カブトガニ由来のＧ因子の生産方法
【課題】一定の品質を有する（１→３）−β−Ｄ−グルカン（ＢＧ）の測定試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうる、カブトガニ由来のＧ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたＧ因子の生産方法の提供。
【解決手段】カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。またカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであるウイルス；（Ａ）特定な配列で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（Ｂ）「（Ａ）で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【解決手段】カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。またカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであるウイルス；（Ａ）特定な配列で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（Ｂ）「（Ａ）で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたＧ因子の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＡｃＮＰＶ：Autographa californicaの核多角体病ウイルス
ＢＧ：（１→３）−β−Ｄ−グルカン
Ｅｔ：エンドトキシン（「リポポリサッカライド」ともいう。）
ＨＥＰＥＳ：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）
ＨＰＲ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＭＯＩ：多重感染度（multiplicity of infection）
ＮＰＶ：核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ｐＮＡ：パラニトロアニリン
ＰＶＤＦ：ポリビニリデン・ジフルオリド(polyvinylidene difluoride)
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単に「ライセート」という。）を使用して、ＥｔやＢＧを測定する方法が知られている。この方法は、ＥｔやＢＧによってライセートが凝固することに基づいている。この凝固反応は、いくつかの凝固因子が段階的に活性化されることによって引き起こされる（特許文献１、非特許文献１）。
例えば、ＢＧがライセートに接触すると、ライセート中に存在するＧ因子が活性化されて活性型Ｇ因子が生成する。この活性型Ｇ因子は、ライセート中に存在するプロクロッティングエンザイムを活性化してクロッティングエンザイムが生成する。このクロッティングエンザイムは、ライセート中に存在するコアキュローゲン分子中の特定の箇所を限定水解し、これによりコアギュリンゲルが生成してライセートが凝固する。コアギュローゲンは、合成基質（例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニン−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ））にも作用して、そのアミド結合を水解してｐＮＡを遊離する。したがって、生成した発色物質（ｐＮＡ）の吸光度を測定することにより、ＢＧを定量することができる（特許文献１）。
【０００３】
一方、Ｇ因子は、αサブユニットとβサブユニットとから構成されるタンパク質である。それぞれのサブユニットのクローニングは既になされているが（非特許文献２）、これらのＤＮＡを用いて活性を保持するタンパク質（Ｇ因子）を発現することは困難であった。
【０００４】
【特許文献１】特開平０８−１２２３３４号公報
【非特許文献１】J. Protein Chem., 5, p255-268 (1986)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 269(2). p1370-1374 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一定の品質を有するＢＧの測定試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうる、カブトガニ由来のＧ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたＧ因子の生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｇ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスが保持された細胞を用いることにより、Ｇ因子活性を有するタンパク質を製造することができることを見出し、これにより一定の品質を有するＢＧの測定試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス（以下「本発明ウイルス１」という。）を提供する。
ここにいうカブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されることが好ましい。
【０００８】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【０００９】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであるものも好ましい。
（ａ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
ここにいう「ウイルス」は、バキュロウイルスであることが好ましい。バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。
また本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス（以下「本発明ウイルス２」という。）を提供する。
【００１０】
ここにいうカブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものであることが好ましい。
【００１１】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【００１２】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであるものも好ましい。
（ａ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
ここにいう「ウイルス」は、バキュロウイルスであることが好ましい。バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。
【００１３】
以下、本発明ウイルス１及び本発明ウイルス２を併せて又は個々に「本発明ウイルス」ともいう。
また本発明は、本発明ウイルスを保持する細胞（以下「本発明細胞」という。）を提供する。
本発明細胞は、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２の両方を保持するものが好ましい。この細胞は、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２とを、前者のＭＯＩが後者のＭＯＩよりも高くなるように細胞に感染させて得られるものであることが好ましい。この場合には、本発明ウイルス１のＭＯＩと、本発明ウイルス２のＭＯＩとが１．５：１〜６４：１となるように設定されることが好ましい。
また本発明細胞は、昆虫由来の細胞であることが好ましい。
【００１４】
また本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法（以下「本発明方法」という。）を提供する。ここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニット」は、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」であることが好ましい。
【００１５】
本発明方法は、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法」を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明ウイルスは、これを用いることによって、一定の品質を有するＧ因子の安定的、効率的、大量かつ安価な生産に有用な本発明細胞が提供されることから極めて有用である。また本発明細胞は、これを用いることにより、Ｇ因子活性を保持した一定の品質のタンパク質を安定的、効率的、大量かつ安価に生産することができ、またこれによって本発明方法が提供されることから極めて有用である。さらに、本発明方法を用いることにより、Ｇ因子活性を保持した一定の品質のタンパク質を安定的、効率的、大量かつ安価に生産することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞−１ 本発明ウイルス１
本発明ウイルス１は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルスである。
【００１８】
本発明ウイルス１において保持される「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡである限りにおいて特に限定されない。
このようなＤＮＡとしては、以下のようなカブトガニに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡが例示される；
タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ。
これらのなかでも、タキプレウス・トリデンタツスやリムルス・ポリフェムスに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡが好ましく、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡがより好ましい。
【００１９】
本発明ウイルス１において保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
ここにいう「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ」は、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡである。
【００２０】
また天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等なものといえる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等の機能を有するタンパク質である。上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２１】
なお本明細書において「数個のアミノ酸」とは、当該タンパク質の活性が失われない範囲で変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基を含むタンパク質の場合には２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２２】
（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するものである。Ｇ因子のαサブユニットはＢＧに結合する活性を有していることから、ＢＧへの結合活性の有無を調べることによって、αサブユニットの活性の有無を調べることができる。
【００２３】
本発明ウイルス１において「ＤＮＡが保持された」とは、そのＤＮＡが保持されている限りにおいて、他の塩基やＤＮＡが更に保持されていることを妨げるものではない。したがって、例えばそのＤＮＡのみならず、更にマーカーペプチド等をコードするＤＮＡ等が保持されていてもよい。
【００２４】
例えば、「上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ」と「マーカーペプチド等をコードするＤＮＡ」とが連結されたＤＮＡが保持されたベクターも、本発明ウイルス１に包含される。保持されるＤＮＡをこのようにデザインすると、マーカーペプチド等との融合タンパク質として発現させることができ、その発現されたタンパク質の精製、検出、分析等を容易にすることができるというメリットがある。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His-tag、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２５】
本発明ウイルス１の製造方法も特に限定されない。本発明ウイルス１を製造する方法の一例は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。
【００２６】
