エンドグルカナーゼの製造法
【課題】効率的な枯草菌由来の完全長ＢｇｌＣの製造法、及びそれにより得られる新規な完全長ＢｇｌＣを提供する。
【解決手段】枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用いて、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させる、ＢｇｌＣの製造法。
【解決手段】枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用いて、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させる、ＢｇｌＣの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤用酵素として有用な枯草菌由来のエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造法、及びそれにより得られる新規なエンド−β−１，４−グルカナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。またバイオマスの有効的な利用方法として、セルロースを分解する酵素であるセルラーゼを用い、糖類やエネルギー物質に変換しようとする試みが、従来から行われている。ゆえにセルラーゼに関する研究は、世界中の研究機関において多岐にわたり行われている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般的に中酸性における最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。
【０００３】
一方、掘越によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来（例えば特許文献１、非特許文献１参照）、困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（例えば特許文献２〜４参照）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。しかし、これらのアルカリセルラーゼは、結晶性セルロースをほとんど分解しない、所謂エンドグルカナーゼであることが判っている。洗剤用酵素が有すべき重要な性質としては、繊維を分解せず（即ち繊維を傷めず）に汚れを落とす性質、あるいはその性質を促進する性質等が挙げられ、かかる性質を有する酵素は非常に有用なアルカリセルラーゼといえる。一方、衣類は何回も洗浄を繰返すことで毛羽立ちや色褪せが生じるため、このような現象を防止するため、結晶性セルロース分解活性を有し、且つアルカリ性領域で作用するセルラーゼの提供も望まれている。
【０００４】
更に近年、遺伝子工学の発展に伴い、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても例外ではなく、既に数多くの遺伝子がクローニング、塩基配列決定され、また実生産に用いられている例も存在する。
【０００５】
セルラーゼとは、植物の細胞壁の主成分であるセルロースのβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素の総称であり、当該セルラーゼに属する代表的な酵素としては、エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドラーゼ及びβ-Ｄ-グルコシダーゼが知られている。
【０００６】
これらのセルラーゼのうち、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（以下「ＢｇｌＣ」と称する）は、セルロースのβ−１，４−グリコシド結合を無作為に加水分解するセルラーゼである。
【０００７】
枯草菌由来のＢｇｌＣは、Ｍａｃｋａｙらによって１９８６年に、枯草菌（ＰＡＰ１１５株）のＢｇｌＣタンパク質をコードする遺伝子としてクローニングされ、また当該タンパク質が４９９アミノ酸からなる（推定分子量５５ｋＤａ、シグナル配列を除くと５２ｋＤａ）ことが明らかにされている（非特許文献２）。Ｗｏｌｆらは１９９５年に、枯草菌１６８株のＢｇｌＣをコードする遺伝子（ｅｇｌＳ）をクローニングし、それが上記ＰＡＰ１１５株のＢｇｌＣをコードする遺伝子と同一であることを明らかにしている（非特許文献３）。Ｌｏらは１９８８年に、枯草菌及び大腸菌において当該遺伝子を発現させたこと、並びに、発現した５２ｋＤａのＢｇｌＣがその後、細胞外においてＣ末端側のプロセシングを受け、それぞれ３２ｋＤａ（以下「不完全長ＢｇｌＣ」と称する）及び３５．８ｋＤａになることを報告している（非特許文献４）。上記５２ｋＤａのＢｇｌＣ(以下「完全長ＢｇｌＣ」と称する)については、これまで効率的な製造方法が存在せず、また前躯体と考えられていたこともあり、酵素としての性質についても十分に解明されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ＆Ａｋｉｂａ，Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）
【非特許文献２】Ｍａｃｋａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６，Ｖｏｌ．１４（２２），ｐａｇｅ９１５９−７０
【非特許文献３】Ｗｏｌｆら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．１４１，ｐａｇｅ２８１−９０
【非特許文献４】Ｌｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９８８，ｐａｇｅ２２８７−９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、効率的な枯草菌由来の完全長ＢｇｌＣの製造法、及びそれにより得られる新規な完全長ＢｇｌＣの提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記従来技術に鑑み、完全長ＢｇｌＣの製造方法及びそれにより得られた完全長ＢｇｌＣに関して本発明者らが鋭意研究を行った結果、特定のプロテアーゼを欠失する枯草菌株を用いて組換え生産した場合に、上記完全長ＢｇｌＣが効率的に発現され、バイオマスである粉砕パルプに対する高い糖化活性を有し、更に当該完全長ＢｇｌＣが不完全長のＢｇｌＣと比較し有利な性質を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１３）に係るものである。
（１） 枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させることを特徴とする、ＢｇｌＣの製造法。
（２） 前記８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、上記（１）記載の製造法。
（３） 前記枯草菌変異株が、枯草菌ＢｇｌＣをコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子がプラスミドにより導入されている、上記（１）又は（２）記載の製造法。
（４） 前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として導入されていることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれかに記載の製造法。
（５） 前記シグナル配列が、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、上記（４）に記載の製造法。
（６） 前記バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、上記（５）に記載の製造法。
（７） 前記完全長ＢｇｌＣが、５２ｋＤａの分子量を有するＢｇｌＣである、上記（１）から（６）のいずれかに記載の製造法。
（８） 前記シグナル配列を含む前駆体遺伝子が、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列を有する、上記（４）から（７）のいずれかに記載の製造法。
（９） 枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させ、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を、プラスミドにより導入してなる枯草菌変異株。
（１０） 前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域と作動可能に連結されている、上記（９）記載の枯草菌変異株。
（１１） 枯草菌１６８株から欠失させる８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、上記（９）又は（１０）に記載の枯草菌変異株。
（１２） 上記（１）から（８）記載の製造法により得られる完全長ＢｇｌＣ。
（１３） 以下の酵素学的性質を有する、完全長ＢｇｌＣ：
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）。
最適反応温度：約５０℃（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））。
温度安定性：３０℃〜６０℃（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間反応）。
分子量：約５２ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、衣料用洗剤、繊維処理剤として有用な完全長ＢｇｌＣを効率的に生産することが可能となる。また、当該完全長ＢｇｌＣは他の細菌由来のセルラーゼよりも糖化活性が高く、また不完全長ＢｇｌＣと比較し、温度安定性が高く、更に粉砕パルプに対する高い糖化活性を有するため、セルロースの糖化用酵素として有用であり、バイオマスからのバイオエタノールの製造や洗浄用酵素として応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＣＲ断片を用いた２重交差法による標的遺伝子の欠失方法を示す図。
【図２】ｂｇｌＣ遺伝子のクローニングを示す図。
【図３】本発明のＢｇｌＣのＣＭＣ分解活性に及ぼすｐＨの影響を示す図。
【図４】本発明のＢｇｌＣのＣＭＣ分解活性に及ぼす温度の影響を示す図。
【図５】本発明のＢｇｌＣの安定性に及ぼす温度の影響を示す図。
