｆｅｒと３：１の割合で混合した。各試料を１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳを含む12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により展開した。泳動後、クマシーブリリアントブルー染色液（４５％Methanol,１０％Acetic acid,0.025％Coomassie brilliant blue）で染色（以下ＣＢＢ染色と略記する。）、もしくはウエスタンブロッディングにより解析した。
【００４６】
５）ウェスタンブロッティング解析
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ終了後、ゲルを転写緩衝液（0.02M Tris, 0.15M Glycine, 0.01%SDS,5% Methanol）で洗浄し、ウェスタンブロッティング装置ホライズブロット（アトー株式会社、東京都）を用いて、ニトロセルロース膜Hybond C Extra（Amersham, Amersham, UK）に１００ｍＡで1.5時間転写した。転写後、ニトロセルロース膜未結合部分をブロック液（１％Skim Milk Powder, 0.1％ Tween-20をPBSで溶解）でブロッキングした。ついで一次抗体として抗ポリヒスチジンマウス血清（SIGMA, St.Lois, MO, USA:以下αpolyHisと略称する。）を用い、室温で３時間反応させた。反応後、ブロック液で３回洗浄し、二次抗体を３７℃で２時間反応させた。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA）を希釈して用いた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、BM blue POD substrate（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）用いて発色させた。
【００４７】
１１．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの大量発現および精製
1.5×１０6cells/ｍｌに調整したＳｆ９細胞にＡｃＡＩ ＮＰ ＨｉｓをＭＯＩ ５ ＰＦＵ／cellで接種した。接種後２４時間ごとに培養液の一部を採取して等量のトリパンブルー液と混合後、生細胞と死細胞の数をカウントした。生細胞数が5.0×１０5 cells／ｍｌを下回った時点で７００ｘｇ、１５分間遠心により細胞を沈殿させペレットを回収した。このペレットをXpress System Protein Purification Kit (Invitrogen)を用い、キット説明書に従い、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを精製した。すなわち、培養細胞５０ｍｌ分のペレットを１０ｍｌのNative Binding Bufferで再浮遊し、氷上でHandy Sonic model UR-20P（TOMY，東京都）を用い超音波による細胞の破壊を行った。続いて４℃、15,000ｘｇで２０分間遠心し、上清を回収し、２Ｍ ＮａＯＨによりｐＨを7.6〜7.8に調整した。ニッケルキレートカラムをＤＷ2で洗浄し、Native Binding Bufferで平衡後、回収したＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを含む上清をニッケルキレートカラムに入れ1時間振盪させることでＨｉｓ−ｔａｇを付加された発現タンパク質を吸着させた。吸着後のカラムをWash Bufferで洗浄し、５０、５００、1,000ｍＭの各濃度に調整したＩｍｉｄａｚｏｌｅを用いて１ｍｌずつの分画にし、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加タンパク質を溶出させた。これを12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＣＢＢ染色による確認後、タンパク質が確認された分画をＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（Amersham Pharmacia Biotech、東京都）を通して脱塩した。これを同様に12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＣＢＢ染色およびウェスタンブロッティングによる確認後、無菌濾過し、精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓとした。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓのタンパク質含有量はMicro BCA Protein Assay Reagent Kit（PIERCE,Rockford, IN, USA）を用いて測定した。
【００４８】
１２．ＮＰ抗原を用いた間接ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、Kidaら（Kidaら, Virology. 122:38-47.1982.）の方法に従い実施した。精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ（９０μｇ／ｍｌ）を抗原としてＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト株式会社、東京都）に５０μｌ／wellで播き、室温で２時間もしくは４℃で２４時間静置した。抗原を回収し、抗原がコートされていないwell部分への非特異反応を防止するため、ＢＳＡ１０（Bovine serum albmin fraction Ｖ （ナカライテスク株式会社、京都府）１０ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに添加、ｐＨ7.2）を１００μｌずつ添加し、室温、１時間もしくは４℃、２４時間静置後、ＰＢＳＴ（0.05％Tween２０添加ＰＢＳ，ｐＨ7.4）で３回洗浄した。