まず、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡを用意する。当該ＤＮＡとして、前記（Ａ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。また、前記（Ｂ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。このＤＮＡは、それぞれ所定のタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。これらのＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するものが存在するが、いずれの塩基配列を有するＤＮＡをも用いることができる。
【００２７】
前記（Ａ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが例示される。またGenBank accession No. Ｄ１６６２２として登録されているＤＮＡも使用することができる。また、配列番号１における塩基番号１〜２０５８で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡを用いてもよい。
【００２８】
また、前記（Ｂ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、例えば前記（Ａ）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００２９】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３０】
このようなＤＮＡをウイルスに導入することにより、本発明ウイルス１を製造することができる。
【００３１】
このようなＤＮＡが導入されるウイルスは、遺伝子のトランスフェクションに用いることができるウイルスである限りにおいて特に限定されない。なかでもバキュロウイルスが好ましい。その中でも、ＮＰＶが好ましい。ＮＰＶは、ＮＰＶとして分類されるウイルスである限りにおいて特に限定されず、例えばＡｃＮＰＶや、カイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV、BmNPV）等を用いることができる。なかでも、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
【００３２】
ウイルスへのＤＮＡの導入は、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターの種類も特に限定されず、例えばpPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等が例示されるが、なかでもpPSC8が好ましい。これらのトランスファーベクターは、市販のものを用いることもできる。
【００３３】
トランスファーベクターを用いた相同的組換えの方法も特に限定されない。その具体的な一例は、実施例を参照されたい。
【００３４】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたウイルスが製造されたか否かは、例えば、製造されたウイルスの塩基配列を解析して、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持されているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質が、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットのアミノ酸配列を有しているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有しているか否か、等を調べることによって確認することができる。
【００３５】
本発明ウイルス１は、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明方法等に利用することができる。
＜１＞−２ 本発明ウイルス２
本発明ウイルス２は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルスである。
【００３６】
ここにいう「カブトガニ」の例示や、好ましい態様等については、「＜１＞−１」と同様である。
【００３７】
本発明ウイルス２において保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
ここにいう「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ」は、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡである。
また上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」の意義は、前記の「＜１＞−１」と同様である。なお（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するものである。Ｇ因子のβサブユニットはセリンプロテアーゼ活性を有していることから、セリンプロテアーゼ活性の有無を調べることによって、βサブユニットの活性の有無を調べることができる。
なお、「数個のアミノ酸」、「ＤＮＡが保持された」等の意義は、「＜１＞−１」と同様である。また本発明ウイルス２の製造方法も、前記「＜１＞−１」における「配列番号２」を「配列番号４」と読み替えたものと同じである。
【００３８】
前記（Ａ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが例示される。またGenBank accession No. Ｄ１６６２３として登録されている塩基配列も使用することができる。
【００３９】
前記（Ｂ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡについても、「＜１＞−１」と同様である。
【００４０】
このようなＤＮＡをウイルスに導入することにより、本発明ウイルス２を製造することができる。ＤＮＡが導入されるウイルスの例示や好ましい態様、導入の方法等についても、「＜１＞−１」と同様である
また、前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたウイルスが製造されたか否かの確認も、「＜１＞−１」と同様に行うことができる。本発明ウイルス２も、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明方法等に利用することができる。
＜２＞本発明細胞
本発明細胞は、本発明ウイルスを保持する細胞である。
【００４１】
本発明ウイルスについての説明は、前記の通りである。
【００４２】
ここで用いる細胞は、本発明ウイルスが感染しうる細胞であって、かつ、本発明ウイルスが保持しているカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットが発現することができるものであれば良い。その一例として昆虫に由来する細胞を挙げることができる。また昆虫に由来する細胞として、Ｓｆ９細胞を例示することができる。
【００４３】
本発明ウイルスを細胞に保持させる方法も特に限定されないが、例えばウイルスとしてＮＰＶを採用した場合には、単に本発明ウイルスと細胞とを接触させるだけで、本発明ウイルスを当該細胞に感染させることができ、本発明ウイルスを当該細胞に保持させることができる。その具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００４４】
なお本発明細胞は、本発明ウイルス１のみを保持するものでもよく、本発明ウイルス２のみを保持するものでもよく、これらの両方を保持するものであっても良い。また、これら以外のウイルスをも併せて保持するものであってもよい。
本発明細胞が、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２の両方を保持する細胞である場合には、当該細胞は、本発明ウイルス１と本発明ウイルス２とを、前者のＭＯＩが後者のＭＯＩよりも高くなるように細胞に感染させて得られるものであることが好ましい。このような本発明細胞としては、例えば、本発明ウイルス１のＭＯＩと本発明ウイルス２のＭＯＩの比を１．５：１〜６４：１となるようにして細胞に感染させたものを例示することができる。この本発明ウイルス１のＭＯＩと本発明ウイルス２のＭＯＩとの比は、１．５：１〜３２：１であることがより好ましく、２：１〜３２：１であることがより好ましく、２：１〜１６：１であることがより好ましく、２：１〜８：１であることがより好ましく、２：１〜６：１であることがより好ましく、２：１〜４：１又は３：１〜５：１であることがより好ましく、４：１であることがより好ましい。
【００４５】
本発明細胞は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを生産する能力を有することから、これらの性質を指標にして、本発明細胞を選択することができる。
【００４６】
本発明細胞は、例えば後述する本発明方法等に利用することができる。
＜３＞本発明方法
本発明方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法である。
【００４７】
「本発明細胞」については、前記で説明した通りである。
【００４８】
本出願書類において「生育」とは、形質転換体である細胞の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）、培養された細胞自体、細胞を組み込んだ動物・昆虫等からの分泌物・排出物等を包含する概念である。
【００４９】
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。
【００５０】
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するサブユニットの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。
【００５１】
生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する方法は、生育物の種類に応じて、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。
【００５２】
例えば、これらのサブユニットが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。またこれらのサブユニットが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によってこれらのサブユニットを抽出することができ、その抽出物をそのままαサブユニット及び／又はβサブユニットとして用いてもよい。
【００５３】
本発明方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたサブユニットをさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、サブユニットの使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００５５】
なお本発明方法は、αサブユニットのみを生産させるものであっても、βサブユニットのみを生産させるものであっても、これら両方を生産させるものであってもよい。また、これらのサブユニット以外のものを同時に生産させても良い。
【００５６】
αサブユニットを生産させる場合には本発明ウイルス１を保持する細胞を、βサブユニットを生産させる場合には本発明ウイルス２を保持する細胞を、αサブユニットとβサブユニットの両方を生産させる場合には、本発明ウイルス１と本発明ウイルス２の両方を保持する細胞を用いればよい。
αサブユニットとβサブユニットの両方を生産させると、「αサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」を生産させることができる。
生産されたタンパク質が、αサブユニット及び／又はβサブユニットであるか否か、αサブユニット及びβサブユニットから構成されているか否か、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているか否か等は、採取されたタンパク質のアミノ酸配列、分子量、電気泳動結果、サブユニットに特異的に反応する抗体を用いたウエスタンブロッティング、ＢＧへの結合能、セリンプロテアーゼ活性の有無等を分析することによって確認することができる。
【００５７】
本発明方法によれば、αサブユニット、βサブユニット及びこれらから構成されカブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を極めて効率的に生産することができる。
【００５８】
本発明方法には、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法」が包含される。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞Ｇ因子のαサブユニットの発現
Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNA（九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より入手した。このcDNAは、前記の非特許文献２に記載の方法で調製したものである。）を、トランスファーベクター（pPSC8）に導入し、所定の塩基配列を有するクローンを選択した。選択された発現ベクター（FactorG-α／pPSC8）DNAとバキュロウイルス（AcNPV）DNAをSf9細胞にコトランスフェクトした。この培養液上清から得られたウイルス液を純化し、増幅した。バキュロウイルスに感染した細胞からウイルスDNAを抽出しシークエンス解析をした。得られたウイルス液をexpresSF+（登録商標）細胞に感染させ、ウエスタンブロッティングによって発現物の解析を行った。以下、これらのステップの詳細を説明する。