【図６】１６８Ｄｃｅ株及びＤｐｒ９Ｄｃｅ株におけるＢｇｌＣタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【図７】プロテアーゼ単一欠失株、並びにプロテアーゼ多重欠失株におけるＢｇｌＣタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願発明の製造法は、枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させるものである。
【００１６】
枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子とは、枯草菌のエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードする遺伝子のことを指し、当該遺伝子は上記したとおり既にクローニング及び塩基配列決定がなされている（非特許文献２及び３）。本発明においては、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子の具体的態様は、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、ＢｇｌＣ活性を有するタンパク質をコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子である。
【００１７】
本願発明において、完全長ＢｇｌＣとは、枯草菌の細胞内外においてプロテアーゼによりＣ末端側のプロセシングを受けて３３ｋＤａとなった状態の枯草菌ＢｇｌＣ（本願において不完全長ＢｇｌＣと称する）とは相異なる、プロセシングを受けない状態の、５２ｋＤａの分子量を有する、完全長の枯草菌ＢｇｌＣのことを指す。
【００１８】
上記製造法において用いられる枯草菌変異株は、枯草菌１６８株を元株として用い、更にその元株から所定のプロテアーゼ遺伝子を欠失させて作製した変異株である。
【００１９】
枯草菌１６８株とは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８として公知の枯草菌株であり、通常、遺伝子組換えタンパク質生産の際の野生株として用いられている。また枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７及びＢＳＯＲＦ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、各種遺伝子操作を行うことができる。
【００２０】
本願発明に係る枯草菌変異株は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失している。更に、完全長ＢｇｌＣタンパク質のプロセシングを抑止し、当該完全長ＢｇｌＣタンパク質の細胞外分泌による製造を効率的に行う観点から、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子を欠失させるのが好ましい。なお、これらのプロテアーゼ遺伝子を欠失した枯草菌変異株は、特開２００６−１７４７０７号に記載の方法により作製することができる。
【００２１】
本願発明に係る枯草菌ＢｇｌＣは、ＢｇｌＣタンパク質を細胞外分泌させるために、そのＮ末端側にシグナル配列を有することが必要である。当該シグナル配列は、完全長ＢｇｌＣタンパク質の細胞外分泌を容易にするものであれば特に限定されず、枯草菌ＢｇｌＣ固有のシグナル配列の他、例えばバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５、特開２０００−２１００８１号公報）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６、特開平４−１９０７９３号公報）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、ＢｇｌＣタンパク質と連結していることが好ましい。従って、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子は、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として存在しているのが好ましく、かかる前駆体遺伝子としては、例えば配列番号１６で示される、枯草菌ＫＳＭ−Ｓ２３７由来のセルラーゼのシグナル配列をコードする遺伝子が連結した遺伝子が挙げられる。
【００２２】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２３】
前記完全長ｂｇｌＣ遺伝子中にバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列を連結する手段は特に限定されず、操作の簡便性の観点から、既に報告された方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８（１９９０）等）に基づき実施できる。
【００２４】
上記の枯草菌変異株を用いて枯草菌ＢｇｌＣタンパク質を製造する場合、上記の枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、ｂｇｌＣ遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。
【００２５】
上記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子に作動可能に連結させるプロモーターとしては、導入された枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を枯草菌細胞内で発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されず、例えばバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５、特開２０００−２１００８１号公報）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６、特開平４−１９０７９３号公報）由来のアルカリセルラーゼＳ２３７とＳＰ６４のプロモーター、枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子とリボソームＲＮＡオペロンｒｒｎＯのプロモーター等が挙げられる。
【００２６】
本発明において上記の枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子、好ましくはシグナル配列を含む前駆体遺伝子、又はさらにプロモーター等を作動可能に連結させたそれらの遺伝子は、ゲノム中に存在しても、プラスミド中に存在してもよいが、プラスミド中に存在することが好ましい。
【００２７】
上記遺伝子をプラスミド中に存在させる場合には、上記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子にシグナルペプチドをコードする遺伝子やプロモーター等を作動可能に連結させた後、得られたＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを一般的な形質転換法によって宿主に導入して形質転換するのが好ましい。当該発現プラスミドとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２８】
一方、上記遺伝子をゲノム中に存在させる場合には、当該ＤＮＡ断片に宿主ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主ゲノムに直接組み込むことによって本発明の枯草菌を得ることができる。なお、枯草菌はゲノムにｂｇｌＣ遺伝子を有するが９種のプロテアーゼを欠失させてもＳＤＳ電気泳動ではＢｇｌＣを確認できないため、本来のゲノムに存在するｂｇｌＣ遺伝子は発現がないか、極めて少ないと考えられる。よって、ゲノム上の本来のｂｇｌＣ遺伝子を発現させるためには、ｂｇｌＣ遺伝子の上流に、宿主の枯草菌が本来有するものとは異なる制御領域又は制御領域及びシグナル配列を導入した枯草菌を得るのが好ましい。
【００２９】
上記で得られた枯草菌形質転換体を、適切な培地において培養し、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させて枯草菌ＢｇｌＣタンパク質を産生させ、更に当該タンパク質を細胞外へ分泌させることを特徴とする。枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させる際、当該遺伝子に連結したプロモーターの性質に応じて、当該培地の組成を適宜調節するのが好ましい。特に発現誘導型プロモーターを用いる場合には、そのプロモーター活性を向上させる誘導物質を適切なタイミングで培地中に添加するのが好ましい。
【００３０】
上記の枯草菌変異株は、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００３１】
培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い、目的のＢｇｌＣタンパク質を抽出・精製することにより得ることができる。
【００３２】
上記により得られた完全長ＢｇｌＣは、セルロースに作用してその鎖を切断する活性を有し、しかも不完全長ＢｇｌＣと比較し糖化活性が高い。ゆえに、セルロースの糖化用酵素として有用であり、例えばバイオマスからバイオエタノールを工業的に製造するための酵素として利用することができる。
【００３３】
上記により得られた完全長ＢｇｌＣは、以下の酵素学的性質を有する。
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。また当該活性は、不完全長ＢｇｌＣと比較し４２〜１３２％高い（表４）。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する（表２から表４）。
最適反応ｐＨ：５０ｍＭの各緩衝液［酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０及びｐＨ５．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０及びｐＨ８．０）、並びにグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０及びｐＨ１０．０）］中で酵素反応を行った結果、少なくともｐＨ４〜１０で作用し、最適ｐＨは約５である。
最適反応温度：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で反応を行った場合、最適反応温度は約５０℃である。
