エリスロアスコルビン酸の製造方法
【課題】アスコルビン酸の代替として有用なエリスロアスコルビン酸を高変換率で効率よく製造する。
【解決手段】アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌、好ましくはペニシリウム属、特に、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）と接触させ、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取する。このとき、真菌は、固定化担体に固定化されていてもよい。
【解決手段】アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌、好ましくはペニシリウム属、特に、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）と接触させ、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取する。このとき、真菌は、固定化担体に固定化されていてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロアスコルビン酸の製造方法に関し、特に微生物を用いたエリスロアスコルビン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロアスコルビン酸は、ビタミンＣ（アスコルビン酸）の酸化分解によって得られるビタミンＣ誘導体の１種である（非特許文献１を参照）。また、カビ及び酵母においてビタミンＣ様化合物として作用しており、特に、ビタミンＣと同様に抗酸化作用があり、またビタミンＣよりも安定性が高いので、ビタミンＣに代わる物質として期待されている（例えば、非特許文献２〜４）。
しかしながら、エリスロアスコルビン酸の化学合成（例えば非特許文献２及び５）は、複雑でコスト高を招き、効率的ではない。また、酵母を用いてエリスロアスコルビン酸を生成させることもできるが、そもそも酵母におけるエリスロアスコルビン酸の生成量は微量（例えば非特許文献６）であるため、大量生産には向かない。
一方、酵母におけるエリスロアスコルビン酸生合成の最終ステップに関与するＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼを大腸菌に機能的に組み込んで生成させる系では、大腸菌においてエリスロアスコルビン酸を生成することができる（例えば非特許文献７）。しかしながら、得られるエリスロアスコルビン酸は大腸菌の菌体内に蓄積されるため精製が容易でなく、生産量自体も１７８μｇ／ｇ菌体程度に過ぎない。
【非特許文献１】Arch Biochem. Biophys., 355,9-14 (1998)
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 41, 1391-1396 (1993)
【非特許文献３】Mol. Microbiol., 30, 895-903 (1998)
【非特許文献４】Infect. Immun., 69, 3939-3946 (2001)
【非特許文献５】Carbohydr. Res., 220, 117-125 (1991)
【非特許文献６】Biochim. Biophys. Acta., 1429, 29-39 (1998)
【非特許文献７】Appl. Emviron. Microbiol., 65, 4684-4687 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このようにエリスロアスコルビン酸を生成するために化学合成、生合成の両面から検討・開発されているが、いずれも工業的な生産という観点から充分ではない。
従って、本発明の目的は、エリスロアスコルビン酸を効率よく製造可能なエリスロアスコルビン酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法は、アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、を含むものである。
ここで、前記アスコルビン酸分解能を有する真菌は、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ケトミウム属（Chaetomium）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属及びドレクスレラ（Drechslera）属から成る群より選択された菌であるが好ましく、このうちペニシリウム属、特にペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）であることが更に好ましい。
また、前記真菌が、固定化担体に固定化されていてもよい。
【０００５】
本発明では、アスコルビン酸分解能を有する真菌が、アスコルビン酸と接触して、これを代謝すると、高い効率でアスコルビン酸をエリスロアスコルビン酸に変換する。この結果、生成されたエリスロアスコルビン酸は菌体外へ放出されるので、エリスロアスコルビン酸の回収と精製が容易になる。また真菌によるエリスロアスコルビン酸の生成能は、通常の酵母と比較して顕著に高い。従って、この真菌を用いることによって、エリスロアスコルビン酸から効率よくエリスロアスコルビン酸が得られることが見出された。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、エリスロアスコルビン酸を、アスコルビン酸とペニシリウム属の真菌とを接触させることにより製造するので、エリスロアスコルビン酸を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法は、アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、を含むものである。
【０００８】
本製造方法で用いられる真菌は、アスコルビン酸分解能を有する菌であればよく、無性世代及び有性世代のいずれであってもよい。中でもアスペルギルス属、ケトミウム属（Chaetomium）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属及びドレクスレラ（Drechslera）属から成る群より選択された真菌、特にペニシリウム属が好ましい。このようなペニシリウム属としては、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８、２００５年７月２１日付で受領）が生成能の観点から特に好ましい。
【０００９】
このペニシリウムＮｏ．１９６Ｆは、土壌より分離した真菌であり、形態的な特徴は、以下の通りである。
培養的・形態的性質
（１）巨視的観察結果
ａ） ポテトデキストロース寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３０〜３５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greenish grey （29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｂ） ２％麦芽寒天培地での形態観察