ＢＳＡ５Ｔ（ＢＳＡ fraction Ｖを５ｍｇ／ｍｌになるようＰＢＳＴに添加）で４０、１６０、６４０、２，５６０倍に希釈した被検血清を５０μｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで４回洗浄後、ＢＳＡ５Ｔで１，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗鶏ＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International，Inc. CA, USA）を５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応後、発色剤（ｐＨ4.0,0.05Ｍ Citric buffer,0.013％過酸化水素，２％ ４０ｍＭ ＡＢＴＳ）を１００μｌずつ添加し、暗室、室温で１５分後と３０分後にＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社、東京都）により４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
１３．ＮＰ抗原を用いたＡＧＰ試験
ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染昆虫細胞をDisruption buffer（0.05M Tris-HCl,0.5％ TritonX100,0.6M KCl）処理して抗原とし、ＡＧＰ試験に従い行った。
【００５０】
１４．モノクローナル抗体の作製
１）供試マウス
６週齢ＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス（日本クレア株式会社、東京都）１匹を用いた。
２）免疫抗原
モノクローナル抗体作製のための免疫源は、精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いた。精製ウイルスを最終濃度0.05％のホルマリンで不活化し、４℃で保存した。アジュバントにはフロイントコンプリートアジュバント（SIGMA）用い、ＰＢＳで４倍に希釈した精製ウイルスと等量混合し乳剤を作製した。作製した免疫源はマウスの腹腔内に２００μｌ／headで接種した。同様に処理した乳剤を同様の方法で初回免疫から２週毎に複数回追加免疫を行い、最終追加免疫３日後にマウスを解剖した。
【００５１】
３）ハイブリドーマの作製
マウスミエローマ細胞（J Immunol Methods. 35(1-2):1-21.1980:以下ＦＯ細胞と略称する。）を、ＲＰＭＩ １６４０培地（ニッスイ、東京都）に１０％ＦＣＳを添加した培地（以下１０％ＲＰＭＩ １６４０と略称する。）で、３７℃、５％ＣＯ2で静置培養した。細胞培養ルーからＦＯ細胞をはがし、１００ｘｇで８分間遠心することにより細胞を集め、１０％ＲＰＭＩ １６４０で再浮遊し２．０×１０7cell／ｍｌに調整し、融合に供した。最終免疫から３日後、マウスをエーテル麻酔下で心臓採血により安楽殺した後、その血液を３７℃、５％ＣＯ2で１時間、さらに４℃で２４時間静置した。２４時間後に血清を分離し、−２０℃で保存した。安楽殺処置後のマウス脾臓を摘出し、ディスポーザブル注射器の内筒を用い、金属メッシュ上で脾臓を圧片することにより脾臓細胞を分離した。脾臓細胞に１０％ＲＰＭＩ １６４０を加え、脾臓細胞洗浄を１００ｘｇ、８分間、２回行った。洗浄した脾臓細胞を１０％ＲＰＭＩ １６４０で1.0×１０8 cell／ｍｌに調節した。
【００５２】
４）マウスリンフォカインの作製
ハイブリドーマを増殖活性化させるため、マウスリンフォカインを作製した（KANE, M. M. and BANKS, J. N. Immunoassay Making and manipulating hybridoma cells. 5.1 Facilities and media Protocol. 11 37-40.）。抗原未接種のＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽殺後、先述と同様な方法で脾臓を分離し、分離した脾臓細胞を2.5μｌ／ｍｌ lipopolysaccharide endotoxin（SIGMA：以下ＬＰＳと略称する。）含有１０％ＲＰＭＩ １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2、４日間培養した。３９０ｘｇ、５分間で遠心後、上清を回収し、２６ｍｍ Syringe Filter 0.22μｌ（Corning Incorporated Corning,NY 14831,Germany）を用い濾過滅菌後、セラムチューブ（Greiner bio-one、Frickenhausen１,Germany）に分注し−２０℃で保存した。使用時はＨＴ培地（SIGMA）で２０倍希釈し１００μｌ／wellで用いた。
【００５３】
５）細胞融合と選択
免疫マウスの脾臓細胞を1.0×１０8cell、ＦＯ細胞を２×１０7cellに調整し、脾臓細胞：ＦＯ細胞＝５：１で混合した。１００ｘｇ、８分間遠心後、培養液を除去し、ポリエチレングリコール４０００（関東化学株式会社、埼玉：以下ＰＥＧと略称する。）溶液（8.75μＭ ＰＥＧ，１５％ジメチルスルフォキシド添加ＲＰＭＩ １６４０）0.2ｍｌを徐々に滴下しながら融合し、ハイブリドーマを作製した。
融合にあたりＨＡＴ培地（SIGMA）で細胞濃度を１０6cell／ｍｌに調整し、９６wellプレート（９６Wells w/Lid、Flat Bottom:Greiner）に１００μｌ／wellで播き、ハイブリドーマを選択した。得られたハイブリドーマに対し、北海道大学大学院獣医学研究科微生物学教室喜田宏教授から分与されたＡＩＶ抗原（A/Aichi/２/６８）と粗精製ＡＩＶ ＮＰを抗原としたＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＮＰ抗体産生ハイブリドーマを、５％リンフォカインを添加したＨＴ培地を用い限界希釈法により２回クローニングを行った。クローニング後、アイソタイプを調べ、大量培養した。
【００５４】
１５．モノクローナル抗体の確認