温度安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で２０分間反応を行った場合、３０℃〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。また、不完全長ＢｇｌＣと比較し、約２０℃高い。
分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約５２ｋＤａである。
【００３４】
また、得られた完全長ＢｇｌＣのアミノ酸を解析した結果、配列番号１７に示す配列であり、公知の推定アミノ酸配列どおりであった。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００３６】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００３７】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００３８】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００３９】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５，１３５（１９９０））、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））のいずれかによって行った。
【００４０】
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）、２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）、あるいはＣＳＬ発酵培地（２％酵母エキス、０．５％コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、０．０５％塩化マグネシウム七水和物、０．６％尿素、０．２％Ｌ−トリプトファン、１０％グルコース、０．１５％リン酸二水素ナトリウム、０．３５％リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いた。
【００４１】
（実施例１）ｂｇｌＣ遺伝子欠失株の構築
図１に示したように、枯草菌１６８株及びＤｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号）ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／））を薬剤耐性遺伝子（エリスロマイシン耐性遺伝子）に置換して欠失株を作製した。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したｂｇｌＣＦＷ及びｂｇｌＣ／ＥｍＲのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｂｇｌＣ／ＥｍＦ及びｂｇｌＣＲＶのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子の下流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。更に、プラスミドｐＭｕｔｉｎ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，３０９７−３１０４，１９９８）鋳型とし、表１に示したｅｍｆ２及びｅｍｒ２のプライマーセットを用いて、１．３ｋｂのエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
次に、得られた１．０ｋｂ断片（Ａ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）及びＥｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表１に示すｂｇｌＣＦＷ２及びｂｇｌＣＲＶ２のプライマーセットを用いたＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって、３断片が（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）の順で含まれる３．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。
【００４４】
更に、得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、コンピテントセル形質転換法により１６８株の形質転換を行った。形質転換後、エリスロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００４５】
得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってｂｇｌＣ遺伝子がＥｍ耐性遺伝子で置換されていることを確認した。以上の操作により、１６８株のｂｇｌＣ遺伝子欠失株（ΔｂｇｌＣ：：Ｅｍ株）を構築し、１６８Ｄｃｅと命名した。
【００４６】
また、Ｄｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号）を元株とし、以上と同様の操作を行いｂｇｌＣ遺伝子欠失株を構築し、Ｄｐｒ９Ｄｃｅと命名した。
【００４７】
（実施例２）ｂｇｌＣ過剰発現プラスミドの構築
プラスミドの構築は、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTM Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行なった（図２）。プロトコールに従って設計したプライマー（表１）を用いて、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号）のプロモーターとシグナル配列の断片を、ｐＨＹＳ２３７（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（１１）：２２８１−９，２０００）を鋳型にして、並びに、枯草菌セルラーゼ遺伝子ｂｇｌＣを、枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にして、それぞれＰＳＦ＿ｉｎｆｕ（ＥｃＩ）とＰＳ２３７Ｒのプライマーセット、及びｂｇｌＣ−ｓｉｇ／ＰＳＦとｂｇｌＣ＿ｉｎｆｕ（ＳａＩ）のプライマーセットを用いて増幅した。得られた増幅産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化により線状化したｐＨＹ３００ＰＬＫ及びＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素を適当量で混合して３０分間反応を行ない、Ｓ２３７セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列にｂｇｌＣの構造遺伝子が連結したプラスミドを構築し、それをｐＨＰＳ−ｂｇｌＣと命名した。更に、当該プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（ＴａＫａＲａ）に導入し、形質転換した。
【００４８】
また、同様の操作により、ＳＰ６４セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列をｂｇｌＣの構造遺伝子に連結させた発現プラスミドを構築し、このプラスミドをｐＨＰＳ６４−ｂｇｌＣと命名した。また、枯草菌由来のｂｇｌＳ遺伝子を用いて同様の操作を行い、発現プラスミドｐＨＰＳ−ｂｇｌＳを構築した。
【００４９】
ＣＭＣ及びトリパンブルーを添加したＬＢ寒天培地を用い、テトラサイクリン耐性により大腸菌形質転換体を選抜した。また、当該形質転換体がハロー形成をすることが判明した。形質転換体より精製したプラスミドを用いて制限酵素処理あるいはＰＣＲを行い、形質転換が適切に行われていることを確認した。
【００５０】
（実施例３）枯草菌宿主へのプラスミド導入及び得られた形質転換体の培養
以上のように構築したプラスミドｐＨＰＳ−ｂｇｌＣ及び ｐＨＰＳ６４−ｂｇｌＣを、プロトプラスト形質転換法によってそれぞれ宿主菌株１６８Ｄｃｅ及びＤｐｒ９Ｄｃｅに導入した。これにより得られた組換え菌株を、１０ ｍＬのＬＢ培地で３０℃で一晩振盪培養し、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清中セルラーゼの活性測定を行なった。
【００５１】
（実施例４）培養上清のＣＭＣ分解活性
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ：日本製紙社製）が１．０％（ｗ／ｖ）、及び酢酸緩衝液が５０ｍＭとなるように９０μＬの混合液を調製し、適当な濃度に希釈した酵素溶液１０μＬを添加し、５０℃で１５分間反応した。ＤＮＳ溶液１００μＬを添加して反応を停止させた後、１００℃で５分間熱処理した。冷却後、反応液１００μＬの吸光度（５３５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。なお、基質溶液９０μＬにＤＮＳ溶液を１００μＬ添加後、酵素溶液１０μＬを加え、同様の操作を行ったものを対照とした。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコース相当の還元糖を遊離する酵素量を、１ユニット（Ｕ）とした。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
（実施例５）培養上清のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトシオシド分解活性
１／７．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに、０．４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ加えて混和し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、３０℃、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０）変化を１０分間にわたり測定した。Ｓ２３７セルラーゼの活性を１００％とした相対活性を表３に示す。ＢｇｌＣはＳ２３７由来のセルラーゼより約２５％活性が高いことが明らかとなった。
【００５４】
【表３】
【００５５】
