キノコ類栽培方法
【課題】菌床栽培されるキノコ類の新規な栽培方法の提供。
【解決手段】本発明は、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法、を提供する。
【解決手段】本発明は、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法、を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ類の新規な栽培方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコの消費額は、食用及び健康食品用のものを合わせると、日本国内だけでも約２，７５０億円と非常に大きく（２００５年度林野庁調べ）、特に一部のキノコについては近年の健康志向を反映して需要が増大している。これらのキノコの多くが人工的に栽培されたものであり、例えば原木に穴をあけて種菌を打ち込み、一年間、林間地など自然環境下において菌を蔓延させ（原木栽培）、又はオガコに米糠等の栄養源を加えて固めたものに種菌を接種し、空調設備を備えた施設内において菌を蔓延させることで（菌床栽培）栽培されている。一方、キノコの種類によっては人工栽培そのものが難しく、また、人工栽培に成功したとしてもハタケシメジのように増殖が遅いために商品化が困難なこともある。
【０００３】
キノコの増殖を促進させる方法としては、フスマ、米ぬかなどの窒素源を含む施用剤を適宜添加することが一般的に行われており、このような施肥は一定の効果を上げている。
【０００４】
しかしながら、施肥の効果については自ずと限界があり、用いる肥料の量を多くしても、一定以上のキノコの増殖促進効果は期待できないばかりか、肥料を多く与えすぎると、かえって植物の成長に障害となり、栄養過多の培地を廃棄することから、ひいては土壌を汚染してしまうことにもなりかねない。
【０００５】
このように、肥料の使用量を抑え、土壌環境を悪化させることなくキノコの生産量を増大させる必要性が当業界に存在している。
【０００６】
本願発明者がアオウキクサ（Lemna paucicostata)から単離したケトール脂肪酸は、花芽形成の促進のように、植物の成長が抑制されるときに生じる植物の消極的な生命活動に作用するだけでなく（特開平１１−２９４１０号公報）、植物賦活作用、例えば、植物の成長促進（茎葉の拡大、塊茎塊根の成長促進等）、休眠抑制、植物のストレスに対する抵抗性の付与、抗老化等の植物成長調節作用も有している（特開２００１−１３１００６号公報）。
【０００７】
特開２００１−１３１００６号公報において、ケトール脂肪酸はキノコ類の成長促進剤としても言及されており、具体的にはタモギダケの菌糸増殖効果及びシイタケの子実体生長促進効果が試験例Ｄで確認されている。一方、当該公報はキノコ類に対するケトール脂肪酸の最適な使用方法及び使用時期等については何ら言及していない。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２９４１０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１００６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、キノコ類の新規な栽培方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
キノコ類の増殖促進のために、本発明者が特定のケトール脂肪酸の最適な使用方法について検討したところ、ストレス曝露後の菌糸体、特に、菌床栽培における菌掻き工程後の菌子体にケトール脂肪酸を適用することで、キノコの生産量が増大することが明らかとなった。
【００１１】
即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法。
［２］菌床栽培における菌掻き工程によりストレス曝露される、［１］に記載のキノコ類の栽培方法。
［３］適用工程が菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される、［１］又は［２］に記載のキノコ類の栽培方法。
［４］適用工程が菌掻き工程終了後から２４時間以内に実施される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のキノコ類の栽培方法。
【発明の効果】
【００１２】
菌床栽培における菌掻き工程時に特定のケトール脂肪酸をキノコ類に適用することで、最終的な子実体の収量は当該工程以前に適用した場合と比較して顕著に増大する。また、一般的な植物の花芽形成促進及び賦活には３〜６０ｐｐｍ程度の量のケトール脂肪酸が必要とされるが、本発明においてはその１／１００程度の濃度からケトール脂肪酸が効果を発揮する。
【００１３】
ここで、ケトール脂肪酸は植物がストレスを受けた時に多く生成される性質を有している。理論に拘束されることを意図するものではないが、菌掻き工程は菌子体にストレスをもたらすと考えられ、本発明によるキノコの増殖促進効果はかかるストレスで生成されたケトール脂肪酸とともに噴霧されたケトール脂肪酸が菌糸体に作用することによりもたらされるものと思われる。
【００１４】
その他の効果として栽培期間の短縮が挙げられる。例えば、エリンギに適用した場合、通常９日の栽培期間が必要とされるが、本発明の栽培方法を使用することにより１〜２日収穫日を早期化することが可能となる。特に、菌糸体培養時期に当該方法を実施することで、更に栽培期間を短縮することが可能となる。尚、菌糸体培養とは、子実体を形成する前に、菌糸を菌床（培地）中に増殖させる工程である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で使用するケトール脂肪酸は、上記の通り、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸である（以下、このケトール脂肪酸を「特定ケトール脂肪酸」ともいう）。すなわち、特定ケトール脂肪酸は、その炭素原子数が４〜２４であることを特徴とする、アルコールの水酸基とケトンのカルボニル基とを同一分子内に有する脂肪酸である。
【００１６】
また、本発明において、特定ケトール脂肪酸は、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子がα位またはγ位の位置にあることが、所望するキノコ類の増殖効果を発揮するうえで好ましく、特に、α位であることがこの観点から好ましい。
【００１７】
また、特定ケトール脂肪酸には、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在することが、所望するキノコ類の増殖効果を発揮するうえで好ましい。
【００１８】
また、特定ケトール脂肪酸の炭素原子数は１８であり、かつ、炭素間の二重結合が２か所存在することが好ましい。
【００１９】
特定ケトール脂肪酸の具体例としては、例えば９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下，特定ケトール脂肪酸（Ｉ）ということもある〕、１３−ヒドロキシ−１２−オキソ−９（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下，特定ケトール脂肪酸（ＩＩ）ということもある〕、１３−ヒドロキシ−１０−オキソ−１１（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下、特定ケトール脂肪酸（ＩＩＩ）ということもある〕、９−ヒドロキシ−１２−オキソ−１０（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下、特定ケトール脂肪酸（ＩＶ）ということもある〕等を挙げることができる。
