ウイルス遺伝子発現の調節
【課題】細胞でウイルスゲノムの発現を変化させる方法の開発。
【解決手段】当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する。該センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は対となって、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、それによって該遺伝子の発現を変化させることができる。該方法を使用して得られた細胞、植物または動物、それらの後代およびそれから誘導された種子を含む。該遺伝子の発現によって得られる好ましい性質は、そのような細胞、植物または動物のウイルスに対する抵抗性または耐性である。
【解決手段】当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する。該センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は対となって、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、それによって該遺伝子の発現を変化させることができる。該方法を使用して得られた細胞、植物または動物、それらの後代およびそれから誘導された種子を含む。該遺伝子の発現によって得られる好ましい性質は、そのような細胞、植物または動物のウイルスに対する抵抗性または耐性である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子発現を変化させる方法であって、当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する方法、並びに本発明の方法を使用して得られたウイルス遺伝子発現の変化を有する細胞、植物または動物に関する。本発明は特に、ウイルスに抵抗性または耐性のそのような細胞、植物または動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスへの抵抗性または耐性は、大きな関心が寄せられている分野である。ウイルスはほとんどの生物に影響を及ぼす。作物において、収量の大部分がウイルス感染のために失われ得る。家畜は、しばしばウイルスに感染し、重大な経済的な結末を導く病気の蔓延を防止するため、時に屠殺される。コンパニオンアニマルもウイルスに襲われ、最終的にウイルスはヒトに感染し、多くの苦しみをもたらす。ウイルスに対する処置が開発されてきたが、それらはしばしば非常に高コストであるか効果が限定的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞、植物または動物を変更し、特定のウイルス遺伝子の発現を変化させて、当該ウイルスに抵抗性または耐性の細胞、植物または動物を創出することが望ましい。遺伝子の発現を変化させる現行の方法は、通常、センスまたはアンチセンスサプレッションの方法による。不幸なことに、これらの方法は、遺伝子発現を変化させる能力がしばしば変動的で、予測不能であり、多くの場合、特定の遺伝子活性を完全に崩壊させることはできない。
したがって、ウイルス遺伝子の発現を効率的かつ予測可能に変化させ、ウイルスに抵抗性または耐性を有する細胞、植物または動物を得るのを可能にする、長く考えられているが達成されていない、新規方法および組成物の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子の発現を、その遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNA断片を使用して、変化させる方法に関する。このようなセンスおよびアンチセンスRNA断片が二本鎖RNA分子を形成することができるのが重要である。特に、本発明は、細胞、植物または動物に、ウイルスに対する抵抗性または耐性を付与する方法および組成物に関する。好ましくは、本発明は、ウイルスに対する抵抗性または耐性を植物に付与する方法に関する。本発明は、そのような方法を使用して得られた植物細胞、そのような細胞に由来する植物、そのような植物の後代およびそのような植物に由来する種子にも関する。そのような植物細胞または植物において、特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変化は、当業界で既知の現行法を使用して得られた特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変化よりもより有効で、選択的でより予測可能である。
【０００５】
本発明は、
複数のサブ配列、例えばRNA断片またはDNA配列を細胞に導入することを含む方法であって、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAのセンスおよびアンチセンス配列を有し、二本鎖RNA分子を形成することができることを特徴とする方法を提供する。その方法は、好ましくは、細胞に複数のサブ配列からなるRNAを導入することを含み、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAの配列を有することを特徴とする。好ましくは、そのRNAは、３’末端サブ配列の上流に位置する少なくとも1個の翻訳停止コドンを含む。さらなる好ましい実施態様において、その方法は、当該RNAの発現をコードするヌクレオチド配列またはDNA分子を細胞に導入することを含む。
【０００６】
本発明は、
細胞にウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片および当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。好ましい実施態様では、その標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくは、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、2個の異なるRNA分子に含まれる。
【０００７】
さらなる好ましい実施態様では、RNA断片を、当該細胞に導入する前に混合する。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片を当該細胞に導入する前に二本鎖RNA分子を形成することのできる条件で混合する。さらなる好ましい実施態様では、次にそのRNA断片を当該細胞に導入する。さらに好ましい実施態様ではそのRNA断片は1個のRNA分子に含まれる。その場合、そのRNA分子は好ましくはフォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖RNA分子を形成することができる。
【０００８】
本発明は、さらに、
細胞に、当該細胞中でウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片を発現することのできる第１のDNA配列、および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該ウイルス標的遺伝子の当該細胞中での発現が変化する。好ましい実施態様では、標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくはウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞である。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、安定的に植物細胞のゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子は、当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。さらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、２個の異なる、すなわち別のＤＮＡ分子に含まれる。
【０００９】
あるいは、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、１個のＤＮＡ分子に含まれる。この場合、この第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、好ましくは当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれ、このことは、センスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片が１個のＲＮＡ断片に含まれることを意味する。好ましくは、そのＲＮＡ分子はフォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は、二本鎖領域を形成することができる。このようなＲＮＡ分子の例は、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５または配列番号２８の逆方向反復配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、センスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片は、２個のＲＮＡ分子に含まれ、または２個のＲＮＡ分子として発現される。この場合、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、好ましくは双方向性プロモーターに実施可能なように連結され、あるいは、第１のＤＮＡ配列は第１のプロモーターに実施可能なように連結され、第２のＤＮＡ配列は、第２のプロモーターに実施可能なように連結されている。ここで、その第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターまたは異なるプロモーターである。さらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれる。
【００１０】
なおさらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である。この場合、このＤＮＡ分子は、当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターをさらに含む。好ましい実施態様では、このＤＮＡ分子は、当該第１のプロモーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位特異的組換え部位、並びに当該第１のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位をさらに含む。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１および第２の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。さらなる好ましい実施態様では、当該逆方向化の結果、当該第１のプロモーターは、当該第２(または第１、最初にプロモーターに連結されたＤＮＡ配列による)のＤＮＡ配列を発現することができる。その植物細胞は、好ましくは当該部位特異的組換え部位を認識することのできる部位特異的レコンビナーゼをさらに含む。
【００１１】
なおさらなる好ましい実施態様では、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーターをさらに含む。ここで、当該第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターを含むか、または異なるプロモーターを含む。
さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子中のプロモーターは当該細胞の本来のプロモーターを含む。さらに好ましい実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階によって調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。所望により、プロモーターは、そのプロモーターのそれぞれの側のＤＮＡ配列の転写を開始することのできるディバージェントまたは双方向性プロモーターである。
【００１２】
なおさらなる好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ配列の間のリンカーをさらに含む。そのリンカーは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子または調節配列、例えばイントロンプロセシングシグナルを含む例えば発現カセットを含む。
【００１３】
本発明は、本発明のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む細胞をもさらに提供する。ここで、当該細胞内の当該ウイルス標的遺伝子の発現は、当該ＲＮＡ断片によって変化する。好ましい実施態様では、その細胞は、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。本発明は、その植物細胞に由来する植物およびその後代、並びにその植物に由来する種子を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物をも提供する。好ましい実施態様では、そのようなＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウイルスゲノムまたはその一部のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列を含む。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。更なる好ましい実施態様では、当該細胞内の当該ウイルスゲノムまたはその一部の発現が変化する。さらなる好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１または当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。なおさらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーターを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された双方向性プロモーターをさらに含む。
【００１５】
本発明は、下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。
(ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖である。
(ｂ)当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーター。
(ｃ)当該プロモーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位特異的組換え部位。
(ｄ)当該第１または第２のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１および第２の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。
好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
【００１６】
本発明は下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。
(ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖である。
(ｂ)当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーター。
(ｃ)当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーター。
好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
【００１７】
「二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)」分子は、標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および同じ標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を含む。その両者は、互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。それによって、そのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。
「相補的」は、逆位平行(antiparallel)ヌクレオチド配列における相補的塩基残基の間で水素結合を形成することによって互いに対となることのできる逆位平行ヌクレオチド配列を含む２本のヌクレオチド配列をいう。
【００１８】
「逆位平行」は、本明細書では、一方のヌクレオチド配列では５’−３’方向に、他方のヌクレオチド配列では３’−５’方向に渡るホスホジエステル結合を有する相補的塩基残基の間の水素結合により対となった２本のヌクレオチド配列をいう。
「標的遺伝子」は、既知の機能の任意のウイルス遺伝子であるか、その機能が未知であるが全部または一部のヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。標的遺伝子は、細胞の本来の遺伝子であるか、予め細胞に好ましくは遺伝子形質転換またはその細胞のウイルス感染によって導入された異種性の遺伝子である。好ましくは、その標的遺伝子は、植物細胞の遺伝子である。
「本来の」遺伝子とは、形質転換されない細胞のゲノムに存在する遺伝子をいう。
【００１９】
「必須」遺伝子は、タンパク質、例えば、細胞の成長または生存に必須な生合成酵素、レセプター、情報伝達タンパク質、構造遺伝子産物、または輸送タンパク質のようなタンパク質をコードしている遺伝子をいう。
細胞の標的遺伝子の発現の「変化」は、本発明の方法の適用の後、ある細胞内の標的遺伝子の発現レベルが、その方法の適用のない細胞内でのその発現と異なることを意味する。遺伝子発現の変化は、好ましくは、その細胞内での標的遺伝子の発現が減少し、好ましくは大きく減少し、より好ましくはその遺伝子発現が検出不可能となり、細胞またはそれに由来する植物もしくは動物にノックアウト突然変異表現型をもたらすことを意味する。
「単離」は、本発明では、その本来の環境から離れて存在し、したがって天然物ではない人手によって単離された核酸分子である。単離核酸分子は、精製形態で存在してもよく、天然ではない環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞内に存在し得る。
【００２０】
本明細書で使用される「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を適当な宿主細胞にもたらすことができ、終結シグナルに実施可能なように連結される所望のヌクレオチド配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含むことができるＤＮＡ配列を意味する。典型的には、それは、ヌクレオチド配列の正確な翻訳のために必要な配列をも含む。コード領域は、通常、所望のタンパク質をコードするが、所望の機能性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをもセンスまたはアンチセンス配向でコードしてもよい。所望のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラ(少なくとも１個のその構成要素が少なくとも１個の他のその構成要素について異種性である)であってよい。発現カセットは、天然に存在するが異種性の発現のために有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかし、典型的には、発現カセットは、宿主について異種性であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞内に天然に存在せず、宿主細胞または宿主細胞の後代に形質転換事象によって導入されなければならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞がある特定の外部刺激にさらされるときのみ転写を開始させる誘導可能プロモーターの制御下であってよい。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発育段階に特異的であることができる。
【００２１】
本明細書で使用する「異種性の」は、「天然の起源と異なる」を意味するか、非天然状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物、特に他種の生物に由来する核酸配列で形質転換されれば、その核酸配列を有するその宿主細胞について、およびその宿主細胞の子孫についてその核酸配列は異種性である。同様に、異種性とは、同じ天然の、もとの細胞型に由来し、挿入されているが、非天然状態、例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレオチド配列をいう。
【００２２】
本明細書でヌクレオチド配列について使用するとき、「実質的に類似な」の語は、最も広い意味で、引用ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味する。ここで、この対応する配列は、引用ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドとして、実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードする。例えば、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸の変化のみ存在する場合である。望ましくは、その実質的に類似のヌクレオチド配列が、引用ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする。実質的に類似のヌクレオチド配列および引用ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージ（相補的配列内の相補的塩基の数を、相補的配列中の塩基の総数で割る）は、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは８５％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%である。
【００２３】
「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現付与に関係する配列をいう。調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列および終結シグナルに実施可能なように連結されたプロモーターを含む。これらは、典型的には、ヌクレオチド配列の適当な翻訳に要する配列を包含する。
「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物または植物の一部をいう。ここに、挿し木、細胞または組織培養物および種子も含まれる。本発明に使用されるように、「植物組織」の語は、植物体、植物細胞、植物器官、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物、並びに構造および／または機能単位に組織化された植物細胞の任意の群を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
「ウイルス抵抗性または耐性」は、本明細書では、感受性細胞、植物または動物と比較したときに１種またはそれ以上のウイルスに対して感受性ではないか低い感受性である抵抗性または耐性細胞、植物または動物を意味する。例えば、抵抗性または耐性は、ウイルス感染の通常の症状が不存在であるか減少していること、または細胞内のウイルスの蓄積もしくは複製が防止されるか減少していること、または例えば、細胞から細胞へのウイルスの移動が防止されるか減少していることを意味する。
「ウイルスゲノムまたはその一部の発現の変化」は、典型的には、ウイルスまたはその一部もしくはその構成要素、例えば、ウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の蓄積、複製または移動が、細胞内で影響を受けていることと理解される。
【００２５】
本発明は、ウイルス遺伝子の細胞、植物または動物内での発現を調節、すなわち変化させる方法に関する。細胞、植物または動物における遺伝子の発現を調節するために通常利用される方法は、予測可能性に欠け、調節されるべき遺伝子によって変動的である。本発明はこれらの課題を解決し、細胞、植物または動物における遺伝子の再現可能で、効率的な調節を提供する。
発現が調節される遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部である。好ましい実施態様では、細胞は真核細胞、より好ましくは植物細胞、例えば、単子葉植物もしくは双子葉植物細胞、または動物細胞、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコもしくはイヌ、もしくは鳥類からのものである。本発明は、ウイルス標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片を利用し、細胞内の遺伝子の発現を変化させる。第1の実施態様では、本発明は、細胞に標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。そのＲＮＡ断片を、その細胞に種々の形質転換方法、例えば、パーティクルボンバードメントまたはＰＥＧ介在形質転換またはエレクトロポレーションによって導入する。さらなる好ましい実施態様では、他の方法、例えば、ＲＮＡ断片のマイクロインジェクションを使用する。
【００２６】
好ましい実施態様では、ＲＮＡ断片は、2個の異なるＲＮＡ分子に含まれる。この場合、ＲＮＡ断片を当該細胞に導入する前に、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできるような条件下で混合する。さらなる好ましい実施態様では、ＲＮＡ断片を次に当該細胞に導入する。好ましくは、それぞれのＲＮＡ分子の導入の間の時間間隔は短く、好ましくは１時間より短い。なおさらなる実施態様では、ＲＮＡ断片は、1個のＲＮＡ分子に含まれる。単一のＲＮＡ分子を使用することによって、2個の相補的ＲＮＡ断片は対となるほどにきわめて近接しているのが好ましい。その場合、好ましくはＲＮＡ分子は、フォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖領域を形成することができる。この場合、ＲＮＡ断片の相補的部分は、互いに認識し、互いに対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。好ましい実施態様では、このＲＮＡ断片を細胞に導入する前に二本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできる条件でインキュベートする。なおさらなる実施態様では、このＲＮＡ分子は、センスＲＮＡ断片とアンチセンスＲＮＡ断片の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットによってコードされたＲＮＡ配列を含む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを含む調節配列によってコードされているＲＮＡ配列を含む。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、ウイルスゲノムの発現を変化させる方法であって、細胞に当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。好ましい実施態様では、その第１のＤＮＡ配列およびその第２のＤＮＡ配列は、その細胞のゲノムに安定的に組みこまれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮＡ配列は２個の異なるＤＮＡ分子に含まれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮＡ配列は、１個のＤＮＡ分子に含まれる。この場合、そのＤＮＡ分子は、好ましくはセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む単一のＲＮＡ分子をコードする。単一のＲＮＡ分子を使用することによって、その２個の相補的ＲＮＡ断片は対となるほどに非常に近接しているので、それは好ましい。そのＤＮＡ分子は、２個の別々のＲＮＡ分子、例えば、センスＲＮＡ断片を含む1個のＲＮＡ分子およびアンチセンスＲＮＡ断片を含む１個のＲＮＡ分子を含む１個のＲＮＡ分子をコードする。単一のＲＮＡ分子またはそららの２個の別のＲＮＡ分子は、好ましくは、フォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は、二本鎖領域を形成することができる。そのＲＮＡ断片の相補的部分は互いに認識し、互いに対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。
【００２８】
ある実施態様では、単一のＤＮＡ分子または２個の別のＤＮＡ分子のそれぞれは当該ＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列中のプロモーターは、本来の植物プロモーターまたは不活性化されるべき当該ウイルス遺伝子の本来のプロモーターを含む。その二本鎖ＲＮＡがウイルス標的遺伝子として同じ組織で発育中に同時に発現するのを確保するためである。さらなる実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階に応じて調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。
なおさらなる実施態様では、このＤＮＡ配列は、当該２個の相補的ＲＮＡ断片をコードするＤＮＡ配列の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを含む調節配列を含む。
本発明のＤＮＡ分子を、当業界で周知の方法または後記に示す方法を使用して細胞に形質転換する。本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、そのようなＤＮＡ構築物を含む組換えベクターおよび本発明のＤＮＡ配列を含む組成物を提供する。
【００２９】
本発明では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、望ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より望ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５００ｂｐ長である。好ましくはその相補的領域は、５ｋｂより小さく、より好ましくは２ｋｂより小さい。ある特定の実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、標的遺伝子のコード領域を含む。さらなる好ましい実施態様では、その相補的領域は、標的遺伝子の非翻訳領域(ＵＴＲ)、例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、本発明のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ断片をコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ分子に由来し、あるいは、発現を変化させるべきウイルス標的遺伝子の調節エレメント、例えば、プロモーターまたは終結シグナルを含む。
【００３０】
さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、発現が変化する遺伝子の対応する配列と同一である。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と実質的に類似であり、なお、その遺伝子の発現を変化させることができる。この場合、その相補的領域は、望ましくは発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と少なくとも５０％同一、より望ましくは少なくとも７０%同一、好ましくは少なくとも９０%同一、より好ましくは少なくとも９５%同一である。それによって、単一の二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、単一の遺伝子または複数の遺伝子の発現を変化させることができる。ここで、当該単一の遺伝子は二本鎖ＲＮＡに同一な配列を含むか、その二本鎖ＲＮＡと実質的の類似である。
【００３１】
さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に全くミスマッチを含まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に少なくとも１個のミスマッチを含む。そのとき、２個のＲＮＡ断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、それによってその遺伝子の発現を変化させることができる。望ましくは、相補的領域のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間のミスマッチは５０％より少なく、より望ましくは３０％より少なく、好ましくは２０%より少なく、より好ましくは１０%より少なく、なおさらに好ましくは５%より少ない。
【００３２】
ウイルスに対する抵抗性または耐性
