ガストリンホルモン免疫アッセイ
本発明は、試料中の全ガストリンホルモン及び遊離ガストリンホルモンを含む、ガストリンホルモンの検出及び定量するアッセイ法を提供する。哺乳類、特にヒト被検体の血液、血漿、又は他の体液などの生体液試料を用いて行うのに適したＥＬＩＳＡ型不均一相アッセイが提供される。本方法は、生体液試料中の遊離及び全体のＧ１７及びＧ３４の量、ならびに遊離及び全体のＧｌｙ伸長型Ｇ１７及びＧｌｙ伸長型Ｇ３４の量の正確なアッセイを提供する。ガストリンホルモン免疫アッセイを用いて、ガストリンホルモン関連疾患又は状態を患っている患者に適した治療を決定する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、生体液中の生体ペプチド、特にガストリンホルモンペプチドを検出及び／又は定量するＥＬＩＳＡ法に関する。詳細には、本発明は、生体液中の遊離ペプチド、及び抗体結合ペプチドを含む全ペプチドを検出及び／又は定量する方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００３年３月２８日付けで出願された「ガストリンホルモンアッセイ」と題する米国仮出願第６０／４５８，２４４号の利益を主張し、その明細書は本明細書中その全体が参照により援用される。また、２００４年３月２９日付けで、「ガストリンホルモンに対するモノクローナル抗体」と題する米国仮出願第６０／＊＊＊＊＊＊＊と同時出願されており、その明細書は本明細書中その全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
ガストリンホルモンは１００年前に初めて同定されて１９６０年代に精製されたものの、正常組織及び疾患組織での異なる組織へのその作用はいまだ完全には理解されていない。ガストリン系の知識にこのようなギャップがある１つの主な理由は、複数の形のガストリンホルモンのそれぞれを別々に検出及び同定することが難しいためであった。
【０００４】
哺乳類では、ペプチドホルモンであるガストリンは複数の形で存在し、ペプチド鎖にあるアミノ酸残基の数に基づいて、主に２つの大きさのクラス、「小」ガストリンと「大」ガストリンにグループ化される。「小」ガストリン形には、成熟ガストリン１７（Ｇ１７）及びグリシン伸長型Ｇ１７（Ｇ１−Ｇｌｙ）が含まれ、「大」ガストリンには、ガストリン３４（Ｇ３４）及びグリシン伸長型Ｇ３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が含まれる。Ｇ１７の成熟形は、胃酸分泌の主要なエフェクターであり、この役割においてはＧ３４の約６倍効果があると見積もられている。様々な形のガストリンが、前駆体ペプチドであるプロガストリンから、開裂により、また場合によっては開裂形の修飾により、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される。ヒトＧ３４は、そのＣ末端にＧ１７の全１７アミノ酸配列を有し、そして予想どおり、Ｇ１７と免疫学的に交差反応する。
【０００５】
成熟Ｇ１７は、アミノ末端残基及びカルボキシ末端残基の両方で修飾される。Ｎ末端グルタミン酸は環化してピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成し、そしてＣ末端フェニルアラニン残基の遊離カルボキシル基は酵素、ペプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によりアミド化してＣ末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する。 (Dockray他著、Ann. Rev. Physiol. (2001) 63: 119-139を参照)。
【０００６】
ヒトの「小」ガストリンの主要な形である成熟Ｇ１７は、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号１）を有する。Ｇ１７−Ｇｌｙは、健康なヒト被検体の「小」ガストリンの少数成分として見いだされる、ガストリンの不完全処理形であり、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号２）を有する。
【０００７】
ヒトの「大」ガストリンの主要な形であるガストリン−３４は、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号３）を有し、Ｃ末端グリシン残基を余計に持つグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）は、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号４）を有する。
【０００８】
ガストリンは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）に応答して胃の幽門洞Ｇ細胞により分泌される。ガストリン分泌は、胃酸と、複数のペプチドホルモン、最も顕著には、ソマトスタチンの傍分泌作用とにより抑制される。ガストリンペプチドは、健康な個体の胃で酸の分泌を刺激するように機能すると、長い間認識されてきたが、最近になって初めてこれらのペプチドが、胃腸管（ＧＩ）系の様々な型の細胞の増殖、分化、及び成熟の制御も行うことが示された。
【０００９】
ＧＩ系でのそれらの局所的活性に加えて、Ｇ１７、及びそれより劣るがＧ１７−Ｇｌｙは、血流中に放出され、胃癌、結腸直腸癌、及び膵癌などの胃腸障害及び疾患にかかっている患者の血清では増加することが見いだされている。さらに最近では、これらのガストリン種が胃腸管に付随しないで小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び肝臓転移腫瘍を含む他の疾患に付随することもまた見いだされいている。例えば、「ガストリンと大腸癌：統合的仮説（Gastrin and Colon Cancer: a unifying hypothesis）」S. N. Joshi他著、Digestive Diseases (1996) 14: 334-344、及び「ガストリン と 結腸直腸癌（Gastrin and colorectal cancer）」Smith, A. M. and Watson, S. A.著、Alimentary Pharmacology and Therapeutics (2000) 14 (10): 1231-1247を参照。
【００１０】
抗体は、医薬、獣医学、及び他の分野で用いられる多数のアッセイ技法において、重要な試薬である。そのような検査には、多くの日常的に用いられる免疫アッセイ技法、例えば、酵素結合免疫吸着（immunosorbant）検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び免疫蛍光（ＩＦ）アッセイなどが含まれる。
【００１１】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、独自の特徴を有しており、これによりモノクローナル抗体は、これらのアッセイの多くにおいて用いられる場合に、多くの点でポリクローナル抗血清及びポリクローナル抗血清から精製された抗体より優れている。これらの寄与として、標的抗原に対するモノデターミナント（monodeterminant）特異性（すなわち、単独のエピトープに対する特異性）、異なる抗体調製物の中で特異性を変化させないこと、ならびに親和性及び化学組成を経時で変化させないことが挙げられる。そのうえさらに、ＭＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法により無期限かつ無限の量で産生され得る。これらの性質は、ポリクローナル抗体のそれと明らかに対照的であり、ポリクローナル抗体は、生物学的変異性を必ず伴い、かつ免疫化動物の一生にかかる抗体産生能力の制限を受けるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化法を必要とする。
【００１２】
これらの利点にも関わらず、個々のＭＡｂの間には、たとえそれらが同じエピトープに対して特異的であったとしても、違いが存在する。例えば、単一の抗原性エピトープ領域を用いた免疫化により誘導されたＭＡｂ間に、以下の特徴のいずれか又は全てに関して差異が生じ得る。１）エピトープの分子組成及び立体構造に対する精密な特異性、２）抗体イディオタイプ、３）抗体親和性、４）抗体アロタイプ、及び５）抗体アイソタイプ。これらの特徴的な違いは、同じ抗原領域に対して発生した異なるＭＡｂ単離物が所定のアッセイで異なる挙動を取り得るというように、特定の免疫アッセイにおいてＭＡｂの挙動に悪影響を及ぼすおそれがある。結果として、ＭＡｂの中には特定の免疫アッセイで試薬として用いられた場合に、同じエピトープに結合する他のものよりも優れているものがある。
【００１３】
免疫アッセイは、酵素結合免疫吸着（immunosorbant）検定法（ＥＬＩＳＡ）、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）か、ＥＬＩＳＰＯＴ、スロットブロット、及びウェスタンブロットなどの免疫検出アッセイであってもよい。そのような技法の総合的案内として、例えば、Ausubel他(編) (1987) の「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」John Wiley and Sons著、New York, N. Y.を参照。代替的に、免疫アッセイは、組織試料中のガストリンホルモンを視覚化する、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法又は免疫蛍光（ＩＦ）手順であってもよい。例えば、「免疫アッセイの原理と実践（Principles and Practice of Immunoassay）」 (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (編), Stockton Press, New York, N. Y.を参照。
【００１４】
Ｇ１７のＮ末端領域及びＣ末端領域に特異的なモノクローナル抗体が記載されている。例えば、Azuma他著、Gastroenterologica Japonica (1986) 21 (4): 319-324; Ohning他著、Peptides (1994) 15 (3): 417-423 ; Fuerle他著、Pancreas (1995) 10 (3): 281-286; Kovacs他著、Peptides (1996) 17 (4): 583-587; Ohning他著、Am. J. Physiol. (1996) 271 (3 Pt 1): G470-476; Sipponen他著、(2002) Scand. J. Gastroenterol. 37 (7): 785-791を参照。しかしながら、これらの抗体のいずれも、単独又は組合せてのいずれかで、正常状態及び疾患状態の生体液で見いだされるガストリンホルモンの形のそれぞれを認識及び定量し得ることを示していない。
【００１５】
抗ガストリンポリクローナル抗体は、ガストリン活性を阻害するのに有効であることが示されている（「ガストリンのＣ末端テトラペプチドに対する抗体を用いたインキュベーションによるガストリン活性の阻害（Inhibition of gastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide of gastrin）」Jaffe他著、Surgery (1969) 65 (4): 633-639)。また、非ヒト抗ガストリンポリクローナル抗体は、摂食による刺激なしに過剰なガストリンが産生される病的状態であるゾリンジャー・エリソン症候群を患っている患者の治療に応用されている。Hughes他著「ゾリンジャー・エリソン症候群におけるガストリン抗体を用いた治療（Therapy with Gastrin Antibody in the Zollinger-Ellison Syndrome）」Hughes他著、Digestive Diseases (1976) 21 (3): 201-204を参照。しかしながら、これらのウサギ抗ガストリン抗体は「この患者では最善でも短期間の効果」しか有していなかった。（Hughes at p. 204)。
【００１６】
