クラバム、例えばクラブラン酸の製造を改良する新規方法
クラバム、例えばクラブラン酸の製造を改良する新規方法。クラブラン酸を増産できる新規ＤＮＡ配列および新規微生物もまた開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラバム（clavam）、例えばクラブラン酸の製造を改良する新規方法に関する。また、本発明は増量のクラブラン酸の産生能を有する新規ＤＮＡ配列および新規微生物も提供する。
【０００２】
微生物、特にストレプトマイセス種は、クラブラン酸やその他のクラバム、セファロスポリン、ポリケチド、セファマイシン、ツニカマイシン、ホロマイシン（holomycin）およびペニシリンを含む数多くの抗生物質を産生する。この微生物により産生される抗生物質の絶対量および相対量を操作できるようにすることに大きな関心があるため、その生合成経路の代謝機構や遺伝的機構を調査する研究が数多くされてきた（Demain、A.L．(1990） 「50 years of Penicillin applications、history and trends」中の「Biosynthesis and regulation of β-lactam antibiotics.」）。
【０００３】
ストレプトマイセス・クラヴリゲルス（Streptomyces clavuligerus；以下、エス・クラヴリゲルスという）は、２つの主たる群の抗生物質、１つはセファマイシン、セファロスポリンおよびペニシリン(Demain、A.L．(1990）前掲）であり、もう１つはクラバムを含む抗生物質を産生する。クラバムは、独断的に、その環の立体化学に応じて５Ｓおよび５Ｒクラバムの２つのグループに分けることができる。抗生物質オーグメンチン（Augmentin）(グラクソスミスクラインの登録商標）の成分であり商業的に重要なクラバムクラブラン酸は、５Ｒクラバムである。５Ｓクラバムの例としては、クラバム-２-カルボキシレート (Ｃ−２−Ｃ）、２−ヒドロキシメチルクラバム(２ＨＭＣ）およびアラニルクラバム（Brownら．(1979） J．Chem．Soc．Chem．pp282-283）がある。
【０００４】
クラブラン酸産生に関する生合成酵素および制御タンパク質をコードする遺伝子は、セファマイシンＣ産生に関与する遺伝子に隣接するクラスター中に位置しており、エス・クラヴリゲルスのゲノム内で抗生物質関連遺伝子のスーパークラスターを形成している(Alexanderら．(1998） J.Bacteriol．180:4068-79）。例えば、クラブラン酸の先駆体である、クラバミン酸の産生に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ｏｒｆ２（ｃｅａＳ）(Khaleeliら．(1999） J．Am．Chem．Soc．121:9223-9224）、ｏｒｆ３(ｂｌｓ）(BachmannおよびTownsend (1998） Chem．Commun.:2325-2326）、ｏｒｆ４（ｐａｈ）(Wuら．(1995） J．Bacteriol．177:3714-3720）、ｏｒｆ５（ｃａｓ２）(Marshら．(1992） Biochemistry．31:12648-57）および場合によってはｏｒｆ６（Kershawら．(2002） Eur．J．Biochem．269,2052-2059）が挙げられ、それらは全てクラブラン酸クラスター内に位置している。ｏｒｆ２−６における破壊は、その変異体培養菌を澱粉アスパラギン培地（Starch asparagines medium）上で生育させた場合に、クラブラン酸産生を完全に喪失させる。(Aidoo、K.Aら．(1993） p219-236 In．V.P．Gullo、J.C．Hunter-Cevera、R．CooperおよびR．K．Johnson (著）、Developments in Industrial Microbiology series、vol.33 Society for Industrial Microbiology、Fredericksburg、Va.）。しかし、この喪失は、用いる培養基の条件に依存しており、ソイ培地（Soy medium）上で生育させた場合には(Saloweら．(1990） Biochemistry 29: 6499-6508）、クラブラン酸産生が部分的に回復する(Jensenら．(2002） Antimicrob．Agents and Chemother．44: 720-726）。この現象は、エス・クラヴリゲルスのゲノム中に存在する他の遺伝子が特定の条件下で、これらの遺伝子の活性の喪失を何らかの方法で補い得ることを示している。あるいは、ソイ培地に１つまたはそれ以上のｏｒｆ２−６によって産生される代謝産物が少量含まれており、それによって、これらの遺伝子が破壊された株でも少量のクラブラン酸を生産できるようになっている可能性がある。
【０００５】