（実施例６）培養上清のセルロース糖化活性
セルロース｛Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１（Ｆｌｕｋａ社製）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐｏｗｄｅｒ （Ｆｕｌｕｋａ社製）及び粉砕パルプ｝を用い、セルロース糖化反応を行った。なお粉砕パルプは、粉末状パルプ（日本製紙ケミカル社製「Ｗ−４００Ｇ」、４００メッシュパス９０以上、セルロース含有量９９質量％、水分含量１質量％）を媒体撹拌式ミル（アトライタ、三井鉱山（株）製、「ＭＡ１Ｄ−Ｘ」、容器全容量：５．５Ｌ）に５００ｇ投入し、媒体として、直径１０ｍｍ、材質ジルコニア、ジルコニアボール：１１ｋｇをアトライタに充填（充填率５９％）して、回転数３０７ｒｐｍの条件で、２時間粉砕処理することにより粉砕パルプを調製した。
【００５６】
＜糖化反応＞：
１５０ｍｇの上記セルロースを、３ｍＬの酵素反応液（最終濃度０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）、蓋つきスクリュー管（Ｎｏ．５、φ２７×５５ｍｍ；マルエム製））に懸濁し、適量の酵素を添加し、５０℃で振盪撹拌（１５０ｒｐｍ、タイテック製恒温振盪機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら所定の時間反応させた。反応終了後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液中に遊離した還元糖をＤＮＳ法によって定量した。また、対照として酵素無添加の反応液についても同様の操作を行った。
【００５７】
＜糖化率測定（ＤＮＳ法）＞：
ＤＮＳ溶液２００μＬに上清液２μＬを添加し、１００℃で５分間熱処理した。冷却後、反応液１００μＬの吸光度（５３５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法（「生物化学実験法」還元糖の定量法、学会出版センター）によってグルコース換算により定量した。糖化率（％）は、「遊離還元糖量×０．９÷反応前のホロセルロース量×１００」で算出した。各セルロース基質に対するＢｇｌＣの糖化活性を表４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
Ｄｐｒ９Ｄｃｅ株において発現したＢｇｌＣは、１６８Ｄｃｅ株で発現した酵素より糖化活性が高く、特に粉砕パルプに対する活性は２．３倍高かった。
【００６０】
（実施例７）ＢｇｌＣと他の細菌由来のエンドグルカナーゼとの糖化活性比較
粉砕パルプを用いて、ＢｇｌＣと、他の細菌由来のエンドグルカナーゼ（枯草菌ＢｇｌＳ及び枯草菌ＫＳＭ−Ｎ１４５株由来のＥｇＩ−１４５（特開２００５−２８７４４１号））との、糖化活性の比較を行なった。結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
＜ＢｇｌＣの酵素学的性質＞：
（実施例８）ＢｇｌＣの最適反応ｐＨ
５０ｍＭの各緩衝液［酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０及びｐＨ５．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０及びｐＨ８．０）、並びにグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０及びｐＨ１０．０）］を使用した以外は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図３に示す。
【００６３】
（実施例９）ＢｇｌＣの最適反応温度
反応温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で反応させた以外は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図４に示す。
【００６４】
（実施例１０）ＢｇｌＣの温度安定性
５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で２０分間処理した後は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図５に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
実施例８から１０において、野生株及びプロテアーゼ欠失株の両方において発現したＢｇｌＣを用いて測定を行なった結果、プロテアーゼ欠失株にて発現したＢｇｌＣが野生株で発現した酵素よりも温度安定性が高いことが判明した。
【００６７】
本発明の製造法により得られた完全長ＢｇｌＣの酵素学的性質を、以下に示す。
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有し、当該活性が、枯草菌１６８株により産生されるＢｇｌＣと比較し４２〜１３２％高い。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ４〜１０で作用し、最適ｐＨは約５である。
最適反応温度：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で反応を行った場合、最適反応温度は約５０℃である。
温度安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で反応を行った場合、３０℃〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。
分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約５２ｋＤａである。
【００６８】
（実施例１１）ＢｇｌＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例３で得られた培養上清中のＢｇｌＣを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。図６に示すように、野生株では３３ｋＤａの不完全長ＢｇｌＣが発現されるのに対し、プロテアーゼ９重欠失株では５２ｋＤａの完全長ＢｇｌＣが発現した。この結果から、野生株から得られたＢｇｌＣはプロテアーゼにより分解されているが、本願発明の製造法により得られたＢｇｌＣはプロテアーゼによる分解を受けず、完全長が維持されることが明らかとなった。
【００６９】
次に、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択されるプロテアーゼのいずれか１つを欠失する単一欠失株、並びにそれらを複数欠失するプロテアーゼ多重欠失株を用いて、ＢｇｌＣの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結果を図７に示す。いずれの単一欠失株においてもＢｇｌＣの分解が観察されたが、８重欠失株以上ではＢｇｌＣの分解が完全に抑えられ、完全長ＢｇｌＣが観察された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤用酵素として有用な枯草菌由来のエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造法、及びそれにより得られる新規なエンド−β−１，４−グルカナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。またバイオマスの有効的な利用方法として、セルロースを分解する酵素であるセルラーゼを用い、糖類やエネルギー物質に変換しようとする試みが、従来から行われている。ゆえにセルラーゼに関する研究は、世界中の研究機関において多岐にわたり行われている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般的に中酸性における最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。
【０００３】
一方、掘越によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来（例えば特許文献１、非特許文献１参照）、困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（例えば特許文献２〜４参照）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。しかし、これらのアルカリセルラーゼは、結晶性セルロースをほとんど分解しない、所謂エンドグルカナーゼであることが判っている。洗剤用酵素が有すべき重要な性質としては、繊維を分解せず（即ち繊維を傷めず）に汚れを落とす性質、あるいはその性質を促進する性質等が挙げられ、かかる性質を有する酵素は非常に有用なアルカリセルラーゼといえる。一方、衣類は何回も洗浄を繰返すことで毛羽立ちや色褪せが生じるため、このような現象を防止するため、結晶性セルロース分解活性を有し、且つアルカリ性領域で作用するセルラーゼの提供も望まれている。
【０００４】
更に近年、遺伝子工学の発展に伴い、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても例外ではなく、既に数多くの遺伝子がクローニング、塩基配列決定され、また実生産に用いられている例も存在する。
【０００５】
セルラーゼとは、植物の細胞壁の主成分であるセルロースのβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素の総称であり、当該セルラーゼに属する代表的な酵素としては、エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドラーゼ及びβ-Ｄ-グルコシダーゼが知られている。
【０００６】
これらのセルラーゼのうち、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（以下「ＢｇｌＣ」と称する）は、セルロースのβ−１，４−グリコシド結合を無作為に加水分解するセルラーゼである。
【０００７】