１．発現ベクターの構築
Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNA（FactorG-α/pFastbac1）をBamHI/Hind IIIで処理し、目的遺伝子が含まれる約2,100bpの断片を回収した。このサンプルを平滑末端化処理後、Nru Ｉで処理したpPSC8（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物でE.coli JM109を形質転換し、形質転換体を得た。目的サイズの断片が確認されたプラスミドを精製し、シークエンスを確認した。シークエンスの解析には、以下のプライマー、及びABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3 (Applied Biosystems社)を使用した。また電気泳動には自動シークエンサーABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社)を、解析にはGenetyx（ゼネティクス社）を使用した。プライマー配列を配列表の配列番号５〜１３に示す。
配列番号５：PSC F
配列番号６：PSC R
配列番号７：Factor G α 441/460-F
配列番号８：Factor G α 941/960-F
配列番号９：Factor G α 1601/1620-F
配列番号１０：Factor G α 582/563-R
配列番号１１：Factor G α 1082/1063-R
配列番号１２：Factor G α 1582/1563-R
配列番号１３：Factor G α 1700/1681-R
目的遺伝子の挿入が確認されたクローンを、50μg/mLのアンピシリンを含む100mLのLB培地に植菌し、30℃で一晩培養した。増殖した菌体を回収し、Plasmid Midi Kit（QIAGEN社）のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。
２．コトランスフェクション
25cm２フラスコに播いた1.0 x 106 個のSf9細胞に、Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNAを保持する発現ベクター 4.6 μg、Linear AcNPV DNA 85ng及びLIPOFECTIN Reagent（（インビトロジェン）Invitrogen社製）5μLを含む無血清SF-900 II 培地（インビトロジェン（Invitrogen）社製） 200μLを添加した。28℃で６時間静置後、培養液量が5mLとなるように無血清Sf-900 II培地を加えた。さらに28℃で９日間培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
３．組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００６０】
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で７日間静置培養した。培地ごとに、多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlの無血清Sf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液とした。
４．組換えウイルスの増幅
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００６１】
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、３日間静置培養し、第１代ウイルス液とした。
【００６２】
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3,000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液とした。
５．遺伝子挿入確認
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【００６３】
第２代ウイルス液を回収した際に得られた沈殿を200μlのＴＥに懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りＰＣＲを行った。
配列番号１４：PSC F2
配列番号１５：PSC R2
0.2mLのサンプルチューブに上記のウイルスＤＮＡ 1μL、2.5mM dNTP 8μL、KOD buffer 5μL、25mM 塩化マグネシウム溶液 4μL、PSC F2及びPSC R2プライマー（4pmol/ｍＬ）をそれぞれ2.5μL、KOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）1μL及び滅菌した純水26μLを添加してよく攪拌した。これを用いて、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
【００６４】
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス解析は、前記の「１．」と同様の試薬、機器、PSC FとPSC Rプライマーを使用した。
６．組換えウイルス液の作製
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコに100 ml用意した。これに上記第２代ウイルス液を1 ml加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第３代ウイルス液とした。
７．タイター測定
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に定着させた後、培養液を除去した。第３代ウイルス液を無血清Sf-900II 培地で１０５、１０６、１０７及び１０８倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつシャーレに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、観察されたプラークの個数を数え、タイターを求めた。
８．発現試験
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第３代ウイルス液を各々MOI=0.5、２、８となるように加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。
９．発現物の確認
前記「８．」で回収したサンプルについて、定法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。セミドライブロッティング法によりブロッティング膜にタンパク質を転写し、以下の条件でウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、His-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
【００６５】
サンプルの処理：上清については、Laemmli Sample Buffer（BIO-RAD社）を添加し、99℃で３分間熱処理した。沈殿については、200μL相当の沈殿に200μLのＰＢＳを加えて懸濁後、Laemmli Sample Bufferを添加して、99℃で３分間熱処理した。
【００６６】
サンプルのアプライ量：20μL/レーンとした。
【００６７】
SDS-PAGEゲル：12.5％ゲル（BIO-RAD社）を用いた。
【００６８】
SDS-PAGE通電：150V、CVとした。
ブロッティング膜：ＰＶＤＦを用いた。
【００６９】
ブロッティング通電：15V、CV、30分間とした。
【００７０】
抗体：Penta・His HRP Conjugate（QIAGEN社）を用いた。
【００７１】
検出：ECL Detection Reagent (Amersham Biosciences社)を用いた。
１０．結果
pPSC8に挿入後の全塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と完全に一致した。このことから、ＰＣＲによってミューテーションが導入されていないことが確認された。また組換えウイルスにおける目的配列のＮ末端及びＣ末端に対応する部分の塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と一致した。このことから、組換えウイルス中にＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列の存在が確認された。
【００７２】
また、タイター測定の結果は、3 x 108 pfu/mLであった。
【００７３】
前記「９．」の結果、目的の位置（約75kDa付近）に抗His-tag抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のαサブユニットが発現されたことが確認された。
＜２＞Ｇ因子のβサブユニットの発現
Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNA（九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より入手した。このcDNAは、前記の非特許文献２に記載の方法で調製したものである。）を、前記＜１＞と同様に発現させ、その発現物の解析を行った。以下、これらのステップの詳細を説明する。
１．発現ベクターの構築
Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNA（FactorG-β/pFastbac1）をBamHI/Hind IIIで処理し、目的遺伝子が含まれる約1,000bpの断片を回収した。このサンプルを平滑末端化処理後、Nru Ｉで処理したpPSC8と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物でE.coli JM109を形質転換し、形質転換体を得た。目的遺伝子の挿入が確認されたクローンを、50μg/mLのアンピシリンを含む100mLのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。増殖した菌体を回収し、Plasmid Midi Kit（QIAGEN社）のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。
２．コトランスフェクション
25cm２フラスコに播いた1.0 x 106 個のSf9細胞に、Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNAを保持する発現ベクター 4.6 μg、Linear AcNPV DNA 85ng及びLIPOFECTIN Reagent 5μLを含む無血清SF-900 II 培地 200μLを添加した。28℃で６時間静置後、培養液量が5mLとなるように無血清Sf-900 II培地を加えた。さらに28℃で７日間培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
３．組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７４】
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900 II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で６日間静置培養した。培地ごとに、シャーレにできた多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlの無血清Sf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液とした。
４．組換えウイルスの増幅
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７５】
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、３日間静置培養し、第１代ウイルス液とした。
【００７６】
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3,000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液とした。
５．遺伝子挿入確認
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【００７７】
第２代ウイルス液を回収した際に得られた沈殿を200μlのＴＥに懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りＰＣＲを行った。
配列番号１６：PSC F2
配列番号１７：PSC R2
0.2mLのサンプルチューブに上記のウイルスＤＮＡ 1μL、2.5mM dNTP 8μL、KOD buffer 5μL、25mM 塩化マグネシウム溶液 4μL、PSC F2及びPSC R2プライマー（4pmol/ｍＬ）をそれぞれ2.5μL、KOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）1μL及び滅菌した純水26μLを添加してよく攪拌した。これを用いて、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