上記Ｍａｒｓｈら（1992）は、エス・クラヴリゲルスが２コピーのｃａｓ遺伝子（ｃａｓ１およびｃａｓ２）を有していると報告した。ｃａｓ１はクラブラン酸遺伝子クラスターと関連していないが、ｃａｓ２に対して高い相同性を示す。ｃａｓ２の破壊は、その培養菌をソイ培地上で生育させた場合にクラブラン酸産生を３５％低下させ、培養菌を澱粉アスパラギン（ＳＡ）培地上で培養した場合には完全に産生を停止させる（ParadkarおよびJensen 1995 J.Bact 177: 1307-1314）。ｃａｓ１遺伝子の破壊は、ＳＡ培地上では野生型に近いレベルのクラブラン酸を産生するが、ソイ培地上で培養した場合には野生型よりも３１−７３％低いクラブラン酸量を産生する突然変異体を与える（Mosherら(1999） Antimicrob．Agents and Chemother．43: 1215-1224）。また、ｃａｓ１およびｃａｓ２の両方の遺伝子とも破壊された変異体株では、試験したどの発酵条件下でもクラブラン酸を産生しないことが報告されている。興味深いことに、ｃａｓ１周辺の遺伝子を配列決定したところ、クラブラン酸産生に関与する新たな遺伝子は見つからなかったが、その代わり５Ｓクラバム生合成に関与する新規遺伝子が６種類（ｃｖｍ１〜６と称する）同定された（Mosherら(1999）前掲）。さらに、これら５Ｓクラバム−特異的遺伝子の研究によって、遺伝子工学的方法を用いた遺伝子の破壊が、その変異体株の生産するクラブラン酸レベルを向上させ、さらに５Ｓクラバム産生レベルを劇的に低下させることが示された(WO98/33896）。ある５Ｓクラバムは毒性であることが知られているため、英国および米国の薬局方ではそのレベルを厳しく規制していることから、５Ｓクラバムにおける、特に５Ｓクラバム クラバム−２−カルボキシレートにおける産生の低下は、クラブラン酸の商業的生産に特に重要である。
【０００６】
クラブラン酸生合成の理解が進んだにもかかわらず、医薬産業ではより望ましい目標に向けて、今尚、経費上の理由および安全上の理由の両面からクラブラン酸の生産方法の改善が継続されている。
【０００７】
以下の定義は、本明細書中で頻出する特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【０００８】
本明細書中で用いられる「遺伝子」には、遺伝子の機能または発現に必要ないずれかの調節領域も含まれる。
【０００９】
本明細書中で用いられる「ｃｖｍ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６またはｃｖｍ７のいずれかを意味する。
【００１０】
本明細書中で用いられる「ｃｖｍｐａｒａ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｃｖｍ６ｐａｒａまたはｃｖｍ７ｐａｒａのいずれかを意味する。
【００１１】
本明細書中で用いられる「ｏｒｆ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８のいずれかを意味する。
【００１２】
本明細書中で用いられる「ｏｒｆｐａｒａ」は、上記で定義した遺伝子ｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａまたはｏｒｆ６ｐａｒａのいずれかを意味する。
【００１３】
本明細書中で用いられる「破壊（された）」は、（５Ｓクラバム産生に関する）遺伝子の活性を、例えば抗生物質耐性遺伝子、好ましくはアプロマイシン（Paradkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）前掲）を用いた挿入不活性化またはその他の突然変異技術（例えば、上記 Sambrookら (1989）に開示された技術）によって、低下もしくは消失させることを意味する。その他の突然変異技術には、別のＤＮＡ（抗生物質体制遺伝子でないもの）の挿入、遺伝子配列中の１個またはそれ以上の塩基を交換するか、もしくは遺伝子の配列中への１個またはそれ以上の塩基を挿入する部位特異的変異導入のいずれかが含まれる。
【００１４】
本明細書中で用いられる「欠失（された）」は、欠失が行われる前には、その遺伝子またはその断片を含んでいたより大きなポリヌクレオチドから、前記遺伝子または前記断片を欠失（除去）することを意味する。欠失を生じさせるポリヌクレオチドを、遺伝子置換技術（ParadkarおよびJensen (1995）前掲）によって微生物のゲノムに導入すると、遺伝子またはそれにコードされたタンパク質の活性が消失または低下し、その微生物によって産生される５Ｓクラバムのレベルが減少する。この欠失は、大規模（例えば、調節管理領域を含むか含まない完全な読み取り枠）であっても小規模（例えば、フレームシフト変異となる単一塩基）であってもよい。
【００１５】
本明細書中で用いられる「減少（された）」は、本発明の微生物によって産生される５Sクラバムのレベルが、関連する読み取り枠が破壊も欠失もされていない、相当するエス・クラヴリゲルス株で産生されるレベルよりも低いことを意味する。従って、この相当するエス・クラヴリゲルスは、読み取り枠に破壊や欠失を順次導入して本発明の微生物を作る「親」株である。
【００１６】
本明細書中で用いられる「少なくとも維持（された）」は、本発明の微生物において産生されるクラブラン酸レベルが、関連する読み取り枠が破壊も欠失もされていない相当するエス・クラヴリゲルス株において産生されるレベルと同等またはそれ以上であることを意味する。従って、この相当するエス・クラヴリゲルスは、読み取り枠に破壊や欠失を順次導入して本発明の微生物を作る「親」株である。
【００１７】
