キナーゼ活性測定方法及び試薬
【課題】メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性値を正確に測定することが可能なキナーゼ活性測定方法及び試薬を提供すること。
【解決手段】メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、生体から採取したキナーゼを含む試料と、キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入するリン酸化工程と、リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、基質に結合した標識物質の標識に基づいてキナーゼの活性を測定する工程と、を含むキナーゼ活性測定方法。
【解決手段】メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、生体から採取したキナーゼを含む試料と、キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入するリン酸化工程と、リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、基質に結合した標識物質の標識に基づいてキナーゼの活性を測定する工程と、を含むキナーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するキナーゼ活性測定方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者の腫瘍細胞には、９番染色体と２２番染色体とが相互転座することにより形成されたフィラデルフィア染色体と呼ばれる異常染色体が特異的に見られる。９番染色体にはｃ−ａｂｌという遺伝子があり、この遺伝子の近傍で断裂が起きて２２番染色体のｂｃｒ（breakpoint cluster region）という場所に転座する。これによって二つの遺伝子が融合して一つのキメラ遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌが形成される。このキメラ遺伝子がコードするキナーゼであるＢｃｒ／Ａｂｌは、細胞増殖シグナルを異常に亢進させて白血病細胞を異常増殖させ、ＣＭＬを引き起こすと考えられている。
【０００３】
また、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）はｃ・ｋｉｔ遺伝子が突然変異を起こすことにより、この遺伝子にコードされたＫＩＴと呼ばれる酵素が過剰に作用して引き起こされると考えられている。
【０００４】
ＣＭＬやＧＩＳＴに対する効果的な治療方法の一つとして、メシル酸イマチニブを有効成分とする分子標的薬グリベック（ノバルティス社）を用いた薬物療法が挙げられる。メシル酸イマチニブは、Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴのようなキナーゼと結合してその働きを阻害し、これらの疾患に対して抗腫瘍効果を発揮する。
【０００５】
しかしながら、グリベックは全てのＣＭＬ患者に抗腫瘍効果があるわけではなく、Ｂｃｒ／Ａｂｌの活性値が高いＣＭＬ患者に対してのみ高い効果がある。それにもかかわらず、ＣＭＬに対する薬物治療においては、薬物治療を受ける全ての患者に第一選択薬としてグリベックが投与される。そのため、グリベック投与の有効性の低いＣＭＬ患者に対してもグリベックを投与しているのが現状である。
【０００６】
また、グリベックは全てのＧＩＳＴ患者に抗腫瘍効果があるわけではなく、ＫＩＴの活性値が高いＧＩＳＴ患者に対してのみ高い効果がある。ＧＩＳＴに対する薬物治療においては、ＫＩＴ陽性のＧＩＳＴ患者にのみグリベックが投与される。ＫＩＴが陽性か陰性かの判定法の一つとして、ＫＩＴに特異的に結合する標識抗体を用いて摘出された腫瘍細胞を染色する免疫組織学的方法が挙げられる。しかしながら、この方法では、技師の技量によっては偽陽性となることがある。偽陽性となった場合は、本来グリベック投与の有効性が低いにもかかわらず、グリベックを投与してしまうことがある。
【０００７】
上述のようなグリベック投与の効果が小さい患者にとっては、グリベックが投与されると薬効が小さいにもかかわらず副作用などの身体的負担や治療費などの経済的負担を負わなければならない。従って、グリベックの効果が大きい患者にのみ選択的にグリベック投与を行なうために、グリベックの有効成分であるメシル酸イマチニブが標的とするキナーゼの活性を正確に測定する方法や試薬の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性値を正確に測定することが可能なキナーゼ活性測定方法及び試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、生体から採取したキナーゼを含む試料と、キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入するリン酸化工程と、リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、基質に結合した標識物質の標識に基づいてキナーゼの活性を測定する工程と、を含むキナーゼ活性測定方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するための試薬であって、キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸基を導入された基質に結合可能な標識物質と、を含有するキナーゼ活性測定試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼがリン酸化した基質の量を測定することができるため、前記キナーゼの活性値を正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のキナーゼ活性測定方法によると、以下のようにしてキナーゼの活性が測定される。先ず、キナーゼを含む試料と、このキナーゼに対する基質と、ＡＴＰとを混合する。これにより、キナーゼの作用でＡＴＰのリン酸基が基質のチロシン残基に導入される。リン酸基を導入された基質に結合可能な標識物質を結合させた後、この標識物質が発するシグナルを検出する。この検出結果に基づいてキナーゼの活性が算出される。
【００１３】
活性測定されるキナーゼとしては、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼであれば特に限定されない。具体的には活性型Ａｂｌを有する酵素やＫＩＴなどが挙げられる。活性型Ａｂｌを有する酵素としては、Ｂｃｒ／Ａｂｌを例示できる。活性型Ａｂｌを有する酵素やＫＩＴなどは、基質となるポリペプチドのチロシン残基にリン酸基を導入するチロシンキナーゼである。
【００１４】
メシル酸イマチニブは、水溶性の粉末状物質で、化学名は4-(4-Methylpiperazin-1-ylmethyl)-N-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-ylamino)phenyl] benzamide monomethanesulfonateであり、特定のキナーゼのＡＴＰが結合すべき部位（ＡＴＰ結合部位）に結合するという性質を有する。
【００１５】
試料としては、測定対象となるキナーゼを含有するものであれば特に限定されず、腫瘍細胞や腫瘍細胞塊等を含む生体試料などを用いることができる。また、生体試料を物理的及び／又は化学的処理により可溶化した液体試料、或いはその液体試料を遠心分離するなどしてさらに精製した試料などを用いることも可能である。
