カワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法
【課題】カワヒバリガイ幼生を簡易に検出する。カワヒバリガイ幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する。
【解決手段】配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるカワヒバリガイ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにした。また、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにした。
【解決手段】配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるカワヒバリガイ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにした。また、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する淡水域から採集した被験試料のカワヒバリガイ幼生の有無を検出し、その個体数の定量を行うのに好適なカワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
付着生物による被害としては、例えば、海水域における火力・原子力発電所等の冷却水路系へのアカフジツボ等のフジツボ類の付着による被害が知られている。冷却水路系にフジツボ類が付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボ類が付着したり、剥がれたフジツボ類が詰まったりすることによって、管壁の腐食が生じる。そこで、各発電所では、付着したフジツボ類を機械的に除去したり、フジツボ類の付着を抑制したりするための様々な防除対策が実施されている。
【０００３】
ところで、このような付着生物による被害は、従来わが国における河川や湖等の淡水域では殆ど発生していなかった。ところが、１９９０年前後に、中国及び朝鮮半島を原産とする淡水性二枚貝であるカワヒバリガイ（Limnoperna fortunei)が揖斐川を含む木曽川水系や琵琶湖・淀川水系に侵入し、その生息領域が拡大するにつれて、海水域において生じている被害と同様の被害が生じつつある。カワヒバリガイは、繊維状の分泌物である足糸により岩などの基質に固着する性質を持ち、配管内部に大量発生して水の流れを妨げるなど水利施設の運用に悪影響を与えることが知られている（非特許文献１）。現在では、淡水域に設置されているわが国の水力発電所等においても、冷却水配管や冷却器、水位計にカワヒバリガイが付着することにより、海水域において生じている被害と同様の被害が生じている。
【０００４】
また、カワヒバリガイは特定外来種として指定されており、カワヒバリガイの生息領域が拡大すると、プランクトン食性の在来生物との競合により、生態系が破壊されてしまう。さらには、カワヒバリガイは寄生性の吸虫（腹口類）の第一中間宿主となることから、第二中間宿主のコイ科魚類において、メタセルカリアの重篤感染による被害も出ている。
【０００５】
このように、カワヒバリガイは様々な被害を及ぼす生物であることから、早急に駆除することが望まれている。
【０００６】
ここで、カワヒバリガイは、水路等の基体に付着してしまうと、完全に除去することが困難である。また、除去する際に発生する死骸等によって水質の悪化が生じ、周囲の環境に対する悪影響が懸念される。したがって、カワヒバリガイの駆除は、水路等の基体に付着する前の浮遊幼生の段階で、大量に発生する時期を見計らって行うことが望ましいと考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】Magera, Y., Y.Matsui, Y.Goto and A.Yuasa, 2001, Journal of Water Supply Reseach and Technology-aqua, 50: 113-124.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
淡水域には、カワヒバリガイ幼生以外にも多種多様なプランクトンが存在している。したがって、淡水域で採集した被験試料からカワヒバリガイ幼生の発生量を調査する際には、多種多様なプランクトンの中からカワヒバリガイ幼生のみを選択的に検出・定量する必要がある。しかしながら、カワヒバリガイ幼生とこれらプランクトンとの間の形態分類学上の差異のみを頼りにカワヒバリガイ幼生の検出・定量を行うことは、熟練した研究者でも極めて困難なものである。そこで、誰もがカワヒバリガイ幼生を簡易に検出・定量することのできる方法の確立が望まれている。
【０００９】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、カワヒバリガイ幼生を簡易に検出する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、カワヒバリガイ幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチによりカワヒバリガイを分子レベルで種々検討した。その結果、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、カワヒバリガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマーセットを開発することに成功し、本発明に至った。
【００１２】
即ち、本発明のカワヒバリガイ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。
【００１３】
このプライマーセットは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。したがって、このプライマーセットによれば、この特定領域の遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１４】
ここで、「特異的」とは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、コウロエンカワヒバリガイ、ムラサキイガイ、ホトトギスガイ、キヌマトイガイ、ミドリイガイを認識しないこと、さらには淡水域に一般的に存在しているプランクトンを認識しないことを意味している。
【００１５】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００１６】
被験試料にカワヒバリガイ幼生が含まれている場合には、上記のプライマーセットがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識してＰＣＲを起こし、カワヒバリガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にカワヒバリガイ幼生が含まれていない場合には、上記のプライマーセットによりＰＣＲを起こす対象遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１７】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００１８】
このように、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料の遺伝子増幅量から被験試料に存在するカワヒバリガイ幼生個体数を定量することができる。
【００１９】
ここで、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとし、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００２０】
また、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法において、被験試料を分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明のカワヒバリガイ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むものである。したがって、このプローブがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明の効果】
【００２２】
請求項１に記載のカワヒバリガイ検出用プライマーセットによれば、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができる。したがって、このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２３】
請求項２に記載のカワヒバリガイ幼生の検出方法によれば、被験試料にカワヒバリガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、カワヒバリガイ幼生のみを特異的に検出することができる。
【００２４】
請求項３に記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料にカワヒバリガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、カワヒバリガイ幼生のみを特異的に検出し、その個体数を定量することができる。
【００２５】
請求項４記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用しており、しかも、請求項１に記載のプライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片長は、リアルタイムＰＣＲを行うのに好適な長さとなることから、カワヒバリガイ幼生の個体数の定量分析をより精度良く行うことができる。
【００２６】
請求項５記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、幼生の成長段階（幼生の体積）に応じて被験試料を分画して定量することが可能となる。したがって幼生個体数の定量精度をさらに高めることができる。
【００２７】
請求項６記載のカワヒバリガイ検出用キットによれば、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含んでいるので、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