【００７８】
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス解析は、前記の「＜１＞の１．」と同様の試薬、機器を使用した。ここで用いたプライマーは以下の通りである。
配列番号１８：PSC F
配列番号１９：PSC R
６．組換えウイルス液の作製
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコに100 ml用意した。これに上記第２代ウイルス液を1 ml加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第３代ウイルス液とした。
７．タイター測定
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に定着させた後、培養液を除去した。第３代ウイルス液を無血清Sf-900II 培地で１０５、１０６、１０７及び１０８倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつシャーレに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、観察されたプラークの個数を数え、タイターを求めた。
８．発現試験
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第３代ウイルス液を各々MOI=0.5、２、８となるように加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。
９．発現物の確認
前記「８．」で回収したサンプルについて、前記「＜１＞の９．」と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、His-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
１０．結果
組換えウイルスにおける目的配列のＮ末端及びＣ末端に対応する部分の塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と一致した。このことから、組換えウイルス中にＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡの配列が確認された。
【００７９】
また、タイター測定の結果は、1.7 x 108 pfu/mLであった。
【００８０】
前記「９．」の結果、目的の位置（約37kDa付近）に抗His-tag抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のβサブユニットが発現されたことが確認された。
＜３＞Ｇ因子のα及びβサブユニットの共発現
前記＜１＞及び＜２＞において調製したＧ因子のα及びβサブユニットについてのそれぞれの第３代ウイルス液を用いて、両サブユニットの共発現を試みた。
【００８１】
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、125 ml 三角フラスコ３本に50 mlずつ用意した。これらに、前記で調製したＧ因子のα及びβサブユニットについての各々の第３代ウイルス液を以下の種々の割合で加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。上清は凍結させて保存した。
サンプル１：αサブユニット：βサブユニット＝１：０（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：0（ウイルス量(μL)）
サンプル２：αサブユニット：βサブユニット＝０：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝0：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル３：αサブユニット：βサブユニット＝１：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル４：αサブユニット：βサブユニット＝１：２（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：375（ウイルス量(μL)）
サンプル５：αサブユニット：βサブユニット＝１：４（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：750（ウイルス量(μL)）
サンプル６：αサブユニット：βサブユニット＝２：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝115.4：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル７：αサブユニット：βサブユニット＝４：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝230.8：187.5（ウイルス量(μL)）
上清について、SDS-PAGEゲルを10％ゲル（BIO-RAD社）とし、検出用の抗体を抗GST-HRP Conjugate（Amersham Biosciences社）とした以外は、前記「＜１＞の９．」と同じ方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子αサブユニットをコードするＤＮＡ」及び「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、いずれもＧＳＴが結合した形で発現されるようデザインされている。
その結果、目的の位置（約75kDa付近及び約37kDa付近）に抗ＧＳＴ抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のα及びβサブユニットの両方が発現されたことが確認された。
また、上清をNi Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences社）を用いて精製し、これを脱塩・濃縮したサンプルについて、SDS-PAGEゲルを5−20％グラジエントゲル（ATTO社）とし、一次抗体を抗Ｇ因子αサブユニット血清と抗Ｇ因子βサブユニット血清（いずれも、九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より恵与された。）との混合物とし、二次抗体としてHRP結合抗ウサギIgG抗体を用い、検出にKonica Immunostain HRP-100（Konica Minolta社）を用いた以外は、前記「＜１＞の９．」と同じ方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子αサブユニットをコードするＤＮＡ」及び「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、いずれもHis-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
その結果、目的の位置（約75kDa付近及び約37kDa付近）に抗体と反応するバンドが確認された。このことからも、Ｇ因子のα及びβサブユニットの両方が発現されたことが確認された。
【００８２】
また、上記の７つのサンプルの培養後の上清について、発現されたタンパク質がＧ因子活性を保持しているか否か調べた。
【００８３】
培養後の上清画分を、150mM NaClを含有する氷冷した50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）で11倍に希釈した。この希釈物（それぞれ25μL）に、カブトガニ血球抽出物由来のプロクロッティングエンザイム（25μL）、デキストラン（終濃度2.4％）、Tris-HCl緩衝液（pH8.0）（終濃度0.08M）、MgSO4（終濃度0.08M）、CaCl2（終濃度0.16mM）、注射用蒸留水（10μL）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA基質（前記の特許文献１参照）（終濃度0.53mM）及びＢＧを0.25ng添加し、総容量を125.1μlとして、37℃で24時間反応させた後、405nm（ブランク）及び492nmにおける吸光度を測定した。また陽性コントロールとして、カブトガニ血球抽出物由来のＧ因子を用いた。実験は２回行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を以下に示す。
（結果）
サンプル１（α：β＝１：０）：０．１６６
サンプル２（α：β＝０：１）：０．１６７
サンプル３（α：β＝１：１）：０．２７８
サンプル４（α：β＝１：２）：０．１９０
サンプル５（α：β＝１：４）：０．１６９
サンプル６（α：β＝２：１）：０．７３０
サンプル７（α：β＝４：１）：１．０７８
Ｇ因子 ：１．３２８
この結果から、サンプル６や７のように、細胞にウイルスを感染させる際にαサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスのＭＯＩを、βサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスのＭＯＩよりも高くしたものにおいて、Ｇ因子の活性が認められた。またこの結果から、以上のようにして発現されたαサブユニット及びβサブユニットの各々は、それぞれの機能を失っていないことも確認された。
【００８４】
これにより得られたＧ因子は、ＢＧに反応することから、ＢＧの測定や真菌症の診断等にそのまま用いることもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたＧ因子の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＡｃＮＰＶ：Autographa californicaの核多角体病ウイルス
ＢＧ：（１→３）−β−Ｄ−グルカン
Ｅｔ：エンドトキシン（「リポポリサッカライド」ともいう。）
ＨＥＰＥＳ：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）
ＨＰＲ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＭＯＩ：多重感染度（multiplicity of infection）
ＮＰＶ：核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ｐＮＡ：パラニトロアニリン
ＰＶＤＦ：ポリビニリデン・ジフルオリド(polyvinylidene difluoride)
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単に「ライセート」という。）を使用して、ＥｔやＢＧを測定する方法が知られている。この方法は、ＥｔやＢＧによってライセートが凝固することに基づいている。この凝固反応は、いくつかの凝固因子が段階的に活性化されることによって引き起こされる（特許文献１、非特許文献１）。
例えば、ＢＧがライセートに接触すると、ライセート中に存在するＧ因子が活性化されて活性型Ｇ因子が生成する。この活性型Ｇ因子は、ライセート中に存在するプロクロッティングエンザイムを活性化してクロッティングエンザイムが生成する。このクロッティングエンザイムは、ライセート中に存在するコアキュローゲン分子中の特定の箇所を限定水解し、これによりコアギュリンゲルが生成してライセートが凝固する。コアギュローゲンは、合成基質（例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニン−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ））にも作用して、そのアミド結合を水解してｐＮＡを遊離する。したがって、生成した発色物質（ｐＮＡ）の吸光度を測定することにより、ＢＧを定量することができる（特許文献１）。
【０００３】
一方、Ｇ因子は、αサブユニットとβサブユニットとから構成されるタンパク質である。それぞれのサブユニットのクローニングは既になされているが（非特許文献２）、これらのＤＮＡを用いて活性を保持するタンパク質（Ｇ因子）を発現することは困難であった。
【０００４】
【特許文献１】特開平０８−１２２３３４号公報
【非特許文献１】J. Protein Chem., 5, p255-268 (1986)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 269(2). p1370-1374 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一定の品質を有するＢＧの測定試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうる、カブトガニ由来のＧ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたＧ因子の生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｇ因子のサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスが保持された細胞を用いることにより、Ｇ因子活性を有するタンパク質を製造することができることを見出し、これにより一定の品質を有するＢＧの測定試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス（以下「本発明ウイルス１」という。）を提供する。
ここにいうカブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されることが好ましい。
【０００８】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【０００９】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであるものも好ましい。
（ａ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
ここにいう「ウイルス」は、バキュロウイルスであることが好ましい。バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。
また本発明は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス（以下「本発明ウイルス２」という。）を提供する。
【００１０】
ここにいうカブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものであることが好ましい。
【００１１】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【００１２】
またここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであるものも好ましい。
（ａ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
ここにいう「ウイルス」は、バキュロウイルスであることが好ましい。バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。
【００１３】
以下、本発明ウイルス１及び本発明ウイルス２を併せて又は個々に「本発明ウイルス」ともいう。
また本発明は、本発明ウイルスを保持する細胞（以下「本発明細胞」という。）を提供する。
本発明細胞は、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２の両方を保持するものが好ましい。この細胞は、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２とを、前者のＭＯＩが後者のＭＯＩよりも高くなるように細胞に感染させて得られるものであることが好ましい。この場合には、本発明ウイルス１のＭＯＩと、本発明ウイルス２のＭＯＩとが１．５：１〜６４：１となるように設定されることが好ましい。
また本発明細胞は、昆虫由来の細胞であることが好ましい。
【００１４】
また本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法（以下「本発明方法」という。）を提供する。ここにいう「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニット」は、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」であることが好ましい。
【００１５】
本発明方法は、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法」を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明ウイルスは、これを用いることによって、一定の品質を有するＧ因子の安定的、効率的、大量かつ安価な生産に有用な本発明細胞が提供されることから極めて有用である。また本発明細胞は、これを用いることにより、Ｇ因子活性を保持した一定の品質のタンパク質を安定的、効率的、大量かつ安価に生産することができ、またこれによって本発明方法が提供されることから極めて有用である。さらに、本発明方法を用いることにより、Ｇ因子活性を保持した一定の品質のタンパク質を安定的、効率的、大量かつ安価に生産することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞−１ 本発明ウイルス１
本発明ウイルス１は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルスである。
【００１８】
本発明ウイルス１において保持される「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡである限りにおいて特に限定されない。
このようなＤＮＡとしては、以下のようなカブトガニに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡが例示される；
タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ。
これらのなかでも、タキプレウス・トリデンタツスやリムルス・ポリフェムスに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡが好ましく、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のαサブユニットがコードされているＤＮＡがより好ましい。
【００１９】
本発明ウイルス１において保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
ここにいう「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ」は、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡである。
【００２０】
また天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等なものといえる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等の機能を有するタンパク質である。上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２１】
なお本明細書において「数個のアミノ酸」とは、当該タンパク質の活性が失われない範囲で変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基を含むタンパク質の場合には２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２２】
（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するものである。Ｇ因子のαサブユニットはＢＧに結合する活性を有していることから、ＢＧへの結合活性の有無を調べることによって、αサブユニットの活性の有無を調べることができる。
【００２３】
本発明ウイルス１において「ＤＮＡが保持された」とは、そのＤＮＡが保持されている限りにおいて、他の塩基やＤＮＡが更に保持されていることを妨げるものではない。したがって、例えばそのＤＮＡのみならず、更にマーカーペプチド等をコードするＤＮＡ等が保持されていてもよい。
【００２４】
例えば、「上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ」と「マーカーペプチド等をコードするＤＮＡ」とが連結されたＤＮＡが保持されたベクターも、本発明ウイルス１に包含される。保持されるＤＮＡをこのようにデザインすると、マーカーペプチド等との融合タンパク質として発現させることができ、その発現されたタンパク質の精製、検出、分析等を容易にすることができるというメリットがある。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His-tag、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２５】
本発明ウイルス１の製造方法も特に限定されない。本発明ウイルス１を製造する方法の一例は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。
【００２６】
まず、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡを用意する。当該ＤＮＡとして、前記（Ａ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。また、前記（Ｂ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。このＤＮＡは、それぞれ所定のタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。これらのＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するものが存在するが、いずれの塩基配列を有するＤＮＡをも用いることができる。
【００２７】
前記（Ａ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが例示される。またGenBank accession No. Ｄ１６６２２として登録されているＤＮＡも使用することができる。また、配列番号１における塩基番号１〜２０５８で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡを用いてもよい。
【００２８】
また、前記（Ｂ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、例えば前記（Ａ）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００２９】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３０】
このようなＤＮＡをウイルスに導入することにより、本発明ウイルス１を製造することができる。
【００３１】
このようなＤＮＡが導入されるウイルスは、遺伝子のトランスフェクションに用いることができるウイルスである限りにおいて特に限定されない。なかでもバキュロウイルスが好ましい。その中でも、ＮＰＶが好ましい。ＮＰＶは、ＮＰＶとして分類されるウイルスである限りにおいて特に限定されず、例えばＡｃＮＰＶや、カイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV、BmNPV）等を用いることができる。なかでも、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
【００３２】
ウイルスへのＤＮＡの導入は、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターの種類も特に限定されず、例えばpPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等が例示されるが、なかでもpPSC8が好ましい。これらのトランスファーベクターは、市販のものを用いることもできる。
【００３３】
トランスファーベクターを用いた相同的組換えの方法も特に限定されない。その具体的な一例は、実施例を参照されたい。
【００３４】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたウイルスが製造されたか否かは、例えば、製造されたウイルスの塩基配列を解析して、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持されているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質が、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットのアミノ酸配列を有しているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有しているか否か、等を調べることによって確認することができる。
【００３５】
本発明ウイルス１は、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明方法等に利用することができる。
＜１＞−２ 本発明ウイルス２
本発明ウイルス２は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルスである。
【００３６】
ここにいう「カブトガニ」の例示や、好ましい態様等については、「＜１＞−１」と同様である。
【００３７】
本発明ウイルス２において保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
ここにいう「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ」は、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡである。
また上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」の意義は、前記の「＜１＞−１」と同様である。なお（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するものである。Ｇ因子のβサブユニットはセリンプロテアーゼ活性を有していることから、セリンプロテアーゼ活性の有無を調べることによって、βサブユニットの活性の有無を調べることができる。
なお、「数個のアミノ酸」、「ＤＮＡが保持された」等の意義は、「＜１＞−１」と同様である。また本発明ウイルス２の製造方法も、前記「＜１＞−１」における「配列番号２」を「配列番号４」と読み替えたものと同じである。