【００２０】
以下に、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）〜（ＩＶ）の化学構造式を記載する。
【００２１】
【化１】
【００２２】
なお、その他の特定ケトール脂肪酸の化学構造式並びにこれらの特定ケトール脂肪酸の化学合成法については特開２００１−１３１００６号公報（上掲）で開示されている通りである。
【００２３】
本発明によると、上記特定ケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用することにより、キノコの収量を増大させることができる。
【００２４】
菌床栽培によりキノコを栽培する場合、殺菌したキノコ用培地をポット等の栽培用のビンに詰め込み、続いてキノコ培地上に種菌を接種して菌糸が培養される。所定の培養期間後、培地表面の古い菌を掻き取ることで（「菌掻き」工程）、菌糸が集合組織化し、子実体のもととなる（原基形成）。
【００２５】
ここで、菌掻きは、上述した通り菌糸体に対し物理的なストレスを与える。具体的な態様において、本発明は、菌床栽培において、菌掻き工程後の菌糸体に上記特定ケトール脂肪酸を適用することを含んで成るキノコ類の栽培方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、上記適用は、菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される。特定ケトール脂肪酸の菌糸体への適用は、収量を増大させる観点からは、菌掻き工程終了後から２４時間以内に行うのが好ましく、６時間以内に行うのが更に好ましい。
【００２７】
尚、本発明で使用するストレス曝露とは、菌掻き工程に限定されることを意図するものではなく、生育過程のキノコに何らかのストレスを与えるものであればいずれのものでもよい。例えば、乾燥ストレス、熱ストレス、浸透圧ストレス等がこのようなストレスとして挙げられる。
【００２８】
特定ケトール脂肪酸をキノコの菌糸体に適用する量の上限は特に限定されない。一方、上記の特定ケトール脂肪酸のキノコの菌糸体に対する適用量の下限は、キノコの種類や菌糸体の大きさにより異なるが、１回の適用当り、０．１μＭ程度以上が一応の目安である。
【００２９】
特定ケトール脂肪酸の使用量は、その使用態様や使用する対象となるキノコの種類、さらには当該特定ケトール脂肪酸を含む具体的な剤形等に応じて選択することが可能である。本発明の態様として、特定ケトール脂肪酸をそのまま用いることも可能であるが、上記の特定ケトール脂肪酸の適用の目安等を勘案すると、概ね、剤全体に対して０．０３〜６０ｐｐｍ 程度が好ましく、さらに好ましくは、同０．３〜３０ｐｐｍ 程度である。例えば、ヒラタケ及びエリンギの場合、０．０５〜５０ｐｐｍ、好ましくは０．１〜４０ｐｐｍ、更に好ましくは０．３〜３０ｐｐｍである。
【００３０】
かかる剤形としては、例えば、液剤、固形剤、粉剤、乳剤、底床添加剤等の剤形が挙げられ、その剤形に応じて、製剤学上適用することが可能な公知の担体成分、製剤用補助剤等を本発明の所期の効果であるキノコの成長促進作用が損なわれない限度において、適宜配合することができる。例えば、担体成分としては、特定ケトール脂肪酸を含む剤形が底床添加剤または固形剤である場合には、概ねタルク、クレー、バーミキュライト、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機質や小麦粉、澱粉等の固体担体が；また液剤である場合には、概ね水、キシレン等の芳香族炭化水素類、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の液体担体が上記の担体成分として用いられる。また製剤用補助剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体等の非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、結合剤等を適宜配合することができる。
【００３１】
さらに必要に応じて、一般的な植物成長調節剤や、安息香酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ピペコリン酸等を、上記の本発明の所期の効果を損なわない限度において、特定ケトール脂肪酸を含む剤形中に配合することもできる。
【００３２】
前記方法で使用する特定ケトール脂肪酸は、菌掻き工程を経た菌糸体や子実体原基形成期の菌糸体の一部または全体に液剤や乳剤として散布、滴下、塗布等することや、固形剤や粉剤として培地から吸収させること等が可能である。
【００３３】
特定ケトール脂肪酸のキノコへの適用頻度は、キノコの種類や適用目的等により異なるが、基本的には、ただ１度の適用によっても所望する効果を得ることができる。複数回適用する場合には、５日程度の間隔をあけることが効率的である。
【００３４】
特定ケトール脂肪酸が適用可能なキノコの種類は、菌床栽培における菌掻きなどのように、栽培途中でキノコにストレスを与える工程が必要な栽培方法で栽培されるものであれば特に限定されない。例えば、かかるキノコとして、シイタケ、ナメコ、エノキタケ、ヒラタケ、ブナシメジ、マイタケ、エリンギ、ハタケシメジ、ウスヒラタケ等が例として挙げられる。
【００３５】
また、製剤用補助剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホンコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体の非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、又は結合剤等を適宜配合することができる。
【００３６】
さらに必要に応じて、植物生長調整剤や、安息香酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ピペコリン酸等を、本発明の所期の効果を損なわない限度において、特定ケトール脂肪酸を含む剤形中に配合することが出来る。
【実施例】
【００３７】
後述するキノコの栽培においては、特定ケトール酸として９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸が用いられる。当該特定ケトール酸は以下のとおり酵素法を用いて調製した。
【００３８】
１．コメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの調製
コメ胚芽３５０ｇを石油エーテルで洗浄、脱脂及び乾燥したもの（２５０ｇ）を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１．２５Ｌに懸濁し、この懸濁物をホモジナイズした。
【００３９】
次いで、かかるホモジナイズ抽出液を１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清（０．８Ｌ）を得た。得られた上清に硫酸アンモニウム１４０．８g （０〜３０％飽和）を加え、４℃で一晩放置した。その後、９５００rpm で３０分間遠心を行い、得られた上清（０．８５Ｌ）に硫酸アンモニウム２３２g （７０％飽和）を添加して、４℃で５時間放置した。