本発明は、ウイルス抵抗性または耐性である細胞、動物または植物をもたらす。本発明を使用して制御されるウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖およびマイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、アンビセンスＲＮＡウイルス並びにレトロウイルスを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御される植物ウイルスは、例えば、トスポウイルス(例えば、トマト黄化えそウイルス、ＴＳＭＶと略称)、ポティウイルス(例えば、カブモザイクウイルス、ＴｕＭＶと略称、レタスモザイクウイルス、ＬＭＶと略称、カボチャモザイクウイルスＩＩ、ＷＭＶＩＩと略称、ズッキーニ黄化モザイクウイルス、ＺＹＭＶと略称、ジャガイモＹウイルス、ＲＶＹと略称、およびパパイヤリングスポットウイルス、ＰＲＳＶと略称)、ポテックスウイルス、トバモウイルス(例えば、ペッパー微班ウイルス、ＰＭＭＶと略称、およびトマトモザイクウイルス、ＴｏＭＶと略称)、ルテオウイルス(例えばビート西部萎黄ウイルス、ＢＷＹＶと略称、およびbeet mild yellowing virus、ＢＭＹＶと略称)、ククモウイルス(例えば、キュウリモザイクウイルス、ＣＭＶと略称)、ジェミニウイルス(例えば、tomato yellow leafcurl virus、ＴＹＬＣＶと略称)、カウリモウイルス(例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶと略称)、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トンブスウイルス並びにフロウイルス(例えば、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ＢＮＹＶＶと略称)である。本発明を使用して制御可能なさらなるウイルスのクラスが、Zacomer et al.(1995) Journal of General Virology, 76:231-247およびMartelli(1992)Plant Disease, 76: 436-441に記載されている。ウイルス制御を達するためにウイルスゲノムの好ましいＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウイルスレプリカーゼ、ムーブメントタンパク質等をコードしている遺伝子の領域に対応する。ウイルスゲノム発現を制御するために有用なさらなるヌクレオチド配列は、ＷＯ９５／０９９２０に記載されている。好ましいＤＮＡ配列はタンパク質に翻訳されないウイルスゲノムの一部、例えば、５’または３’非翻訳領域を含みうる。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法は広いスペクトルのウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。例えば、本発明の方法はウイルスゲノムによってコードされているウイルスおよび同じウイルス綱、群または属の他のウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。あるいは、本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび同じウイルスの他の分離株によってコードされているウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび異なる種であって好ましくは関連する種、好ましくはそのようなウイルスが存在する種である異なる種における同じウイルス群または属の他のウイルスによってコードされているウイルスに対する抵抗性または耐性をももたらす。所望により、1対より多い、すなわち少なくとも2対の、ｄｓＲＮＡを形成することのできるセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する。そのような対は例えば、同じウイルスゲノムだけでなく同じウイルスゲノムの異なる部分に由来する。あるいは、そのような対は、異なるウイルスゲノムに由来する。したがって、異なるウイルスクラス、群または属への抵抗性または耐性を、本発明を使用して達成する。
【００３４】
植物細胞およびそれに由来する植物は、それらはウイルス抵抗性または耐性であるのだが、好ましくは双子葉植物である。シュガービートおよびキャノーラにおけるフロウイルス(例えばRush and Heidel(1995)Plant Disease 79: 868-875参照)の抵抗性または耐性を付与する方法を、本発明に記載し、ＢＮＹＶＶ、シュガービートにおけるrhizomania(crazy roots)の原因病原体についてさらなる詳細を実施例9に記載する。「ウイルス黄化」(例えば、CRC Handbook on Disease of Sugar Beet, Volume II, pp. 35-52参照)例えば、ＢＭＹＶおよびビート西部萎黄ウイルス(ＢＷＹＶ)(シュガービートおよび脂肪種子ナタネにそれぞれ感染する)への抵抗性または耐性を付与する方法を、実施例8にさらに詳細に記載する。
本発明の方法は、単子葉植物のウイルスへの耐性または抵抗性を付与する。例えば、本発明および米国特許5,569,828の方法を使用して、Maize chlorotic dwarf virusに対する耐性または抵抗性を得る。同様に本発明および米国特許5,428,144の方法を使用して、Maize dwarf mosaic virusに対する耐性または抵抗性を得る。
【００３５】
植物形質転換技術
本発明のＤＮＡ分子を植物またはバクテリア細胞に通常の組換えＤＮＡ技術を使用して組みこむ。一般に、本発明のＤＮＡ分子は形質転換ベクターに含まれる。当分野で既知の多くのそのようなベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾されたウイルスを使用する。発現系の構成要素を修飾して、例えば、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の発現を増大させる。例えば、配列の切除、ヌクレオチドの置換、または他の修飾を実施する。当分野で既知の発現系を使用して、実質的に任意の作物植物細胞を適当な条件で形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、宿主細胞のゲノムに好ましくは安定的に組みこむ。さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、自己複製ベクター中に置く。自己複製ベクターの例は、ウイルス、特にジェミニウイルスである。形質転換された細胞を好ましくは植物体に再生する。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であってよく、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、(インゲン)マメ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アウパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチコ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、シュガービート、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、並びに樹木植物、例えば、針葉樹および落葉樹を含むがこれらに限定されない。望ましいヌクレオチド配列を特定の植物種に形質転換し、その種内で増殖し、または伝統的な育種法を使用して同じ種の特に商業的な変種を含む他の変種に導入する。
【００３６】
Ａ．植物発現カセットの構築に要するもの
トランスジェニック植物における発現を意図された遺伝子配列を、まず発現カセットに、植物で発現可能な適当なプロモーターの後方に組みこむ。発現カセットは、導入遺伝子の発現のために要するか選択された任意のさらなる配列を含みうる。そのような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発現を増強する外来配列、必須配列および特定のオルガネラおよび細胞構成要素への遺伝子産物のターゲッティングを意図する配列を含むがこれらに限定されない。これらの発現カセットを、後記の植物形質転換ベクターに容易に送達することができる。典型的な発現カセットの種々の構成要素を後述する。
【００３７】
１．プロモーター
発現カセットに使用されるプロモーターの選択によって、トランジェニック植物における導入遺伝子の位置および時間的発現パターンが決定される。選択されたプロモーターは、特異的な細胞型(例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)または特異的な組織または器官(例えば、根、葉または花)中で導入遺伝子を発現させ、その選択はその遺伝子産物の蓄積の望ましい位置に影響を及ぼす。あるいは、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件で遺伝子の発現を駆動する。プロモーターはその力、すなわち転写を促進する能力が異なる。利用される宿主細胞系によって、当分野で既知の任意の数の適当なプロモーターを使用する。例えば、構成的発現のために、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、イネアクチンプロモーター、またはユビキチンプロモーターを使用する。例えば、調節可能な発現のためには、タバコまたはアラビドプシスに由来する化学的に誘導可能なＰＲ−１プロモーターを使用する(例えば、米国特許5,689,044参照)。
【００３８】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導可能なものである。傷部位で発現される多くのプロモーターが記載されている。この種の好ましいプロモーターは、Stanford et al. Mol Gen. Genet. 215: 200-208(1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588(1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158(1989),Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142(1993) and Warner et al. Plant J.3:191-201(1993)に記載されているものを含む。
好ましい組織特異的発現型は、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的および花特異的なものを含む。緑色組織での発現に適当なプロモーターは、光合成に関係する遺伝子を調節する多くのものを含む。これらの多くは、単子葉植物および双子葉植物からクローニングされた。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子に由来するトウモロコシＰＥＰＣプロモーターである(Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589(1989))。根特異的発現に好ましいプロモーターは、de Framondによって記載されたものである(FEBS 290: 103-106(1991); EP0452269)。さらに好ましい根特異的プロモーターは、本発明によって提供するＴ−１遺伝子に由来するものである。好ましい茎特異的プロモーターは、米国特許5,625,136に記載されたものであり、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動する。
本発明の好ましい実施態様は根特異的な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。さらに好ましい実施態様は、傷誘導可能または病原体感染誘導可能な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。
【００３９】
２．転写ターミネーター
広範な転写ターミネーターが発現カセット中の使用のために利用可能である。これらは導入遺伝子を超えた転写の終結および正確なポリアデニル化に必要である。適当な転写ターミネーターが植物で機能するとして知られているものであり、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、およびエンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方に使用される。
【００４０】
３．発現の増強または調節のための配列
多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強することが見出されている。これらの配列は、本発明の遺伝子と結合させて使用して、トランスジェニック植物内での発現を増加させることができる。例えば、種々のイントロン配列、例えば、トウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞で発現を増強することが示された。さらに、ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配列が発現を増強すると知られており、これらは双子葉植物細胞で特に効果的である。
【００４１】
４．コード配列の最適化
一般に、選択された遺伝子のコード配列を、所望の作物種における最適な発現のためにコード配列を変化させることによって改変し得る。コード配列を修飾して特定の作物種で最適な発現を達成する方法が周知である(例えば、Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324(1991); and Koziel et al., Bio/technol. 11:194(1993)参照)。
さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分子を色素体ゲノムに直接的に形質転換する。色素体形質転換法が米国特許番号5,451,513、5,545,817および5,545,818、ＰＣＴ出願番号WO95/16783、およびMcBride et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,7301-7305に詳細に記載されている。葉緑体形質転換の基本的な方法は、選択マーカーにフランキングなクローニングされた色素体ＤＮＡの領域を所望の遺伝子と共に、適当な標的組織に、例えば、バイオリスティックまたはプロトプラスト形質転換(例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質転換)を使用して導入することに関する。ターゲティング配列と称する１ないし１．５ｋｂフランキング領域によって、色素体ゲノムの同種性の組み換えを容易化し、plastomeの特異的領域の置換または修飾が可能になる。
【００４２】
最初に、葉緑体16S ｒRNA並びにスペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するｒｐｓ１２遺伝子における点突然変異を形質転換のための選択マーカーとして利用する(Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., and Maliga, P. (1992)Plant Cell 4,39-45)。これらのマーカーの間のクローニング部位の存在によって、外来DNA分子の導入のための色素体ターゲッティングベクターを生成することができる(Staub, J.M.,and Maliga, P. (1993)EMBO J.12, 601-606)。劣性のｒRNAまたはr−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を、優性の選択マーカー、例えば、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−3’-アデニルトランスフェラーゼをコードしているバクテリアａａｄＡ遺伝子で置換することによって、形質転換頻度を実質的に増加できる(Svab, Z., and Maliga, P. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。以前、このマーカーを使用して、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの色素体ゲノムの高頻度形質転換に成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991)Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)。色素体形質転換に有用な他の選択マーカーが当分野で知られ、本発明の範囲に入る。
【００４３】
色素体発現とは、遺伝子が相同組換えでそれぞれの植物細胞に存在する数千コピーの環状色素体ゲノムに挿入されることである。好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡを色素体ターゲッティングベクターに挿入し、所望の植物宿主の色素体ゲノムに形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む色素体ゲノムについてホモプラスミックな植物を得て、それはそのＤＮＡ分子を選択的に高度に発現することができる。好ましくは、そのＤＮＡ分子をコードしているセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は、対となって、植物色素体内で二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、色素体遺伝子の発現を変化させることができる。好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンス断片は相補的領域に全くミスマッチを含まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチアセンス断片は少なくとも1個のミスマッチをその相補的領域に含む。この場合、ＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ分子内のＤＮＡ配列は、互いに再結合することができない。
【００４４】
Ｂ．植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換に利用可能な多くの形質添加ベクターが植物形質転換技術の当業者に既知であり、本発明に関係する遺伝子を任意のそのベクターと結合させて使用することができる。そのベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換の標的の種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するｎｐｔｌｌ遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するＢaｒ遺伝子(White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062(1990),Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631(1990))抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)およびメタトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis et al., EMBO J.2(7): 1099-1104(1983))並びにグリホサートに対する抵抗性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子(米国特許番号4,940,935 and 5,188,642)を含む。
【００４５】
１．アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
多くのベクターがアグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に利用できる。これらは典型的には少なくとも1個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、例えばｐＢＩＮ１９(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))およびｐＸＹＺのようなベクターを含む。アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは、バイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびｐＣＩＢ２００１並びにバイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体を含む。(例えば米国特許番号5,639,949参照)。
【００４６】
２．非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果的に、これらの配列を欠いたベクターをＴ−ＤＮＡ配列を含む前記のもののようなベクターに加えて利用する。アグロバクテリウムに依存しない形質転換法は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み(例えば、ＰＥＧおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換される種の好ましい選択に多くは依存する。非アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９、およびｐＳＯＧ３５を含む。(例えば、米国特許番号5,639,949参照)。
【００４７】
Ｃ．形質転換法
所望のＤＮＡ配列を発現系にクローニングし、植物細胞に形質転換する。植物の形質転換および再生の方法は当分野で周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベクター、並びに直接的ＤＮＡ取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルを外来ＤＮＡの送達のために使用する。さらにアグロバクテリウム属からのバクテリアを植物細胞を形質転換するために利用できる。
【００４８】
双子葉植物のための形質転換方法は当分野で周知であり、アグロバクテリウムに基づく方法およびアグロバクテリウムを要しない方法を含む。非アグロバクテリウム方法は、外生遺伝的物質をプロトプラストまたは細胞に直接的に取り込むことを含む。これは、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション仲介取り込み、パーティクルボンバードメント仲介送達またはマイクロインジェクションによって達成する。いずれの場合も、形質転換した細胞を、当分野で既知の標準的方法を使用して植物体に再生する。
殆どの単子葉植物種の形質転換は、現在ではルーチンとなった。好ましい方法は、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用するプロトプラストへの直接的遺伝子導入、カルス組織へのパーティクルボンバードメントおよびアグロバクテリウム仲介形質転換を含む。
【００４９】
本発明を後記の詳細な実施例を記載することによってさらに説明する。これらの実施例は例示のみのために提供し、特に明示しない限り限定することを意図していない。
【００５０】
ここで使用した標準的組み換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当分野で周知であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY(1989) and T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) and by Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。
【実施例１】
【００５１】
実施例１：ルシフェラーゼ遺伝子の発現の調節
ルシフェラーゼＲＮＡデュプレックス(duplex)をコードするキメラＤＮＡ分子の構築
プラスミドｐＬｕｃ＋(Promega)からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の７８３ｂｐの「センス」配向断片を、ｐＰＨ１０８プラスミＤＮＡからオリゴヌクレオチドプライマーｄｓ Ｌｕｃ１（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＡＡ ＡＣＡ−３’、配列番号１；ＢａｍＨＩ制限部位に下線を付す）およびｄｓ Ｌｕｃ２（５’−ＣＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ＴｕｒｂｏＰｆｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を、５０μｌ反応物中で、製造者のプロトコールにしたがって、９５℃／１分、５５℃／１．５分、７２℃／２分の５サイクル、続いて９５℃／１分、７２℃／３．５分の２５サイクルで使用する。同様の方法で、プラスミドｐＬｕｃ＋からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の７３７ｂｐ「アンチセンス」配向断片をｐＰＨ１０８プラスミドＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーｄｓ Ｌｕｃ３（５’−ＣＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ−３’、配列番号３；ＸｂａＩ制限部位に下線を付す）およびｄｓ Ｌｕｃ２（５’−ＣＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を付す）を使用してＰＣＲによって増幅する。得られたＤＮＡ断片を低融点アガロース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いてＰＣＲ産物を含む切除したゲルスライスをフェノール−クロロホルム抽出により精製する。標準的方法（制限酵素をNew England Biolabsから得た)にしたがって、センス産物（ｄｓ Ｌｕｃ１／２）からのＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アンチセンス産物（ｄｓ Ｌｕｃ３／２）からのＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。得られた粘着末端ＤＮＡ断片を前記のようにゲル精製する。ｍａｓ１’プロモーター(Velten et al. (19984)EMBO J. 3: 2723-2730)を含むＤＮＡ断片をプラスミドＣＳＡ１０４をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、５６４ｂｐ ＤＮＡ断片を精製することによって得る。この断片をＢａｍＨＩで再消化し、ｍａｓ１’プロモータを含む４８４ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブ断片を単離し、ゲル精製する。プラスミドｐＰＨ１６９を構築するために、クローニングベクターｐＬｉｔｍｕｓ２９(New England Biolabs)からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、単離した断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用して４通りの反応でｍａｓ１’プロモーター ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ）ｄｓ Ｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。ｄｓ Ｌｕｃ１／２／３ＲＮＡデュプレックス構築物でのアグロバクテリウム仲介植物形質転換のためのバイナリーベクターｐＰＨ１７０を構築するために、バクテリア選択のためのカナマイシン抵抗性遺伝子およびトランスジェニック植物選択のためのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有するバイナリープラスミドｐＳＧＣＨＣ１からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化する。得られたｐＳＧＣＨＣ１からの１１．６ｋｂ単離断片を４通りの反応でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用してｍａｓ１’プロモーターＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス(ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ）ｄｓ Ｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。
【００５２】
アグロバクテリウムの形質転換およびアラビドプシス植物の減圧浸潤
プラスミドｐＰＨ１７０をアグロバクテリウムツメファシエンスＧＶ３１０１にエレクトロポレーションによって導入し、形質転換されたコロニーを選択し、増幅する。ルシフェラーゼを構成的に（ＵＢＱ３プロモーター(Norris et al.(1993)PMB 21:895-906)／ＵＢＱ３＋ＣａＭＶ ３５Ｓ５’ＵＴＲ／ｌｕｃ＋；ｐＰＨ１０８）または誘導可能に（アラビドプシスＰＲ−１プロモーター／ｌｕｃ＋；ｐＰＨ１３５、系統６Ｅ）発現しているアラビドプシス(Arabidopsis thaliana)突然変異系統の４ないし５週齢の植物を、ｐＰＨ１７０バイナリーＴ−ＤＮＡベクターを有するアグロバクテリウムコロニーで減圧浸潤する。形質転換した植物を、ハイグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、制御されたファイトトロン条件下でルシフェラーゼ活性の決定のために育成する。さらに、ｐＰＨ１３５−６Ｅバックグラウンドのルシフェラーゼ活性をＢＴＨ（ＢＴＨ処理はLawton et al. Plant J. 10: 71-82に詳細に記載されている）で誘導の４８時間後に評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン基質の添加に続く組織エキストラクト中でのルミネッセンスに基づくアッセイを使用して定量する。ルシフェラーゼ活性をＣＣＤ-cooledビデオイメージングシステム(Hamamatsu)を使用して植物体でもモニターする。
【実施例２】
【００５３】
実施例２：アラビドプシスＧＬ１遺伝子の発現の調節
ＧＬ１遺伝子は、通常のトリコーム（リーフヘアー）形成のイニシエーションに要するｍｙｂ様転写因子をコードする(Oppenheimer et al.(1991)Cell 67: 483-493)。発育の初期のＧＬ１発現のノックアウトは、植物にトリコームの欠如をもたらす。ノックアウト表現型は幼苗で容易に同定でき、致死ではない。構成的発現のための３種のベクターおよびＧａｌ４ＣＩ調節された発現のための３種のベクターを構築する。それぞれのプロモーターを試験するための３種の異なるベクターは、ＧＬ１遺伝子断片のセンス（＋）発現、アンチセンス（−）発現およびデュプレックス（＋／−）ＲＮＡ発現である。（＋）および（−）ベクターは、ＧＬ１の発現に及ぼす効果を比較するためのコントロールである。それぞれの場合、ＧＬ１配列(GenBank Accession M79448)の塩基＃７３９ないし＃１７８１からの５’断片をベクター構築のために使用する。
【００５４】
Ｇａｌ４ＣＩ調節された発現
ＧＬ１遺伝子断片を交差誘導可能ベクター構築物ｐＪＧ３０４−１にＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片としてクローニングする。プラスミドｐＪＧ３０４をｐＢＳＳＫ＋から誘導する。プラスミドｐＢＳ ＳＫ＋(Stratagene, LaJolla,CA)をＳａｃＩで線形化し、マングビーンヌクレアーゼで処理し、ＳａｃＩ部位を除去し、Ｔ４リガーゼで再ライゲートし、ｐＪＧ２０１を作成する。１０ＸＧＡＬ４コンセンサス結合部位／ＣａＭＶ ３５Ｓミニマルプロモーター／ＧＵＳ遺伝子／ＣａＭＶターミネーターカセットをｐＡＴ７１からＫｐｎＩで除去し、ｐＪＧ２０１のＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＪＧ３０４を作成する。プラスミドｐＪＧ３０４を制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で一部消化し、全長線形断片を単離する。この断片をモル過剰の２２塩基のオリゴヌクレオチドＪＧ−Ｌ（５’−ＧＴＡ ＣＣＴ ＣＧＡ Ｇ ＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＣＧＡ Ｇ−３’、配列番号４）とライゲートする。制限分析を使用して、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位の５’にこのリンカーを挿入されたクローンであると同定し、このプラスミドをｐＪＧ３０４ＤＸｈｏＩと命名する。
ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位を、５’末端に適当な制限部位を有するＰＣＲプライマーを合成することによって（＋）および（−）断片の末端に付加する。（＋／）ＧＬ１断片を２個の断片:５’末端にＮｃｏＩ部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する（＋）断片および５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端にＳａｃＩ部位を有する（−）断片を最初に生成することによって生成する。デュプレックスユニットを得られた断片にＥｃｏＲＩ部位でライゲートすることによって生成する。発現ユニットは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン、続いてミニマルＴＡＴＡ配列、および（＋）、（−）または（＋／−）配向であるＧＬ１遺伝子断片を含む。
【００５５】
構成的発現
双子葉植物で比較的強力で構成的なアグロバクテリウム（ｒｅｆ）からのマンノピンシンターゼのｍａｓ１’プロモーターを使用する。前記のように、ＧＬ（＋）、（−）および（＋／−）断片をpBluescriptの１’プロモーターの後方にライゲートする。３種類の異なる発現カセットをｐＣＩＢ２００にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片としてライゲートする(Uknes et al.(1993)Plant Cell 5:159-169)。
【実施例３】
【００５６】
実施例３：シスタチオンベータリアーゼ遺伝子の発現の調節
シスタチオンベータリアーゼ（ＣＢＬ）遺伝子は、メチオニン生合成経路のある段階をコードしている。植物におけるその発現の調節の影響をセンスおよびアンチセンス構築物、並びに二本鎖ＲＮＡ構築物を使用して試験する。
アンチセンス構築物：ｐＪＧ３０４ＤＸｈｏＩベクターからの断片を含み、アンチセンス配向のＣＧＬ遺伝子(ヌクレオチド＃１３−１１５９、Genbbank accession #L40511)の一部が挿入された、バイナリーＢＡＳＴＡベクターｐＪＧ２６１を使用する。
センス構築物：ＣＢＬ断片が反対配向である以外は、アンチセンス構築物と同様である。この構築物はＡＴＧ開始コドンおよび殆どのＣＢＬ ＯＲＦを含み、ＣＢＬ遺伝子の発現の制御および調節として働く。
二本鎖ＲＮＡ構築物：センス配向のＣＢＬ遺伝子断片（#１３−１１５９）を、ＣＢＬ遺伝子のアンチセンス配向バージョンの下流であってベクターｐＪＧ３０４−１のＳａｌＩ部位に挿入する。約１０ｂｐのリンカーが２コピーのＣＢＬの間に存在する。
【実施例４】
【００５７】
実施例４:植物発現カセットの構築のために必要なもの
トランスジェニック植物における発現を意図する遺伝子配列を、適当なプロモータの後方であって適当な転写ターミネーターの上流の発現カセット中に最初に組みたてる。植物発現カセットの構築に必要なすべては、本発明のＤＮＡ分子に当てはまり、当分野で周知の技術を使用して実施する。
【００５８】
プロモーター選択
発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物でのＤＮＡ分子の位置および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモーターは、特異的な細胞型（例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）でまたは特異的な組織または器官（例えば、根、葉または花）でＤＮＡ分子を発現させ、その選択はそのＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ断片の生合成の望ましい位置に影響を及ぼす。あるいは、選択したプロモーターは、光誘導または他の時間的に調節されたプロモーターの下でＤＮＡ分子の発現を駆動し得る。あるいは選択されたプロモーターは、化学的に調節されるものである。これにより、望ましく、化学的インデューサーでの処理によって引き起こされるときのみＤＮＡ分子の発現を誘導する可能性を提供される。
転写ターミネーター
種々の転写ターミネーターが発現カセット中での使用のために利用可能である。これらは、転写の終結および好ましくは正確なポリアデニル化のために必要である。適当な転写ターミネーターおよび植物中で機能すると知られているものは、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。これらは単子葉および双子葉植物の両方で使用できる。
【００５９】
発現の増強または調節のための配列
