カタラーゼ高生産性リゾビウム属微生物
【課題】熱安定性に優れたカタラーゼを大量に生産する微生物を用いて、培地当たりのカタラーゼ活性を高めることにより、低コストでカタラーゼを提供すること。
【解決手段】蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物および当該微生物が生産するカタラーゼ。
【解決手段】蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物および当該微生物が生産するカタラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカタラーゼを大量に生産するリゾビウム属微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過酸化水素は、繊維やパルプの漂白剤、食品の殺菌剤、酸化剤、半導体ウェハーの洗浄剤として広く使用されている。この過酸化水素は廃水中に残留すると化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を増加させる事や生物処理工程へ悪影響を及ぼす事が懸念されるため分解することが必要とされている。
【０００３】
過酸化水素の分解方法としては、重亜硫酸ナトリウム等の還元剤を用いる方法が実施されてきたが過酸化水素と当量添加しなければ化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を増加させることや作業の安全性の問題から、酵素（カタラーゼ）による処理が実施されるようになってきた。しかしながら、製品としての価格が高いため酵素による過酸化水素の処理は十分普及するに至っていない。
【０００４】
従来カタラーゼを生産する微生物として、カビの一種であるサーモアスカス オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）（特許文献１）や、細菌の一種であるミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）等が使用されてきた。しかしながら、製品にするには酵素の活性値を十分に高めるために精製などの濃縮工程を要していた。さらに、サーモアスカス オーランティアカスやアスペルギルス ニガーなどのカビは培養に５〜１０日間要するため生産効率が悪かった。細菌については培養効率が良いが熱安定性が低いなどそれぞれに欠点を抱えている。
【特許文献１】特開平９−４７２８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は熱安定性に優れたカタラーゼを大量に生産する細菌を用いて、効率良く培養し、かつ培地当たり、または菌体湿重量当たりのカタラーゼ活性を高めることにより、低コストでカタラーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するために本発明者は効率的にカタラーゼを生産する微生物を自然界よりスクリーニングした。その結果、熱安定性の高いカタラーゼを高収量で得られるリゾビウム（Rhizobium）属（旧分類による名称：アグロバクテリウム（Agrobacterium）属）微生物を分離した。また、この微生物は従来用いられてきたカタラーゼ生産菌と比較しても、培養液あたり５〜１０倍のカタラーゼを生産するため、または菌体湿重量あたり１０倍以上のカタラーゼを生産するため、精製など価格高の原因となる工程を得ずに菌体抽出液の状態で過酸化水素の分解に使用することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明はリゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。より具体的には、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。好ましくは、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０，０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。
【０００８】
また、本発明は、リゾビウム属微生物に適した培養条件による培養にて得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。より具体的には、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して得られる菌体の湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。好ましくは、菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性は４，０００ｋＵ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６，０００ｋＵ／ｇ以上である。
【０００９】
また使用する菌株は上記リゾビウム属微生物の変種または変異株でもよい。変種および変異株は、当業者に知られた方法で作成・分離することができる。
【００１０】
また、本発明は以下の理化学的性質を有するリゾビウム属微生物由来のカタラーゼである。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上の活性を保持する。
【００１１】
更に、本発明は上記リゾビウム属微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕してカタラーゼを抽出することを特徴とするカタラーゼの製造方法である。本発明の微生物は培養液あたり、または菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が高いので、菌体破砕後のカタラーゼの濃縮工程は必須ではない。
【００１２】
また更に、本発明は上記カタラーゼを過酸化水素に作用させることを特徴とする過酸化水素の分解方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリゾビウム属微生物は、短い培養日数でしかも高活性のカタラーゼを生産するため、従来工業的に使用されてきた微生物よりもカタラーゼを効率良く得ることができる。
【００１４】
また、本発明のリゾビウム属微生物はカタラーゼを菌体内に蓄積するので、菌体外に放出する微生物と比較してカタラーゼの回収が容易である。例えば、本発明のリゾビウム属微生物を培養して、得られる菌体を少量の液体中で破砕することによって高活性のカタラーゼを含む菌体抽出液を得ることができる。
【００１５】
本発明のリゾビウム属微生物より得られるカタラーゼは、従来工業的に使用されてきたものよりも培地あたりの活性値およびタンパク質あたりの活性値が数倍高く、または菌体湿重量あたりの活性値が１０倍以上高いので使用範囲がより広い。