【００１６】
上述の試料に含まれるキナーゼに、ＡＴＰ及び基質を接触させる。本実施形態で活性測定されるキナーゼとして、例えばＢｃｒ／Ａｂｌの活性を測定する場合、基質としてはＢｃｒ／Ａｂｌと結合可能なポリペプチドであれば何れを用いてもよい。具体的には基質としてミエリンベーシックプロテイン（ＭＢＰ）やＧｒｂ２などを用いることができるが、特にＭＢＰを用いることが好ましい。また、ＫＩＴの活性を測定する場合、基質としてはＫＩＴと結合可能なポリペプチドであれば何れを用いてもよいが、特にＧｒｂ２を用いることが好ましい。
【００１７】
キナーゼにＡＴＰ及び基質を接触させることにより、キナーゼの作用で基質中のチロシン残基がリン酸化される。ここで、リン酸化されたチロシン残基を有する基質（以下、リン酸化基質とする）に特異的に結合する標識物質と、リン酸化基質とを接触させ、これらを結合させる。リン酸化基質に結合した標識物質の標識を検出することにより、キナーゼの活性を測定することが可能となる。
【００１８】
標識物質としては、リン酸化基質に特異的に結合し、検出可能なシグナルを発することのできる物質（以下、シグナル発生物質とする）を有していれば特に限定されない。
例えば、シグナル発生物質とリン酸化基質に特異的に結合する抗体とからなる標識物質を用いることができる。この場合、リン酸化基質に標識物質が結合することによってこの標識物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定することが可能となる。
また、標識物質として、リン酸化基質に特異的に結合可能であり、且つアビジン又はビオチンを付加した抗体と、ビオチン又はアビジンを付加したシグナル発生物質とを用いることも可能である。この場合、リン酸化基質に前記抗体が結合し、さらに抗体に付加したアビジン又はビオチンに、シグナル発生物質に付加したビオチン又はアビジンが結合する。次いでシグナル発生物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定する。
また、標識物質として、リン酸化基質に特異的に結合する一次抗体と、この一次抗体に特異的に結合可能であり、且つアビジン又はビオチンを付加した二次抗体と、ビオチン又はアビジンを付加したシグナル発生物質とを用いることも可能である。この場合、リン酸化基質に一次抗体が結合し、さらにこの一次抗体に二次抗体が結合し、この二次抗体のアビジン又はビオチンにシグナル発生物質のビオチン又はアビジンが結合する。次いで、シグナル発生物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定する。
なお、本明細書における「アビジン」はストレプトアビジンをも含む。
【００１９】
シグナル発生物質としては、検出可能なシグナルを発生することができれば何れを用いてもよい。例えば、放射性同位体、蛍光物質、発色物質などを用いることができるが、蛍光物質を用いることが好ましい。蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮＩＩ、ＹＯＹＯ、ＧＦＰなどを用いることができる。
【００２０】
抗体を有する標識物質を用いる場合、抗体としては基質中のリン酸化されたチロシン（以下、リン酸化チロシンとする）に特異的に結合する抗体を用いることが好ましい。また、抗体として、動物の血液から精製して得られる抗体、遺伝子組み換えによって得られる抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はこれらのうち少なくとも二種類を混合したものなどを用いることができる。ここでいう抗体とは、抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, Journal of Immunology, 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなど他のサブクラスの抗体を用いてもよい。
【００２１】
Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴなどのキナーゼの活性を測定する方法としては、自己リン酸化したキナーゼに特異的に結合する標識抗体を用いて活性を検出するキナーゼ活性測定方法（以下、自己リン酸化測定方法とする）がある。これは、Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴなどのキナーゼが自己リン酸化することで活性化し、基質にリン酸基を導入できるようになることに基づいている。しかしながら、この方法は、実際にリン酸化した基質を直接的に測定したものではなく、これらのキナーゼの自己リン酸化の程度とキナーゼが基質をリン酸化する程度とが一致するとは限らない。このため、リン酸化した基質を直接的に検出する本実施形態の測定方法の方が上述の自己リン酸化測定方法よりも正確にキナーゼの活性を測定することが可能である。
【００２２】
本実施形態のキナーゼ活性測定方法によって測定された活性値に基づいて、患者に対するグリベックの有効性を判定することができる。
【００２３】
グリベックはメシル酸イマチニブを主成分とする抗悪性腫瘍剤であり、現在のところＣＭＬやＧＩＳＴに対して有効であることが確認されている。メシル酸イマチニブは、キナーゼのＡＴＰ結合部位に嵌まり込むため、ＡＴＰ結合部位にメシル酸イマチニブが結合したキナーゼにはＡＴＰが結合できなくなる。これによってキナーゼ活性が阻害され、ＣＭＬやＧＩＳＴに対して抗腫瘍効果を発揮する。
【００２４】
グリベックは、ＣＭＬ患者のうちＢｃｒ／Ａｂｌが高活性である患者に対して効果的であり、ＧＩＳＴ患者のうちＫＩＴが高活性である患者に対して効果的である。このため、上記のキナーゼ活性測定方法で測定されたキナーゼの活性値は、患者に対するグリベック投与の有効性を判定する際の指標とすることができ、グリベック投与が有効であると判定された患者にのみ選択的にグリベック投与を行なうことができる。グリベックの有効性を判定する際、例えば閾値を設定して活性値と比較することにより判定してもよい。具体的には、測定されたキナーゼの活性値と、これに対応する閾値とを比較し、活性値が閾値以上であった場合はグリベックの投与が有効であると判定され、活性値が閾値未満であった場合はグリベックの投与が有効ではないと判定される。閾値の設定としては、例えば、グリベック投与前のＣＭＬ患者集団又はＧＩＳＴ患者集団のそれぞれの腫瘍細胞のＢｃｒ／Ａｂｌ活性又はＫＩＴ活性を測定し、これらの患者に一定期間グリベックを投与してその薬効を調べ、Ｂｃｒ／Ａｂｌ活性値又はＫＩＴ活性値とグリベックの薬効の有無を対比させて、前記集団をグリベック投与が効果的である患者集団とグリベック投与が効果的でない患者集団を高率に分類できる活性値を閾値とすることができる。
【００２５】
また、キナーゼの活性値によってグリベックの投与量を調節し、患者の薬効に合わせた治療を行なうことも可能である。
【００２６】
グリベックの有効性を判定する際に用いられる試料としては、ＣＭＬ患者やＧＩＳＴ患者から採取した腫瘍細胞や腫瘍細胞塊などを含む試料を用いることができる。また、これらを物理的及び／又は化学的処理により可溶化した液体試料、或いはその液体試料を遠心分離するなどしてさらに精製した試料などを用いることもできる。
【００２７】
本実施形態のキナーゼ活性測定試薬は、キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸化基質に結合可能な標識物質と、を含有する。上記成分は、単一の容器に収容してもよいし、少なくとも一つの成分を別の容器に収容してもよい。好ましくは、基質とＡＴＰと含有する第一試薬を第一容器に収容し、標識物質を含有する第二試薬を第二容器に収容する。また、標識物質が、例えば一次抗体、二次抗体及びシグナル発生物質からなる場合、これらをそれぞれ別の容器に収容することが好ましい。
