キメラマウス、ノックアウトマウス、及びそれらの作製方法、並びにＥＳ細胞株
【課題】キメラマウスやノックアウトマウスの作製に好適なＥＳ細胞株を樹立すること。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いて、生殖系列キメラマウスを効率的かつ高頻度に作製できる手段を提供すること。
【解決手段】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法を提供する。これにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を用いて、生殖系列キメラマウスを高頻度に作製できる。従って、例えば、そのＥＳ細胞の遺伝子組換えを行うことにより、ノックアウトマウスを高頻度に作製できる。
【解決手段】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法を提供する。これにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を用いて、生殖系列キメラマウスを高頻度に作製できる。従って、例えば、そのＥＳ細胞の遺伝子組換えを行うことにより、ノックアウトマウスを高頻度に作製できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス又はノックアウトマウスの作製方法、それらの方法により作製されたキメラマウス又はノックアウトマウス、並びにキメラマウスの作製が可能で、生殖細胞への分化能力を保持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）は、発生初期胚の内部細胞塊由来の未分化細胞であり、あらゆる種類の細胞に分化する能力を有する。そのため、近年、再生医療などへの応用が期待されている。
【０００３】
マウスのＥＳ細胞は、１９８０年代に分離され、現在では、ノックアウトマウス作製などに広く応用されている。
【０００４】
ノックアウトマウスは、遺伝子工学的手法により、ある遺伝子を欠損又は変異させたマウスである。
【０００５】
ノックアウトマウスは、概ね、以下の手順で作製される。まず、ターゲッティングベクター（組換えＤＮＡ）を調製した後、エレクトロポレーション法などにより、そのターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する。そして、相同的遺伝子組換えのおこったＥＳ細胞株を選別する。次に、８細胞期胚又は胚盤胞期胚の中に、その組換えＥＳ細胞を、インジェクション法により注入し、キメラ胚を作製する。次に、そのキメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、産仔（キメラマウス）を得る。次に、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されているかどうかを確認する。そして、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されていることが確認されたマウス同士を交配し、得られた産仔の中からノックアウトマウスを選別する。
【０００６】
なお、本発明に関連のある先行文献として、例えば、以下の文献が挙げられる。特許文献１及び特許文献２には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統のマウス由来の雌のＥＳ細胞株、及び、その細胞株を用いたキメラ個体作製手段、などが記載されている。非特許文献１には、遺伝子ノックアウトによる胎生期致死を回避する技術として、４倍体胚とＥＳ細胞を凝集させることにより、ＥＳ細胞由来のマウスを作製する手段が記載されている。
【特許文献１】特開２００４−１４１０７３号公報
【特許文献２】特開２００１−６１４７０号公報
【非特許文献１】Nagy A. et al, “Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells” Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol90, pp.8424-8428, September 1993 Developmental Biology
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、ＥＳ細胞株の樹立は難しいという問題がある。例えば、既知の手順の通りにＥＳ細胞を作製した場合でも、ＥＳ細胞株を樹立できない場合も多く、また、ＥＳ細胞株を樹立した場合でも、樹立した株ごとに、キメラを形成する能力や組織への分化能力などの性質・特性が大きく異なることが多い。
【０００８】
また、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いてノックアウトマウスを作製することが難しい、という課題がある。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスは、近交系のマウスとして、最も広く用いられている系統の一つであり、形質や属性などに関する膨大なデータの蓄積を有する。従って、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスのＥＳ細胞株を用いてノックアウトマウスを作製することが最も好ましい。しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いた場合、生殖系列キメラマウスの作製が難しい。そのため、現在、１２９系マウス由来のＥＳ細胞株や、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスとＣＢＡ系統のマウスのＦ１雑種由来のＥＳ細胞を用いて生殖系列キメラマウスを作製し、ノックアウトマウスを樹立することが多い。その場合、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスにコンジェニック化するためには、通常、２年以上の年月を要する。
【０００９】
そこで、本発明は、キメラマウスやノックアウトマウスの作製に好適なＥＳ細胞株を樹立すること、及び、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いて、生殖系列キメラマウスを効率的かつ高頻度に作製できる手段を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、今般、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）の樹立に成功した（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。
【００１１】
そして、発明者らは、そのＥＳ細胞株を用いて研究を重ねた結果、従来通り、インジェクション法により、８細胞期胚又は胚盤胞期胚の中にＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製するのではなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と４倍体初期胚とを凝集させることにより、生殖系列（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ）キメラマウスを短時間で効率的に作製できることを新規に見出した。
【００１２】
そこで、本発明では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法を提供する。
【００１３】
これにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を用いて、生殖系列キメラマウスを高頻度に作製できる。従って、例えば、そのＥＳ細胞の遺伝子組換えを行ってから生殖系列キメラマウスを作製することにより、ノックアウトマウスを高頻度に樹立できる。
【００１４】