【００１６】
更に、本発明のリゾビウム属微生物より得られるカタラーゼは熱安定性に優れているので使用範囲が比較的広い。菌体抽出液を４、３０、５０℃にそれぞれ４ヶ月間静置した後も、酵素活性の低下は認められないため、常温での長期保存が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物（以下、単に「本発明微生物」ということもある）は、工場廃水や土壌等からスクリーニングすることにより得られる。なお、本発明においてカタラーゼ活性は、３０℃にて１分間に過酸化水素を１μｍｏｌ分解する活性を１単位（１Ｕ：１ユニット）と定義する。
【００１８】
同様に、培養により得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とする本発明のリゾビウム属微生物（以下、単に「本発明微生物」ということもある）は、工場廃水や土壌等からスクリーニングすることにより得られる。
【００１９】
上記スクリーニングは、例えば次のようにして行われる。まず、工場廃水や土壌等を過酸化水素含有培地に添加し培養する。過酸化水素存在下で増殖することを指標に、さらにその菌体そのものまたは菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する速度を指標に選択する。菌体抽出液は培養液を超音波照射やフレンチプレス等によって破砕して得ることができる。そして培地あたりのカタラーゼ活性およびタンパク質あたりのカタラーゼ活性を測定し、培地あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１５,０００Ｕ／ｍｌ以上、特に好ましくは２０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０,０００Ｕ／ｍｇ以上、特に好ましくは１５,０００Ｕ／ｍｇ以上であるものを本発明微生物として選択すればよい。
【００２０】
上記のようなスクリーニングで得られる微生物の一例としては、本発明者が飲料メーカーの工場廃水より見出した２−１株（旧名称：ＳＧ２−１株）が挙げられる。以下にこの微生物の菌学的諸性質を以下に示す。
【００２１】
＜ 形態 ＞
細胞の形態：桿菌
運動性：有り
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：ベージュ
コロニーの表面：平滑
生育温度：４℃、３０℃、４０℃で生育する。４５℃で生育しない
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６.５〜７.５）
酸素要求性：好気
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
Ｏ−Ｆテスト：oxidative
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
資化性（Ｄ−フルクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、グリセロール、Ｌアラビノース、スクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース）：有り
【００２２】
上記２−１株をＢＩＯＬＯＧ簡易同定システムに供し、９５種類の炭素源の資化パターンを得た。資化パターンについて類似性の高い菌種を検索したところ、リゾビウム属に最も高い類似性を示していた。また、上記微生物のＤＮＡを常法により抽出し１６Ｓ ｒＤＮＡの部分をＰＣＲ法により増幅して塩基配列を決定し、その塩基配列についてＦＡＳＴＡサーチを行ったところリゾビウム属に属することが判明した。
【００２３】
上記解析により２−１株はリゾビウム エスピー（Rhizobium sp.）（旧分類による名称：アグロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp.））と同定された。本出願人はこれをリゾビウム エスピー ２−１（Rhizobium sp. 2-1）と命名し（旧分類による名称：アグロバクテリウム エスピー ２−１（Agrobacterium sp. ２−１））、平成１６年１２月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号305-8566、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３４８として寄託した。
【００２４】
次に、本発明微生物を使用するカタラーゼの製造について説明する。本発明微生物はカタラーゼを菌体内に生産するので、本発明微生物からカタラーゼを得るためには、まず、本発明微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕すればよい。必要に応じ、破砕液からカタラーゼを抽出することにより、より高活性のカタラーゼ懸濁液を得ることができる。
【００２５】
本発明微生物の培養に用いる培地の炭素源としてはグルコース、酵母エキス等を使用することができ、窒素源としてはペプトン、トリプトン、酵母エキス、肉エキス等を使用することができる。また、無機塩としてはリン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を用いることが出来る。下記に具体的な培地の一例を示す。
【００２６】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ｐＨ ６.５
【００２７】
上記培地を用いた本発明微生物の培養は通常２０℃〜３５℃好ましくは３０℃、ｐＨ５.５〜９.５、好ましくは６.５〜７.５の好気条件で行われる。培養時間は対数増殖期後期から定常期前期までの時間でよく、定常期に達するまでの時間はおよそ１５〜２０時間程度である。
【００２８】
上記培養で得られる培養液中の微生物を破砕する方法は、微生物を破砕できる方法であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液等で洗浄後、超音波照射、フレンチプレス、酵素（リゾチウム）等で破砕されることが好ましく、特に、フレンチプレスが好ましい。更に、培養液中の菌体を破砕後には未破砕の菌体を分離するために遠心分離、ろ過等を行ってもよい。
【００２９】
上記培養液中の微生物を破砕することにより得られる菌体抽出液はカタラーゼ活性が十分に高いため、コスト高の一因となる濃縮過程を経ずに菌体抽出液のまま過酸化水素の分解等に使用することができる。
【００３０】
斯くして得られる本発明のカタラーゼは過酸化水素に作用し、酸素と水に分解するものであり、更に以下の理化学的性質を有するものである。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上、好ましくは８５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上、好ましくは５５％以上の活性を保持する。