【００４０】
次に、同様に９５００rpm で３０分間遠心を行い、これにより得られた沈澱物（コメ胚芽抽出液の硫安３０〜７０％飽和画分）をｐＨ４．５の酢酸緩衝液３００mlに溶解し、６３℃で５分間加熱処理を行った。その後、生成した沈澱物を除去して、得られた上清をＲＣ透析チューブ（Spectrum社製ポア４：MWCO 12000〜14000 ）を用いて透析（３Ｌ×３）により脱塩後、所望するコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を得た。
【００４１】
２．アマ種子由来のアレンオキサイドシンターゼの調製
アマ種子は一丸ファルコスから購入した。このアマ種子２００g に、アセトン２５０mlを添加してホモジナイズ（２０s ×３）し、得られた沈澱物を目皿ロートで濾取し、溶媒を除去した。次いで、沈澱物を再びアセトン２５０mlに懸濁してホモジナイズ（１０s ×３）し、沈澱物を得た。沈澱物をアセトン及びエチルエーテルで洗浄後、乾燥して、アマ種子のアセトン性粉を得た（１５０g ）。
【００４２】
このアマ種子のアセトン粉末を、氷冷下５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００mlに懸濁し、これを０℃で１時間スターラー攪拌を施して抽出した。得られた抽出物に１１０００rpm で３０分間遠心し、これにより得られた上清（３８０ｍｌ）に硫酸アンモニウム１０５．３g （０〜４５％飽和）を加え、氷冷下で１時間静置し、さらに１１０００rpm で３０分間遠心して得られた沈澱物を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍｌに溶解し、透析して脱塩し（３Ｌ×３）、所望するアマ種子由来のアレンオキサイドシンターゼの粗酵素液を得た。
【００４３】
３．α−リノレン酸のナトリウム塩の調製
出発原料とするα−リノレン酸は、水における溶解性が著しく低いので、酵素基質として働くことを容易にするために、α−リノレン酸をナトリウム塩化した。すなわち、炭酸ナトリウム５３０mgを、精製水１０mlに溶解して５５℃に加温し、これにα−リノレン酸（ナカライテスク社）を２７８mg滴下して、３時間攪拌した。反応終了後、Dawex50wxk(H+ form) （ダウケミカル社製）で中和すると、沈澱物が生成した。これを濾過して樹脂を除き、MeOHで洗浄後、減圧下で溶媒を留去した。これにより得られた生成物をイソプロパノールで再結晶し、所望するα−リノレン酸のナトリウム塩（１２５０mg，８３％）を得た。
【００４４】
４．９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の製造
上記３により得られたα−リノレン酸のナトリウム塩（１５mg：５０μmol ）を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０mlに溶解した。次いで、この溶液に、酸素気流下、２５℃で上記１により得たコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を３．１８ml添加した後、３０分間攪拌した後、さらに同じくコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を３．１８mlを添加して、３０分間攪拌した。この攪拌終了後、このリポキシゲナーゼ反応物に、窒素気流下で上記２で得たアレンオキサイドシンターゼの粗酵素液を３４．５ml添加して、１時間攪拌した後、氷冷下希塩酸を添加して、反応溶液のｐＨを３．０に調整した。
【００４５】
次いで、反応液をＣＨＣｌ3 −ＭｅＯＨ＝１０：１で抽出した。得られた有機層に硫酸マグネシウムを加えて脱水し、減圧下、溶媒を留去して乾燥した。このようにして得られた粗生成物をあらためてＨＰＬＣにかけて、その特定ケトール脂肪酸（Ｉ）と認められるピーク（リテンションタイム：１６分付近）を分取した。分取した画分にクロロホルムを加え、クロロホルム層を分離して水洗し、エバポレーターでこのクロロホルムを留去して、精製物を得た。
【００４６】
この精製物の構造を確認するために重メタノール溶液で1Ｈ，及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、1Ｈ−ＮＭＲにおいて、末端メチル基〔δ0.98(t) 〕，２組のオレフィン〔（δ5.25,5.40),(δ5.55,5.62 ）〕，２級水酸基〔δ4.09(dd)〕及び多数のメチレンに基づくシグナルが認められ、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）と同一化合物と推定された。
【００４７】
さらに、13Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフト値を比較したところ、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）〔特開平１０−３２４６０２号公報第７頁の第１１欄下から第１行目以降に記載されている「製造例（抽出法）」における13Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフト値（同公開公報第８頁第１３欄第２行目以降段落番号［００５４］及び［００５５］に記載）〕と一致した。よって、上記のようにして得た酵素法による合成品は、上文で定義した特定ケトール脂肪酸に属する、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸であることが明らかとなった。
【００４８】
噴霧剤の調製
上記特定ケトール脂肪酸は、所望の濃度となるように純水中で適宜希釈することにより噴霧剤へと調製される。
【００４９】
特定ケトール脂肪酸の噴霧時期の検討
ヒラタケとブナシメジを用いて、特定ケトール脂肪酸を栽培期間のうち、いつ噴霧するのがもっとも効果的であるかを調べた。上記噴霧剤中、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の濃度は、カーネーションに対する特定ケトール脂肪酸の実験において本発明者が使用した濃度に従い、３０ｐｐｍとした（横山峯幸、植物の生長調節 40:90-100, 2005）。上記噴霧剤を噴霧しない対照区以外に、菌糸接種後、３、１０、１４、２１、２８日後のいずれかに当該噴霧剤を噴霧した。当然のことながら、上記の噴霧時期は菌糸が増殖している時期で子実体は現れていない。
【００５０】
続いて、上記菌糸接種後の試験区とは別に、菌掻き後についても別途試験区を設けた。菌掻きは、菌糸が十分生育した後、すなわち、ヒラタケの場合菌糸培養３０日目、そしてブナシメジの場合菌糸培養８５日目に、十分に生育した菌糸を含む培地表面を掻き乱すことで行った。当該菌掻き工程後、試験区に上記噴霧剤を噴霧した。更に、原基が形成を始めた直後、つまりブナシメジの場合、菌掻き後７日目、ヒラタケの場合、菌掻き後３日目に前記噴霧剤を噴霧する区を設けて同様に上記噴霧剤を噴霧した。試験に用いたビンの本数はいずれの試験区とも３２本であった。ヒラタケについての結果を図１、そしてブナシメジについての結果を図２に示す。
【００５１】
図１及び２から明らかなように、本発明で使用する特定ケトール脂肪酸、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の噴霧に適した時期は菌掻きの後であった。さらに本実験で明らかになったように特定ケトール脂肪酸の濃度を高めると、きのこの生産量は２０％近くも増大することが明らかとなった。