コロニーの直径：５０〜５３ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Dark green（29F-8）〜Greenish grey （29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｃ） オートミール寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３３〜３５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greyish green（29B-C-3）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｄ） ＬＣＡ培地（三浦培地）での形態観察
コロニーの直径：５５〜６５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greyish green（29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
【００１０】
ｅ） ツァペック酵母エキス寒天培地（２５℃）での形態観察
コロニーの直径：２０〜２２ｍｍ
表面性状：ビロード状〜羊毛状、放射状の溝を形成
可溶性色素産生の有無：無
ｆ） ツァペック酵母エキス寒天培地（３７℃）での形態観察
コロニーの直径：５〜９ｍｍ
コロニー表面の色調：White（1A-1)
コロニー裏面の色調：Light orange（5A-5）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｇ） 麦芽エキス寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３５〜３７ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：White（1A-1）
表面性状：羊毛状
可溶性色素産生の有無：無
ｈ） 硝酸グリセロール寒天培地での形態観察
コロニーの直径：５〜６ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：White（1A-1）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
＊色調のカッコ内は、Kornerup A. and Wanscher, J. H. (1978) Methuen handbook of colour, 3rd ed., Eyre Methuen, London, UK, pp.243で用いられている色のコード番号を示す。
【００１１】
（２）微視的観察結果
栄養菌糸
菌糸は寒天表面上若しくは寒天内に形成され、無色、有隔壁菌糸の形成が認められた。
生殖器官
・分生子柄及び分生子形成細胞
上記ａ）〜ｄ）の培地による形態観察では、分生子柄は規則的に分岐し、分生子柄の先端部から円筒状のメトレが形成され、その先に分生子形成細胞であるフィアライドが形成される二輪生、及びメトレが形成されない単輪生のペニシルスが観察された。フィアライドはアンプル状を示した。
また、上記ｅ）〜ｈ）の培地による形態観察では、分生子柄は栄養菌糸に直生し、分岐せず、柄の先端部にはやや膨らみが認められ、その先端に円筒形のメトレ（１０〜１５×２〜３μｍ）が形成され、メトレの先端に分生子形成細胞であるフィアライド（８〜１０×２〜２．５μｍ）が形成される二輪生のペニシルスが主に観察された。
・分生子
上記ａ）〜ｄ）の培地による形態観察では、分生子はフィアロ型分生子であり、フィアライドから鎖状に連なって形成され、卵形〜楕円形、細胞、表面は平滑或いはややいぼ状であった。
・有性生殖器官
上記ａ）〜ｄ）の培地では、長期培養によるテレオモルフの形成は確認できない。
【００１２】
本Ｎｏ．１９６Ｆの形態的特徴による分類学的性質に基づき、Arx, J. A. von (1981) The genera of fungi sporulating in pure culture 3rd edition, A. R. Gantner Verlag KG., Vaduz, Germany, pp.424、Barron, G. L. (1968) The genera of hyphomycetes from soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, MD, USA, pp.364、Domsch, K. H., Gams, W. and Anderson, T.-H. (1993) Compendium of soil fungi, Volume I, IHW-Verlag, Eching, Germany, Reprinted, pp.860、Domsch, K. H., Gams, W. and Anderson, T.-H. (1993) Compendium of soil fungi and supplement, Volume II, IHW-Verlag, Eching, Germany, Reprinted, pp.405、Kiffer, E. and Morelet, M. (2000) The Deuteromycetes :Mitosporic fungi classification and generic keys, Science Publishers Inc., Enfield, NH, USA, pp.273、及びKirk, P. M., Cannon, P. F., David, J. C. and Stalpers, J. A. (2001) Dictionary of the fungi 9th edition, CAB International, Wallingfork, UK, pp.655 を参考に、分類・同定を行った結果、本Ｎｏ．１９６株は、ペニシリウム（Penicillium）属であると推察された。
【００１３】
また上記ｅ）〜ｈ）において、ペニシルスは二輪生、フィアライドはアンプル形であり、メトレの長さがフィアライドに比べて長いという特徴が認めたこと、メトレが分生子柄先端の株から分岐するように形成されるペニシルスであることから、Pitt, J. I. (1979) The genus Penicillium and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces, Academic Press, London, UK, 634pp. に基づいて、ペニシリウム属のうちでも、Furcatum亜属、Divaricatum節の１菌種であると推察された。
【００１４】
本発明に用いられる真菌の培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれでもよく、特に制限されない。例えば、ポテトデキストロース寒天培地（培地組成：馬鈴薯（２００ｇ）抽出液１０００ｍｌ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ）などの培地において２５℃の好気条件下、静置培養で維持、増殖することができる。また液体培地及び固体培地のいずれであってもよいが、アスコルビン酸と接触させる際には生成物の回収の観点から液体培地であることが好ましい。なお、固体培地での培養後にアスコルビン酸製造のための液体培地に供する場合には、アスコルビン酸分解能を有する真菌を液体培地による前培養に供することが好ましい。
【００１５】
