キナーゼ活性検出法
【課題】 新たなキナーゼ活性検出法を提供する。
【解決手段】 キナーゼをペプチドに作用させるステップ、導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ、前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ、及び導入された標識物質を検出するステップを含んでなるキナーゼ活性検出法が提供される。
【解決手段】 キナーゼをペプチドに作用させるステップ、導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ、前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ、及び導入された標識物質を検出するステップを含んでなるキナーゼ活性検出法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキナーゼ活性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質のリン酸化、脱リン酸化は、生体内のシグナル伝達において、最も重要なものの一つであり、細胞の分化、増殖、細胞死に至るまで様々な生命活動に関与している。例えば、細胞の腫瘍化に、SrcやRafといったキナーゼが関与していることはよく知られている。このように、多くのキナーゼが重要な役割を果たしていることが明らかにされているが、すでに同定されたキナーゼでさえ、どの蛋白質を基質とするか、どのようなアミノ酸配列を認識してリン酸化するのか、といった基礎的知見を欠くものが少なくない。全遺伝子の2〜3パーセントがキナーゼをコードしているというヒトゲノム計画の結果からも明らかなように、「リン酸化」という翻訳後修飾の持つ一般性と重要性は非常に大きい。
キナーゼ活性の検出法は多数報告されているが、原理的に２種類に分類できる。放射性同位元素（RI）でラベルされたATP（[γ-32P]ATP）を用いる方法と、リン酸化アミノ酸を認識する抗体を用いる方法である。前者は、キナーゼによる基質蛋白質／ペプチドのリン酸化反応後、基質に取り込まれた32Pの放射能を測定してキナーゼ活性を定量化する。この方法は、広範に用いられているが、RIを用いるため危険性が高い上に、相応の施設を必要とするという問題点がある。後者は、リン酸化されたペプチドを抗体で認識する方法である。この方法は、安全かつハイスループットスクリーニング（HTS）に応用可能であるが、“リン酸化された”アミノ酸を“特異的”に認識する抗体を作成する必要があり、汎用性、コスト面に問題があると考えられる。
最近、細胞内でリン酸化される蛋白質を一斉検出する目的で、リン酸基の反応性に着目した手法が報告された。細胞抽出物に化学的処理を施して、リン酸化蛋白質を化学変換、分離後、質量分析法でリン酸化部位を推測するというものである（非特許文献１及び２）。この方法の有用性を現時点で判断することは出来ないが、リン酸化以外の多様な翻訳後修飾を含む、多種類の蛋白質を対象としているため、結果の解釈に注意を要すると思われる。また浜地らは近年、シンプルな亜鉛錯体がリン酸基を認識し、蛍光性に変化することを見出している（非特許文献３）。だが、その蛍光プローブは、キナーゼの基質の１つであるATPにも強く応答したり、リン酸化されるペプチドの配列により感度が大きく異なる等、実用化に向けて解決すべき問題点がいくつかある。これらは、リン酸基の化学的性質に着目した数少ない例であるが、いずれもキナーゼ活性の検出を目標としたものではない。
ごく最近、Molecular Probe社より、“Pro-Q Diamond”なるリン酸化アミノ酸検出蛍光試薬が発売された（非特許文献４）。文献等を参照する限り、非常に優れたプローブと考えられるが、その構造、検出原理等は、一切秘匿されているため、その有用性の正確な評価は現時点では難しい。
【０００３】
【非特許文献１】H. Zhou, J. D. Watts, R. Aebersold, Nat. Biotechnol. 2001, 19, 375-378.
【非特許文献２】Y. Oda, T. Nagasu, B. T. Chait, Nat. Biotechnol. 2001, 19, 379-382.
【非特許文献３】A. Ojida, Y. Mito-oka, K. Sada, I. Hamachi, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 2454-2463.
【非特許文献４】K. Martin, T. H. Steinberg, L. A. Cooley, K. R. Gee, J. M. Beechem, W. F. Patton, Proteomics 2003, 3, 1244-1255.
【非特許文献５】M. E. M. Noble, J. A. Endicott, L. N. Johnson, Science 2004, 303, 1800-1805.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上の背景の下、本発明は新たなキナーゼ活性検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明者らは検討を重ねた。まず、今まであまり注目されていなかった、リン酸化アミノ酸の化学的性質に着目した。一般に、リン酸化を受けるアミノ酸は、セリン、スレオニン、チロシンの３種であるが、セリンースレオニンキナーゼが、その大多数を占めることが知られている。そこで、セリンースレオニンキナーゼを対象としたキナーゼ活性検出方法の開発を試みた。その結果、新たな原理に基づく検出方法を完成するに至った。本発明は、この成果に基づくものであって、以下の構成を提供する。
以下の各ステップを含んでなるキナーゼ活性検出法：
キナーゼをペプチドに作用させるステップ；
導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ；
前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ；及び
導入された標識物質を検出するステップ。
本発明の一態様では、前記キナーゼが、セリン−スレオニンキナーゼであることを特徴とする。
また、本発明の一態様では、前記標識物質が蛍光性物質であることを特徴とする。
更に、本発明の一態様では、前記標識物質がＳＨ基等の求核性官能基を有することを特徴とする。
更に、本発明の一態様では、前記ペプチドが不溶性支持体に固定されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検出方法は、リン酸化アミノ酸そのものを検出するので汎用性が高いという利点を持つ。そのため、例えば、各種キナーゼの特異的基質の同定や、特異的阻害剤のハイスループットスクリーニングなど、広範囲な用途への適用が期待される。また、既存のキナーゼ活性検出法と併用することで、目的とするキナーゼがセリンースレオニンキナーゼか、チロシンキナーゼであるか判定することも可能である。さらに、現存するキナーゼ活性の検出法と比し、本発明の検出方法は簡便な検出を可能し、低コスト化も図られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施例（実験例を含む）を説明する。
【実施例１】
【０００８】
＜実験方法＞
１．蛍光性化合物の合成
用いた試薬の多くはTCI、WAKO、nacalaiから市販さられているものを、DIPEAについてはWatanabe Chemから市販されているものを使用し、特に精製を行うことなく使用した。反応や再結晶には蒸留した溶媒を用いた。
【０００９】
１−１．化合物１の合成
【化１】
【００１０】
Resorcinol (1.00 g; 9.1 mmol) を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、conc. H2SO4 (10 mL)、4-chloroacetoacetic acid ethyl ester (1.65 g; 10.0 mmol)を加えて、室温で、一晩、遮光して撹拌した。氷冷した水(55 mL)に反応混合物を滴下し、析出物をろ取、減圧乾燥し、0.88 gの白色固体を得た。Y. 46 %
1H NMR (DMSO-d6): d 4.96 (s, 2H); 6.43 (s, 1H); 6.76 (d, 1H, J = 2.3 Hz); 6.84 (dd, 1H, J = 2.3, 8.8 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz).
MS FAB (NBA): 211 (M + 1)
【化２】
【００１１】
原料 (200 mg; 0.95 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (8 mL)、thioacetic acid (86 mg; 1.13 mmol)、DIPEA (146 mg; 1.13 mmol)を加えて、室温で遮光し、90 min撹拌した。溶媒を濃縮し、残渣をCH2Cl2に溶解し、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 2/3)により精製した。230 mgの白色固体を得た。Y. 97 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.40 (s, 3H); 4.26 (s, 2H); 6.24 (s, 1H); 6.74 (d, 1H, J = 2.4 Hz); 6.81 (dd, 1H, J = 2.4, 8.8 Hz); 7.60 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.64 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 251 (M + 1)
一部CH3CNで再結晶
Anal. Calcd for C12H10O4S: C, 57.59; H, 4.03; N, 0.00. Found: C, 57.78; H, 4.09; N, 0.00.