近年、血清中のガストリンホルモンのアミド化対非アミド化の比が、個体の十二指腸潰瘍又は胃粘膜萎縮（gastric atrophy）を発症する危険性プロファイルの指標を提供することが示唆されている。T. C. Wangの「胃腸管障害の診断及び治療（Diagnosis and Treatment of gastrointestinal Disease）」と題する公開された米国特許出願第２００３／００４９６８９号を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
これまでのところ、ガストリンホルモンのＧ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、Ｇ３４、及びＧ３４−Ｇｌｙ形のそれぞれを、高感度に検出することができ、そして正確に認識することができるＭＡｂは得られていない。そのうえさらに、本発明に至るまでは、生体液の試料中のガストリンホルモンのこれらの形における、それぞれの量を正確に測定することはできなかった。診断検査するためのアッセイで本発明のＭａｂを用いることは、正常状態及び疾患状態でのガストリンホルモンの生物学をより正確に定義し、薬学的に使用されるＭＡｂ組成物ならびにガストリン関連疾患及び状態の予防及び治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
［発明の概要］
本発明は、生体液試料中の抗体結合及び遊離を含むガストリンホルモンの全量を決定する方法を提供する。この方法は以下の工程、（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、（ｃ）Ｎ末端配列ガストリンペプチドの存在下、該試料中の該ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した該抗体の固定化複合体を生成させるために、該試料をインキュベートする工程と、（ｄ）該固定化複合体を洗浄しＮ末端配列ガストリンペプチドを除去するために、及び該複合体を、ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合し、検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を形成させるために、適した検出可能なマーカー抱合抗体とともにインキュベートする工程と、（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、（ｆ）該生体液試料中の該ガストリンホルモンの全量を決定するために、該展開試薬を測定する工程とを含む。
【００１９】
本発明はまた、生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む。（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、（ｂ）該ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、（ｃ）該試料中の該ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した該抗体の固定化複合体を生成させるために、該試料をインキュベートする工程と、（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、該抗体を含む未結合の構成成分を除去するために、及び該複合体を、該ガストリンホルモンに結合したＣ末端エピトープに選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、（ｆ）該展開試薬を測定し、該生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する工程。
【００２０】
本発明はさらに、生体液試料中の結合ペプチド＋遊離ペプチドの全量を決定する方法を提供し、ここでペプチドの少なくとも一部分は第一結合配列で可逆的に結合している。この方法は以下の工程を含む。（ａ）ペプチドを含有する生体液試料を得る工程と、（ｂ）第一結合配列中に存在しない、ペプチドの第一エピトープに選択的に結合する抗体でコーティングした固体基質を提供する工程と、（ｃ）第一結合配列を含むが第一エピトープは含まないペプチドフラグメントの存在下、ペプチドがこの抗体に結合するのに適した条件で、ペプチドと結合したこの抗体の複合体を産生するために、試料の一部をインキュベートする工程と、（ｄ）未結合抗体及びペプチドフラグメントを除去するために、ウェルを洗浄し、及び複合体をペプチドの第二エピトープと選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、（ｅ）ウェルを洗浄し、及び該ウェルに展開試薬を添加する工程と、（ｆ）生体液試料中の結合ペプチド＋遊離ペプチドの全量を決定するために、展開した試薬を測定する工程。
【００２１】
本発明はまた、ガストリンホルモン関連疾患又は状態を患っている患者のガストリンホルモン遮断治療を評価する方法も提供する。この方法は以下の工程を含む。ａ）治療前又は治療の初期段階で患者から生体液の第一の試料を得る工程と、ｂ）免疫アッセイ法により第一の試料中のガストリンホルモンレベルを決定する工程と、ｃ）治療すべき疾患又は状態、及び第一の試料中のガストリンホルモンレベルに基づいて診断する工程と、ｄ）ガストリンホルモンに結合する第一薬剤又は第一薬剤を生成する物質を、これがそのｉｎ ｖｉｖｏ中の標的受容体に結合するのを調節することを含む、患者に治療を施す工程と、ｅ）治療が有効であると思われる適した時間後、患者から生体液の第二の試料を得る工程と、ｆ）第二の試料の第一の取分中の、結合ガストリンホルモン及び遊離ガストリンホルモンを含む全ガストリンホルモンレベルを、免疫アッセイ（immunassay）法により決定する工程であって、第二の試料の第一の分取量は（ｉ）第一薬剤が結合した任意のガストリンホルモンに置き換わる第二薬剤と、（ｉｉ）第二薬剤と結合しない、固定化抗ガストリンホルモン抗体、とがインキュベートされて、決定される工程、洗浄し第二薬剤を除去する工程、及びガストリンホルモンに結合するが固定化抗体と競合しない検出可能な抗体を添加する工程、ガストリンホルモンに結合した固定化抗体を含む免疫複合体を形成する工程、続いてガストリンホルモンが検出可能な抗体と結合する工程、ｇ）免疫複合体中の検出可能な抗体の量を検出し、かつ、それにより第二の試料中の全ガストリンホルモン量を決定する工程、ｈ）第二の試料の第二の分取分で工程（ｆ）及び工程（ｇ）を繰り返すことにより、遊離ガストリンホルモンレベルを決定するのに、工程（ｆ）のインキュベーションは第二薬剤を用いずに決定する工程、ｊ）患者におけるガストリンホルモン遮断治療の有効性を決定するために、第一の試料中の遊離ガストリンホルモンで求められた量と第二の試料中の遊離及び全ガストリンホルモンの量とを比較する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
［発明の詳細な説明］
以下に、本明細書中で使用される場合の用語及び語句の定義を提供する。
【００２３】
本明細書中、互換的に使用される場合、「ガストリンホルモン」又は「ガストリンホルモン形」は、任意の、生物学的に活性の及び／又は免疫学的に交差反応性のガストリンホルモンペプチドを意味する。ガストリンホルモンの主な形として、Ｃ末端でアミド化されているか又は遊離Ｃ末端を有するかに関わらないガストリン１７（Ｇ１７）；グリシン伸長型ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）；Ｃ末端アミド化形及び遊離Ｃ末端を有する形の両方を含むガストリン３４（Ｇ３４）、ならびにグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書中使用される場合、ガストリンホルモンの特定の形に対して「選択的」という用語は、抗体が、ガストリンホルモンの特定の形の特定の標的エピトープに対して特異的であるものの、標的エピトープを含むガストリンホルモンのそれぞれの形と結合することを意味する。例えば、成熟（アミド化）Ｇ１７のＣ末端は、成熟Ｇ１７及びＧ３４と共通である。したがって、成熟Ｇ１７Ｃ末端で見いだされる標的のＣ末端エピトープに対して特異的であるＭＡｂは、Ｇ１７に対して（及びＧ３４に対して）も選択的である。
【００２５】
本明細書中使用される場合、試料中のガストリンホルモン形の「全量」は、遊離（未結合）ガストリンホルモン形の量＋複合化（結合）ガストリンホルモン形の量の合計を意味する。複合化ガストリンは、試料中の抗体又は他のガストリン結合部分で結合されていてもよい。
【００２６】
本明細書中使用される場合、「生体液」は、生物由来の物質を含む任意の液体を意味する。本発明で使用するのに好適な生体液として、動物、特に哺乳類、好ましくはヒト被検体の体液が挙げられる。体液は、任意の体液であってもよく、血液、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液（ＣＳＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書中使用される場合、「保存剤」は、生体液の試料又は生物成分を含む液体試料中のガストリンの時間による分解を減少させる、任意の薬剤、補充物、又は添加物を意味する。本発明の実施に有用な保存剤には、当該分野で既知である多くの保存剤のいずれもが含まれ、例えばアジ化ナトリウム、ＥＤＴＡなどの一般的な化学保存料、及び例えばＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、及びアプロチニン（例えばトラジロール（Trasylol））などのプロテアーゼインヒビター、又は例えばヘパリンなどの生物保存料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中使用される場合、「検査プレート」は任意の固体基質を意味し、その上で、複数の液体試料が本発明の方法に従って個別にアッセイされ得る。本明細書中使用される場合、検査プレートの「ウェル」は、プレートの試料受入場所として用いられる、検査プレートのある範囲を意味する。代表的には、検査プレートのウェルは、試料体積＋アッセイ手順の任意の工程で添加される任意の緩衝液又は洗浄液の体積を受け入れかつ保持するのに十分な、プレート表面にある凹みで形成される。
【００２９】
標的分子に適用される場合、そして本明細書中使用される場合、「測定する」とは、分析物又は標的分子の量を検出、定量、又は量を決定することを意味する。
【００３０】
具体的には、本発明は、生体液中の特定の形のガストリンホルモンを測定するように意図された免疫酵素検定法（immunoenzymometric assay）（一般に「ＥＬＩＳＡ」又は酵素結合免疫吸着と呼ばれる）に用いるのに特に適したＭＡｂを開示する。
【００３１】
本発明の実施に有用なＭＡｂには、ガストリン１７（Ｇ１７）のＮ末端に、アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（配列番号５）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３２】
同じく本発明の実施に有用なＭＡｂには、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に、アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３３】
別の態様において、本発明の実施に有用なＭＡｂには、ヒトガストリン３４（ｈＧ３４）のＮ末端に、アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３４】
さらに別の態様において、本発明の実施に有用なＭＡｂには、グリシン伸長型ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に、アミノ酸配列ＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号８）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３５】
本発明の実施に有用なＭＡｂは、好ましくは、それらが約１０６〜約１０７ＬＭ−１の結合定数（Ｋａ）で選択的な結合を示すガストリンホルモン形に結合し、好ましくはＭＡｂは、約１０７〜約１０８ＬＭ１、さらにより好ましくは約１０８〜約１０９ＬＭ１、なおさらに好ましくは約１０９〜約１０１０ＬＭ１、そしてより一層好ましくは約１０１０〜約１０１１ＬＭ１、そして最も好ましくは約１０１１〜約１０１２ＬＭ１のＫａでガストリンホルモン形に結合する。