液体培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれであってもよく、一例としては、グルコース２質量％、デンプン２質量％、乾燥ブイヨン０．５質量％、酵母エキス０．２質量％、大豆ミール０．５質量％、消泡剤０．０１質量％による培地を挙げることができるが、菌の種類及び状態に応じて適宜変更可能である。
【００１６】
本発明によるエリスロアスコルビン酸の生成は、生産用培地による本培養工程によって行われる。この本培養工程は、アスコルビン酸の添加前の非生産工程と、アスコルビン酸の添加後の生産工程とで構成されている。
本培養工程に使用される培地には、生産用の液体培地を用いることが好ましい。
このような液体培地は、通常、微生物による化合物生産に使用可能であることが知られている培地であればいずれであってもよく、上記前培養用の液体培地に対して各種無機栄養素、例えば硝酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどを含むものが用いられる。また生産用液体培地のｐＨは、一般に３〜９、好ましくは５〜６である。
また本培養は、上記生産用液体培地を用いて静置培養または振盪培養による。振盪培養を適用する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェーカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの培地量とした場合に３０ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとすることができる。培養の際の温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。４℃よりも低いとエリスロアスコルビン酸への変換が起こらない場合があり好ましくなく、一方５０℃よりも高いと変換のための酵素活性が低下する場合があり、好ましくない。
【００１７】
アスコルビン酸と接触させる際の菌体濃度は、真菌の種類又は生育状態によって異なるが、一般に、湿重量で０．０１〜０．１ｇ／ｍｌである。但し、さらに増やすことも可能である。
【００１８】
真菌と接触されるアスコルビン酸は、真菌と接触して代謝することができる形態であれば、粉体及び液体のいずれであってもよいが、真菌への取り込み量や生成されたエリスロアスコルビン酸の回収容易性の観点から液体であることが好ましい。アスコルビン酸溶液を得るための溶媒としては、いずれのものであってもよく、水、メタノール、エタノール等を挙げることができる。アスコルビン酸溶液の濃度は、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。なお、アスコルビン酸溶液はｐＨを調整して、培地のｐＨと同様にｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜７とすることが好ましい。
【００１９】
アスコルビン酸の添加量は、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に、０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは３〜３０ｍｇ／ｍｌの量で培養系に添加すればよい。０．１ｍｇ／ｍｌよりも少ないとエリスロアスコルビン酸が得られない場合があり、一方、２００ｍｇ／ｍｌを超えると変換が不完全になる場合があるため、それぞれ好ましくない。
【００２０】
本培養工程のうち非生産工程は、使用される真菌の種類や前培養における菌の生育状態・数によって異なるが、一般に、生産用培地による本培養開始直後〜４８時間、変換効率の観点から好ましくは１０〜４８時間、更に好ましくは１８〜３２時間行うことができる。４８時間を超えると、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換効率が急激に低下して、エリスロアスコルビン酸を得ることができない場合があり、好ましくない。詳細は不明であるが、原料物質であるアスコルビン酸と生成物であるエリスロアスコルビン酸とは、それぞれこの培養系で分解していると考えられる。従って、高い変換効率でアスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸を得るためには、特にエリスロアスコルビン酸の分解速度を抑えることが好ましい。非生産工程を上述した期間にすることによって、その後の生産工程におけるエリスロアスコルビン酸の分解速度を抑えることができると考えられ、その結果、高い変換効率でエリスロアスコルビン酸を得ることができる。
【００２１】
生産工程は、培養系へアスコルビン酸が添加されることによって開始される。アスコルビン酸と真菌との接触時間は、すべてのアスコルビン酸がエリスロアスコルビン酸に変換されるまで継続することができ、真菌の種類及び培養状態によって異なるが、一般に１０〜８０時間、好ましくは２４〜４８時間であればよい。この間に、真菌がアスコルビン酸と接触してアスコルビン酸を代謝してエリスロアスコルビン酸に変換・生成し、菌体外へ放出する。なお、生産工程の継続時間は、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換状態によって適宜変更することができる。このような変換状態の確認は、例えば薄層クロマトグラフィーなどの既知の手段を用いて容易に行うことができる。
【００２２】
培養系に放出されたエリスロアスコルビン酸は、採取工程によって採取される。このときエリスロアスコルビン酸を採取する方法としては、生産培地中に放出された化合物を回収又は精製できることが知られている手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
各採取手段を使用する前には、培養系から菌体を除去することが好ましい。菌体の除去には、濾過等を用いればよい。
得られたエリスロアスコルビン酸は、公知の化学分析、機器分析によって確認することができる。
【００２３】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法において、真菌は、固定化担体に固定化されていてもよい。
この場合には、菌体が固定化担体に固定化されているので、真菌を培養する必要がなく、エリスロアスコルビン酸を、培地成分を含まない状態で生成・回収することができ、またエリスロアスコルビン酸と菌体との分離を容易に行うことができる。これにより、エリスロアスコルビン酸の分離・精製工程を簡略化することができる。
【００２４】
ここで用いられる固定化担体としては、本発明にかかる真菌を固定化できるものであればよく、例えば、ガラス、シリカなどの無機材料や、例えば寒天、カラギーナンなどの有機材料を挙げることができる。これらの担体に対して真菌を固定化する方法は、当業界では公知であり、真菌の種類等に合わせて適宜選択することができる。
【００２５】
固定化担体は、また真菌が固定化できればいずれの形態であってもよく、板状、球状、粉状などを挙げることができる。板状の場合には、アスコルビン酸溶液を固定化担体上に添加すればよく、また粉状の場合には、所定の容器に詰めてカラムを構成し、アスコルビン酸溶液をカラムに通せばよい。このような固定化担体とアスコルビン酸との接触形態の選択及び接触は、当業者には容易に実施することができる。
固定化担体への真菌の固定化は、真菌の種類等によって異なるが、一般に０．１〜５００ｍｇ／ｍｌ、生産量の観点から好ましくは５０〜３００ｍｇ／ｍｌの菌体密度で行うことができる。
【００２６】