本発明は、新たに同定されたエス・クラヴリゲルス遺伝子を用いたクラブラン酸を生成する新規方法に関する。ｏｒｆ４から誘導されたプローブを用いることで、エス・クラヴリゲルスゲノムの断片を単離し、そして、それが破壊された場合にエス・クラヴリゲルスにおける５Ｓおよび５Ｒクラバム生合成に影響を及ぼすことが示された遺伝子が多数含まれることを明らかにした。断片の配列を分析することで、ｏｒｆ４に対して高い相同性を示す遺伝子（本明細書中以下、ｏｒｆ４ｐａｒと称する）の存在が示された。しかしながら、驚くべきことに、このｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子に隣接した領域の配列をさらに分析することで、クラブラン酸（ｃａｓ２クラスター）および５Ｓクラバム（ｃａｓ１クラスター）のいずれにおいても、既に同定された遺伝子のパラロガスを含む新しい遺伝子のクラスターが明らかとなった。
【００１８】
従って、本発明は、５Ｓクラバム生合成に重要な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠は上記エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生を減少させ、およびクラブラン酸産生が少なくとも維持されることとなるように破壊または欠失されており、その読み取り枠が以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ(配列番号:１）;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ(配列番号:２）;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６(配列番号:５）;または
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７(配列番号:６）
から選択される、エス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、５Ｓクラバム生合成に重要な読み取り枠の１つまたはそれ以上の相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が上記エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生を減少させ、およびクラブラン酸産生が少なくとも維持されるように破壊または欠失されており、その読み取り枠が以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１(配列番号:７）、ｃｖｍ２(配列番号:８）、ｃｖｍ３(配列番号:９）、ｃｖｍ４(配列番号:１０）、ｃｖｍ５(配列番号:１１）、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ;または
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から選択される、エス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００２０】
遺伝子ｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５およびｃｖｍ６は、上記のMosherら(1999）およびWO98/33896に開示されている(ｃｖｍ１はｏｒｆｕｐ１であり、ｃｖｍ２はｏｒｆｕｐ２、ｃｖｍ３はｏｒｆｕｐ３、ｃｖｍ４はｏｒｄｗｎ１、ｃｖｍ５はｏｒｆｄｗｎ２、並びにｃｖｍ６はｏｒｆｄｗｎ３である）。さらなる５Ｓクラバム（ｃａｓ１）クラスターの５Ｓクラバム特異的遺伝子であるとして見出されたｃｖｍ７遺伝子は、本発明を成した研究中に同定され、本明細書中以下に開示する。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物の作製に用いられるｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ７ｐａｒａ読み取り枠を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドには以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６;
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７;
ｅ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７またはｃｖｍ７ｐａｒａ;あるいは
ｆ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７またはｃｖｍ６ｐａｒａ、
から成る群から選択される読み取り枠が含まれる。
【００２２】
その他の態様において、本発明は、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物の作製に用いることができる、本明細書中で開示するｃｖｍポリヌクレオチドをクローニングおよび操作するためのベクターを提供する。また、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物を作製するための、これらベクターの使用方法も提供する。