【００３６】
本発明の方法に従って分析されるべき試料は、好ましくは哺乳類からの生体液の試料であり、この試料は、検出、定量、又は決定されるべきペプチドの量を含有しているか、あるいは含有していると思われる。好ましくは、試料はガストリンホルモンを少なくとも１種のガストリンホルモン形で含有する。最も好ましくは、保存剤が試料に添加されていて試料混合物を形成しており、そして試料混合物は、哺乳類からの試料採取より約１分〜約１５分の間の時間内で凍結されている。
【００３７】
本明細書中使用される場合、結合に「適した条件」は、抗体のその同種抗原への結合、及びマーカー酵素標識が検出剤として用いられる抗体と抱合する反応であるマーカー酵素標識の酵素反応を許容する、温度、ｐＨ、及びイオン強度の条件を意味する。抗体抗原結合についての、及び各種マーカー酵素反応についてのそのような適した条件は、当業者に既知であり、そして過度の実験を行うことなく日常的な方法で、各反応について具体的に決定され得る。
【００３８】
本明細書中使用される場合、「検出可能なマーカー抱合抗体」は、任意の標識化抗体を意味し、ここで標識は、例えば酵素標識などの検出可能な信号を提供するか、例えば放射能標識、酵素標識、蛍光若しくは発光標識などの検出可能な信号、又はアビジン抱合部分により検出可能なビオチン標識などの別々に検出され得る部分を提供することによりそれ自身が検出され得る第二の標識化抗体などの別の薬剤で検出され得る。
【００３９】
本明細書中使用される場合、「検出可能なマーカー抱合抗体複合体」は、その同種抗原と結合した、検出可能なマーカーが抱合した抗体を含む複合体であり、同種抗原は例えばガストリンホルモンであってもよい。そのようなガストリンホルモン抗体複合体は、測定され得る検出可能な信号を提供し、そして検出可能な抗体の濃度に直接関連している。好適な濃度範囲にわたって、信号は検出可能なマーカー抱合抗体複合体の濃度に直接比例する。
【００４０】
本明細書中使用される場合、「展開試薬」は、抗体抱合酵素により展開される試薬を意味する。例えば、アルカリホスファターゼの展開試薬はｐＮＰＰであり得る。
【００４１】
本発明は、全（結合及び遊離）ガストリンホルモンを測定するアッセイ法及びガストリンホルモン遮断治療の評価法を提供する。これらのアッセイ法を以下に記載する。患者におけるガストリンホルモン遮断治療の評価法は、１つの治療レジメンを続けるのかそれとも別のものにするかを決定する時機が患者の転帰にとって重要であり得る実際の臨床で特に価値がある。本発明の方法は、これらの臨床上の判断の基礎となる情報を提供する。本方法は、治療前又は治療の初期段階（例えば、米国特許第５，６２２，７０２号に記載されるような、ガストリンホルモンペプチド抱合ワクチンでの接種直後）のガストリンホルモンの測定を提供し、また、治療が効果を上げ始めたと期待される期間後の全及び／又は遊離ガストリンホルモンの１つ以上の測定を提供する。
【００４２】
分析方法
以下は、ヒト血漿などの生体液中に存在する全（非複合化＋抗体複合化）又は遊離（非複合化）ヒトガストリンホルモン（Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、Ｇ３４、又はＧ３４−Ｇｌｙ）のいずれかを決定するための、アッセイされているガストリンホルモンの特定の分子形のＣ末端又はＮ末端に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を用いることによる、本発明の分析法（免疫酵素検定法）の記載である。あるいは、分子のＣ末端又はＮ末端に対するポリクローナル抗体の組合せが、分子のＮ末端又はＣ末端それぞれに対するモノクローナル抗体と組み合わせて用いられてもよい。
【００４３】
以下に記載されるアッセイにおいて、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｆ９６ ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４３９４５４）検査プレートを用い、また抗体コーティング溶液をホウ酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％アジ化ナトリウム含有）で調製した。
【００４４】
１．プレートコーティング：検査されるべき特定のヒトガストリン分子形に対して選択的な抗体を、最適濃度で、検査プレートのマイクロウェル表面にコーティングした。
【００４５】
最適抗体濃度は、アッセイされるべき形の標準ガストリンホルモンの既知濃度を用いて標準曲線を作ることにより決定し、標準曲線は必要とされる有用な濃度範囲にわたって、必要とされる感度と正確さを有する。Ｇ１７については、アッセイの有用なＧ１７濃度範囲は、一般に、バックグラウンド（約４ｐＭ又はそれ未満）〜約２５ｐＭ又は約５０ｐＭまでである。しかしながら、ガストリン産生腫瘍の患者では、血漿ガストリンホルモンレベルは、８００ｐＭもの高さ、又は１０００ｐＭ（１．０マイクロモル）でさえあり得る。必要とされる範囲にわたる適切な感度及び精度の決定は、過度の実験を行うことなく当業者により容易に決定され得る。
【００４６】
２．プレート洗浄：コーティング溶液を除去して洗浄緩衝液（１ウェルあたり約４００μｌ）を添加し、そして除去する。この洗浄サイクルを、必要とされる回数繰り返す。洗浄緩衝液は、０．０１０Ｍのリン酸緩衝液；０．００２７Ｍの塩化カリウム、及び０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４、０．０１％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有）であった。プレート洗浄は自動化されてもよい（以下に記載されるアッセイでは、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｗｅｌｌｗａｓｈ ４Ｍｋ２、Life Sciences International (UK) Ltd, Basingstoke, UK を用いた）。
【００４７】
３．プレートブロッキング：タンパク質及び洗浄剤（コーティング緩衝液中１％のＢＳＡ／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含有するブロッキング緩衝液をマイクロウェルに添加する。プレートはこの形で貯蔵されてもよい。
【００４８】
４．試料及び標準の添加：プレートを上記に記載のとおりに洗浄する。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン、及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を各ウェルに添加する（１００μＬ／ウェル）。検査標準（例えば標準ガストリンホルモンの量を増やしながら添加していったガストリン欠乏血漿など）及び検査血漿試料をウェルに添加する（２０μＬ／ウェル）。名目上４℃で一晩反応を進行させる。血清試料のガストリン欠乏は、試料を室温で一晩放置することにより、容易に達成される。
【００４９】
全ガストリンホルモン（抗体結合ガストリンホルモンを含む）がアッセイされるべきこれらのアッセイにおいて、乖離ペプチドＧ１７（１−９）（１００μｇ／ｍｌ）は、アッセイ緩衝液、すなわちウサギＩｇＧＥＤＴＡ混合物中に含まれる。
【００５０】
５．抱合体の添加：洗浄に続いて、酵素標識と抱合した、アッセイされるべきガストリンホルモン形のＮ末端に対して特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含有するアッセイ緩衝液、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加する。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。検出化合物の展開に用いるのに適した酵素基質の例として、アルカリホスファターゼについてニトロ−フェニルリン酸、又は西洋ワサビペルオキシダーゼについてテトラメチルベンジジンスルフォネート（ＴＭＢＳ）が挙げられる。色展開の程度は、吸光単位（ＡＵ、ｐ−ニトロフェノールの場合は４０５ｎｍで、ＴＮＢＳの場合は４５０ｎｍで読む）として読まれ（sread）、検査試料中に存在するＧ１７の量を示しており、そして実際の濃度は、検査試料の吸光度を、濃度既知のガストリンホルモンを用いて作られた標準曲線に対して読むことにより決定される。
【００５１】
７．読み取り：十分なアッセイシグナルが得られたら、シグナルを、例えばマイクロプレート分光光度計又は蛍光光度計（fluorimeter）で測定する。
【００５２】
８．データ処理：ガストリンホルモン形の既知標準溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築する。較正曲線を用いて、検査試料中のガストリンホルモン形の濃度を内挿する。
【００５３】
全ガストリンホルモン形及び遊離ガストリンホルモン形の量を決定する特定のアッセイプロトコルを以下に記載する。
【００５４】
全Ｇ１７の決定
このアッセイでは、ヒトガストリン１７のＣ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、乖離ペプチドＧ１７（１９）（１００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。検査標準（０−４．１−１０．２−２６．６−６４−１６０−４００−１０００ｐＭのＧ１７が添加されたガストリン欠乏血漿）及び検査血漿試料をウェルに添加した（２０μＬ／ウェル）。反応を、冷蔵庫中、名目上４℃で、一晩進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７のＮ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。洗浄に続いて、上記に記載されるとおり、色素生産性基質（ｐＮＰＰ）を添加し、プレートをインキュベートして色を展開させ、そしてプレート読み取り機で読み取った。既知の標準Ｇ１７溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築した。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ１７濃度を内挿した。代表的な較正曲線を図１に示す。
【００５５】
遊離Ｇ１７の決定
ヒトガストリン１７分子のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液に調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を添加して、マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、酵素標識としてのアルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７のＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、上記に記載されるとおり、色素生産性基質（ｐＮＰＰ）を添加し、プレートをインキュベートして色を展開させ、そしてプレート読み取り機で読み取った。上記に記載される全Ｇ１７のアッセイのように、既知の標準Ｇ１７溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築した。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ１７濃度を内挿した。代表的な較正曲線を図２に示す。
【００５６】
全Ｇ１７−Ｇｌｙ抗体の決定
上記に記載されるとおり、ヒトグリシン伸長型ガストリン１７分子のＣ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、乖離ペプチドＧ１７（１９）（１００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を各ウェルに添加した（例えば１００μＬ／ウェル）。検査標準（０−４．１−１０．２−２６．６−６４−１６０−４００−１０００ｐＭのＧ１７−ＧｌｙでＧ１７−Ｇｌｙが添加されたガストリン欠乏血漿）及び検査血漿試料をウェルに添加した（例えば２０μＬ／ウェル）。反応を、名目上４℃で、一晩進行させた。続く工程は、全Ｇ１７のアッセイで上記に記載されたままであった。
【００５７】
遊離Ｇ１７−Ｇｌｙ抗体の決定