本発明のカワヒバリガイ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。即ち、配列番号１記載の２３塩基からなる塩基配列で表されるプライマーと、配列番号２記載の２５塩基からなる塩基配列で表されるプライマーとからなるものである。
【００３０】
このプライマーセットにより、配列番号３に示すカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３４５〜４８２番目に含まれる１３８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３１】
ここで、プライマーの塩基配列は、配列番号１及び２で示される塩基配列のものに限定されない。例えば、プライマーの一端または両端が延長あるいは短縮されたプライマーであって、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は、１８〜４０塩基とすることが好適である。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こりやすくなって、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、短すぎても、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３２】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３３】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法について説明する。本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００３４】
被験試料としては、カワヒバリガイ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含む淡水域から採集された環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、被験試料はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
被験試料からは水分をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好適である。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなる。したがって、被験試料の長期保存が可能になる。尚、エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存しても良いが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。勿論、冷凍保存してもよい。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えて、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。また、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００３６】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、被験試料を風乾したり、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うことによって、水分の除去のみを行ってＰＣＲに供してもよい。
【００３７】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にカワヒバリガイ幼生の検出を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００３８】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。
【００３９】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることもできる。増幅産物が検出された場合には、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在していると判定することができる。
【００４０】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法について説明する。本発明のカワヒバリ以外幼生個体数の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４１】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、カワヒバリガイ幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するカワヒバリガイ幼生の個体数の定量を行うようにしている。
【００４２】
即ち、本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を利用し、被験試料のＣｔ値に基づいて、被験試料に含まれるカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００４３】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などを適宜採用することもできる。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００４６】
本発明の定量方法に用いる検量線は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。
【００４７】
試料の処理方法に関しては、上述の通り、例えば試料中のカワヒバリガイ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好適であるが、この方法に限定されるものではない。
【００４８】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法あるいは新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜やＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適であるが、特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、カワヒバリガイ幼生の定量をより正確に実施することができる。
【００４９】
ここで、カワヒバリガイ幼生の甲皮が原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、甲皮の破砕処理を行うことが好適である。例えば、乾燥させた試料を入れたエッペンドルフチューブにジルコニアボール（例えば、直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個程度）を入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。この処理を行うことにより、カワヒバリガイ幼生の甲皮（殻）によるＤＮＡ抽出効率の低下等を防いで、幼生個体数の分析精度を確実に高精度なものとすることができる。
【００５０】
尚、カワヒバリガイ幼生の成長過程は、成体から放出された卵（５０〜６０μｍ）が孵化後にトロコフォア幼生となり、約１日後、ベリジャー幼生となる。そして、数週間でＤ型幼生（１００〜１５０μｍ）となり、さらに１週間ほどで付着期のペディベリジャー幼生（３００μｍ程度）となる。そして、付着変態後に稚貝となる。但し、ベリジャー幼生とＤ型幼生とを一括してベリジャー幼生と呼ぶ場合もある。
【００５１】
このように、カワヒバリガイ幼生は、その成長段階により、個体サイズが増加し、その細胞数も増加する。したがって、成長段階に応じて標的となるＣＯＩ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することとなり、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の成長段階で異なってくる。そこで、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体のＣＯＩ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、ＣＯＩ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、ペディベリジャー幼生のみが含まれている試料を用いれば、ペディベリジャー幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、Ｄ型幼生のみが含まれている試料を用いれば、Ｄ型幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００５２】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。上記の通り、カワヒバリガイ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、定量分析の対象としている成長段階の幼生のみを通過させて取り出し、これを被験試料とすることで、その成長段階の幼生の個体数を定量分析することができる。このように、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することで、特定の成長段階にあるカワヒバリガイ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。
【００５３】
以上、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法により、淡水域で採集した被験試料に存在しているカワヒバリガイ幼生の有無を顕微鏡などで観察することなく分析することが可能となる。したがって、本発明によりカワヒバリガイ幼生の検出・定量分析を行うことで、対象淡水域へのカワヒバリガイ幼生の存在や繁殖の有無を知ることが可能となり、対象淡水域へのカワヒバリガイ幼生の存在を明らかにすることで、被害可能性を予知できると共に、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。また、本発明のカワヒバリガイ幼生の個体数の定量方法により、淡水域で採集した被験試料に存在しているカワヒバリガイ幼生の個体数を定量分析することが可能となる。したがって、本発明の定量方法によりカワヒバリガイ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、対象淡水域でのカワヒバリガイの付着時期を確実に予測することが可能となり、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。したがって、駆除剤の使用量を抑えてカワヒバリガイ駆除にかかるコストを抑えることができ、駆除剤による河川水等の汚染も最小限に抑えることが可能となる。