試薬にはｐＨを緩衝するために緩衝液を含有させてもよい。緩衝液の種類は特に限定されないが、例えばグッド緩衝液、リン酸緩衝液などを用いることができる。各成分を複数の容器に収容した場合、それぞれの容器に緩衝液を含有させることができる。
【００２８】
（実施例１）メシル酸イマチニブによるＢｃｒ／Ａｂｌの活性阻害
１．測定用試料の調製
ＣＭＬ患者から株化されたＫＵ８１２細胞をIP buffer（0.1% NP-40, 25mM Tris (pH 7.4), 150mM NaCl, 25mM NaF, 0.5mM Vanadate, 1mM DTT, 100μg/ml PMSF, 0.2% Protease inhibitorを含む）中でホモジナイズし、ライセートを調製した。得られたライセートをライセート中のタンパク質が５０μｇとなるように調製してこれを測定用試料Ａとし、５つの容器i〜vにそれぞれ収容した。
【００２９】
２．免疫沈降
容器i〜vに収容された測定用試料Ａについて以下のようにして免疫沈降を行なった。
５０％プロテインＡビーズ（Amersham社）４０μｌに抗Ｂｃｒ抗体であるBcr（N-20）:sc-885（Santa Cruz社）５μｇを結合させた。Bcr（N-20）:sc-885を結合させたプロテインＡビーズを各容器に添加し、ここにIP bufferをそれぞれ２０μｌ添加した。次に、各容器を４℃で一時間穏やかに攪拌して各容器に収容された測定用試料Ａに含まれるＢｃｒ／ＡｂｌをプロテインＡビーズに捕捉させた。
各容器i〜vにさらにIP bufferを１ｍｌずつ添加し、転倒混和によりＢｃｒ／Ａｂｌが結合したプロテインＡビーズを洗浄し、遠心分離後上清を廃棄した。各容器にTS buffer（50mM Tris, 150mM NaClを含む）を１ｍｌずつ添加し、転倒混和して洗浄、遠心分離後上清を廃棄した。さらに各容器にTris buffer（50mM Trisを含む）を１ｍｌずつ添加し、転倒混和して洗浄、遠心分離後上清を廃棄した。
【００３０】
４．キナーゼ反応
免疫沈降後、各容器にＭＢＰ（Sigma社）４０μｇ、ＡＴＰ(Sigma社)２ｍＭ及び緩衝液（50mM Tris (pH7.4), 10mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 0.375% Brij 35, 0.1mg/ml BSA, 1mM DTTを含む）を含むＢｃｒ／Ａｂｌ反応用試薬を添加した。さらに、容器iiに０．１μＭのメシル酸イマチニブ、容器iiiに１μＭのメシル酸イマチニブ、容器ivに１０μＭのメシル酸イマチニブ、容器vに１００μＭのメシル酸イマチニブを添加した。なお、容器iにはメシル酸イマチニブを添加しなかった。
メシル酸イマチニブ添加後、各容器を３０℃で３０分間激しく攪拌し、キナーゼ反応を行った。
【００３１】
５．検出
キナーゼ反応によってリン酸化されたチロシン残基の量がＢｃｒ／Ａｂｌの活性値となる。
キナーゼ反応後、各容器に収容された測定用試料ＡにＴＢＳを添加して、測定用試料Ａ中に含まれる全タンパク質量が０．４μｇ／５０μｌとなるように調製し、ＰＶＤＦメンブレンをセットしたスロットブロッターの各ウェルに測定用試料Ａを５０μｌずつ収容した。ウェルの底面即ちＰＶＤＦメンブレンの裏側からウェル中の試料を吸引し、ＰＶＤＦメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。ＰＶＤＦメンブレンをスロットブロッターから分離し、一次抗体溶液8ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうした後、ＴＢＳで洗浄した。次に二次抗体溶液8ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうした。
一次抗体溶液には、リン酸化チロシンに特異的に結合する抗体であるanti-pTyr (4G10) mouse（Upstate社）が一次抗体として含まれていた。また、二次抗体溶液には、一次抗体に特異的に結合する抗体であるBiotinylated F(ab')2 Fragment of rabbit anti-mouse IgG (DAKO社)が二次抗体として含まれていた。なお、二次抗体にはビオチンが付加されていた。
一次抗体溶液及び二次抗体溶液に反応させ、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳで洗浄した後、Streptavidin FITC (Vector社)を含有するＦＩＴＣ溶液8ｍｌ（２μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうし、ＰＶＤＦメンブレン上のリン酸化基質をＦＩＴＣで標識した。その後、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳで洗浄し、さらに蒸留水で洗浄した。洗浄後ＰＶＤＦメンブレンを60度で乾燥させ、ＰＶＤＦメンブレンに吸着されたリン酸化基質の蛍光強度をイメージアナライザ（BIO-RAD社）によって分析、蛍光強度を測定し、予め作製しておいた検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたリン酸化基質を定量した。
【００３２】
以下に検量線の作成方法を説明する。先ず、ウサギIgG抗体溶液を５種類の濃度となるように、１μｇ／1ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ溶液中に混和し、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ収容した。前記ウサギIgG抗体に結合可能な抗体とＦＩＴＣとからなる標識物質を用いて上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して蛍光強度と濃度との関係をグラフにすることにより検量線を作成した。
【００３３】
６．結果
図１は、容器i〜vに収容された測定用試料に含まれるキナーゼ活性の値を示すグラフである。図１は、メシル酸イマチニブの添加量が多いほどキナーゼの活性値が低いことを示している。このことより、本実施例の実験手順で測定したキナーゼ活性値は、メシル酸イマチニブによって活性阻害されるＢｃｒ／Ａｂｌの活性値であることが確認された。
【００３４】
（実施例２）Ｂｃｒ／Ａｂｌの活性の測定
１．測定用試料の調整
実施例１と同様にして含有する全タンパク質量が５０μｇとなるように測定用試料Ａを調製した。さらに、含有する全タンパク質量が１００μｇとなるように測定用試料Ｂを調製し、含有する全タンパク質量が１５０μｇとなるように測定用試料Ｃを調製した。また、ネガティブコントロールとして、IP bufferのみからなる測定用試料Ｄを調製した。
【００３５】
２．免疫沈降、キナーゼ反応及び検出
実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ａ〜Ｄについて免疫沈降を行なった。免疫沈降後、メシル酸イマチニブを添加しないこと以外は実施例１と同様の手順で測定用試料Ａ〜Ｄについてキナーゼ反応を行なった。キナーゼ反応後、実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ａ〜Ｄについて検出を行なった。
【００３６】
３．結果