本発明の製造方法によれば、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸へ高い効率で変換することができ、通常、アスコルビン酸１００ｍｇから５０〜８０ｍｇのエリスロアスコルビン酸に変換することができる（６０〜９８モル％の変換効率）。このような高い変換効率は、これまでに報告がなく、本発明によって初めて得られたものである。なお、変換効率は本培養工程における非生産工程の長さによって変更することができる。
また、本発明によって得られるエリスロアスコルビン酸は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）よりも安定性が高く、同様の抗酸化作用を持つことが知られている。このため、本発明では、効率よく生産されたエリスロアスコルビン酸を、アスコルビン酸の代替品として広範な用途に安価に供給することが可能となる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２８】
［実施例１］
ペニシリウムＮｏ１９６Ｆによるアスコルビン酸の生成
千葉県館山市沖ノ島公園で採取した土壌から、ビタミンＣ分解能に基づいて、真菌ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ株を選別した。
この真菌を、下記に示す前培養培地１００ｍｌを含むバッフル付き５００ｍｌフラスコで、４日間２５℃にて振とう培養（前培養）し、シードを得た。得られたシードを、下記に示す生産培地１００ｍｌを含むバッフル付き５００ｍｌフラスコに対して、５ｍｌ添加して、１日２５℃で振とう培養した。
この培養液に、ビタミンＣ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ；３Ｍ ＮａＯＨでｐＨ６に調整）を１５ｍｌ添加し、２４時間２５℃で振とう培養した。ビタミンＣからエリスロアスコルビン酸への変換の様子は薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル６０ Ｆ２５４、展開溶媒：クロロホルム−メタノール−酢酸（５：４：１））で確認できた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
培養後、フラスコ２本の培養液を吸引ろ過して菌体を除去後、得られたろ液２００ｍｌに１．８ＬのＭｅＯＨを添加した。この操作で淡黄色の不溶物（約５０ｍｌ）が生じたが、これも合わせて次の操作に用いた。
この抽出液を２回のクロマトグラフィーにかけた。
１回目のアビセル（結晶性セルロース）カラムクロマトグラフィーは、アビセル（ＡＶＩＣＥＬ；旭化成）をＭｅＯＨに懸濁して得られた直径３５ｍｍ、高さ３５０ｍｍのカラムとして使用した。これに上記抽出物を注入した。その後、７００ｍｌの８０％ＭｅＯＨ、５００ｍｌの７５％ＭｅＯＨでカラムを順次展開した。転換物は素通り画分、および８０％ＭｅＯＨ画分の前半に回収された。
転換物を含む画分をまとめて減圧濃縮した後に、残った水溶液を凍結乾燥により、粗精製物を得た。
【００３１】
２回目のアビセルカラムクロマトグラフィーは、アビセルをクロロホルム−ＭｅＯＨ（９：１）に懸濁して得られた直径２５ｍｍ、高さ６００ｍｍのカラムとして使用した。これに上記粗精製物の半量の懸濁液（６０ｍｌのＭｅＯＨに溶解後、５４０ｍｌのクロロホルムと混合）を注入した。その後、２５０ｍｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（９：１）、１Ｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（８：２）、８００ｍｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（７：３）で順次カラムを展開した。転換物はクロロホルム−ＭｅＯＨ（８：２）画分の半ばからクロロホルム−ＭｅＯＨ（７：３）画分の前半にかけて回収された。
【００３２】
次いで、転換物を含む画分をまとめて減圧濃縮して０．４ｇの乾固物を得た。得られた乾固物を４ｍｌのＭｅＯＨに溶解後、そのうちの１．２ｍｌを４回に分けてInertsil ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（３０×２５０ｍｍ；GL Science）を用いて分画した（４０℃）。展開溶媒として０．１％（v/v）ギ酸水溶液−ＭｅＯＨを用い、ＭｅＯＨ濃度をサンプル注入後０％から５０％まで２５分間で直線的に増加させた。流速は毎分１５ｍｌ、検出は２２０ｎｍの吸収を用いた。この条件で、保持時間７．３分から８．１分の画分を集めた（図１参照）。
その後、得られた画分をまとめて減圧濃縮後、残った水溶液を凍結乾燥し、２１ｍｇの精製標品を得た。
【００３３】
［実施例２］
得られたエリスロアスコルビン酸の特性
ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、１Ｈ ６００ＭＨｚ， １３Ｃ １５０ＭＨｚ、５０℃で測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６溶液とした。
ＭＳは、ＳＸ−１０２Ａ（ＪＥＯＬ）を用い、negative ion modeでグリセロールをマトリックスとして測定した。
ＵＶは、３２０ spectrophotometer（Hitachi）を用いた。試料はＭｅＯＨに溶解した（２５mｇ／ｍｌ）。
ＩＲは、ＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０（ＪＥＯＬ）を用いた。ＭｅＯＨに溶解した試料５０mｇを岩塩に塗布して測定した。
旋光度は、ＤＩＰ−３６０（ＪＡＳＣＯ）を用いた（２０℃、Ｎａ）。試料はＭｅＯＨに溶解した（５ｍｇ／ｍｌ）。
結果を表２及び３、図２及び３に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
これらの結果から、本方法によって得られた化合物は、純度の高い下記のＬ−エリスロアスコルビン酸であることは明らかであった。
【００３７】
【化１】
【００３８】
このように本発明によれば、アスコルビン酸と真菌、特にペニシリウムＮｏ１９６とを接触させることにより、アスコルビン酸の代替として有用なエリスロアスコルビン酸を、効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本実施例にかかるクロマトグラフィーのチャートである。
【図２】本実施例にかかるＩＲスペクトルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロアスコルビン酸の製造方法に関し、特に微生物を用いたエリスロアスコルビン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロアスコルビン酸は、ビタミンＣ（アスコルビン酸）の酸化分解によって得られるビタミンＣ誘導体の１種である（非特許文献１を参照）。また、カビ及び酵母においてビタミンＣ様化合物として作用しており、特に、ビタミンＣと同様に抗酸化作用があり、またビタミンＣよりも安定性が高いので、ビタミンＣに代わる物質として期待されている（例えば、非特許文献２〜４）。
しかしながら、エリスロアスコルビン酸の化学合成（例えば非特許文献２及び５）は、複雑でコスト高を招き、効率的ではない。また、酵母を用いてエリスロアスコルビン酸を生成させることもできるが、そもそも酵母におけるエリスロアスコルビン酸の生成量は微量（例えば非特許文献６）であるため、大量生産には向かない。