ＥＳ細胞と４倍体初期胚とを凝集させた後、その凝集胚をマウスに移植した場合、その産仔は、ほぼ全てがＥＳ細胞由来の細胞により形成されるため、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、交配などにより検定する必要がない。また、Ｃ５７ＢＬ／６系統の遺伝形質を備えたノックアウトマウスの作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスにコンジェニック化する必要がないため、作製期間を大幅に短縮できる。従って、キメラマウス又はノックアウトマウスの作製を短時間で効率的に行うことができる。
【００１５】
４倍体初期胚は、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２細胞期胚を電気的に融合することにより作製できる。
【００１６】
なお、本発明において、「生殖系列キメラマウス」とは、交配によりＥＳ細胞由来の遺伝子型を子孫に伝達できるキメラマウスのことをいう。即ち、生殖細胞（精子又は卵）がＥＳ細胞由来の細胞により形成され、ＥＳ細胞の遺伝情報が生殖により次世代に伝達可能であるキメラマウスのことをいう。例えば、インジェクション法により初期胚にＥＳ細胞を注入してキメラ胚を作製し、キメラマウスを得た場合、初期胚由来の細胞により生殖細胞が形成される場合と、ＥＳ細胞由来の細胞により生殖細胞が形成される場合がある。それに対し、キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞由来の細胞により形成された場合、そのキメラマウスを用いて交配を行うことにより、ＥＳ細胞由来の遺伝子型を子孫に伝達できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、生殖系列キメラマウスを効率的かつ高頻度に作製できる。
【実施例１】
【００１８】
実施例１では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から独自にＥＳ細胞株を樹立し、そのＥＳ細胞株を用いて、キメラマウスの作製を試みた。
【００１９】
概要を以下に示す。
【００２０】
はじめに、ＥＳ細胞株を樹立した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの胚盤胞から内部細胞塊を採取した後、その採取した細胞をフィーダー細胞上で培養し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ由来の雄のＥＳ細胞を樹立した（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。フィーダー細胞として、ＢＡＬＢ／ｃ系統由来のマウス胎仔線維芽細胞をマイトマイシンＣ処理して用いた。また、培地として、ＤＭＥＭ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥＡＧＬＥ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ダルベッコ変法イーグル培地、ＳＩＧＭＡ社製）に、１５％ＫＳＲ（ＫＮＯＣＫＯＵＴ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ノックアウト血清代替添加物、ＧＩＢＣＯ社製）、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病阻害因子、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ；非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したものを用いた。
【００２１】
続いて、樹立したＥＳ細胞株を用いて、インジェクション法によるキメラマウスの作製を試みた。まず、交配したＩＣＲ系統の雌マウスから８細胞期胚又は胚盤胞期胚を採取した。次に、インジェクション法により、樹立したＥＳ細胞を、その胚の中に注入し、キメラ胚を作製した。次に、そのキメラ胚を、偽妊娠雌マウスの子宮に移植し、自然分娩により、産仔（雄マウス）を得た。そして、得られた雄マウスがＥＳ細胞由来の細胞を有するマウスであるかどうか、毛色により判定した。なお、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの毛色は黒色、ＩＣＲ系統のマウスは白色（アルビノ）であり、キメラマウスは、白色部位と黒色（又は茶色）部位のある斑模様になる。
【００２２】
次に、得られた雄キメラマウスとＩＣＲ系統の雌マウスを交配し、作製した雄キメラマウスが生殖系列キメラマウスであるかどうかを調べた。雄キメラマウスの生殖細胞（精子）がＥＳ細胞由来の細胞により形成されている場合、交配後に得られた産仔（雄又は雌マウス）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ由来の形質を備えるため、黒色になる。一方、雄キメラマウスの生殖細胞が胚細胞由来の細胞により形成されている場合、交配後に得られた産仔（雄又は雌マウス）はＩＣＲ由来であるため、白色毛色になる。そこで、交配後の産仔（雄又は雌マウス）の毛色を確認することにより、作製した雄キメラマウスが生殖系列キメラマウスであるかどうかを調べた。
【００２３】
結果を表１に示す。表中、「ｄｏｎｏｒ」は用いたＥＳ細胞を、「ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ」は用いた胚のマウス系統の由来（ｓｔｒａｉｎｓ）と胚の種類（ｅｍｂｒｙｏ）を、それぞれ示し、「ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｅｄ」はＥＳ細胞の導入手段を示す。表中、「Ｎｏ． ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ」は偽妊娠マウスに移植したキメラ胚の個数を、「Ｎｏ． ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」はそのうち生まれた産仔数を、「Ｎｏ． ｏｆ ｃｈｉｍｅｒａｓ」は生まれた産仔のうちキメラマウスの個体数（雌雄両方を含む数）を、「Ｎｏ． ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｈｉｍｅｒａｓ」は得られたキメラマウスのうち生殖系列キメラマウスの個体数を、それぞれ示す。なお、表中、「Ｂ６ＥＳ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から樹立したＥＳ細胞を用いた結果であることを、「ｃｌｏｎｅ Ａ」及び「ｃｌｏｎｅ Ｂ」は、クローンが別であることを、「ＩＣＲ」はＩＣＲ系統のマウスの初期胚を用いたことを、「８−ｃｅｌｌ」は８細胞期胚を用いたことを、「ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」は胞胚期胚を用いたことを、「ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」はインジェクション法によりＥＳ細胞注入を行ったことを、それぞれ表す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
図１は、作製したキメラマウスの図面代用写真である。右側の二つのマウスでは、黒色部分が少なく、ＥＳ細胞に由来する細胞の占有率が低かった。その後、ＩＣＲ系統の雌マウスを交配した結果、生殖系列遺伝の能力は確認できなかった（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｈｉｍｅｒａ）。それに対し、左側の二つのマウスでは、ＥＳ細胞に由来する細胞の占有率が１００％に近く、全身が黒色であった。その後、ＩＣＲ系統の雌マウスを交配した結果、生殖系列キメラマウスであることが確認された（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｈｉｍｅｒａ）。
【００２６】
表１及び図１に示す通り、本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から雄ＥＳ細胞株を樹立でき、また、一般的な方法であるインジェクション法によっても、そのＥＳ細胞株を用いて雄の生殖系列キメラマウスを作製することができた。