【００２３】
ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ７ｐａｒａによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により提供される（それぞれ配列番号：３および配列番号：４）。
【００２４】
さらに、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドであって、その読み取り枠が以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ（配列番号:１２）、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ（配列番号:１３）、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ（配列番号:１４）、および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ（配列番号:１５）、
から成る群から選択されるポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドであって、その読み取り枠が、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０（カナダ特許出願番号2108113およびJensen,S.Eら(2000） Antimicrob．Agents Chemother 44:720-6）、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２（Li、R.Nら(2000） J．Bacteriol 182:4087-95）、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８（国際特許出願番号 PCT/GB02/04989）から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子と組み合わされる、以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
を１つまたはそれ以上を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを、それを用いることで高いレベルのクラブラン酸を産生することができるストレプトマイセス・クラヴリゲルス株を作製するための上記ベクターの使用方法と共に、提供する。
【００２７】
そのように作製されたストレプトマイセス・クラヴリゲルス株、および発酵によりクラブラン酸を産生させるためにそれらを使用する方法もまた提供される。
【００２８】
このように、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドを含むベクターを有するストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
の群から選択される微生物をさらに提供する。
【００２９】
さらなる態様について、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリペプチドを含むベクターを有するストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０（カナダ特許出願番号2108113 およびJensen、S.Eら(2000） Antimicrob．Agents Chemother 44:720-6）、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２（Li、R.Nら(2000） J．Bacteriol 182:4087-95）、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８（国際特許出願番号 PCT/GB02/04989）から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子と組み合わされる、以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
から成る群から選択される、ストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００３０】