【００３８】
前記（Ａ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが例示される。またGenBank accession No. Ｄ１６６２３として登録されている塩基配列も使用することができる。
【００３９】
前記（Ｂ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡについても、「＜１＞−１」と同様である。
【００４０】
このようなＤＮＡをウイルスに導入することにより、本発明ウイルス２を製造することができる。ＤＮＡが導入されるウイルスの例示や好ましい態様、導入の方法等についても、「＜１＞−１」と同様である
また、前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたウイルスが製造されたか否かの確認も、「＜１＞−１」と同様に行うことができる。本発明ウイルス２も、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明方法等に利用することができる。
＜２＞本発明細胞
本発明細胞は、本発明ウイルスを保持する細胞である。
【００４１】
本発明ウイルスについての説明は、前記の通りである。
【００４２】
ここで用いる細胞は、本発明ウイルスが感染しうる細胞であって、かつ、本発明ウイルスが保持しているカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットが発現することができるものであれば良い。その一例として昆虫に由来する細胞を挙げることができる。また昆虫に由来する細胞として、Ｓｆ９細胞を例示することができる。
【００４３】
本発明ウイルスを細胞に保持させる方法も特に限定されないが、例えばウイルスとしてＮＰＶを採用した場合には、単に本発明ウイルスと細胞とを接触させるだけで、本発明ウイルスを当該細胞に感染させることができ、本発明ウイルスを当該細胞に保持させることができる。その具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００４４】
なお本発明細胞は、本発明ウイルス１のみを保持するものでもよく、本発明ウイルス２のみを保持するものでもよく、これらの両方を保持するものであっても良い。また、これら以外のウイルスをも併せて保持するものであってもよい。
本発明細胞が、本発明ウイルス１と、本発明ウイルス２の両方を保持する細胞である場合には、当該細胞は、本発明ウイルス１と本発明ウイルス２とを、前者のＭＯＩが後者のＭＯＩよりも高くなるように細胞に感染させて得られるものであることが好ましい。このような本発明細胞としては、例えば、本発明ウイルス１のＭＯＩと本発明ウイルス２のＭＯＩの比を１．５：１〜６４：１となるようにして細胞に感染させたものを例示することができる。この本発明ウイルス１のＭＯＩと本発明ウイルス２のＭＯＩとの比は、１．５：１〜３２：１であることがより好ましく、２：１〜３２：１であることがより好ましく、２：１〜１６：１であることがより好ましく、２：１〜８：１であることがより好ましく、２：１〜６：１であることがより好ましく、２：１〜４：１又は３：１〜５：１であることがより好ましく、４：１であることがより好ましい。
【００４５】
本発明細胞は、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを生産する能力を有することから、これらの性質を指標にして、本発明細胞を選択することができる。
【００４６】
本発明細胞は、例えば後述する本発明方法等に利用することができる。
＜３＞本発明方法
本発明方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法である。
【００４７】
「本発明細胞」については、前記で説明した通りである。
【００４８】
本出願書類において「生育」とは、形質転換体である細胞の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）、培養された細胞自体、細胞を組み込んだ動物・昆虫等からの分泌物・排出物等を包含する概念である。
【００４９】
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。
【００５０】
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するサブユニットの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。
【００５１】
生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する方法は、生育物の種類に応じて、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。
【００５２】
例えば、これらのサブユニットが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。またこれらのサブユニットが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によってこれらのサブユニットを抽出することができ、その抽出物をそのままαサブユニット及び／又はβサブユニットとして用いてもよい。
【００５３】
本発明方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたサブユニットをさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、サブユニットの使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００５５】
なお本発明方法は、αサブユニットのみを生産させるものであっても、βサブユニットのみを生産させるものであっても、これら両方を生産させるものであってもよい。また、これらのサブユニット以外のものを同時に生産させても良い。
【００５６】
αサブユニットを生産させる場合には本発明ウイルス１を保持する細胞を、βサブユニットを生産させる場合には本発明ウイルス２を保持する細胞を、αサブユニットとβサブユニットの両方を生産させる場合には、本発明ウイルス１と本発明ウイルス２の両方を保持する細胞を用いればよい。
αサブユニットとβサブユニットの両方を生産させると、「αサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」を生産させることができる。
生産されたタンパク質が、αサブユニット及び／又はβサブユニットであるか否か、αサブユニット及びβサブユニットから構成されているか否か、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているか否か等は、採取されたタンパク質のアミノ酸配列、分子量、電気泳動結果、サブユニットに特異的に反応する抗体を用いたウエスタンブロッティング、ＢＧへの結合能、セリンプロテアーゼ活性の有無等を分析することによって確認することができる。
【００５７】
本発明方法によれば、αサブユニット、βサブユニット及びこれらから構成されカブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を極めて効率的に生産することができる。
【００５８】
本発明方法には、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法」が包含される。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞Ｇ因子のαサブユニットの発現
Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNA（九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より入手した。このcDNAは、前記の非特許文献２に記載の方法で調製したものである。）を、トランスファーベクター（pPSC8）に導入し、所定の塩基配列を有するクローンを選択した。選択された発現ベクター（FactorG-α／pPSC8）DNAとバキュロウイルス（AcNPV）DNAをSf9細胞にコトランスフェクトした。この培養液上清から得られたウイルス液を純化し、増幅した。バキュロウイルスに感染した細胞からウイルスDNAを抽出しシークエンス解析をした。得られたウイルス液をexpresSF+（登録商標）細胞に感染させ、ウエスタンブロッティングによって発現物の解析を行った。以下、これらのステップの詳細を説明する。
１．発現ベクターの構築
Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNA（FactorG-α/pFastbac1）をBamHI/Hind IIIで処理し、目的遺伝子が含まれる約2,100bpの断片を回収した。このサンプルを平滑末端化処理後、Nru Ｉで処理したpPSC8（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物でE.coli JM109を形質転換し、形質転換体を得た。目的サイズの断片が確認されたプラスミドを精製し、シークエンスを確認した。シークエンスの解析には、以下のプライマー、及びABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3 (Applied Biosystems社)を使用した。また電気泳動には自動シークエンサーABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社)を、解析にはGenetyx（ゼネティクス社）を使用した。プライマー配列を配列表の配列番号５〜１３に示す。
配列番号５：PSC F
配列番号６：PSC R
配列番号７：Factor G α 441/460-F
配列番号８：Factor G α 941/960-F
配列番号９：Factor G α 1601/1620-F
配列番号１０：Factor G α 582/563-R
配列番号１１：Factor G α 1082/1063-R
配列番号１２：Factor G α 1582/1563-R
配列番号１３：Factor G α 1700/1681-R
目的遺伝子の挿入が確認されたクローンを、50μg/mLのアンピシリンを含む100mLのLB培地に植菌し、30℃で一晩培養した。増殖した菌体を回収し、Plasmid Midi Kit（QIAGEN社）のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。
２．コトランスフェクション
25cm２フラスコに播いた1.0 x 106 個のSf9細胞に、Ｇ因子のαサブユニットをコードするcDNAを保持する発現ベクター 4.6 μg、Linear AcNPV DNA 85ng及びLIPOFECTIN Reagent（（インビトロジェン）Invitrogen社製）5μLを含む無血清SF-900 II 培地（インビトロジェン（Invitrogen）社製） 200μLを添加した。28℃で６時間静置後、培養液量が5mLとなるように無血清Sf-900 II培地を加えた。さらに28℃で９日間培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
３．組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００６０】
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で７日間静置培養した。培地ごとに、多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlの無血清Sf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液とした。
４．組換えウイルスの増幅
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００６１】
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、３日間静置培養し、第１代ウイルス液とした。
【００６２】
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3,000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液とした。
５．遺伝子挿入確認
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【００６３】
第２代ウイルス液を回収した際に得られた沈殿を200μlのＴＥに懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りＰＣＲを行った。
配列番号１４：PSC F2
配列番号１５：PSC R2
0.2mLのサンプルチューブに上記のウイルスＤＮＡ 1μL、2.5mM dNTP 8μL、KOD buffer 5μL、25mM 塩化マグネシウム溶液 4μL、PSC F2及びPSC R2プライマー（4pmol/ｍＬ）をそれぞれ2.5μL、KOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）1μL及び滅菌した純水26μLを添加してよく攪拌した。これを用いて、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
【００６４】