図２は、測定用試料Ａ〜Ｄのキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。図２より、各測定用試料に含まれるＢｃｒ／Ａｂｌの活性値は、各測定用試料に含まれるタンパク質の量に比例しており、極めて良好な定量性を示した。このことより、各測定用試料中のＢｃｒ／Ａｂｌの活性値が正確に測定できたことが判った。
【００３７】
（実施例３）ＫＩＴ活性測定に有用な基質の選択
１．測定用試料の調製
ＧＩＳＴ患者から株化されたＨＥＬ細胞をIP buffer中でホモジナイズし、ライセートを調製した。得られたライセートをライセート中のタンパク質が５０μｇとなるように調製してこれを測定用試料Ｅとし、３つの容器vi〜viiにそれぞれ収容した。
【００３８】
２．免疫沈降
抗Ｂｃｒ抗体ではなく、抗ＫＩＴ抗体であるＣ−１９（Santa Cruz社）を用いること以外は、実施例１と同様の実験手順で容器vi〜viiiに収容した測定用試料Ｅについて免疫沈降を行なった。
【００３９】
３．キナーゼ反応
免疫沈降後、三種類のＫＩＴ反応用試薬を調整し、それぞれを容器vi〜容器viiiに添加した。容器viには、ＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬（ＭＢＰ４．４μｇ、ＡＴＰ２ｍＭ、50mM Tris (pH7.4), 10mM MgCl2, 10mM MnCl2, 0.1mM EDTA, 0.375% Brij35及び1mM DTTを含む）を添加した。容器viiには、ヒストンＨ１含有ＫＩＴ反応用試薬（４．４μｇのＭＢＰではなく、４．４μｇのヒストンＨ１を含有する以外はＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬と同じ組成である）を添加した。容器viiiには、Ｇｒｂ２含有ＫＩＴ反応用試薬（４．４μｇのＭＢＰではなく、４．４μｇのＧｒｂ２を含有する以外はＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬と同じ組成である）を添加した。
ＫＩＴ反応用試薬を添加した後、各容器を３０℃で３０分間激しく攪拌し、キナーゼ反応を行った。
【００４０】
４．検出
実施例１と同様にして容器vi〜viiiに収容された測定用試料Ｅについて検出を行なった。
【００４１】
５．結果
図３は、ブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図３のレーンVIは容器viに収容された試料中のＭＢＰをブロッティングしたものであり、レーンVIIは容器viiに収容された試料中のヒストンＨ１をブロッティングしたものであり、レーンVIIIは容器viiiに収容された試料中のＧｒｂ２をブロッティングしたものである。図３より、レーンVIIIにのみ蛍光が観察された（図３中、矢印で示す）。即ち、ＫＩＴの作用によりＧｒｂ２のみがリン酸化され、ＦＩＴＣにより標識されたことが判る。従って、ＫＩＴの活性を測定するための基質としてはＧｒｂ２が最も好ましく用いられることが判明した。
【００４２】
（実施例４）Ｇｒｂ２を用いたＫＩＴ活性値の測定
１．測定用試料の調製
実施例３と同様にして含有する全タンパク質量が５０μｇである測定用試料Ｅを調製した。さらに、全タンパク質量が７５μｇとなるように測定用試料Ｆを調製した。また、ネガティブコントロールとしてIP bufferのみからなる測定用試料Ｄを調製した。
【００４３】
２．免疫沈降
実施例３と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについて免疫沈降を行なった。
【００４４】
３．キナーゼ反応
免疫沈降後、各測定用試料にＧｒｂ２を４．４μｇ添加し、実験例３と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについてキナーゼ反応を行なった。
【００４５】
４．検出
実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについて検出を行なった。
【００４６】
５．結果
図４はブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図５中、レーンＤはキナーゼ反応後の測定用試料Ｄをブロッティングしたものであり、レーンＥはキナーゼ反応後の測定用試料Ｅをブロッティングしたものであり、レーンＦはキナーゼ反応後の測定用試料Ｆをブロッティングしたものである。一番左のレーンはラダーである。図５は、図４のブロッティング結果を示すグラフである。図５より、各測定用試料に含まれるＫＩＴの活性値は、各測定用試料に含まれるタンパク質の量に比例しており、極めて良好な定量性を示した。このことより、各測定用試料中のＫＩＴの活性値が正確に測定できたことが判った。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】容器i〜vに収容された測定用試料に含まれるキナーゼ活性の値を示すグラフである。
【図２】測定用試料Ａ〜Ｄのキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるブロッティングの結果を示す蛍光写真である。
【図４】実施例４におけるブロッティングの結果を示す蛍光写真である。
【図５】図４のブロッティング結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するキナーゼ活性測定方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者の腫瘍細胞には、９番染色体と２２番染色体とが相互転座することにより形成されたフィラデルフィア染色体と呼ばれる異常染色体が特異的に見られる。９番染色体にはｃ−ａｂｌという遺伝子があり、この遺伝子の近傍で断裂が起きて２２番染色体のｂｃｒ（breakpoint cluster region）という場所に転座する。これによって二つの遺伝子が融合して一つのキメラ遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌが形成される。このキメラ遺伝子がコードするキナーゼであるＢｃｒ／Ａｂｌは、細胞増殖シグナルを異常に亢進させて白血病細胞を異常増殖させ、ＣＭＬを引き起こすと考えられている。
【０００３】
また、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）はｃ・ｋｉｔ遺伝子が突然変異を起こすことにより、この遺伝子にコードされたＫＩＴと呼ばれる酵素が過剰に作用して引き起こされると考えられている。
【０００４】
ＣＭＬやＧＩＳＴに対する効果的な治療方法の一つとして、メシル酸イマチニブを有効成分とする分子標的薬グリベック（ノバルティス社）を用いた薬物療法が挙げられる。メシル酸イマチニブは、Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴのようなキナーゼと結合してその働きを阻害し、これらの疾患に対して抗腫瘍効果を発揮する。
【０００５】
しかしながら、グリベックは全てのＣＭＬ患者に抗腫瘍効果があるわけではなく、Ｂｃｒ／Ａｂｌの活性値が高いＣＭＬ患者に対してのみ高い効果がある。それにもかかわらず、ＣＭＬに対する薬物治療においては、薬物治療を受ける全ての患者に第一選択薬としてグリベックが投与される。そのため、グリベック投与の有効性の低いＣＭＬ患者に対してもグリベックを投与しているのが現状である。
【０００６】
また、グリベックは全てのＧＩＳＴ患者に抗腫瘍効果があるわけではなく、ＫＩＴの活性値が高いＧＩＳＴ患者に対してのみ高い効果がある。ＧＩＳＴに対する薬物治療においては、ＫＩＴ陽性のＧＩＳＴ患者にのみグリベックが投与される。ＫＩＴが陽性か陰性かの判定法の一つとして、ＫＩＴに特異的に結合する標識抗体を用いて摘出された腫瘍細胞を染色する免疫組織学的方法が挙げられる。しかしながら、この方法では、技師の技量によっては偽陽性となることがある。偽陽性となった場合は、本来グリベック投与の有効性が低いにもかかわらず、グリベックを投与してしまうことがある。