【００５２】
ヒラタケ及びエリンギ栽培における特定ケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度の決定
１．ヒラタケの実用生産における９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の適用例
ヒラタケは温帯の世界各地に分布する木材腐朽菌であり、自然界では主に秋から春にかけて広葉樹の枯れ木や倒木、切り株などに多数重なり合って発生する。日本では年間を通じて主に菌床ビンを用いた施設栽培が広く行われている。上述の通り調製した噴霧剤を施設栽培現場で適用し、その作用を調べた。
【００５３】
スギのオガコとフスマを５：１の割合で混ぜたものをプラスチックのビン(容量８００ｍＬ)に詰め、オートクレープで殺菌・放冷後、ヒラタケの種菌を接稗した。２６℃、湿度７５％で３０日間培養し、菌糸を全体にいきわたらせた。上記噴霧剤は菌掻き操作後に噴霧した。当該噴霧剤中、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸を０．１、０．２、０．５、１ｐｐｍになるように水に溶かし、ビン当り０．１ｍＬほど噴霧した。対照区は無噴霧とした。それぞれの試験区では５５本〜５９本のビンを用いた。前記噴霧剤を噴霧後、１４〜１６℃の部屋に移し、湿度８５％に管理した。９日後に収穫適期（出荷の適期）と思われたので収穫し、それぞれのビンから発生したヒラタケの生重量を測定し、平均値を比較した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３で明らかな様にヒラタケは９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の濃度に依存してその生産量が増加した。特に、噴霧濃度が０．５ｐｐｍの場合に生産量が１割以上増大した。
【００５５】
２．エリンギの実用生産における９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の適用例
エリンギはもともとアフリカ北部、中央アジア、ヨーロッパに自生するきのこであるが、近年、人気が出て日本でも盛んに施設栽培されるようになってきた。そこで上述のヒラタケの培養と同様な培養法で生育したエリンギの菌糸について菌掻きを行った後、菌掻き直後の菌糸に対し上記噴霧剤を噴霧した。試験に用いた本数はいずれの試験区とも６０本であった。図４から明らかなように９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は０．２ｐｐｍの時に有意な生産量増加効果を示した。また、エリンギについては生産量が増大するだけでなく、子実体培養期間が１０日から８日に早まった。これは、きのこの周年栽培を考えた場合、栽培回数を増やすことが出来るので、このような観点からも栽培の効率化を図ることができるものである。
【００５６】
その他のキノコについても、ヒラタケ、エリンギ及びブナシメジと同様に本発明のキノコ類栽培方法による菌糸体の増殖結果を図５に示す。当該結果から明らかなように、本発明のキノコ類栽培方法は、いずれのキノコの菌糸体も有意に増大させた。特に、ハタケシメジ、ウスヒラタケについては、上記噴霧剤を噴霧していないものと比較して１．５倍以上菌糸体の重量が増加した。
【００５７】
キノコ菌糸増殖における特定ケトール脂肪酸作用性の検討
きのこの菌糸体培養は主に健康食品用のきのこで汎用されている方法である。菌糸増殖における特定ケトール脂肪酸の作用性を検討した。ヒラタケ、ウスヒラタケ、エリンギ、シイタケ、ナメコ、マイタケ、ハタケシメジの菌糸をＳＭＹ培地（１％ショ糖、１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス）を２０ｍＬ入れた１００ｍｌトールビーカーに植えつけた。９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は無菌水に３０ｎＭ、１００ｎＭ、１３０ｐＭを溶解させ、菌糸植え付け後に上部からシャーレ当たり０．１ｍＬずつ噴霧した。１００ｎＭは０．０３ｐｐｍにあたる。２６℃で１ヶ月培養した後、菌糸体だけを取り出し、重量を測定した結果を図５に示した。
【００５８】
促進の大小はあるが、いずれも濃度依存的に９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸はキノコ菌糸の増殖を促進した。なお、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の菌糸増殖促進効果はもともとの菌糸増殖が遅いキノコほど効果が大きい傾向が見られた。図５に示したキノコの中でも、ハタケシメジに対し９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は高い増殖促進作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の方法によれば、特定ケトール脂肪酸の適用を菌掻き工程後の特定の時期に行うことで、キノコの菌糸体重量を顕著に増大させ、収穫時期も早めることができる。特に、増殖速度が遅いキノコほどかかる増大効果の恩恵を受けることができるため、本発明の方法はこれまで増殖が遅く商品化が困難であったこのようなキノコにとって好適である。特に、本発明は、味がよく、薬理効果が高いことが知られているものの、増殖が遅いために本格的な実用化が阻害されていたハタケシメジに対しての利用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、特定ケトール脂肪酸を含む噴霧剤の噴霧時期によるヒラタケの子実体生重量（ｇ）の差異を示すグラフである。
【図２】図２は、特定ケトール脂肪酸を含む噴霧剤の噴霧時期によるブナシメジの子実体生重量（ｇ）の差異を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒラタケ栽培におけるケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度を示す棒グラフである。
【図４】図４は、エリンギ栽培におけるケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度を示す棒グラフである。
【図５】図５は、種々のキノコに対するケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）のキノコ菌糸体増殖促進作用を示す折れ線グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ類の新規な栽培方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコの消費額は、食用及び健康食品用のものを合わせると、日本国内だけでも約２，７５０億円と非常に大きく（２００５年度林野庁調べ）、特に一部のキノコについては近年の健康志向を反映して需要が増大している。これらのキノコの多くが人工的に栽培されたものであり、例えば原木に穴をあけて種菌を打ち込み、一年間、林間地など自然環境下において菌を蔓延させ（原木栽培）、又はオガコに米糠等の栄養源を加えて固めたものに種菌を接種し、空調設備を備えた施設内において菌を蔓延させることで（菌床栽培）栽培されている。一方、キノコの種類によっては人工栽培そのものが難しく、また、人工栽培に成功したとしてもハタケシメジのように増殖が遅いために商品化が困難なこともある。