【００５４】
次に、本発明のカワヒバリガイ検出用キットについて説明する。
【００５５】
本発明のカワヒバリガイ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むものである。
【００５６】
したがって、このプローブがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【００５７】
本発明のカワヒバリガイ検出用キットの一例として、図１７に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００５８】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方である。
【００６０】
ＤＮＡチップ１を用いて、カワヒバリガイ幼生の検出を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のカワヒバリガイ幼生の検出を行うことができる。
【００６１】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００６２】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いてカワヒバリガイ幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、カワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、カワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００６３】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とするカワヒバリガイ幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、カワヒバリガイ幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【実施例】
【００６４】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
（実施例１）
カワヒバリガイ、及びカワヒバリガイと比較的近縁であると考えられる二枚貝であるコウロエンカワヒバリガイ（Xenostrobus securis)、ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）、ホトトギスガイ（Musculista senhousia）、ミドリイガイ（Perna viridis）のＣＯＩ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいてカワヒバリガイに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供した二枚貝は採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。
【００６６】
データベース化に供した二枚貝は、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００６７】
ＡＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認された。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＡＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００６８】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、ＣＯＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、後生無脊椎生物のＣＯＩ遺伝子に対するプライマーとして文献１で報告されているユニバーサルプライマーを用いた（文献１：Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., Vrijenhoek, R., 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 294-299.）。
【００６９】
配列番号３及び４に使用したユニバーサルプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（インビトロジェン）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、アドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのアドバンテージ２に添付された方法に従った。具体的には、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００７０】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３０サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００７１】
その結果、ＣＯＩ遺伝子のＰＣＲにおいては、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適であったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片は本来は７０９ｂｐ程度の長さであるが、配列を正確に確認できたのは、いずれの二枚貝においても約５０５〜５８５ｂｐの長さであった。
【００７２】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号３と４に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００７３】
各種二枚貝を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載された塩基配列からなるユニバーサルプライマーを用いて得られたＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号５〜９に示す。配列番号５がカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号６がコウロエンカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号７がムラサキイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号８がホトトギスガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号９がミドリイガイのＣＯＩ領域の塩基配列である。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である５０５〜５８５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号５〜９に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。但し、コウロエンカワヒバリガイについては、配列番号６に記載された塩基配列と１９塩基だけ異なる塩基配列とが同等に検出された（配列番号１０）。具体的には、２４番目、５４番目、８１番目、１０３番目、１７７番目、２１０番目、２４９番目、２５０番目、２５２番目、３３３番目、３５１番目、３８１番目、４０５番目、４５６番目、５１６番目、５４１番目、５５９番目、５８１番目及び５８４番目の１９箇所の塩基が配列番号６に記載の塩基配列とは異なっていた。
【００７４】
次に、配列表の配列番号５〜９の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、カワヒバリガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１３８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。これらのプライマーを合成（インビトロジェン）し、以下の実験に供した。
【００７５】
配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーセットについて、上記方法により得られたカワヒバリガイ成体、コウロエンカワヒバリガイ成体、ムラサキイガイ成体、ホトトギスガイ成体及びキヌマトイガイ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、このプライマーセットの有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。
【００７６】
ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。電気泳動写真を図１に示す。尚、図１において、Ｌ列がカワヒバリガイの電気泳動結果であり、Ｘ列がコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、Ｍｙ列がムラサキイガイの電気泳動結果であり、Ｍｕ列がホトトギスガイの電気泳動結果であり、Ｈ列がキヌマトイガイの電気泳動結果である。
【００７７】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、カワヒバリガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーにより増幅した１３８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
【００７８】
次に、コウロエンカワヒバリガイ成体、ムラサキイガイ成体、ホトトギスガイ成体及びキヌマトイガイ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供してもバンドは確認できなかった。