（ｂ）ｐＨ安定性
３０℃で３０分間処理したときｐＨ５〜１１で８０％以上、好ましくは９０％以上の活性を保持する。
（ｃ）至適温度
至適温度は４〜６５℃、好ましくは３０〜５０℃である。
（ｄ）至適ｐＨ
至適ｐＨは５〜９、好ましくは６〜９である。
【００３１】
上記に示された本発明微生物およびカタラーゼは繊維やパルプの漂白剤、食品の殺菌、酸化剤、半導体ウェハーの洗浄を行う工場の排水や下水の処理に好適に用いることが出来る。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。
【００３３】
なお、以下の実施例においてカタラーゼ活性は次のようにして算出した。まず、３０ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を調整し、この１ｍｌを１ｃｍの光透過石英セルに入れ、菌体抽出液を数μl添加して反応を開始させた。分光光度計により過酸化水素の減少を２４０ｎｍの吸光値で測定し、その初速度から活性値を計算した。
【００３４】
実施例１
カタラーゼを生産する微生物のスクリーニング：
工場廃水や土壌約２００サンプルについて、カタラーゼ活性が高い微生物をスクリーニングした。まず、工場廃水や土壌等を下記に示す培地に添加し培養した。過酸化水素存在下で増殖することを指標に、さらにその菌体そのものまたは菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する速度を指標に選択した。菌体抽出液は培養液を超音波照射やフレンチプレス等によって破砕して菌体抽出液を調製し、そのカタラーゼ活性を測定した。
【００３５】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
過酸化水素 ５００ｐｐｍ
蒸留水 １Ｌ
【００３６】
上記スクリーニングの結果、工場廃水から一般的にカタラーゼ活性が高いといわれているミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）ＮＢＲＣ３３３３よりも数倍高いカタラーゼ活性を有する微生物として２−１株を取得した。この２−１株についてＢＩＯＬＯＧ簡易同定システムおよび１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を用いたＦＡＳＴＡサーチを行った結果、リゾビウム エスピーと同定された。本発明者は２−１株をリゾビウム エスピー ２−１と名付けた。リゾビウム エスピー ２−１株の分類学上の位置を図１に示した。尚、旧分類による名称アグロバクテリウム エスピーＳＧ２−１株の分類学上の位置を図２に示した。
【００３７】
実施例２
菌体抽出液の調製：
リゾビウム エスピー ２−１株（以下、単に「２−１株」という）を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）によって集菌した。回収した菌体約５ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、培地量と同量（１Ｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。また、比較としてミクロコッカス ルテウス ＮＢＲＣ３３３３（以下、単に「ＮＢＲＣ３３３３」という）の菌体抽出液を２−１株と同様にして得た。これら菌体抽出液のカタラーゼ活性とタンパク質あたりのカタラーゼ活性を測定した。
【００３８】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
【００３９】
２−１株の菌体抽出液あたりのカタラーゼ活性は２２,５４０Ｕ／ｍｌであり、タンパク質あたりのカタラーゼ活性は２１,５５０Ｕ／ｍｇであった。一方、ＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液あたりのカタラーゼ活性は３,１４０Ｕ／ｍｌであり、タンパク質あたりのカタラーゼ活性は２,８７０Ｕ／ｍｇであった。
また、菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性としては、２−１株は６,５０８ｋＵ／ｇであり、ＮＢＲＣ３３３３株では２３６ｋＵ／ｇであった。
【００４０】
実施例３
カタラーゼの性質の測定：
実施例２で得られた２−１株の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについて以下の性質を測定した。また、比較としてＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについても同様に測定した。
【００４１】
（１）熱安定性および至適温度
試験管に実施例２で得られた菌体抽出液１ｍｌを入れ、各温度（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５）で１５分間インキュベートした後、カタラーゼ活性を測定した。その結果を図３に示した。
【００４２】
２−１株が生産するカタラーゼはインキュベート前のカタラーゼ活性を１００％とした場合に、６０℃で８８％、６５℃で５７％の活性を保持していた。一方、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼは６０℃で４２％、６５℃で１６％の活性を保持していた。また、２−１株が生産するカタラーゼの至適温度は３０〜５０℃であった。
【００４３】
（２）ｐＨ安定性
菌体抽出液を各ｐＨ（４、５、６、７、８、９、１０、１１）の緩衝液に添加し、３０℃で３０分静置後のカタラーゼ活性を測定した。緩衝液は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８〜９）、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０〜１１）を使用した。
【００４４】
２−１株が生産するカタラーゼはｐＨ５〜１１でｐＨ７のときの約９０％以上の活性を保持した。また、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼもほぼ同様の結果であった。
【００４５】
（３）至適ｐＨ
過酸化水素を３０ｍＭ含む各ｐＨ（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）の緩衝液を調整し、その緩衝液中でのカタラーゼ活性を測定した。
【００４６】
２−１株が生産するカタラーゼの至適ｐＨは６〜９であった。また、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼもほぼ同様の結果であった。
【００４７】
以上の通り、２−１株が生産するカタラーゼは、従来カタラーゼ活性が高いといわれていたＮＢＲＣ３３３３より培地あたり、また、タンパク質あたりの活性値が数倍高く、しかも熱安定性に優れたものであった。