【０００３】
キノコの増殖を促進させる方法としては、フスマ、米ぬかなどの窒素源を含む施用剤を適宜添加することが一般的に行われており、このような施肥は一定の効果を上げている。
【０００４】
しかしながら、施肥の効果については自ずと限界があり、用いる肥料の量を多くしても、一定以上のキノコの増殖促進効果は期待できないばかりか、肥料を多く与えすぎると、かえって植物の成長に障害となり、栄養過多の培地を廃棄することから、ひいては土壌を汚染してしまうことにもなりかねない。
【０００５】
このように、肥料の使用量を抑え、土壌環境を悪化させることなくキノコの生産量を増大させる必要性が当業界に存在している。
【０００６】
本願発明者がアオウキクサ（Lemna paucicostata)から単離したケトール脂肪酸は、花芽形成の促進のように、植物の成長が抑制されるときに生じる植物の消極的な生命活動に作用するだけでなく（特開平１１−２９４１０号公報）、植物賦活作用、例えば、植物の成長促進（茎葉の拡大、塊茎塊根の成長促進等）、休眠抑制、植物のストレスに対する抵抗性の付与、抗老化等の植物成長調節作用も有している（特開２００１−１３１００６号公報）。
【０００７】
特開２００１−１３１００６号公報において、ケトール脂肪酸はキノコ類の成長促進剤としても言及されており、具体的にはタモギダケの菌糸増殖効果及びシイタケの子実体生長促進効果が試験例Ｄで確認されている。一方、当該公報はキノコ類に対するケトール脂肪酸の最適な使用方法及び使用時期等については何ら言及していない。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２９４１０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１００６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、キノコ類の新規な栽培方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
キノコ類の増殖促進のために、本発明者が特定のケトール脂肪酸の最適な使用方法について検討したところ、ストレス曝露後の菌糸体、特に、菌床栽培における菌掻き工程後の菌子体にケトール脂肪酸を適用することで、キノコの生産量が増大することが明らかとなった。
【００１１】
即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法。
［２］菌床栽培における菌掻き工程によりストレス曝露される、［１］に記載のキノコ類の栽培方法。
［３］適用工程が菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される、［１］又は［２］に記載のキノコ類の栽培方法。
［４］適用工程が菌掻き工程終了後から２４時間以内に実施される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のキノコ類の栽培方法。
【発明の効果】
【００１２】
菌床栽培における菌掻き工程時に特定のケトール脂肪酸をキノコ類に適用することで、最終的な子実体の収量は当該工程以前に適用した場合と比較して顕著に増大する。また、一般的な植物の花芽形成促進及び賦活には３〜６０ｐｐｍ程度の量のケトール脂肪酸が必要とされるが、本発明においてはその１／１００程度の濃度からケトール脂肪酸が効果を発揮する。
【００１３】
ここで、ケトール脂肪酸は植物がストレスを受けた時に多く生成される性質を有している。理論に拘束されることを意図するものではないが、菌掻き工程は菌子体にストレスをもたらすと考えられ、本発明によるキノコの増殖促進効果はかかるストレスで生成されたケトール脂肪酸とともに噴霧されたケトール脂肪酸が菌糸体に作用することによりもたらされるものと思われる。
【００１４】
その他の効果として栽培期間の短縮が挙げられる。例えば、エリンギに適用した場合、通常９日の栽培期間が必要とされるが、本発明の栽培方法を使用することにより１〜２日収穫日を早期化することが可能となる。特に、菌糸体培養時期に当該方法を実施することで、更に栽培期間を短縮することが可能となる。尚、菌糸体培養とは、子実体を形成する前に、菌糸を菌床（培地）中に増殖させる工程である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で使用するケトール脂肪酸は、上記の通り、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸である（以下、このケトール脂肪酸を「特定ケトール脂肪酸」ともいう）。すなわち、特定ケトール脂肪酸は、その炭素原子数が４〜２４であることを特徴とする、アルコールの水酸基とケトンのカルボニル基とを同一分子内に有する脂肪酸である。
【００１６】
また、本発明において、特定ケトール脂肪酸は、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子がα位またはγ位の位置にあることが、所望するキノコ類の増殖効果を発揮するうえで好ましく、特に、α位であることがこの観点から好ましい。
【００１７】
また、特定ケトール脂肪酸には、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在することが、所望するキノコ類の増殖効果を発揮するうえで好ましい。
【００１８】
また、特定ケトール脂肪酸の炭素原子数は１８であり、かつ、炭素間の二重結合が２か所存在することが好ましい。
【００１９】
特定ケトール脂肪酸の具体例としては、例えば９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下，特定ケトール脂肪酸（Ｉ）ということもある〕、１３−ヒドロキシ−１２−オキソ−９（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下，特定ケトール脂肪酸（ＩＩ）ということもある〕、１３−ヒドロキシ−１０−オキソ−１１（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下、特定ケトール脂肪酸（ＩＩＩ）ということもある〕、９−ヒドロキシ−１２−オキソ−１０（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸〔以下、特定ケトール脂肪酸（ＩＶ）ということもある〕等を挙げることができる。
【００２０】
以下に、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）〜（ＩＶ）の化学構造式を記載する。
【００２１】
【化１】
【００２２】
なお、その他の特定ケトール脂肪酸の化学構造式並びにこれらの特定ケトール脂肪酸の化学合成法については特開２００１−１３１００６号公報（上掲）で開示されている通りである。
【００２３】
本発明によると、上記特定ケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用することにより、キノコの収量を増大させることができる。
【００２４】
菌床栽培によりキノコを栽培する場合、殺菌したキノコ用培地をポット等の栽培用のビンに詰め込み、続いてキノコ培地上に種菌を接種して菌糸が培養される。所定の培養期間後、培地表面の古い菌を掻き取ることで（「菌掻き」工程）、菌糸が集合組織化し、子実体のもととなる（原基形成）。