【００２７】
この実験結果には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚からＥＳ細胞株を樹立でき、かつ、そのＥＳ細胞株を用いて、生殖系列キメラマウスを作製することができたという点で、有利性がある。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスには、遺伝的に異なるいくつかの亜系がある。例えば、６Ｊは米国Ｊａｃｋｓｏｎ研究所で確立された亜系であり、６Ｎは米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）で確立された亜系である。そのうち、６Ｊの系統は、マウスのゲノム解析などの研究でプロトタイプ（標準系統）として最も広く用いられている系統である。従って、本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６系統のうち、特に６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いて生殖系列に移行できるキメラマウスを作製することができたという点で、有利性がある。
【００２８】
加えて、上述の実験結果には、雄のＥＳ細胞株を樹立でき、かつ、そのＥＳ細胞株を用いて、雄の生殖系列キメラマウスを作製することができたという点でも、有利性がある。雄のＥＳ細胞を用いた場合、雄の生殖系列キメラマウスを得ることができるため、その精子を用いることにより、一度にたくさんの子孫マウスを得ることができる。従って、ＥＳ細胞由来のマウスを効率的に作製できる。また、雄のＥＳ細胞は、Ｘ染色体とＹ染色体の両方を有しているため、Ｙ染色体上に存在する遺伝子の解析なども行うことができるという有利性がある。
【実施例２】
【００２９】
実施例２では、ＥＳ細胞株と４倍体胚とを用いて、キメラマウスの作製を試みた。
【００３０】
まず、４倍体胚を作製した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスから、２細胞期胚を採取し、電気融合法により、４倍体にした。次に、この４倍体胚を８細胞期まで培養した。次に、４倍体胚の透明体を除去した後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統由来のＥＳ細胞を入れ、両者を凝集させた。なお、本実験では、実施例１で樹立したＥＳ細胞の代わりに、発明者らが別途樹立した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｇｒｅｅｎ ｍｏｕｓｅ（ＧＦＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウス）由来のＥＳ細胞を用いた。このＥＳ細胞と実施例１で樹立したＥＳ細胞とは、用いたマウスの系統が全く同一であるため、遺伝形質はＧＦＰ遺伝子が導入されていることを除き同一であると推測できる。次に、その凝集胚を胚盤胞にまで発生させた後、偽妊娠マウスに移植し、産仔（雄マウス）を得た。
【００３１】
なお、一般的な電気融合法では、複数の２細胞期胚を直線状に並べ、両側を平行二重電極で挟み、電気融合を行う。しかしながら、この方法で電気融合を行った場合、全ての細胞で均一に細胞融合を行うことができず、４倍体胚を確実に作製することができない。従って、作製した４倍体胚の中に２倍体胚が混在するため、目的のマウスの発生率が下がるという問題があった。そこで、発明者らの試行錯誤の末、本実験では、一個の２細胞期胚を針型電極で挟み込むことにより電気融合を行い、４倍体胚を一個ずつ作製した。これにより、４倍体胚の作製効率は下がったが、確実に、４倍体胚を得ることができるようになった。
【００３２】
結果を表２に示す。表中の各記載は、表１と同様である。表中、「Ｂ６Ｇ−２ ｃｅｌｌｓ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｇｒｅｅｎ ｍｏｕｓｅから樹立したＥＳ細胞を用いた結果であることを、「Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの初期胚を用いたことを、「ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ ８−ｃｅｌｌ」は、４倍体の８細胞期胚を用いたことを、「ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ」は凝集法により４倍体胚とＥＳ細胞との凝集を行ったことを、それぞれ示す。表中、その他の表中の各記載は、表１と同様である。
【００３３】
【表２】
【００３４】
表２に示す通り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞株と、４倍体胚とを凝集させる方法を用いることにより、高頻度に雄キメラマウスを作製できた。
【００３５】
なお、このキメラマウス作製方法は、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配して調べる必要がないという点で有利性がある。この方法を用いた場合、４倍体細胞は発生途上で死滅するため、作製した雄キメラマウスは、ほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来の細胞から形成される。従って、生殖細胞もＥＳ細胞由来の細胞から形成されるため、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配などにより調べる必要がない。
【００３６】
加えて、上述のキメラマウス作製方法は、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製するために、別途、交配を行う必要がないという点でも有利性がある。インジェクション法によりキメラマウスを作製する場合、例えば、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、生殖細胞キメラマウスであるかどうかを確認した後、得られた産仔同士をさらに交配して、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたマウスを作製する。それに対し、上述の手順でキメラマウスを作製する場合、それらの交配を行う必要がない。
【００３７】
従って、このキメラマウス作製方法を用いることにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたマウスを短期間で作製することができ、また、それらのマウスの作製効率を大幅に向上できる。
【実施例３】
【００３８】
実施例３では、実施例１で樹立したＥＳ細胞株を用いて、ノックアウトマウスの作製を試みた。本実験では、例として、アンジオテンシノーゲン遺伝子欠損マウスの作製を試みた。
【００３９】
はじめに、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子の組換えを行い、組換えＥＳ細胞を作製した。まず、ターゲッティングベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）の作製を行った。アンジオテンシノーゲン遺伝子の一部の配列を有するＤＮＡを調製した後、ポジティブ選別マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ’）を、ネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ）遺伝子を、そのＤＮＡに連結し、ターゲットベクターを作製した。次に、エレクトロポレーション法により、そのターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。これにより、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子とターゲッティングベクターとの間の相同的組換えがおきるため、組換えＥＳ細胞を作製できる（図２参照）。