【００４８】
実施例４
カタラーゼを用いた過酸化水素の分解：
２−１株を実施例２と同様に定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）によって集菌した。得られた菌体約５ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、培地量の１／５（２００ｍｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は１２６,６００Ｕ／ｍｌであった。この菌体抽出液を終濃度０.１％になるように過酸化水素を１％含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。廃水中の過酸化水素の濃度を経時的に測定した結果を図４に示した。
【００４９】
工場廃水に含まれていた１％の過酸化水素は、１分後には０.２０％、３分後には０.０５％、５分後にはほぼ完全に分解した。
【００５０】
実施例５
カタラーゼを用いた過酸化水素の分解：
２−１株を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１０分）によって集菌した。得られた菌体約２３ｇ（湿重量）を２００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は２１２,８４０Ｕ／ｍｌであった。この菌体抽出液を終濃度１００Ｕ／ｍｌになるように過酸化水素を１％含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。ＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液についても同時に試験を行い、比較した。
【００５１】
（培地組成）
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
クエン酸ナトリウム １ｇ
グルタミン酸ナトリウム １０ｇ
コーンスティープリカー ５ｇ
蒸留水 １Ｌ
【００５２】
廃水に含まれていた１％の過酸化水素は、１分後には０.３８％に、５分後には０.０５％、２０分後にはほぼ完全に分解した。一方、ＮＢＲＣ３３３３は、１分後に０.４４％、５分後に０.２７％、２０分後も０.２０％が残存したままだった。廃水中の過酸化水素の濃度を経時的に測定した結果を図５に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明微生物はカタラーゼを大量に、かつ、菌体内に生産するので高活性カタラーゼの製造に好適である。また、これより得られる本発明のカタラーゼは、熱安定性に優れたものであり、過酸化水素の分解に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明微生物２−１株の分類学上の位置を示す系統樹である。
【図２】図２は、本発明微生物の旧名称での分類学上の位置を示す系統樹である。
【図３】図３は、本発明のカタラーゼを含む菌体抽出液の温度安定性を示す図面である。
【図４】図４は、本発明のカタラーゼを工場廃水に作用させ、過酸化水素が減少する様子を示す図面である。
【図５】図５は、本発明のカタラーゼを工場廃水に作用させ、過酸化水素が減少する様子を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はカタラーゼを大量に生産するリゾビウム属微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過酸化水素は、繊維やパルプの漂白剤、食品の殺菌剤、酸化剤、半導体ウェハーの洗浄剤として広く使用されている。この過酸化水素は廃水中に残留すると化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を増加させる事や生物処理工程へ悪影響を及ぼす事が懸念されるため分解することが必要とされている。
【０００３】
過酸化水素の分解方法としては、重亜硫酸ナトリウム等の還元剤を用いる方法が実施されてきたが過酸化水素と当量添加しなければ化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を増加させることや作業の安全性の問題から、酵素（カタラーゼ）による処理が実施されるようになってきた。しかしながら、製品としての価格が高いため酵素による過酸化水素の処理は十分普及するに至っていない。
【０００４】
従来カタラーゼを生産する微生物として、カビの一種であるサーモアスカス オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）（特許文献１）や、細菌の一種であるミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）等が使用されてきた。しかしながら、製品にするには酵素の活性値を十分に高めるために精製などの濃縮工程を要していた。さらに、サーモアスカス オーランティアカスやアスペルギルス ニガーなどのカビは培養に５〜１０日間要するため生産効率が悪かった。細菌については培養効率が良いが熱安定性が低いなどそれぞれに欠点を抱えている。
【特許文献１】特開平９−４７２８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は熱安定性に優れたカタラーゼを大量に生産する細菌を用いて、効率良く培養し、かつ培地当たり、または菌体湿重量当たりのカタラーゼ活性を高めることにより、低コストでカタラーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するために本発明者は効率的にカタラーゼを生産する微生物を自然界よりスクリーニングした。その結果、熱安定性の高いカタラーゼを高収量で得られるリゾビウム（Rhizobium）属（旧分類による名称：アグロバクテリウム（Agrobacterium）属）微生物を分離した。また、この微生物は従来用いられてきたカタラーゼ生産菌と比較しても、培養液あたり５〜１０倍のカタラーゼを生産するため、または菌体湿重量あたり１０倍以上のカタラーゼを生産するため、精製など価格高の原因となる工程を得ずに菌体抽出液の状態で過酸化水素の分解に使用することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明はリゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。より具体的には、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。好ましくは、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０，０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。