【００２５】
ここで、菌掻きは、上述した通り菌糸体に対し物理的なストレスを与える。具体的な態様において、本発明は、菌床栽培において、菌掻き工程後の菌糸体に上記特定ケトール脂肪酸を適用することを含んで成るキノコ類の栽培方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、上記適用は、菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される。特定ケトール脂肪酸の菌糸体への適用は、収量を増大させる観点からは、菌掻き工程終了後から２４時間以内に行うのが好ましく、６時間以内に行うのが更に好ましい。
【００２７】
尚、本発明で使用するストレス曝露とは、菌掻き工程に限定されることを意図するものではなく、生育過程のキノコに何らかのストレスを与えるものであればいずれのものでもよい。例えば、乾燥ストレス、熱ストレス、浸透圧ストレス等がこのようなストレスとして挙げられる。
【００２８】
特定ケトール脂肪酸をキノコの菌糸体に適用する量の上限は特に限定されない。一方、上記の特定ケトール脂肪酸のキノコの菌糸体に対する適用量の下限は、キノコの種類や菌糸体の大きさにより異なるが、１回の適用当り、０．１μＭ程度以上が一応の目安である。
【００２９】
特定ケトール脂肪酸の使用量は、その使用態様や使用する対象となるキノコの種類、さらには当該特定ケトール脂肪酸を含む具体的な剤形等に応じて選択することが可能である。本発明の態様として、特定ケトール脂肪酸をそのまま用いることも可能であるが、上記の特定ケトール脂肪酸の適用の目安等を勘案すると、概ね、剤全体に対して０．０３〜６０ｐｐｍ 程度が好ましく、さらに好ましくは、同０．３〜３０ｐｐｍ 程度である。例えば、ヒラタケ及びエリンギの場合、０．０５〜５０ｐｐｍ、好ましくは０．１〜４０ｐｐｍ、更に好ましくは０．３〜３０ｐｐｍである。
【００３０】
かかる剤形としては、例えば、液剤、固形剤、粉剤、乳剤、底床添加剤等の剤形が挙げられ、その剤形に応じて、製剤学上適用することが可能な公知の担体成分、製剤用補助剤等を本発明の所期の効果であるキノコの成長促進作用が損なわれない限度において、適宜配合することができる。例えば、担体成分としては、特定ケトール脂肪酸を含む剤形が底床添加剤または固形剤である場合には、概ねタルク、クレー、バーミキュライト、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機質や小麦粉、澱粉等の固体担体が；また液剤である場合には、概ね水、キシレン等の芳香族炭化水素類、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の液体担体が上記の担体成分として用いられる。また製剤用補助剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体等の非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、結合剤等を適宜配合することができる。
【００３１】
さらに必要に応じて、一般的な植物成長調節剤や、安息香酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ピペコリン酸等を、上記の本発明の所期の効果を損なわない限度において、特定ケトール脂肪酸を含む剤形中に配合することもできる。
【００３２】
前記方法で使用する特定ケトール脂肪酸は、菌掻き工程を経た菌糸体や子実体原基形成期の菌糸体の一部または全体に液剤や乳剤として散布、滴下、塗布等することや、固形剤や粉剤として培地から吸収させること等が可能である。
【００３３】
特定ケトール脂肪酸のキノコへの適用頻度は、キノコの種類や適用目的等により異なるが、基本的には、ただ１度の適用によっても所望する効果を得ることができる。複数回適用する場合には、５日程度の間隔をあけることが効率的である。
【００３４】
特定ケトール脂肪酸が適用可能なキノコの種類は、菌床栽培における菌掻きなどのように、栽培途中でキノコにストレスを与える工程が必要な栽培方法で栽培されるものであれば特に限定されない。例えば、かかるキノコとして、シイタケ、ナメコ、エノキタケ、ヒラタケ、ブナシメジ、マイタケ、エリンギ、ハタケシメジ、ウスヒラタケ等が例として挙げられる。
【００３５】
また、製剤用補助剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホンコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体の非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、又は結合剤等を適宜配合することができる。
【００３６】
さらに必要に応じて、植物生長調整剤や、安息香酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ピペコリン酸等を、本発明の所期の効果を損なわない限度において、特定ケトール脂肪酸を含む剤形中に配合することが出来る。
【実施例】
【００３７】
後述するキノコの栽培においては、特定ケトール酸として９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸が用いられる。当該特定ケトール酸は以下のとおり酵素法を用いて調製した。
【００３８】
１．コメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの調製
コメ胚芽３５０ｇを石油エーテルで洗浄、脱脂及び乾燥したもの（２５０ｇ）を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１．２５Ｌに懸濁し、この懸濁物をホモジナイズした。
【００３９】
次いで、かかるホモジナイズ抽出液を１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清（０．８Ｌ）を得た。得られた上清に硫酸アンモニウム１４０．８g （０〜３０％飽和）を加え、４℃で一晩放置した。その後、９５００rpm で３０分間遠心を行い、得られた上清（０．８５Ｌ）に硫酸アンモニウム２３２g （７０％飽和）を添加して、４℃で５時間放置した。
【００４０】
次に、同様に９５００rpm で３０分間遠心を行い、これにより得られた沈澱物（コメ胚芽抽出液の硫安３０〜７０％飽和画分）をｐＨ４．５の酢酸緩衝液３００mlに溶解し、６３℃で５分間加熱処理を行った。その後、生成した沈澱物を除去して、得られた上清をＲＣ透析チューブ（Spectrum社製ポア４：MWCO 12000〜14000 ）を用いて透析（３Ｌ×３）により脱塩後、所望するコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を得た。
【００４１】
２．アマ種子由来のアレンオキサイドシンターゼの調製
アマ種子は一丸ファルコスから購入した。このアマ種子２００g に、アセトン２５０mlを添加してホモジナイズ（２０s ×３）し、得られた沈澱物を目皿ロートで濾取し、溶媒を除去した。次いで、沈澱物を再びアセトン２５０mlに懸濁してホモジナイズ（１０s ×３）し、沈澱物を得た。沈澱物をアセトン及びエチルエーテルで洗浄後、乾燥して、アマ種子のアセトン性粉を得た（１５０g ）。
【００４２】