【００４０】
なお、組換えのおきたＥＳ細胞にはネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれるため、Ｇ４１８（選別用薬剤）を含有する培地で培養を行うことにより、組換えＥＳ細胞を選別できる。また、アンジオテンシノーゲン遺伝子の途中にネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれるため、アンジオテンシノーゲン遺伝子の機能を欠損させることができる。
【００４１】
ＥＳ細胞におけるアンジオテンシノーゲン遺伝子の組換え頻度を表３に示す。表中、「ＴＴ２」は、ＥＳ細胞としてＴＴ２細胞株を用いた場合における遺伝子組換え頻度を示す（対照）。なお、ＴＴ２細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスとＣＢＡ系統のマウスとのＦ１雑種から採取されたＥＳ細胞由来のＥＳ細胞株である。表中、「Ｂ６−ＥＳ」は、本実験において樹立した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス由来のＥＳ細胞における遺伝子組換え頻度を示す。表中、「Ｇ４１８抵抗性クローンの数」は、Ｇ４１８含有培地で培養を行った際に増殖したクローンの数を示し、「遺伝子組換えクローンの数」は、Ｇ４１８抵抗性クローンのうち、ＰＣＲにより、実際に遺伝子組換えが確認されたクローンの数を示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
続いて、作製した組換えＥＳ細胞を用いて、実施例１と同様の方法（インジェクション法）によりキメラマウスを作製した。
【００４４】
結果を表４及び図３に示す。表４中の各記載は、表１又は表２と同様である。その他、「Ａｇｔ−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂ６ＥＳ ｃｅｌｌｓ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から樹立したＥＳ細胞についてアンジオテンシノーゲン遺伝子の遺伝子組換え（ノックアウト）を行った、遺伝子組換えＥＳ細胞を用いた結果であることを示す。なお、図３は、組換えＥＳ細胞を用いて作製したキメラマウスの図面代用写真である。このキメラマウスでは、生殖系列キメラであることを確認できなかった。
【００４５】
【表４】
【００４６】
表４などに示す通り、組換えＥＳ細胞を用いて、インジェクション法によりキメラマウス（ノックアウトマウス）を作製した場合、全体でキメラマウスは１匹しか作製できなかった。また、この雄キメラマウスとＩＣＲ系統の雌マウスを交配したが、組換えＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製することはできなかった。
【００４７】
そこで、今度は、実施例２の方法（４倍体胚を用いる方法）により、ノックアウトマウスの作製を試みた。
【００４８】
結果を表５に示す。表中の各記載は、表１、表２、又は表４と同様である。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示す通り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来の組換えＥＳ細胞株と、４倍体胚とを凝集させる方法を用いることにより、高頻度に雄ノックアウトマウスを作製できた。
【００５１】
なお、このノックアウトマウス作製方法は、手順中において、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配して調べる必要がないという点、及び、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製するために、別途、交配を行う必要がないという点で有利性がある。従って、このノックアウトマウス作製方法を用いることにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたノックアウトマウスを短期間で作製することができ、また、ノックアウトマウスの作製効率を大幅に向上できる。
【００５２】
その他、作製したノックアウトマウスの尻尾の一部を切断して組織を採取し、そのマウスが変異遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）を有するか、ＰＣＲ法により調べた。結果を図４に示す。
【００５３】
図４は、ＰＣＲの結果を示す図面代用写真である。図中の各バンドは、胎仔におけるネオマイシン耐性遺伝子の存在の有無を示す。
【００５４】
レーン１〜５は、作製したノックアウトマウスにおけるＰＣＲの結果を示す。なお、レーン１は、胎仔のうちに死んだ個体の結果であり、レーン２〜５は、生存した胎仔の結果である。レーン６は、ネガティブコントロールであり、遺伝子組換えを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊの個体から採取した尻尾を用いた場合におけるＰＣＲの結果を示す。レーン７及びレーン８は、ポジティブコントロールであり、既に、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれているノックアウトマウスの個体から採取した尻尾を用いた場合におけるＰＣＲの結果を示す。
【００５５】
図４の結果は、作製したノックアウトマウスでは、目的の遺伝子がノックアウトされていることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞のみからなり、かつ、生殖系列キメラマウス又はノックアウトマウスを短期間で高頻度に作製できる。
【００５７】
上述の通り、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスは、近交系のマウスとして、最も広く用いられている系統であり、形質や属性などに関する膨大なデータの蓄積を有する。本発明により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のノックアウトマウスを作製できるため、例えば、そのノックアウトマウスから得られたデータと、蓄積データとを比較・検討することにより、ノックアウトした遺伝子の詳細な機能解析などを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１において、インジェクション法により作製したキメラマウスの図面代用写真。
【図２】実施例３において、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子とターゲッティングベクターとの間の相同的組換えを示す模式図。
【図３】実施例３において、インジェクション法により、組換えＥＳ細胞を用いて作製したノックアウトマウスの図面代用写真。
【図４】目的の遺伝子がノックアウトされているかどうかに関する、ＰＣＲの結果を示す図面代用写真。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス又はノックアウトマウスの作製方法、それらの方法により作製されたキメラマウス又はノックアウトマウス、並びにキメラマウスの作製が可能で、生殖細胞への分化能力を保持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）は、発生初期胚の内部細胞塊由来の未分化細胞であり、あらゆる種類の細胞に分化する能力を有する。そのため、近年、再生医療などへの応用が期待されている。
【０００３】
マウスのＥＳ細胞は、１９８０年代に分離され、現在では、ノックアウトマウス作製などに広く応用されている。
【０００４】
ノックアウトマウスは、遺伝子工学的手法により、ある遺伝子を欠損又は変異させたマウスである。
【０００５】