１）抗ＡＩＶ ＮＰ抗体検出用ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、抗原として粗精製ＡＩＶ ＮＰを、１次抗体にハイブリドーマ培養上清を、２次抗体にペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International、Inc. CA, USA）を用いて行った。
２）ウェスタンブロッティング解析
抗原としてＰＢＳ（ｐＨ7.2）で１００倍希釈した精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）と精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用い、12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とウェスタンブロッティングを行った。１次抗体として、ＭＡｂ産生ハイブリドーマ培養上清を用い、２次抗体には、ブロック液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（Transduction Laboratories,Lexington, KY, USA）を用いた。
【００５５】
１６．アイソタイプの決定
アイソタイプの決定は、Immuno pure Monoclonal Antibody Isotype kit Ｉ（PIERCE）を用い、製品マニュアルに基づいて行った。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（SUMILON）にキット附属の coating antibody solutionを ５０μｌずつ固相化後、室温で２時間もしくは４℃で２４時間静置した。溶液を取り除き１２５μｌのblocking solutionを加え３７℃で１時間静置した。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、ＭＡｂを含むハイブリドーマ培養上清と陽性対照を５０μｌずつ添加後、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、抗マウス特異的アイソタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ，ＩｇＡ，κ，λ）ウサギ血清と陰性対照として正常ウサギ血清を滴下した。陽性対照には抗マウスＩｇＧを滴下し、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清を５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。１２５μｌのwash bufferで４回洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ substrate solutionを加え、室温で３０分間反応させ、ＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社、東京都）により４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５６】
１７．ＭＡｂの精製および濃縮
クローニングを終了したＭＡｂ産生ハイブリドーマを大量培養フラット（INTEGRA CellLineCL 1000）（IBS INTEGRA BIOSCIENCES, INTEGRA Biosciences AG,Switzerland）を用い培養した。細胞数が約２×１０7〜４×１０7cell／ｍｌの時期に、継代し、培養上清を回収した。大量培養フラット（INTEGRA CellLineCL1000）から回収したＭＡｂ産生ハイブリドーマ培養上清から、Montage（商標） life science kits（MILLIPORE.com, MA, USA）を用いＭＡｂの精製を行った。前処理としてキット附属の0.22ｍｍマイクレス−ＧＰで産生ハイブリドーマ培養上清中の塵埃を除去した。Binding bufferを用いてPROSEP-A media plugを平衡状態にし、上清を１５０ｘｇ、２０分間遠心することでＭＡｂをPROSEP-A media plugに吸着させた。続いて、Binding bufferで５００ｘｇ、２分間の遠心を２回行いPROSEP-A media plugへの非結合タンパク質を洗浄および除去した。Elution bufferで５００ｘｇ、５分間遠心し、溶出液でPROSEP-A media plugからＭＡｂを溶出した。得られたＭＡｂに対し、Amicon Ultra 15 centrifugal Filter 30K NMWLで脱塩と濃縮を行った。そして、等量のグリセロールを添加後−２０℃で保存した。
【００５７】
１８．競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡはZhouら（Zhouら, Avian Dis. 42:757-761.1998.;Zhouら,Avian Dis. 42 : 517-22. 1998）とShaferら（Shaferら,Avian Dis.42:28-34.1998）の方法に従って行った。抗原としてＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ（５０μｌ／well）をＥＬＩＳＡ用９６wellプレート（SUMILON）に２時間、室温又は４℃、２４時間シートさせた。抗原を回収したのち、wellをＢＳＡ１０ １００μｌ／wellによって２時間、室温又は４℃、２４時間ブロッキングした。WellをＰＢＳＴによって３回洗浄した。希釈した供試血清とブランクとコントロールとしてＢＳＡ５Ｔをそれぞれ５０μｌ／well添加し、３７℃、２０分間反応させた。血清を除去することなしに、ＰＢＳで20,000倍希釈されたＭＡｂをブランクwellを除き５０μｌ／well、ブランクwellにはＢＳＡ５Ｔをそれぞれ５０μｌ／well添加し、３７℃、１時間反応させた。WellをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＢＳＡ５Ｔで1,000倍希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清（CHEMICON International）を５０μｌ／well添加し、３７℃、１時間反応させた。WellをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μｌ／wellの発色剤（ｐＨ4.0，0.05Ｍ Citric buffer，0.013％過酸化水素，２％ ４０ｍＭ ＡＢＴＳ）を添加し、３７℃、３０分間反応させた。３０分後、ＥＬＩＳＡ plate reader（三光純薬株式会社）を用い４０５ｎｍ（ＯＤ405）で測定した。コントロール（ＭＡｂのみ）と比較したサンプル血清の抑制率は、正しい値を得るためにブランク値の平均を引いた後に算出され、それは全ての供試血清値とコントロールの値から引かれた。その公式は、１００−（１００×［供試血清値−ブランク値（ＢＳＡ５Ｔ）／コントロール値（ＭＡｂのみ）−ブランク値（ＢＳＡ５Ｔ）］）である。抑制率３０％以上を陽性とした。さらに、３０％以上の抑制を示した最大血清希釈倍数の逆数を競合ＥＬＩＳＡ価とした。
【００５８】
［結果］
１．ＡＩＶ ＮＰＨｉｓ遺伝子の作製
分離A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）株の感染漿尿液からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として、ＡＩ特異的プライマーであるUni１２を用いたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。そのｃＤＮＡに対し、ＮＰ特異的プライマーであるＡＩＶ ＮＰＦとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓを設計し、これらを用いてＰＣＲを行ったところ、ＮＰの全長と考えられる約1,500塩基対の増幅を確認した。
得られたＰＣＲ産物をTA Cloning Kitを用いてｐＣＲ2.1にライゲーションし、コンピテント細胞である大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。White-Blue Selectionを利用して目的遺伝子の挿入されているホワイトコロニーを選択し、増菌培養を行った。得られた大腸菌からプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ladder（宝酒造株式会社）と比較したところ、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子と推定される約1,500ｂｐとベクターと推定される約3,900ｂｐの２本のバンドが認められた。さらに、プライマー（ＡＩＶ ＮＰＦとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓ）を用いたＰＣＲにより、５’末端および３’末端から約５００残基の塩基配列の一致を確認した。全長ＮＰの配列決定は行っていない。
【００５９】
２．トランスファーベクターの構築
ＡＩＶＮＰ Ｈｉｓ−ｐＣＲ2.1をＢａｍＨＩで消化し、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを含む断片をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１にTakara DNA Ligation Kitを用いてライゲーションした。さらにコンピテントセルにトランスフォーメーションし、大腸菌からプラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドをＢａｍＨＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１，５００ｂｐの挿入遺伝子と約10,000ｂｐのｐＡｃＹＭ１ベクターのＤＮＡが確認された。この約1,500ｂｐのバンドが認められたプラスミドについて、ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ遺伝子が、ポリヒドリンプロモーターに対して正方向に挿入されていることを確認するために、Ｂａｃ１ＮプライマーとＡＩＶ ＮＰＲ Ｈｉｓを用いてＰＣＲを行い、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。約1,500ｂｐのバンドの増幅が正方向に挿入されたことを示し、1,500ｂｐの増幅が認められたうちの一つのプラスミドをｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１とし、以下の発現実験に用いた。
【００６０】
３．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ発現組換えバキュロウイルスの作製
プラスミドｐＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓ−ｐＡｃＹＭ１とＡｃＲＰ２３-ＬａｃＺ ＤＮＡをコトランスフェクションし、培養上清を、Ｘ−ｇａｌ存在下でプラッククローニングを行った。White-Blue Selection により白色を示したプラックを３回プラッククローニングし、Ｓｆ２１細胞で数継代後、高力価ウイルスを得、シードウイルスとした。プラックアッセイの結果、このシードウイルスの力価は2.0×１０8ＰＦＵ／ｍｌであった。これを組換えバキュロウイルスＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓとした。
【００６１】
４．組換えＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの発現の確認
得られたＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓを1.5×１０6cell／ｍｌ ３００ｍｌのＳｆ９細胞にＭＯＩを５ＰＦＵ／cellで接種し、5.0×１０5cell／ｍｌを下回った時点で回収した。αpolyHisを用いたウェスタンブロッティングでは、ＡｃＡＩ ＮＰ Ｈｉｓ感染細胞で約５６ｋＤａのバンドが認められ、ＡｃＮＰＶ感染細胞およびＭｏｃｋでは特異的バンドは認められなかった。
【００６２】