このアマ種子のアセトン粉末を、氷冷下５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００mlに懸濁し、これを０℃で１時間スターラー攪拌を施して抽出した。得られた抽出物に１１０００rpm で３０分間遠心し、これにより得られた上清（３８０ｍｌ）に硫酸アンモニウム１０５．３g （０〜４５％飽和）を加え、氷冷下で１時間静置し、さらに１１０００rpm で３０分間遠心して得られた沈澱物を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍｌに溶解し、透析して脱塩し（３Ｌ×３）、所望するアマ種子由来のアレンオキサイドシンターゼの粗酵素液を得た。
【００４３】
３．α−リノレン酸のナトリウム塩の調製
出発原料とするα−リノレン酸は、水における溶解性が著しく低いので、酵素基質として働くことを容易にするために、α−リノレン酸をナトリウム塩化した。すなわち、炭酸ナトリウム５３０mgを、精製水１０mlに溶解して５５℃に加温し、これにα−リノレン酸（ナカライテスク社）を２７８mg滴下して、３時間攪拌した。反応終了後、Dawex50wxk(H+ form) （ダウケミカル社製）で中和すると、沈澱物が生成した。これを濾過して樹脂を除き、MeOHで洗浄後、減圧下で溶媒を留去した。これにより得られた生成物をイソプロパノールで再結晶し、所望するα−リノレン酸のナトリウム塩（１２５０mg，８３％）を得た。
【００４４】
４．９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の製造
上記３により得られたα−リノレン酸のナトリウム塩（１５mg：５０μmol ）を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０mlに溶解した。次いで、この溶液に、酸素気流下、２５℃で上記１により得たコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を３．１８ml添加した後、３０分間攪拌した後、さらに同じくコメ胚芽由来のリポキシゲナーゼの粗酵素液を３．１８mlを添加して、３０分間攪拌した。この攪拌終了後、このリポキシゲナーゼ反応物に、窒素気流下で上記２で得たアレンオキサイドシンターゼの粗酵素液を３４．５ml添加して、１時間攪拌した後、氷冷下希塩酸を添加して、反応溶液のｐＨを３．０に調整した。
【００４５】
次いで、反応液をＣＨＣｌ3 −ＭｅＯＨ＝１０：１で抽出した。得られた有機層に硫酸マグネシウムを加えて脱水し、減圧下、溶媒を留去して乾燥した。このようにして得られた粗生成物をあらためてＨＰＬＣにかけて、その特定ケトール脂肪酸（Ｉ）と認められるピーク（リテンションタイム：１６分付近）を分取した。分取した画分にクロロホルムを加え、クロロホルム層を分離して水洗し、エバポレーターでこのクロロホルムを留去して、精製物を得た。
【００４６】
この精製物の構造を確認するために重メタノール溶液で1Ｈ，及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、1Ｈ−ＮＭＲにおいて、末端メチル基〔δ0.98(t) 〕，２組のオレフィン〔（δ5.25,5.40),(δ5.55,5.62 ）〕，２級水酸基〔δ4.09(dd)〕及び多数のメチレンに基づくシグナルが認められ、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）と同一化合物と推定された。
【００４７】
さらに、13Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフト値を比較したところ、特定ケトール脂肪酸（Ｉ）〔特開平１０−３２４６０２号公報第７頁の第１１欄下から第１行目以降に記載されている「製造例（抽出法）」における13Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフト値（同公開公報第８頁第１３欄第２行目以降段落番号［００５４］及び［００５５］に記載）〕と一致した。よって、上記のようにして得た酵素法による合成品は、上文で定義した特定ケトール脂肪酸に属する、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸であることが明らかとなった。
【００４８】
噴霧剤の調製
上記特定ケトール脂肪酸は、所望の濃度となるように純水中で適宜希釈することにより噴霧剤へと調製される。
【００４９】
特定ケトール脂肪酸の噴霧時期の検討
ヒラタケとブナシメジを用いて、特定ケトール脂肪酸を栽培期間のうち、いつ噴霧するのがもっとも効果的であるかを調べた。上記噴霧剤中、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の濃度は、カーネーションに対する特定ケトール脂肪酸の実験において本発明者が使用した濃度に従い、３０ｐｐｍとした（横山峯幸、植物の生長調節 40:90-100, 2005）。上記噴霧剤を噴霧しない対照区以外に、菌糸接種後、３、１０、１４、２１、２８日後のいずれかに当該噴霧剤を噴霧した。当然のことながら、上記の噴霧時期は菌糸が増殖している時期で子実体は現れていない。
【００５０】
続いて、上記菌糸接種後の試験区とは別に、菌掻き後についても別途試験区を設けた。菌掻きは、菌糸が十分生育した後、すなわち、ヒラタケの場合菌糸培養３０日目、そしてブナシメジの場合菌糸培養８５日目に、十分に生育した菌糸を含む培地表面を掻き乱すことで行った。当該菌掻き工程後、試験区に上記噴霧剤を噴霧した。更に、原基が形成を始めた直後、つまりブナシメジの場合、菌掻き後７日目、ヒラタケの場合、菌掻き後３日目に前記噴霧剤を噴霧する区を設けて同様に上記噴霧剤を噴霧した。試験に用いたビンの本数はいずれの試験区とも３２本であった。ヒラタケについての結果を図１、そしてブナシメジについての結果を図２に示す。
【００５１】
図１及び２から明らかなように、本発明で使用する特定ケトール脂肪酸、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の噴霧に適した時期は菌掻きの後であった。さらに本実験で明らかになったように特定ケトール脂肪酸の濃度を高めると、きのこの生産量は２０％近くも増大することが明らかとなった。
【００５２】
ヒラタケ及びエリンギ栽培における特定ケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度の決定
１．ヒラタケの実用生産における９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の適用例
ヒラタケは温帯の世界各地に分布する木材腐朽菌であり、自然界では主に秋から春にかけて広葉樹の枯れ木や倒木、切り株などに多数重なり合って発生する。日本では年間を通じて主に菌床ビンを用いた施設栽培が広く行われている。上述の通り調製した噴霧剤を施設栽培現場で適用し、その作用を調べた。
【００５３】