【化３】
【００１２】
原料 (1.19 g; 4.75 mmol)を300 mL三頚ナスフラスコにいれ、methanol (120 mL)に溶解し、脱気、 Ar置換後、0.25 g/mL NaOH水溶液 (2.2 mL; 13.75 mmol)を加えて、室温で遮光し、50 min撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした。Methanolを濃縮し、EtOAcで抽出(40, 30, 30 mL)後、brine wash (30 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanolに溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol/CH2Cl2)により精製した。0.84 gの白色固体を得た。Y. 85 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.19 (t, 1H, J = 7.9 Hz); 3.87 (d, 2H, J = 7.9 Hz); 6.28 (s, 1H); 6.73 (d, 1H, J = 2.2 Hz); 6.81 (dd, 1H, J = 2.2, 8.7 Hz); 7.71 (d, 1H, J = 8.7 Hz); 10.60 (s, 1H).
MS FAB (M + 1): 209 (M + 1)
一部EtOAcで再結晶
Anal. Calcd for C10H8O3S: C, 57.68; H, 3.87; N, 0.00. Found: C, 57.43; H, 3.99; N, 0.00.
【００１３】
１−２．化合物２の合成
【化４】
【００１４】
3-Aminophenol (2.18 g; 20 mmol)を100mL二頚ナスフラスコにいれ、EtOAc (30 mL) を加えて30 min 還流した。Phenyl chloroformate (1.72 g; 11 mmol)を20 minかけて滴下して加え、さらに1h還流した。反応中生じた白色沈殿をろ去し、ろ液を濃縮した。減圧乾燥し、2.30 g の白色固体を得た。Y. quant
1H NMR (DMSO-d6): d 10.10 (s, 1H); 9.43 (s, 1H); 7.45-7.40 (m, 2H); 7.28-7.20 (m, 3H); 7.10-7.04 (m, 2H); 6.91 (d, 1H, J = 4.23 Hz); 6.44 (d, 1H, J = 4.23 Hz)
MS FAB (NBA): 230 (M + 1)
【化５】
【００１５】
原料 (3.00 g; 13.1 mmol)を100 mL二頚ナスフラスコにいれ、80 % H2SO4 (40 mL)、4-chloroacetoacetic acid ethyl ester (2.37 g; 14.4 mmol)を加えて、室温で、6.5h遮光して撹拌した。氷冷したした水(50 mL)に反応混合物を滴下し、析出物をろ取した。これをethanolで再結晶し、白色固体1.92 gを得た。Y. 45 %
1H NMR (DMSO-d6): d 4.99 (s, 2H); 6.55 (s, 1H); 7.25-7.30 (m, 3H); 7.42-7.49 (m, 3H); 7.61 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 7.81 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.80 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 330 (M + 1)
Anal. Calcd for C17H12ClNO4: C, 61.92; H, 3.67; N, 4.25. Found: C, 61.67; H, 3.75; N, 4.38.
【化６】
【００１６】
原料 (330 mg; 1.00 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (10 mL)、thioacetic acid (84 mg; 1.1 mmol)、DIPEA (142 mg; 1.1 mmol)を加えて、室温で遮光し、2 h撹拌した。溶媒を濃縮し、残渣をCH2Cl2に溶解し、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 2/3)により精製した。354 mgの白色固体を得た。Y. 96 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.39 (s, 3H); 4.29 (s, 2H); 6.35 (s, 1H); 7.25-7.30 (m, 3H); 7.42-7.46 (m, 3H); 7.59 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.77 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 370 (M + 1)
一部CH3CNで再結晶
Anal. Calcd for C19H15NO5S: C, 61.78; H, 4.09; N, 3.79. Found: C, 61.55; H, 4.05; N, 4.03.
【化７】
【００１７】
原料 (790 mg; 2.14 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist.THF (50 mL)、10 M NaOH水溶液 (860 μL; 8.6 mmol)を加えて、室温で遮光し、45 min撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした(pH4-5)。THFを濃縮し、0.2 M pH7 sodium phosphate bufferを加えて中性とした。EtOAcで抽出(70 mL×3)後、brine wash (50 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol/CH2Cl2)より精製した。240 mgの黄色固体を得た。Y. 54 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.11 (t, 1H, J = 8.2 Hz); 3.79 (d, 2H, J = 8.2 Hz); 6.05 (s, 1H); 6.17 (bs, 2H); 6.42 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 6.56 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz); 7.50 (d, 1H, J = 8.7 Hz).
MS FAB (NBA): 208 (M + 1)
【００１８】
１−３．化合物３の合成
【化８】
【００１９】
原料 (500 mg; 2.40 mmol)を100 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (50 mL)、methyl vinyl ketone (190 mg; 2.76 mmol) 、0.25 M NaOH / methanol (0.95 mL; 0.24mmol)を加えて、室温で遮光し、4 h撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした。溶液を濃縮し、残渣をEtOAc (200 mL)に溶解後、brine wash (40 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol / CH2Cl2)により精製した。521 mgの白色固体を得た。Y. 78 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.07 (s, 3H); 2.61 (t, 2H, J = 7.0 Hz); 2.76 (t, 2H, J = 7.0 Hz); 3.89 (s, 2H); 6.25 (s, 1H); 6.72 (d, 1H, J = 2.3 Hz); 6.80 (dd, 1H, J = 2.3, 8.8 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.58 (s, 1H)
MS FAB (NBA): 279 (M + 1)
【００２０】
１−４．化合物４の合成
【化９】
【００２１】
原料 (30 mg; 0.14 mmol)、potassium tert-butoxide (1.6 mg; 0.014mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、THF (5 mL)、methyl vinyl ketone (11 mg; 0.15 mmol)を加えて、室温で遮光し、17 h撹拌した。氷冷下0.2 M pH7 sodium phosphate buffer (10 mL)を加え、反応溶液を中性とした(約pH7-8)。THFを濃縮し、EtOAcで抽出(30, 20, 20 mL)後、brine wash (20 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 1/1)より精製した。25 mgの黄色固体を得た。Y. 64 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.11 (t, 1H, J = 8.2 Hz); 3.79 (d, 2H, J = 8.2 Hz); 6.05 (s, 1H); 6.17 (bs, 2H); 6.42 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 6.56 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz); 7.50 (d, 1H, J = 8.7 Hz).