多くの配列が転写ユニット内からの遺伝子発現を増強することが見出されてきた。これらの配列を本発明のＤＮＡ分子と組み合わせて使用し、トランスジェニック植物中でのその発現を増大させることができる。
種々のイントロン配列が特に単子葉植物細胞での発現を増強させることが示されている。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンが、トウモロコシ細胞に導入されたときそのコグネイトプロモーターの下で野生型遺伝子の発現を有意に増強することが見出された。イントロン１は、特に有効であると見出され、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物において発現を増強する(Callis et al., Genes Dvelop 1: 1183-1200(1987))。同じ実験系で、トウモロコシｂｒｏｎｚｅ１遺伝子からのイントロンが発現の増強に同様の効果を有する(Callis et al.,前掲)。イントロン配列は、日常的に植物形質転換ベクターに、典型的には非翻訳リーダー内に組みこまれている。
ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列が、発現を増強することが知られている。これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス(TMV、「Ω配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス(Maize Chlorotic Mottle Virus(MCMV))、およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列が、発現を増強するのに有効であると示されている(例えば、Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711(1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15; 65-79(1990))。
【実施例５】
【００６０】
実施例５：発現カセット構築物の例
本発明は、プロモーターの起源に関わらず植物で発現可能な任意のプロモーターの調節の下での本発明のＤＮＡ分子の発現を含む。したがって、ＤＮＡ分子を、当分野で周知の方法によって任意の発現カセットに挿入する。これらの発現カセットは、後記の植物形質転換ベクターに容易に移入することができる。さらに本発明は、ＤＮＡ分子の発現のために要されまたは選択される任意のさらなる配列と組み合わせて任意の発現可能プロモーターを使用することを含む。そのような配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外来配列を含むがこれらに限定されない(例えば、イントロン[例えば、Ａｄｈイントロン１]、ウイルス性配列[例えばＴＭＶ−Ω]）。
【００６１】
構成的発現：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、公開された特許出願ＥＰ０３９２２２５に記載されている。ｐＣＧＮ１７６１は「ダブル」３５Ｓプロモーターおよびｔｍｌ転写ターミネーターを含み、プロモーターおよびターミネーターの間に特異的ＥｃｏＲＩ部位を有しており、ｐＵＣ−タイプバックボーンを有する。存在するＥｃｏＲＩ部位に加えＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位を含む修飾されたポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の誘導体を構築する。この誘導体をｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと命名する。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸはトランスジェニック植物での３５Ｓプロモーターの制御の下での発現のためのポリリンカー内のｃＤＮＡ配列または遺伝子配列（微生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。そのような構築物の完全な３５Ｓプロモーター−遺伝子配列−ｔｍｌターミネーターカセットを、プロモーターの５’側のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、およびＸｂａＩ部位で、ターミネーターの３’側のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩ部位で、形質転換ベクターへ送達するため切除することができる。さらにダブル３５Ｓプロモーター断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩまたはＰｓｔＩでの５’切除、および任意のポリリンカー制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩ）での３’切除によって、他のプロモーターと置き換えるために除去することができる。
したがって、本発明のＤＮＡ分子を、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御の下での構成的発現のために挿入することができる。
【００６２】
化学的に調節可能なプロモーターの下での発現
この節はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを任意の選択されたプロモーターで置換えることについて記載する。例証として化学的に調節されるＰＲ−１ａプロモーターを記載する。選択されたプロモーターを好ましくはそのソースから制限酵素によって切除するが、あるいは適当な末端制限部位を有するプライマーを使用してＰＣＲ−増幅することができる。もしＰＣＲ−増幅を実施するならば、プロモーターは標的ベクター中の増幅されたプロモーターのクローニングの後、増幅エラーを確認するために再配列決定するべきである。化学的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターをプラスミドｐＣＩＢ１００４（ＥＰ０３３２１０４参照）から切断し、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに送達する。ｐＣＩＢ１００４をＮｃｏＩで切断し、得られた線状断片の３’オーバーハングをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端化する。次に、その断片をＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、得られたＰＲ−１ａプロモーターを含む断片をゲル精製し、ダブル３５Ｓプロモーターを除去されたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにクローニングする。これを、ＸｈｏＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、続いてＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＣＩＢ１００４プロモーター断片がクローニングされるべきより大きなベクターターミネーターを含む断片を単離することによって実施する。これにより、ＰＲ−１ａプロモーターおよびｔｍｌターミネーター、並びに特有のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位を有する介在しているポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体を作成する。
本発明のＤＮＡ分子をこのベクターに挿入し、融合産物（すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター）をその後、本出願に記載されたものを含む任意の選択された形質転換ベクターに送達する。そしてそのＤＮＡ分子の化学的に誘導可能発現を実現する。
【００６３】
構成的発現:アクチンプロモーター
アクチンのいくつかのイソフォームは、ほとんどの細胞型中で発現され、結果的に、構成的プロモーターとしてアクチンプロモーターを選択するのがよいと知られている。特にイネＡｃｔ１遺伝子からのプロモーターはクローニングされ、特性が把握されている(McElroy et al.Plant Cell 2:163-171(1990))。そのプロモーターの１．３ｋｂの断片は、イネプロトプラスト中の発現に要求されるすべての調節エレメントを含んでいることが発見されている。さらにＡｃｔ１プロモーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉植物における使用のために構築されてきた(McElroy et al.Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。これらはＡｃｔ−イントロン１、Ａｄｈ１ ５’フランキング配列、およびＡｄｈ１−イントロン１（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）およびＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターからの配列を含む。最高の発現を示すベクターは、３５ＳおよびＡｃｔ１イントロンまたはＡｃｔ１ ５’フランキング配列およびＡｃｔ１イントロンの融合物である。McElroy et al.(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))によって記載されたプロモーター発現カセットを、本発明のＤＮＡ分子の発現のために容易に修飾することができ、単子葉植物宿主における使用に特に好適である。例えばプロモーターを含む断片をＭｃＥｌｒｏｙの構築物から取り外して使用し、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを置き換えることができ、それは挿入または特定の遺伝子配列のために利用可能である。こうして構築した融合遺伝子を、その後適当な形質転換ベクターに送達することができる。別の報告では、第１のイントロンを有するイネＡｃｔ１プロモーターが培養オオムギ細胞中で高度の発現をディレクトすることも発見された(Chibbar et al.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。
本発明のＤＮＡ分子をそのようなプロモーターの下流に挿入し、続いて、融合産物(すなわちプロモーター-遺伝子−ターミネーター)を任意の選択された、本明細書に記載されているものを含む、形質転換ベクターに送達する。
【００６４】
構成的発現:ユビキチンプロモーター
ユビキチンは多くの細胞型中に蓄積すると知られているもう一つの遺伝子産物であり、そのプロモーターはいくつかの種からトランスジェニック植物における使用のためにクローニングされてきた(例えばヒマワリ−Binet et al.Plant Science 79:87-94(1991)、トウモロコシ−Christensen et al.Plant Molec.Biol.12:619-632(1989))。トウモロコシユビキチンプロモーターはトランスジェニック単子葉系で開発されており、その配列および単子葉植物の形質転換のために構築されたベクターは特許出願ＥＰ０３４２９２６に公開された。さらに、Taylor et al.(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))はトウモロコシユビキチンプロモーターおよび第１のイントロンを含むベクター（ｐＡＨＣ２５）、およびマイクロプロジェクタイルボンバードにより導入されたときの多くの単子葉植物の細胞懸濁物中でのその高い活性について記載している。そのユビキチンプロモーターはトランスジェニック植物、特に単子葉植物中でのＤＮＡ分子の発現に特に好適である。適当なベクターは、適当なユビキチンプロモーターおよび／またはイントロン配列の導入によって修飾された、ｐＡＨＣ２５の誘導体または本明細書中に記載された任意の形質転換ベクターである。
したがって、本発明のＤＮＡ分子を任意のこれらのベクターに挿入し、融合産物（すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター）を植物の形質転換に使用して、ＤＮＡ分子を構成的に発現させる。
【００６５】
根特異的発現
本発明のＤＮＡ分子に好ましい発現のパターンは根での発現である。根組織のみでのヌクレオチド配列の発現は、葉および花組織並びに種子での発現を変化させることなく、根のみで標的遺伝子の発現を変化させる利点がある。適当な根プロモーターは、de Framond(FEBS 290:103-106(1991))によって、また公開された特許出願ＥＰ０４５２２６９において記載されたようなものである。このプロモーターをｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのような適当なベクターに送達し、ＤＮＡ分子をそのようなベクターに挿入する。その完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットをその後、所望の形質転換ベクターへ送達する。
【００６６】
傷誘導可能プロモーター
多くのそのようなプロモーターが記載され(例えばXu et al.Plant Molec.Biol.22:573-588(1993)、Logemann et al.Plant Cell 1:151-158(1989)。Rohrmeier&Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant Molec.Biol.22:129-142(1993)、Warner et al.Plant J.3:191-201(1993))、すべて本発明での使用に好適である。Logemann et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモｗｕｎ１遺伝子の５’上流配列を記載している。Xu et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモ（ｐｉｎ２）からの傷誘導可能プロモーターは単子葉植物イネでも活性があることを記載している。さらにRohrmeier&Lehle(前掲)は傷に誘導され、標準的な技術を使用してコグネイトプロモーターを単離するのに使用可能であるトウモロコシWip1 cＤＮＡのクローニングを記載している。同様にFirek et al.(前掲)およびWarner(前掲)は、局部的傷および病原体侵入部位で発現される、単子葉植物Asparagus officinalisからの傷誘導可能遺伝子を記載している。当技術分野で周知のクローニング技術を使用して、これらのプロモーターを適当なベクターに送達し、本発明のＤＮＡ分子と融合し、これらの遺伝子を害虫感染の部位で発現させるために使用することができる。
【００６７】
髄における好ましい発現
特許出願ＷＯ９３／０７２７８は、髄細胞で選択的に発現されているトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の単離を記載している。標準的な分子生物学的な技術を使用して、このプロモーターまたはその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに送達することができ、３５Ｓプロモーターを置き換え、髄に好ましいように本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用することができる。実際、髄に好ましいプロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トランスジェニック植物における便宜のために修飾する。ＤＮＡ分子の髄に好ましい発現を、そのようなベクター中のＤＮＡ分子に挿入することによって達成する。
【００６８】
花粉特異的発現
特許出願ＷＯ９３／９７２７８は、花粉細胞で発現されているトウモロコシカルシウム依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＰＫ）遺伝子の単離をさらに記載している。その遺伝子配列およびプロモーターは転写開始から１４００ｂｐにわたる。標準的な分子生物学的技術を使用して、プロモーターまたはその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに送達し、３５Ｓプロモーターを置き換え、花粉特異的な方法で本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用する。実際、花粉特異的プロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トランスジェニック植物における便宜のために修飾することができる。
葉特異的発現
ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードしているトウモロコシ遺伝子が、Hudspeth&Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって記載された。標準的な分子生物学的な技術を使用して、この遺伝子のためのプロモーターを使用し、トランスジェニック植物における葉特異的方法で、本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動する。
【実施例６】
【００６９】
実施例６：植物形質転換ベクターの構築
多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明のＤＮＡ分子を前述の任意の発現カセットに挿入し、適当な条件の下で望まれる細胞中でＤＮＡ分子を発現させることができる。ヌクレオチド配列を含む発現カセットを、任意の後記の適当な形質転換ベクターに組み込む。使用のためのベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種による。ある標的種では、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチン的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子(Messing & Vieria, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature 304:183-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するｂａｒ遺伝子(White et al.,Nucl Acids Res 18:1062(1990)、Spencer et al.Theor Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochiger&Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2929-2931)、およびメタトレキセート(methatrexate)に対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis and Jarry.,EMBO J.2(7):1099-1104(1983))を含む。
【００７０】
アグロバクテリウム形質転換に好適なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に多くベクターが利用可能である。典型的にはこれらは少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、ｐＢＩＮ１９(Bevan,Nucl.Acids Res.(1984))およびｐＶｉｃｔｏｒ ＨＩＮＫ（配列番号５）のようなベクターを含む。以下に２種の典型的なベクターの構築を記載する。
ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築
バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１をアグロバクテリウムでの使用のための組換えベクターの構築に使用し、以下のような方法で構築する。ｐＴＪＳ７５ｋａｎを、ｐＴＪＳ７５(Schmidhauser&Helinski,J Bacteriol.164:446-455(1985))をＮａｒＩによって消化し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を切除し、続いてＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩ断片を挿入して作成する(Messing & Vieira, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。ＸｈｏＩリンカーを、レフトおよびライトT-ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含むｐＣＩＢ７(Rothstein et al.,Gene 53:153-161(1987))のＥｃｏＲＶ断片にライゲートし、ＸｈｏＩ−消化された断片をＳａｌＩ−消化されたｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローニングし、ｐＣＩＢ２００を作成する（ＥＰ０３３２１０４参照）。ｐＣＩＢ２００は以下の特有なポリリンカー制限部位：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｌＩを含む。ｐＣＩＢ２００１はさらなる制限部位のポリリンカーへの挿入により作成されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおける特有の制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩ、およびＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１は、これらの特有の制限部位を含むことに加えて、植物およびバクテリアのカナマイシン選択、アグロバクテリウム−仲介形質転換のためのレフトおよびライトＴ−ＤＮＡボーダー、ＲＫ２由来のＥ．ｃｏｌｉおよび他の宿主間の移動のためのｔｒｆＡ機能、並びにＲＫ２からのＯｒｉＴおよびＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーはこれらの自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。本発明のＤＮＡ分子を含む前記した植物発現カセットのいずれかを、ｐＣＩＢ２００１に好ましくはポリリンカーを使用して挿入する。
【００７１】
ｐＣＩＢ１０の構築およびその誘導体のハイグロマイシン選択
バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子、Ｔ−ＤＮＡライトおよびレフトボーダー配列を含んでおり、広宿主−範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組み入れており、Ｅ．ｃｏｌｉおよびアグロバクテリウム双方で複製することが可能である。その構築はRothstein et al.(Gene53:153-161(1987))によって記載されている。Gritz et al.(Gene25:179-188(1983))によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの遺伝子を組み入れている種々のｐＣＩＢ１０の誘導体が構築されてきた。これらの誘導体によってハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、またはハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）によるトランスジェニック植物細胞の選択が可能となる。このベクターを使用して本発明のＤＮＡ分子を含む発現カセットを形質転換する。
【００７２】
非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換によって、選択された形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性が回避され、結果的にこれらの配列を欠いたベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む前述のもののようなベクターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技術は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み（例えばＰＥＧおよびエレクトロポレーション）、マイクロインジェクションまたは花粉形質転換（米国特許５６２９１８３）による形質転換を含む。ベクターの選択については、多くは形質転換される種にとって好ましいように選択する。以下にある典型的なベクターの構築を記載する。
【００７３】
ｐＣＩＢ３０６４の構築
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（またはホスヒノトリシン）による選択と組み合わされた直接的遺伝子導入法に適当なｐＵＣ−由来ベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６はＥ．ｃｏｌｉ ＧＵＳ遺伝子に実施可能なように融合したＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ ３５Ｓ転写ターミネーターを含み、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’位に２個のＡＴＧ配列を含む。これらの部位を、標準的ＰＣＲ法を使用して変異させ、ＡＴＧを除去し、制限部位ＳｓｐＩおよびＰｖｕＩＩを作成する。新しい制限部位は特有のＳａｌＩ部位から９６および３７ｂｐ離れており、真の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れている。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名する。そしてｐＣＩＢ３０２５からＳａｌＩおよびＳａｃＩでの消化によってＧＵＳ遺伝子を切除し、平滑末端化してライゲートし、プラスミドｐＣＩＢ３０６０を作成する。プラスミドｐＪＩＴ８２をJohn Innes Centre,Norwichより入手し、Streptomyces viridochromogenesからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのＳｍａＩ断片を切除し、ｐＣＩＢ３０６０(Thompson et al.EMBO J 6:2519-2523(1987))のＨｐａＩ部位に挿入する。この作成したｐＣＩＢ３０６４は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御の下での除草剤選択のためのｂａｒ遺伝子、アンピシリン抵抗性の遺伝子(E.coliにおける選択のため)および特有の部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを有するポリリンカーを含む。このベクターは本発明のＤＮＡ分子の発現をディレクトするそれ自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。
【００７４】
ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築
ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてE.coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲを使用して、３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ遺伝子からのイントロン６（〜５５０ｂｐ）およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅する。E.coliジヒドロ葉酸レダクターゼタイプＩＩ遺伝子をコードしている２５０ｂｐの断片をＰＣＲによって増幅し、これらの２種のＰＣＲ断片を、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１(Clontech)からのＳａｃＩ-ＰｓｔＩ断片と構築する。これらの断片の構築によって、イントロン6配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと融合された３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９を作成する。ｐＳＯＧ１９のＧＵＳリーダーを、トウモロコシ退録斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列と置換してベクターｐＳＯＧ３５を作成する。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン抵抗性のｐＵＣ遺伝子を有しており、外来配列、特に本発明のＤＮＡ分子のクローニングに利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する。
【実施例７】
【００７５】
実施例７：葉緑体形質転換
形質転換ベクター
本発明のＤＮＡ分子の植物色素体での発現のために、色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、実施例３６）を使用する。ＤＮＡ分子を、ｐＰＨ１４３に挿入し、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列を置換する。次にこのベクターを色素体形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性についての形質転換体の選択のために使用する。あるいは、ＤＮＡ分子をｐＰＨ１４３に挿入し、ａａｄＨ遺伝子を置換する。この場合、形質転換体を、ＰＲＯＴＯＸ阻害剤に対する抵抗性について選択する。
葉緑体形質転換
タバコNicotiana tawbacum c.v.「Xanthi nc」の種子をプレート当たり７粒、1’’の環状に並べてＴアガー培地上に発芽させる。播種１２−１４日後に、詳細に記載されたプラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５(Svab, Z. and Maliga, P.(1993)PNAS 90, 913-917)からのＤＮＡでコートした１μｍタングステン粒子(M10, Biorad, Hercules, CA)でボンバードする。ボンバードした苗を、Ｔ培地上で２日インキュベートし、その後葉を切除し、背軸側を上にして明光（３５０−５００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）中で、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンジヒドロクロリド(Sigma, St. Louis,MO)を含むＰＭＯＰ培地(Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P.(1990)PNAS 87, 8526-8530)のプレート上に置く。ボンバードメントの３ないし８週間後に下方に白化した葉を示す抵抗性シュートを、同じ選択培地上にサブクローニングしカルスを形成させ、二次的シュートを単離しサブクローニングする。独立したサブクローンにおける形質転換した色素体ゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティ）を、サザンブロッティングの標準的な方法によって評価した(Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した総細胞ＤＮＡ(Mettler, I. J. (1987)Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349)を、１％トリスボレート(ＴＢＥ)アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、ｒｐｓ７／１２色素体ターゲッティング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片に対応する、３２Ｐ標識したランダムプライマーＤＮＡ配列で探索した。ホモプラスミックなシュートをスペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地(McBride, K. E. et al.(1994)PNAS 91, 7301-7305)上で無菌的に発根させ、グリーンハウスに移す。
【実施例８】
【００７６】
実施例８：ＰｏｌＣプロモーターによって駆動されるＢＷＹＶからのコートタンパク質遺伝子についてのセンスおよびアンチセンスデュプレックスＲＮＡ断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築
ビート西部萎黄病ウイルス(ＢＷＹＶ)（いわゆるウイルスイエロー)コートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の０．６Ｋｂの「センス」配向断片をプライマーＨｉＮＫ０２５ｂｉｓ（５’−ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ−３’、配列番号６；ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２６（５’−ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ−３’、配列番号７；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）を使用してプラスミドｐＺＵ０４６から増幅する。あるいは、断片をプラスミドｐＢＷ１７(Veidt et al, Nucleic Acids Research 16: 9917-9932, 1988; accession number X13063)から、プライマーＨｉＮＫ０２５ｂｉｓ２（５’− ＡＡＴ ＣＧＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ−３’、配列番号８；ヌクレオチド３４７５ないし３４９８、ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２６ｂｉｓ（５’−ＣＴＡ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ−３’配列番号９、ヌクレオチド４１１４ないし４０８５、ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を、製造者の規定にしたがって２５μｌ反応中で使用し、３０サイクルの９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／９０秒（＋２秒／サイクル）を適用する。得られたＰＣＲ断片を、Seakem GTG アガロース(FMC)から作成した１％トリスアセテートゲルでの電気泳動、続いてＰＣＲ産物を含むゲルスライスからＱＩＡｑｕｉｃｋゲルエキストラクションキット(QIAGEN)での抽出によって精製する。その後、標準的方法にしたがってＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ（すべての制限酵素は、Life Technologiesから入手）で消化し、再びゲル精製した。精製した断片を、ＲｏｌＣプロモーターおよびＮｏｓターミネーターの間にＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用してライゲートする。得られたクローンをｐＨｉＮＫ１３８と命名する。
【００７７】