ノックアウトマウスは、概ね、以下の手順で作製される。まず、ターゲッティングベクター（組換えＤＮＡ）を調製した後、エレクトロポレーション法などにより、そのターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する。そして、相同的遺伝子組換えのおこったＥＳ細胞株を選別する。次に、８細胞期胚又は胚盤胞期胚の中に、その組換えＥＳ細胞を、インジェクション法により注入し、キメラ胚を作製する。次に、そのキメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、産仔（キメラマウス）を得る。次に、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されているかどうかを確認する。そして、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されていることが確認されたマウス同士を交配し、得られた産仔の中からノックアウトマウスを選別する。
【０００６】
なお、本発明に関連のある先行文献として、例えば、以下の文献が挙げられる。特許文献１及び特許文献２には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統のマウス由来の雌のＥＳ細胞株、及び、その細胞株を用いたキメラ個体作製手段、などが記載されている。非特許文献１には、遺伝子ノックアウトによる胎生期致死を回避する技術として、４倍体胚とＥＳ細胞を凝集させることにより、ＥＳ細胞由来のマウスを作製する手段が記載されている。
【特許文献１】特開２００４−１４１０７３号公報
【特許文献２】特開２００１−６１４７０号公報
【非特許文献１】Nagy A. et al, “Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells” Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol90, pp.8424-8428, September 1993 Developmental Biology
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、ＥＳ細胞株の樹立は難しいという問題がある。例えば、既知の手順の通りにＥＳ細胞を作製した場合でも、ＥＳ細胞株を樹立できない場合も多く、また、ＥＳ細胞株を樹立した場合でも、樹立した株ごとに、キメラを形成する能力や組織への分化能力などの性質・特性が大きく異なることが多い。
【０００８】
また、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いてノックアウトマウスを作製することが難しい、という課題がある。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスは、近交系のマウスとして、最も広く用いられている系統の一つであり、形質や属性などに関する膨大なデータの蓄積を有する。従って、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスのＥＳ細胞株を用いてノックアウトマウスを作製することが最も好ましい。しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いた場合、生殖系列キメラマウスの作製が難しい。そのため、現在、１２９系マウス由来のＥＳ細胞株や、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスとＣＢＡ系統のマウスのＦ１雑種由来のＥＳ細胞を用いて生殖系列キメラマウスを作製し、ノックアウトマウスを樹立することが多い。その場合、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスにコンジェニック化するためには、通常、２年以上の年月を要する。
【０００９】
そこで、本発明は、キメラマウスやノックアウトマウスの作製に好適なＥＳ細胞株を樹立すること、及び、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いて、生殖系列キメラマウスを効率的かつ高頻度に作製できる手段を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、今般、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）の樹立に成功した（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。
【００１１】
そして、発明者らは、そのＥＳ細胞株を用いて研究を重ねた結果、従来通り、インジェクション法により、８細胞期胚又は胚盤胞期胚の中にＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製するのではなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と４倍体初期胚とを凝集させることにより、生殖系列（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ）キメラマウスを短時間で効率的に作製できることを新規に見出した。
【００１２】
そこで、本発明では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法を提供する。
【００１３】
これにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を用いて、生殖系列キメラマウスを高頻度に作製できる。従って、例えば、そのＥＳ細胞の遺伝子組換えを行ってから生殖系列キメラマウスを作製することにより、ノックアウトマウスを高頻度に樹立できる。
【００１４】
ＥＳ細胞と４倍体初期胚とを凝集させた後、その凝集胚をマウスに移植した場合、その産仔は、ほぼ全てがＥＳ細胞由来の細胞により形成されるため、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、交配などにより検定する必要がない。また、Ｃ５７ＢＬ／６系統の遺伝形質を備えたノックアウトマウスの作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスにコンジェニック化する必要がないため、作製期間を大幅に短縮できる。従って、キメラマウス又はノックアウトマウスの作製を短時間で効率的に行うことができる。
【００１５】
４倍体初期胚は、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２細胞期胚を電気的に融合することにより作製できる。
【００１６】
なお、本発明において、「生殖系列キメラマウス」とは、交配によりＥＳ細胞由来の遺伝子型を子孫に伝達できるキメラマウスのことをいう。即ち、生殖細胞（精子又は卵）がＥＳ細胞由来の細胞により形成され、ＥＳ細胞の遺伝情報が生殖により次世代に伝達可能であるキメラマウスのことをいう。例えば、インジェクション法により初期胚にＥＳ細胞を注入してキメラ胚を作製し、キメラマウスを得た場合、初期胚由来の細胞により生殖細胞が形成される場合と、ＥＳ細胞由来の細胞により生殖細胞が形成される場合がある。それに対し、キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞由来の細胞により形成された場合、そのキメラマウスを用いて交配を行うことにより、ＥＳ細胞由来の遺伝子型を子孫に伝達できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、生殖系列キメラマウスを効率的かつ高頻度に作製できる。
【実施例１】
【００１８】
実施例１では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から独自にＥＳ細胞株を樹立し、そのＥＳ細胞株を用いて、キメラマウスの作製を試みた。
【００１９】
概要を以下に示す。
【００２０】