【０００７】
上述のようなグリベック投与の効果が小さい患者にとっては、グリベックが投与されると薬効が小さいにもかかわらず副作用などの身体的負担や治療費などの経済的負担を負わなければならない。従って、グリベックの効果が大きい患者にのみ選択的にグリベック投与を行なうために、グリベックの有効成分であるメシル酸イマチニブが標的とするキナーゼの活性を正確に測定する方法や試薬の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性値を正確に測定することが可能なキナーゼ活性測定方法及び試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、生体から採取したキナーゼを含む試料と、キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入するリン酸化工程と、リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、基質に結合した標識物質の標識に基づいてキナーゼの活性を測定する工程と、を含むキナーゼ活性測定方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するための試薬であって、キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸基を導入された基質に結合可能な標識物質と、を含有するキナーゼ活性測定試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼがリン酸化した基質の量を測定することができるため、前記キナーゼの活性値を正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のキナーゼ活性測定方法によると、以下のようにしてキナーゼの活性が測定される。先ず、キナーゼを含む試料と、このキナーゼに対する基質と、ＡＴＰとを混合する。これにより、キナーゼの作用でＡＴＰのリン酸基が基質のチロシン残基に導入される。リン酸基を導入された基質に結合可能な標識物質を結合させた後、この標識物質が発するシグナルを検出する。この検出結果に基づいてキナーゼの活性が算出される。
【００１３】
活性測定されるキナーゼとしては、メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼであれば特に限定されない。具体的には活性型Ａｂｌを有する酵素やＫＩＴなどが挙げられる。活性型Ａｂｌを有する酵素としては、Ｂｃｒ／Ａｂｌを例示できる。活性型Ａｂｌを有する酵素やＫＩＴなどは、基質となるポリペプチドのチロシン残基にリン酸基を導入するチロシンキナーゼである。
【００１４】
メシル酸イマチニブは、水溶性の粉末状物質で、化学名は4-(4-Methylpiperazin-1-ylmethyl)-N-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-ylamino)phenyl] benzamide monomethanesulfonateであり、特定のキナーゼのＡＴＰが結合すべき部位（ＡＴＰ結合部位）に結合するという性質を有する。
【００１５】
試料としては、測定対象となるキナーゼを含有するものであれば特に限定されず、腫瘍細胞や腫瘍細胞塊等を含む生体試料などを用いることができる。また、生体試料を物理的及び／又は化学的処理により可溶化した液体試料、或いはその液体試料を遠心分離するなどしてさらに精製した試料などを用いることも可能である。
【００１６】
上述の試料に含まれるキナーゼに、ＡＴＰ及び基質を接触させる。本実施形態で活性測定されるキナーゼとして、例えばＢｃｒ／Ａｂｌの活性を測定する場合、基質としてはＢｃｒ／Ａｂｌと結合可能なポリペプチドであれば何れを用いてもよい。具体的には基質としてミエリンベーシックプロテイン（ＭＢＰ）やＧｒｂ２などを用いることができるが、特にＭＢＰを用いることが好ましい。また、ＫＩＴの活性を測定する場合、基質としてはＫＩＴと結合可能なポリペプチドであれば何れを用いてもよいが、特にＧｒｂ２を用いることが好ましい。
【００１７】
キナーゼにＡＴＰ及び基質を接触させることにより、キナーゼの作用で基質中のチロシン残基がリン酸化される。ここで、リン酸化されたチロシン残基を有する基質（以下、リン酸化基質とする）に特異的に結合する標識物質と、リン酸化基質とを接触させ、これらを結合させる。リン酸化基質に結合した標識物質の標識を検出することにより、キナーゼの活性を測定することが可能となる。
【００１８】
標識物質としては、リン酸化基質に特異的に結合し、検出可能なシグナルを発することのできる物質（以下、シグナル発生物質とする）を有していれば特に限定されない。
例えば、シグナル発生物質とリン酸化基質に特異的に結合する抗体とからなる標識物質を用いることができる。この場合、リン酸化基質に標識物質が結合することによってこの標識物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定することが可能となる。
また、標識物質として、リン酸化基質に特異的に結合可能であり、且つアビジン又はビオチンを付加した抗体と、ビオチン又はアビジンを付加したシグナル発生物質とを用いることも可能である。この場合、リン酸化基質に前記抗体が結合し、さらに抗体に付加したアビジン又はビオチンに、シグナル発生物質に付加したビオチン又はアビジンが結合する。次いでシグナル発生物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定する。
また、標識物質として、リン酸化基質に特異的に結合する一次抗体と、この一次抗体に特異的に結合可能であり、且つアビジン又はビオチンを付加した二次抗体と、ビオチン又はアビジンを付加したシグナル発生物質とを用いることも可能である。この場合、リン酸化基質に一次抗体が結合し、さらにこの一次抗体に二次抗体が結合し、この二次抗体のアビジン又はビオチンにシグナル発生物質のビオチン又はアビジンが結合する。次いで、シグナル発生物質が発するシグナルを検出し、キナーゼの活性を測定する。
なお、本明細書における「アビジン」はストレプトアビジンをも含む。
【００１９】
シグナル発生物質としては、検出可能なシグナルを発生することができれば何れを用いてもよい。例えば、放射性同位体、蛍光物質、発色物質などを用いることができるが、蛍光物質を用いることが好ましい。蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮＩＩ、ＹＯＹＯ、ＧＦＰなどを用いることができる。
【００２０】
抗体を有する標識物質を用いる場合、抗体としては基質中のリン酸化されたチロシン（以下、リン酸化チロシンとする）に特異的に結合する抗体を用いることが好ましい。また、抗体として、動物の血液から精製して得られる抗体、遺伝子組み換えによって得られる抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はこれらのうち少なくとも二種類を混合したものなどを用いることができる。ここでいう抗体とは、抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, Journal of Immunology, 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなど他のサブクラスの抗体を用いてもよい。