前記と同様な方法で、１．４Ｋｂ「アンチセンス」配向ＢＷＹＶ ＣＰ断片を、プラスミドｐＺＵ１７４ＡからプライマーＨｉＮＫ２５１（５’― ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＧ ＣＣＣ Ａ―３’、配列番号１０；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２８（５’―ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＧ―３’、配列番号１１；ＮｓｉＩ制限部位に下線を付する）を使用して、あるいは、プラスミドｐＢＷ１７からプライマーＨｉＮＫ２５１（ヌクレオチド４８４４ないし４８１４）およびＨｉＮＫ２２８ｂｉｓ（５’−ＣＧＴ ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＧ−３’、配列番号１２；ヌクレオチド３４７８ないし３５０３、ＮｓｉＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ゲル精製して、ＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで消化する。４．９Ｋｂ プラスミドｐＨｉＮＫ１３８をＰｓｔＩで線形化し、熱感受性アルカリフォスファターゼ(Life Technologies)を使用して脱リン酸化する。ベクターおよびＰＣＲ断片をゲル精製し、続いてｐＨｉＮＫ１３８にＰＣＲ断片を双方向ライゲーションする。ＣＰ遺伝子（配列番号１３）についてのデュプレックスＲＮＡを生ずる配向を制限部位分析によって決定し、それは、逆方向の繰り返しがＣＰ遺伝子の下流のＢＷＹＶゲノムに由来する０．７Ｋｂスペーサー配列（ＯＲＦ６という）によって分離されている０．６Ｋｂ ＣＰ遺伝子からなるｐＨｉＮＫ１５２を生じた。スペーサー配列はアンチセンス配向である。最終的に、当該遺伝子カセットを、選択マーカー遺伝子としてホスホマンノースイソメラーゼを有する特許のバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627)に送達し、ｐＨｉＮＫ１７９を得る。
【実施例９】
【００７８】
実施例９．１：アラビドプシスＵｂｉ３ｉｎｔプロモーターによって駆動される、ＢＮＹＶＶからのレプリカーゼ遺伝子についてのセンスおよびアンチセンス（デュプレックス）ＲＮＡ断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築
総ＲＮＡをビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）フロウイルスに感染したシュガービート根から、QIAGENのRNAeasy Plantミニキットを使用して抽出する。ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子（ＲＮＡ１）の３’末端を増幅するために、ＲＮＡを、Superscript（商標）II RNAse H-Reverse Transcriptase(RT)(Life Technologies)および逆プライマーＨｉＮＫ２８５（５’−ＴＣＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＡＧ Ａ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＣ−３’、配列番号１４）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを生成する。プライマーＨｉＮＫ２８５は、ＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１配列(accession number D00115)のヌクレオチド６３７８および６４０５の間に位置し、ＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計されている。次に、ＲＴ反応を使用して２種類のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用する：
ＢａｍＨＩ部位を導入するよう設計されたＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５１６８ｂｐおよび５１７８ｂｐの間に位置するプライマーＨｉＮＫ２８３（５’―ＡＡＧ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＣ―３’配列番号１５）、およびＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計されたＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５５９７および５６２０の間に位置するプライマーＨｉＮＫ２８４（５’−ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＣ Ａ―３’、配列番号１６）を使用する反応Ａ。
プライマーＨｉＮＫ２８３をプライマーＨｉＮＫ２８５と組み合わせて使用する反応Ｂ。両者は前記した。
【００７９】
こうして得られたＲＴ−ＰＣＲ産物は、将来のＲＮＡデュプレックスを構成するヌクレオチド５１６８−５６２０の間にＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１配列を有する。将来のスペーサー配列は、プライマーＨｉＮＫ２８３およびＨｉＮＫ２８５で得られるＲＴ−ＰＣＲ産物に存在するＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５６２１−６４０５ｂｐに対応する。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を製造者の規定にしたがって２５μｌ反応中で使用し、９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／９０秒（＋２秒／サイクル）の３０サイクルを適用する。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を、Seakem GTG アガロース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いてQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)による増幅産物を含むゲルスライスの抽出によって精製する。ゲル精製の後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ(life Technologies)によって標準的方法にしたがって消化し、前記のように精製する。
最終的に、ＲＴ−ＰＣＲ産物をアラビドプシスユビキチン３(Ubo3int)プロモーターおよびＮｏｓターミネーターの間にＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用する３段階のライゲーション反応によってクローニングする。２種類の得られたクローンを、ｐＨｉＮＫ１８１（アンチセンス配向のスペーサー、配列番号１７参照）およびｐＨｉＮＫ１８４（センス配向のスペーサー、配列番号１８参照）と称する。
【００８０】
シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換のためのバイナリーベクターを構築するために、選択マーカーとしてホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を有するバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627)、並びにプラスミドｐＨｉＮＫ１８１およびｐＨｉＮＫ１８４からのＤＮＡを、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ(New England Biolabs)によって消化し、ベクターおよび挿入断片を前記のように電気泳動で精製する。得られた７．７ｋｂ ｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫベクター断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用して、ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子のデュプレックスＲＮＡをコードしている遺伝子カセットにライゲートし、それぞれｐＨｉＮＫ１８７（アンチセンススペーサー）およびｐＨｉＮＫ１８８（センススペーサー）を得る。
【００８１】
実施例９．２：シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換
植物種のアグロバクテリウム仲介形質転換法はよく確立され当業者に既知であり、外植体型、アグロバクテリウム株、または使用される選択マーカーおよび再生系によって変化してもよい。ここで以下のプロトコールには、外植体のソースとして子葉、選択マーカー遺伝子としてマンノース−６−フォスフェートイソメラーゼを使用するシュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換を記載する(Joersbo et al, Molecular Breeding 4: 111-117, 1998)。表面殺菌したシュガービート種子をウォーターアガー上に弱光下で約１２℃の温度で発芽させる。十分に展開した子葉を、節領域のすぐ下方で横断的に切断することによって苗から切除し、両方の子葉をやさしく引っ張り切裂く。子葉外植体を、２０ｇ／ｌスクロース、０．２５ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５００μＭ アセトシリンゴンを補足したＭＳ培地ｐＨ５．２に希釈した適当な形質転換ベクターを有するアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１の最適密度（ＯＤ６００）０．１ないし０．３に希釈した懸濁液に子葉を浸すことによって接種する。インキュベーションの5分後、外植体をアグロバクテリウム懸濁液から移動し、無菌濾紙に浸し、接種懸濁液の接触を除去し、共培養プレート上に移す。共培養プレートは、３０ｇ／ｌ スクロース、２００μＭ アセトシリンゴンを含み、４．７ｇ／ｌ アガロースで固めた１／１０ＭＳ培地ｐＨ５．７を含み、固めた培地の上に１．５ｍｌ ＴＸＤ培地（ＰＧＯビタミン、０．００５ｍｇ／ｌ カイネチン、４ｍｇ／ｌ ＣＰＡ（ｐ−クロロフェノキシ酢酸）、３０ｇ／ｌ スクロースで補足したＭＳ塩、ｐＨ５．７）で湿らせた濾紙で覆ったペトリ皿からなる。外植体を弱光下２１℃で４日間共培養し、次に２０ｇ／ｌ スクロース、１．２５ｇ／ｌ マンノース、０．２５ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリンで補足し９ｇ／ｌ アガーで固めたＭＳ培地ｐＨ５．９からなる選択再生培地に移す。３週間ごとに、外植体を次第にマンノースの濃度を最大１５ｇ／ｌまで増加させる新しい培地に継代培養する。２１℃の１２週間の選択および再生の後、再生したシュートを収穫し、発根させ、Feramisco and co-workers(Feramisco et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641. 1973)に記載された共役酵素反応に本質的にしたがってＰＭＩ活性を分析する。陽性の植物を土でポット植えして、最終的にグリーンハウスに移す。
【００８２】
実施例９．３：rhizomaniaに対する抵抗性のスクリーニング
土に播種またはポット植えして、苗またはＴ０形質転換体を、ＢＮＹＶＶを有するPolymyxa betaeが蔓延している土壌に移植する前に、最初に約４週間の期間、根系を十分に発達させる。蔓延した土壌をドイツのrhizomania汚染圃場から収集する。抵抗性検定の間、植物を１２ｃｍポットで約２１℃、１６時間明期で成長させる。蔓延した土壌への移植の４週間後、植物を土壌から抜き取り、根系の底半分を固着した泥から水洗して除去する。０．５ｇの根組織の無作為サンプルからの液汁を、Pollaehne pressの方法で収集し、２％ ＰＶＰおよび０．２％ 卵白アルブミンで補足したリン酸バッファー塩水ｐＨ７．２からなる１０ｍｌの抽出バッファーに添加する。サンプル中の存在ウイルスの量を、ＢＮＹＶＶのためのトリプル抗体サンドイッチ（ＴＡＳ）ＥＬＩＳＡ(Adgen Ltd, Scotland, UKから入手可能、供給者の指示に本質的に従う）で決定する。標準曲線を各プレートについて作成し、根サンプルのウイルス含量を測定した吸光値から算出する。非形質転換感受性シュガービート植物を否定的なコントロールとして使用し、自然のrhizomania抵抗性のためのＣ２８遺伝子を有する植物を肯定的なコントロールとする。表１は、プラスミドｐHINK１８８で得られた形質転換事象の結果の要約である。
【表１】
【表２】
【実施例１０】
【００８３】
実施例１０：メロンにおけるズッキーニ黄化モザイクポティウイルス（ＺＹＭＶ）およびパパイヤリングスポットポティウイルス（ＰＲＳＶ）抵抗性のための植物形質転換ベクターの構築：
ＮＯＳターミネーター(Beven, M., et al, 1983 Nucleic Acids Res. 11(2), 369-385)を２６０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｉｓｔＩ断片としてＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩで消化してプラスミドｐＺＯ１５６０にクローニングする。ＰＺＯ１５６０は、多数のクローニング部位より有用なものと置換されたｐＵＣ由来プラスミドである。ＮＯＳターミネーターの挿入の後、新しい構築物をｐＺＵ５５３と命名する。
１７２８ｂｐ Ｕｂｉ３プロモーター／イントロン断片(Callis, J., et al, (1995 Genetics 139(2), 921-939)をＢａｍＨＩで消化、次にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理およびＫｐｎＩ消化によって単離する。この断片をｐＺＵ５５３にクローニングし、ＳｍａＩで消化する。新しい構築物をｐＺＵ６１５と命名する。
【００８４】
ｐＺＵ６１５に挿入されるべきさらなるＤＮＡ断片を、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって最初に増幅し、得られたＰＣＲ断片をpBluescript SK＋にクローニングする。５１３ｂｐアクチン２イントロンＬ（リーダーイントロン）断片を増幅するために、２種のプライマーをAn et al, The Plant Journal: 10: 107-121, 1996からの配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６３：５’−ＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧ−３’、配列番号１９）は５’スプライシング部位の上流に直接アニーリングし、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩおよびＳａｃＩＩ制限部位を増幅されるべきアクチン２イントロンＬ断片の５’末端に付加する。３’プライマー（ＺＵＰ１５６４：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣ―３’、配列番号２０）は３’スプライシング部位の下流に直接アニーリングし、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩ制限部位を増幅されるべきアクチン２イントロンＬ断片の３’末端に付加する。ＰＣＲ断片をＺＵＰ１５６３および１５６４によって増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１１と命名する。プラスミドｐＺＵ６１５にＡｃｔ２イントロンＬを供給するために、４９９ｂｐ ＢａｍＨ／ＮｃｏＩ Ａｃｔ２イントロンＬ断片をｐＺＵ６１１から単離し、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＺＵ６１５のＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流およびＮＯＳターミネーターの上流にクローニングする。新しい構築物をｐＺＵ６１６と命名する。この断片の挿入は、同時に、次の３段階のクローニングのためのさらなる制限部位をカセットに提供する。
【００８５】
非翻訳（ｎｔ）７３９ｂｐ ＰＲＳＶ ＣＰ断片(Shyi-Dong, Y., et al,(1992).Journal of General Virology 73, 2531-2541)を増幅するために、二種のプライマーをShyi-Dong Yehからのフランスの圃場の分離株の配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６５：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧ―３’、配列番号２１）はＰＲＳＶ ＣＰの開始コドンの２８５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＰＲＳＶ ＣＰ断片の５’末端にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を付加する。３’プライマー（ＺＵＰ１５６６：５’―ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＴＡＣＣ―３’、配列番号２２）は、ＰＲＳＶ ＣＰの停止コドンの５５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＰＲＳＶ ＣＰ断片の３’末端にＮｈｅＩ制限部位を付加する。増幅したＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、新しいプラスミドをｐＺＵ６１２と命名する。
【００８６】
７３５ｂｐ非翻訳ＺＹＭＶ ＣＰ断片(Gal-On, A., et al,(1990. Gene 87, 273-277)を増幅するために、２種のプライマーをGal-On, A.からのフランス圃場分離株の配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６７：５’―ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＣＣＧＧ―３’、配列番号２３）はＺＹＭＶ ＣＰの開始コドンの２５３ｂｐ下流にアニーリングし、ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片の５’末端にＮｈｅＩ制限部位を含む。３’プライマー（ＺＵＰ１５６８：５’―ＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣ―３’、配列番号２４）は、ＺＹＭＶ ＣＰ停止コドンの８９ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＺＹＭＶ ＣＰ断片の３’末端にＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。増幅したＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１３と命名する。ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片を次に、ｐＺＵ６１６にＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流でＡｃｔ２イントロンLの上流にクローニングする。この目的のために、７１９ｂｐ ＮｈｅＩ／ＳａｃｌＩ ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１３から単離し、ｐＺＵ６１６のＮｈｅＩおよびＳａｃｌＩ部位にクローニングする。この構築物をｐＺＵ６１７と命名する。次に、ＰＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１７にＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流でＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片の上流にクローニングする。この目的のために７２０ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ ｐＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１２から単離し、ｐＺＵ６１７のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングする。この新しい構築物をｐＺＵ６１８と命名する。
【００８７】
遺伝子カセットを完成するためにクローンニングすべき最後の断片は、ＰＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片および同じ配向でその下流にＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片を含む。対応する断片をテンプレートとしてｐＺＵ６１８からＰｆｘ ＰＣＲ並びにプライマーＺＵＰ１５６５およびＺＵＰ１５６８を使用して増幅する。このＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、得られたプラスミドをｐＺＵ６１９と命名する。
逆方向反復遺伝子カセットを構築するためにＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片を、ｐＺＵ６１８プラスミドにすでに存在するＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片と逆方向にｐＺＵ６１８に挿入する。この目的のために１４４５ｂｐ ＳａｌＩ／ＮｃｏＩ ＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片をｐＺＵ６１９から単離し、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＺＵ６１８にＡｃｔ２イントロンＬの下流でＮＯＳターミネーターの上流にクローニングする。得られたプラスミドをｐＺＵ６２２と命名する。当該カセットをバイナリーベクターｐＺＵ５４７、ＳＭＡＳプロモーター／ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットをさらに含むプラスミドｐＶｉｃｔｏｒＨｉｎｋに由来するバイナリーベクターに挿入する。この末端に逆方向反復遺伝子カセットを含む５４１４ｂｐ ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ ＤＮＡ断片をｐＺＵ６２２から単離し、ｐＺＵ５４７のＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位にタンデム配向で選択カセットの上流にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ６２３（配列番号２５）と命名する。
【実施例１１】
【００８８】
実施例１１：トマトにおけるジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）のための植物形質転換ベクターの構築
R.A.A. van der Vlugtの論文「Engineering resistance against potato virus Y」(1993)に公開されたＰＶＹｎ（ＰＶＹのフランス圃場分離株）の配列に基づいて、２種のプライマー（ＺＵＰ１５９８：５’―ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＧＴＣ―３’、配列番号２６、およびＺＵＰ１５９０：５’― ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧ―３’、配列番号２７）を使用して、標準的ＰＣＲによって、Life TechnologiesからのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを使用して、コートタンパク質シストロン配列および９９ヌクレオチドの３’末端非翻訳領域を含む８０４ｂｐ断片を増幅する。増幅したＰＣＲ断片を平滑末端断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｐＺＵＡと命名する。増幅したＰＶＹ特異的挿入物をＢａｍＨＩ／ＳａｃｌＩ断片として切除し、ｐＺＵ６１６のＢａｍＨＩ／ＳａｃｌＩ部位にクローニングし（実施例１０参照）、ｐＺＵＢを得る。ＰＺＵＢおよびｐＺＵＣの両方をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化する。ｐＺＵＡからのＰＶＹ特異的断片をアガロースゲルから精製し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したｐＺＵＢにライゲートし、以下のエレメントを含むｐＺＵＣを得る：
イントロンを有するＵＢＩ３プロモーター、続いてＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ断片トしてのセンス配向のＰＶＹ ＰＣＲ産物、続いてＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ ＡＣＴ２イントロン、続いてＳａＩＩ／ＮｃｏＩ断片としてのアンチセンス配向のＰＶＹ ＰＣＲ産物、さらに最後にＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてのｎｏｓターミネーター。最終的にｐＺＵＣを、ｐＨｉＮＫ０８５バイナリーベクター由来のＳＭＡＳプロモーター／ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットを含むバイナリーベクターｐＺＵ５４７にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ６３４（配列番号２８）と命名する。
【実施例１２】
【００８９】
実施例１２：メロンおよびトマト植物材料へのバイナリーベクターの形質転換
植物材料へのバイナリーベクターの送達方法は確立され当業者に既知である。その方法を、例えば、使用するアグロバクテリウム株の相違、外植体材料の起源の相違、再生系の相違、および形質転換されるべき植物種の品種の相違によって変える。前記実施例１０および１１のバイナリー植物形質転換ベクターを、後記手段にしたがって形質転換実験に使用する。バイナリーベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスに送達し、続いて植物外植体材料と形質転換したアグロバクテリウム株を接種、共培養し、適当な抗生物質を使用してアグロバクテリウム株を選択的に殺し、マンノースを含む選択培地上で成長させることによって形質転換した細胞を選択し、組織をシュート誘導培地に移し、発根誘導培地に選択したシュートを移し、小植物体を土に移す。前記実施例１０および１１の遺伝子カセットの存在を確認するために、トランスジェニック植物からの全ＤＮＡを周知のサザンブロッティング分析法を使用して分析する。
【実施例１３】
【００９０】
実施例１３：ＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ抵抗性についてのトランジェニックメロン植物のスクリーニング
病原体に感染しないように、形質転換した植物をグリーンハウスで標準的隔離条件で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ、種子を収穫する。
最初の形質転換体のＳ１後代の１００植物を、挿入した遺伝子の分離について分析し、次に機械的接種によってＺＹＭＶで感染させる。ＺＹＭＶで全体に感染した宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに１週齢の苗の子葉および第１葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生をモニターする。ＺＹＭＶ配列を有する植物は、ＺＹＭＶ感染に対する感受性が減少し、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＺＹＭＶ感染を示す。ＺＹＭＶ耐性植物を自殖し、種子を収穫する。トランスジェニックＺＹＭＶ抵抗性植物を、前記の方法にしたがってＰＲＳＶで機械的に接種する。ＺＹＭＶにすでに抵抗性の植物は、ＰＲＳＶ感染に対しても感受性が減少しており、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＰＲＳＶ症状を示す。
【実施例１４】
【００９１】
実施例１４：ＰＶＹに抵抗性のトランスジェニックトマト植物のスクリーニング
形質転換した植物を、病原体の感染を防止するために、標準的隔離条件下でグリーンハウス内で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ種子を収穫する。
最初の形質転換体のＳ１後代の５０植物を、挿入した遺伝子の分離について分析し、次に機械的接種によってＰＶＹで感染させる。ＰＶＹで全身的に感染した宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに５週齢の苗の最初の２枚の十分に伸長した葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生をモニターする。ＰＶＹ配列を有する植物は、ＰＶＹ感染への感受性が減少し、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＰＶＹ症状を示す。
前記の実施態様は例示である。本発明の記載は当業者に本発明の多くの変更を有するものを提供する。自明で予測可能な変更は、すべて添付のクレームに包含することを意図している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子発現を変化させる方法であって、当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する方法、並びに本発明の方法を使用して得られたウイルス遺伝子発現の変化を有する細胞、植物または動物に関する。本発明は特に、ウイルスに抵抗性または耐性のそのような細胞、植物または動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスへの抵抗性または耐性は、大きな関心が寄せられている分野である。ウイルスはほとんどの生物に影響を及ぼす。作物において、収量の大部分がウイルス感染のために失われ得る。家畜は、しばしばウイルスに感染し、重大な経済的な結末を導く病気の蔓延を防止するため、時に屠殺される。コンパニオンアニマルもウイルスに襲われ、最終的にウイルスはヒトに感染し、多くの苦しみをもたらす。ウイルスに対する処置が開発されてきたが、それらはしばしば非常に高コストであるか効果が限定的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞、植物または動物を変更し、特定のウイルス遺伝子の発現を変化させて、当該ウイルスに抵抗性または耐性の細胞、植物または動物を創出することが望ましい。遺伝子の発現を変化させる現行の方法は、通常、センスまたはアンチセンスサプレッションの方法による。不幸なことに、これらの方法は、遺伝子発現を変化させる能力がしばしば変動的で、予測不能であり、多くの場合、特定の遺伝子活性を完全に崩壊させることはできない。
したがって、ウイルス遺伝子の発現を効率的かつ予測可能に変化させ、ウイルスに抵抗性または耐性を有する細胞、植物または動物を得るのを可能にする、長く考えられているが達成されていない、新規方法および組成物の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子の発現を、その遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNA断片を使用して、変化させる方法に関する。このようなセンスおよびアンチセンスRNA断片が二本鎖RNA分子を形成することができるのが重要である。特に、本発明は、細胞、植物または動物に、ウイルスに対する抵抗性または耐性を付与する方法および組成物に関する。好ましくは、本発明は、ウイルスに対する抵抗性または耐性を植物に付与する方法に関する。本発明は、そのような方法を使用して得られた植物細胞、そのような細胞に由来する植物、そのような植物の後代およびそのような植物に由来する種子にも関する。そのような植物細胞または植物において、特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変化は、当業界で既知の現行法を使用して得られた特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変化よりもより有効で、選択的でより予測可能である。
【０００５】
本発明は、
複数のサブ配列、例えばRNA断片またはDNA配列を細胞に導入することを含む方法であって、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAのセンスおよびアンチセンス配列を有し、二本鎖RNA分子を形成することができることを特徴とする方法を提供する。その方法は、好ましくは、細胞に複数のサブ配列からなるRNAを導入することを含み、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAの配列を有することを特徴とする。好ましくは、そのRNAは、３’末端サブ配列の上流に位置する少なくとも1個の翻訳停止コドンを含む。さらなる好ましい実施態様において、その方法は、当該RNAの発現をコードするヌクレオチド配列またはDNA分子を細胞に導入することを含む。
【０００６】
本発明は、
細胞にウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片および当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。好ましい実施態様では、その標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくは、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、2個の異なるRNA分子に含まれる。
【０００７】
さらなる好ましい実施態様では、RNA断片を、当該細胞に導入する前に混合する。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片を当該細胞に導入する前に二本鎖RNA分子を形成することのできる条件で混合する。さらなる好ましい実施態様では、次にそのRNA断片を当該細胞に導入する。さらに好ましい実施態様ではそのRNA断片は1個のRNA分子に含まれる。その場合、そのRNA分子は好ましくはフォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖RNA分子を形成することができる。
【０００８】
本発明は、さらに、
細胞に、当該細胞中でウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片を発現することのできる第１のDNA配列、および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該ウイルス標的遺伝子の当該細胞中での発現が変化する。好ましい実施態様では、標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくはウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞である。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、安定的に植物細胞のゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子は、当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。さらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、２個の異なる、すなわち別のＤＮＡ分子に含まれる。