MS FAB (NBA): 278 (M + 1)
【００２２】
２．蛍光測定
合成した化合物群の蛍光は、日立F4500蛍光度計を用いて測定した。各化合物の5 mM DMSO溶液を調製し、glycine/NaOH緩衝液（pH 9.4）或いはナトリウムリン酸バッファー（pH 2-12）に希釈して測定に供した。励起波長は、360 nm、蛍光波長は465 nmで、室温下測定した。
【００２３】
３．ペプチド合成
実験に用いたペプチドは一般的なFmocペプチド固相合成法に従い、以下のスキームのように合成した。Fmocアミノ酸のカップリングが完全に進行したか否かをカイザーテストで確認し、不完全な場合はカップリング時間の延長、或いは試薬の再添加を行った。
【００２４】
Fmocアミノ酸類(Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser{OP(OBzl)OH}-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH)及びペプチド合成用試薬は特に記さない限り、Watanabe Chem、WAKOで市販されているものを用いた。アッセイに用いたPKAはSigmaのcAMP dependent protein kinase catalytic subunit from bovine heartを、その他の試薬はWAKOで市販されているものを用いた。
【００２５】
ペプチド合成には、目的に応じて以下のレジンを用いた。
C末端をアミド化してビーズから切り離したペプチド調製用レジン;
TentaGel S RAM (0.3 mmol/g); Advanced ChemTech
ビーズ上固定化ペプチド合成に用いたレジン
TentaGel S NH2 (0.3 mmol/g); Advanced ChemTech
Amino PEGA Resin (PEGA800; 0.4 mmol/g); Novabiochem
PL-PEGA Resin (PEGA1900; 0.2 mmol/g, 300-500 mm, 30-50 mesh); Polymer Laboratories
【化１０】
【００２６】
４．溶液条件でのβ脱離条件検討
固相合成したAc-LRRASLG-NH2、Ac-LRRApSLG-NH2を用いて条件検討を行った。加える塩基の種類、濃度あるいは緩衝液によりpHを制御する等、塩基条件を変化させ、酢酸で反応を終了させた後にHPLCで分析した。HPLCの分析条件は以下の通りである。
使用カラム; Inertsil ODS-3
展開溶媒１; 0.1 % TFA水溶液 展開溶媒２; 0.1 % TFAアセトニトリル溶液
グラジエント; 展開溶媒１/展開溶媒２ [90 / 10→65 / 35 (25 min)]
流速; 1mL/min
【００２７】
５．ビーズ担持ペプチドを用いた検討
５−１．酵素反応
1.5 mLエッペンドルフチューブにAc-LRRASLGペプチドを固相合成したビーズをとり、水(10 min×3)、キナーゼ反応緩衝液(KB; pH 6.8, 30 mM MES, 10 or 15 mM MgCl2, 0.4 mg/mL BSA)(10 min×3)で洗浄後、KB中、室温で12 hプレインキュベーションした。KB (10 min×2)で洗浄後、ATP及びPKAの最終濃度が、それぞれ200 or 300 μM、30, 50 or 70 units/mLとなるように調製し、室温（25 ℃)で10 hシェーカー上で振盪した。阻害剤を添加する場合、所定の濃度の阻害剤を反応液に添加し、同様に室温で10 h振盪した。反応終了後、洗浄用緩衝液(WB; 50 mM pH 7.2 PBS, 0.68 M NaCl, 13 mM KCl, 0.05 % Tween20)でビーズを洗浄(10 min×2、1 h×2、5 min×2)した後、さらに水で洗浄(10 min×2、1 h×2、5 min×2)した。
【００２８】
５−２．β脱離
洗浄後のビーズをH2O/DMSO/EtOH = 4/3/1溶液中NaOH 濃度0.1 Mで室温(25℃)、1 hシェーカー上で振盪した。反応溶液を除去後、氷冷した10 % AcOH/H2Oを加えて反応を終了した。その後、水で洗浄(1 min×5)した。
【００２９】
５−３．マイケル付加反応
β脱離反応後、洗浄したビーズにH2O/DMSO/EtOH = 4/3/1溶液中NaOH を濃度25 mM、化合物１を濃度0.5〜3.0 mMとなるように加え、室温(25℃)、1 hシェーカー上で振盪した。反応溶液を除去し、氷冷した10 % AcOH/DMFを加えて反応を終了した。その後、ビーズをDMF(10 min×2、2 h×1、10 min×2)、methanol (5 min×1、1 h×1、5 min×1)、H2O (10 min×3)、6 N塩酸グアニジン(1 h×1、10 h×1)、H2O (5 min×2)で洗浄した。pH 9.4 Glycine / NaOH緩衝液中、蛍光顕微鏡（浜松ホトニクスARGUS/HiSCA；励起波長360 nm、蛍光波長425 nm〜）で観察した。
【００３０】
＜実験結果＞
リン酸化を受ける３種のアミノ酸のうち、リン酸化されたセリンとスレオニンは、化学的性質が類似している。そこで、以下のようなキナーゼ活性検出法を計画した。
リン酸化されたセリン及びスレオニンは類似した化学的性質を有しており、塩基性条件下で容易にリン酸基がβ脱離することが知られている。この現象は、リン酸化ペプチドを化学合成する際に大きな問題となっていた。合成上の問題点は、新規保護基の開発により解決したが、申請者は、逆に、この化学的性質をキナーゼ活性の検出に応用できるのではないかと考えた。図１に示すように、リン酸基がβ脱離して生成した二重結合は、マイケル反応受容体となり、SH基等を有する求核剤と速やかに反応すると考えられる。そこで求核剤に蛍光性分子を用いれば、リン酸基を持つアミノ酸残基選択的に蛍光団を導入することが可能であると考えた（図１）。
まず、本検出法に必須の蛍光性分子の合成に着手した。SH基を有する蛍光物質として化合物1、2をデザイン、合成した（図２）。合成は、以下に示すスキームに従って行った。
【化１１】
続いて、これらの化合物が、作業仮説通り、マイケル反応受容体と反応するか、反応後も蛍光を有するかを検討することとした。マイケル反応受容体のモデル化合物としてmethyl vinyl ketoneと反応させたところ、速やかに反応が進行して目的化合物3、4を与えた。これら化合物3、4は、反応前の化合物1、2と比較して蛍光強度の増大がみられた（スキーム２、図３）。
【化１２】
反応後に蛍光強度が増大するという性質は、蛍光物質のビーズ上への非特異的吸着に起因する蛍光を相対的に低減させることにつながり、アッセイ系の信頼性向上が期待できる。すなわち、いずれの化合物も本アッセイに適した性質を有していることが明らかとなった。
本検出法は図１に示すように、１）β脱離と２）マイケル付加の二つのステップからなる。いずれもペプチドが不安定な塩基性条件下での反応であり、特に最近になってβ脱離条件下での副反応が幾つか報告されているため、各ステップの反応条件を最適化することとした。この際、ビーズ上にペプチドを担持した固相条件では、機器分析が困難であるため、ビーズを用いた固相ではなく、ペプチド溶液としてそれぞれの反応を行い、反応の進行をHPLC、MS (MALDI)を用いて追跡した。ペプチドとして、Ac-LRRASLG-NH2、Ac-LRRApSLG-NH2を用いた。0.1 M Caps緩衝液を用いてpH10, 11の環境でpSのリン酸基のβ脱離を試みたが、温度を上昇させても効率よくβ脱離を進行させることはできなかった。β脱離を効率よく(室温で反応時間として1〜2 h以内に)進行させるには、NaOHやLiOHをある程度の濃度(50 mM 〜)で加えることが必要であった。LiOHとNaOHを比較すると反応効率に大きな差異は認められなかった。また、リン酸基のβ脱離を促進することで知られるBa2+を少量加えたが、Ba2+の存在よりも塩基そのものの濃度の方が反応効率に大きく影響した。次に、リン酸基のβ脱離を効率よく進行させた100 mM NaOH条件で、リン酸化されていないAc-LRRASLG-NH2の安定性をHPLCを用いて分析した。その結果100 mM NaOHという条件ではAc-LRRASLG-NH2は不安定であり何らかの反応を起こしていた。反応溶媒をH2OからH2O/DMSO/EtOH(4:3:1)へと変更することで、副反応を抑制することができた。このように反応条件を種々検討し、効率的にβ脱離及びマイケル付加が進行する条件、すなわち
ステップ１）β脱離
溶媒：0.1 M NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1
反応温度：25 ℃
ステップ２）マイケル付加
溶媒：25 mM NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1
蛍光化合物濃度：1 mM
反応温度：25 ℃
を見いだすことに成功した。
次に、リン酸化セリンを配列中に含むペプチド(LRRApSLG)を担持させたビーズと、リン酸化されていないセリンを含むペプチド(LRRASLG)を担持させたビーズ、二種類のビーズに対し、最適化した反応条件でβ脱離、マイケル付加反応を行った。ビーズとして、酵素反応に適しているとされ、実際に非常に良く用いられているTentaGel及びPEGA800の２種類のビーズを用いた。蛍光顕微鏡（励起波長：360 nm, 蛍光波長：425 nm〜）を用いてビーズを観察したところ、二種のビーズ間で蛍光に有意な差がみられ、リン酸基を有するペプチド選択的に蛍光団が導入されたことが示唆された。合成した1、2のいずれの分子を用いた場合でも同様の結果が得られたが、1を用いた場合の方が、僅かに二種のビーズ間で蛍光の差が大きかったため、今後1を用いることとした（図４）。化合物3の蛍光のpH依存性を検討したところ、pH9-10にかけて安定かつ強い蛍光を与えた（図５）。そこで、蛍光を測定する際には、pH 9.4のバッファーを用いることとした。続いて、蛍光化合物の濃度を検討した結果、低濃度ではポジティブビーズと蛍光性化合物との反応性が低く、高濃度では蛍光性物質のネガティブビーズに対する非特異的吸着が見られた。図６に示すように、1 mM前後（0.5〜3 mM程度）で最も明確な差が見られた。