また本発明は、前記開示の他に破壊もしくは欠失された５Ｓ遺伝子と組み合わされていても良い１つまたはそれ以上の破壊もしくは欠失されたｃｖｍ６ｐａｒａまたはｃｖｍ７ｐａｒａ遺伝子と、前記開示の他にクラブラン酸生合成遺伝子（ｏｒｆ２〜ｏｒｆ１８遺伝子から選択される）と組み合わされていても良いｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａまたはｏｒｆ６ｐａｒａ遺伝子を含むベクターとの組み合わせを含む、エス・クラヴリゲルス微生物にも関する。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示された配列、並びに上記のMosherら(1999）、WO98/33896、カナダ特許出願番号2108113、Jensen、S.Eら (2000）前掲、Li、R.Nら(2000）前掲、および前記の国際特許出願番号PCT/GB02/04989に記載の配列を用いた、一般的なクローニング技術、例えばＰＣＲ法またはライブラリースクリーニング法によって単離することができる。このようなクローニング方法の例としては、例えば、Sambrook、J.ら (1989） モレキュラー・クローニング、ライブラリー・マニュアル(第２版）コールド・スプリンガー・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリンガー・ハーバー、ニューヨーク（Molecular cloning、a laboratory manual (2nd Ed） Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York）に記載されている。
【００３２】
それぞれの読み取り枠を含むポリヌクレオチドは、当分野で周知の技術を用いて、単離され、そして上記のように種々組み合わせてベクター中にライゲーションして一体とすることができる。ベクターは、達成される機能、例えばクローニング、発現、遺伝子不活性化または遺伝子置換のためのエス・クラヴリゲルスなどへの運搬によって選択されよう。いずれの場合においても、当業者であればベクターの変種を利用でき、それらは当分野で周知である。例えば、そのようなベクターとしては、上記Sambrook、Jら(1989）の一般的なクローニングベクター、上記Hopwood、D.Aら(1985）のストレプトマイセス用ベクター、上記ParadkarおよびJensen (1995）、上記Mosherら(1999）および上記WO98/33896の遺伝子破壊用および遺伝子置換用ベクター、並びに上記CA2108113のストレプトマイセス・クラヴリゲルスの遺伝子発現に好適なベクターが知られている。しかしながら、ベクターの選択は、本明細書中に開示したものだけに限定されるものではない。
【００３３】
さらに、ｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａ、ｏｒｆ５ｐａｒａおよびｏｒｆ６ｐａｒａ遺伝子を含む遺伝子の組み合わせにおいて、当業者であれば、本来のプロモーターもしくはストレプトマイセス・クラヴリゲルス背景でも機能する異種プロモーターのいずれかの転写プロモーター、あるいは実際にそれぞれの読み取り枠の発現を随意に活性化できる形式のその他の調節配列と関連させて、それぞれの読み取り枠を好適に確実に配置させるための好適なＤＮＡ構築物を設計することができるであろう。
【００３４】
次いで、ポリヌクレオチドの操作、特にストレプトマイセス・クラヴリゲルス背景への導入については、一般的な方法、例えば上記のHopwood、D.Aら(1985）に開示されているような方法に従って、実施することができる。遺伝子配列の破壊、次いで遺伝子置換は、上記のParadkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）の方法に従って実施することができる。遺伝子の欠失は、慣用技術、例えばWO98/33896に開示されている技術を用いて実施することができる。
【００３５】
本発明の微生物は、限定するものではないが、ストレプトマイセス・クラヴリゲルスＡＴＣＣ２７０６４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、マナッサス、バージニア、USA）、あるいはＮＲＲＬ ３５８５（ノース・リージョン・リサーチ・ラボラトリー（Northern Regional Research Laboratory）、ピオリア、イリノイ、USA）として入手できるものを含む、ストレプトマイセス・クラヴリゲルス株から作製することができる。例えば、遺伝子工学技術によって作製されるもの、または株改良法(strain improvement method）によって作製されるものを含む、ストレプトマイセス・クラヴリゲルスの変異株も用いることができる。そのような株の例としては、ＷＯ９８／３３８９６に開示されているようなストレプトマイセス・クラヴリゲルス株５６−１Ａ、５６−３Ａ、５７−２Ｂ、５７−１Ｃ、６０−１Ａ、６０−２Ａ、６０−３Ａ、６１−１Ａ、６１−２Ａ、６１−３Ａまたは６１−４Ａが挙げられる。
【００３６】
このように、別の態様において、本発明は上記のポリヌクレオチドを単離し、前記ポリヌクレオチドを操作し、その操作したポリヌクレオチドを前記の好適な微生物に導入し、クラブラン酸を産生する条件下でその好適な微生物を発酵培養することで産生されるクラブラン酸を単離および精製することを含む、好適な微生物におけるクラブラン酸産生を改良する方法に関する。前記ポリヌクレオチドの操作は、ｃｖｍ遺伝子と一緒に用いられることあるｃｖｍｐａｒａ遺伝子の場合に遺伝子配列を破壊又は欠失させる方法、あるいはｏｒｆ遺伝子と一緒に用いられることあるｏｒｆｐａｒａ遺伝子の場合に発現に好適なベクター中に挿入する方法があり得る。
【００３７】
好適な微生物はストレプトマイセス・クラヴリゲルスであることが好ましい。