５．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓの大量培養および精製
大量培養し、Ｎｉカラムを用いて精製を行った。Ｎｉカラムに吸着させたＡＩＶ ＮＰ ＨｉｓをImidazoleで溶出後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開しＣＢＢ染色で確認した。５００ｍＭで溶出させた際、約５６ｋＤａのバンドが認められた分画についてプールし、ＰＤ１０カラムを通して脱塩し、同様にＣＢＢ染色およびウェスタンブロッティングを行った。ここで約５６ｋＤａのバンドが認められた分画を再度プールし、0.45μｍフィルターでろ過し、精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓとした。タンパク定量の結果、１００ｍｌのＳｆ９細胞培養ペレットから９０μｇ／ｍｌ、総タンパク量２７０μｇの精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓが得られた。
【００６３】
６．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡ
ＡＩＶ免疫鶏血清１２検体については、実施した血清希釈４０倍、１６０倍、６４０倍、２５６０倍において、用いた野外正常鶏血清１０検体より有意に高い値を示した。また、用いた全ての野外正常鶏血清において、実施した血清希釈における非特異的陽性反応は認められなかった。なお、陽性域は野外正常鶏血清の平均値と標準偏差から算出し、野外正常鶏血清における値に、その標準偏差の３倍を加えた値以上の反応を陽性とした。
【００６４】
７．ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＡＧＰ試験
ＡＩＶ免疫鶏血清１２検体でのみ沈降線を確認することができ、野外鶏血清１６４検体では非特異的陽性反応は認められなかった。野外ダチョウ血清４４８検体では全て陰性であった。これらの結果はＲＮＰ抗原を用いた試験結果と同様であった。
【００６５】
８．抗ＡＩＶ ＮＰ ＭＡｂの作製と同定
精製ＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を用いて免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞から１０種類のＭＡｂ産生ハイブリドーマが得られた。そのうち培養上清がＡＩＶ ＮＰ抗原に反応する８種類はＮＰに反応するＭＡｂを産生するハイブリドーマとみなし、ＡＩＶ抗原（A/Aichi/２/６８）には反応するがＡＩＶ ＮＰ抗原には反応しない２種類は他のタンパク質に反応するＭＡｂを産生するハイブリドーマであるとみなした。なお、これらＭＡｂのアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＭであった。目的とするＮＰと反応するＩｇＧは１１Ｅ５と６Ｅ１０に確認され、６Ｅ１０については限界希釈法を用いて５回クローニングを行ったが、軽鎖κ、重鎖ＩｇＭおよびＩｇＧ２ａの２種類のＭＡｂ産生ハイブリドーマが混在していた。これ以上の分離は時間的に困難と考え、細胞を液体窒素で凍結保存した。１１Ｅ５については軽鎖κ、重鎖ＩｇＧ１であった。
【００６６】
９．ＭＡｂ １１Ｅ５の大量培養と精製および濃縮
クローニングが終了したＭＡｂ産生ハイブリドーマ１１Ｅ５をINTEGRA CellLineCL 1000によって大量培養し、３０ｍｌの培養上清を得た。さらに、Montage（商標） life science kits（MILLIPORE.com, MA, USA）を用い培養上清を精製した結果、４００μｌの濃縮されたＭＡｂ １１Ｅ５が得られた。
【００６７】
１０．ＭＡｂ １１Ｅ５の反応性
抗原に精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡにおいて、濃縮前ＭＡｂ １１Ｅ５では1.0×１０3倍希釈、濃縮後ＭＡｂ １１Ｅ５では1.0×１０5倍希釈まで反応した。抗原としてＡＩＶ A/budgerigar/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）あるいは精製ＡＩＶ ＮＰ Ｈｉｓを抗原としたウェスタンブロッティング解析ではともにいずれの位置にもバンドが確認できなかった。つまり、ウェスタンブロッティング解析には反応しなかった。
【００６８】
１１．ＭＡｂ １１Ｅ５を用いた競合ＥＬＩＳＡ
供試血清について、ＡＩＶ免疫鶏血清は１００倍希釈、その他の血清は５倍希釈でＥＬＩＳＡに用いた。ＡＩＶ免疫鶏血清を用いた試験ではブランク平均値が0.218、コントロール平均値が1.311、Ｈ４Ｎ５免疫血清値が0.201、Ｈ５Ｎ３免疫血清値が0.23、Ｈ９Ｎ２免疫血清値が0.194、Ｈ１１Ｎ６免疫血清値が0.204であった。ＳＰＦ鶏血清ではブランク平均値が0.137、コントロール平均値が1.046、検体１が1.035、検体２が1.045、検体３が0.993であった。これらを既に示した公式にあてはめ抑制率を計算すると、
Ｈ４Ｎ５免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.201‐0.218／1.311‐0.218］）＝101.5％、Ｈ５Ｎ３免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.23‐0.218／1.311‐0.218］）＝98.8572％、Ｈ９Ｎ２免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.194‐0.218／1.311‐0.218］）＝102.1％、Ｈ１１Ｎ６免疫血清抑制率（％）＝100‐（100×［0.204‐0.218／1.311‐0.218］）＝101.2％、ＳＰＦ血清検体１抑制率（％）＝100‐（100×［1.035‐0.137／1.046‐0.137］）＝1.174％、ＳＰＦ血清検体２抑制率（％）＝100‐（100×［1.045‐0.137／1.046‐0.137］）＝0.073％、ＳＰＦ血清検体３抑制率（％）＝100‐（100×［0.993‐0.137／1.046‐0.137］）＝5.798％となり、他の検体についても同様の計算を行った。ＡＩＶ免疫鶏血清７検体は全てほぼ１００％（平均抑制率99.8％、標準偏差0.432）の抑制を示し、ＳＰＦ鶏血清２５検体（平均抑制率1.805％、標準偏差3.655）、野外正常鶏血清４３検体（平均抑制率7.462％、標準偏差3.969）、ダチョウ血清３１１検体（平均抑制率4.833％、標準偏差4.683）においては抑制反応は認められなかった。またＡＧＰ価２〜８である実際のＨ９Ｎ２感染鶏血清５検体はそれぞれ１００％、３４％、１００％、９１％、８０％の抑制率を示した。そこで、陰性検体の抑制率の平均値と標準偏差、また実験感染鶏血清の抑制率から、３０％以上の抑制を陽性とすることとした。