【００２１】
Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴなどのキナーゼの活性を測定する方法としては、自己リン酸化したキナーゼに特異的に結合する標識抗体を用いて活性を検出するキナーゼ活性測定方法（以下、自己リン酸化測定方法とする）がある。これは、Ｂｃｒ／ＡｂｌやＫＩＴなどのキナーゼが自己リン酸化することで活性化し、基質にリン酸基を導入できるようになることに基づいている。しかしながら、この方法は、実際にリン酸化した基質を直接的に測定したものではなく、これらのキナーゼの自己リン酸化の程度とキナーゼが基質をリン酸化する程度とが一致するとは限らない。このため、リン酸化した基質を直接的に検出する本実施形態の測定方法の方が上述の自己リン酸化測定方法よりも正確にキナーゼの活性を測定することが可能である。
【００２２】
本実施形態のキナーゼ活性測定方法によって測定された活性値に基づいて、患者に対するグリベックの有効性を判定することができる。
【００２３】
グリベックはメシル酸イマチニブを主成分とする抗悪性腫瘍剤であり、現在のところＣＭＬやＧＩＳＴに対して有効であることが確認されている。メシル酸イマチニブは、キナーゼのＡＴＰ結合部位に嵌まり込むため、ＡＴＰ結合部位にメシル酸イマチニブが結合したキナーゼにはＡＴＰが結合できなくなる。これによってキナーゼ活性が阻害され、ＣＭＬやＧＩＳＴに対して抗腫瘍効果を発揮する。
【００２４】
グリベックは、ＣＭＬ患者のうちＢｃｒ／Ａｂｌが高活性である患者に対して効果的であり、ＧＩＳＴ患者のうちＫＩＴが高活性である患者に対して効果的である。このため、上記のキナーゼ活性測定方法で測定されたキナーゼの活性値は、患者に対するグリベック投与の有効性を判定する際の指標とすることができ、グリベック投与が有効であると判定された患者にのみ選択的にグリベック投与を行なうことができる。グリベックの有効性を判定する際、例えば閾値を設定して活性値と比較することにより判定してもよい。具体的には、測定されたキナーゼの活性値と、これに対応する閾値とを比較し、活性値が閾値以上であった場合はグリベックの投与が有効であると判定され、活性値が閾値未満であった場合はグリベックの投与が有効ではないと判定される。閾値の設定としては、例えば、グリベック投与前のＣＭＬ患者集団又はＧＩＳＴ患者集団のそれぞれの腫瘍細胞のＢｃｒ／Ａｂｌ活性又はＫＩＴ活性を測定し、これらの患者に一定期間グリベックを投与してその薬効を調べ、Ｂｃｒ／Ａｂｌ活性値又はＫＩＴ活性値とグリベックの薬効の有無を対比させて、前記集団をグリベック投与が効果的である患者集団とグリベック投与が効果的でない患者集団を高率に分類できる活性値を閾値とすることができる。
【００２５】
また、キナーゼの活性値によってグリベックの投与量を調節し、患者の薬効に合わせた治療を行なうことも可能である。
【００２６】
グリベックの有効性を判定する際に用いられる試料としては、ＣＭＬ患者やＧＩＳＴ患者から採取した腫瘍細胞や腫瘍細胞塊などを含む試料を用いることができる。また、これらを物理的及び／又は化学的処理により可溶化した液体試料、或いはその液体試料を遠心分離するなどしてさらに精製した試料などを用いることもできる。
【００２７】
本実施形態のキナーゼ活性測定試薬は、キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸化基質に結合可能な標識物質と、を含有する。上記成分は、単一の容器に収容してもよいし、少なくとも一つの成分を別の容器に収容してもよい。好ましくは、基質とＡＴＰと含有する第一試薬を第一容器に収容し、標識物質を含有する第二試薬を第二容器に収容する。また、標識物質が、例えば一次抗体、二次抗体及びシグナル発生物質からなる場合、これらをそれぞれ別の容器に収容することが好ましい。
試薬にはｐＨを緩衝するために緩衝液を含有させてもよい。緩衝液の種類は特に限定されないが、例えばグッド緩衝液、リン酸緩衝液などを用いることができる。各成分を複数の容器に収容した場合、それぞれの容器に緩衝液を含有させることができる。
【００２８】
（実施例１）メシル酸イマチニブによるＢｃｒ／Ａｂｌの活性阻害
１．測定用試料の調製
ＣＭＬ患者から株化されたＫＵ８１２細胞をIP buffer（0.1% NP-40, 25mM Tris (pH 7.4), 150mM NaCl, 25mM NaF, 0.5mM Vanadate, 1mM DTT, 100μg/ml PMSF, 0.2% Protease inhibitorを含む）中でホモジナイズし、ライセートを調製した。得られたライセートをライセート中のタンパク質が５０μｇとなるように調製してこれを測定用試料Ａとし、５つの容器i〜vにそれぞれ収容した。
【００２９】
２．免疫沈降
容器i〜vに収容された測定用試料Ａについて以下のようにして免疫沈降を行なった。
５０％プロテインＡビーズ（Amersham社）４０μｌに抗Ｂｃｒ抗体であるBcr（N-20）:sc-885（Santa Cruz社）５μｇを結合させた。Bcr（N-20）:sc-885を結合させたプロテインＡビーズを各容器に添加し、ここにIP bufferをそれぞれ２０μｌ添加した。次に、各容器を４℃で一時間穏やかに攪拌して各容器に収容された測定用試料Ａに含まれるＢｃｒ／ＡｂｌをプロテインＡビーズに捕捉させた。
各容器i〜vにさらにIP bufferを１ｍｌずつ添加し、転倒混和によりＢｃｒ／Ａｂｌが結合したプロテインＡビーズを洗浄し、遠心分離後上清を廃棄した。各容器にTS buffer（50mM Tris, 150mM NaClを含む）を１ｍｌずつ添加し、転倒混和して洗浄、遠心分離後上清を廃棄した。さらに各容器にTris buffer（50mM Trisを含む）を１ｍｌずつ添加し、転倒混和して洗浄、遠心分離後上清を廃棄した。
【００３０】
４．キナーゼ反応
免疫沈降後、各容器にＭＢＰ（Sigma社）４０μｇ、ＡＴＰ(Sigma社)２ｍＭ及び緩衝液（50mM Tris (pH7.4), 10mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 0.375% Brij 35, 0.1mg/ml BSA, 1mM DTTを含む）を含むＢｃｒ／Ａｂｌ反応用試薬を添加した。さらに、容器iiに０．１μＭのメシル酸イマチニブ、容器iiiに１μＭのメシル酸イマチニブ、容器ivに１０μＭのメシル酸イマチニブ、容器vに１００μＭのメシル酸イマチニブを添加した。なお、容器iにはメシル酸イマチニブを添加しなかった。
メシル酸イマチニブ添加後、各容器を３０℃で３０分間激しく攪拌し、キナーゼ反応を行った。
【００３１】
５．検出
キナーゼ反応によってリン酸化されたチロシン残基の量がＢｃｒ／Ａｂｌの活性値となる。
キナーゼ反応後、各容器に収容された測定用試料ＡにＴＢＳを添加して、測定用試料Ａ中に含まれる全タンパク質量が０．４μｇ／５０μｌとなるように調製し、ＰＶＤＦメンブレンをセットしたスロットブロッターの各ウェルに測定用試料Ａを５０μｌずつ収容した。ウェルの底面即ちＰＶＤＦメンブレンの裏側からウェル中の試料を吸引し、ＰＶＤＦメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。ＰＶＤＦメンブレンをスロットブロッターから分離し、一次抗体溶液8ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうした後、ＴＢＳで洗浄した。次に二次抗体溶液8ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうした。