枯草菌由来のＢｇｌＣは、Ｍａｃｋａｙらによって１９８６年に、枯草菌（ＰＡＰ１１５株）のＢｇｌＣタンパク質をコードする遺伝子としてクローニングされ、また当該タンパク質が４９９アミノ酸からなる（推定分子量５５ｋＤａ、シグナル配列を除くと５２ｋＤａ）ことが明らかにされている（非特許文献２）。Ｗｏｌｆらは１９９５年に、枯草菌１６８株のＢｇｌＣをコードする遺伝子（ｅｇｌＳ）をクローニングし、それが上記ＰＡＰ１１５株のＢｇｌＣをコードする遺伝子と同一であることを明らかにしている（非特許文献３）。Ｌｏらは１９８８年に、枯草菌及び大腸菌において当該遺伝子を発現させたこと、並びに、発現した５２ｋＤａのＢｇｌＣがその後、細胞外においてＣ末端側のプロセシングを受け、それぞれ３２ｋＤａ（以下「不完全長ＢｇｌＣ」と称する）及び３５．８ｋＤａになることを報告している（非特許文献４）。上記５２ｋＤａのＢｇｌＣ(以下「完全長ＢｇｌＣ」と称する)については、これまで効率的な製造方法が存在せず、また前躯体と考えられていたこともあり、酵素としての性質についても十分に解明されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ＆Ａｋｉｂａ，Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）
【非特許文献２】Ｍａｃｋａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６，Ｖｏｌ．１４（２２），ｐａｇｅ９１５９−７０
【非特許文献３】Ｗｏｌｆら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．１４１，ｐａｇｅ２８１−９０
【非特許文献４】Ｌｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９８８，ｐａｇｅ２２８７−９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、効率的な枯草菌由来の完全長ＢｇｌＣの製造法、及びそれにより得られる新規な完全長ＢｇｌＣの提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記従来技術に鑑み、完全長ＢｇｌＣの製造方法及びそれにより得られた完全長ＢｇｌＣに関して本発明者らが鋭意研究を行った結果、特定のプロテアーゼを欠失する枯草菌株を用いて組換え生産した場合に、上記完全長ＢｇｌＣが効率的に発現され、バイオマスである粉砕パルプに対する高い糖化活性を有し、更に当該完全長ＢｇｌＣが不完全長のＢｇｌＣと比較し有利な性質を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１３）に係るものである。
（１） 枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させることを特徴とする、ＢｇｌＣの製造法。
（２） 前記８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、上記（１）記載の製造法。
（３） 前記枯草菌変異株が、枯草菌ＢｇｌＣをコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子がプラスミドにより導入されている、上記（１）又は（２）記載の製造法。
（４） 前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として導入されていることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれかに記載の製造法。
（５） 前記シグナル配列が、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、上記（４）に記載の製造法。
（６） 前記バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、上記（５）に記載の製造法。
（７） 前記完全長ＢｇｌＣが、５２ｋＤａの分子量を有するＢｇｌＣである、上記（１）から（６）のいずれかに記載の製造法。
（８） 前記シグナル配列を含む前駆体遺伝子が、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列を有する、上記（４）から（７）のいずれかに記載の製造法。
（９） 枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させ、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を、プラスミドにより導入してなる枯草菌変異株。
（１０） 前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域と作動可能に連結されている、上記（９）記載の枯草菌変異株。
（１１） 枯草菌１６８株から欠失させる８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、上記（９）又は（１０）に記載の枯草菌変異株。
（１２） 上記（１）から（８）記載の製造法により得られる完全長ＢｇｌＣ。
（１３） 以下の酵素学的性質を有する、完全長ＢｇｌＣ：
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）。
最適反応温度：約５０℃（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））。
温度安定性：３０℃〜６０℃（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間反応）。
分子量：約５２ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、衣料用洗剤、繊維処理剤として有用な完全長ＢｇｌＣを効率的に生産することが可能となる。また、当該完全長ＢｇｌＣは他の細菌由来のセルラーゼよりも糖化活性が高く、また不完全長ＢｇｌＣと比較し、温度安定性が高く、更に粉砕パルプに対する高い糖化活性を有するため、セルロースの糖化用酵素として有用であり、バイオマスからのバイオエタノールの製造や洗浄用酵素として応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＣＲ断片を用いた２重交差法による標的遺伝子の欠失方法を示す図。
【図２】ｂｇｌＣ遺伝子のクローニングを示す図。
【図３】本発明のＢｇｌＣのＣＭＣ分解活性に及ぼすｐＨの影響を示す図。
【図４】本発明のＢｇｌＣのＣＭＣ分解活性に及ぼす温度の影響を示す図。
【図５】本発明のＢｇｌＣの安定性に及ぼす温度の影響を示す図。
【図６】１６８Ｄｃｅ株及びＤｐｒ９Ｄｃｅ株におけるＢｇｌＣタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【図７】プロテアーゼ単一欠失株、並びにプロテアーゼ多重欠失株におけるＢｇｌＣタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願発明の製造法は、枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させるものである。
【００１６】
枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子とは、枯草菌のエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードする遺伝子のことを指し、当該遺伝子は上記したとおり既にクローニング及び塩基配列決定がなされている（非特許文献２及び３）。本発明においては、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子の具体的態様は、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、ＢｇｌＣ活性を有するタンパク質をコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子である。
【００１７】
本願発明において、完全長ＢｇｌＣとは、枯草菌の細胞内外においてプロテアーゼによりＣ末端側のプロセシングを受けて３３ｋＤａとなった状態の枯草菌ＢｇｌＣ（本願において不完全長ＢｇｌＣと称する）とは相異なる、プロセシングを受けない状態の、５２ｋＤａの分子量を有する、完全長の枯草菌ＢｇｌＣのことを指す。
【００１８】
上記製造法において用いられる枯草菌変異株は、枯草菌１６８株を元株として用い、更にその元株から所定のプロテアーゼ遺伝子を欠失させて作製した変異株である。
【００１９】
枯草菌１６８株とは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８として公知の枯草菌株であり、通常、遺伝子組換えタンパク質生産の際の野生株として用いられている。また枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７及びＢＳＯＲＦ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、各種遺伝子操作を行うことができる。
【００２０】
本願発明に係る枯草菌変異株は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失している。更に、完全長ＢｇｌＣタンパク質のプロセシングを抑止し、当該完全長ＢｇｌＣタンパク質の細胞外分泌による製造を効率的に行う観点から、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子を欠失させるのが好ましい。なお、これらのプロテアーゼ遺伝子を欠失した枯草菌変異株は、特開２００６−１７４７０７号に記載の方法により作製することができる。
【００２１】
本願発明に係る枯草菌ＢｇｌＣは、ＢｇｌＣタンパク質を細胞外分泌させるために、そのＮ末端側にシグナル配列を有することが必要である。当該シグナル配列は、完全長ＢｇｌＣタンパク質の細胞外分泌を容易にするものであれば特に限定されず、枯草菌ＢｇｌＣ固有のシグナル配列の他、例えばバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５、特開２０００−２１００８１号公報）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６、特開平４−１９０７９３号公報）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、ＢｇｌＣタンパク質と連結していることが好ましい。従って、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子は、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として存在しているのが好ましく、かかる前駆体遺伝子としては、例えば配列番号１６で示される、枯草菌ＫＳＭ−Ｓ２３７由来のセルラーゼのシグナル配列をコードする遺伝子が連結した遺伝子が挙げられる。