【０００９】
あるいは、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、１個のＤＮＡ分子に含まれる。この場合、この第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、好ましくは当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれ、このことは、センスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片が１個のＲＮＡ断片に含まれることを意味する。好ましくは、そのＲＮＡ分子はフォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は、二本鎖領域を形成することができる。このようなＲＮＡ分子の例は、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５または配列番号２８の逆方向反復配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、センスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片は、２個のＲＮＡ分子に含まれ、または２個のＲＮＡ分子として発現される。この場合、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、好ましくは双方向性プロモーターに実施可能なように連結され、あるいは、第１のＤＮＡ配列は第１のプロモーターに実施可能なように連結され、第２のＤＮＡ配列は、第２のプロモーターに実施可能なように連結されている。ここで、その第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターまたは異なるプロモーターである。さらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれる。
【００１０】
なおさらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である。この場合、このＤＮＡ分子は、当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターをさらに含む。好ましい実施態様では、このＤＮＡ分子は、当該第１のプロモーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位特異的組換え部位、並びに当該第１のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位をさらに含む。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１および第２の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。さらなる好ましい実施態様では、当該逆方向化の結果、当該第１のプロモーターは、当該第２(または第１、最初にプロモーターに連結されたＤＮＡ配列による)のＤＮＡ配列を発現することができる。その植物細胞は、好ましくは当該部位特異的組換え部位を認識することのできる部位特異的レコンビナーゼをさらに含む。
【００１１】
なおさらなる好ましい実施態様では、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーターをさらに含む。ここで、当該第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターを含むか、または異なるプロモーターを含む。
さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子中のプロモーターは当該細胞の本来のプロモーターを含む。さらに好ましい実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階によって調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。所望により、プロモーターは、そのプロモーターのそれぞれの側のＤＮＡ配列の転写を開始することのできるディバージェントまたは双方向性プロモーターである。
【００１２】
なおさらなる好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ配列の間のリンカーをさらに含む。そのリンカーは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子または調節配列、例えばイントロンプロセシングシグナルを含む例えば発現カセットを含む。
【００１３】
本発明は、本発明のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む細胞をもさらに提供する。ここで、当該細胞内の当該ウイルス標的遺伝子の発現は、当該ＲＮＡ断片によって変化する。好ましい実施態様では、その細胞は、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。本発明は、その植物細胞に由来する植物およびその後代、並びにその植物に由来する種子を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物をも提供する。好ましい実施態様では、そのようなＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウイルスゲノムまたはその一部のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列を含む。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。更なる好ましい実施態様では、当該細胞内の当該ウイルスゲノムまたはその一部の発現が変化する。さらなる好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１または当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。なおさらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーターを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された双方向性プロモーターをさらに含む。
【００１５】
本発明は、下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。
(ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖である。
(ｂ)当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーター。
(ｃ)当該プロモーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位特異的組換え部位。
(ｄ)当該第１または第２のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１および第２の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。
好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
【００１６】
本発明は下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。
(ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖である。
(ｂ)当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーター。
(ｃ)当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーター。
好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
【００１７】
「二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)」分子は、標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および同じ標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を含む。その両者は、互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。それによって、そのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。
「相補的」は、逆位平行(antiparallel)ヌクレオチド配列における相補的塩基残基の間で水素結合を形成することによって互いに対となることのできる逆位平行ヌクレオチド配列を含む２本のヌクレオチド配列をいう。
【００１８】
「逆位平行」は、本明細書では、一方のヌクレオチド配列では５’−３’方向に、他方のヌクレオチド配列では３’−５’方向に渡るホスホジエステル結合を有する相補的塩基残基の間の水素結合により対となった２本のヌクレオチド配列をいう。
「標的遺伝子」は、既知の機能の任意のウイルス遺伝子であるか、その機能が未知であるが全部または一部のヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。標的遺伝子は、細胞の本来の遺伝子であるか、予め細胞に好ましくは遺伝子形質転換またはその細胞のウイルス感染によって導入された異種性の遺伝子である。好ましくは、その標的遺伝子は、植物細胞の遺伝子である。
「本来の」遺伝子とは、形質転換されない細胞のゲノムに存在する遺伝子をいう。
【００１９】
「必須」遺伝子は、タンパク質、例えば、細胞の成長または生存に必須な生合成酵素、レセプター、情報伝達タンパク質、構造遺伝子産物、または輸送タンパク質のようなタンパク質をコードしている遺伝子をいう。
細胞の標的遺伝子の発現の「変化」は、本発明の方法の適用の後、ある細胞内の標的遺伝子の発現レベルが、その方法の適用のない細胞内でのその発現と異なることを意味する。遺伝子発現の変化は、好ましくは、その細胞内での標的遺伝子の発現が減少し、好ましくは大きく減少し、より好ましくはその遺伝子発現が検出不可能となり、細胞またはそれに由来する植物もしくは動物にノックアウト突然変異表現型をもたらすことを意味する。
「単離」は、本発明では、その本来の環境から離れて存在し、したがって天然物ではない人手によって単離された核酸分子である。単離核酸分子は、精製形態で存在してもよく、天然ではない環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞内に存在し得る。
【００２０】
本明細書で使用される「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を適当な宿主細胞にもたらすことができ、終結シグナルに実施可能なように連結される所望のヌクレオチド配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含むことができるＤＮＡ配列を意味する。典型的には、それは、ヌクレオチド配列の正確な翻訳のために必要な配列をも含む。コード領域は、通常、所望のタンパク質をコードするが、所望の機能性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをもセンスまたはアンチセンス配向でコードしてもよい。所望のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラ(少なくとも１個のその構成要素が少なくとも１個の他のその構成要素について異種性である)であってよい。発現カセットは、天然に存在するが異種性の発現のために有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかし、典型的には、発現カセットは、宿主について異種性であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞内に天然に存在せず、宿主細胞または宿主細胞の後代に形質転換事象によって導入されなければならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞がある特定の外部刺激にさらされるときのみ転写を開始させる誘導可能プロモーターの制御下であってよい。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発育段階に特異的であることができる。
【００２１】
本明細書で使用する「異種性の」は、「天然の起源と異なる」を意味するか、非天然状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物、特に他種の生物に由来する核酸配列で形質転換されれば、その核酸配列を有するその宿主細胞について、およびその宿主細胞の子孫についてその核酸配列は異種性である。同様に、異種性とは、同じ天然の、もとの細胞型に由来し、挿入されているが、非天然状態、例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレオチド配列をいう。
【００２２】
本明細書でヌクレオチド配列について使用するとき、「実質的に類似な」の語は、最も広い意味で、引用ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味する。ここで、この対応する配列は、引用ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドとして、実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードする。例えば、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸の変化のみ存在する場合である。望ましくは、その実質的に類似のヌクレオチド配列が、引用ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする。実質的に類似のヌクレオチド配列および引用ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージ（相補的配列内の相補的塩基の数を、相補的配列中の塩基の総数で割る）は、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは８５％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%である。
【００２３】
「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現付与に関係する配列をいう。調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列および終結シグナルに実施可能なように連結されたプロモーターを含む。これらは、典型的には、ヌクレオチド配列の適当な翻訳に要する配列を包含する。
「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物または植物の一部をいう。ここに、挿し木、細胞または組織培養物および種子も含まれる。本発明に使用されるように、「植物組織」の語は、植物体、植物細胞、植物器官、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物、並びに構造および／または機能単位に組織化された植物細胞の任意の群を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
「ウイルス抵抗性または耐性」は、本明細書では、感受性細胞、植物または動物と比較したときに１種またはそれ以上のウイルスに対して感受性ではないか低い感受性である抵抗性または耐性細胞、植物または動物を意味する。例えば、抵抗性または耐性は、ウイルス感染の通常の症状が不存在であるか減少していること、または細胞内のウイルスの蓄積もしくは複製が防止されるか減少していること、または例えば、細胞から細胞へのウイルスの移動が防止されるか減少していることを意味する。
「ウイルスゲノムまたはその一部の発現の変化」は、典型的には、ウイルスまたはその一部もしくはその構成要素、例えば、ウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の蓄積、複製または移動が、細胞内で影響を受けていることと理解される。
【００２５】
本発明は、ウイルス遺伝子の細胞、植物または動物内での発現を調節、すなわち変化させる方法に関する。細胞、植物または動物における遺伝子の発現を調節するために通常利用される方法は、予測可能性に欠け、調節されるべき遺伝子によって変動的である。本発明はこれらの課題を解決し、細胞、植物または動物における遺伝子の再現可能で、効率的な調節を提供する。
発現が調節される遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部である。好ましい実施態様では、細胞は真核細胞、より好ましくは植物細胞、例えば、単子葉植物もしくは双子葉植物細胞、または動物細胞、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコもしくはイヌ、もしくは鳥類からのものである。本発明は、ウイルス標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片を利用し、細胞内の遺伝子の発現を変化させる。第1の実施態様では、本発明は、細胞に標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。そのＲＮＡ断片を、その細胞に種々の形質転換方法、例えば、パーティクルボンバードメントまたはＰＥＧ介在形質転換またはエレクトロポレーションによって導入する。さらなる好ましい実施態様では、他の方法、例えば、ＲＮＡ断片のマイクロインジェクションを使用する。
【００２６】
好ましい実施態様では、ＲＮＡ断片は、2個の異なるＲＮＡ分子に含まれる。この場合、ＲＮＡ断片を当該細胞に導入する前に、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできるような条件下で混合する。さらなる好ましい実施態様では、ＲＮＡ断片を次に当該細胞に導入する。好ましくは、それぞれのＲＮＡ分子の導入の間の時間間隔は短く、好ましくは１時間より短い。なおさらなる実施態様では、ＲＮＡ断片は、1個のＲＮＡ分子に含まれる。単一のＲＮＡ分子を使用することによって、2個の相補的ＲＮＡ断片は対となるほどにきわめて近接しているのが好ましい。その場合、好ましくはＲＮＡ分子は、フォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖領域を形成することができる。この場合、ＲＮＡ断片の相補的部分は、互いに認識し、互いに対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。好ましい実施態様では、このＲＮＡ断片を細胞に導入する前に二本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできる条件でインキュベートする。なおさらなる実施態様では、このＲＮＡ分子は、センスＲＮＡ断片とアンチセンスＲＮＡ断片の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットによってコードされたＲＮＡ配列を含む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを含む調節配列によってコードされているＲＮＡ配列を含む。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、ウイルスゲノムの発現を変化させる方法であって、細胞に当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。好ましい実施態様では、その第１のＤＮＡ配列およびその第２のＤＮＡ配列は、その細胞のゲノムに安定的に組みこまれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮＡ配列は２個の異なるＤＮＡ分子に含まれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮＡ配列は、１個のＤＮＡ分子に含まれる。この場合、そのＤＮＡ分子は、好ましくはセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む単一のＲＮＡ分子をコードする。単一のＲＮＡ分子を使用することによって、その２個の相補的ＲＮＡ断片は対となるほどに非常に近接しているので、それは好ましい。そのＤＮＡ分子は、２個の別々のＲＮＡ分子、例えば、センスＲＮＡ断片を含む1個のＲＮＡ分子およびアンチセンスＲＮＡ断片を含む１個のＲＮＡ分子を含む１個のＲＮＡ分子をコードする。単一のＲＮＡ分子またはそららの２個の別のＲＮＡ分子は、好ましくは、フォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は、二本鎖領域を形成することができる。そのＲＮＡ断片の相補的部分は互いに認識し、互いに対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。
【００２８】
ある実施態様では、単一のＤＮＡ分子または２個の別のＤＮＡ分子のそれぞれは当該ＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列中のプロモーターは、本来の植物プロモーターまたは不活性化されるべき当該ウイルス遺伝子の本来のプロモーターを含む。その二本鎖ＲＮＡがウイルス標的遺伝子として同じ組織で発育中に同時に発現するのを確保するためである。さらなる実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階に応じて調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。
なおさらなる実施態様では、このＤＮＡ配列は、当該２個の相補的ＲＮＡ断片をコードするＤＮＡ配列の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを含む調節配列を含む。
本発明のＤＮＡ分子を、当業界で周知の方法または後記に示す方法を使用して細胞に形質転換する。本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、そのようなＤＮＡ構築物を含む組換えベクターおよび本発明のＤＮＡ配列を含む組成物を提供する。
【００２９】
本発明では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、望ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より望ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５００ｂｐ長である。好ましくはその相補的領域は、５ｋｂより小さく、より好ましくは２ｋｂより小さい。ある特定の実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、標的遺伝子のコード領域を含む。さらなる好ましい実施態様では、その相補的領域は、標的遺伝子の非翻訳領域(ＵＴＲ)、例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、本発明のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ断片をコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ分子に由来し、あるいは、発現を変化させるべきウイルス標的遺伝子の調節エレメント、例えば、プロモーターまたは終結シグナルを含む。
【００３０】
さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、発現が変化する遺伝子の対応する配列と同一である。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と実質的に類似であり、なお、その遺伝子の発現を変化させることができる。この場合、その相補的領域は、望ましくは発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と少なくとも５０％同一、より望ましくは少なくとも７０%同一、好ましくは少なくとも９０%同一、より好ましくは少なくとも９５%同一である。それによって、単一の二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、単一の遺伝子または複数の遺伝子の発現を変化させることができる。ここで、当該単一の遺伝子は二本鎖ＲＮＡに同一な配列を含むか、その二本鎖ＲＮＡと実質的の類似である。
【００３１】
さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に全くミスマッチを含まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に少なくとも１個のミスマッチを含む。そのとき、２個のＲＮＡ断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、それによってその遺伝子の発現を変化させることができる。望ましくは、相補的領域のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間のミスマッチは５０％より少なく、より望ましくは３０％より少なく、好ましくは２０%より少なく、より好ましくは１０%より少なく、なおさらに好ましくは５%より少ない。
【００３２】
ウイルスに対する抵抗性または耐性
本発明は、ウイルス抵抗性または耐性である細胞、動物または植物をもたらす。本発明を使用して制御されるウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖およびマイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、アンビセンスＲＮＡウイルス並びにレトロウイルスを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御される植物ウイルスは、例えば、トスポウイルス(例えば、トマト黄化えそウイルス、ＴＳＭＶと略称)、ポティウイルス(例えば、カブモザイクウイルス、ＴｕＭＶと略称、レタスモザイクウイルス、ＬＭＶと略称、カボチャモザイクウイルスＩＩ、ＷＭＶＩＩと略称、ズッキーニ黄化モザイクウイルス、ＺＹＭＶと略称、ジャガイモＹウイルス、ＲＶＹと略称、およびパパイヤリングスポットウイルス、ＰＲＳＶと略称)、ポテックスウイルス、トバモウイルス(例えば、ペッパー微班ウイルス、ＰＭＭＶと略称、およびトマトモザイクウイルス、ＴｏＭＶと略称)、ルテオウイルス(例えばビート西部萎黄ウイルス、ＢＷＹＶと略称、およびbeet mild yellowing virus、ＢＭＹＶと略称)、ククモウイルス(例えば、キュウリモザイクウイルス、ＣＭＶと略称)、ジェミニウイルス(例えば、tomato yellow leafcurl virus、ＴＹＬＣＶと略称)、カウリモウイルス(例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶと略称)、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トンブスウイルス並びにフロウイルス(例えば、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ＢＮＹＶＶと略称)である。本発明を使用して制御可能なさらなるウイルスのクラスが、Zacomer et al.(1995) Journal of General Virology, 76:231-247およびMartelli(1992)Plant Disease, 76: 436-441に記載されている。ウイルス制御を達するためにウイルスゲノムの好ましいＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウイルスレプリカーゼ、ムーブメントタンパク質等をコードしている遺伝子の領域に対応する。ウイルスゲノム発現を制御するために有用なさらなるヌクレオチド配列は、ＷＯ９５／０９９２０に記載されている。好ましいＤＮＡ配列はタンパク質に翻訳されないウイルスゲノムの一部、例えば、５’または３’非翻訳領域を含みうる。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法は広いスペクトルのウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。例えば、本発明の方法はウイルスゲノムによってコードされているウイルスおよび同じウイルス綱、群または属の他のウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。あるいは、本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび同じウイルスの他の分離株によってコードされているウイルスへの抵抗性または耐性をもたらす。本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび異なる種であって好ましくは関連する種、好ましくはそのようなウイルスが存在する種である異なる種における同じウイルス群または属の他のウイルスによってコードされているウイルスに対する抵抗性または耐性をももたらす。所望により、1対より多い、すなわち少なくとも2対の、ｄｓＲＮＡを形成することのできるセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する。そのような対は例えば、同じウイルスゲノムだけでなく同じウイルスゲノムの異なる部分に由来する。あるいは、そのような対は、異なるウイルスゲノムに由来する。したがって、異なるウイルスクラス、群または属への抵抗性または耐性を、本発明を使用して達成する。
【００３４】
植物細胞およびそれに由来する植物は、それらはウイルス抵抗性または耐性であるのだが、好ましくは双子葉植物である。シュガービートおよびキャノーラにおけるフロウイルス(例えばRush and Heidel(1995)Plant Disease 79: 868-875参照)の抵抗性または耐性を付与する方法を、本発明に記載し、ＢＮＹＶＶ、シュガービートにおけるrhizomania(crazy roots)の原因病原体についてさらなる詳細を実施例9に記載する。「ウイルス黄化」(例えば、CRC Handbook on Disease of Sugar Beet, Volume II, pp. 35-52参照)例えば、ＢＭＹＶおよびビート西部萎黄ウイルス(ＢＷＹＶ)(シュガービートおよび脂肪種子ナタネにそれぞれ感染する)への抵抗性または耐性を付与する方法を、実施例8にさらに詳細に記載する。
本発明の方法は、単子葉植物のウイルスへの耐性または抵抗性を付与する。例えば、本発明および米国特許5,569,828の方法を使用して、Maize chlorotic dwarf virusに対する耐性または抵抗性を得る。同様に本発明および米国特許5,428,144の方法を使用して、Maize dwarf mosaic virusに対する耐性または抵抗性を得る。
【００３５】
植物形質転換技術
本発明のＤＮＡ分子を植物またはバクテリア細胞に通常の組換えＤＮＡ技術を使用して組みこむ。一般に、本発明のＤＮＡ分子は形質転換ベクターに含まれる。当分野で既知の多くのそのようなベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾されたウイルスを使用する。発現系の構成要素を修飾して、例えば、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の発現を増大させる。例えば、配列の切除、ヌクレオチドの置換、または他の修飾を実施する。当分野で既知の発現系を使用して、実質的に任意の作物植物細胞を適当な条件で形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、宿主細胞のゲノムに好ましくは安定的に組みこむ。さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、自己複製ベクター中に置く。自己複製ベクターの例は、ウイルス、特にジェミニウイルスである。形質転換された細胞を好ましくは植物体に再生する。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であってよく、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、(インゲン)マメ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アウパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチコ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、シュガービート、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、並びに樹木植物、例えば、針葉樹および落葉樹を含むがこれらに限定されない。望ましいヌクレオチド配列を特定の植物種に形質転換し、その種内で増殖し、または伝統的な育種法を使用して同じ種の特に商業的な変種を含む他の変種に導入する。
【００３６】
Ａ．植物発現カセットの構築に要するもの
トランスジェニック植物における発現を意図された遺伝子配列を、まず発現カセットに、植物で発現可能な適当なプロモーターの後方に組みこむ。発現カセットは、導入遺伝子の発現のために要するか選択された任意のさらなる配列を含みうる。そのような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発現を増強する外来配列、必須配列および特定のオルガネラおよび細胞構成要素への遺伝子産物のターゲッティングを意図する配列を含むがこれらに限定されない。これらの発現カセットを、後記の植物形質転換ベクターに容易に送達することができる。典型的な発現カセットの種々の構成要素を後述する。
【００３７】
１．プロモーター
発現カセットに使用されるプロモーターの選択によって、トランジェニック植物における導入遺伝子の位置および時間的発現パターンが決定される。選択されたプロモーターは、特異的な細胞型(例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)または特異的な組織または器官(例えば、根、葉または花)中で導入遺伝子を発現させ、その選択はその遺伝子産物の蓄積の望ましい位置に影響を及ぼす。あるいは、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件で遺伝子の発現を駆動する。プロモーターはその力、すなわち転写を促進する能力が異なる。利用される宿主細胞系によって、当分野で既知の任意の数の適当なプロモーターを使用する。例えば、構成的発現のために、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、イネアクチンプロモーター、またはユビキチンプロモーターを使用する。例えば、調節可能な発現のためには、タバコまたはアラビドプシスに由来する化学的に誘導可能なＰＲ−１プロモーターを使用する(例えば、米国特許5,689,044参照)。