【００７９】
以上の結果から、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。尚、ミドリイガイについては、電気泳動実験を行わなかったものの、ＣＯＩ領域の塩基配列の相違から、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーを使用してＰＣＲを行ったとしても、遺伝子増幅は生じることはない。
【００８０】
（実施例２）
本発明のプライマーを用いた定量分析について検討した。
【００８１】
まず、カワヒバリガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。結果を図２に示す。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるカワヒバリガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、カワヒバリガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００８２】
（実施例３）
カワヒバリガイ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件と定量分析について検討を行った。
【００８３】
２００８年８月２０日に大塩湖（群馬県富岡市）で採集したカワヒバリガイのＤ型幼生（殻長約１５０μｍ）に９９．５％エタノールを十分に加えて、カワヒバリガイのＤ型幼生をエタノールに固定し、４℃で保存した。
【００８４】
ＤＮＡ抽出処理は、カワヒバリガイのＤ型幼生を０、１、２、５、１０、２０、５０個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。
【００８５】
フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳによる多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００８６】
ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【００８７】
その結果、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合の試料間のＣｔ値ばらつきがＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を行った場合のＣｔ値ばらつきよりも少ないことが明らかとなった。
【００８８】
したがって、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理でも同様の定量化が可能であるが、フジフィルム社のQuickGene DNA tissue Ｋｉｔ Sを採用することがＣｔ値ばらつきを抑える上で好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。
【００８９】
また、カワヒバリガイ幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、カワヒバリガイ幼生の甲皮の堅さに起因するＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。また、この破砕処理は多量の他種動物プランクトンを含む採集サンプルの場合にはさらに効率よくカワヒバリガイのDNAを抽出できることもわかった。
【００９０】
また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（１３８ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。
【００９１】
尚、他のインビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットやインビトロジェン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔのＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。
【００９２】
次に、リアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。前述の操作で最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。即ち、１、２、５、１０、２０及び５０個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４及び１個体相当の幼生が含まれることになる。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲの結果を図３に示す。図３におけるＣｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。上記の通り、リアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４及び１個体相当と非常に少ない幼生個体数であったにも関わらず、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。即ち、カワヒバリガイのＤ型幼生がＤＮＡ抽出液１００μＬ中に１個体以上存在すれば、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもって幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、カワヒバリガイのＤ型幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の推定ができると考えられた。
【００９４】
（実施例４）
複数のプランクトンが混在しているプランクトンサンプルにカワヒバリガイ幼生が含まれている場合であっても、カワヒバリガイ幼生を特異的に検出できるか検討した。
【００９５】
プランクトンサンプルは、２００８年８月２０日に大塩湖（群馬県富岡市）で採集し、４２０μｍのメッシュで大きなゴミやプランクトンを除いた後、７４μｍのメッシュに残ったプランクトンより、水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。尚、淡水域から採集したプランクトンサンプルからは、あらかじめカワヒバリガイの幼生を顕微鏡下で取り除いてあるため、複数のプランクトンが混在しているものの、カワヒバリガイ幼生が存在していない。
【００９６】
エタノール固定したプランクトンサンプルから体積比として約５０倍量を４本のチューブに収容した。そして、４つのうち２つのチューブにカワヒバリガイのＤ型幼生を５０個体添加した。即ち、プランクトンサンプルのみからなる被験試料Ａ及びＢと、プランクトンサンプルにカワヒバリガイＤ型幼生が５０個体存在している被験試料Ｃ及びＤとを作製した。
【００９７】
次に、被験試料Ａ〜Ｄのそれぞれを、ＤＮＡ抽出処理（実施例３と同様の処理）し、ＰＣＲを行った。但し、被験試料Ａ及びＣは２５サイクルとし、被験試料Ｂ及びＤは３５サイクルとした。ＰＣＲ終了後、被験試料を電気泳動に供し、検出されるＤＮＡバンドを確認した。
【００９８】
電気泳動の結果を図４に示す。図４の左側の２５サイクルの結果において、Ａ列は被験試料Ａ（プランクトンサンプルのみ）の場合の結果であり、Ｃ列は被験試料Ｃ（プランクトンサンプル＋カワヒバリガイＤ型幼生５０個体）の結果である。また、図４の右側の３５サイクルの結果において、Ｂ列は被験試料Ｂ（プランクトンサンプルのみ）の場合の結果であり、Ｄ列は被験試料Ｄ（プランクトンサンプル＋カワヒバリガイＤ型幼生５０個体）の結果である。
【００９９】
図４に示される結果から、ＰＣＲのサイクル数を３５サイクルとすると、混合プランクトンのみの場合にも若干のＤＮＡ増幅が見られることが明らかとなった。これに対し、ＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとすると、混合プランクトンのみの場合にはＤＮＡ増幅は見られず、カワヒバリガイ幼生によるＤＮＡ増幅のみが起こることが判明した。このことから、リアルタイムＰＣＲのサイクル数は２５サイクル程度とすることが好適であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】カワヒバリガイ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２】反応液中の鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときのＰＣＲ（２５サイクル）後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図３】カワヒバリガイ幼生を用いてリアルタイムＰＣＲにより作成された検量線である。
【図４】混合プランクトン中におけるカワヒバリガイ幼生の遺伝子増幅について確認したアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【符号の説明】
【０１０１】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する淡水域から採集した被験試料のカワヒバリガイ幼生の有無を検出し、その個体数の定量を行うのに好適なカワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
付着生物による被害としては、例えば、海水域における火力・原子力発電所等の冷却水路系へのアカフジツボ等のフジツボ類の付着による被害が知られている。冷却水路系にフジツボ類が付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボ類が付着したり、剥がれたフジツボ類が詰まったりすることによって、管壁の腐食が生じる。そこで、各発電所では、付着したフジツボ類を機械的に除去したり、フジツボ類の付着を抑制したりするための様々な防除対策が実施されている。
【０００３】
ところで、このような付着生物による被害は、従来わが国における河川や湖等の淡水域では殆ど発生していなかった。ところが、１９９０年前後に、中国及び朝鮮半島を原産とする淡水性二枚貝であるカワヒバリガイ（Limnoperna fortunei)が揖斐川を含む木曽川水系や琵琶湖・淀川水系に侵入し、その生息領域が拡大するにつれて、海水域において生じている被害と同様の被害が生じつつある。カワヒバリガイは、繊維状の分泌物である足糸により岩などの基質に固着する性質を持ち、配管内部に大量発生して水の流れを妨げるなど水利施設の運用に悪影響を与えることが知られている（非特許文献１）。現在では、淡水域に設置されているわが国の水力発電所等においても、冷却水配管や冷却器、水位計にカワヒバリガイが付着することにより、海水域において生じている被害と同様の被害が生じている。