続いて、実際にキナーゼを用い、図１に従ってアッセイを行った。キナーゼにはよく研究されている市販のプロテインキナーゼA(PKA)を選択し、その特異的基質ペプチド(Kemptide; LRRASLG)を上述の２種類のビーズ上に固相合成した。その結果、図７に示すように、蛍光強度に全く差が見られず、酵素反応が進行していないことが示唆された。酵素やATP濃度、反応温度等様々な条件を検討しても改善は見られなかったが、より巨大な分子をも透過するビーズPEGA1900を用いたところ、化学合成したリン酸化セリン含有ペプチド(LRRApSLG)を用いた場合と同程度の蛍光の差がみられた（図８）。さらに、酵素反応時間依存的な蛍光強度の増大が見られ、ビーズ上でセリン・スレオニンキナーゼ活性を検出できる可能性が示唆された。PEGA1900に担持したペプチドを用いて、酵素反応条件を最適化したところ、以下に示す条件が最適であることが明らかとなった。
・酵素反応：
PKA 30 units/mL, ATP 300 μM in KB, 25 ℃, 10-12 h
（注：キナーゼ濃度を100 units/mLに上げると、反応は3-4 hで終了した。また、反応温度は、30-35 ℃が最適であったが、実験環境上加温することが困難であったため、室温条件を選択した）
・β脱離：
0.1 M NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1, 25 ℃, 1 h
・マイケル付加：
3 mM 化合物1, 25 mM NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1, 25 ℃, 1 h
本検出法の蛍光強度の差が、酵素活性を反映しているかを確認する目的で、PKAの強力な阻害剤ペプチド（IP: Ac-GRTGRRNAI-NH2）を用いて、蛍光強度に変化が見られるか否か検討した。その結果、図９に示すように、阻害剤濃度依存的に蛍光強度の減弱が見られ、本検出法が、キナーゼ阻害剤のアッセイに適用可能であることが示された。今後、マイケル反応後に蛍光波長が変化する蛍光性分子を用いれば、更なる信頼性、定量性の向上が期待できると考えられる。
【００３１】
＜まとめ＞
本検出系は、キナーゼ活性を簡便に蛍光検出できること、阻害剤のアッセイに用いうることが明らかとなった。本検出法は、以下のような応用が考えられる。
１．ビーズに担持したペプチドを用いたキナーゼ認識配列の決定
キナーゼの中には、その認識配列が明らかになっていないものも多い。多様性に富むビーズ担持ペプチドの合成法はすでに確立されているため、様々な配列のペプチドを含むビーズ担持ペプチドを用いて、目的キナーゼの認識配列の一斉スクリーニングが可能となると考えられる。
【００３２】
２．ビーズに担持したペプチドを用いたキナーゼ阻害剤のスクリーニング
今回示したように、本検出法はキナーゼ阻害剤のアッセイに用いうる。蛍光を検出原理とする簡便なアッセイであるため、汎用性が高く多様なキナーゼに対して適用できる。多くのキナーゼ阻害剤が医薬品のターゲットとなっている現在、HTSに適用可能な本法の利用価値は高いと考えられる。
【００３３】
３．マイクロアレイを用いたキナーゼ認識配列の決定及び阻害剤のスクリーニング
ビーズアッセイに比べ、幾分特殊な装置を要するが、ペプチドはマイクロアレイ上に担持することが可能である。より長波長の励起波長、蛍光波長を持つ蛍光色素を用いれば、DNA用に開発された市販のマイクロアレイリーダーの使用が期待できる。マイクロアレイを用いれば、高度な情報の集積化が可能であり、上述のようなキナーゼ認識配列の決定や、阻害剤のスクリーニングをより小スケールで行うことが出来る可能性がある。
また、特定のキナーゼ活性の亢進や低下が特徴的に見られる疾患の場合、本法を用いれば、キナーゼ活性に関する情報を簡便に得ることが出来、病態の診断などへの応用も期待できる。近年、多くの酵素が、その活性を様々な翻訳後修飾により複雑かつ厳密に制御していることが明らかとなっている。酵素活性自体を簡便に検出できる本法は信頼性が高いと考えられ、応用範囲は広いと期待される。
【００３４】
４．ゲル中のリン酸化蛋白質の蛍光誘導化
近年、プロテオミクス研究が活発になされている。その中心的役割を果たしているのが蛋白質の２次元電気泳動と、質量分析による同定である。本検出原理を用いれば、電気泳動後のゲル中に含まれるリン酸化を受けた蛋白質を選択的に蛍光誘導化できる可能性があり、細胞内の情報伝達で重要な役割を果たすリン酸化、脱リン酸化に関して多くの情報が得られると期待される。また、リン酸基を持つ蛋白質やペプチドは、一般的に質量分析に対する感度が非常に悪いことが知られているが、これはリン酸基の持つマイナスチャージに起因すると考えられている。本検出法で誘導化すると、リン酸化アミノ酸はマイナスチャージを持たなくなるため、大きな感度の上昇が期待される。
以上、本検出系は生化学的、医学的に重要なキナーゼの活性を簡便に検出できる一般的原理を供するものであり、高い汎用性と幅広い応用性を有しているといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
前述のように、既存のキナーゼ活性検出方法は、RI法と抗体法とに大別されるが、いずれも既存の生化学的手法をキナーゼに適用したものといえる。リン酸化アミノ酸の持つ化学的性質を利用したキナーゼアッセイ法はほとんど存在しない。本検出法は、危険性や汎用性に問題がある生化学的手法ではなく、シンプルな化学的手法を適用した点で、独創的であるといえよう。
本検出法は、リン酸化セリン及びスレオニンを検出する基本原理を供するものであり、非常に汎用性が高いという特色を持つ。ビーズ上に担持したペプチドを用いて、エッペンドルフチューブやマイクロプレート内でアッセイすることも可能であるし、メンブレンやガラスプレート上にペプチドを担持させたペプチドアレイにも適用しうる。さらに、蛋白質に応用できる可能性もある。SDS-PAGEにかけた後のゲル中のリン酸化蛋白質を、蛍光性に誘導化することが出来れば、本検出法の利用価値は極めて大きいものとなろう。
特異的キナーゼ阻害剤は、抗ガン剤をはじめ、各種医薬品として期待されており、開発研究が進んでいる（非特許文献５を参照）。現在主流となりつつあるコンビナトリアルケミストリーを用いた医薬品開発には、HTSが必要不可欠であるが、本アッセイ系の持つ特色は、まさにその要求を満たすものである。
【００３６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は本アッセイの原理を示す。
【図２】図２は、実施例においてデザイン、合成した蛍光物質（１、２）を示す。
【図３】図３は、化合物１、３の蛍光スペクトルを示すグラフ（5μM （0.1％DMSO）in glycine/NaOH buffer(pH 9.4）、Ex:360 nm)である。
【図４】図４は、ビーズ担持ペプチドを用いた検討結果を示す。
【図５】図５は、化合物３の蛍光のpH依存性を示すグラフである。
【図６】図６は、化合物１の濃度に関する検討結果を示す。
【図７】図７は、固相に担持したペプチドを用いたキナーゼ活性の検出方法及び結果（１）である。
【図８】図８は、固相に担持したペプチドを用いたキナーゼ活性の検出方法及び結果（２）である。
【図９】図９は、本アッセイ系に対するキナーゼ阻害剤の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はキナーゼ活性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質のリン酸化、脱リン酸化は、生体内のシグナル伝達において、最も重要なものの一つであり、細胞の分化、増殖、細胞死に至るまで様々な生命活動に関与している。例えば、細胞の腫瘍化に、SrcやRafといったキナーゼが関与していることはよく知られている。このように、多くのキナーゼが重要な役割を果たしていることが明らかにされているが、すでに同定されたキナーゼでさえ、どの蛋白質を基質とするか、どのようなアミノ酸配列を認識してリン酸化するのか、といった基礎的知見を欠くものが少なくない。全遺伝子の2〜3パーセントがキナーゼをコードしているというヒトゲノム計画の結果からも明らかなように、「リン酸化」という翻訳後修飾の持つ一般性と重要性は非常に大きい。
キナーゼ活性の検出法は多数報告されているが、原理的に２種類に分類できる。放射性同位元素（RI）でラベルされたATP（[γ-32P]ATP）を用いる方法と、リン酸化アミノ酸を認識する抗体を用いる方法である。前者は、キナーゼによる基質蛋白質／ペプチドのリン酸化反応後、基質に取り込まれた32Pの放射能を測定してキナーゼ活性を定量化する。この方法は、広範に用いられているが、RIを用いるため危険性が高い上に、相応の施設を必要とするという問題点がある。後者は、リン酸化されたペプチドを抗体で認識する方法である。この方法は、安全かつハイスループットスクリーニング（HTS）に応用可能であるが、“リン酸化された”アミノ酸を“特異的”に認識する抗体を作成する必要があり、汎用性、コスト面に問題があると考えられる。
最近、細胞内でリン酸化される蛋白質を一斉検出する目的で、リン酸基の反応性に着目した手法が報告された。細胞抽出物に化学的処理を施して、リン酸化蛋白質を化学変換、分離後、質量分析法でリン酸化部位を推測するというものである（非特許文献１及び２）。この方法の有用性を現時点で判断することは出来ないが、リン酸化以外の多様な翻訳後修飾を含む、多種類の蛋白質を対象としているため、結果の解釈に注意を要すると思われる。また浜地らは近年、シンプルな亜鉛錯体がリン酸基を認識し、蛍光性に変化することを見出している（非特許文献３）。だが、その蛍光プローブは、キナーゼの基質の１つであるATPにも強く応答したり、リン酸化されるペプチドの配列により感度が大きく異なる等、実用化に向けて解決すべき問題点がいくつかある。これらは、リン酸基の化学的性質に着目した数少ない例であるが、いずれもキナーゼ活性の検出を目標としたものではない。
ごく最近、Molecular Probe社より、“Pro-Q Diamond”なるリン酸化アミノ酸検出蛍光試薬が発売された（非特許文献４）。文献等を参照する限り、非常に優れたプローブと考えられるが、その構造、検出原理等は、一切秘匿されているため、その有用性の正確な評価は現時点では難しい。
【０００３】
【非特許文献１】H. Zhou, J. D. Watts, R. Aebersold, Nat. Biotechnol. 2001, 19, 375-378.