はじめに、ＥＳ細胞株を樹立した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの胚盤胞から内部細胞塊を採取した後、その採取した細胞をフィーダー細胞上で培養し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ由来の雄のＥＳ細胞を樹立した（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。フィーダー細胞として、ＢＡＬＢ／ｃ系統由来のマウス胎仔線維芽細胞をマイトマイシンＣ処理して用いた。また、培地として、ＤＭＥＭ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥＡＧＬＥ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ダルベッコ変法イーグル培地、ＳＩＧＭＡ社製）に、１５％ＫＳＲ（ＫＮＯＣＫＯＵＴ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ノックアウト血清代替添加物、ＧＩＢＣＯ社製）、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病阻害因子、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ；非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したものを用いた。
【００２１】
続いて、樹立したＥＳ細胞株を用いて、インジェクション法によるキメラマウスの作製を試みた。まず、交配したＩＣＲ系統の雌マウスから８細胞期胚又は胚盤胞期胚を採取した。次に、インジェクション法により、樹立したＥＳ細胞を、その胚の中に注入し、キメラ胚を作製した。次に、そのキメラ胚を、偽妊娠雌マウスの子宮に移植し、自然分娩により、産仔（雄マウス）を得た。そして、得られた雄マウスがＥＳ細胞由来の細胞を有するマウスであるかどうか、毛色により判定した。なお、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの毛色は黒色、ＩＣＲ系統のマウスは白色（アルビノ）であり、キメラマウスは、白色部位と黒色（又は茶色）部位のある斑模様になる。
【００２２】
次に、得られた雄キメラマウスとＩＣＲ系統の雌マウスを交配し、作製した雄キメラマウスが生殖系列キメラマウスであるかどうかを調べた。雄キメラマウスの生殖細胞（精子）がＥＳ細胞由来の細胞により形成されている場合、交配後に得られた産仔（雄又は雌マウス）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ由来の形質を備えるため、黒色になる。一方、雄キメラマウスの生殖細胞が胚細胞由来の細胞により形成されている場合、交配後に得られた産仔（雄又は雌マウス）はＩＣＲ由来であるため、白色毛色になる。そこで、交配後の産仔（雄又は雌マウス）の毛色を確認することにより、作製した雄キメラマウスが生殖系列キメラマウスであるかどうかを調べた。
【００２３】
結果を表１に示す。表中、「ｄｏｎｏｒ」は用いたＥＳ細胞を、「ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ」は用いた胚のマウス系統の由来（ｓｔｒａｉｎｓ）と胚の種類（ｅｍｂｒｙｏ）を、それぞれ示し、「ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｅｄ」はＥＳ細胞の導入手段を示す。表中、「Ｎｏ． ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ」は偽妊娠マウスに移植したキメラ胚の個数を、「Ｎｏ． ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」はそのうち生まれた産仔数を、「Ｎｏ． ｏｆ ｃｈｉｍｅｒａｓ」は生まれた産仔のうちキメラマウスの個体数（雌雄両方を含む数）を、「Ｎｏ． ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｈｉｍｅｒａｓ」は得られたキメラマウスのうち生殖系列キメラマウスの個体数を、それぞれ示す。なお、表中、「Ｂ６ＥＳ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から樹立したＥＳ細胞を用いた結果であることを、「ｃｌｏｎｅ Ａ」及び「ｃｌｏｎｅ Ｂ」は、クローンが別であることを、「ＩＣＲ」はＩＣＲ系統のマウスの初期胚を用いたことを、「８−ｃｅｌｌ」は８細胞期胚を用いたことを、「ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」は胞胚期胚を用いたことを、「ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」はインジェクション法によりＥＳ細胞注入を行ったことを、それぞれ表す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
図１は、作製したキメラマウスの図面代用写真である。右側の二つのマウスでは、黒色部分が少なく、ＥＳ細胞に由来する細胞の占有率が低かった。その後、ＩＣＲ系統の雌マウスを交配した結果、生殖系列遺伝の能力は確認できなかった（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｈｉｍｅｒａ）。それに対し、左側の二つのマウスでは、ＥＳ細胞に由来する細胞の占有率が１００％に近く、全身が黒色であった。その後、ＩＣＲ系統の雌マウスを交配した結果、生殖系列キメラマウスであることが確認された（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｈｉｍｅｒａ）。
【００２６】
表１及び図１に示す通り、本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から雄ＥＳ細胞株を樹立でき、また、一般的な方法であるインジェクション法によっても、そのＥＳ細胞株を用いて雄の生殖系列キメラマウスを作製することができた。
【００２７】
この実験結果には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚からＥＳ細胞株を樹立でき、かつ、そのＥＳ細胞株を用いて、生殖系列キメラマウスを作製することができたという点で、有利性がある。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスには、遺伝的に異なるいくつかの亜系がある。例えば、６Ｊは米国Ｊａｃｋｓｏｎ研究所で確立された亜系であり、６Ｎは米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）で確立された亜系である。そのうち、６Ｊの系統は、マウスのゲノム解析などの研究でプロトタイプ（標準系統）として最も広く用いられている系統である。従って、本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６系統のうち、特に６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞株を用いて生殖系列に移行できるキメラマウスを作製することができたという点で、有利性がある。
【００２８】
加えて、上述の実験結果には、雄のＥＳ細胞株を樹立でき、かつ、そのＥＳ細胞株を用いて、雄の生殖系列キメラマウスを作製することができたという点でも、有利性がある。雄のＥＳ細胞を用いた場合、雄の生殖系列キメラマウスを得ることができるため、その精子を用いることにより、一度にたくさんの子孫マウスを得ることができる。従って、ＥＳ細胞由来のマウスを効率的に作製できる。また、雄のＥＳ細胞は、Ｘ染色体とＹ染色体の両方を有しているため、Ｙ染色体上に存在する遺伝子の解析なども行うことができるという有利性がある。
【実施例２】
【００２９】
実施例２では、ＥＳ細胞株と４倍体胚とを用いて、キメラマウスの作製を試みた。
【００３０】