【０００４】
また、カワヒバリガイは特定外来種として指定されており、カワヒバリガイの生息領域が拡大すると、プランクトン食性の在来生物との競合により、生態系が破壊されてしまう。さらには、カワヒバリガイは寄生性の吸虫（腹口類）の第一中間宿主となることから、第二中間宿主のコイ科魚類において、メタセルカリアの重篤感染による被害も出ている。
【０００５】
このように、カワヒバリガイは様々な被害を及ぼす生物であることから、早急に駆除することが望まれている。
【０００６】
ここで、カワヒバリガイは、水路等の基体に付着してしまうと、完全に除去することが困難である。また、除去する際に発生する死骸等によって水質の悪化が生じ、周囲の環境に対する悪影響が懸念される。したがって、カワヒバリガイの駆除は、水路等の基体に付着する前の浮遊幼生の段階で、大量に発生する時期を見計らって行うことが望ましいと考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】Magera, Y., Y.Matsui, Y.Goto and A.Yuasa, 2001, Journal of Water Supply Reseach and Technology-aqua, 50: 113-124.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
淡水域には、カワヒバリガイ幼生以外にも多種多様なプランクトンが存在している。したがって、淡水域で採集した被験試料からカワヒバリガイ幼生の発生量を調査する際には、多種多様なプランクトンの中からカワヒバリガイ幼生のみを選択的に検出・定量する必要がある。しかしながら、カワヒバリガイ幼生とこれらプランクトンとの間の形態分類学上の差異のみを頼りにカワヒバリガイ幼生の検出・定量を行うことは、熟練した研究者でも極めて困難なものである。そこで、誰もがカワヒバリガイ幼生を簡易に検出・定量することのできる方法の確立が望まれている。
【０００９】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、カワヒバリガイ幼生を簡易に検出する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、カワヒバリガイ幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチによりカワヒバリガイを分子レベルで種々検討した。その結果、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、カワヒバリガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマーセットを開発することに成功し、本発明に至った。
【００１２】
即ち、本発明のカワヒバリガイ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。
【００１３】
このプライマーセットは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。したがって、このプライマーセットによれば、この特定領域の遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１４】
ここで、「特異的」とは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、コウロエンカワヒバリガイ、ムラサキイガイ、ホトトギスガイ、キヌマトイガイ、ミドリイガイを認識しないこと、さらには淡水域に一般的に存在しているプランクトンを認識しないことを意味している。
【００１５】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００１６】
被験試料にカワヒバリガイ幼生が含まれている場合には、上記のプライマーセットがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識してＰＣＲを起こし、カワヒバリガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にカワヒバリガイ幼生が含まれていない場合には、上記のプライマーセットによりＰＣＲを起こす対象遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１７】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００１８】
このように、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料の遺伝子増幅量から被験試料に存在するカワヒバリガイ幼生個体数を定量することができる。
【００１９】
ここで、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとし、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００２０】
また、本発明のカワヒバリガイ幼生の定量方法において、被験試料を分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明のカワヒバリガイ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むものである。したがって、このプローブがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明の効果】
【００２２】
請求項１に記載のカワヒバリガイ検出用プライマーセットによれば、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができる。したがって、このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２３】
請求項２に記載のカワヒバリガイ幼生の検出方法によれば、被験試料にカワヒバリガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、カワヒバリガイ幼生のみを特異的に検出することができる。
【００２４】
請求項３に記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料にカワヒバリガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、カワヒバリガイ幼生のみを特異的に検出し、その個体数を定量することができる。
【００２５】
請求項４記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用しており、しかも、請求項１に記載のプライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片長は、リアルタイムＰＣＲを行うのに好適な長さとなることから、カワヒバリガイ幼生の個体数の定量分析をより精度良く行うことができる。
【００２６】
請求項５記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、幼生の成長段階（幼生の体積）に応じて被験試料を分画して定量することが可能となる。したがって幼生個体数の定量精度をさらに高めることができる。
【００２７】
請求項６記載のカワヒバリガイ検出用キットによれば、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含んでいるので、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
本発明のカワヒバリガイ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。即ち、配列番号１記載の２３塩基からなる塩基配列で表されるプライマーと、配列番号２記載の２５塩基からなる塩基配列で表されるプライマーとからなるものである。
【００３０】
このプライマーセットにより、配列番号３に示すカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３４５〜４８２番目に含まれる１３８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３１】
ここで、プライマーの塩基配列は、配列番号１及び２で示される塩基配列のものに限定されない。例えば、プライマーの一端または両端が延長あるいは短縮されたプライマーであって、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は、１８〜４０塩基とすることが好適である。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こりやすくなって、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、短すぎても、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３２】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３３】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法について説明する。本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００３４】
被験試料としては、カワヒバリガイ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含む淡水域から採集された環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、被験試料はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