【非特許文献２】Y. Oda, T. Nagasu, B. T. Chait, Nat. Biotechnol. 2001, 19, 379-382.
【非特許文献３】A. Ojida, Y. Mito-oka, K. Sada, I. Hamachi, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 2454-2463.
【非特許文献４】K. Martin, T. H. Steinberg, L. A. Cooley, K. R. Gee, J. M. Beechem, W. F. Patton, Proteomics 2003, 3, 1244-1255.
【非特許文献５】M. E. M. Noble, J. A. Endicott, L. N. Johnson, Science 2004, 303, 1800-1805.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上の背景の下、本発明は新たなキナーゼ活性検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明者らは検討を重ねた。まず、今まであまり注目されていなかった、リン酸化アミノ酸の化学的性質に着目した。一般に、リン酸化を受けるアミノ酸は、セリン、スレオニン、チロシンの３種であるが、セリンースレオニンキナーゼが、その大多数を占めることが知られている。そこで、セリンースレオニンキナーゼを対象としたキナーゼ活性検出方法の開発を試みた。その結果、新たな原理に基づく検出方法を完成するに至った。本発明は、この成果に基づくものであって、以下の構成を提供する。
以下の各ステップを含んでなるキナーゼ活性検出法：
キナーゼをペプチドに作用させるステップ；
導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ；
前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ；及び
導入された標識物質を検出するステップ。
本発明の一態様では、前記キナーゼが、セリン−スレオニンキナーゼであることを特徴とする。
また、本発明の一態様では、前記標識物質が蛍光性物質であることを特徴とする。
更に、本発明の一態様では、前記標識物質がＳＨ基等の求核性官能基を有することを特徴とする。
更に、本発明の一態様では、前記ペプチドが不溶性支持体に固定されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検出方法は、リン酸化アミノ酸そのものを検出するので汎用性が高いという利点を持つ。そのため、例えば、各種キナーゼの特異的基質の同定や、特異的阻害剤のハイスループットスクリーニングなど、広範囲な用途への適用が期待される。また、既存のキナーゼ活性検出法と併用することで、目的とするキナーゼがセリンースレオニンキナーゼか、チロシンキナーゼであるか判定することも可能である。さらに、現存するキナーゼ活性の検出法と比し、本発明の検出方法は簡便な検出を可能し、低コスト化も図られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施例（実験例を含む）を説明する。
【実施例１】
【０００８】
＜実験方法＞
１．蛍光性化合物の合成
用いた試薬の多くはTCI、WAKO、nacalaiから市販さられているものを、DIPEAについてはWatanabe Chemから市販されているものを使用し、特に精製を行うことなく使用した。反応や再結晶には蒸留した溶媒を用いた。
【０００９】
１−１．化合物１の合成
【化１】
【００１０】
Resorcinol (1.00 g; 9.1 mmol) を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、conc. H2SO4 (10 mL)、4-chloroacetoacetic acid ethyl ester (1.65 g; 10.0 mmol)を加えて、室温で、一晩、遮光して撹拌した。氷冷した水(55 mL)に反応混合物を滴下し、析出物をろ取、減圧乾燥し、0.88 gの白色固体を得た。Y. 46 %
1H NMR (DMSO-d6): d 4.96 (s, 2H); 6.43 (s, 1H); 6.76 (d, 1H, J = 2.3 Hz); 6.84 (dd, 1H, J = 2.3, 8.8 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz).
MS FAB (NBA): 211 (M + 1)
【化２】
【００１１】
原料 (200 mg; 0.95 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (8 mL)、thioacetic acid (86 mg; 1.13 mmol)、DIPEA (146 mg; 1.13 mmol)を加えて、室温で遮光し、90 min撹拌した。溶媒を濃縮し、残渣をCH2Cl2に溶解し、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 2/3)により精製した。230 mgの白色固体を得た。Y. 97 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.40 (s, 3H); 4.26 (s, 2H); 6.24 (s, 1H); 6.74 (d, 1H, J = 2.4 Hz); 6.81 (dd, 1H, J = 2.4, 8.8 Hz); 7.60 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.64 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 251 (M + 1)
一部CH3CNで再結晶
Anal. Calcd for C12H10O4S: C, 57.59; H, 4.03; N, 0.00. Found: C, 57.78; H, 4.09; N, 0.00.
【化３】
【００１２】
原料 (1.19 g; 4.75 mmol)を300 mL三頚ナスフラスコにいれ、methanol (120 mL)に溶解し、脱気、 Ar置換後、0.25 g/mL NaOH水溶液 (2.2 mL; 13.75 mmol)を加えて、室温で遮光し、50 min撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした。Methanolを濃縮し、EtOAcで抽出(40, 30, 30 mL)後、brine wash (30 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanolに溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol/CH2Cl2)により精製した。0.84 gの白色固体を得た。Y. 85 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.19 (t, 1H, J = 7.9 Hz); 3.87 (d, 2H, J = 7.9 Hz); 6.28 (s, 1H); 6.73 (d, 1H, J = 2.2 Hz); 6.81 (dd, 1H, J = 2.2, 8.7 Hz); 7.71 (d, 1H, J = 8.7 Hz); 10.60 (s, 1H).
MS FAB (M + 1): 209 (M + 1)
一部EtOAcで再結晶
Anal. Calcd for C10H8O3S: C, 57.68; H, 3.87; N, 0.00. Found: C, 57.43; H, 3.99; N, 0.00.