一方、酵母におけるエリスロアスコルビン酸生合成の最終ステップに関与するＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼを大腸菌に機能的に組み込んで生成させる系では、大腸菌においてエリスロアスコルビン酸を生成することができる（例えば非特許文献７）。しかしながら、得られるエリスロアスコルビン酸は大腸菌の菌体内に蓄積されるため精製が容易でなく、生産量自体も１７８μｇ／ｇ菌体程度に過ぎない。
【非特許文献１】Arch Biochem. Biophys., 355,9-14 (1998)
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 41, 1391-1396 (1993)
【非特許文献３】Mol. Microbiol., 30, 895-903 (1998)
【非特許文献４】Infect. Immun., 69, 3939-3946 (2001)
【非特許文献５】Carbohydr. Res., 220, 117-125 (1991)
【非特許文献６】Biochim. Biophys. Acta., 1429, 29-39 (1998)
【非特許文献７】Appl. Emviron. Microbiol., 65, 4684-4687 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このようにエリスロアスコルビン酸を生成するために化学合成、生合成の両面から検討・開発されているが、いずれも工業的な生産という観点から充分ではない。
従って、本発明の目的は、エリスロアスコルビン酸を効率よく製造可能なエリスロアスコルビン酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法は、アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、を含むものである。
ここで、前記アスコルビン酸分解能を有する真菌は、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ケトミウム属（Chaetomium）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属及びドレクスレラ（Drechslera）属から成る群より選択された菌であるが好ましく、このうちペニシリウム属、特にペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）であることが更に好ましい。
また、前記真菌が、固定化担体に固定化されていてもよい。
【０００５】
本発明では、アスコルビン酸分解能を有する真菌が、アスコルビン酸と接触して、これを代謝すると、高い効率でアスコルビン酸をエリスロアスコルビン酸に変換する。この結果、生成されたエリスロアスコルビン酸は菌体外へ放出されるので、エリスロアスコルビン酸の回収と精製が容易になる。また真菌によるエリスロアスコルビン酸の生成能は、通常の酵母と比較して顕著に高い。従って、この真菌を用いることによって、エリスロアスコルビン酸から効率よくエリスロアスコルビン酸が得られることが見出された。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、エリスロアスコルビン酸を、アスコルビン酸とペニシリウム属の真菌とを接触させることにより製造するので、エリスロアスコルビン酸を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法は、アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、を含むものである。
【０００８】
本製造方法で用いられる真菌は、アスコルビン酸分解能を有する菌であればよく、無性世代及び有性世代のいずれであってもよい。中でもアスペルギルス属、ケトミウム属（Chaetomium）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属及びドレクスレラ（Drechslera）属から成る群より選択された真菌、特にペニシリウム属が好ましい。このようなペニシリウム属としては、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８、２００５年７月２１日付で受領）が生成能の観点から特に好ましい。
【０００９】
このペニシリウムＮｏ．１９６Ｆは、土壌より分離した真菌であり、形態的な特徴は、以下の通りである。
培養的・形態的性質
（１）巨視的観察結果
ａ） ポテトデキストロース寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３０〜３５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greenish grey （29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｂ） ２％麦芽寒天培地での形態観察
コロニーの直径：５０〜５３ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Dark green（29F-8）〜Greenish grey （29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｃ） オートミール寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３３〜３５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greyish green（29B-C-3）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｄ） ＬＣＡ培地（三浦培地）での形態観察
コロニーの直径：５５〜６５ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：Greyish green（29B-2）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
【００１０】
ｅ） ツァペック酵母エキス寒天培地（２５℃）での形態観察
コロニーの直径：２０〜２２ｍｍ
表面性状：ビロード状〜羊毛状、放射状の溝を形成
可溶性色素産生の有無：無
ｆ） ツァペック酵母エキス寒天培地（３７℃）での形態観察
コロニーの直径：５〜９ｍｍ
コロニー表面の色調：White（1A-1)
コロニー裏面の色調：Light orange（5A-5）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
ｇ） 麦芽エキス寒天培地での形態観察
コロニーの直径：３５〜３７ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：White（1A-1）
表面性状：羊毛状
可溶性色素産生の有無：無
ｈ） 硝酸グリセロール寒天培地での形態観察
コロニーの直径：５〜６ｍｍ
コロニー表面・裏面の色調：White（1A-1）
表面性状：ビロード状
可溶性色素産生の有無：無