【００２２】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２３】
前記完全長ｂｇｌＣ遺伝子中にバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列を連結する手段は特に限定されず、操作の簡便性の観点から、既に報告された方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８（１９９０）等）に基づき実施できる。
【００２４】
上記の枯草菌変異株を用いて枯草菌ＢｇｌＣタンパク質を製造する場合、上記の枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、ｂｇｌＣ遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。
【００２５】
上記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子に作動可能に連結させるプロモーターとしては、導入された枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を枯草菌細胞内で発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されず、例えばバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５、特開２０００−２１００８１号公報）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６、特開平４−１９０７９３号公報）由来のアルカリセルラーゼＳ２３７とＳＰ６４のプロモーター、枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子とリボソームＲＮＡオペロンｒｒｎＯのプロモーター等が挙げられる。
【００２６】
本発明において上記の枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子、好ましくはシグナル配列を含む前駆体遺伝子、又はさらにプロモーター等を作動可能に連結させたそれらの遺伝子は、ゲノム中に存在しても、プラスミド中に存在してもよいが、プラスミド中に存在することが好ましい。
【００２７】
上記遺伝子をプラスミド中に存在させる場合には、上記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子にシグナルペプチドをコードする遺伝子やプロモーター等を作動可能に連結させた後、得られたＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを一般的な形質転換法によって宿主に導入して形質転換するのが好ましい。当該発現プラスミドとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２８】
一方、上記遺伝子をゲノム中に存在させる場合には、当該ＤＮＡ断片に宿主ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主ゲノムに直接組み込むことによって本発明の枯草菌を得ることができる。なお、枯草菌はゲノムにｂｇｌＣ遺伝子を有するが９種のプロテアーゼを欠失させてもＳＤＳ電気泳動ではＢｇｌＣを確認できないため、本来のゲノムに存在するｂｇｌＣ遺伝子は発現がないか、極めて少ないと考えられる。よって、ゲノム上の本来のｂｇｌＣ遺伝子を発現させるためには、ｂｇｌＣ遺伝子の上流に、宿主の枯草菌が本来有するものとは異なる制御領域又は制御領域及びシグナル配列を導入した枯草菌を得るのが好ましい。
【００２９】
上記で得られた枯草菌形質転換体を、適切な培地において培養し、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させて枯草菌ＢｇｌＣタンパク質を産生させ、更に当該タンパク質を細胞外へ分泌させることを特徴とする。枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させる際、当該遺伝子に連結したプロモーターの性質に応じて、当該培地の組成を適宜調節するのが好ましい。特に発現誘導型プロモーターを用いる場合には、そのプロモーター活性を向上させる誘導物質を適切なタイミングで培地中に添加するのが好ましい。
【００３０】
上記の枯草菌変異株は、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００３１】
培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い、目的のＢｇｌＣタンパク質を抽出・精製することにより得ることができる。
【００３２】
上記により得られた完全長ＢｇｌＣは、セルロースに作用してその鎖を切断する活性を有し、しかも不完全長ＢｇｌＣと比較し糖化活性が高い。ゆえに、セルロースの糖化用酵素として有用であり、例えばバイオマスからバイオエタノールを工業的に製造するための酵素として利用することができる。
【００３３】
上記により得られた完全長ＢｇｌＣは、以下の酵素学的性質を有する。
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。また当該活性は、不完全長ＢｇｌＣと比較し４２〜１３２％高い（表４）。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する（表２から表４）。
最適反応ｐＨ：５０ｍＭの各緩衝液［酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０及びｐＨ５．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０及びｐＨ８．０）、並びにグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０及びｐＨ１０．０）］中で酵素反応を行った結果、少なくともｐＨ４〜１０で作用し、最適ｐＨは約５である。
最適反応温度：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で反応を行った場合、最適反応温度は約５０℃である。
温度安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で２０分間反応を行った場合、３０℃〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。また、不完全長ＢｇｌＣと比較し、約２０℃高い。
分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約５２ｋＤａである。
【００３４】
また、得られた完全長ＢｇｌＣのアミノ酸を解析した結果、配列番号１７に示す配列であり、公知の推定アミノ酸配列どおりであった。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００３６】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００３７】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００３８】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００３９】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５，１３５（１９９０））、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））のいずれかによって行った。
【００４０】
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）、２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）、あるいはＣＳＬ発酵培地（２％酵母エキス、０．５％コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、０．０５％塩化マグネシウム七水和物、０．６％尿素、０．２％Ｌ−トリプトファン、１０％グルコース、０．１５％リン酸二水素ナトリウム、０．３５％リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いた。
【００４１】
（実施例１）ｂｇｌＣ遺伝子欠失株の構築
図１に示したように、枯草菌１６８株及びＤｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号）ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／））を薬剤耐性遺伝子（エリスロマイシン耐性遺伝子）に置換して欠失株を作製した。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したｂｇｌＣＦＷ及びｂｇｌＣ／ＥｍＲのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｂｇｌＣ／ＥｍＦ及びｂｇｌＣＲＶのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｂｇｌＣ遺伝子の下流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。更に、プラスミドｐＭｕｔｉｎ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，３０９７−３１０４，１９９８）鋳型とし、表１に示したｅｍｆ２及びｅｍｒ２のプライマーセットを用いて、１．３ｋｂのエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
次に、得られた１．０ｋｂ断片（Ａ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）及びＥｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表１に示すｂｇｌＣＦＷ２及びｂｇｌＣＲＶ２のプライマーセットを用いたＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって、３断片が（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）の順で含まれる３．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。