【００１３】
１−２．化合物２の合成
【化４】
【００１４】
3-Aminophenol (2.18 g; 20 mmol)を100mL二頚ナスフラスコにいれ、EtOAc (30 mL) を加えて30 min 還流した。Phenyl chloroformate (1.72 g; 11 mmol)を20 minかけて滴下して加え、さらに1h還流した。反応中生じた白色沈殿をろ去し、ろ液を濃縮した。減圧乾燥し、2.30 g の白色固体を得た。Y. quant
1H NMR (DMSO-d6): d 10.10 (s, 1H); 9.43 (s, 1H); 7.45-7.40 (m, 2H); 7.28-7.20 (m, 3H); 7.10-7.04 (m, 2H); 6.91 (d, 1H, J = 4.23 Hz); 6.44 (d, 1H, J = 4.23 Hz)
MS FAB (NBA): 230 (M + 1)
【化５】
【００１５】
原料 (3.00 g; 13.1 mmol)を100 mL二頚ナスフラスコにいれ、80 % H2SO4 (40 mL)、4-chloroacetoacetic acid ethyl ester (2.37 g; 14.4 mmol)を加えて、室温で、6.5h遮光して撹拌した。氷冷したした水(50 mL)に反応混合物を滴下し、析出物をろ取した。これをethanolで再結晶し、白色固体1.92 gを得た。Y. 45 %
1H NMR (DMSO-d6): d 4.99 (s, 2H); 6.55 (s, 1H); 7.25-7.30 (m, 3H); 7.42-7.49 (m, 3H); 7.61 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 7.81 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.80 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 330 (M + 1)
Anal. Calcd for C17H12ClNO4: C, 61.92; H, 3.67; N, 4.25. Found: C, 61.67; H, 3.75; N, 4.38.
【化６】
【００１６】
原料 (330 mg; 1.00 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (10 mL)、thioacetic acid (84 mg; 1.1 mmol)、DIPEA (142 mg; 1.1 mmol)を加えて、室温で遮光し、2 h撹拌した。溶媒を濃縮し、残渣をCH2Cl2に溶解し、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 2/3)により精製した。354 mgの白色固体を得た。Y. 96 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.39 (s, 3H); 4.29 (s, 2H); 6.35 (s, 1H); 7.25-7.30 (m, 3H); 7.42-7.46 (m, 3H); 7.59 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.77 (s, 1H).
MS FAB (NBA): 370 (M + 1)
一部CH3CNで再結晶
Anal. Calcd for C19H15NO5S: C, 61.78; H, 4.09; N, 3.79. Found: C, 61.55; H, 4.05; N, 4.03.
【化７】
【００１７】
原料 (790 mg; 2.14 mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist.THF (50 mL)、10 M NaOH水溶液 (860 μL; 8.6 mmol)を加えて、室温で遮光し、45 min撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした(pH4-5)。THFを濃縮し、0.2 M pH7 sodium phosphate bufferを加えて中性とした。EtOAcで抽出(70 mL×3)後、brine wash (50 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol/CH2Cl2)より精製した。240 mgの黄色固体を得た。Y. 54 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.11 (t, 1H, J = 8.2 Hz); 3.79 (d, 2H, J = 8.2 Hz); 6.05 (s, 1H); 6.17 (bs, 2H); 6.42 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 6.56 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz); 7.50 (d, 1H, J = 8.7 Hz).
MS FAB (NBA): 208 (M + 1)
【００１８】
１−３．化合物３の合成
【化８】
【００１９】
原料 (500 mg; 2.40 mmol)を100 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、freshly dist. THF (50 mL)、methyl vinyl ketone (190 mg; 2.76 mmol) 、0.25 M NaOH / methanol (0.95 mL; 0.24mmol)を加えて、室温で遮光し、4 h撹拌した。氷冷下1N HClを加えて反応溶液を酸性とした。溶液を濃縮し、残渣をEtOAc (200 mL)に溶解後、brine wash (40 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (5 % methanol / CH2Cl2)により精製した。521 mgの白色固体を得た。Y. 78 %
1H NMR (DMSO-d6): d 2.07 (s, 3H); 2.61 (t, 2H, J = 7.0 Hz); 2.76 (t, 2H, J = 7.0 Hz); 3.89 (s, 2H); 6.25 (s, 1H); 6.72 (d, 1H, J = 2.3 Hz); 6.80 (dd, 1H, J = 2.3, 8.8 Hz); 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 10.58 (s, 1H)
MS FAB (NBA): 279 (M + 1)
【００２０】
１−４．化合物４の合成
【化９】
【００２１】
原料 (30 mg; 0.14 mmol)、potassium tert-butoxide (1.6 mg; 0.014mmol)を50 mL二頚ナスフラスコにいれ、Ar置換後、THF (5 mL)、methyl vinyl ketone (11 mg; 0.15 mmol)を加えて、室温で遮光し、17 h撹拌した。氷冷下0.2 M pH7 sodium phosphate buffer (10 mL)を加え、反応溶液を中性とした(約pH7-8)。THFを濃縮し、EtOAcで抽出(30, 20, 20 mL)後、brine wash (20 mL×1)、EtOAcを無水MgSO4で乾燥後、濃縮した。残渣をmethanol/EtOAcの混合溶媒に溶解後、シリカゲルにまぶし、カラムクロマトグラフィー (EtOAc/n-hexane = 1/1)より精製した。25 mgの黄色固体を得た。Y. 64 %
1H NMR (DMSO-d6): d 3.11 (t, 1H, J = 8.2 Hz); 3.79 (d, 2H, J = 8.2 Hz); 6.05 (s, 1H); 6.17 (bs, 2H); 6.42 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 6.56 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz); 7.50 (d, 1H, J = 8.7 Hz).
MS FAB (NBA): 278 (M + 1)
【００２２】
２．蛍光測定
合成した化合物群の蛍光は、日立F4500蛍光度計を用いて測定した。各化合物の5 mM DMSO溶液を調製し、glycine/NaOH緩衝液（pH 9.4）或いはナトリウムリン酸バッファー（pH 2-12）に希釈して測定に供した。励起波長は、360 nm、蛍光波長は465 nmで、室温下測定した。
【００２３】
３．ペプチド合成
実験に用いたペプチドは一般的なFmocペプチド固相合成法に従い、以下のスキームのように合成した。Fmocアミノ酸のカップリングが完全に進行したか否かをカイザーテストで確認し、不完全な場合はカップリング時間の延長、或いは試薬の再添加を行った。
【００２４】
Fmocアミノ酸類(Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser{OP(OBzl)OH}-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH)及びペプチド合成用試薬は特に記さない限り、Watanabe Chem、WAKOで市販されているものを用いた。アッセイに用いたPKAはSigmaのcAMP dependent protein kinase catalytic subunit from bovine heartを、その他の試薬はWAKOで市販されているものを用いた。