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス解析は、前記の「１．」と同様の試薬、機器、PSC FとPSC Rプライマーを使用した。
６．組換えウイルス液の作製
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコに100 ml用意した。これに上記第２代ウイルス液を1 ml加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第３代ウイルス液とした。
７．タイター測定
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に定着させた後、培養液を除去した。第３代ウイルス液を無血清Sf-900II 培地で１０５、１０６、１０７及び１０８倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつシャーレに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、観察されたプラークの個数を数え、タイターを求めた。
８．発現試験
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第３代ウイルス液を各々MOI=0.5、２、８となるように加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。
９．発現物の確認
前記「８．」で回収したサンプルについて、定法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。セミドライブロッティング法によりブロッティング膜にタンパク質を転写し、以下の条件でウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡ」は、His-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
【００６５】
サンプルの処理：上清については、Laemmli Sample Buffer（BIO-RAD社）を添加し、99℃で３分間熱処理した。沈殿については、200μL相当の沈殿に200μLのＰＢＳを加えて懸濁後、Laemmli Sample Bufferを添加して、99℃で３分間熱処理した。
【００６６】
サンプルのアプライ量：20μL/レーンとした。
【００６７】
SDS-PAGEゲル：12.5％ゲル（BIO-RAD社）を用いた。
【００６８】
SDS-PAGE通電：150V、CVとした。
ブロッティング膜：ＰＶＤＦを用いた。
【００６９】
ブロッティング通電：15V、CV、30分間とした。
【００７０】
抗体：Penta・His HRP Conjugate（QIAGEN社）を用いた。
【００７１】
検出：ECL Detection Reagent (Amersham Biosciences社)を用いた。
１０．結果
pPSC8に挿入後の全塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と完全に一致した。このことから、ＰＣＲによってミューテーションが導入されていないことが確認された。また組換えウイルスにおける目的配列のＮ末端及びＣ末端に対応する部分の塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と一致した。このことから、組換えウイルス中にＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列の存在が確認された。
【００７２】
また、タイター測定の結果は、3 x 108 pfu/mLであった。
【００７３】
前記「９．」の結果、目的の位置（約75kDa付近）に抗His-tag抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のαサブユニットが発現されたことが確認された。
＜２＞Ｇ因子のβサブユニットの発現
Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNA（九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より入手した。このcDNAは、前記の非特許文献２に記載の方法で調製したものである。）を、前記＜１＞と同様に発現させ、その発現物の解析を行った。以下、これらのステップの詳細を説明する。
１．発現ベクターの構築
Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNA（FactorG-β/pFastbac1）をBamHI/Hind IIIで処理し、目的遺伝子が含まれる約1,000bpの断片を回収した。このサンプルを平滑末端化処理後、Nru Ｉで処理したpPSC8と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物でE.coli JM109を形質転換し、形質転換体を得た。目的遺伝子の挿入が確認されたクローンを、50μg/mLのアンピシリンを含む100mLのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。増殖した菌体を回収し、Plasmid Midi Kit（QIAGEN社）のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。
２．コトランスフェクション
25cm２フラスコに播いた1.0 x 106 個のSf9細胞に、Ｇ因子のβサブユニットをコードするcDNAを保持する発現ベクター 4.6 μg、Linear AcNPV DNA 85ng及びLIPOFECTIN Reagent 5μLを含む無血清SF-900 II 培地 200μLを添加した。28℃で６時間静置後、培養液量が5mLとなるように無血清Sf-900 II培地を加えた。さらに28℃で７日間培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
３．組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７４】
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900 II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で６日間静置培養した。培地ごとに、シャーレにできた多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlの無血清Sf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液とした。
４．組換えウイルスの増幅
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７５】
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、３日間静置培養し、第１代ウイルス液とした。
【００７６】
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3,000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液とした。
５．遺伝子挿入確認
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【００７７】
第２代ウイルス液を回収した際に得られた沈殿を200μlのＴＥに懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りＰＣＲを行った。
配列番号１６：PSC F2
配列番号１７：PSC R2
0.2mLのサンプルチューブに上記のウイルスＤＮＡ 1μL、2.5mM dNTP 8μL、KOD buffer 5μL、25mM 塩化マグネシウム溶液 4μL、PSC F2及びPSC R2プライマー（4pmol/ｍＬ）をそれぞれ2.5μL、KOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）1μL及び滅菌した純水26μLを添加してよく攪拌した。これを用いて、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
【００７８】
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス解析は、前記の「＜１＞の１．」と同様の試薬、機器を使用した。ここで用いたプライマーは以下の通りである。
配列番号１８：PSC F
配列番号１９：PSC R
６．組換えウイルス液の作製
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコに100 ml用意した。これに上記第２代ウイルス液を1 ml加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第３代ウイルス液とした。
７．タイター測定
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に定着させた後、培養液を除去した。第３代ウイルス液を無血清Sf-900II 培地で１０５、１０６、１０７及び１０８倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつシャーレに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清Sf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、観察されたプラークの個数を数え、タイターを求めた。
８．発現試験
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第３代ウイルス液を各々MOI=0.5、２、８となるように加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。
９．発現物の確認
前記「８．」で回収したサンプルについて、前記「＜１＞の９．」と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、His-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
１０．結果
組換えウイルスにおける目的配列のＮ末端及びＣ末端に対応する部分の塩基配列を解析した結果、Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列と一致した。このことから、組換えウイルス中にＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡの配列が確認された。
【００７９】
また、タイター測定の結果は、1.7 x 108 pfu/mLであった。
【００８０】
前記「９．」の結果、目的の位置（約37kDa付近）に抗His-tag抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のβサブユニットが発現されたことが確認された。
＜３＞Ｇ因子のα及びβサブユニットの共発現
前記＜１＞及び＜２＞において調製したＧ因子のα及びβサブユニットについてのそれぞれの第３代ウイルス液を用いて、両サブユニットの共発現を試みた。
【００８１】
昆虫細胞 expresSF+を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、125 ml 三角フラスコ３本に50 mlずつ用意した。これらに、前記で調製したＧ因子のα及びβサブユニットについての各々の第３代ウイルス液を以下の種々の割合で加え、130 rpm、28℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。上清は凍結させて保存した。
サンプル１：αサブユニット：βサブユニット＝１：０（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：0（ウイルス量(μL)）
サンプル２：αサブユニット：βサブユニット＝０：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝0：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル３：αサブユニット：βサブユニット＝１：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル４：αサブユニット：βサブユニット＝１：２（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：375（ウイルス量(μL)）
サンプル５：αサブユニット：βサブユニット＝１：４（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝57.7：750（ウイルス量(μL)）
サンプル６：αサブユニット：βサブユニット＝２：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝115.4：187.5（ウイルス量(μL)）
サンプル７：αサブユニット：βサブユニット＝４：１（ＭＯＩ比）
αサブユニット：βサブユニット＝230.8：187.5（ウイルス量(μL)）