被験試料からは水分をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好適である。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなる。したがって、被験試料の長期保存が可能になる。尚、エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存しても良いが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。勿論、冷凍保存してもよい。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えて、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。また、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００３６】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、被験試料を風乾したり、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うことによって、水分の除去のみを行ってＰＣＲに供してもよい。
【００３７】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にカワヒバリガイ幼生の検出を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００３８】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。
【００３９】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることもできる。増幅産物が検出された場合には、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在していると判定することができる。
【００４０】
次に、本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法について説明する。本発明のカワヒバリ以外幼生個体数の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４１】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、カワヒバリガイ幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するカワヒバリガイ幼生の個体数の定量を行うようにしている。
【００４２】
即ち、本発明のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法は、カワヒバリガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を利用し、被験試料のＣｔ値に基づいて、被験試料に含まれるカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００４３】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などを適宜採用することもできる。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００４６】
本発明の定量方法に用いる検量線は、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上記のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。
【００４７】
試料の処理方法に関しては、上述の通り、例えば試料中のカワヒバリガイ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好適であるが、この方法に限定されるものではない。
【００４８】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法あるいは新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜やＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適であるが、特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、カワヒバリガイ幼生の定量をより正確に実施することができる。
【００４９】
ここで、カワヒバリガイ幼生の甲皮が原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、甲皮の破砕処理を行うことが好適である。例えば、乾燥させた試料を入れたエッペンドルフチューブにジルコニアボール（例えば、直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個程度）を入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。この処理を行うことにより、カワヒバリガイ幼生の甲皮（殻）によるＤＮＡ抽出効率の低下等を防いで、幼生個体数の分析精度を確実に高精度なものとすることができる。
【００５０】
尚、カワヒバリガイ幼生の成長過程は、成体から放出された卵（５０〜６０μｍ）が孵化後にトロコフォア幼生となり、約１日後、ベリジャー幼生となる。そして、数週間でＤ型幼生（１００〜１５０μｍ）となり、さらに１週間ほどで付着期のペディベリジャー幼生（３００μｍ程度）となる。そして、付着変態後に稚貝となる。但し、ベリジャー幼生とＤ型幼生とを一括してベリジャー幼生と呼ぶ場合もある。
【００５１】
このように、カワヒバリガイ幼生は、その成長段階により、個体サイズが増加し、その細胞数も増加する。したがって、成長段階に応じて標的となるＣＯＩ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することとなり、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の成長段階で異なってくる。そこで、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体のＣＯＩ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、ＣＯＩ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、ペディベリジャー幼生のみが含まれている試料を用いれば、ペディベリジャー幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、Ｄ型幼生のみが含まれている試料を用いれば、Ｄ型幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００５２】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。上記の通り、カワヒバリガイ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、定量分析の対象としている成長段階の幼生のみを通過させて取り出し、これを被験試料とすることで、その成長段階の幼生の個体数を定量分析することができる。このように、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することで、特定の成長段階にあるカワヒバリガイ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。
【００５３】
以上、本発明のカワヒバリガイ幼生の検出方法により、淡水域で採集した被験試料に存在しているカワヒバリガイ幼生の有無を顕微鏡などで観察することなく分析することが可能となる。したがって、本発明によりカワヒバリガイ幼生の検出・定量分析を行うことで、対象淡水域へのカワヒバリガイ幼生の存在や繁殖の有無を知ることが可能となり、対象淡水域へのカワヒバリガイ幼生の存在を明らかにすることで、被害可能性を予知できると共に、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。また、本発明のカワヒバリガイ幼生の個体数の定量方法により、淡水域で採集した被験試料に存在しているカワヒバリガイ幼生の個体数を定量分析することが可能となる。したがって、本発明の定量方法によりカワヒバリガイ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、対象淡水域でのカワヒバリガイの付着時期を確実に予測することが可能となり、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。したがって、駆除剤の使用量を抑えてカワヒバリガイ駆除にかかるコストを抑えることができ、駆除剤による河川水等の汚染も最小限に抑えることが可能となる。
【００５４】
次に、本発明のカワヒバリガイ検出用キットについて説明する。
【００５５】
本発明のカワヒバリガイ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むものである。
【００５６】
したがって、このプローブがカワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【００５７】
本発明のカワヒバリガイ検出用キットの一例として、図１７に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００５８】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方である。
【００６０】
ＤＮＡチップ１を用いて、カワヒバリガイ幼生の検出を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のカワヒバリガイ幼生の検出を行うことができる。
【００６１】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００６２】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いてカワヒバリガイ幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、カワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、カワヒバリガイ幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、カワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００６３】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とするカワヒバリガイ幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、カワヒバリガイ幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【実施例】