まず、４倍体胚を作製した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスから、２細胞期胚を採取し、電気融合法により、４倍体にした。次に、この４倍体胚を８細胞期まで培養した。次に、４倍体胚の透明体を除去した後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統由来のＥＳ細胞を入れ、両者を凝集させた。なお、本実験では、実施例１で樹立したＥＳ細胞の代わりに、発明者らが別途樹立した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｇｒｅｅｎ ｍｏｕｓｅ（ＧＦＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウス）由来のＥＳ細胞を用いた。このＥＳ細胞と実施例１で樹立したＥＳ細胞とは、用いたマウスの系統が全く同一であるため、遺伝形質はＧＦＰ遺伝子が導入されていることを除き同一であると推測できる。次に、その凝集胚を胚盤胞にまで発生させた後、偽妊娠マウスに移植し、産仔（雄マウス）を得た。
【００３１】
なお、一般的な電気融合法では、複数の２細胞期胚を直線状に並べ、両側を平行二重電極で挟み、電気融合を行う。しかしながら、この方法で電気融合を行った場合、全ての細胞で均一に細胞融合を行うことができず、４倍体胚を確実に作製することができない。従って、作製した４倍体胚の中に２倍体胚が混在するため、目的のマウスの発生率が下がるという問題があった。そこで、発明者らの試行錯誤の末、本実験では、一個の２細胞期胚を針型電極で挟み込むことにより電気融合を行い、４倍体胚を一個ずつ作製した。これにより、４倍体胚の作製効率は下がったが、確実に、４倍体胚を得ることができるようになった。
【００３２】
結果を表２に示す。表中の各記載は、表１と同様である。表中、「Ｂ６Ｇ−２ ｃｅｌｌｓ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｇｒｅｅｎ ｍｏｕｓｅから樹立したＥＳ細胞を用いた結果であることを、「Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの初期胚を用いたことを、「ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ ８−ｃｅｌｌ」は、４倍体の８細胞期胚を用いたことを、「ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ」は凝集法により４倍体胚とＥＳ細胞との凝集を行ったことを、それぞれ示す。表中、その他の表中の各記載は、表１と同様である。
【００３３】
【表２】
【００３４】
表２に示す通り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞株と、４倍体胚とを凝集させる方法を用いることにより、高頻度に雄キメラマウスを作製できた。
【００３５】
なお、このキメラマウス作製方法は、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配して調べる必要がないという点で有利性がある。この方法を用いた場合、４倍体細胞は発生途上で死滅するため、作製した雄キメラマウスは、ほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来の細胞から形成される。従って、生殖細胞もＥＳ細胞由来の細胞から形成されるため、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配などにより調べる必要がない。
【００３６】
加えて、上述のキメラマウス作製方法は、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製するために、別途、交配を行う必要がないという点でも有利性がある。インジェクション法によりキメラマウスを作製する場合、例えば、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、生殖細胞キメラマウスであるかどうかを確認した後、得られた産仔同士をさらに交配して、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたマウスを作製する。それに対し、上述の手順でキメラマウスを作製する場合、それらの交配を行う必要がない。
【００３７】
従って、このキメラマウス作製方法を用いることにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたマウスを短期間で作製することができ、また、それらのマウスの作製効率を大幅に向上できる。
【実施例３】
【００３８】
実施例３では、実施例１で樹立したＥＳ細胞株を用いて、ノックアウトマウスの作製を試みた。本実験では、例として、アンジオテンシノーゲン遺伝子欠損マウスの作製を試みた。
【００３９】
はじめに、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子の組換えを行い、組換えＥＳ細胞を作製した。まず、ターゲッティングベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）の作製を行った。アンジオテンシノーゲン遺伝子の一部の配列を有するＤＮＡを調製した後、ポジティブ選別マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ’）を、ネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ）遺伝子を、そのＤＮＡに連結し、ターゲットベクターを作製した。次に、エレクトロポレーション法により、そのターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。これにより、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子とターゲッティングベクターとの間の相同的組換えがおきるため、組換えＥＳ細胞を作製できる（図２参照）。
【００４０】
なお、組換えのおきたＥＳ細胞にはネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれるため、Ｇ４１８（選別用薬剤）を含有する培地で培養を行うことにより、組換えＥＳ細胞を選別できる。また、アンジオテンシノーゲン遺伝子の途中にネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれるため、アンジオテンシノーゲン遺伝子の機能を欠損させることができる。
【００４１】
ＥＳ細胞におけるアンジオテンシノーゲン遺伝子の組換え頻度を表３に示す。表中、「ＴＴ２」は、ＥＳ細胞としてＴＴ２細胞株を用いた場合における遺伝子組換え頻度を示す（対照）。なお、ＴＴ２細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスとＣＢＡ系統のマウスとのＦ１雑種から採取されたＥＳ細胞由来のＥＳ細胞株である。表中、「Ｂ６−ＥＳ」は、本実験において樹立した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス由来のＥＳ細胞における遺伝子組換え頻度を示す。表中、「Ｇ４１８抵抗性クローンの数」は、Ｇ４１８含有培地で培養を行った際に増殖したクローンの数を示し、「遺伝子組換えクローンの数」は、Ｇ４１８抵抗性クローンのうち、ＰＣＲにより、実際に遺伝子組換えが確認されたクローンの数を示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
続いて、作製した組換えＥＳ細胞を用いて、実施例１と同様の方法（インジェクション法）によりキメラマウスを作製した。
【００４４】
結果を表４及び図３に示す。表４中の各記載は、表１又は表２と同様である。その他、「Ａｇｔ−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂ６ＥＳ ｃｅｌｌｓ」は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス初期胚から樹立したＥＳ細胞についてアンジオテンシノーゲン遺伝子の遺伝子組換え（ノックアウト）を行った、遺伝子組換えＥＳ細胞を用いた結果であることを示す。なお、図３は、組換えＥＳ細胞を用いて作製したキメラマウスの図面代用写真である。このキメラマウスでは、生殖系列キメラであることを確認できなかった。