Ｇ１７−Ｇｌｙ分子のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。記載される通りにプレートを洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）（例えば１００μｌ／ウェル）、続いて試料／標準（例えば５０μｌ／ウェル）を添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７−ＧｌｙのＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。続く工程は、遊離Ｇ１７のアッセイで上記に記載されたまさにそのままであった。
【００５８】
Ｇ３４の決定
ヒトガストリン３４のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。記載される通りにプレートを洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）（例えば１００μｌ／ウェル）、続いて試料／標準（例えば５０μｌ／ウェル）を添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ３４のＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加して、マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。色素生産性基質（ｐＮＰＰ）の添加、そしてプレート読み取り機を用いたプレートウェル中の試料シグナルの読み取り、及び続くデータ処理は上記に記載されるとおりであった。既知の標準Ｇ３４溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築する。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ３４濃度を内挿する。
【実施例】
【００５９】
〔実施例１〕
既知量のガストリン１７を添加してあるガストリン欠乏血清試料における、全ガストリン１７の決定。
血清を一晩室温に放置して、存在するガストリンホルモンを内因性プロテアーゼにより完全に分解させることにより、ガストリンホルモンを欠乏させた。
【００６０】
アッセイ内の精度と確度を決定するために、既知量の標準ガストリン１７（Ｇ１７）を、複製した分取量のガストリン欠乏血清試料に添加して、表１に示される正常濃度とした。抗ガストリンホルモン抗体含有血清試料についてと同様な手順で、Ｎ末端ガストリンペプチドを用いて全Ｇ１７についてアッセイを行った。Ｎ末端ガストリンペプチドＧ１７（１−９）を、上記に記載される通り、１００μｇ／ｍｌの濃度で、試料及び標準の添加の工程で添加した。結果は、表１に提供されるが、アッセイがＥＬＩＳＡ法の許容限度内でＧ１７を正確に定量したことを示し、このＥＬＩＳＡ限度は、＋２０％の相対誤差である。より大事なことは、患者で通常見られる濃度（上記に記載されるとおり）である１００ｐＭ以下のＧ１７濃度で、アッセイがもっとも正確であることである。
【００６１】
【表１】
【００６２】
〔実施例２〕
既知量のガストリン１７を添加してあるガストリン欠乏血清試料における、遊離ガストリン１７の決定。
このアッセイは、遊離ガストリン１７（Ｇ１７）の決定について上記の「アッセイ手順」で記載された方法に従って行った。結果は、表２に提供されるが、アッセイがＥＬＩＳＡ法の許容限度内で遊離Ｇ１７を正確に定量したことを示す。より大事なことは、患者に通常見られる濃度である１００ｐＭ以下のＧ１７濃度で、アッセイがもっとも正確であることである。
【００６３】
【表２】
【００６４】
〔実施例３〕
ガストリン１７安定性
ガストリンの室温（約２２℃）での安定性を、試料を調製して１５ｐＭ、１００ｐＭ、及び６００ｐＭの既知Ｇ１７濃度にした直後（０時間試料）、及びベンチ上室温で２時間後の、全Ｇ１７を測定することにより、上記に記載されるとおりの全ガストリンアッセイで評価した。結果は、試料それぞれでＧ１７濃度が実質的に減少していることを実証し、以下の表３に示される。このことは、ガストリンホルモンについて試料を検査する本発明のアッセイ方法を用いて得られたガストリン値の確度に対して、血漿が患者血液試料から調製されるときに温度上昇への曝露を最小限にすることを含む、適切な試料取り扱い技術の重要性を実証する。
【００６５】
【表３】
【００６６】
［参照としての援用］
本明細書中に記載される全ての特許及び文献は、その全体が参照として本明細書により明示的に援用される。
【００６７】
［ハイブリドーマ細胞株の寄託］
本発明の特定ＭＡｂを産生する以下のハイブリドーマは、２００４年３月２５日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス）の寄託となった。
１．ＭＡｂ４００−１産生ハイブリドーマ４００−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
２．ＭＡｂ４００−２産生ハイブリドーマ４００−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
３．ＭＡｂ４００−３産生ハイブリドーマ４００−３は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
４．ＭＡｂ４００−４産生ハイブリドーマ４００−４は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
５．ＭＡｂ４０１−２産生ハイブリドーマ４０１−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
６．ＭＡｂ４４５−１産生ハイブリドーマ４４５−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
７．ＭＡｂ４４５−２産生ハイブリドーマ４４５−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
８．ＭＡｂ４５８−１産生ハイブリドーマ４５８−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】全ガストリン１７についての代表的な較正曲線であり、色素生産性基質としてテトラメチルベンジジンスルフォネート（ＴＭＢＳ）を用いた酵素触媒展開に続いて４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度に対してプロットされたピコモルオーダーのガストリン濃度を示す。
【図２】遊離ガストリン１７についての代表的な較正曲線であり、上記のように４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度に対してプロットされたピコモルオーダーのガストリン濃度を示す。
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、生体液中の生体ペプチド、特にガストリンホルモンペプチドを検出及び／又は定量するＥＬＩＳＡ法に関する。詳細には、本発明は、生体液中の遊離ペプチド、及び抗体結合ペプチドを含む全ペプチドを検出及び／又は定量する方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００３年３月２８日付けで出願された「ガストリンホルモンアッセイ」と題する米国仮出願第６０／４５８，２４４号の利益を主張し、その明細書は本明細書中その全体が参照により援用される。また、２００４年３月２９日付けで、「ガストリンホルモンに対するモノクローナル抗体」と題する米国仮出願第６０／＊＊＊＊＊＊＊と同時出願されており、その明細書は本明細書中その全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
ガストリンホルモンは１００年前に初めて同定されて１９６０年代に精製されたものの、正常組織及び疾患組織での異なる組織へのその作用はいまだ完全には理解されていない。ガストリン系の知識にこのようなギャップがある１つの主な理由は、複数の形のガストリンホルモンのそれぞれを別々に検出及び同定することが難しいためであった。
【０００４】
哺乳類では、ペプチドホルモンであるガストリンは複数の形で存在し、ペプチド鎖にあるアミノ酸残基の数に基づいて、主に２つの大きさのクラス、「小」ガストリンと「大」ガストリンにグループ化される。「小」ガストリン形には、成熟ガストリン１７（Ｇ１７）及びグリシン伸長型Ｇ１７（Ｇ１−Ｇｌｙ）が含まれ、「大」ガストリンには、ガストリン３４（Ｇ３４）及びグリシン伸長型Ｇ３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が含まれる。Ｇ１７の成熟形は、胃酸分泌の主要なエフェクターであり、この役割においてはＧ３４の約６倍効果があると見積もられている。様々な形のガストリンが、前駆体ペプチドであるプロガストリンから、開裂により、また場合によっては開裂形の修飾により、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される。ヒトＧ３４は、そのＣ末端にＧ１７の全１７アミノ酸配列を有し、そして予想どおり、Ｇ１７と免疫学的に交差反応する。
【０００５】
成熟Ｇ１７は、アミノ末端残基及びカルボキシ末端残基の両方で修飾される。Ｎ末端グルタミン酸は環化してピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成し、そしてＣ末端フェニルアラニン残基の遊離カルボキシル基は酵素、ペプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によりアミド化してＣ末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する。 (Dockray他著、Ann. Rev. Physiol. (2001) 63: 119-139を参照)。
【０００６】
ヒトの「小」ガストリンの主要な形である成熟Ｇ１７は、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号１）を有する。Ｇ１７−Ｇｌｙは、健康なヒト被検体の「小」ガストリンの少数成分として見いだされる、ガストリンの不完全処理形であり、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号２）を有する。
【０００７】
ヒトの「大」ガストリンの主要な形であるガストリン−３４は、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号３）を有し、Ｃ末端グリシン残基を余計に持つグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）は、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号４）を有する。
【０００８】
ガストリンは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）に応答して胃の幽門洞Ｇ細胞により分泌される。ガストリン分泌は、胃酸と、複数のペプチドホルモン、最も顕著には、ソマトスタチンの傍分泌作用とにより抑制される。ガストリンペプチドは、健康な個体の胃で酸の分泌を刺激するように機能すると、長い間認識されてきたが、最近になって初めてこれらのペプチドが、胃腸管（ＧＩ）系の様々な型の細胞の増殖、分化、及び成熟の制御も行うことが示された。
【０００９】
ＧＩ系でのそれらの局所的活性に加えて、Ｇ１７、及びそれより劣るがＧ１７−Ｇｌｙは、血流中に放出され、胃癌、結腸直腸癌、及び膵癌などの胃腸障害及び疾患にかかっている患者の血清では増加することが見いだされている。さらに最近では、これらのガストリン種が胃腸管に付随しないで小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び肝臓転移腫瘍を含む他の疾患に付随することもまた見いだされいている。例えば、「ガストリンと大腸癌：統合的仮説（Gastrin and Colon Cancer: a unifying hypothesis）」S. N. Joshi他著、Digestive Diseases (1996) 14: 334-344、及び「ガストリン と 結腸直腸癌（Gastrin and colorectal cancer）」Smith, A. M. and Watson, S. A.著、Alimentary Pharmacology and Therapeutics (2000) 14 (10): 1231-1247を参照。