【００４４】
更に、得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、コンピテントセル形質転換法により１６８株の形質転換を行った。形質転換後、エリスロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００４５】
得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってｂｇｌＣ遺伝子がＥｍ耐性遺伝子で置換されていることを確認した。以上の操作により、１６８株のｂｇｌＣ遺伝子欠失株（ΔｂｇｌＣ：：Ｅｍ株）を構築し、１６８Ｄｃｅと命名した。
【００４６】
また、Ｄｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号）を元株とし、以上と同様の操作を行いｂｇｌＣ遺伝子欠失株を構築し、Ｄｐｒ９Ｄｃｅと命名した。
【００４７】
（実施例２）ｂｇｌＣ過剰発現プラスミドの構築
プラスミドの構築は、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTM Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行なった（図２）。プロトコールに従って設計したプライマー（表１）を用いて、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号）のプロモーターとシグナル配列の断片を、ｐＨＹＳ２３７（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（１１）：２２８１−９，２０００）を鋳型にして、並びに、枯草菌セルラーゼ遺伝子ｂｇｌＣを、枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にして、それぞれＰＳＦ＿ｉｎｆｕ（ＥｃＩ）とＰＳ２３７Ｒのプライマーセット、及びｂｇｌＣ−ｓｉｇ／ＰＳＦとｂｇｌＣ＿ｉｎｆｕ（ＳａＩ）のプライマーセットを用いて増幅した。得られた増幅産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化により線状化したｐＨＹ３００ＰＬＫ及びＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素を適当量で混合して３０分間反応を行ない、Ｓ２３７セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列にｂｇｌＣの構造遺伝子が連結したプラスミドを構築し、それをｐＨＰＳ−ｂｇｌＣと命名した。更に、当該プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（ＴａＫａＲａ）に導入し、形質転換した。
【００４８】
また、同様の操作により、ＳＰ６４セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列をｂｇｌＣの構造遺伝子に連結させた発現プラスミドを構築し、このプラスミドをｐＨＰＳ６４−ｂｇｌＣと命名した。また、枯草菌由来のｂｇｌＳ遺伝子を用いて同様の操作を行い、発現プラスミドｐＨＰＳ−ｂｇｌＳを構築した。
【００４９】
ＣＭＣ及びトリパンブルーを添加したＬＢ寒天培地を用い、テトラサイクリン耐性により大腸菌形質転換体を選抜した。また、当該形質転換体がハロー形成をすることが判明した。形質転換体より精製したプラスミドを用いて制限酵素処理あるいはＰＣＲを行い、形質転換が適切に行われていることを確認した。
【００５０】
（実施例３）枯草菌宿主へのプラスミド導入及び得られた形質転換体の培養
以上のように構築したプラスミドｐＨＰＳ−ｂｇｌＣ及び ｐＨＰＳ６４−ｂｇｌＣを、プロトプラスト形質転換法によってそれぞれ宿主菌株１６８Ｄｃｅ及びＤｐｒ９Ｄｃｅに導入した。これにより得られた組換え菌株を、１０ ｍＬのＬＢ培地で３０℃で一晩振盪培養し、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清中セルラーゼの活性測定を行なった。
【００５１】
（実施例４）培養上清のＣＭＣ分解活性
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ：日本製紙社製）が１．０％（ｗ／ｖ）、及び酢酸緩衝液が５０ｍＭとなるように９０μＬの混合液を調製し、適当な濃度に希釈した酵素溶液１０μＬを添加し、５０℃で１５分間反応した。ＤＮＳ溶液１００μＬを添加して反応を停止させた後、１００℃で５分間熱処理した。冷却後、反応液１００μＬの吸光度（５３５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。なお、基質溶液９０μＬにＤＮＳ溶液を１００μＬ添加後、酵素溶液１０μＬを加え、同様の操作を行ったものを対照とした。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコース相当の還元糖を遊離する酵素量を、１ユニット（Ｕ）とした。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
（実施例５）培養上清のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトシオシド分解活性
１／７．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに、０．４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ加えて混和し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、３０℃、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０）変化を１０分間にわたり測定した。Ｓ２３７セルラーゼの活性を１００％とした相対活性を表３に示す。ＢｇｌＣはＳ２３７由来のセルラーゼより約２５％活性が高いことが明らかとなった。
【００５４】
【表３】
【００５５】
（実施例６）培養上清のセルロース糖化活性
セルロース｛Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１（Ｆｌｕｋａ社製）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐｏｗｄｅｒ （Ｆｕｌｕｋａ社製）及び粉砕パルプ｝を用い、セルロース糖化反応を行った。なお粉砕パルプは、粉末状パルプ（日本製紙ケミカル社製「Ｗ−４００Ｇ」、４００メッシュパス９０以上、セルロース含有量９９質量％、水分含量１質量％）を媒体撹拌式ミル（アトライタ、三井鉱山（株）製、「ＭＡ１Ｄ−Ｘ」、容器全容量：５．５Ｌ）に５００ｇ投入し、媒体として、直径１０ｍｍ、材質ジルコニア、ジルコニアボール：１１ｋｇをアトライタに充填（充填率５９％）して、回転数３０７ｒｐｍの条件で、２時間粉砕処理することにより粉砕パルプを調製した。
【００５６】
＜糖化反応＞：
１５０ｍｇの上記セルロースを、３ｍＬの酵素反応液（最終濃度０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）、蓋つきスクリュー管（Ｎｏ．５、φ２７×５５ｍｍ；マルエム製））に懸濁し、適量の酵素を添加し、５０℃で振盪撹拌（１５０ｒｐｍ、タイテック製恒温振盪機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら所定の時間反応させた。反応終了後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液中に遊離した還元糖をＤＮＳ法によって定量した。また、対照として酵素無添加の反応液についても同様の操作を行った。
【００５７】
＜糖化率測定（ＤＮＳ法）＞：
ＤＮＳ溶液２００μＬに上清液２μＬを添加し、１００℃で５分間熱処理した。冷却後、反応液１００μＬの吸光度（５３５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法（「生物化学実験法」還元糖の定量法、学会出版センター）によってグルコース換算により定量した。糖化率（％）は、「遊離還元糖量×０．９÷反応前のホロセルロース量×１００」で算出した。各セルロース基質に対するＢｇｌＣの糖化活性を表４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
Ｄｐｒ９Ｄｃｅ株において発現したＢｇｌＣは、１６８Ｄｃｅ株で発現した酵素より糖化活性が高く、特に粉砕パルプに対する活性は２．３倍高かった。
【００６０】
（実施例７）ＢｇｌＣと他の細菌由来のエンドグルカナーゼとの糖化活性比較
粉砕パルプを用いて、ＢｇｌＣと、他の細菌由来のエンドグルカナーゼ（枯草菌ＢｇｌＳ及び枯草菌ＫＳＭ−Ｎ１４５株由来のＥｇＩ−１４５（特開２００５−２８７４４１号））との、糖化活性の比較を行なった。結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
＜ＢｇｌＣの酵素学的性質＞：
（実施例８）ＢｇｌＣの最適反応ｐＨ
５０ｍＭの各緩衝液［酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０及びｐＨ５．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０及びｐＨ８．０）、並びにグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０及びｐＨ１０．０）］を使用した以外は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図３に示す。
【００６３】
（実施例９）ＢｇｌＣの最適反応温度
反応温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で反応させた以外は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図４に示す。
【００６４】
（実施例１０）ＢｇｌＣの温度安定性
５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃で２０分間処理した後は、実施例４と同様の方法に従い、試験を行った。結果を表６及び図５に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