【０００８】
また、本発明は、リゾビウム属微生物に適した培養条件による培養にて得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。より具体的には、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して得られる菌体の湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物である。好ましくは、菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性は４，０００ｋＵ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６，０００ｋＵ／ｇ以上である。
【０００９】
また使用する菌株は上記リゾビウム属微生物の変種または変異株でもよい。変種および変異株は、当業者に知られた方法で作成・分離することができる。
【００１０】
また、本発明は以下の理化学的性質を有するリゾビウム属微生物由来のカタラーゼである。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上の活性を保持する。
【００１１】
更に、本発明は上記リゾビウム属微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕してカタラーゼを抽出することを特徴とするカタラーゼの製造方法である。本発明の微生物は培養液あたり、または菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が高いので、菌体破砕後のカタラーゼの濃縮工程は必須ではない。
【００１２】
また更に、本発明は上記カタラーゼを過酸化水素に作用させることを特徴とする過酸化水素の分解方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリゾビウム属微生物は、短い培養日数でしかも高活性のカタラーゼを生産するため、従来工業的に使用されてきた微生物よりもカタラーゼを効率良く得ることができる。
【００１４】
また、本発明のリゾビウム属微生物はカタラーゼを菌体内に蓄積するので、菌体外に放出する微生物と比較してカタラーゼの回収が容易である。例えば、本発明のリゾビウム属微生物を培養して、得られる菌体を少量の液体中で破砕することによって高活性のカタラーゼを含む菌体抽出液を得ることができる。
【００１５】
本発明のリゾビウム属微生物より得られるカタラーゼは、従来工業的に使用されてきたものよりも培地あたりの活性値およびタンパク質あたりの活性値が数倍高く、または菌体湿重量あたりの活性値が１０倍以上高いので使用範囲がより広い。
【００１６】
更に、本発明のリゾビウム属微生物より得られるカタラーゼは熱安定性に優れているので使用範囲が比較的広い。菌体抽出液を４、３０、５０℃にそれぞれ４ヶ月間静置した後も、酵素活性の低下は認められないため、常温での長期保存が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物（以下、単に「本発明微生物」ということもある）は、工場廃水や土壌等からスクリーニングすることにより得られる。なお、本発明においてカタラーゼ活性は、３０℃にて１分間に過酸化水素を１μｍｏｌ分解する活性を１単位（１Ｕ：１ユニット）と定義する。
【００１８】
同様に、培養により得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とする本発明のリゾビウム属微生物（以下、単に「本発明微生物」ということもある）は、工場廃水や土壌等からスクリーニングすることにより得られる。
【００１９】
上記スクリーニングは、例えば次のようにして行われる。まず、工場廃水や土壌等を過酸化水素含有培地に添加し培養する。過酸化水素存在下で増殖することを指標に、さらにその菌体そのものまたは菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する速度を指標に選択する。菌体抽出液は培養液を超音波照射やフレンチプレス等によって破砕して得ることができる。そして培地あたりのカタラーゼ活性およびタンパク質あたりのカタラーゼ活性を測定し、培地あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１５,０００Ｕ／ｍｌ以上、特に好ましくは２０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０,０００Ｕ／ｍｇ以上、特に好ましくは１５,０００Ｕ／ｍｇ以上であるものを本発明微生物として選択すればよい。
【００２０】
上記のようなスクリーニングで得られる微生物の一例としては、本発明者が飲料メーカーの工場廃水より見出した２−１株（旧名称：ＳＧ２−１株）が挙げられる。以下にこの微生物の菌学的諸性質を以下に示す。
【００２１】
＜ 形態 ＞
細胞の形態：桿菌
運動性：有り
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：ベージュ
コロニーの表面：平滑
生育温度：４℃、３０℃、４０℃で生育する。４５℃で生育しない
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６.５〜７.５）
酸素要求性：好気
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
Ｏ−Ｆテスト：oxidative
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
資化性（Ｄ−フルクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、グリセロール、Ｌアラビノース、スクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース）：有り
【００２２】
上記２−１株をＢＩＯＬＯＧ簡易同定システムに供し、９５種類の炭素源の資化パターンを得た。資化パターンについて類似性の高い菌種を検索したところ、リゾビウム属に最も高い類似性を示していた。また、上記微生物のＤＮＡを常法により抽出し１６Ｓ ｒＤＮＡの部分をＰＣＲ法により増幅して塩基配列を決定し、その塩基配列についてＦＡＳＴＡサーチを行ったところリゾビウム属に属することが判明した。
【００２３】
上記解析により２−１株はリゾビウム エスピー（Rhizobium sp.）（旧分類による名称：アグロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp.））と同定された。本出願人はこれをリゾビウム エスピー ２−１（Rhizobium sp. 2-1）と命名し（旧分類による名称：アグロバクテリウム エスピー ２−１（Agrobacterium sp. ２−１））、平成１６年１２月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号305-8566、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３４８として寄託した。