【００１０】
抗体は、医薬、獣医学、及び他の分野で用いられる多数のアッセイ技法において、重要な試薬である。そのような検査には、多くの日常的に用いられる免疫アッセイ技法、例えば、酵素結合免疫吸着（immunosorbant）検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び免疫蛍光（ＩＦ）アッセイなどが含まれる。
【００１１】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、独自の特徴を有しており、これによりモノクローナル抗体は、これらのアッセイの多くにおいて用いられる場合に、多くの点でポリクローナル抗血清及びポリクローナル抗血清から精製された抗体より優れている。これらの寄与として、標的抗原に対するモノデターミナント（monodeterminant）特異性（すなわち、単独のエピトープに対する特異性）、異なる抗体調製物の中で特異性を変化させないこと、ならびに親和性及び化学組成を経時で変化させないことが挙げられる。そのうえさらに、ＭＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法により無期限かつ無限の量で産生され得る。これらの性質は、ポリクローナル抗体のそれと明らかに対照的であり、ポリクローナル抗体は、生物学的変異性を必ず伴い、かつ免疫化動物の一生にかかる抗体産生能力の制限を受けるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化法を必要とする。
【００１２】
これらの利点にも関わらず、個々のＭＡｂの間には、たとえそれらが同じエピトープに対して特異的であったとしても、違いが存在する。例えば、単一の抗原性エピトープ領域を用いた免疫化により誘導されたＭＡｂ間に、以下の特徴のいずれか又は全てに関して差異が生じ得る。１）エピトープの分子組成及び立体構造に対する精密な特異性、２）抗体イディオタイプ、３）抗体親和性、４）抗体アロタイプ、及び５）抗体アイソタイプ。これらの特徴的な違いは、同じ抗原領域に対して発生した異なるＭＡｂ単離物が所定のアッセイで異なる挙動を取り得るというように、特定の免疫アッセイにおいてＭＡｂの挙動に悪影響を及ぼすおそれがある。結果として、ＭＡｂの中には特定の免疫アッセイで試薬として用いられた場合に、同じエピトープに結合する他のものよりも優れているものがある。
【００１３】
免疫アッセイは、酵素結合免疫吸着（immunosorbant）検定法（ＥＬＩＳＡ）、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）か、ＥＬＩＳＰＯＴ、スロットブロット、及びウェスタンブロットなどの免疫検出アッセイであってもよい。そのような技法の総合的案内として、例えば、Ausubel他(編) (1987) の「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」John Wiley and Sons著、New York, N. Y.を参照。代替的に、免疫アッセイは、組織試料中のガストリンホルモンを視覚化する、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法又は免疫蛍光（ＩＦ）手順であってもよい。例えば、「免疫アッセイの原理と実践（Principles and Practice of Immunoassay）」 (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (編), Stockton Press, New York, N. Y.を参照。
【００１４】
Ｇ１７のＮ末端領域及びＣ末端領域に特異的なモノクローナル抗体が記載されている。例えば、Azuma他著、Gastroenterologica Japonica (1986) 21 (4): 319-324; Ohning他著、Peptides (1994) 15 (3): 417-423 ; Fuerle他著、Pancreas (1995) 10 (3): 281-286; Kovacs他著、Peptides (1996) 17 (4): 583-587; Ohning他著、Am. J. Physiol. (1996) 271 (3 Pt 1): G470-476; Sipponen他著、(2002) Scand. J. Gastroenterol. 37 (7): 785-791を参照。しかしながら、これらの抗体のいずれも、単独又は組合せてのいずれかで、正常状態及び疾患状態の生体液で見いだされるガストリンホルモンの形のそれぞれを認識及び定量し得ることを示していない。
【００１５】
抗ガストリンポリクローナル抗体は、ガストリン活性を阻害するのに有効であることが示されている（「ガストリンのＣ末端テトラペプチドに対する抗体を用いたインキュベーションによるガストリン活性の阻害（Inhibition of gastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide of gastrin）」Jaffe他著、Surgery (1969) 65 (4): 633-639)。また、非ヒト抗ガストリンポリクローナル抗体は、摂食による刺激なしに過剰なガストリンが産生される病的状態であるゾリンジャー・エリソン症候群を患っている患者の治療に応用されている。Hughes他著「ゾリンジャー・エリソン症候群におけるガストリン抗体を用いた治療（Therapy with Gastrin Antibody in the Zollinger-Ellison Syndrome）」Hughes他著、Digestive Diseases (1976) 21 (3): 201-204を参照。しかしながら、これらのウサギ抗ガストリン抗体は「この患者では最善でも短期間の効果」しか有していなかった。（Hughes at p. 204)。
【００１６】
近年、血清中のガストリンホルモンのアミド化対非アミド化の比が、個体の十二指腸潰瘍又は胃粘膜萎縮（gastric atrophy）を発症する危険性プロファイルの指標を提供することが示唆されている。T. C. Wangの「胃腸管障害の診断及び治療（Diagnosis and Treatment of gastrointestinal Disease）」と題する公開された米国特許出願第２００３／００４９６８９号を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
これまでのところ、ガストリンホルモンのＧ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、Ｇ３４、及びＧ３４−Ｇｌｙ形のそれぞれを、高感度に検出することができ、そして正確に認識することができるＭＡｂは得られていない。そのうえさらに、本発明に至るまでは、生体液の試料中のガストリンホルモンのこれらの形における、それぞれの量を正確に測定することはできなかった。診断検査するためのアッセイで本発明のＭａｂを用いることは、正常状態及び疾患状態でのガストリンホルモンの生物学をより正確に定義し、薬学的に使用されるＭＡｂ組成物ならびにガストリン関連疾患及び状態の予防及び治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
［発明の概要］
本発明は、生体液試料中の抗体結合及び遊離を含むガストリンホルモンの全量を決定する方法を提供する。この方法は以下の工程、（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、（ｃ）Ｎ末端配列ガストリンペプチドの存在下、該試料中の該ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した該抗体の固定化複合体を生成させるために、該試料をインキュベートする工程と、（ｄ）該固定化複合体を洗浄しＮ末端配列ガストリンペプチドを除去するために、及び該複合体を、ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合し、検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を形成させるために、適した検出可能なマーカー抱合抗体とともにインキュベートする工程と、（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、（ｆ）該生体液試料中の該ガストリンホルモンの全量を決定するために、該展開試薬を測定する工程とを含む。
【００１９】
本発明はまた、生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む。（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、（ｂ）該ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、（ｃ）該試料中の該ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した該抗体の固定化複合体を生成させるために、該試料をインキュベートする工程と、（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、該抗体を含む未結合の構成成分を除去するために、及び該複合体を、該ガストリンホルモンに結合したＣ末端エピトープに選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、（ｆ）該展開試薬を測定し、該生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する工程。
【００２０】
本発明はさらに、生体液試料中の結合ペプチド＋遊離ペプチドの全量を決定する方法を提供し、ここでペプチドの少なくとも一部分は第一結合配列で可逆的に結合している。この方法は以下の工程を含む。（ａ）ペプチドを含有する生体液試料を得る工程と、（ｂ）第一結合配列中に存在しない、ペプチドの第一エピトープに選択的に結合する抗体でコーティングした固体基質を提供する工程と、（ｃ）第一結合配列を含むが第一エピトープは含まないペプチドフラグメントの存在下、ペプチドがこの抗体に結合するのに適した条件で、ペプチドと結合したこの抗体の複合体を産生するために、試料の一部をインキュベートする工程と、（ｄ）未結合抗体及びペプチドフラグメントを除去するために、ウェルを洗浄し、及び複合体をペプチドの第二エピトープと選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、（ｅ）ウェルを洗浄し、及び該ウェルに展開試薬を添加する工程と、（ｆ）生体液試料中の結合ペプチド＋遊離ペプチドの全量を決定するために、展開した試薬を測定する工程。
【００２１】
本発明はまた、ガストリンホルモン関連疾患又は状態を患っている患者のガストリンホルモン遮断治療を評価する方法も提供する。この方法は以下の工程を含む。ａ）治療前又は治療の初期段階で患者から生体液の第一の試料を得る工程と、ｂ）免疫アッセイ法により第一の試料中のガストリンホルモンレベルを決定する工程と、ｃ）治療すべき疾患又は状態、及び第一の試料中のガストリンホルモンレベルに基づいて診断する工程と、ｄ）ガストリンホルモンに結合する第一薬剤又は第一薬剤を生成する物質を、これがそのｉｎ ｖｉｖｏ中の標的受容体に結合するのを調節することを含む、患者に治療を施す工程と、ｅ）治療が有効であると思われる適した時間後、患者から生体液の第二の試料を得る工程と、ｆ）第二の試料の第一の取分中の、結合ガストリンホルモン及び遊離ガストリンホルモンを含む全ガストリンホルモンレベルを、免疫アッセイ（immunassay）法により決定する工程であって、第二の試料の第一の分取量は（ｉ）第一薬剤が結合した任意のガストリンホルモンに置き換わる第二薬剤と、（ｉｉ）第二薬剤と結合しない、固定化抗ガストリンホルモン抗体、とがインキュベートされて、決定される工程、洗浄し第二薬剤を除去する工程、及びガストリンホルモンに結合するが固定化抗体と競合しない検出可能な抗体を添加する工程、ガストリンホルモンに結合した固定化抗体を含む免疫複合体を形成する工程、続いてガストリンホルモンが検出可能な抗体と結合する工程、ｇ）免疫複合体中の検出可能な抗体の量を検出し、かつ、それにより第二の試料中の全ガストリンホルモン量を決定する工程、ｈ）第二の試料の第二の分取分で工程（ｆ）及び工程（ｇ）を繰り返すことにより、遊離ガストリンホルモンレベルを決定するのに、工程（ｆ）のインキュベーションは第二薬剤を用いずに決定する工程、ｊ）患者におけるガストリンホルモン遮断治療の有効性を決定するために、第一の試料中の遊離ガストリンホルモンで求められた量と第二の試料中の遊離及び全ガストリンホルモンの量とを比較する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