実施例８から１０において、野生株及びプロテアーゼ欠失株の両方において発現したＢｇｌＣを用いて測定を行なった結果、プロテアーゼ欠失株にて発現したＢｇｌＣが野生株で発現した酵素よりも温度安定性が高いことが判明した。
【００６７】
本発明の製造法により得られた完全長ＢｇｌＣの酵素学的性質を、以下に示す。
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有し、当該活性が、枯草菌１６８株により産生されるＢｇｌＣと比較し４２〜１３２％高い。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ４〜１０で作用し、最適ｐＨは約５である。
最適反応温度：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で反応を行った場合、最適反応温度は約５０℃である。
温度安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で反応を行った場合、３０℃〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。
分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約５２ｋＤａである。
【００６８】
（実施例１１）ＢｇｌＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例３で得られた培養上清中のＢｇｌＣを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。図６に示すように、野生株では３３ｋＤａの不完全長ＢｇｌＣが発現されるのに対し、プロテアーゼ９重欠失株では５２ｋＤａの完全長ＢｇｌＣが発現した。この結果から、野生株から得られたＢｇｌＣはプロテアーゼにより分解されているが、本願発明の製造法により得られたＢｇｌＣはプロテアーゼによる分解を受けず、完全長が維持されることが明らかとなった。
【００６９】
次に、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択されるプロテアーゼのいずれか１つを欠失する単一欠失株、並びにそれらを複数欠失するプロテアーゼ多重欠失株を用いて、ＢｇｌＣの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結果を図７に示す。いずれの単一欠失株においてもＢｇｌＣの分解が観察されたが、８重欠失株以上ではＢｇｌＣの分解が完全に抑えられ、完全長ＢｇｌＣが観察された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させることを特徴とする、ＢｇｌＣの製造法。
【請求項２】
前記８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
前記枯草菌変異株が、枯草菌ＢｇｌＣをコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子がプラスミドにより導入されている、請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として導入されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
前記シグナル配列が、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、請求項４記載の製造法。
【請求項６】
前記バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、請求項５記載の製造法。
【請求項７】
前記完全長ＢｇｌＣが、５２ｋＤａの分子量を有するＢｇｌＣである、請求項１から６のいずれか１項記載の製造法。
【請求項８】
前記シグナル配列を含む前駆体遺伝子が、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列を有する、請求項４から７のいずれか１項記載の製造法。
【請求項９】
枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させ、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を、プラスミドにより導入してなる枯草菌変異株。
【請求項１０】
前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域と作動可能に連結されている、請求項１０記載の枯草菌変異株。
【請求項１１】
枯草菌１６８株から欠失させる８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、請求項９又は１０記載の枯草菌変異株。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか１項記載の製造法により得られる完全長ＢｇｌＣ。
【請求項１３】
以下の酵素学的性質を有する、完全長ＢｇｌＣ：
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）。
最適反応温度：約５０℃（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））。
温度安定性：３０℃〜６０℃（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間反応）。
分子量：約５２ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）。
【請求項１】
枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させることを特徴とする、ＢｇｌＣの製造法。
【請求項２】
前記８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
前記枯草菌変異株が、枯草菌ＢｇｌＣをコードする枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子がプラスミドにより導入されている、請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、シグナル配列を含む前駆体遺伝子として導入されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
前記シグナル配列が、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、請求項４記載の製造法。
【請求項６】
前記バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列が、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）又はバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼのシグナル配列である、請求項５記載の製造法。
【請求項７】
前記完全長ＢｇｌＣが、５２ｋＤａの分子量を有するＢｇｌＣである、請求項１から６のいずれか１項記載の製造法。
【請求項８】
前記シグナル配列を含む前駆体遺伝子が、配列番号１６で示される塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列を有する、請求項４から７のいずれか１項記載の製造法。
【請求項９】
枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子の中から選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させ、枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子を、プラスミドにより導入してなる枯草菌変異株。
【請求項１０】
前記枯草菌ｂｇｌＣ遺伝子が、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域と作動可能に連結されている、請求項１０記載の枯草菌変異株。
【請求項１１】
枯草菌１６８株から欠失させる８つ以上のプロテアーゼ遺伝子が、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子であるか、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子である、請求項９又は１０記載の枯草菌変異株。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか１項記載の製造法により得られる完全長ＢｇｌＣ。
【請求項１３】
以下の酵素学的性質を有する、完全長ＢｇｌＣ：
作用：セルロースに作用して還元糖を生成する活性を有する。
基質特異性：カルボキシメチルセルース、セロトリオシド、粉砕パルプを分解し、還元糖を生成する。
最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）。
最適反応温度：約５０℃（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））。
温度安定性：３０℃〜６０℃（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間反応）。
分子量：約５２ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）。
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１１５２１９（Ｐ２０１２−１１５２１９Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６９２９４（Ｐ２０１０−２６９２９４）
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「バイオマスエネルギー先導技術開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「バイオマスエネルギー先導技術開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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