【００２４】
次に、本発明微生物を使用するカタラーゼの製造について説明する。本発明微生物はカタラーゼを菌体内に生産するので、本発明微生物からカタラーゼを得るためには、まず、本発明微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕すればよい。必要に応じ、破砕液からカタラーゼを抽出することにより、より高活性のカタラーゼ懸濁液を得ることができる。
【００２５】
本発明微生物の培養に用いる培地の炭素源としてはグルコース、酵母エキス等を使用することができ、窒素源としてはペプトン、トリプトン、酵母エキス、肉エキス等を使用することができる。また、無機塩としてはリン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を用いることが出来る。下記に具体的な培地の一例を示す。
【００２６】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ｐＨ ６.５
【００２７】
上記培地を用いた本発明微生物の培養は通常２０℃〜３５℃好ましくは３０℃、ｐＨ５.５〜９.５、好ましくは６.５〜７.５の好気条件で行われる。培養時間は対数増殖期後期から定常期前期までの時間でよく、定常期に達するまでの時間はおよそ１５〜２０時間程度である。
【００２８】
上記培養で得られる培養液中の微生物を破砕する方法は、微生物を破砕できる方法であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液等で洗浄後、超音波照射、フレンチプレス、酵素（リゾチウム）等で破砕されることが好ましく、特に、フレンチプレスが好ましい。更に、培養液中の菌体を破砕後には未破砕の菌体を分離するために遠心分離、ろ過等を行ってもよい。
【００２９】
上記培養液中の微生物を破砕することにより得られる菌体抽出液はカタラーゼ活性が十分に高いため、コスト高の一因となる濃縮過程を経ずに菌体抽出液のまま過酸化水素の分解等に使用することができる。
【００３０】
斯くして得られる本発明のカタラーゼは過酸化水素に作用し、酸素と水に分解するものであり、更に以下の理化学的性質を有するものである。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上、好ましくは８５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上、好ましくは５５％以上の活性を保持する。
（ｂ）ｐＨ安定性
３０℃で３０分間処理したときｐＨ５〜１１で８０％以上、好ましくは９０％以上の活性を保持する。
（ｃ）至適温度
至適温度は４〜６５℃、好ましくは３０〜５０℃である。
（ｄ）至適ｐＨ
至適ｐＨは５〜９、好ましくは６〜９である。
【００３１】
上記に示された本発明微生物およびカタラーゼは繊維やパルプの漂白剤、食品の殺菌、酸化剤、半導体ウェハーの洗浄を行う工場の排水や下水の処理に好適に用いることが出来る。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。
【００３３】
なお、以下の実施例においてカタラーゼ活性は次のようにして算出した。まず、３０ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を調整し、この１ｍｌを１ｃｍの光透過石英セルに入れ、菌体抽出液を数μl添加して反応を開始させた。分光光度計により過酸化水素の減少を２４０ｎｍの吸光値で測定し、その初速度から活性値を計算した。
【００３４】
実施例１
カタラーゼを生産する微生物のスクリーニング：
工場廃水や土壌約２００サンプルについて、カタラーゼ活性が高い微生物をスクリーニングした。まず、工場廃水や土壌等を下記に示す培地に添加し培養した。過酸化水素存在下で増殖することを指標に、さらにその菌体そのものまたは菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する速度を指標に選択した。菌体抽出液は培養液を超音波照射やフレンチプレス等によって破砕して菌体抽出液を調製し、そのカタラーゼ活性を測定した。
【００３５】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
過酸化水素 ５００ｐｐｍ
蒸留水 １Ｌ
【００３６】
上記スクリーニングの結果、工場廃水から一般的にカタラーゼ活性が高いといわれているミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）ＮＢＲＣ３３３３よりも数倍高いカタラーゼ活性を有する微生物として２−１株を取得した。この２−１株についてＢＩＯＬＯＧ簡易同定システムおよび１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を用いたＦＡＳＴＡサーチを行った結果、リゾビウム エスピーと同定された。本発明者は２−１株をリゾビウム エスピー ２−１と名付けた。リゾビウム エスピー ２−１株の分類学上の位置を図１に示した。尚、旧分類による名称アグロバクテリウム エスピーＳＧ２−１株の分類学上の位置を図２に示した。
【００３７】
実施例２
菌体抽出液の調製：
リゾビウム エスピー ２−１株（以下、単に「２−１株」という）を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）によって集菌した。回収した菌体約５ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、培地量と同量（１Ｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。また、比較としてミクロコッカス ルテウス ＮＢＲＣ３３３３（以下、単に「ＮＢＲＣ３３３３」という）の菌体抽出液を２−１株と同様にして得た。これら菌体抽出液のカタラーゼ活性とタンパク質あたりのカタラーゼ活性を測定した。
【００３８】
（培地組成）
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
【００３９】
２−１株の菌体抽出液あたりのカタラーゼ活性は２２,５４０Ｕ／ｍｌであり、タンパク質あたりのカタラーゼ活性は２１,５５０Ｕ／ｍｇであった。一方、ＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液あたりのカタラーゼ活性は３,１４０Ｕ／ｍｌであり、タンパク質あたりのカタラーゼ活性は２,８７０Ｕ／ｍｇであった。