【００３８】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導可能なものである。傷部位で発現される多くのプロモーターが記載されている。この種の好ましいプロモーターは、Stanford et al. Mol Gen. Genet. 215: 200-208(1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588(1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158(1989),Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142(1993) and Warner et al. Plant J.3:191-201(1993)に記載されているものを含む。
好ましい組織特異的発現型は、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的および花特異的なものを含む。緑色組織での発現に適当なプロモーターは、光合成に関係する遺伝子を調節する多くのものを含む。これらの多くは、単子葉植物および双子葉植物からクローニングされた。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子に由来するトウモロコシＰＥＰＣプロモーターである(Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589(1989))。根特異的発現に好ましいプロモーターは、de Framondによって記載されたものである(FEBS 290: 103-106(1991); EP0452269)。さらに好ましい根特異的プロモーターは、本発明によって提供するＴ−１遺伝子に由来するものである。好ましい茎特異的プロモーターは、米国特許5,625,136に記載されたものであり、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動する。
本発明の好ましい実施態様は根特異的な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。さらに好ましい実施態様は、傷誘導可能または病原体感染誘導可能な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。
【００３９】
２．転写ターミネーター
広範な転写ターミネーターが発現カセット中の使用のために利用可能である。これらは導入遺伝子を超えた転写の終結および正確なポリアデニル化に必要である。適当な転写ターミネーターが植物で機能するとして知られているものであり、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、およびエンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方に使用される。
【００４０】
３．発現の増強または調節のための配列
多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強することが見出されている。これらの配列は、本発明の遺伝子と結合させて使用して、トランスジェニック植物内での発現を増加させることができる。例えば、種々のイントロン配列、例えば、トウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞で発現を増強することが示された。さらに、ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配列が発現を増強すると知られており、これらは双子葉植物細胞で特に効果的である。
【００４１】
４．コード配列の最適化
一般に、選択された遺伝子のコード配列を、所望の作物種における最適な発現のためにコード配列を変化させることによって改変し得る。コード配列を修飾して特定の作物種で最適な発現を達成する方法が周知である(例えば、Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324(1991); and Koziel et al., Bio/technol. 11:194(1993)参照)。
さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分子を色素体ゲノムに直接的に形質転換する。色素体形質転換法が米国特許番号5,451,513、5,545,817および5,545,818、ＰＣＴ出願番号WO95/16783、およびMcBride et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,7301-7305に詳細に記載されている。葉緑体形質転換の基本的な方法は、選択マーカーにフランキングなクローニングされた色素体ＤＮＡの領域を所望の遺伝子と共に、適当な標的組織に、例えば、バイオリスティックまたはプロトプラスト形質転換(例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質転換)を使用して導入することに関する。ターゲティング配列と称する１ないし１．５ｋｂフランキング領域によって、色素体ゲノムの同種性の組み換えを容易化し、plastomeの特異的領域の置換または修飾が可能になる。
【００４２】
最初に、葉緑体16S ｒRNA並びにスペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するｒｐｓ１２遺伝子における点突然変異を形質転換のための選択マーカーとして利用する(Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., and Maliga, P. (1992)Plant Cell 4,39-45)。これらのマーカーの間のクローニング部位の存在によって、外来DNA分子の導入のための色素体ターゲッティングベクターを生成することができる(Staub, J.M.,and Maliga, P. (1993)EMBO J.12, 601-606)。劣性のｒRNAまたはr−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を、優性の選択マーカー、例えば、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−3’-アデニルトランスフェラーゼをコードしているバクテリアａａｄＡ遺伝子で置換することによって、形質転換頻度を実質的に増加できる(Svab, Z., and Maliga, P. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。以前、このマーカーを使用して、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの色素体ゲノムの高頻度形質転換に成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991)Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)。色素体形質転換に有用な他の選択マーカーが当分野で知られ、本発明の範囲に入る。
【００４３】
色素体発現とは、遺伝子が相同組換えでそれぞれの植物細胞に存在する数千コピーの環状色素体ゲノムに挿入されることである。好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡを色素体ターゲッティングベクターに挿入し、所望の植物宿主の色素体ゲノムに形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む色素体ゲノムについてホモプラスミックな植物を得て、それはそのＤＮＡ分子を選択的に高度に発現することができる。好ましくは、そのＤＮＡ分子をコードしているセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は、対となって、植物色素体内で二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、色素体遺伝子の発現を変化させることができる。好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンス断片は相補的領域に全くミスマッチを含まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチアセンス断片は少なくとも1個のミスマッチをその相補的領域に含む。この場合、ＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ分子内のＤＮＡ配列は、互いに再結合することができない。
【００４４】
Ｂ．植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換に利用可能な多くの形質添加ベクターが植物形質転換技術の当業者に既知であり、本発明に関係する遺伝子を任意のそのベクターと結合させて使用することができる。そのベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換の標的の種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するｎｐｔｌｌ遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するＢaｒ遺伝子(White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062(1990),Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631(1990))抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)およびメタトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis et al., EMBO J.2(7): 1099-1104(1983))並びにグリホサートに対する抵抗性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子(米国特許番号4,940,935 and 5,188,642)を含む。
【００４５】
１．アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
多くのベクターがアグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に利用できる。これらは典型的には少なくとも1個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、例えばｐＢＩＮ１９(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))およびｐＸＹＺのようなベクターを含む。アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは、バイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびｐＣＩＢ２００１並びにバイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体を含む。(例えば米国特許番号5,639,949参照)。
【００４６】
２．非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果的に、これらの配列を欠いたベクターをＴ−ＤＮＡ配列を含む前記のもののようなベクターに加えて利用する。アグロバクテリウムに依存しない形質転換法は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み(例えば、ＰＥＧおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換される種の好ましい選択に多くは依存する。非アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９、およびｐＳＯＧ３５を含む。(例えば、米国特許番号5,639,949参照)。
【００４７】
Ｃ．形質転換法
所望のＤＮＡ配列を発現系にクローニングし、植物細胞に形質転換する。植物の形質転換および再生の方法は当分野で周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベクター、並びに直接的ＤＮＡ取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルを外来ＤＮＡの送達のために使用する。さらにアグロバクテリウム属からのバクテリアを植物細胞を形質転換するために利用できる。
【００４８】
双子葉植物のための形質転換方法は当分野で周知であり、アグロバクテリウムに基づく方法およびアグロバクテリウムを要しない方法を含む。非アグロバクテリウム方法は、外生遺伝的物質をプロトプラストまたは細胞に直接的に取り込むことを含む。これは、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション仲介取り込み、パーティクルボンバードメント仲介送達またはマイクロインジェクションによって達成する。いずれの場合も、形質転換した細胞を、当分野で既知の標準的方法を使用して植物体に再生する。
殆どの単子葉植物種の形質転換は、現在ではルーチンとなった。好ましい方法は、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用するプロトプラストへの直接的遺伝子導入、カルス組織へのパーティクルボンバードメントおよびアグロバクテリウム仲介形質転換を含む。
【００４９】
本発明を後記の詳細な実施例を記載することによってさらに説明する。これらの実施例は例示のみのために提供し、特に明示しない限り限定することを意図していない。
【００５０】
ここで使用した標準的組み換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当分野で周知であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY(1989) and T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) and by Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。
【実施例１】
【００５１】
実施例１：ルシフェラーゼ遺伝子の発現の調節
ルシフェラーゼＲＮＡデュプレックス(duplex)をコードするキメラＤＮＡ分子の構築
プラスミドｐＬｕｃ＋(Promega)からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の７８３ｂｐの「センス」配向断片を、ｐＰＨ１０８プラスミＤＮＡからオリゴヌクレオチドプライマーｄｓ Ｌｕｃ１（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＡＡ ＡＣＡ−３’、配列番号１；ＢａｍＨＩ制限部位に下線を付す）およびｄｓ Ｌｕｃ２（５’−ＣＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ＴｕｒｂｏＰｆｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を、５０μｌ反応物中で、製造者のプロトコールにしたがって、９５℃／１分、５５℃／１．５分、７２℃／２分の５サイクル、続いて９５℃／１分、７２℃／３．５分の２５サイクルで使用する。同様の方法で、プラスミドｐＬｕｃ＋からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の７３７ｂｐ「アンチセンス」配向断片をｐＰＨ１０８プラスミドＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーｄｓ Ｌｕｃ３（５’−ＣＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ−３’、配列番号３；ＸｂａＩ制限部位に下線を付す）およびｄｓ Ｌｕｃ２（５’−ＣＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を付す）を使用してＰＣＲによって増幅する。得られたＤＮＡ断片を低融点アガロース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いてＰＣＲ産物を含む切除したゲルスライスをフェノール−クロロホルム抽出により精製する。標準的方法（制限酵素をNew England Biolabsから得た)にしたがって、センス産物（ｄｓ Ｌｕｃ１／２）からのＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アンチセンス産物（ｄｓ Ｌｕｃ３／２）からのＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。得られた粘着末端ＤＮＡ断片を前記のようにゲル精製する。ｍａｓ１’プロモーター(Velten et al. (19984)EMBO J. 3: 2723-2730)を含むＤＮＡ断片をプラスミドＣＳＡ１０４をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、５６４ｂｐ ＤＮＡ断片を精製することによって得る。この断片をＢａｍＨＩで再消化し、ｍａｓ１’プロモータを含む４８４ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブ断片を単離し、ゲル精製する。プラスミドｐＰＨ１６９を構築するために、クローニングベクターｐＬｉｔｍｕｓ２９(New England Biolabs)からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、単離した断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用して４通りの反応でｍａｓ１’プロモーター ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ）ｄｓ Ｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。ｄｓ Ｌｕｃ１／２／３ＲＮＡデュプレックス構築物でのアグロバクテリウム仲介植物形質転換のためのバイナリーベクターｐＰＨ１７０を構築するために、バクテリア選択のためのカナマイシン抵抗性遺伝子およびトランスジェニック植物選択のためのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有するバイナリープラスミドｐＳＧＣＨＣ１からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化する。得られたｐＳＧＣＨＣ１からの１１．６ｋｂ単離断片を４通りの反応でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用してｍａｓ１’プロモーターＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス(ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ）ｄｓ Ｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。
【００５２】
アグロバクテリウムの形質転換およびアラビドプシス植物の減圧浸潤
プラスミドｐＰＨ１７０をアグロバクテリウムツメファシエンスＧＶ３１０１にエレクトロポレーションによって導入し、形質転換されたコロニーを選択し、増幅する。ルシフェラーゼを構成的に（ＵＢＱ３プロモーター(Norris et al.(1993)PMB 21:895-906)／ＵＢＱ３＋ＣａＭＶ ３５Ｓ５’ＵＴＲ／ｌｕｃ＋；ｐＰＨ１０８）または誘導可能に（アラビドプシスＰＲ−１プロモーター／ｌｕｃ＋；ｐＰＨ１３５、系統６Ｅ）発現しているアラビドプシス(Arabidopsis thaliana)突然変異系統の４ないし５週齢の植物を、ｐＰＨ１７０バイナリーＴ−ＤＮＡベクターを有するアグロバクテリウムコロニーで減圧浸潤する。形質転換した植物を、ハイグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、制御されたファイトトロン条件下でルシフェラーゼ活性の決定のために育成する。さらに、ｐＰＨ１３５−６Ｅバックグラウンドのルシフェラーゼ活性をＢＴＨ（ＢＴＨ処理はLawton et al. Plant J. 10: 71-82に詳細に記載されている）で誘導の４８時間後に評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン基質の添加に続く組織エキストラクト中でのルミネッセンスに基づくアッセイを使用して定量する。ルシフェラーゼ活性をＣＣＤ-cooledビデオイメージングシステム(Hamamatsu)を使用して植物体でもモニターする。
【実施例２】
【００５３】
実施例２：アラビドプシスＧＬ１遺伝子の発現の調節
ＧＬ１遺伝子は、通常のトリコーム（リーフヘアー）形成のイニシエーションに要するｍｙｂ様転写因子をコードする(Oppenheimer et al.(1991)Cell 67: 483-493)。発育の初期のＧＬ１発現のノックアウトは、植物にトリコームの欠如をもたらす。ノックアウト表現型は幼苗で容易に同定でき、致死ではない。構成的発現のための３種のベクターおよびＧａｌ４ＣＩ調節された発現のための３種のベクターを構築する。それぞれのプロモーターを試験するための３種の異なるベクターは、ＧＬ１遺伝子断片のセンス（＋）発現、アンチセンス（−）発現およびデュプレックス（＋／−）ＲＮＡ発現である。（＋）および（−）ベクターは、ＧＬ１の発現に及ぼす効果を比較するためのコントロールである。それぞれの場合、ＧＬ１配列(GenBank Accession M79448)の塩基＃７３９ないし＃１７８１からの５’断片をベクター構築のために使用する。
【００５４】
Ｇａｌ４ＣＩ調節された発現
ＧＬ１遺伝子断片を交差誘導可能ベクター構築物ｐＪＧ３０４−１にＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片としてクローニングする。プラスミドｐＪＧ３０４をｐＢＳＳＫ＋から誘導する。プラスミドｐＢＳ ＳＫ＋(Stratagene, LaJolla,CA)をＳａｃＩで線形化し、マングビーンヌクレアーゼで処理し、ＳａｃＩ部位を除去し、Ｔ４リガーゼで再ライゲートし、ｐＪＧ２０１を作成する。１０ＸＧＡＬ４コンセンサス結合部位／ＣａＭＶ ３５Ｓミニマルプロモーター／ＧＵＳ遺伝子／ＣａＭＶターミネーターカセットをｐＡＴ７１からＫｐｎＩで除去し、ｐＪＧ２０１のＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＪＧ３０４を作成する。プラスミドｐＪＧ３０４を制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で一部消化し、全長線形断片を単離する。この断片をモル過剰の２２塩基のオリゴヌクレオチドＪＧ−Ｌ（５’−ＧＴＡ ＣＣＴ ＣＧＡ Ｇ ＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＣＧＡ Ｇ−３’、配列番号４）とライゲートする。制限分析を使用して、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位の５’にこのリンカーを挿入されたクローンであると同定し、このプラスミドをｐＪＧ３０４ＤＸｈｏＩと命名する。
ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位を、５’末端に適当な制限部位を有するＰＣＲプライマーを合成することによって（＋）および（−）断片の末端に付加する。（＋／）ＧＬ１断片を２個の断片:５’末端にＮｃｏＩ部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する（＋）断片および５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端にＳａｃＩ部位を有する（−）断片を最初に生成することによって生成する。デュプレックスユニットを得られた断片にＥｃｏＲＩ部位でライゲートすることによって生成する。発現ユニットは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン、続いてミニマルＴＡＴＡ配列、および（＋）、（−）または（＋／−）配向であるＧＬ１遺伝子断片を含む。
【００５５】
構成的発現
双子葉植物で比較的強力で構成的なアグロバクテリウム（ｒｅｆ）からのマンノピンシンターゼのｍａｓ１’プロモーターを使用する。前記のように、ＧＬ（＋）、（−）および（＋／−）断片をpBluescriptの１’プロモーターの後方にライゲートする。３種類の異なる発現カセットをｐＣＩＢ２００にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片としてライゲートする(Uknes et al.(1993)Plant Cell 5:159-169)。
【実施例３】
【００５６】
実施例３：シスタチオンベータリアーゼ遺伝子の発現の調節
シスタチオンベータリアーゼ（ＣＢＬ）遺伝子は、メチオニン生合成経路のある段階をコードしている。植物におけるその発現の調節の影響をセンスおよびアンチセンス構築物、並びに二本鎖ＲＮＡ構築物を使用して試験する。
アンチセンス構築物：ｐＪＧ３０４ＤＸｈｏＩベクターからの断片を含み、アンチセンス配向のＣＧＬ遺伝子(ヌクレオチド＃１３−１１５９、Genbbank accession #L40511)の一部が挿入された、バイナリーＢＡＳＴＡベクターｐＪＧ２６１を使用する。
センス構築物：ＣＢＬ断片が反対配向である以外は、アンチセンス構築物と同様である。この構築物はＡＴＧ開始コドンおよび殆どのＣＢＬ ＯＲＦを含み、ＣＢＬ遺伝子の発現の制御および調節として働く。
二本鎖ＲＮＡ構築物：センス配向のＣＢＬ遺伝子断片（#１３−１１５９）を、ＣＢＬ遺伝子のアンチセンス配向バージョンの下流であってベクターｐＪＧ３０４−１のＳａｌＩ部位に挿入する。約１０ｂｐのリンカーが２コピーのＣＢＬの間に存在する。
【実施例４】
【００５７】
実施例４:植物発現カセットの構築のために必要なもの
トランスジェニック植物における発現を意図する遺伝子配列を、適当なプロモータの後方であって適当な転写ターミネーターの上流の発現カセット中に最初に組みたてる。植物発現カセットの構築に必要なすべては、本発明のＤＮＡ分子に当てはまり、当分野で周知の技術を使用して実施する。
【００５８】
プロモーター選択
発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物でのＤＮＡ分子の位置および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモーターは、特異的な細胞型（例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）でまたは特異的な組織または器官（例えば、根、葉または花）でＤＮＡ分子を発現させ、その選択はそのＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ断片の生合成の望ましい位置に影響を及ぼす。あるいは、選択したプロモーターは、光誘導または他の時間的に調節されたプロモーターの下でＤＮＡ分子の発現を駆動し得る。あるいは選択されたプロモーターは、化学的に調節されるものである。これにより、望ましく、化学的インデューサーでの処理によって引き起こされるときのみＤＮＡ分子の発現を誘導する可能性を提供される。
転写ターミネーター
種々の転写ターミネーターが発現カセット中での使用のために利用可能である。これらは、転写の終結および好ましくは正確なポリアデニル化のために必要である。適当な転写ターミネーターおよび植物中で機能すると知られているものは、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。これらは単子葉および双子葉植物の両方で使用できる。
【００５９】
発現の増強または調節のための配列
多くの配列が転写ユニット内からの遺伝子発現を増強することが見出されてきた。これらの配列を本発明のＤＮＡ分子と組み合わせて使用し、トランスジェニック植物中でのその発現を増大させることができる。
種々のイントロン配列が特に単子葉植物細胞での発現を増強させることが示されている。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンが、トウモロコシ細胞に導入されたときそのコグネイトプロモーターの下で野生型遺伝子の発現を有意に増強することが見出された。イントロン１は、特に有効であると見出され、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物において発現を増強する(Callis et al., Genes Dvelop 1: 1183-1200(1987))。同じ実験系で、トウモロコシｂｒｏｎｚｅ１遺伝子からのイントロンが発現の増強に同様の効果を有する(Callis et al.,前掲)。イントロン配列は、日常的に植物形質転換ベクターに、典型的には非翻訳リーダー内に組みこまれている。
ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列が、発現を増強することが知られている。これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス(TMV、「Ω配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス(Maize Chlorotic Mottle Virus(MCMV))、およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列が、発現を増強するのに有効であると示されている(例えば、Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711(1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15; 65-79(1990))。
【実施例５】
【００６０】
実施例５：発現カセット構築物の例
本発明は、プロモーターの起源に関わらず植物で発現可能な任意のプロモーターの調節の下での本発明のＤＮＡ分子の発現を含む。したがって、ＤＮＡ分子を、当分野で周知の方法によって任意の発現カセットに挿入する。これらの発現カセットは、後記の植物形質転換ベクターに容易に移入することができる。さらに本発明は、ＤＮＡ分子の発現のために要されまたは選択される任意のさらなる配列と組み合わせて任意の発現可能プロモーターを使用することを含む。そのような配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外来配列を含むがこれらに限定されない(例えば、イントロン[例えば、Ａｄｈイントロン１]、ウイルス性配列[例えばＴＭＶ−Ω]）。
【００６１】
構成的発現：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、公開された特許出願ＥＰ０３９２２２５に記載されている。ｐＣＧＮ１７６１は「ダブル」３５Ｓプロモーターおよびｔｍｌ転写ターミネーターを含み、プロモーターおよびターミネーターの間に特異的ＥｃｏＲＩ部位を有しており、ｐＵＣ−タイプバックボーンを有する。存在するＥｃｏＲＩ部位に加えＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位を含む修飾されたポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の誘導体を構築する。この誘導体をｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと命名する。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸはトランスジェニック植物での３５Ｓプロモーターの制御の下での発現のためのポリリンカー内のｃＤＮＡ配列または遺伝子配列（微生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。そのような構築物の完全な３５Ｓプロモーター−遺伝子配列−ｔｍｌターミネーターカセットを、プロモーターの５’側のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、およびＸｂａＩ部位で、ターミネーターの３’側のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩ部位で、形質転換ベクターへ送達するため切除することができる。さらにダブル３５Ｓプロモーター断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩまたはＰｓｔＩでの５’切除、および任意のポリリンカー制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩ）での３’切除によって、他のプロモーターと置き換えるために除去することができる。
したがって、本発明のＤＮＡ分子を、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御の下での構成的発現のために挿入することができる。
【００６２】
化学的に調節可能なプロモーターの下での発現
この節はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを任意の選択されたプロモーターで置換えることについて記載する。例証として化学的に調節されるＰＲ−１ａプロモーターを記載する。選択されたプロモーターを好ましくはそのソースから制限酵素によって切除するが、あるいは適当な末端制限部位を有するプライマーを使用してＰＣＲ−増幅することができる。もしＰＣＲ−増幅を実施するならば、プロモーターは標的ベクター中の増幅されたプロモーターのクローニングの後、増幅エラーを確認するために再配列決定するべきである。化学的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターをプラスミドｐＣＩＢ１００４（ＥＰ０３３２１０４参照）から切断し、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに送達する。ｐＣＩＢ１００４をＮｃｏＩで切断し、得られた線状断片の３’オーバーハングをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端化する。次に、その断片をＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、得られたＰＲ−１ａプロモーターを含む断片をゲル精製し、ダブル３５Ｓプロモーターを除去されたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにクローニングする。これを、ＸｈｏＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、続いてＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＣＩＢ１００４プロモーター断片がクローニングされるべきより大きなベクターターミネーターを含む断片を単離することによって実施する。これにより、ＰＲ−１ａプロモーターおよびｔｍｌターミネーター、並びに特有のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位を有する介在しているポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体を作成する。