【００４５】
【表４】
【００４６】
表４などに示す通り、組換えＥＳ細胞を用いて、インジェクション法によりキメラマウス（ノックアウトマウス）を作製した場合、全体でキメラマウスは１匹しか作製できなかった。また、この雄キメラマウスとＩＣＲ系統の雌マウスを交配したが、組換えＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製することはできなかった。
【００４７】
そこで、今度は、実施例２の方法（４倍体胚を用いる方法）により、ノックアウトマウスの作製を試みた。
【００４８】
結果を表５に示す。表中の各記載は、表１、表２、又は表４と同様である。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示す通り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来の組換えＥＳ細胞株と、４倍体胚とを凝集させる方法を用いることにより、高頻度に雄ノックアウトマウスを作製できた。
【００５１】
なお、このノックアウトマウス作製方法は、手順中において、生殖系列キメラマウスであるかどうかを、別途、交配して調べる必要がないという点、及び、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されるマウスを作製するために、別途、交配を行う必要がないという点で有利性がある。従って、このノックアウトマウス作製方法を用いることにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで形成されたノックアウトマウスを短期間で作製することができ、また、ノックアウトマウスの作製効率を大幅に向上できる。
【００５２】
その他、作製したノックアウトマウスの尻尾の一部を切断して組織を採取し、そのマウスが変異遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）を有するか、ＰＣＲ法により調べた。結果を図４に示す。
【００５３】
図４は、ＰＣＲの結果を示す図面代用写真である。図中の各バンドは、胎仔におけるネオマイシン耐性遺伝子の存在の有無を示す。
【００５４】
レーン１〜５は、作製したノックアウトマウスにおけるＰＣＲの結果を示す。なお、レーン１は、胎仔のうちに死んだ個体の結果であり、レーン２〜５は、生存した胎仔の結果である。レーン６は、ネガティブコントロールであり、遺伝子組換えを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊの個体から採取した尻尾を用いた場合におけるＰＣＲの結果を示す。レーン７及びレーン８は、ポジティブコントロールであり、既に、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれているノックアウトマウスの個体から採取した尻尾を用いた場合におけるＰＣＲの結果を示す。
【００５５】
図４の結果は、作製したノックアウトマウスでは、目的の遺伝子がノックアウトされていることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス由来のＥＳ細胞のみからなり、かつ、生殖系列キメラマウス又はノックアウトマウスを短期間で高頻度に作製できる。
【００５７】
上述の通り、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスは、近交系のマウスとして、最も広く用いられている系統であり、形質や属性などに関する膨大なデータの蓄積を有する。本発明により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のノックアウトマウスを作製できるため、例えば、そのノックアウトマウスから得られたデータと、蓄積データとを比較・検討することにより、ノックアウトした遺伝子の詳細な機能解析などを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１において、インジェクション法により作製したキメラマウスの図面代用写真。
【図２】実施例３において、内在性アンジオテンシノーゲン遺伝子とターゲッティングベクターとの間の相同的組換えを示す模式図。
【図３】実施例３において、インジェクション法により、組換えＥＳ細胞を用いて作製したノックアウトマウスの図面代用写真。
【図４】目的の遺伝子がノックアウトされているかどうかに関する、ＰＣＲの結果を示す図面代用写真。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法。
【請求項２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２細胞期胚を電気的に融合することにより、前記４倍体初期胚を作製することを特徴とする請求項１記載のキメラマウス作製方法。
【請求項３】
前記キメラマウスは、生殖系列キメラマウスであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のキメラマウス作製方法。
【請求項４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞の遺伝子組換えを行う手順と、
作製された組換えＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順と、を少なくとも含むノックアウトマウス作製方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の方法により作製されたキメラマウス。
【請求項６】
請求項４記載の方法により作製されたノックアウトマウス。
【請求項７】
キメラマウスの作製が可能で、生殖細胞への分化能力を保持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞株（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。
【請求項１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、「ＥＳ細胞」とする。）と、４倍体初期胚とを凝集させる手順を少なくとも含むキメラマウス作製方法。
【請求項２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２細胞期胚を電気的に融合することにより、前記４倍体初期胚を作製することを特徴とする請求項１記載のキメラマウス作製方法。
【請求項３】
前記キメラマウスは、生殖系列キメラマウスであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のキメラマウス作製方法。
【請求項４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞の遺伝子組換えを行う手順と、
作製された組換えＥＳ細胞と、４倍体初期胚とを凝集させる手順と、を少なくとも含むノックアウトマウス作製方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の方法により作製されたキメラマウス。
【請求項６】
請求項４記載の方法により作製されたノックアウトマウス。
【請求項７】
キメラマウスの作製が可能で、生殖細胞への分化能力を保持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞株（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６８３）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−１０４９６４（Ｐ２００７−１０４９６４Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９８８２５（Ｐ２００５−２９８８２５）
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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