また、菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性としては、２−１株は６,５０８ｋＵ／ｇであり、ＮＢＲＣ３３３３株では２３６ｋＵ／ｇであった。
【００４０】
実施例３
カタラーゼの性質の測定：
実施例２で得られた２−１株の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについて以下の性質を測定した。また、比較としてＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについても同様に測定した。
【００４１】
（１）熱安定性および至適温度
試験管に実施例２で得られた菌体抽出液１ｍｌを入れ、各温度（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５）で１５分間インキュベートした後、カタラーゼ活性を測定した。その結果を図３に示した。
【００４２】
２−１株が生産するカタラーゼはインキュベート前のカタラーゼ活性を１００％とした場合に、６０℃で８８％、６５℃で５７％の活性を保持していた。一方、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼは６０℃で４２％、６５℃で１６％の活性を保持していた。また、２−１株が生産するカタラーゼの至適温度は３０〜５０℃であった。
【００４３】
（２）ｐＨ安定性
菌体抽出液を各ｐＨ（４、５、６、７、８、９、１０、１１）の緩衝液に添加し、３０℃で３０分静置後のカタラーゼ活性を測定した。緩衝液は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８〜９）、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０〜１１）を使用した。
【００４４】
２−１株が生産するカタラーゼはｐＨ５〜１１でｐＨ７のときの約９０％以上の活性を保持した。また、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼもほぼ同様の結果であった。
【００４５】
（３）至適ｐＨ
過酸化水素を３０ｍＭ含む各ｐＨ（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）の緩衝液を調整し、その緩衝液中でのカタラーゼ活性を測定した。
【００４６】
２−１株が生産するカタラーゼの至適ｐＨは６〜９であった。また、ＮＢＲＣ３３３３が生産するカタラーゼもほぼ同様の結果であった。
【００４７】
以上の通り、２−１株が生産するカタラーゼは、従来カタラーゼ活性が高いといわれていたＮＢＲＣ３３３３より培地あたり、また、タンパク質あたりの活性値が数倍高く、しかも熱安定性に優れたものであった。
【００４８】
実施例４
カタラーゼを用いた過酸化水素の分解：
２−１株を実施例２と同様に定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）によって集菌した。得られた菌体約５ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、培地量の１／５（２００ｍｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は１２６,６００Ｕ／ｍｌであった。この菌体抽出液を終濃度０.１％になるように過酸化水素を１％含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。廃水中の過酸化水素の濃度を経時的に測定した結果を図４に示した。
【００４９】
工場廃水に含まれていた１％の過酸化水素は、１分後には０.２０％、３分後には０.０５％、５分後にはほぼ完全に分解した。
【００５０】
実施例５
カタラーゼを用いた過酸化水素の分解：
２−１株を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離（１０,０００ｇ、１０分）によって集菌した。得られた菌体約２３ｇ（湿重量）を２００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（２０,０００ｌｂ／ｉｎ２）で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離（１０,０００ｇ、１５分）することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は２１２,８４０Ｕ／ｍｌであった。この菌体抽出液を終濃度１００Ｕ／ｍｌになるように過酸化水素を１％含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。ＮＢＲＣ３３３３の菌体抽出液についても同時に試験を行い、比較した。
【００５１】
（培地組成）
酵母エキス ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
クエン酸ナトリウム １ｇ
グルタミン酸ナトリウム １０ｇ
コーンスティープリカー ５ｇ
蒸留水 １Ｌ
【００５２】
廃水に含まれていた１％の過酸化水素は、１分後には０.３８％に、５分後には０.０５％、２０分後にはほぼ完全に分解した。一方、ＮＢＲＣ３３３３は、１分後に０.４４％、５分後に０.２７％、２０分後も０.２０％が残存したままだった。廃水中の過酸化水素の濃度を経時的に測定した結果を図５に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明微生物はカタラーゼを大量に、かつ、菌体内に生産するので高活性カタラーゼの製造に好適である。また、これより得られる本発明のカタラーゼは、熱安定性に優れたものであり、過酸化水素の分解に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明微生物２−１株の分類学上の位置を示す系統樹である。
【図２】図２は、本発明微生物の旧名称での分類学上の位置を示す系統樹である。
【図３】図３は、本発明のカタラーゼを含む菌体抽出液の温度安定性を示す図面である。
【図４】図４は、本発明のカタラーゼを工場廃水に作用させ、過酸化水素が減少する様子を示す図面である。
【図５】図５は、本発明のカタラーゼを工場廃水に作用させ、過酸化水素が減少する様子を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物。
【請求項２】
培養が、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養するものである、請求項１記載のリゾビウム属微生物。
【請求項３】
タンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０，０００Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１または２記載のリゾビウム属微生物。
【請求項４】
リゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物。
【請求項５】
培養が、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養するものである、請求項４記載のリゾビウム属微生物。
【請求項６】
以下の菌学的性質を有する請求項第１〜５のいずれか一項記載のリゾビウム属微生物。
＜ 形態 ＞
細胞の形態：桿菌
運動性：有り
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：ベージュ
コロニーの表面：平滑
生育温度：４℃、３０℃、４０℃で生育する。４５℃で生育しない
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６.５〜７.５）
酸素要求性：好気
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
Ｏ−Ｆテスト：oxidative
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
資化性（Ｄ−フルクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、グリセロール、Ｌアラビノース、スクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース）：有り
【請求項７】
リゾビウム エスピー ２−１（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３４８）である、請求項第１〜６のいずれか一項記載のリゾビウム属微生物。
【請求項８】
以下の理化学的性質を有するリゾビウム属微生物由来のカタラーゼ。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上の活性を保持する。
【請求項９】
請求項第１〜７項の何れかに記載のリゾビウム属微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕してカタラーゼを抽出することを特徴とするカタラーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項第９項に記載のカタラーゼを過酸化水素に作用させることを特徴とする過酸化水素の分解方法。
【請求項１】
リゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕して得られるカタラーゼ活性が培地あたり１０,０００Ｕ／ｍｌ以上であり、かつ、タンパク質あたりのカタラーゼ活性が５,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物。
【請求項２】
培養が、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養するものである、請求項１記載のリゾビウム属微生物。
【請求項３】
タンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０，０００Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１または２記載のリゾビウム属微生物。
【請求項４】
リゾビウム属微生物に適した培養条件での培養にて得られる菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性が１，０００ｋＵ／ｇ以上であり、かつタンパク質あたりのカタラーゼ活性が１０,０００Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とするリゾビウム属微生物。
【請求項５】
培養が、蒸留水１Ｌあたりトリプトンを１０ｇ、酵母エキスを５ｇおよび塩化ナトリウムを１０ｇ含む培地で１日培養するものである、請求項４記載のリゾビウム属微生物。
【請求項６】
以下の菌学的性質を有する請求項第１〜５のいずれか一項記載のリゾビウム属微生物。
＜ 形態 ＞
細胞の形態：桿菌
運動性：有り
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：ベージュ
コロニーの表面：平滑
生育温度：４℃、３０℃、４０℃で生育する。４５℃で生育しない
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６.５〜７.５）
酸素要求性：好気
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
Ｏ−Ｆテスト：oxidative
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
資化性（Ｄ−フルクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、グリセロール、Ｌアラビノース、スクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース）：有り
【請求項７】
リゾビウム エスピー ２−１（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３４８）である、請求項第１〜６のいずれか一項記載のリゾビウム属微生物。
【請求項８】
以下の理化学的性質を有するリゾビウム属微生物由来のカタラーゼ。
（ａ）熱安定性
６０℃で１５分間放置したとき放置前の７５％以上の活性を保持する。
６５℃で１５分間放置したとき放置前の４５％以上の活性を保持する。
【請求項９】
請求項第１〜７項の何れかに記載のリゾビウム属微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕してカタラーゼを抽出することを特徴とするカタラーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項第９項に記載のカタラーゼを過酸化水素に作用させることを特徴とする過酸化水素の分解方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３０４７８６（Ｐ２００６−３０４７８６Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９８０２９（Ｐ２００６−９８０２９）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（５０５１２２５７５）有限会社Ｓ．Ｇラボラトリー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（５０５１２２５７５）有限会社Ｓ．Ｇラボラトリー (3)
【Ｆターム（参考）】
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