［発明の詳細な説明］
以下に、本明細書中で使用される場合の用語及び語句の定義を提供する。
【００２３】
本明細書中、互換的に使用される場合、「ガストリンホルモン」又は「ガストリンホルモン形」は、任意の、生物学的に活性の及び／又は免疫学的に交差反応性のガストリンホルモンペプチドを意味する。ガストリンホルモンの主な形として、Ｃ末端でアミド化されているか又は遊離Ｃ末端を有するかに関わらないガストリン１７（Ｇ１７）；グリシン伸長型ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）；Ｃ末端アミド化形及び遊離Ｃ末端を有する形の両方を含むガストリン３４（Ｇ３４）、ならびにグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書中使用される場合、ガストリンホルモンの特定の形に対して「選択的」という用語は、抗体が、ガストリンホルモンの特定の形の特定の標的エピトープに対して特異的であるものの、標的エピトープを含むガストリンホルモンのそれぞれの形と結合することを意味する。例えば、成熟（アミド化）Ｇ１７のＣ末端は、成熟Ｇ１７及びＧ３４と共通である。したがって、成熟Ｇ１７Ｃ末端で見いだされる標的のＣ末端エピトープに対して特異的であるＭＡｂは、Ｇ１７に対して（及びＧ３４に対して）も選択的である。
【００２５】
本明細書中使用される場合、試料中のガストリンホルモン形の「全量」は、遊離（未結合）ガストリンホルモン形の量＋複合化（結合）ガストリンホルモン形の量の合計を意味する。複合化ガストリンは、試料中の抗体又は他のガストリン結合部分で結合されていてもよい。
【００２６】
本明細書中使用される場合、「生体液」は、生物由来の物質を含む任意の液体を意味する。本発明で使用するのに好適な生体液として、動物、特に哺乳類、好ましくはヒト被検体の体液が挙げられる。体液は、任意の体液であってもよく、血液、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液（ＣＳＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書中使用される場合、「保存剤」は、生体液の試料又は生物成分を含む液体試料中のガストリンの時間による分解を減少させる、任意の薬剤、補充物、又は添加物を意味する。本発明の実施に有用な保存剤には、当該分野で既知である多くの保存剤のいずれもが含まれ、例えばアジ化ナトリウム、ＥＤＴＡなどの一般的な化学保存料、及び例えばＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、及びアプロチニン（例えばトラジロール（Trasylol））などのプロテアーゼインヒビター、又は例えばヘパリンなどの生物保存料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中使用される場合、「検査プレート」は任意の固体基質を意味し、その上で、複数の液体試料が本発明の方法に従って個別にアッセイされ得る。本明細書中使用される場合、検査プレートの「ウェル」は、プレートの試料受入場所として用いられる、検査プレートのある範囲を意味する。代表的には、検査プレートのウェルは、試料体積＋アッセイ手順の任意の工程で添加される任意の緩衝液又は洗浄液の体積を受け入れかつ保持するのに十分な、プレート表面にある凹みで形成される。
【００２９】
標的分子に適用される場合、そして本明細書中使用される場合、「測定する」とは、分析物又は標的分子の量を検出、定量、又は量を決定することを意味する。
【００３０】
具体的には、本発明は、生体液中の特定の形のガストリンホルモンを測定するように意図された免疫酵素検定法（immunoenzymometric assay）（一般に「ＥＬＩＳＡ」又は酵素結合免疫吸着と呼ばれる）に用いるのに特に適したＭＡｂを開示する。
【００３１】
本発明の実施に有用なＭＡｂには、ガストリン１７（Ｇ１７）のＮ末端に、アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（配列番号５）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３２】
同じく本発明の実施に有用なＭＡｂには、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に、アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３３】
別の態様において、本発明の実施に有用なＭＡｂには、ヒトガストリン３４（ｈＧ３４）のＮ末端に、アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３４】
さらに別の態様において、本発明の実施に有用なＭＡｂには、グリシン伸長型ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長型ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に、アミノ酸配列ＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号８）内のエピトープで選択的に結合するＭＡｂが含まれる。
【００３５】
本発明の実施に有用なＭＡｂは、好ましくは、それらが約１０６〜約１０７ＬＭ−１の結合定数（Ｋａ）で選択的な結合を示すガストリンホルモン形に結合し、好ましくはＭＡｂは、約１０７〜約１０８ＬＭ１、さらにより好ましくは約１０８〜約１０９ＬＭ１、なおさらに好ましくは約１０９〜約１０１０ＬＭ１、そしてより一層好ましくは約１０１０〜約１０１１ＬＭ１、そして最も好ましくは約１０１１〜約１０１２ＬＭ１のＫａでガストリンホルモン形に結合する。
【００３６】
本発明の方法に従って分析されるべき試料は、好ましくは哺乳類からの生体液の試料であり、この試料は、検出、定量、又は決定されるべきペプチドの量を含有しているか、あるいは含有していると思われる。好ましくは、試料はガストリンホルモンを少なくとも１種のガストリンホルモン形で含有する。最も好ましくは、保存剤が試料に添加されていて試料混合物を形成しており、そして試料混合物は、哺乳類からの試料採取より約１分〜約１５分の間の時間内で凍結されている。
【００３７】
本明細書中使用される場合、結合に「適した条件」は、抗体のその同種抗原への結合、及びマーカー酵素標識が検出剤として用いられる抗体と抱合する反応であるマーカー酵素標識の酵素反応を許容する、温度、ｐＨ、及びイオン強度の条件を意味する。抗体抗原結合についての、及び各種マーカー酵素反応についてのそのような適した条件は、当業者に既知であり、そして過度の実験を行うことなく日常的な方法で、各反応について具体的に決定され得る。
【００３８】
本明細書中使用される場合、「検出可能なマーカー抱合抗体」は、任意の標識化抗体を意味し、ここで標識は、例えば酵素標識などの検出可能な信号を提供するか、例えば放射能標識、酵素標識、蛍光若しくは発光標識などの検出可能な信号、又はアビジン抱合部分により検出可能なビオチン標識などの別々に検出され得る部分を提供することによりそれ自身が検出され得る第二の標識化抗体などの別の薬剤で検出され得る。
【００３９】
本明細書中使用される場合、「検出可能なマーカー抱合抗体複合体」は、その同種抗原と結合した、検出可能なマーカーが抱合した抗体を含む複合体であり、同種抗原は例えばガストリンホルモンであってもよい。そのようなガストリンホルモン抗体複合体は、測定され得る検出可能な信号を提供し、そして検出可能な抗体の濃度に直接関連している。好適な濃度範囲にわたって、信号は検出可能なマーカー抱合抗体複合体の濃度に直接比例する。
【００４０】
本明細書中使用される場合、「展開試薬」は、抗体抱合酵素により展開される試薬を意味する。例えば、アルカリホスファターゼの展開試薬はｐＮＰＰであり得る。
【００４１】
本発明は、全（結合及び遊離）ガストリンホルモンを測定するアッセイ法及びガストリンホルモン遮断治療の評価法を提供する。これらのアッセイ法を以下に記載する。患者におけるガストリンホルモン遮断治療の評価法は、１つの治療レジメンを続けるのかそれとも別のものにするかを決定する時機が患者の転帰にとって重要であり得る実際の臨床で特に価値がある。本発明の方法は、これらの臨床上の判断の基礎となる情報を提供する。本方法は、治療前又は治療の初期段階（例えば、米国特許第５，６２２，７０２号に記載されるような、ガストリンホルモンペプチド抱合ワクチンでの接種直後）のガストリンホルモンの測定を提供し、また、治療が効果を上げ始めたと期待される期間後の全及び／又は遊離ガストリンホルモンの１つ以上の測定を提供する。
【００４２】
分析方法
以下は、ヒト血漿などの生体液中に存在する全（非複合化＋抗体複合化）又は遊離（非複合化）ヒトガストリンホルモン（Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、Ｇ３４、又はＧ３４−Ｇｌｙ）のいずれかを決定するための、アッセイされているガストリンホルモンの特定の分子形のＣ末端又はＮ末端に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を用いることによる、本発明の分析法（免疫酵素検定法）の記載である。あるいは、分子のＣ末端又はＮ末端に対するポリクローナル抗体の組合せが、分子のＮ末端又はＣ末端それぞれに対するモノクローナル抗体と組み合わせて用いられてもよい。
【００４３】
以下に記載されるアッセイにおいて、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｆ９６ ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４３９４５４）検査プレートを用い、また抗体コーティング溶液をホウ酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％アジ化ナトリウム含有）で調製した。
【００４４】
１．プレートコーティング：検査されるべき特定のヒトガストリン分子形に対して選択的な抗体を、最適濃度で、検査プレートのマイクロウェル表面にコーティングした。
【００４５】
最適抗体濃度は、アッセイされるべき形の標準ガストリンホルモンの既知濃度を用いて標準曲線を作ることにより決定し、標準曲線は必要とされる有用な濃度範囲にわたって、必要とされる感度と正確さを有する。Ｇ１７については、アッセイの有用なＧ１７濃度範囲は、一般に、バックグラウンド（約４ｐＭ又はそれ未満）〜約２５ｐＭ又は約５０ｐＭまでである。しかしながら、ガストリン産生腫瘍の患者では、血漿ガストリンホルモンレベルは、８００ｐＭもの高さ、又は１０００ｐＭ（１．０マイクロモル）でさえあり得る。必要とされる範囲にわたる適切な感度及び精度の決定は、過度の実験を行うことなく当業者により容易に決定され得る。
【００４６】
２．プレート洗浄：コーティング溶液を除去して洗浄緩衝液（１ウェルあたり約４００μｌ）を添加し、そして除去する。この洗浄サイクルを、必要とされる回数繰り返す。洗浄緩衝液は、０．０１０Ｍのリン酸緩衝液；０．００２７Ｍの塩化カリウム、及び０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４、０．０１％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有）であった。プレート洗浄は自動化されてもよい（以下に記載されるアッセイでは、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｗｅｌｌｗａｓｈ ４Ｍｋ２、Life Sciences International (UK) Ltd, Basingstoke, UK を用いた）。
【００４７】