【００２５】
ペプチド合成には、目的に応じて以下のレジンを用いた。
C末端をアミド化してビーズから切り離したペプチド調製用レジン;
TentaGel S RAM (0.3 mmol/g); Advanced ChemTech
ビーズ上固定化ペプチド合成に用いたレジン
TentaGel S NH2 (0.3 mmol/g); Advanced ChemTech
Amino PEGA Resin (PEGA800; 0.4 mmol/g); Novabiochem
PL-PEGA Resin (PEGA1900; 0.2 mmol/g, 300-500 mm, 30-50 mesh); Polymer Laboratories
【化１０】
【００２６】
４．溶液条件でのβ脱離条件検討
固相合成したAc-LRRASLG-NH2、Ac-LRRApSLG-NH2を用いて条件検討を行った。加える塩基の種類、濃度あるいは緩衝液によりpHを制御する等、塩基条件を変化させ、酢酸で反応を終了させた後にHPLCで分析した。HPLCの分析条件は以下の通りである。
使用カラム; Inertsil ODS-3
展開溶媒１; 0.1 % TFA水溶液 展開溶媒２; 0.1 % TFAアセトニトリル溶液
グラジエント; 展開溶媒１/展開溶媒２ [90 / 10→65 / 35 (25 min)]
流速; 1mL/min
【００２７】
５．ビーズ担持ペプチドを用いた検討
５−１．酵素反応
1.5 mLエッペンドルフチューブにAc-LRRASLGペプチドを固相合成したビーズをとり、水(10 min×3)、キナーゼ反応緩衝液(KB; pH 6.8, 30 mM MES, 10 or 15 mM MgCl2, 0.4 mg/mL BSA)(10 min×3)で洗浄後、KB中、室温で12 hプレインキュベーションした。KB (10 min×2)で洗浄後、ATP及びPKAの最終濃度が、それぞれ200 or 300 μM、30, 50 or 70 units/mLとなるように調製し、室温（25 ℃)で10 hシェーカー上で振盪した。阻害剤を添加する場合、所定の濃度の阻害剤を反応液に添加し、同様に室温で10 h振盪した。反応終了後、洗浄用緩衝液(WB; 50 mM pH 7.2 PBS, 0.68 M NaCl, 13 mM KCl, 0.05 % Tween20)でビーズを洗浄(10 min×2、1 h×2、5 min×2)した後、さらに水で洗浄(10 min×2、1 h×2、5 min×2)した。
【００２８】
５−２．β脱離
洗浄後のビーズをH2O/DMSO/EtOH = 4/3/1溶液中NaOH 濃度0.1 Mで室温(25℃)、1 hシェーカー上で振盪した。反応溶液を除去後、氷冷した10 % AcOH/H2Oを加えて反応を終了した。その後、水で洗浄(1 min×5)した。
【００２９】
５−３．マイケル付加反応
β脱離反応後、洗浄したビーズにH2O/DMSO/EtOH = 4/3/1溶液中NaOH を濃度25 mM、化合物１を濃度0.5〜3.0 mMとなるように加え、室温(25℃)、1 hシェーカー上で振盪した。反応溶液を除去し、氷冷した10 % AcOH/DMFを加えて反応を終了した。その後、ビーズをDMF(10 min×2、2 h×1、10 min×2)、methanol (5 min×1、1 h×1、5 min×1)、H2O (10 min×3)、6 N塩酸グアニジン(1 h×1、10 h×1)、H2O (5 min×2)で洗浄した。pH 9.4 Glycine / NaOH緩衝液中、蛍光顕微鏡（浜松ホトニクスARGUS/HiSCA；励起波長360 nm、蛍光波長425 nm〜）で観察した。
【００３０】
＜実験結果＞
リン酸化を受ける３種のアミノ酸のうち、リン酸化されたセリンとスレオニンは、化学的性質が類似している。そこで、以下のようなキナーゼ活性検出法を計画した。
リン酸化されたセリン及びスレオニンは類似した化学的性質を有しており、塩基性条件下で容易にリン酸基がβ脱離することが知られている。この現象は、リン酸化ペプチドを化学合成する際に大きな問題となっていた。合成上の問題点は、新規保護基の開発により解決したが、申請者は、逆に、この化学的性質をキナーゼ活性の検出に応用できるのではないかと考えた。図１に示すように、リン酸基がβ脱離して生成した二重結合は、マイケル反応受容体となり、SH基等を有する求核剤と速やかに反応すると考えられる。そこで求核剤に蛍光性分子を用いれば、リン酸基を持つアミノ酸残基選択的に蛍光団を導入することが可能であると考えた（図１）。
まず、本検出法に必須の蛍光性分子の合成に着手した。SH基を有する蛍光物質として化合物1、2をデザイン、合成した（図２）。合成は、以下に示すスキームに従って行った。
【化１１】
続いて、これらの化合物が、作業仮説通り、マイケル反応受容体と反応するか、反応後も蛍光を有するかを検討することとした。マイケル反応受容体のモデル化合物としてmethyl vinyl ketoneと反応させたところ、速やかに反応が進行して目的化合物3、4を与えた。これら化合物3、4は、反応前の化合物1、2と比較して蛍光強度の増大がみられた（スキーム２、図３）。
【化１２】
反応後に蛍光強度が増大するという性質は、蛍光物質のビーズ上への非特異的吸着に起因する蛍光を相対的に低減させることにつながり、アッセイ系の信頼性向上が期待できる。すなわち、いずれの化合物も本アッセイに適した性質を有していることが明らかとなった。
本検出法は図１に示すように、１）β脱離と２）マイケル付加の二つのステップからなる。いずれもペプチドが不安定な塩基性条件下での反応であり、特に最近になってβ脱離条件下での副反応が幾つか報告されているため、各ステップの反応条件を最適化することとした。この際、ビーズ上にペプチドを担持した固相条件では、機器分析が困難であるため、ビーズを用いた固相ではなく、ペプチド溶液としてそれぞれの反応を行い、反応の進行をHPLC、MS (MALDI)を用いて追跡した。ペプチドとして、Ac-LRRASLG-NH2、Ac-LRRApSLG-NH2を用いた。0.1 M Caps緩衝液を用いてpH10, 11の環境でpSのリン酸基のβ脱離を試みたが、温度を上昇させても効率よくβ脱離を進行させることはできなかった。β脱離を効率よく(室温で反応時間として1〜2 h以内に)進行させるには、NaOHやLiOHをある程度の濃度(50 mM 〜)で加えることが必要であった。LiOHとNaOHを比較すると反応効率に大きな差異は認められなかった。また、リン酸基のβ脱離を促進することで知られるBa2+を少量加えたが、Ba2+の存在よりも塩基そのものの濃度の方が反応効率に大きく影響した。次に、リン酸基のβ脱離を効率よく進行させた100 mM NaOH条件で、リン酸化されていないAc-LRRASLG-NH2の安定性をHPLCを用いて分析した。その結果100 mM NaOHという条件ではAc-LRRASLG-NH2は不安定であり何らかの反応を起こしていた。反応溶媒をH2OからH2O/DMSO/EtOH(4:3:1)へと変更することで、副反応を抑制することができた。このように反応条件を種々検討し、効率的にβ脱離及びマイケル付加が進行する条件、すなわち
ステップ１）β脱離
溶媒：0.1 M NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1
反応温度：25 ℃
ステップ２）マイケル付加
溶媒：25 mM NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1
蛍光化合物濃度：1 mM
反応温度：25 ℃
を見いだすことに成功した。
次に、リン酸化セリンを配列中に含むペプチド(LRRApSLG)を担持させたビーズと、リン酸化されていないセリンを含むペプチド(LRRASLG)を担持させたビーズ、二種類のビーズに対し、最適化した反応条件でβ脱離、マイケル付加反応を行った。ビーズとして、酵素反応に適しているとされ、実際に非常に良く用いられているTentaGel及びPEGA800の２種類のビーズを用いた。蛍光顕微鏡（励起波長：360 nm, 蛍光波長：425 nm〜）を用いてビーズを観察したところ、二種のビーズ間で蛍光に有意な差がみられ、リン酸基を有するペプチド選択的に蛍光団が導入されたことが示唆された。合成した1、2のいずれの分子を用いた場合でも同様の結果が得られたが、1を用いた場合の方が、僅かに二種のビーズ間で蛍光の差が大きかったため、今後1を用いることとした（図４）。化合物3の蛍光のpH依存性を検討したところ、pH9-10にかけて安定かつ強い蛍光を与えた（図５）。そこで、蛍光を測定する際には、pH 9.4のバッファーを用いることとした。続いて、蛍光化合物の濃度を検討した結果、低濃度ではポジティブビーズと蛍光性化合物との反応性が低く、高濃度では蛍光性物質のネガティブビーズに対する非特異的吸着が見られた。図６に示すように、1 mM前後（0.5〜3 mM程度）で最も明確な差が見られた。