スギのオガコとフスマを５：１の割合で混ぜたものをプラスチックのビン(容量８００ｍＬ)に詰め、オートクレープで殺菌・放冷後、ヒラタケの種菌を接稗した。２６℃、湿度７５％で３０日間培養し、菌糸を全体にいきわたらせた。上記噴霧剤は菌掻き操作後に噴霧した。当該噴霧剤中、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸を０．１、０．２、０．５、１ｐｐｍになるように水に溶かし、ビン当り０．１ｍＬほど噴霧した。対照区は無噴霧とした。それぞれの試験区では５５本〜５９本のビンを用いた。前記噴霧剤を噴霧後、１４〜１６℃の部屋に移し、湿度８５％に管理した。９日後に収穫適期（出荷の適期）と思われたので収穫し、それぞれのビンから発生したヒラタケの生重量を測定し、平均値を比較した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３で明らかな様にヒラタケは９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の濃度に依存してその生産量が増加した。特に、噴霧濃度が０．５ｐｐｍの場合に生産量が１割以上増大した。
【００５５】
２．エリンギの実用生産における９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の適用例
エリンギはもともとアフリカ北部、中央アジア、ヨーロッパに自生するきのこであるが、近年、人気が出て日本でも盛んに施設栽培されるようになってきた。そこで上述のヒラタケの培養と同様な培養法で生育したエリンギの菌糸について菌掻きを行った後、菌掻き直後の菌糸に対し上記噴霧剤を噴霧した。試験に用いた本数はいずれの試験区とも６０本であった。図４から明らかなように９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は０．２ｐｐｍの時に有意な生産量増加効果を示した。また、エリンギについては生産量が増大するだけでなく、子実体培養期間が１０日から８日に早まった。これは、きのこの周年栽培を考えた場合、栽培回数を増やすことが出来るので、このような観点からも栽培の効率化を図ることができるものである。
【００５６】
その他のキノコについても、ヒラタケ、エリンギ及びブナシメジと同様に本発明のキノコ類栽培方法による菌糸体の増殖結果を図５に示す。当該結果から明らかなように、本発明のキノコ類栽培方法は、いずれのキノコの菌糸体も有意に増大させた。特に、ハタケシメジ、ウスヒラタケについては、上記噴霧剤を噴霧していないものと比較して１．５倍以上菌糸体の重量が増加した。
【００５７】
キノコ菌糸増殖における特定ケトール脂肪酸作用性の検討
きのこの菌糸体培養は主に健康食品用のきのこで汎用されている方法である。菌糸増殖における特定ケトール脂肪酸の作用性を検討した。ヒラタケ、ウスヒラタケ、エリンギ、シイタケ、ナメコ、マイタケ、ハタケシメジの菌糸をＳＭＹ培地（１％ショ糖、１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス）を２０ｍＬ入れた１００ｍｌトールビーカーに植えつけた。９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は無菌水に３０ｎＭ、１００ｎＭ、１３０ｐＭを溶解させ、菌糸植え付け後に上部からシャーレ当たり０．１ｍＬずつ噴霧した。１００ｎＭは０．０３ｐｐｍにあたる。２６℃で１ヶ月培養した後、菌糸体だけを取り出し、重量を測定した結果を図５に示した。
【００５８】
促進の大小はあるが、いずれも濃度依存的に９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸はキノコ菌糸の増殖を促進した。なお、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸の菌糸増殖促進効果はもともとの菌糸増殖が遅いキノコほど効果が大きい傾向が見られた。図５に示したキノコの中でも、ハタケシメジに対し９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸は高い増殖促進作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の方法によれば、特定ケトール脂肪酸の適用を菌掻き工程後の特定の時期に行うことで、キノコの菌糸体重量を顕著に増大させ、収穫時期も早めることができる。特に、増殖速度が遅いキノコほどかかる増大効果の恩恵を受けることができるため、本発明の方法はこれまで増殖が遅く商品化が困難であったこのようなキノコにとって好適である。特に、本発明は、味がよく、薬理効果が高いことが知られているものの、増殖が遅いために本格的な実用化が阻害されていたハタケシメジに対しての利用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、特定ケトール脂肪酸を含む噴霧剤の噴霧時期によるヒラタケの子実体生重量（ｇ）の差異を示すグラフである。
【図２】図２は、特定ケトール脂肪酸を含む噴霧剤の噴霧時期によるブナシメジの子実体生重量（ｇ）の差異を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒラタケ栽培におけるケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度を示す棒グラフである。
【図４】図４は、エリンギ栽培におけるケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）の至適濃度を示す棒グラフである。
【図５】図５は、種々のキノコに対するケトール脂肪酸（９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸）のキノコ菌糸体増殖促進作用を示す折れ線グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法。
【請求項２】
菌床栽培における菌掻き工程によりストレス曝露される、請求項１に記載のキノコ類の栽培方法。
【請求項３】
適用工程が菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される、請求項１又は２に記載のキノコ類の栽培方法。
【請求項４】
適用工程が菌掻き工程終了後から２４時間以内に実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキノコ類の栽培方法。
【請求項１】
炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸の、カルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位の位置にある、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸をストレス曝露後の菌子体に適用する工程を含んで成るキノコ類の栽培方法。
【請求項２】
菌床栽培における菌掻き工程によりストレス曝露される、請求項１に記載のキノコ類の栽培方法。
【請求項３】
適用工程が菌掻き工程終了後から原基が形成するまでの間に実施される、請求項１又は２に記載のキノコ類の栽培方法。
【請求項４】
適用工程が菌掻き工程終了後から２４時間以内に実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキノコ類の栽培方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１７８２９（Ｐ２００９−１７８２９Ａ）
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８３３０１（Ｐ２００７−１８３３０１）
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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