＊色調のカッコ内は、Kornerup A. and Wanscher, J. H. (1978) Methuen handbook of colour, 3rd ed., Eyre Methuen, London, UK, pp.243で用いられている色のコード番号を示す。
【００１１】
（２）微視的観察結果
栄養菌糸
菌糸は寒天表面上若しくは寒天内に形成され、無色、有隔壁菌糸の形成が認められた。
生殖器官
・分生子柄及び分生子形成細胞
上記ａ）〜ｄ）の培地による形態観察では、分生子柄は規則的に分岐し、分生子柄の先端部から円筒状のメトレが形成され、その先に分生子形成細胞であるフィアライドが形成される二輪生、及びメトレが形成されない単輪生のペニシルスが観察された。フィアライドはアンプル状を示した。
また、上記ｅ）〜ｈ）の培地による形態観察では、分生子柄は栄養菌糸に直生し、分岐せず、柄の先端部にはやや膨らみが認められ、その先端に円筒形のメトレ（１０〜１５×２〜３μｍ）が形成され、メトレの先端に分生子形成細胞であるフィアライド（８〜１０×２〜２．５μｍ）が形成される二輪生のペニシルスが主に観察された。
・分生子
上記ａ）〜ｄ）の培地による形態観察では、分生子はフィアロ型分生子であり、フィアライドから鎖状に連なって形成され、卵形〜楕円形、細胞、表面は平滑或いはややいぼ状であった。
・有性生殖器官
上記ａ）〜ｄ）の培地では、長期培養によるテレオモルフの形成は確認できない。
【００１２】
本Ｎｏ．１９６Ｆの形態的特徴による分類学的性質に基づき、Arx, J. A. von (1981) The genera of fungi sporulating in pure culture 3rd edition, A. R. Gantner Verlag KG., Vaduz, Germany, pp.424、Barron, G. L. (1968) The genera of hyphomycetes from soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, MD, USA, pp.364、Domsch, K. H., Gams, W. and Anderson, T.-H. (1993) Compendium of soil fungi, Volume I, IHW-Verlag, Eching, Germany, Reprinted, pp.860、Domsch, K. H., Gams, W. and Anderson, T.-H. (1993) Compendium of soil fungi and supplement, Volume II, IHW-Verlag, Eching, Germany, Reprinted, pp.405、Kiffer, E. and Morelet, M. (2000) The Deuteromycetes :Mitosporic fungi classification and generic keys, Science Publishers Inc., Enfield, NH, USA, pp.273、及びKirk, P. M., Cannon, P. F., David, J. C. and Stalpers, J. A. (2001) Dictionary of the fungi 9th edition, CAB International, Wallingfork, UK, pp.655 を参考に、分類・同定を行った結果、本Ｎｏ．１９６株は、ペニシリウム（Penicillium）属であると推察された。
【００１３】
また上記ｅ）〜ｈ）において、ペニシルスは二輪生、フィアライドはアンプル形であり、メトレの長さがフィアライドに比べて長いという特徴が認めたこと、メトレが分生子柄先端の株から分岐するように形成されるペニシルスであることから、Pitt, J. I. (1979) The genus Penicillium and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces, Academic Press, London, UK, 634pp. に基づいて、ペニシリウム属のうちでも、Furcatum亜属、Divaricatum節の１菌種であると推察された。
【００１４】
本発明に用いられる真菌の培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれでもよく、特に制限されない。例えば、ポテトデキストロース寒天培地（培地組成：馬鈴薯（２００ｇ）抽出液１０００ｍｌ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ）などの培地において２５℃の好気条件下、静置培養で維持、増殖することができる。また液体培地及び固体培地のいずれであってもよいが、アスコルビン酸と接触させる際には生成物の回収の観点から液体培地であることが好ましい。なお、固体培地での培養後にアスコルビン酸製造のための液体培地に供する場合には、アスコルビン酸分解能を有する真菌を液体培地による前培養に供することが好ましい。
【００１５】
液体培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれであってもよく、一例としては、グルコース２質量％、デンプン２質量％、乾燥ブイヨン０．５質量％、酵母エキス０．２質量％、大豆ミール０．５質量％、消泡剤０．０１質量％による培地を挙げることができるが、菌の種類及び状態に応じて適宜変更可能である。
【００１６】
本発明によるエリスロアスコルビン酸の生成は、生産用培地による本培養工程によって行われる。この本培養工程は、アスコルビン酸の添加前の非生産工程と、アスコルビン酸の添加後の生産工程とで構成されている。
本培養工程に使用される培地には、生産用の液体培地を用いることが好ましい。
このような液体培地は、通常、微生物による化合物生産に使用可能であることが知られている培地であればいずれであってもよく、上記前培養用の液体培地に対して各種無機栄養素、例えば硝酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどを含むものが用いられる。また生産用液体培地のｐＨは、一般に３〜９、好ましくは５〜６である。
また本培養は、上記生産用液体培地を用いて静置培養または振盪培養による。振盪培養を適用する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェーカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの培地量とした場合に３０ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとすることができる。培養の際の温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。４℃よりも低いとエリスロアスコルビン酸への変換が起こらない場合があり好ましくなく、一方５０℃よりも高いと変換のための酵素活性が低下する場合があり、好ましくない。
【００１７】
アスコルビン酸と接触させる際の菌体濃度は、真菌の種類又は生育状態によって異なるが、一般に、湿重量で０．０１〜０．１ｇ／ｍｌである。但し、さらに増やすことも可能である。
【００１８】