本発明のＤＮＡ分子をこのベクターに挿入し、融合産物（すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター）をその後、本出願に記載されたものを含む任意の選択された形質転換ベクターに送達する。そしてそのＤＮＡ分子の化学的に誘導可能発現を実現する。
【００６３】
構成的発現:アクチンプロモーター
アクチンのいくつかのイソフォームは、ほとんどの細胞型中で発現され、結果的に、構成的プロモーターとしてアクチンプロモーターを選択するのがよいと知られている。特にイネＡｃｔ１遺伝子からのプロモーターはクローニングされ、特性が把握されている(McElroy et al.Plant Cell 2:163-171(1990))。そのプロモーターの１．３ｋｂの断片は、イネプロトプラスト中の発現に要求されるすべての調節エレメントを含んでいることが発見されている。さらにＡｃｔ１プロモーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉植物における使用のために構築されてきた(McElroy et al.Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。これらはＡｃｔ−イントロン１、Ａｄｈ１ ５’フランキング配列、およびＡｄｈ１−イントロン１（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）およびＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターからの配列を含む。最高の発現を示すベクターは、３５ＳおよびＡｃｔ１イントロンまたはＡｃｔ１ ５’フランキング配列およびＡｃｔ１イントロンの融合物である。McElroy et al.(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))によって記載されたプロモーター発現カセットを、本発明のＤＮＡ分子の発現のために容易に修飾することができ、単子葉植物宿主における使用に特に好適である。例えばプロモーターを含む断片をＭｃＥｌｒｏｙの構築物から取り外して使用し、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを置き換えることができ、それは挿入または特定の遺伝子配列のために利用可能である。こうして構築した融合遺伝子を、その後適当な形質転換ベクターに送達することができる。別の報告では、第１のイントロンを有するイネＡｃｔ１プロモーターが培養オオムギ細胞中で高度の発現をディレクトすることも発見された(Chibbar et al.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。
本発明のＤＮＡ分子をそのようなプロモーターの下流に挿入し、続いて、融合産物(すなわちプロモーター-遺伝子−ターミネーター)を任意の選択された、本明細書に記載されているものを含む、形質転換ベクターに送達する。
【００６４】
構成的発現:ユビキチンプロモーター
ユビキチンは多くの細胞型中に蓄積すると知られているもう一つの遺伝子産物であり、そのプロモーターはいくつかの種からトランスジェニック植物における使用のためにクローニングされてきた(例えばヒマワリ−Binet et al.Plant Science 79:87-94(1991)、トウモロコシ−Christensen et al.Plant Molec.Biol.12:619-632(1989))。トウモロコシユビキチンプロモーターはトランスジェニック単子葉系で開発されており、その配列および単子葉植物の形質転換のために構築されたベクターは特許出願ＥＰ０３４２９２６に公開された。さらに、Taylor et al.(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))はトウモロコシユビキチンプロモーターおよび第１のイントロンを含むベクター（ｐＡＨＣ２５）、およびマイクロプロジェクタイルボンバードにより導入されたときの多くの単子葉植物の細胞懸濁物中でのその高い活性について記載している。そのユビキチンプロモーターはトランスジェニック植物、特に単子葉植物中でのＤＮＡ分子の発現に特に好適である。適当なベクターは、適当なユビキチンプロモーターおよび／またはイントロン配列の導入によって修飾された、ｐＡＨＣ２５の誘導体または本明細書中に記載された任意の形質転換ベクターである。
したがって、本発明のＤＮＡ分子を任意のこれらのベクターに挿入し、融合産物（すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター）を植物の形質転換に使用して、ＤＮＡ分子を構成的に発現させる。
【００６５】
根特異的発現
本発明のＤＮＡ分子に好ましい発現のパターンは根での発現である。根組織のみでのヌクレオチド配列の発現は、葉および花組織並びに種子での発現を変化させることなく、根のみで標的遺伝子の発現を変化させる利点がある。適当な根プロモーターは、de Framond(FEBS 290:103-106(1991))によって、また公開された特許出願ＥＰ０４５２２６９において記載されたようなものである。このプロモーターをｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのような適当なベクターに送達し、ＤＮＡ分子をそのようなベクターに挿入する。その完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットをその後、所望の形質転換ベクターへ送達する。
【００６６】
傷誘導可能プロモーター
多くのそのようなプロモーターが記載され(例えばXu et al.Plant Molec.Biol.22:573-588(1993)、Logemann et al.Plant Cell 1:151-158(1989)。Rohrmeier&Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant Molec.Biol.22:129-142(1993)、Warner et al.Plant J.3:191-201(1993))、すべて本発明での使用に好適である。Logemann et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモｗｕｎ１遺伝子の５’上流配列を記載している。Xu et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモ（ｐｉｎ２）からの傷誘導可能プロモーターは単子葉植物イネでも活性があることを記載している。さらにRohrmeier&Lehle(前掲)は傷に誘導され、標準的な技術を使用してコグネイトプロモーターを単離するのに使用可能であるトウモロコシWip1 cＤＮＡのクローニングを記載している。同様にFirek et al.(前掲)およびWarner(前掲)は、局部的傷および病原体侵入部位で発現される、単子葉植物Asparagus officinalisからの傷誘導可能遺伝子を記載している。当技術分野で周知のクローニング技術を使用して、これらのプロモーターを適当なベクターに送達し、本発明のＤＮＡ分子と融合し、これらの遺伝子を害虫感染の部位で発現させるために使用することができる。
【００６７】
髄における好ましい発現
特許出願ＷＯ９３／０７２７８は、髄細胞で選択的に発現されているトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の単離を記載している。標準的な分子生物学的な技術を使用して、このプロモーターまたはその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに送達することができ、３５Ｓプロモーターを置き換え、髄に好ましいように本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用することができる。実際、髄に好ましいプロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トランスジェニック植物における便宜のために修飾する。ＤＮＡ分子の髄に好ましい発現を、そのようなベクター中のＤＮＡ分子に挿入することによって達成する。
【００６８】
花粉特異的発現
特許出願ＷＯ９３／９７２７８は、花粉細胞で発現されているトウモロコシカルシウム依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＰＫ）遺伝子の単離をさらに記載している。その遺伝子配列およびプロモーターは転写開始から１４００ｂｐにわたる。標準的な分子生物学的技術を使用して、プロモーターまたはその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに送達し、３５Ｓプロモーターを置き換え、花粉特異的な方法で本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用する。実際、花粉特異的プロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トランスジェニック植物における便宜のために修飾することができる。
葉特異的発現
ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードしているトウモロコシ遺伝子が、Hudspeth&Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって記載された。標準的な分子生物学的な技術を使用して、この遺伝子のためのプロモーターを使用し、トランスジェニック植物における葉特異的方法で、本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動する。
【実施例６】
【００６９】
実施例６：植物形質転換ベクターの構築
多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明のＤＮＡ分子を前述の任意の発現カセットに挿入し、適当な条件の下で望まれる細胞中でＤＮＡ分子を発現させることができる。ヌクレオチド配列を含む発現カセットを、任意の後記の適当な形質転換ベクターに組み込む。使用のためのベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種による。ある標的種では、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチン的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子(Messing & Vieria, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature 304:183-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するｂａｒ遺伝子(White et al.,Nucl Acids Res 18:1062(1990)、Spencer et al.Theor Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochiger&Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2929-2931)、およびメタトレキセート(methatrexate)に対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis and Jarry.,EMBO J.2(7):1099-1104(1983))を含む。
【００７０】
アグロバクテリウム形質転換に好適なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に多くベクターが利用可能である。典型的にはこれらは少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、ｐＢＩＮ１９(Bevan,Nucl.Acids Res.(1984))およびｐＶｉｃｔｏｒ ＨＩＮＫ（配列番号５）のようなベクターを含む。以下に２種の典型的なベクターの構築を記載する。
ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築
バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１をアグロバクテリウムでの使用のための組換えベクターの構築に使用し、以下のような方法で構築する。ｐＴＪＳ７５ｋａｎを、ｐＴＪＳ７５(Schmidhauser&Helinski,J Bacteriol.164:446-455(1985))をＮａｒＩによって消化し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を切除し、続いてＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩ断片を挿入して作成する(Messing & Vieira, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。ＸｈｏＩリンカーを、レフトおよびライトT-ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含むｐＣＩＢ７(Rothstein et al.,Gene 53:153-161(1987))のＥｃｏＲＶ断片にライゲートし、ＸｈｏＩ−消化された断片をＳａｌＩ−消化されたｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローニングし、ｐＣＩＢ２００を作成する（ＥＰ０３３２１０４参照）。ｐＣＩＢ２００は以下の特有なポリリンカー制限部位：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｌＩを含む。ｐＣＩＢ２００１はさらなる制限部位のポリリンカーへの挿入により作成されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおける特有の制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩ、およびＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１は、これらの特有の制限部位を含むことに加えて、植物およびバクテリアのカナマイシン選択、アグロバクテリウム−仲介形質転換のためのレフトおよびライトＴ−ＤＮＡボーダー、ＲＫ２由来のＥ．ｃｏｌｉおよび他の宿主間の移動のためのｔｒｆＡ機能、並びにＲＫ２からのＯｒｉＴおよびＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーはこれらの自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。本発明のＤＮＡ分子を含む前記した植物発現カセットのいずれかを、ｐＣＩＢ２００１に好ましくはポリリンカーを使用して挿入する。
【００７１】
ｐＣＩＢ１０の構築およびその誘導体のハイグロマイシン選択
バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子、Ｔ−ＤＮＡライトおよびレフトボーダー配列を含んでおり、広宿主−範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組み入れており、Ｅ．ｃｏｌｉおよびアグロバクテリウム双方で複製することが可能である。その構築はRothstein et al.(Gene53:153-161(1987))によって記載されている。Gritz et al.(Gene25:179-188(1983))によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの遺伝子を組み入れている種々のｐＣＩＢ１０の誘導体が構築されてきた。これらの誘導体によってハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、またはハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）によるトランスジェニック植物細胞の選択が可能となる。このベクターを使用して本発明のＤＮＡ分子を含む発現カセットを形質転換する。
【００７２】
非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター
アグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換によって、選択された形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性が回避され、結果的にこれらの配列を欠いたベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む前述のもののようなベクターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技術は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み（例えばＰＥＧおよびエレクトロポレーション）、マイクロインジェクションまたは花粉形質転換（米国特許５６２９１８３）による形質転換を含む。ベクターの選択については、多くは形質転換される種にとって好ましいように選択する。以下にある典型的なベクターの構築を記載する。
【００７３】
ｐＣＩＢ３０６４の構築
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（またはホスヒノトリシン）による選択と組み合わされた直接的遺伝子導入法に適当なｐＵＣ−由来ベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６はＥ．ｃｏｌｉ ＧＵＳ遺伝子に実施可能なように融合したＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ ３５Ｓ転写ターミネーターを含み、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’位に２個のＡＴＧ配列を含む。これらの部位を、標準的ＰＣＲ法を使用して変異させ、ＡＴＧを除去し、制限部位ＳｓｐＩおよびＰｖｕＩＩを作成する。新しい制限部位は特有のＳａｌＩ部位から９６および３７ｂｐ離れており、真の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れている。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名する。そしてｐＣＩＢ３０２５からＳａｌＩおよびＳａｃＩでの消化によってＧＵＳ遺伝子を切除し、平滑末端化してライゲートし、プラスミドｐＣＩＢ３０６０を作成する。プラスミドｐＪＩＴ８２をJohn Innes Centre,Norwichより入手し、Streptomyces viridochromogenesからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのＳｍａＩ断片を切除し、ｐＣＩＢ３０６０(Thompson et al.EMBO J 6:2519-2523(1987))のＨｐａＩ部位に挿入する。この作成したｐＣＩＢ３０６４は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御の下での除草剤選択のためのｂａｒ遺伝子、アンピシリン抵抗性の遺伝子(E.coliにおける選択のため)および特有の部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを有するポリリンカーを含む。このベクターは本発明のＤＮＡ分子の発現をディレクトするそれ自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。
【００７４】
ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築
ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてE.coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲを使用して、３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ遺伝子からのイントロン６（〜５５０ｂｐ）およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅する。E.coliジヒドロ葉酸レダクターゼタイプＩＩ遺伝子をコードしている２５０ｂｐの断片をＰＣＲによって増幅し、これらの２種のＰＣＲ断片を、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１(Clontech)からのＳａｃＩ-ＰｓｔＩ断片と構築する。これらの断片の構築によって、イントロン6配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと融合された３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９を作成する。ｐＳＯＧ１９のＧＵＳリーダーを、トウモロコシ退録斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列と置換してベクターｐＳＯＧ３５を作成する。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン抵抗性のｐＵＣ遺伝子を有しており、外来配列、特に本発明のＤＮＡ分子のクローニングに利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する。
【実施例７】
【００７５】
実施例７：葉緑体形質転換
形質転換ベクター
本発明のＤＮＡ分子の植物色素体での発現のために、色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、実施例３６）を使用する。ＤＮＡ分子を、ｐＰＨ１４３に挿入し、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列を置換する。次にこのベクターを色素体形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性についての形質転換体の選択のために使用する。あるいは、ＤＮＡ分子をｐＰＨ１４３に挿入し、ａａｄＨ遺伝子を置換する。この場合、形質転換体を、ＰＲＯＴＯＸ阻害剤に対する抵抗性について選択する。
葉緑体形質転換
タバコNicotiana tawbacum c.v.「Xanthi nc」の種子をプレート当たり７粒、1’’の環状に並べてＴアガー培地上に発芽させる。播種１２−１４日後に、詳細に記載されたプラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５(Svab, Z. and Maliga, P.(1993)PNAS 90, 913-917)からのＤＮＡでコートした１μｍタングステン粒子(M10, Biorad, Hercules, CA)でボンバードする。ボンバードした苗を、Ｔ培地上で２日インキュベートし、その後葉を切除し、背軸側を上にして明光（３５０−５００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）中で、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンジヒドロクロリド(Sigma, St. Louis,MO)を含むＰＭＯＰ培地(Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P.(1990)PNAS 87, 8526-8530)のプレート上に置く。ボンバードメントの３ないし８週間後に下方に白化した葉を示す抵抗性シュートを、同じ選択培地上にサブクローニングしカルスを形成させ、二次的シュートを単離しサブクローニングする。独立したサブクローンにおける形質転換した色素体ゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティ）を、サザンブロッティングの標準的な方法によって評価した(Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した総細胞ＤＮＡ(Mettler, I. J. (1987)Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349)を、１％トリスボレート(ＴＢＥ)アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、ｒｐｓ７／１２色素体ターゲッティング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片に対応する、３２Ｐ標識したランダムプライマーＤＮＡ配列で探索した。ホモプラスミックなシュートをスペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地(McBride, K. E. et al.(1994)PNAS 91, 7301-7305)上で無菌的に発根させ、グリーンハウスに移す。
【実施例８】
【００７６】
実施例８：ＰｏｌＣプロモーターによって駆動されるＢＷＹＶからのコートタンパク質遺伝子についてのセンスおよびアンチセンスデュプレックスＲＮＡ断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築
ビート西部萎黄病ウイルス(ＢＷＹＶ)（いわゆるウイルスイエロー)コートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の０．６Ｋｂの「センス」配向断片をプライマーＨｉＮＫ０２５ｂｉｓ（５’−ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ−３’、配列番号６；ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２６（５’−ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ−３’、配列番号７；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）を使用してプラスミドｐＺＵ０４６から増幅する。あるいは、断片をプラスミドｐＢＷ１７(Veidt et al, Nucleic Acids Research 16: 9917-9932, 1988; accession number X13063)から、プライマーＨｉＮＫ０２５ｂｉｓ２（５’− ＡＡＴ ＣＧＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ−３’、配列番号８；ヌクレオチド３４７５ないし３４９８、ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２６ｂｉｓ（５’−ＣＴＡ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ−３’配列番号９、ヌクレオチド４１１４ないし４０８５、ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を、製造者の規定にしたがって２５μｌ反応中で使用し、３０サイクルの９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／９０秒（＋２秒／サイクル）を適用する。得られたＰＣＲ断片を、Seakem GTG アガロース(FMC)から作成した１％トリスアセテートゲルでの電気泳動、続いてＰＣＲ産物を含むゲルスライスからＱＩＡｑｕｉｃｋゲルエキストラクションキット(QIAGEN)での抽出によって精製する。その後、標準的方法にしたがってＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ（すべての制限酵素は、Life Technologiesから入手）で消化し、再びゲル精製した。精製した断片を、ＲｏｌＣプロモーターおよびＮｏｓターミネーターの間にＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用してライゲートする。得られたクローンをｐＨｉＮＫ１３８と命名する。
【００７７】
前記と同様な方法で、１．４Ｋｂ「アンチセンス」配向ＢＷＹＶ ＣＰ断片を、プラスミドｐＺＵ１７４ＡからプライマーＨｉＮＫ２５１（５’― ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＧ ＣＣＣ Ａ―３’、配列番号１０；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２８（５’―ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＧ―３’、配列番号１１；ＮｓｉＩ制限部位に下線を付する）を使用して、あるいは、プラスミドｐＢＷ１７からプライマーＨｉＮＫ２５１（ヌクレオチド４８４４ないし４８１４）およびＨｉＮＫ２２８ｂｉｓ（５’−ＣＧＴ ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＧ−３’、配列番号１２；ヌクレオチド３４７８ないし３５０３、ＮｓｉＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。ゲル精製して、ＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで消化する。４．９Ｋｂ プラスミドｐＨｉＮＫ１３８をＰｓｔＩで線形化し、熱感受性アルカリフォスファターゼ(Life Technologies)を使用して脱リン酸化する。ベクターおよびＰＣＲ断片をゲル精製し、続いてｐＨｉＮＫ１３８にＰＣＲ断片を双方向ライゲーションする。ＣＰ遺伝子（配列番号１３）についてのデュプレックスＲＮＡを生ずる配向を制限部位分析によって決定し、それは、逆方向の繰り返しがＣＰ遺伝子の下流のＢＷＹＶゲノムに由来する０．７Ｋｂスペーサー配列（ＯＲＦ６という）によって分離されている０．６Ｋｂ ＣＰ遺伝子からなるｐＨｉＮＫ１５２を生じた。スペーサー配列はアンチセンス配向である。最終的に、当該遺伝子カセットを、選択マーカー遺伝子としてホスホマンノースイソメラーゼを有する特許のバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627)に送達し、ｐＨｉＮＫ１７９を得る。
【実施例９】
【００７８】
実施例９．１：アラビドプシスＵｂｉ３ｉｎｔプロモーターによって駆動される、ＢＮＹＶＶからのレプリカーゼ遺伝子についてのセンスおよびアンチセンス（デュプレックス）ＲＮＡ断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築
総ＲＮＡをビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）フロウイルスに感染したシュガービート根から、QIAGENのRNAeasy Plantミニキットを使用して抽出する。ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子（ＲＮＡ１）の３’末端を増幅するために、ＲＮＡを、Superscript（商標）II RNAse H-Reverse Transcriptase(RT)(Life Technologies)および逆プライマーＨｉＮＫ２８５（５’−ＴＣＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＡＧ Ａ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＣ−３’、配列番号１４）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを生成する。プライマーＨｉＮＫ２８５は、ＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１配列(accession number D00115)のヌクレオチド６３７８および６４０５の間に位置し、ＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計されている。次に、ＲＴ反応を使用して２種類のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用する：
ＢａｍＨＩ部位を導入するよう設計されたＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５１６８ｂｐおよび５１７８ｂｐの間に位置するプライマーＨｉＮＫ２８３（５’―ＡＡＧ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＣ―３’配列番号１５）、およびＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計されたＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５５９７および５６２０の間に位置するプライマーＨｉＮＫ２８４（５’−ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＣ Ａ―３’、配列番号１６）を使用する反応Ａ。
プライマーＨｉＮＫ２８３をプライマーＨｉＮＫ２８５と組み合わせて使用する反応Ｂ。両者は前記した。
【００７９】
こうして得られたＲＴ−ＰＣＲ産物は、将来のＲＮＡデュプレックスを構成するヌクレオチド５１６８−５６２０の間にＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１配列を有する。将来のスペーサー配列は、プライマーＨｉＮＫ２８３およびＨｉＮＫ２８５で得られるＲＴ−ＰＣＲ産物に存在するＢＮＹＶＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド５６２１−６４０５ｂｐに対応する。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を製造者の規定にしたがって２５μｌ反応中で使用し、９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／９０秒（＋２秒／サイクル）の３０サイクルを適用する。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を、Seakem GTG アガロース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いてQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)による増幅産物を含むゲルスライスの抽出によって精製する。ゲル精製の後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ(life Technologies)によって標準的方法にしたがって消化し、前記のように精製する。
最終的に、ＲＴ−ＰＣＲ産物をアラビドプシスユビキチン３(Ubo3int)プロモーターおよびＮｏｓターミネーターの間にＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用する３段階のライゲーション反応によってクローニングする。２種類の得られたクローンを、ｐＨｉＮＫ１８１（アンチセンス配向のスペーサー、配列番号１７参照）およびｐＨｉＮＫ１８４（センス配向のスペーサー、配列番号１８参照）と称する。
【００８０】
シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換のためのバイナリーベクターを構築するために、選択マーカーとしてホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を有するバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627)、並びにプラスミドｐＨｉＮＫ１８１およびｐＨｉＮＫ１８４からのＤＮＡを、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ(New England Biolabs)によって消化し、ベクターおよび挿入断片を前記のように電気泳動で精製する。得られた７．７ｋｂ ｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫベクター断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用して、ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子のデュプレックスＲＮＡをコードしている遺伝子カセットにライゲートし、それぞれｐＨｉＮＫ１８７（アンチセンススペーサー）およびｐＨｉＮＫ１８８（センススペーサー）を得る。
【００８１】
実施例９．２：シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換
植物種のアグロバクテリウム仲介形質転換法はよく確立され当業者に既知であり、外植体型、アグロバクテリウム株、または使用される選択マーカーおよび再生系によって変化してもよい。ここで以下のプロトコールには、外植体のソースとして子葉、選択マーカー遺伝子としてマンノース−６−フォスフェートイソメラーゼを使用するシュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換を記載する(Joersbo et al, Molecular Breeding 4: 111-117, 1998)。表面殺菌したシュガービート種子をウォーターアガー上に弱光下で約１２℃の温度で発芽させる。十分に展開した子葉を、節領域のすぐ下方で横断的に切断することによって苗から切除し、両方の子葉をやさしく引っ張り切裂く。子葉外植体を、２０ｇ／ｌスクロース、０．２５ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５００μＭ アセトシリンゴンを補足したＭＳ培地ｐＨ５．２に希釈した適当な形質転換ベクターを有するアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１の最適密度（ＯＤ６００）０．１ないし０．３に希釈した懸濁液に子葉を浸すことによって接種する。インキュベーションの5分後、外植体をアグロバクテリウム懸濁液から移動し、無菌濾紙に浸し、接種懸濁液の接触を除去し、共培養プレート上に移す。共培養プレートは、３０ｇ／ｌ スクロース、２００μＭ アセトシリンゴンを含み、４．７ｇ／ｌ アガロースで固めた１／１０ＭＳ培地ｐＨ５．７を含み、固めた培地の上に１．５ｍｌ ＴＸＤ培地（ＰＧＯビタミン、０．００５ｍｇ／ｌ カイネチン、４ｍｇ／ｌ ＣＰＡ（ｐ−クロロフェノキシ酢酸）、３０ｇ／ｌ スクロースで補足したＭＳ塩、ｐＨ５．７）で湿らせた濾紙で覆ったペトリ皿からなる。外植体を弱光下２１℃で４日間共培養し、次に２０ｇ／ｌ スクロース、１．２５ｇ／ｌ マンノース、０．２５ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリンで補足し９ｇ／ｌ アガーで固めたＭＳ培地ｐＨ５．９からなる選択再生培地に移す。３週間ごとに、外植体を次第にマンノースの濃度を最大１５ｇ／ｌまで増加させる新しい培地に継代培養する。２１℃の１２週間の選択および再生の後、再生したシュートを収穫し、発根させ、Feramisco and co-workers(Feramisco et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641. 1973)に記載された共役酵素反応に本質的にしたがってＰＭＩ活性を分析する。陽性の植物を土でポット植えして、最終的にグリーンハウスに移す。
【００８２】
実施例９．３：rhizomaniaに対する抵抗性のスクリーニング
土に播種またはポット植えして、苗またはＴ０形質転換体を、ＢＮＹＶＶを有するPolymyxa betaeが蔓延している土壌に移植する前に、最初に約４週間の期間、根系を十分に発達させる。蔓延した土壌をドイツのrhizomania汚染圃場から収集する。抵抗性検定の間、植物を１２ｃｍポットで約２１℃、１６時間明期で成長させる。蔓延した土壌への移植の４週間後、植物を土壌から抜き取り、根系の底半分を固着した泥から水洗して除去する。０．５ｇの根組織の無作為サンプルからの液汁を、Pollaehne pressの方法で収集し、２％ ＰＶＰおよび０．２％ 卵白アルブミンで補足したリン酸バッファー塩水ｐＨ７．２からなる１０ｍｌの抽出バッファーに添加する。サンプル中の存在ウイルスの量を、ＢＮＹＶＶのためのトリプル抗体サンドイッチ（ＴＡＳ）ＥＬＩＳＡ(Adgen Ltd, Scotland, UKから入手可能、供給者の指示に本質的に従う）で決定する。標準曲線を各プレートについて作成し、根サンプルのウイルス含量を測定した吸光値から算出する。非形質転換感受性シュガービート植物を否定的なコントロールとして使用し、自然のrhizomania抵抗性のためのＣ２８遺伝子を有する植物を肯定的なコントロールとする。表１は、プラスミドｐHINK１８８で得られた形質転換事象の結果の要約である。
【表１】
【表２】
【実施例１０】
【００８３】
実施例１０：メロンにおけるズッキーニ黄化モザイクポティウイルス（ＺＹＭＶ）およびパパイヤリングスポットポティウイルス（ＰＲＳＶ）抵抗性のための植物形質転換ベクターの構築：
ＮＯＳターミネーター(Beven, M., et al, 1983 Nucleic Acids Res. 11(2), 369-385)を２６０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｉｓｔＩ断片としてＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩで消化してプラスミドｐＺＯ１５６０にクローニングする。ＰＺＯ１５６０は、多数のクローニング部位より有用なものと置換されたｐＵＣ由来プラスミドである。ＮＯＳターミネーターの挿入の後、新しい構築物をｐＺＵ５５３と命名する。
１７２８ｂｐ Ｕｂｉ３プロモーター／イントロン断片(Callis, J., et al, (1995 Genetics 139(2), 921-939)をＢａｍＨＩで消化、次にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理およびＫｐｎＩ消化によって単離する。この断片をｐＺＵ５５３にクローニングし、ＳｍａＩで消化する。新しい構築物をｐＺＵ６１５と命名する。
【００８４】
ｐＺＵ６１５に挿入されるべきさらなるＤＮＡ断片を、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって最初に増幅し、得られたＰＣＲ断片をpBluescript SK＋にクローニングする。５１３ｂｐアクチン２イントロンＬ（リーダーイントロン）断片を増幅するために、２種のプライマーをAn et al, The Plant Journal: 10: 107-121, 1996からの配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６３：５’−ＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧ−３’、配列番号１９）は５’スプライシング部位の上流に直接アニーリングし、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩおよびＳａｃＩＩ制限部位を増幅されるべきアクチン２イントロンＬ断片の５’末端に付加する。３’プライマー（ＺＵＰ１５６４：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣ―３’、配列番号２０）は３’スプライシング部位の下流に直接アニーリングし、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩ制限部位を増幅されるべきアクチン２イントロンＬ断片の３’末端に付加する。ＰＣＲ断片をＺＵＰ１５６３および１５６４によって増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１１と命名する。プラスミドｐＺＵ６１５にＡｃｔ２イントロンＬを供給するために、４９９ｂｐ ＢａｍＨ／ＮｃｏＩ Ａｃｔ２イントロンＬ断片をｐＺＵ６１１から単離し、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＺＵ６１５のＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流およびＮＯＳターミネーターの上流にクローニングする。新しい構築物をｐＺＵ６１６と命名する。この断片の挿入は、同時に、次の３段階のクローニングのためのさらなる制限部位をカセットに提供する。
【００８５】
非翻訳（ｎｔ）７３９ｂｐ ＰＲＳＶ ＣＰ断片(Shyi-Dong, Y., et al,(1992).Journal of General Virology 73, 2531-2541)を増幅するために、二種のプライマーをShyi-Dong Yehからのフランスの圃場の分離株の配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６５：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧ―３’、配列番号２１）はＰＲＳＶ ＣＰの開始コドンの２８５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＰＲＳＶ ＣＰ断片の５’末端にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を付加する。３’プライマー（ＺＵＰ１５６６：５’―ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＴＡＣＣ―３’、配列番号２２）は、ＰＲＳＶ ＣＰの停止コドンの５５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＰＲＳＶ ＣＰ断片の３’末端にＮｈｅＩ制限部位を付加する。増幅したＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、新しいプラスミドをｐＺＵ６１２と命名する。
【００８６】
７３５ｂｐ非翻訳ＺＹＭＶ ＣＰ断片(Gal-On, A., et al,(1990. Gene 87, 273-277)を増幅するために、２種のプライマーをGal-On, A.からのフランス圃場分離株の配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６７：５’―ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＣＣＧＧ―３’、配列番号２３）はＺＹＭＶ ＣＰの開始コドンの２５３ｂｐ下流にアニーリングし、ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片の５’末端にＮｈｅＩ制限部位を含む。３’プライマー（ＺＵＰ１５６８：５’―ＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣ―３’、配列番号２４）は、ＺＹＭＶ ＣＰ停止コドンの８９ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＺＹＭＶ ＣＰ断片の３’末端にＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。増幅したＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１３と命名する。ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片を次に、ｐＺＵ６１６にＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流でＡｃｔ２イントロンLの上流にクローニングする。この目的のために、７１９ｂｐ ＮｈｅＩ／ＳａｃｌＩ ＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１３から単離し、ｐＺＵ６１６のＮｈｅＩおよびＳａｃｌＩ部位にクローニングする。この構築物をｐＺＵ６１７と命名する。次に、ＰＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１７にＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流でＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片の上流にクローニングする。この目的のために７２０ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ ｐＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１２から単離し、ｐＺＵ６１７のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングする。この新しい構築物をｐＺＵ６１８と命名する。
【００８７】
遺伝子カセットを完成するためにクローンニングすべき最後の断片は、ＰＲＳＶ ＣＰ非翻訳断片および同じ配向でその下流にＺＹＭＶ ＣＰ非翻訳断片を含む。対応する断片をテンプレートとしてｐＺＵ６１８からＰｆｘ ＰＣＲ並びにプライマーＺＵＰ１５６５およびＺＵＰ１５６８を使用して増幅する。このＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、得られたプラスミドをｐＺＵ６１９と命名する。
逆方向反復遺伝子カセットを構築するためにＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片を、ｐＺＵ６１８プラスミドにすでに存在するＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片と逆方向にｐＺＵ６１８に挿入する。この目的のために１４４５ｂｐ ＳａｌＩ／ＮｃｏＩ ＰＲＳＶ ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶ ＣＰ（ｎｔ）断片をｐＺＵ６１９から単離し、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＺＵ６１８にＡｃｔ２イントロンＬの下流でＮＯＳターミネーターの上流にクローニングする。得られたプラスミドをｐＺＵ６２２と命名する。当該カセットをバイナリーベクターｐＺＵ５４７、ＳＭＡＳプロモーター／ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットをさらに含むプラスミドｐＶｉｃｔｏｒＨｉｎｋに由来するバイナリーベクターに挿入する。この末端に逆方向反復遺伝子カセットを含む５４１４ｂｐ ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ ＤＮＡ断片をｐＺＵ６２２から単離し、ｐＺＵ５４７のＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位にタンデム配向で選択カセットの上流にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ６２３（配列番号２５）と命名する。
【実施例１１】
【００８８】
実施例１１：トマトにおけるジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）のための植物形質転換ベクターの構築
R.A.A. van der Vlugtの論文「Engineering resistance against potato virus Y」(1993)に公開されたＰＶＹｎ（ＰＶＹのフランス圃場分離株）の配列に基づいて、２種のプライマー（ＺＵＰ１５９８：５’―ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＧＴＣ―３’、配列番号２６、およびＺＵＰ１５９０：５’― ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧ―３’、配列番号２７）を使用して、標準的ＰＣＲによって、Life TechnologiesからのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを使用して、コートタンパク質シストロン配列および９９ヌクレオチドの３’末端非翻訳領域を含む８０４ｂｐ断片を増幅する。増幅したＰＣＲ断片を平滑末端断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｐＺＵＡと命名する。増幅したＰＶＹ特異的挿入物をＢａｍＨＩ／ＳａｃｌＩ断片として切除し、ｐＺＵ６１６のＢａｍＨＩ／ＳａｃｌＩ部位にクローニングし（実施例１０参照）、ｐＺＵＢを得る。ＰＺＵＢおよびｐＺＵＣの両方をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化する。ｐＺＵＡからのＰＶＹ特異的断片をアガロースゲルから精製し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したｐＺＵＢにライゲートし、以下のエレメントを含むｐＺＵＣを得る：
イントロンを有するＵＢＩ３プロモーター、続いてＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ断片トしてのセンス配向のＰＶＹ ＰＣＲ産物、続いてＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ ＡＣＴ２イントロン、続いてＳａＩＩ／ＮｃｏＩ断片としてのアンチセンス配向のＰＶＹ ＰＣＲ産物、さらに最後にＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてのｎｏｓターミネーター。最終的にｐＺＵＣを、ｐＨｉＮＫ０８５バイナリーベクター由来のＳＭＡＳプロモーター／ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットを含むバイナリーベクターｐＺＵ５４７にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ６３４（配列番号２８）と命名する。
【実施例１２】
【００８９】
実施例１２：メロンおよびトマト植物材料へのバイナリーベクターの形質転換
植物材料へのバイナリーベクターの送達方法は確立され当業者に既知である。その方法を、例えば、使用するアグロバクテリウム株の相違、外植体材料の起源の相違、再生系の相違、および形質転換されるべき植物種の品種の相違によって変える。前記実施例１０および１１のバイナリー植物形質転換ベクターを、後記手段にしたがって形質転換実験に使用する。バイナリーベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスに送達し、続いて植物外植体材料と形質転換したアグロバクテリウム株を接種、共培養し、適当な抗生物質を使用してアグロバクテリウム株を選択的に殺し、マンノースを含む選択培地上で成長させることによって形質転換した細胞を選択し、組織をシュート誘導培地に移し、発根誘導培地に選択したシュートを移し、小植物体を土に移す。前記実施例１０および１１の遺伝子カセットの存在を確認するために、トランスジェニック植物からの全ＤＮＡを周知のサザンブロッティング分析法を使用して分析する。
【実施例１３】
【００９０】
実施例１３：ＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ抵抗性についてのトランジェニックメロン植物のスクリーニング
病原体に感染しないように、形質転換した植物をグリーンハウスで標準的隔離条件で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ、種子を収穫する。
最初の形質転換体のＳ１後代の１００植物を、挿入した遺伝子の分離について分析し、次に機械的接種によってＺＹＭＶで感染させる。ＺＹＭＶで全体に感染した宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに１週齢の苗の子葉および第１葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生をモニターする。ＺＹＭＶ配列を有する植物は、ＺＹＭＶ感染に対する感受性が減少し、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＺＹＭＶ感染を示す。ＺＹＭＶ耐性植物を自殖し、種子を収穫する。トランスジェニックＺＹＭＶ抵抗性植物を、前記の方法にしたがってＰＲＳＶで機械的に接種する。ＺＹＭＶにすでに抵抗性の植物は、ＰＲＳＶ感染に対しても感受性が減少しており、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＰＲＳＶ症状を示す。
【実施例１４】
【００９１】
実施例１４：ＰＶＹに抵抗性のトランスジェニックトマト植物のスクリーニング
形質転換した植物を、病原体の感染を防止するために、標準的隔離条件下でグリーンハウス内で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ種子を収穫する。
最初の形質転換体のＳ１後代の５０植物を、挿入した遺伝子の分離について分析し、次に機械的接種によってＰＶＹで感染させる。ＰＶＹで全身的に感染した宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに５週齢の苗の最初の２枚の十分に伸長した葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生をモニターする。ＰＶＹ配列を有する植物は、ＰＶＹ感染への感受性が減少し、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＰＶＹ症状を示す。
前記の実施態様は例示である。本発明の記載は当業者に本発明の多くの変更を有するものを提供する。自明で予測可能な変更は、すべて添付のクレームに包含することを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３の１１３２−１７３７ヌクレオチド、配列番号１７の１７３９−２１６６ヌクレオチド、配列番号２５の１７９０−２４３０ヌクレオチド、配列番号２５の２５１１−３１１１ヌクレオチド、および配列番号２８の１７９０−２５７４ヌクレオチドに見られるＤＮＡ配列を１個以上そのウイルス遺伝子内に含むウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対する抵抗性または耐性を植物細胞に付与する方法であって：
１対よりも多い対のＤＮＡ配列を植物細胞に導入する工程を含む方法であって、各々の対に関し、第１のＤＮＡ配列が当該ウイルスのウイルス遺伝子の一部をコードし、対となる第２のＤＮＡ配列が、第１のＤＮＡのアンチセンス配列をコードし、対をなす第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡ配列が、ウイルス感染により、当該植物細胞で発現したときに二本鎖ＲＮＡを形成するものであり；当該対をなすＤＮＡ配列により、ウイルス遺伝子の一部が減少した発現がもたらされるものであり；さらに、当該一群の１より多いウイルスに対する当該植物細胞の抵抗性または耐性をもたらす、少なくとも２対の導入されたＤＮＡ配列が当該一群の異なるウイルスに由来するものである、方法。
【請求項２】
各々の対の当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が当該植物細胞のゲノムに安定的に組みこまれている、請求項１の方法。
【請求項３】
各々の対の当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が２個の別々のＤＮＡ分子に含まれている、請求項１の方法。
【請求項４】
当該ＤＮＡ配列がさらに各々の対の当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第２のプロモーターを含む、請求項３の方法。
【請求項５】
対をなす当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が１個のＤＮＡ分子に含まれている、請求項１の方法。
【請求項６】
対をなす当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれている、請求項５の方法。
【請求項７】
対をなす当該第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡ配列が１個のＲＮＡ分子に含まれている、請求項６の方法。
【請求項８】
当該ＲＮＡ分子がフォールディングし、そこに含まれる当該ＲＮＡ配列が二本鎖領域を形成することのできる、請求項７の方法。
【請求項９】
当該ＤＮＡ分子がさらに当該第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されているプロモーターを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
当該プロモーターが異種性のプロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１１】
当該プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１２】
当該プロモーターが発育段階に応じて調節されるプロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１３】
当該プロモーターが構成的プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１４】
当該プロモーターが誘導可能プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１５】
当該ＤＮＡ分子がさらに第１および第２のＤＮＡ配列の間のリンカーを含む、請求項７の方法。
【請求項１６】
第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされる当該ＲＮＡ配列が２個のＲＮＡ分子に含まれている、請求項６の方法。
【請求項１７】
当該第１のＤＮＡ配列が第１のプロモーターに実施可能なように連結され、当該第２のＤＮＡ配列が第２のプロモーターに実施可能なように連結されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が、双方向性プロモーターに実施可能なように連結されている、請求項１６の方法。
【請求項１９】
当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれている、請求項６の方法。
【請求項２０】
当該第１のＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ分子中の当該第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
当該ＤＮＡ分子がさらに、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項１の方法により得られる植物細胞であって、当該細胞が当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物細胞。
【請求項２３】
請求項２２の植物細胞を含む植物であって、当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物。
【請求項２４】
請求項２２の植物細胞から再生した植物であって、当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物。
【請求項２５】
請求項２４の植物から生産された種子であって、当該種子が当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性であり、当該１対より多い対のＤＮＡ配列を含むものである、種子。
【請求項１】
配列番号１３の１１３２−１７３７ヌクレオチド、配列番号１７の１７３９−２１６６ヌクレオチド、配列番号２５の１７９０−２４３０ヌクレオチド、配列番号２５の２５１１−３１１１ヌクレオチド、および配列番号２８の１７９０−２５７４ヌクレオチドに見られるＤＮＡ配列を１個以上そのウイルス遺伝子内に含むウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対する抵抗性または耐性を植物細胞に付与する方法であって：
１対よりも多い対のＤＮＡ配列を植物細胞に導入する工程を含む方法であって、各々の対に関し、第１のＤＮＡ配列が当該ウイルスのウイルス遺伝子の一部をコードし、対となる第２のＤＮＡ配列が、第１のＤＮＡのアンチセンス配列をコードし、対をなす第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡ配列が、ウイルス感染により、当該植物細胞で発現したときに二本鎖ＲＮＡを形成するものであり；当該対をなすＤＮＡ配列により、ウイルス遺伝子の一部が減少した発現がもたらされるものであり；さらに、当該一群の１より多いウイルスに対する当該植物細胞の抵抗性または耐性をもたらす、少なくとも２対の導入されたＤＮＡ配列が当該一群の異なるウイルスに由来するものである、方法。
【請求項２】
各々の対の当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が当該植物細胞のゲノムに安定的に組みこまれている、請求項１の方法。
【請求項３】
各々の対の当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が２個の別々のＤＮＡ分子に含まれている、請求項１の方法。
【請求項４】
当該ＤＮＡ配列がさらに各々の対の当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第２のプロモーターを含む、請求項３の方法。
【請求項５】
対をなす当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が１個のＤＮＡ分子に含まれている、請求項１の方法。
【請求項６】
対をなす当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれている、請求項５の方法。
【請求項７】
対をなす当該第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡ配列が１個のＲＮＡ分子に含まれている、請求項６の方法。
【請求項８】
当該ＲＮＡ分子がフォールディングし、そこに含まれる当該ＲＮＡ配列が二本鎖領域を形成することのできる、請求項７の方法。
【請求項９】
当該ＤＮＡ分子がさらに当該第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されているプロモーターを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
当該プロモーターが異種性のプロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１１】
当該プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１２】
当該プロモーターが発育段階に応じて調節されるプロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１３】
当該プロモーターが構成的プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１４】
当該プロモーターが誘導可能プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１５】
当該ＤＮＡ分子がさらに第１および第２のＤＮＡ配列の間のリンカーを含む、請求項７の方法。
【請求項１６】
第１および第２のＤＮＡ配列によりコードされる当該ＲＮＡ配列が２個のＲＮＡ分子に含まれている、請求項６の方法。
【請求項１７】
当該第１のＤＮＡ配列が第１のプロモーターに実施可能なように連結され、当該第２のＤＮＡ配列が第２のプロモーターに実施可能なように連結されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が、双方向性プロモーターに実施可能なように連結されている、請求項１６の方法。
【請求項１９】
当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれている、請求項６の方法。
【請求項２０】
当該第１のＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ分子中の当該第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
当該ＤＮＡ分子がさらに、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項１の方法により得られる植物細胞であって、当該細胞が当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物細胞。
【請求項２３】
請求項２２の植物細胞を含む植物であって、当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物。
【請求項２４】
請求項２２の植物細胞から再生した植物であって、当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性である植物。
【請求項２５】
請求項２４の植物から生産された種子であって、当該種子が当該フロウイルス、ポティウイルス、およびルテオウイルスからなる群から選択される１より多いウイルスに対して抵抗性または耐性であり、当該１対より多い対のＤＮＡ配列を含むものである、種子。
【公開番号】特開２０１０−８８４３５（Ｐ２０１０−８８４３５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５５０８７（Ｐ２００９−２５５０８７）
【出願日】平成２１年１１月６日（２００９．１１．６）
【分割の表示】特願２００８−２２４７５３（Ｐ２００８−２２４７５３）の分割
【原出願日】平成１２年５月８日（２０００．５．８）
【出願人】（５０１０１６５５９）シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｙｎｇｅｎｔａ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎｓ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月６日（２００９．１１．６）
【分割の表示】特願２００８−２２４７５３（Ｐ２００８−２２４７５３）の分割
【原出願日】平成１２年５月８日（２０００．５．８）
【出願人】（５０１０１６５５９）シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｙｎｇｅｎｔａ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎｓ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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