一次抗体溶液には、リン酸化チロシンに特異的に結合する抗体であるanti-pTyr (4G10) mouse（Upstate社）が一次抗体として含まれていた。また、二次抗体溶液には、一次抗体に特異的に結合する抗体であるBiotinylated F(ab')2 Fragment of rabbit anti-mouse IgG (DAKO社)が二次抗体として含まれていた。なお、二次抗体にはビオチンが付加されていた。
一次抗体溶液及び二次抗体溶液に反応させ、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳで洗浄した後、Streptavidin FITC (Vector社)を含有するＦＩＴＣ溶液8ｍｌ（２μｇ／ｍｌ）と共に６０分間振とうし、ＰＶＤＦメンブレン上のリン酸化基質をＦＩＴＣで標識した。その後、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳで洗浄し、さらに蒸留水で洗浄した。洗浄後ＰＶＤＦメンブレンを60度で乾燥させ、ＰＶＤＦメンブレンに吸着されたリン酸化基質の蛍光強度をイメージアナライザ（BIO-RAD社）によって分析、蛍光強度を測定し、予め作製しておいた検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたリン酸化基質を定量した。
【００３２】
以下に検量線の作成方法を説明する。先ず、ウサギIgG抗体溶液を５種類の濃度となるように、１μｇ／1ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ溶液中に混和し、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ収容した。前記ウサギIgG抗体に結合可能な抗体とＦＩＴＣとからなる標識物質を用いて上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して蛍光強度と濃度との関係をグラフにすることにより検量線を作成した。
【００３３】
６．結果
図１は、容器i〜vに収容された測定用試料に含まれるキナーゼ活性の値を示すグラフである。図１は、メシル酸イマチニブの添加量が多いほどキナーゼの活性値が低いことを示している。このことより、本実施例の実験手順で測定したキナーゼ活性値は、メシル酸イマチニブによって活性阻害されるＢｃｒ／Ａｂｌの活性値であることが確認された。
【００３４】
（実施例２）Ｂｃｒ／Ａｂｌの活性の測定
１．測定用試料の調整
実施例１と同様にして含有する全タンパク質量が５０μｇとなるように測定用試料Ａを調製した。さらに、含有する全タンパク質量が１００μｇとなるように測定用試料Ｂを調製し、含有する全タンパク質量が１５０μｇとなるように測定用試料Ｃを調製した。また、ネガティブコントロールとして、IP bufferのみからなる測定用試料Ｄを調製した。
【００３５】
２．免疫沈降、キナーゼ反応及び検出
実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ａ〜Ｄについて免疫沈降を行なった。免疫沈降後、メシル酸イマチニブを添加しないこと以外は実施例１と同様の手順で測定用試料Ａ〜Ｄについてキナーゼ反応を行なった。キナーゼ反応後、実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ａ〜Ｄについて検出を行なった。
【００３６】
３．結果
図２は、測定用試料Ａ〜Ｄのキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。図２より、各測定用試料に含まれるＢｃｒ／Ａｂｌの活性値は、各測定用試料に含まれるタンパク質の量に比例しており、極めて良好な定量性を示した。このことより、各測定用試料中のＢｃｒ／Ａｂｌの活性値が正確に測定できたことが判った。
【００３７】
（実施例３）ＫＩＴ活性測定に有用な基質の選択
１．測定用試料の調製
ＧＩＳＴ患者から株化されたＨＥＬ細胞をIP buffer中でホモジナイズし、ライセートを調製した。得られたライセートをライセート中のタンパク質が５０μｇとなるように調製してこれを測定用試料Ｅとし、３つの容器vi〜viiにそれぞれ収容した。
【００３８】
２．免疫沈降
抗Ｂｃｒ抗体ではなく、抗ＫＩＴ抗体であるＣ−１９（Santa Cruz社）を用いること以外は、実施例１と同様の実験手順で容器vi〜viiiに収容した測定用試料Ｅについて免疫沈降を行なった。
【００３９】
３．キナーゼ反応
免疫沈降後、三種類のＫＩＴ反応用試薬を調整し、それぞれを容器vi〜容器viiiに添加した。容器viには、ＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬（ＭＢＰ４．４μｇ、ＡＴＰ２ｍＭ、50mM Tris (pH7.4), 10mM MgCl2, 10mM MnCl2, 0.1mM EDTA, 0.375% Brij35及び1mM DTTを含む）を添加した。容器viiには、ヒストンＨ１含有ＫＩＴ反応用試薬（４．４μｇのＭＢＰではなく、４．４μｇのヒストンＨ１を含有する以外はＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬と同じ組成である）を添加した。容器viiiには、Ｇｒｂ２含有ＫＩＴ反応用試薬（４．４μｇのＭＢＰではなく、４．４μｇのＧｒｂ２を含有する以外はＭＢＰ含有ＫＩＴ反応用試薬と同じ組成である）を添加した。
ＫＩＴ反応用試薬を添加した後、各容器を３０℃で３０分間激しく攪拌し、キナーゼ反応を行った。
【００４０】
４．検出
実施例１と同様にして容器vi〜viiiに収容された測定用試料Ｅについて検出を行なった。
【００４１】
５．結果
図３は、ブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図３のレーンVIは容器viに収容された試料中のＭＢＰをブロッティングしたものであり、レーンVIIは容器viiに収容された試料中のヒストンＨ１をブロッティングしたものであり、レーンVIIIは容器viiiに収容された試料中のＧｒｂ２をブロッティングしたものである。図３より、レーンVIIIにのみ蛍光が観察された（図３中、矢印で示す）。即ち、ＫＩＴの作用によりＧｒｂ２のみがリン酸化され、ＦＩＴＣにより標識されたことが判る。従って、ＫＩＴの活性を測定するための基質としてはＧｒｂ２が最も好ましく用いられることが判明した。
【００４２】
（実施例４）Ｇｒｂ２を用いたＫＩＴ活性値の測定
１．測定用試料の調製
実施例３と同様にして含有する全タンパク質量が５０μｇである測定用試料Ｅを調製した。さらに、全タンパク質量が７５μｇとなるように測定用試料Ｆを調製した。また、ネガティブコントロールとしてIP bufferのみからなる測定用試料Ｄを調製した。
【００４３】
２．免疫沈降
実施例３と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについて免疫沈降を行なった。
【００４４】
３．キナーゼ反応
免疫沈降後、各測定用試料にＧｒｂ２を４．４μｇ添加し、実験例３と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについてキナーゼ反応を行なった。
【００４５】
４．検出
実施例１と同様の実験手順で測定用試料Ｄ〜Ｆについて検出を行なった。
【００４６】
５．結果