真菌と接触されるアスコルビン酸は、真菌と接触して代謝することができる形態であれば、粉体及び液体のいずれであってもよいが、真菌への取り込み量や生成されたエリスロアスコルビン酸の回収容易性の観点から液体であることが好ましい。アスコルビン酸溶液を得るための溶媒としては、いずれのものであってもよく、水、メタノール、エタノール等を挙げることができる。アスコルビン酸溶液の濃度は、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。なお、アスコルビン酸溶液はｐＨを調整して、培地のｐＨと同様にｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜７とすることが好ましい。
【００１９】
アスコルビン酸の添加量は、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に、０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは３〜３０ｍｇ／ｍｌの量で培養系に添加すればよい。０．１ｍｇ／ｍｌよりも少ないとエリスロアスコルビン酸が得られない場合があり、一方、２００ｍｇ／ｍｌを超えると変換が不完全になる場合があるため、それぞれ好ましくない。
【００２０】
本培養工程のうち非生産工程は、使用される真菌の種類や前培養における菌の生育状態・数によって異なるが、一般に、生産用培地による本培養開始直後〜４８時間、変換効率の観点から好ましくは１０〜４８時間、更に好ましくは１８〜３２時間行うことができる。４８時間を超えると、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換効率が急激に低下して、エリスロアスコルビン酸を得ることができない場合があり、好ましくない。詳細は不明であるが、原料物質であるアスコルビン酸と生成物であるエリスロアスコルビン酸とは、それぞれこの培養系で分解していると考えられる。従って、高い変換効率でアスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸を得るためには、特にエリスロアスコルビン酸の分解速度を抑えることが好ましい。非生産工程を上述した期間にすることによって、その後の生産工程におけるエリスロアスコルビン酸の分解速度を抑えることができると考えられ、その結果、高い変換効率でエリスロアスコルビン酸を得ることができる。
【００２１】
生産工程は、培養系へアスコルビン酸が添加されることによって開始される。アスコルビン酸と真菌との接触時間は、すべてのアスコルビン酸がエリスロアスコルビン酸に変換されるまで継続することができ、真菌の種類及び培養状態によって異なるが、一般に１０〜８０時間、好ましくは２４〜４８時間であればよい。この間に、真菌がアスコルビン酸と接触してアスコルビン酸を代謝してエリスロアスコルビン酸に変換・生成し、菌体外へ放出する。なお、生産工程の継続時間は、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換状態によって適宜変更することができる。このような変換状態の確認は、例えば薄層クロマトグラフィーなどの既知の手段を用いて容易に行うことができる。
【００２２】
培養系に放出されたエリスロアスコルビン酸は、採取工程によって採取される。このときエリスロアスコルビン酸を採取する方法としては、生産培地中に放出された化合物を回収又は精製できることが知られている手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
各採取手段を使用する前には、培養系から菌体を除去することが好ましい。菌体の除去には、濾過等を用いればよい。
得られたエリスロアスコルビン酸は、公知の化学分析、機器分析によって確認することができる。
【００２３】
本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法において、真菌は、固定化担体に固定化されていてもよい。
この場合には、菌体が固定化担体に固定化されているので、真菌を培養する必要がなく、エリスロアスコルビン酸を、培地成分を含まない状態で生成・回収することができ、またエリスロアスコルビン酸と菌体との分離を容易に行うことができる。これにより、エリスロアスコルビン酸の分離・精製工程を簡略化することができる。
【００２４】
ここで用いられる固定化担体としては、本発明にかかる真菌を固定化できるものであればよく、例えば、ガラス、シリカなどの無機材料や、例えば寒天、カラギーナンなどの有機材料を挙げることができる。これらの担体に対して真菌を固定化する方法は、当業界では公知であり、真菌の種類等に合わせて適宜選択することができる。
【００２５】
固定化担体は、また真菌が固定化できればいずれの形態であってもよく、板状、球状、粉状などを挙げることができる。板状の場合には、アスコルビン酸溶液を固定化担体上に添加すればよく、また粉状の場合には、所定の容器に詰めてカラムを構成し、アスコルビン酸溶液をカラムに通せばよい。このような固定化担体とアスコルビン酸との接触形態の選択及び接触は、当業者には容易に実施することができる。
固定化担体への真菌の固定化は、真菌の種類等によって異なるが、一般に０．１〜５００ｍｇ／ｍｌ、生産量の観点から好ましくは５０〜３００ｍｇ／ｍｌの菌体密度で行うことができる。
【００２６】
本発明の製造方法によれば、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸へ高い効率で変換することができ、通常、アスコルビン酸１００ｍｇから５０〜８０ｍｇのエリスロアスコルビン酸に変換することができる（６０〜９８モル％の変換効率）。このような高い変換効率は、これまでに報告がなく、本発明によって初めて得られたものである。なお、変換効率は本培養工程における非生産工程の長さによって変更することができる。
また、本発明によって得られるエリスロアスコルビン酸は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）よりも安定性が高く、同様の抗酸化作用を持つことが知られている。このため、本発明では、効率よく生産されたエリスロアスコルビン酸を、アスコルビン酸の代替品として広範な用途に安価に供給することが可能となる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２８】
［実施例１］
ペニシリウムＮｏ１９６Ｆによるアスコルビン酸の生成
千葉県館山市沖ノ島公園で採取した土壌から、ビタミンＣ分解能に基づいて、真菌ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ株を選別した。
この真菌を、下記に示す前培養培地１００ｍｌを含むバッフル付き５００ｍｌフラスコで、４日間２５℃にて振とう培養（前培養）し、シードを得た。得られたシードを、下記に示す生産培地１００ｍｌを含むバッフル付き５００ｍｌフラスコに対して、５ｍｌ添加して、１日２５℃で振とう培養した。
この培養液に、ビタミンＣ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ；３Ｍ ＮａＯＨでｐＨ６に調整）を１５ｍｌ添加し、２４時間２５℃で振とう培養した。ビタミンＣからエリスロアスコルビン酸への変換の様子は薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル６０ Ｆ２５４、展開溶媒：クロロホルム−メタノール−酢酸（５：４：１））で確認できた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