【００６４】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
（実施例１）
カワヒバリガイ、及びカワヒバリガイと比較的近縁であると考えられる二枚貝であるコウロエンカワヒバリガイ（Xenostrobus securis)、ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）、ホトトギスガイ（Musculista senhousia）、ミドリイガイ（Perna viridis）のＣＯＩ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいてカワヒバリガイに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供した二枚貝は採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。
【００６６】
データベース化に供した二枚貝は、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００６７】
ＡＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認された。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＡＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００６８】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、ＣＯＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、後生無脊椎生物のＣＯＩ遺伝子に対するプライマーとして文献１で報告されているユニバーサルプライマーを用いた（文献１：Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., Vrijenhoek, R., 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 294-299.）。
【００６９】
配列番号３及び４に使用したユニバーサルプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（インビトロジェン）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、アドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのアドバンテージ２に添付された方法に従った。具体的には、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００７０】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３０サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００７１】
その結果、ＣＯＩ遺伝子のＰＣＲにおいては、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適であったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片は本来は７０９ｂｐ程度の長さであるが、配列を正確に確認できたのは、いずれの二枚貝においても約５０５〜５８５ｂｐの長さであった。
【００７２】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号３と４に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００７３】
各種二枚貝を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載された塩基配列からなるユニバーサルプライマーを用いて得られたＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号５〜９に示す。配列番号５がカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号６がコウロエンカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号７がムラサキイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号８がホトトギスガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号９がミドリイガイのＣＯＩ領域の塩基配列である。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である５０５〜５８５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号５〜９に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。但し、コウロエンカワヒバリガイについては、配列番号６に記載された塩基配列と１９塩基だけ異なる塩基配列とが同等に検出された（配列番号１０）。具体的には、２４番目、５４番目、８１番目、１０３番目、１７７番目、２１０番目、２４９番目、２５０番目、２５２番目、３３３番目、３５１番目、３８１番目、４０５番目、４５６番目、５１６番目、５４１番目、５５９番目、５８１番目及び５８４番目の１９箇所の塩基が配列番号６に記載の塩基配列とは異なっていた。
【００７４】
次に、配列表の配列番号５〜９の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、カワヒバリガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１３８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。これらのプライマーを合成（インビトロジェン）し、以下の実験に供した。
【００７５】
配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーセットについて、上記方法により得られたカワヒバリガイ成体、コウロエンカワヒバリガイ成体、ムラサキイガイ成体、ホトトギスガイ成体及びキヌマトイガイ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、このプライマーセットの有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。
【００７６】
ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。電気泳動写真を図１に示す。尚、図１において、Ｌ列がカワヒバリガイの電気泳動結果であり、Ｘ列がコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、Ｍｙ列がムラサキイガイの電気泳動結果であり、Ｍｕ列がホトトギスガイの電気泳動結果であり、Ｈ列がキヌマトイガイの電気泳動結果である。
【００７７】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、カワヒバリガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーにより増幅した１３８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
【００７８】
次に、コウロエンカワヒバリガイ成体、ムラサキイガイ成体、ホトトギスガイ成体及びキヌマトイガイ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供してもバンドは確認できなかった。
【００７９】
以上の結果から、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーは、カワヒバリガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。尚、ミドリイガイについては、電気泳動実験を行わなかったものの、ＣＯＩ領域の塩基配列の相違から、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーを使用してＰＣＲを行ったとしても、遺伝子増幅は生じることはない。
【００８０】
（実施例２）
本発明のプライマーを用いた定量分析について検討した。
【００８１】
まず、カワヒバリガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のカワヒバリガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。結果を図２に示す。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるカワヒバリガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、カワヒバリガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００８２】
（実施例３）
カワヒバリガイ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件と定量分析について検討を行った。
【００８３】
２００８年８月２０日に大塩湖（群馬県富岡市）で採集したカワヒバリガイのＤ型幼生（殻長約１５０μｍ）に９９．５％エタノールを十分に加えて、カワヒバリガイのＤ型幼生をエタノールに固定し、４℃で保存した。
【００８４】
ＤＮＡ抽出処理は、カワヒバリガイのＤ型幼生を０、１、２、５、１０、２０、５０個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。
【００８５】
フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳによる多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００８６】
ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【００８７】
その結果、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合の試料間のＣｔ値ばらつきがＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を行った場合のＣｔ値ばらつきよりも少ないことが明らかとなった。
【００８８】
したがって、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理でも同様の定量化が可能であるが、フジフィルム社のQuickGene DNA tissue Ｋｉｔ Sを採用することがＣｔ値ばらつきを抑える上で好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。
【００８９】
また、カワヒバリガイ幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、カワヒバリガイ幼生の甲皮の堅さに起因するＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。また、この破砕処理は多量の他種動物プランクトンを含む採集サンプルの場合にはさらに効率よくカワヒバリガイのDNAを抽出できることもわかった。
【００９０】
また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（１３８ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。
【００９１】
尚、他のインビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットやインビトロジェン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔのＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。
【００９２】
次に、リアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。前述の操作で最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。即ち、１、２、５、１０、２０及び５０個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４及び１個体相当の幼生が含まれることになる。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲの結果を図３に示す。図３におけるＣｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。上記の通り、リアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４及び１個体相当と非常に少ない幼生個体数であったにも関わらず、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。即ち、カワヒバリガイのＤ型幼生がＤＮＡ抽出液１００μＬ中に１個体以上存在すれば、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもって幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、カワヒバリガイのＤ型幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の推定ができると考えられた。
【００９４】
（実施例４）
複数のプランクトンが混在しているプランクトンサンプルにカワヒバリガイ幼生が含まれている場合であっても、カワヒバリガイ幼生を特異的に検出できるか検討した。
【００９５】
プランクトンサンプルは、２００８年８月２０日に大塩湖（群馬県富岡市）で採集し、４２０μｍのメッシュで大きなゴミやプランクトンを除いた後、７４μｍのメッシュに残ったプランクトンより、水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。尚、淡水域から採集したプランクトンサンプルからは、あらかじめカワヒバリガイの幼生を顕微鏡下で取り除いてあるため、複数のプランクトンが混在しているものの、カワヒバリガイ幼生が存在していない。
【００９６】
エタノール固定したプランクトンサンプルから体積比として約５０倍量を４本のチューブに収容した。そして、４つのうち２つのチューブにカワヒバリガイのＤ型幼生を５０個体添加した。即ち、プランクトンサンプルのみからなる被験試料Ａ及びＢと、プランクトンサンプルにカワヒバリガイＤ型幼生が５０個体存在している被験試料Ｃ及びＤとを作製した。
【００９７】
次に、被験試料Ａ〜Ｄのそれぞれを、ＤＮＡ抽出処理（実施例３と同様の処理）し、ＰＣＲを行った。但し、被験試料Ａ及びＣは２５サイクルとし、被験試料Ｂ及びＤは３５サイクルとした。ＰＣＲ終了後、被験試料を電気泳動に供し、検出されるＤＮＡバンドを確認した。
【００９８】
電気泳動の結果を図４に示す。図４の左側の２５サイクルの結果において、Ａ列は被験試料Ａ（プランクトンサンプルのみ）の場合の結果であり、Ｃ列は被験試料Ｃ（プランクトンサンプル＋カワヒバリガイＤ型幼生５０個体）の結果である。また、図４の右側の３５サイクルの結果において、Ｂ列は被験試料Ｂ（プランクトンサンプルのみ）の場合の結果であり、Ｄ列は被験試料Ｄ（プランクトンサンプル＋カワヒバリガイＤ型幼生５０個体）の結果である。
【００９９】
図４に示される結果から、ＰＣＲのサイクル数を３５サイクルとすると、混合プランクトンのみの場合にも若干のＤＮＡ増幅が見られることが明らかとなった。これに対し、ＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとすると、混合プランクトンのみの場合にはＤＮＡ増幅は見られず、カワヒバリガイ幼生によるＤＮＡ増幅のみが起こることが判明した。このことから、リアルタイムＰＣＲのサイクル数は２５サイクル程度とすることが好適であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】カワヒバリガイ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２】反応液中の鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときのＰＣＲ（２５サイクル）後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図３】カワヒバリガイ幼生を用いてリアルタイムＰＣＲにより作成された検量線である。
【図４】混合プランクトン中におけるカワヒバリガイ幼生の遺伝子増幅について確認したアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【符号の説明】
【０１０１】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるカワヒバリガイ検出用プライマーセット。
【請求項２】
被験試料に対し、請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより前記被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定することを特徴とするカワヒバリガイ幼生の検出方法。
【請求項３】
カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対し前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる前記被験試料の遺伝子増幅量から前記被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うことを特徴とするカワヒバリガイ幼生の定量方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載のカワヒバリガイ幼生の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むカワヒバリガイ検出用キット。
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるカワヒバリガイ検出用プライマーセット。
【請求項２】
被験試料に対し、請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより前記被験試料にカワヒバリガイ幼生が存在しているか否かを判定することを特徴とするカワヒバリガイ幼生の検出方法。
【請求項３】
カワヒバリガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによりカワヒバリガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対し前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる前記被験試料の遺伝子増幅量から前記被験試料中のカワヒバリガイ幼生個体数の定量を行うことを特徴とするカワヒバリガイ幼生の定量方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載のカワヒバリガイ幼生の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載のカワヒバリガイ幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとして含むカワヒバリガイ検出用キット。
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１３０９７７（Ｐ２０１０−１３０９７７Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１１９１７（Ｐ２００８−３１１９１７）
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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