３．プレートブロッキング：タンパク質及び洗浄剤（コーティング緩衝液中１％のＢＳＡ／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含有するブロッキング緩衝液をマイクロウェルに添加する。プレートはこの形で貯蔵されてもよい。
【００４８】
４．試料及び標準の添加：プレートを上記に記載のとおりに洗浄する。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン、及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を各ウェルに添加する（１００μＬ／ウェル）。検査標準（例えば標準ガストリンホルモンの量を増やしながら添加していったガストリン欠乏血漿など）及び検査血漿試料をウェルに添加する（２０μＬ／ウェル）。名目上４℃で一晩反応を進行させる。血清試料のガストリン欠乏は、試料を室温で一晩放置することにより、容易に達成される。
【００４９】
全ガストリンホルモン（抗体結合ガストリンホルモンを含む）がアッセイされるべきこれらのアッセイにおいて、乖離ペプチドＧ１７（１−９）（１００μｇ／ｍｌ）は、アッセイ緩衝液、すなわちウサギＩｇＧＥＤＴＡ混合物中に含まれる。
【００５０】
５．抱合体の添加：洗浄に続いて、酵素標識と抱合した、アッセイされるべきガストリンホルモン形のＮ末端に対して特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含有するアッセイ緩衝液、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加する。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。検出化合物の展開に用いるのに適した酵素基質の例として、アルカリホスファターゼについてニトロ−フェニルリン酸、又は西洋ワサビペルオキシダーゼについてテトラメチルベンジジンスルフォネート（ＴＭＢＳ）が挙げられる。色展開の程度は、吸光単位（ＡＵ、ｐ−ニトロフェノールの場合は４０５ｎｍで、ＴＮＢＳの場合は４５０ｎｍで読む）として読まれ（sread）、検査試料中に存在するＧ１７の量を示しており、そして実際の濃度は、検査試料の吸光度を、濃度既知のガストリンホルモンを用いて作られた標準曲線に対して読むことにより決定される。
【００５１】
７．読み取り：十分なアッセイシグナルが得られたら、シグナルを、例えばマイクロプレート分光光度計又は蛍光光度計（fluorimeter）で測定する。
【００５２】
８．データ処理：ガストリンホルモン形の既知標準溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築する。較正曲線を用いて、検査試料中のガストリンホルモン形の濃度を内挿する。
【００５３】
全ガストリンホルモン形及び遊離ガストリンホルモン形の量を決定する特定のアッセイプロトコルを以下に記載する。
【００５４】
全Ｇ１７の決定
このアッセイでは、ヒトガストリン１７のＣ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、乖離ペプチドＧ１７（１９）（１００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。検査標準（０−４．１−１０．２−２６．６−６４−１６０−４００−１０００ｐＭのＧ１７が添加されたガストリン欠乏血漿）及び検査血漿試料をウェルに添加した（２０μＬ／ウェル）。反応を、冷蔵庫中、名目上４℃で、一晩進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７のＮ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。洗浄に続いて、上記に記載されるとおり、色素生産性基質（ｐＮＰＰ）を添加し、プレートをインキュベートして色を展開させ、そしてプレート読み取り機で読み取った。既知の標準Ｇ１７溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築した。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ１７濃度を内挿した。代表的な較正曲線を図１に示す。
【００５５】
遊離Ｇ１７の決定
ヒトガストリン１７分子のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液に調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を添加して、マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、酵素標識としてのアルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７のＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、上記に記載されるとおり、色素生産性基質（ｐＮＰＰ）を添加し、プレートをインキュベートして色を展開させ、そしてプレート読み取り機で読み取った。上記に記載される全Ｇ１７のアッセイのように、既知の標準Ｇ１７溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築した。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ１７濃度を内挿した。代表的な較正曲線を図２に示す。
【００５６】
全Ｇ１７−Ｇｌｙ抗体の決定
上記に記載されるとおり、ヒトグリシン伸長型ガストリン１７分子のＣ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。プレートを記載されるとおりに洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）、乖離ペプチドＧ１７（１９）（１００μｇ／ｍｌ）、及びＥＤＴＡ（３．４ｍＭ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）を各ウェルに添加した（例えば１００μＬ／ウェル）。検査標準（０−４．１−１０．２−２６．６−６４−１６０−４００−１０００ｐＭのＧ１７−ＧｌｙでＧ１７−Ｇｌｙが添加されたガストリン欠乏血漿）及び検査血漿試料をウェルに添加した（例えば２０μＬ／ウェル）。反応を、名目上４℃で、一晩進行させた。続く工程は、全Ｇ１７のアッセイで上記に記載されたままであった。
【００５７】
遊離Ｇ１７−Ｇｌｙ抗体の決定
Ｇ１７−Ｇｌｙ分子のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。記載される通りにプレートを洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）（例えば１００μｌ／ウェル）、続いて試料／標準（例えば５０μｌ／ウェル）を添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ１７−ＧｌｙのＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。続く工程は、遊離Ｇ１７のアッセイで上記に記載されたまさにそのままであった。
【００５８】
Ｇ３４の決定
ヒトガストリン３４のＮ末端に特異的な抗体で、検査プレートのマイクロウェル表面をコーティングした。プレート洗浄及びプレートブロッキングを、上記の一般法で記載されるとおりに行った。記載される通りにプレートを洗浄した。ウサギＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液（洗浄緩衝液で調製した、１％のＢＳＡ、０．１％のウシγ−グロブリン及び２００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン）（例えば１００μｌ／ウェル）、続いて試料／標準（例えば５０μｌ／ウェル）を添加した。マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。洗浄に続いて、アルカリホスファターゼと抱合した、Ｇ３４のＣ末端に特異的なモノクローナル抗体、及びウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するアッセイ緩衝液を各ウェルに添加して、マイクロプレートシェーカーを用いて震盪させながら、反応を室温（名目上＋２２℃）で進行させた。色素生産性基質（ｐＮＰＰ）の添加、そしてプレート読み取り機を用いたプレートウェル中の試料シグナルの読み取り、及び続くデータ処理は上記に記載されるとおりであった。既知の標準Ｇ３４溶液で得られたアッセイシグナルを用いて較正曲線（シグナル対濃度）を構築する。この較正曲線を用いて、検査試料中のＧ３４濃度を内挿する。
【実施例】
【００５９】
〔実施例１〕
既知量のガストリン１７を添加してあるガストリン欠乏血清試料における、全ガストリン１７の決定。
血清を一晩室温に放置して、存在するガストリンホルモンを内因性プロテアーゼにより完全に分解させることにより、ガストリンホルモンを欠乏させた。
【００６０】
アッセイ内の精度と確度を決定するために、既知量の標準ガストリン１７（Ｇ１７）を、複製した分取量のガストリン欠乏血清試料に添加して、表１に示される正常濃度とした。抗ガストリンホルモン抗体含有血清試料についてと同様な手順で、Ｎ末端ガストリンペプチドを用いて全Ｇ１７についてアッセイを行った。Ｎ末端ガストリンペプチドＧ１７（１−９）を、上記に記載される通り、１００μｇ／ｍｌの濃度で、試料及び標準の添加の工程で添加した。結果は、表１に提供されるが、アッセイがＥＬＩＳＡ法の許容限度内でＧ１７を正確に定量したことを示し、このＥＬＩＳＡ限度は、＋２０％の相対誤差である。より大事なことは、患者で通常見られる濃度（上記に記載されるとおり）である１００ｐＭ以下のＧ１７濃度で、アッセイがもっとも正確であることである。
【００６１】
【表１】
【００６２】
〔実施例２〕
既知量のガストリン１７を添加してあるガストリン欠乏血清試料における、遊離ガストリン１７の決定。
このアッセイは、遊離ガストリン１７（Ｇ１７）の決定について上記の「アッセイ手順」で記載された方法に従って行った。結果は、表２に提供されるが、アッセイがＥＬＩＳＡ法の許容限度内で遊離Ｇ１７を正確に定量したことを示す。より大事なことは、患者に通常見られる濃度である１００ｐＭ以下のＧ１７濃度で、アッセイがもっとも正確であることである。
【００６３】
【表２】
【００６４】
〔実施例３〕
ガストリン１７安定性
ガストリンの室温（約２２℃）での安定性を、試料を調製して１５ｐＭ、１００ｐＭ、及び６００ｐＭの既知Ｇ１７濃度にした直後（０時間試料）、及びベンチ上室温で２時間後の、全Ｇ１７を測定することにより、上記に記載されるとおりの全ガストリンアッセイで評価した。結果は、試料それぞれでＧ１７濃度が実質的に減少していることを実証し、以下の表３に示される。このことは、ガストリンホルモンについて試料を検査する本発明のアッセイ方法を用いて得られたガストリン値の確度に対して、血漿が患者血液試料から調製されるときに温度上昇への曝露を最小限にすることを含む、適切な試料取り扱い技術の重要性を実証する。
【００６５】
【表３】
【００６６】
［参照としての援用］
本明細書中に記載される全ての特許及び文献は、その全体が参照として本明細書により明示的に援用される。
【００６７】
［ハイブリドーマ細胞株の寄託］
本発明の特定ＭＡｂを産生する以下のハイブリドーマは、２００４年３月２５日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス）の寄託となった。
１．ＭＡｂ４００−１産生ハイブリドーマ４００−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
２．ＭＡｂ４００−２産生ハイブリドーマ４００−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
３．ＭＡｂ４００−３産生ハイブリドーマ４００−３は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
４．ＭＡｂ４００−４産生ハイブリドーマ４００−４は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
５．ＭＡｂ４０１−２産生ハイブリドーマ４０１−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