【００６９】
１２．競合ＥＬＩＳＡとＡＧＰ試験の陽性限界の比較
Ｈ１からＨ１２に対するＡＩＶ免疫鶏血清において、競合ＥＬＩＳＡでは血清希釈約１００倍から５００倍（競合ＥＬＩＳＡ価１００〜５００）まで検出可能であり、ＡＧＰ試験では約１０倍から２５０倍（ＡＧＰ価１０〜２５０）まで検出可能であった（表１）。つまり、競合ＥＬＩＳＡ陽性限界／ＡＧＰ試験陽性限界は約１〜１０倍であった。
【００７０】
【表１】
【００７１】
１３．感染血清の検出
既に山口県中部家畜保健衛生所においてＡＧＰ試験陰性と診断されたＡＩ殺処分対象の鶏血清７５検体における競合ＥＬＩＳＡでは、３０％以上の抑制を示した検体が１検体でその抑制率は４１％、２０〜３０％の抑制を示した検体が１検体でその抑制率は２１％、１５〜２０％の抑制を示した検体が３検体、１０〜１５％の抑制を示した検体が９検体、５〜１０％の抑制を示した検体が２８検体、抑制が５％以下であった検体が３３検体であった（表２）。なお、３０％以上の抑制を示した検体についてA/Duck/Hokkaido/８４/０２（Ｈ５Ｎ３）を用いたＨＩ試験を実施したところ、血清希釈２０倍までＨ５亜型特異的抑制が確認された。
【００７２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明に係る競合ＥＬＩＳＡのCut 0ff値の設定を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）抗体検出抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査薬。
【請求項２】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）から単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる請求項１に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項３】
ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加してＮＰ−Ｈｉｓとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる請求項１又は２に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項４】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる請求項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項５】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、少なくとも前記（１）の固相化抗原と
（２）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）とからなる請求項１〜４のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項６】
固相化抗原がＥＬＩＳＡプレートに固相化されている請求項４又は５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項７】
ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる請求項５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項８】
インフルエンザウイルスの核タンパク質を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶから単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる請求項８に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１０】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用い、少なくとも前記固相化抗原（１）と
（２）前記核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を用いる請求項８又は９に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１１】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させる請求項１０に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１２】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させ、次いで、
（４）前記（３）の抗ＮＰ ＭＡｂのみと反応する酵素標識抗体を加え、次いで、
（５）前記（４）の酵素標識抗体の標識酵素の酵素基質を加えたときの発色を測定する請求項１１に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１３】
ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１４】
抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いる請求項９〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）抗体検出抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査薬。