図４はブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図５中、レーンＤはキナーゼ反応後の測定用試料Ｄをブロッティングしたものであり、レーンＥはキナーゼ反応後の測定用試料Ｅをブロッティングしたものであり、レーンＦはキナーゼ反応後の測定用試料Ｆをブロッティングしたものである。一番左のレーンはラダーである。図５は、図４のブロッティング結果を示すグラフである。図５より、各測定用試料に含まれるＫＩＴの活性値は、各測定用試料に含まれるタンパク質の量に比例しており、極めて良好な定量性を示した。このことより、各測定用試料中のＫＩＴの活性値が正確に測定できたことが判った。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】容器i〜vに収容された測定用試料に含まれるキナーゼ活性の値を示すグラフである。
【図２】測定用試料Ａ〜Ｄのキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるブロッティングの結果を示す蛍光写真である。
【図４】実施例４におけるブロッティングの結果を示す蛍光写真である。
【図５】図４のブロッティング結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、
生体から採取したキナーゼを含む試料と、前記キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、前記キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入する工程と、
前記リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、
前記基質に結合した前記標識物質の標識に基づいて前記キナーゼの活性を測定する工程と、
を含むキナーゼ活性測定方法。
【請求項２】
前記キナーゼが活性型Ａｂｌを有するキナーゼである請求項１記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項３】
前記活性型Ａｂｌを有するキナーゼがＢｃｒ／Ａｂｌである請求項２に記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項４】
前記基質がミエリンベーシックプロテインである請求項１~３の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項５】
前記試料が慢性骨髄性白血病の患者から採取された生体試料である請求項１〜４の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項６】
前記キナーゼがＫＩＴである請求項１記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項７】
前記基質がＧｒｂ２である請求項１又は６記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項８】
前記試料が消化管間質腫瘍の患者から採取された生体試料である請求項１、請求項６及び請求項７の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項９】
メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するための試薬であって、前記キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸基を導入された前記基質に結合可能な標識物質と、を含有するキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１０】
前記標識物質が、前記リン酸基を導入された基質に結合可能な抗体とシグナル発生物質とを有する請求項９記載のキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１１】
前記標識物質が、前記リン酸基を導入された基質に結合可能な一次抗体と、前記一次抗体に結合可能であり、アビジン又はビオチンを結合させた二次抗体と、ビオチン又はアビジンを結合させたシグナル発生物質とからなる請求項９又は１０記載のキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１２】
前記シグナル発生物質が蛍光物質である請求項１０〜１１の何れかに記載のキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１】
メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定する方法であって、
生体から採取したキナーゼを含む試料と、前記キナーゼの基質と、ＡＴＰとを接触させ、前記キナーゼの作用で前記基質にリン酸基を導入する工程と、
前記リン酸基を導入された基質に標識物質を結合させる工程と、
前記基質に結合した前記標識物質の標識に基づいて前記キナーゼの活性を測定する工程と、
を含むキナーゼ活性測定方法。
【請求項２】
前記キナーゼが活性型Ａｂｌを有するキナーゼである請求項１記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項３】
前記活性型Ａｂｌを有するキナーゼがＢｃｒ／Ａｂｌである請求項２に記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項４】
前記基質がミエリンベーシックプロテインである請求項１~３の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項５】
前記試料が慢性骨髄性白血病の患者から採取された生体試料である請求項１〜４の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項６】
前記キナーゼがＫＩＴである請求項１記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項７】
前記基質がＧｒｂ２である請求項１又は６記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項８】
前記試料が消化管間質腫瘍の患者から採取された生体試料である請求項１、請求項６及び請求項７の何れかに記載のキナーゼ活性測定方法。
【請求項９】
メシル酸イマチニブが結合可能なキナーゼの活性を測定するための試薬であって、前記キナーゼの基質と、ＡＴＰと、リン酸基を導入された前記基質に結合可能な標識物質と、を含有するキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１０】
前記標識物質が、前記リン酸基を導入された基質に結合可能な抗体とシグナル発生物質とを有する請求項９記載のキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１１】
前記標識物質が、前記リン酸基を導入された基質に結合可能な一次抗体と、前記一次抗体に結合可能であり、アビジン又はビオチンを結合させた二次抗体と、ビオチン又はアビジンを結合させたシグナル発生物質とからなる請求項９又は１０記載のキナーゼ活性測定試薬。
【請求項１２】
前記シグナル発生物質が蛍光物質である請求項１０〜１１の何れかに記載のキナーゼ活性測定試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−８２（Ｐ２００７−８２Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８４０９３（Ｐ２００５−１８４０９３）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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