培養後、フラスコ２本の培養液を吸引ろ過して菌体を除去後、得られたろ液２００ｍｌに１．８ＬのＭｅＯＨを添加した。この操作で淡黄色の不溶物（約５０ｍｌ）が生じたが、これも合わせて次の操作に用いた。
この抽出液を２回のクロマトグラフィーにかけた。
１回目のアビセル（結晶性セルロース）カラムクロマトグラフィーは、アビセル（ＡＶＩＣＥＬ；旭化成）をＭｅＯＨに懸濁して得られた直径３５ｍｍ、高さ３５０ｍｍのカラムとして使用した。これに上記抽出物を注入した。その後、７００ｍｌの８０％ＭｅＯＨ、５００ｍｌの７５％ＭｅＯＨでカラムを順次展開した。転換物は素通り画分、および８０％ＭｅＯＨ画分の前半に回収された。
転換物を含む画分をまとめて減圧濃縮した後に、残った水溶液を凍結乾燥により、粗精製物を得た。
【００３１】
２回目のアビセルカラムクロマトグラフィーは、アビセルをクロロホルム−ＭｅＯＨ（９：１）に懸濁して得られた直径２５ｍｍ、高さ６００ｍｍのカラムとして使用した。これに上記粗精製物の半量の懸濁液（６０ｍｌのＭｅＯＨに溶解後、５４０ｍｌのクロロホルムと混合）を注入した。その後、２５０ｍｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（９：１）、１Ｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（８：２）、８００ｍｌのクロロホルム−ＭｅＯＨ（７：３）で順次カラムを展開した。転換物はクロロホルム−ＭｅＯＨ（８：２）画分の半ばからクロロホルム−ＭｅＯＨ（７：３）画分の前半にかけて回収された。
【００３２】
次いで、転換物を含む画分をまとめて減圧濃縮して０．４ｇの乾固物を得た。得られた乾固物を４ｍｌのＭｅＯＨに溶解後、そのうちの１．２ｍｌを４回に分けてInertsil ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（３０×２５０ｍｍ；GL Science）を用いて分画した（４０℃）。展開溶媒として０．１％（v/v）ギ酸水溶液−ＭｅＯＨを用い、ＭｅＯＨ濃度をサンプル注入後０％から５０％まで２５分間で直線的に増加させた。流速は毎分１５ｍｌ、検出は２２０ｎｍの吸収を用いた。この条件で、保持時間７．３分から８．１分の画分を集めた（図１参照）。
その後、得られた画分をまとめて減圧濃縮後、残った水溶液を凍結乾燥し、２１ｍｇの精製標品を得た。
【００３３】
［実施例２］
得られたエリスロアスコルビン酸の特性
ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、１Ｈ ６００ＭＨｚ， １３Ｃ １５０ＭＨｚ、５０℃で測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６溶液とした。
ＭＳは、ＳＸ−１０２Ａ（ＪＥＯＬ）を用い、negative ion modeでグリセロールをマトリックスとして測定した。
ＵＶは、３２０ spectrophotometer（Hitachi）を用いた。試料はＭｅＯＨに溶解した（２５mｇ／ｍｌ）。
ＩＲは、ＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０（ＪＥＯＬ）を用いた。ＭｅＯＨに溶解した試料５０mｇを岩塩に塗布して測定した。
旋光度は、ＤＩＰ−３６０（ＪＡＳＣＯ）を用いた（２０℃、Ｎａ）。試料はＭｅＯＨに溶解した（５ｍｇ／ｍｌ）。
結果を表２及び３、図２及び３に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
これらの結果から、本方法によって得られた化合物は、純度の高い下記のＬ−エリスロアスコルビン酸であることは明らかであった。
【００３７】
【化１】
【００３８】
このように本発明によれば、アスコルビン酸と真菌、特にペニシリウムＮｏ１９６とを接触させることにより、アスコルビン酸の代替として有用なエリスロアスコルビン酸を、効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本実施例にかかるクロマトグラフィーのチャートである。
【図２】本実施例にかかるＩＲスペクトルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、
前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、
を含むエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項２】
アスコルビン酸分解能を有する真菌が、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ケトミウム属、ペシロミセス属、ユーペニシリウム属、フザリウム属、モナスカス属及びドレクスレラ属から成る群より選択された菌であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸分解能を有する真菌がペニシリウム属であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸分解能を有する真菌が、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項５】
前記真菌が、固定化担体に固定化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項１】
アスコルビン酸を、アスコルビン酸分解能を有する真菌と接触させること、
前記接触によって得られたエリスロアスコルビン酸を採取すること、
を含むエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項２】
アスコルビン酸分解能を有する真菌が、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ケトミウム属、ペシロミセス属、ユーペニシリウム属、フザリウム属、モナスカス属及びドレクスレラ属から成る群より選択された菌であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸分解能を有する真菌がペニシリウム属であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸分解能を有する真菌が、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９８）であることを特徴とする請求項１記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項５】
前記真菌が、固定化担体に固定化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１３５４４５（Ｐ２００７−１３５４４５Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３２１３９（Ｐ２００５−３３２１３９）
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（３０１０６８１１４）株式会社コスモステクニカルセンター (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（３０１０６８１１４）株式会社コスモステクニカルセンター (57)
【Ｆターム（参考）】
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