６．ＭＡｂ４４５−１産生ハイブリドーマ４４５−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
７．ＭＡｂ４４５−２産生ハイブリドーマ４４５−２は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
８．ＭＡｂ４５８−１産生ハイブリドーマ４５８−１は寄託番号＊＊＊＊が割り当てられた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】全ガストリン１７についての代表的な較正曲線であり、色素生産性基質としてテトラメチルベンジジンスルフォネート（ＴＭＢＳ）を用いた酵素触媒展開に続いて４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度に対してプロットされたピコモルオーダーのガストリン濃度を示す。
【図２】遊離ガストリン１７についての代表的な較正曲線であり、上記のように４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度に対してプロットされたピコモルオーダーのガストリン濃度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、
（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、
（ｃ）Ｎ末端配列ガストリンペプチドの存在下、該試料中の前記ガストリンホルモンが前記抗体に結合するのに適した条件で、前記ガストリンホルモンに結合した前記抗体の固定化複合体を生成させるために、前記試料をインキュベートする工程と、
（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、未結合の抗体及びＮ末端配列ガストリンペプチドを除去するために、及び前記複合体をガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合し、検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を形成させるために、適した検出可能なマーカー抱合抗体とともにインキュベートする工程と、
（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、
（ｆ）前記生体液試料中の前記ガストリンホルモンの全量を決定するために、該展開試薬を測定する工程
とを含む、生体液試料中のガストリンホルモンの全量を決定する方法。
【請求項２】
（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、
（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、
（ｃ）前記試料中の前記ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した前記抗体の固定化複合体を生成させるために、前記試料をインキュベートする工程と、
（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、未結合の抗体を除去するために、及び該複合体を、ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、
（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、
（ｆ）該展開試薬を測定し、前記生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する工程
とを含む、生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する方法。
【請求項３】
前記体液は血清である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ末端選択性抗体及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体はモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガストリンホルモンはＧ１７又はＧ１７−Ｇｌｙであり、かつ前記Ｃ末端選択性抗体及び前記Ｎ末端選択性抗体はＧ１７に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体、又はハイブリドーマ４４５−１（ＡＴＣＣ寄託番号＃）若しくはハイブリドーマ４４５−２（ＡＴＣＣ寄託番号＃）により産生された該モノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ−末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４００−１、４００−２、４００−３、若しくは４００−４のいずれか１種により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生された前記モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４００−１、４００−２、４００−３、若しくは４００−４のいずれか１種により産生された前記モノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガストリンホルモンはＧ３４又はＧ３４−Ｇｌｙであり、かつ前記Ｃ末端選択性抗体及び前記Ｎ末端選択性抗体はＧ３４又はＧ３４−Ｇｌｙに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体、又はハイブリドーマ４４５−１（ＡＴＣＣ寄託番号＃）若しくはハイブリドーマ４４５−２（ＡＴＣＣ寄託番号＃）により産生された該モノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４０１−２により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生された前記モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４０１−２により産生された前記モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、
（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、
（ｃ）Ｎ末端配列ガストリンペプチドの存在下、該試料中の前記ガストリンホルモンが前記抗体に結合するのに適した条件で、前記ガストリンホルモンに結合した前記抗体の固定化複合体を生成させるために、前記試料をインキュベートする工程と、
（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、未結合の抗体及びＮ末端配列ガストリンペプチドを除去するために、及び前記複合体をガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合し、検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を形成させるために、適した検出可能なマーカー抱合抗体とともにインキュベートする工程と、
（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、
（ｆ）前記生体液試料中の前記ガストリンホルモンの全量を決定するために、該展開試薬を測定する工程
とを含む、生体液試料中のガストリンホルモンの全量を決定する方法。
【請求項２】
（ａ）患者からガストリンホルモン含有生体液試料を得る工程と、
（ｂ）該ガストリンホルモンのＣ末端エピトープに選択的に結合する固定化抗体を提供する工程と、
（ｃ）前記試料中の前記ガストリンホルモンが該抗体に結合するのに適した条件で、該ガストリンホルモンに結合した前記抗体の固定化複合体を生成させるために、前記試料をインキュベートする工程と、
（ｄ）該固定化複合体を洗浄し、未結合の抗体を除去するために、及び該複合体を、ガストリンホルモンのＮ末端エピトープに選択的に結合するために、適した検出可能なマーカー抱合抗体と反応させる工程と、
（ｅ）該検出可能なマーカー抱合固定化抗体複合体を洗浄し、及び展開試薬とともにインキュベートする工程と、
（ｆ）該展開試薬を測定し、前記生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する工程
とを含む、生体液試料中の遊離ガストリンホルモン量を決定する方法。
【請求項３】
前記体液は血清である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ末端選択性抗体及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体はモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガストリンホルモンはＧ１７又はＧ１７−Ｇｌｙであり、かつ前記Ｃ末端選択性抗体及び前記Ｎ末端選択性抗体はＧ１７に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体、又はハイブリドーマ４４５−１（ＡＴＣＣ寄託番号＃）若しくはハイブリドーマ４４５−２（ＡＴＣＣ寄託番号＃）により産生された該モノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ−末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４００−１、４００−２、４００−３、若しくは４００−４のいずれか１種により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生された前記モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４００−１、４００−２、４００−３、若しくは４００−４のいずれか１種により産生された前記モノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガストリンホルモンはＧ３４又はＧ３４−Ｇｌｙであり、かつ前記Ｃ末端選択性抗体及び前記Ｎ末端選択性抗体はＧ３４又はＧ３４−Ｇｌｙに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体、又はハイブリドーマ４４５−１（ＡＴＣＣ寄託番号＃）若しくはハイブリドーマ４４５−２（ＡＴＣＣ寄託番号＃）により産生された該モノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４０１−２により産生されたモノクローナル抗体の特徴を有する該モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４５８−１により産生された前記モノクローナル抗体であるか、及び／又は前記Ｎ末端選択性抗体は、ハイブリドーマ４０１−２により産生された前記モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２１５６９（Ｐ２００６−５２１５６９Ａ）
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９４６５（Ｐ２００６−５０９４６５）
【出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９６６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８８３２６
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５００５２２９０９）アフトン コーポレーション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９６６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８８３２６
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５００５２２９０９）アフトン コーポレーション (5)
【Ｆターム（参考）】
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