続いて、実際にキナーゼを用い、図１に従ってアッセイを行った。キナーゼにはよく研究されている市販のプロテインキナーゼA(PKA)を選択し、その特異的基質ペプチド(Kemptide; LRRASLG)を上述の２種類のビーズ上に固相合成した。その結果、図７に示すように、蛍光強度に全く差が見られず、酵素反応が進行していないことが示唆された。酵素やATP濃度、反応温度等様々な条件を検討しても改善は見られなかったが、より巨大な分子をも透過するビーズPEGA1900を用いたところ、化学合成したリン酸化セリン含有ペプチド(LRRApSLG)を用いた場合と同程度の蛍光の差がみられた（図８）。さらに、酵素反応時間依存的な蛍光強度の増大が見られ、ビーズ上でセリン・スレオニンキナーゼ活性を検出できる可能性が示唆された。PEGA1900に担持したペプチドを用いて、酵素反応条件を最適化したところ、以下に示す条件が最適であることが明らかとなった。
・酵素反応：
PKA 30 units/mL, ATP 300 μM in KB, 25 ℃, 10-12 h
（注：キナーゼ濃度を100 units/mLに上げると、反応は3-4 hで終了した。また、反応温度は、30-35 ℃が最適であったが、実験環境上加温することが困難であったため、室温条件を選択した）
・β脱離：
0.1 M NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1, 25 ℃, 1 h
・マイケル付加：
3 mM 化合物1, 25 mM NaOH/DMSO/EtOH = 4/3/1, 25 ℃, 1 h
本検出法の蛍光強度の差が、酵素活性を反映しているかを確認する目的で、PKAの強力な阻害剤ペプチド（IP: Ac-GRTGRRNAI-NH2）を用いて、蛍光強度に変化が見られるか否か検討した。その結果、図９に示すように、阻害剤濃度依存的に蛍光強度の減弱が見られ、本検出法が、キナーゼ阻害剤のアッセイに適用可能であることが示された。今後、マイケル反応後に蛍光波長が変化する蛍光性分子を用いれば、更なる信頼性、定量性の向上が期待できると考えられる。
【００３１】
＜まとめ＞
本検出系は、キナーゼ活性を簡便に蛍光検出できること、阻害剤のアッセイに用いうることが明らかとなった。本検出法は、以下のような応用が考えられる。
１．ビーズに担持したペプチドを用いたキナーゼ認識配列の決定
キナーゼの中には、その認識配列が明らかになっていないものも多い。多様性に富むビーズ担持ペプチドの合成法はすでに確立されているため、様々な配列のペプチドを含むビーズ担持ペプチドを用いて、目的キナーゼの認識配列の一斉スクリーニングが可能となると考えられる。
【００３２】
２．ビーズに担持したペプチドを用いたキナーゼ阻害剤のスクリーニング
今回示したように、本検出法はキナーゼ阻害剤のアッセイに用いうる。蛍光を検出原理とする簡便なアッセイであるため、汎用性が高く多様なキナーゼに対して適用できる。多くのキナーゼ阻害剤が医薬品のターゲットとなっている現在、HTSに適用可能な本法の利用価値は高いと考えられる。
【００３３】
３．マイクロアレイを用いたキナーゼ認識配列の決定及び阻害剤のスクリーニング
ビーズアッセイに比べ、幾分特殊な装置を要するが、ペプチドはマイクロアレイ上に担持することが可能である。より長波長の励起波長、蛍光波長を持つ蛍光色素を用いれば、DNA用に開発された市販のマイクロアレイリーダーの使用が期待できる。マイクロアレイを用いれば、高度な情報の集積化が可能であり、上述のようなキナーゼ認識配列の決定や、阻害剤のスクリーニングをより小スケールで行うことが出来る可能性がある。
また、特定のキナーゼ活性の亢進や低下が特徴的に見られる疾患の場合、本法を用いれば、キナーゼ活性に関する情報を簡便に得ることが出来、病態の診断などへの応用も期待できる。近年、多くの酵素が、その活性を様々な翻訳後修飾により複雑かつ厳密に制御していることが明らかとなっている。酵素活性自体を簡便に検出できる本法は信頼性が高いと考えられ、応用範囲は広いと期待される。
【００３４】
４．ゲル中のリン酸化蛋白質の蛍光誘導化
近年、プロテオミクス研究が活発になされている。その中心的役割を果たしているのが蛋白質の２次元電気泳動と、質量分析による同定である。本検出原理を用いれば、電気泳動後のゲル中に含まれるリン酸化を受けた蛋白質を選択的に蛍光誘導化できる可能性があり、細胞内の情報伝達で重要な役割を果たすリン酸化、脱リン酸化に関して多くの情報が得られると期待される。また、リン酸基を持つ蛋白質やペプチドは、一般的に質量分析に対する感度が非常に悪いことが知られているが、これはリン酸基の持つマイナスチャージに起因すると考えられている。本検出法で誘導化すると、リン酸化アミノ酸はマイナスチャージを持たなくなるため、大きな感度の上昇が期待される。
以上、本検出系は生化学的、医学的に重要なキナーゼの活性を簡便に検出できる一般的原理を供するものであり、高い汎用性と幅広い応用性を有しているといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
前述のように、既存のキナーゼ活性検出方法は、RI法と抗体法とに大別されるが、いずれも既存の生化学的手法をキナーゼに適用したものといえる。リン酸化アミノ酸の持つ化学的性質を利用したキナーゼアッセイ法はほとんど存在しない。本検出法は、危険性や汎用性に問題がある生化学的手法ではなく、シンプルな化学的手法を適用した点で、独創的であるといえよう。
本検出法は、リン酸化セリン及びスレオニンを検出する基本原理を供するものであり、非常に汎用性が高いという特色を持つ。ビーズ上に担持したペプチドを用いて、エッペンドルフチューブやマイクロプレート内でアッセイすることも可能であるし、メンブレンやガラスプレート上にペプチドを担持させたペプチドアレイにも適用しうる。さらに、蛋白質に応用できる可能性もある。SDS-PAGEにかけた後のゲル中のリン酸化蛋白質を、蛍光性に誘導化することが出来れば、本検出法の利用価値は極めて大きいものとなろう。
特異的キナーゼ阻害剤は、抗ガン剤をはじめ、各種医薬品として期待されており、開発研究が進んでいる（非特許文献５を参照）。現在主流となりつつあるコンビナトリアルケミストリーを用いた医薬品開発には、HTSが必要不可欠であるが、本アッセイ系の持つ特色は、まさにその要求を満たすものである。
【００３６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は本アッセイの原理を示す。
【図２】図２は、実施例においてデザイン、合成した蛍光物質（１、２）を示す。
【図３】図３は、化合物１、３の蛍光スペクトルを示すグラフ（5μM （0.1％DMSO）in glycine/NaOH buffer(pH 9.4）、Ex:360 nm)である。
【図４】図４は、ビーズ担持ペプチドを用いた検討結果を示す。
【図５】図５は、化合物３の蛍光のpH依存性を示すグラフである。
【図６】図６は、化合物１の濃度に関する検討結果を示す。
【図７】図７は、固相に担持したペプチドを用いたキナーゼ活性の検出方法及び結果（１）である。
【図８】図８は、固相に担持したペプチドを用いたキナーゼ活性の検出方法及び結果（２）である。
【図９】図９は、本アッセイ系に対するキナーゼ阻害剤の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の各ステップを含んでなるキナーゼ活性検出法：
キナーゼをペプチドに作用させるステップ；
導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ；
前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ；及び
導入された標識物質を検出するステップ。
【請求項２】
前記キナーゼが、セリン−スレオニンキナーゼである、請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
前記標識物質が蛍光性物質である、請求項１に記載の検出法。
【請求項４】
前記標識物質がＳＨ基等の求核性官能基を有する、請求項１に記載の検出法。
【請求項５】
前記ペプチドが不溶性支持体に固定されている、請求項１に記載の検出法。
【請求項１】
以下の各ステップを含んでなるキナーゼ活性検出法：
キナーゼをペプチドに作用させるステップ；
導入されたリン酸基をβ脱離させるステップ；
前記リン酸基がβ脱離して生成した二重結合部分に、マイケル付加反応によって標識物質を導入するステップ；及び
導入された標識物質を検出するステップ。
【請求項２】
前記キナーゼが、セリン−スレオニンキナーゼである、請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
前記標識物質が蛍光性物質である、請求項１に記載の検出法。
【請求項４】
前記標識物質がＳＨ基等の求核性官能基を有する、請求項１に記載の検出法。
【請求項５】
前記ペプチドが不溶性支持体に固定されている、請求項１に記載の検出法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−１０１７６７（Ｐ２００６−１０１７６７Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９３０８４（Ｐ２００４−２９３０８４）
【出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【出願人】（５０４３７３８２０）
【出願人】（５０４３７３６１３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【出願人】（５０４３７３８２０）
【出願人】（５０４３７３６１３）
【Ｆターム（参考）】
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