上清について、SDS-PAGEゲルを10％ゲル（BIO-RAD社）とし、検出用の抗体を抗GST-HRP Conjugate（Amersham Biosciences社）とした以外は、前記「＜１＞の９．」と同じ方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子αサブユニットをコードするＤＮＡ」及び「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、いずれもＧＳＴが結合した形で発現されるようデザインされている。
その結果、目的の位置（約75kDa付近及び約37kDa付近）に抗ＧＳＴ抗体と反応するバンドが確認された。このことから、Ｇ因子のα及びβサブユニットの両方が発現されたことが確認された。
また、上清をNi Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences社）を用いて精製し、これを脱塩・濃縮したサンプルについて、SDS-PAGEゲルを5−20％グラジエントゲル（ATTO社）とし、一次抗体を抗Ｇ因子αサブユニット血清と抗Ｇ因子βサブユニット血清（いずれも、九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野の牟田達史博士より恵与された。）との混合物とし、二次抗体としてHRP結合抗ウサギIgG抗体を用い、検出にKonica Immunostain HRP-100（Konica Minolta社）を用いた以外は、前記「＜１＞の９．」と同じ方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｇ因子αサブユニットをコードするＤＮＡ」及び「Ｇ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡ」は、いずれもHis-tagが結合した形で発現されるようデザインされている。
その結果、目的の位置（約75kDa付近及び約37kDa付近）に抗体と反応するバンドが確認された。このことからも、Ｇ因子のα及びβサブユニットの両方が発現されたことが確認された。
【００８２】
また、上記の７つのサンプルの培養後の上清について、発現されたタンパク質がＧ因子活性を保持しているか否か調べた。
【００８３】
培養後の上清画分を、150mM NaClを含有する氷冷した50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）で11倍に希釈した。この希釈物（それぞれ25μL）に、カブトガニ血球抽出物由来のプロクロッティングエンザイム（25μL）、デキストラン（終濃度2.4％）、Tris-HCl緩衝液（pH8.0）（終濃度0.08M）、MgSO4（終濃度0.08M）、CaCl2（終濃度0.16mM）、注射用蒸留水（10μL）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA基質（前記の特許文献１参照）（終濃度0.53mM）及びＢＧを0.25ng添加し、総容量を125.1μlとして、37℃で24時間反応させた後、405nm（ブランク）及び492nmにおける吸光度を測定した。また陽性コントロールとして、カブトガニ血球抽出物由来のＧ因子を用いた。実験は２回行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を以下に示す。
（結果）
サンプル１（α：β＝１：０）：０．１６６
サンプル２（α：β＝０：１）：０．１６７
サンプル３（α：β＝１：１）：０．２７８
サンプル４（α：β＝１：２）：０．１９０
サンプル５（α：β＝１：４）：０．１６９
サンプル６（α：β＝２：１）：０．７３０
サンプル７（α：β＝４：１）：１．０７８
Ｇ因子 ：１．３２８
この結果から、サンプル６や７のように、細胞にウイルスを感染させる際にαサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスのＭＯＩを、βサブユニットをコードするＤＮＡを保持するウイルスのＭＯＩよりも高くしたものにおいて、Ｇ因子の活性が認められた。またこの結果から、以上のようにして発現されたαサブユニット及びβサブユニットの各々は、それぞれの機能を失っていないことも確認された。
【００８４】
これにより得られたＧ因子は、ＢＧに反応することから、ＢＧの測定や真菌症の診断等にそのまま用いることもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。
【請求項２】
カブトガニが、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものである、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡである、請求項１に記載のウイルス。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、請求項１に記載のウイルス。
（ａ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ
【請求項５】
ウイルスが、バキュロウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項６】
バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスである、請求項５に記載のウイルス。
【請求項７】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。
【請求項８】
カブトガニが、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものである、請求項７に記載のウイルス。
【請求項９】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡである、請求項７に記載のウイルス。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、請求項７に記載のウイルス。
（ａ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ
【請求項１１】
ウイルスが、バキュロウイルスである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１２】
バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスである、請求項１１に記載のウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のウイルスを保持する細胞。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスと、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスの両方を保持することを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスと、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスとを、前者の多重感染度が後者の多重感染度よりも高くなるように細胞に感染させて得られることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスの多重感染度と、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスの多重感染度とが１．５：１〜６４：１となるように設定されることを特徴とする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
細胞が、昆虫由来の細胞である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法。
【請求項１９】
「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニット」が、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」であることを特徴とする、請求項１８に記載の生産方法。
【請求項２０】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法。
【請求項１】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。
【請求項２】
カブトガニが、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものである、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡである、請求項１に記載のウイルス。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、請求項１に記載のウイルス。
（ａ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号１〜２０２２で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ
【請求項５】
ウイルスが、バキュロウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項６】
バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスである、請求項５に記載のウイルス。
【請求項７】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが保持された、ウイルス。
【請求項８】
カブトガニが、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びカルシノスコルピウス・ロツンディカウダから選択されるものである、請求項７に記載のウイルス。
【請求項９】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡである、請求項７に記載のウイルス。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、請求項７に記載のウイルス。
（ａ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３における塩基番号１〜９３０で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットの活性を有することを特徴とするＤＮＡ
【請求項１１】
ウイルスが、バキュロウイルスである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１２】
バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスである、請求項１１に記載のウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のウイルスを保持する細胞。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスと、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスの両方を保持することを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスと、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスとを、前者の多重感染度が後者の多重感染度よりも高くなるように細胞に感染させて得られることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスの多重感染度と、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のウイルスの多重感染度とが１．５：１〜６４：１となるように設定されることを特徴とする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
細胞が、昆虫由来の細胞である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニットの生産方法。
【請求項１９】
「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及び／又はβサブユニット」が、「カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニット及びβサブユニットから構成され、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質」であることを特徴とする、請求項１８に記載の生産方法。
【請求項２０】
カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡと、カブトガニ由来のＧ因子のβサブユニットをコードするＤＮＡとの両方を保持する細胞を生育させ、その生育物から、カブトガニ由来のＧ因子の活性を保持しているタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＧ因子の生産方法。
【公開番号】特開２００６−２７１３８４（Ｐ２００６−２７１３８４Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８４２８４（Ｐ２００６−８４２８４）
【出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]