【請求項２】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）から単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる請求項１に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項３】
ＡＩＶ A/Duck/Aomori/４７８/０２（Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加してＮＰ−Ｈｉｓとして発現させた核タンパク質（ＮＰ）をＡＩＶ抗体検出抗原として用いる請求項１又は２に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項４】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる請求項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項５】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、少なくとも前記（１）の固相化抗原と
（２）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）とからなる請求項１〜４のいずれかに記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項６】
固相化抗原がＥＬＩＳＡプレートに固相化されている請求項４又は５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項７】
ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる請求項５に記載のインフルエンザ感染検査薬。
【請求項８】
インフルエンザウイルスの核タンパク質を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いることを特徴とするインフルエンザ感染検査方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をＡＩＶから単離し、バキュロウイルス発現系を用いて発現させた核タンパク質（ＮＰ）を、酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用いる請求項８に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１０】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原として用い、少なくとも前記固相化抗原（１）と
（２）前記核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を用いる請求項８又は９に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１１】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させる請求項１０に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１２】
（１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を酵素結合免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）の固相化抗原とし、次いで、
（２）被検血清を加えて、抗トリインフルエンザ（ＡＩＶ）抗体を前記（１）の固相化抗原と反応させ、次いで、
（３）前記（１）の核タンパク質（ＮＰ）に対し特異的に結合する抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を加えて、前記抗核タンパク質モノクローナル抗体（ＮＰ ＭＡｂ）を前記（２）で加えた被検血清と競合反応させ、次いで、
（４）前記（３）の抗ＮＰ ＭＡｂのみと反応する酵素標識抗体を加え、次いで、
（５）前記（４）の酵素標識抗体の標識酵素の酵素基質を加えたときの発色を測定する請求項１１に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１３】
ＡＩＶ A/budgeriger/Aichi/１/７７（Ｈ３Ｎ８）を免疫して作製した抗核タンパク質モノクローナル抗体ＮＰ ＭＡｂ（ＩｇＧ１，κ）を用いる請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【請求項１４】
抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いる請求項９〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザ感染検査方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２８５７４９（Ｐ２００７−２８５７４９Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１０７０４（Ｐ２００６−１１０７０４）
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第５３回日本ウイルス学会学術集会、日本ウイルス学会主催、２００５年１１月２０〜２２日開催（プログラム・抄録集発行：２００５年１１月１日）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第５３回日本ウイルス学会学術集会、日本ウイルス学会主催、２００５年１１月２０〜２２日開催（プログラム・抄録集発行：２００５年１１月１日）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
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