その発酵、単離および精製法は当分野で周知であり、例えば発酵法は英国特許出願１，５０８，９７７に開示されている。抗菌製剤の調製にクラブラン酸を用いる方法は同様に当分野において周知である。
【００３８】
実施例
実施例１−材料および方法
実施例において、すべての方法は特に規定しない限り、上記のSambrook、Jら、上記のHopwood、D.Aら．(1985）およびKieser、Tら(2000）、Practical Streptomyces Geneticsに記載のものである。形質転換法もまた、上記のParadkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）に記載されている。
【００３９】
１．１ 細菌株、培地および培養条件
ストレプトマイセス・クラヴリゲルス ＮＲＲＬ ３５８５はノース・リージョン・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、ＩＬ）から入手した。エス・クラヴリゲルスはＭＹＭアガー（Stuttard、C．(1982） J．Gen．Microbiol．128:115-121）またはＩＳＰ培地＃４アガープレート（Difco、Detroit、MI）のいずれかを用いて維持した。
【００４０】
染色体ＤＮＡを単離するために培養菌を、Alexanderら(1998） J.Bact．180:4068-79に記載のように、トリプチケース・ソイ・ブロース（trypticase soy broth）とＹＥＭＥとの２：３混合物上で生育させた。クラブラン酸および他のクラバム代謝産物の産生物を分析するために培養菌を、特に規定しない限り、ソイ培地（欧州特許第0349 121号）上で生育させた。液体培養菌はすべて２６℃で２５０ｒｐｍの回転攪拌器上で生育させた。
【００４１】
大腸菌におけるＤＮＡ操作はＸＬ−１ブルー株(ストラタジーン、La Jolla、CA）を用いて行った。大腸菌の培養液は、３７℃のＬＢアガー上で維持、およびＬＢ培地の液体培養液中で生育させた(Sambrook、Jら(1989）前掲）。プラスミドを含む培養菌に適切レベルの抗生物質を付加した。
【００４２】
１．２ ＤＮＡ操作
標準的なＤＮＡ操作、例えばプラスミド単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、平滑末端断片の生成、ライゲーション、ニックトランスレーション法によるＤＮＡプローブ３２Ｐの標識化および大腸菌の形質転換などは、上記のSambrook J等(1989）に記載のように行った。ストレプトマイセスｓｐｐ．からのプラスミドおよびゲノムＤＮＡの単離は、上記のKieser、Tら(2000）に記載のように実施した。コスミドｐＷＥ１５におけるエス・クラヴリゲルスのゲノムＤＮＡ断片ライブラリーの構築は製品取り扱い説明書（ストラタジーン）に従って実施した。
【００４３】
エス・クラヴリゲルスＤＮＡ断片のサザン分析を、上記のSambrook、Jら(1989）に記載のように非常に厳密に実施した。ハイブリダイゼーション膜を、いずれも６５℃で３０分間の２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ洗浄を２度行い、３０分間の０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳの洗浄を１度行った。
【００４４】
実施例２−パラログクラスターＤＮＡ断片の調製
２．１ ｏｒｆ４パラログのクローニング及びヌクレオチド配列決定
ｏｒｆ４遺伝子（ＣＡ２１０８１１３）を用いて探索した場合の強いハイブリダイゼーションシグナルや非常に弱いハイブリダイゼーションシグナルと、ＮｃｏＩ消化したエス・クラヴリゲルス染色体ＤＮＡのサザンブロットとの間に一致が見られた。この強いシグナルはｏｒｆ４遺伝子に相当したが、非常に弱いシグナルを示した遺伝子の正体は不明であった。従って、この遺伝子をクローン化することにした。この目的を達成するために、そのサイズがおよそ４−５ｋｂのエス・クラヴリゲルスＤＮＡ由来のＮｃｏＩ断片を、ＮｃｏＩ消化したｐＵＣ１２０（Vieira、JおよびJ Messing (1987） Methods Enzymol．153、3-11）中にライゲーションし、コロニーブロットハイブリダイゼーション法を用い、ｏｒｆ４遺伝子をプローブとして使用してスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを陽性の可能性のあるクローンから単離し、４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片化を行って確認した。代表クローンとしてｐＯ４Ｈ−４を選び、更に研究した。この４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片の配列決定を行った。配列を分析することで、３種の遺伝子が同定され、そのうちの１つはｏｒｆ４と相同性があり、それをｏｒｆ４ｐａｒと命名した。残りの２つの遺伝子はｏｒｆ６およびｃｖｍ６と相同性を有していることが判明し、それらをｏｒｆ６ｐａｒおよびｃｖｍ６ｐａｒと命名した。この結果から、ＤＮＡのこの領域がクラブラン酸生合成遺伝子クラスターまたはｃｖｍクラバム生合成遺伝子クラスターのいずれかのパラログ遺伝子クラスターを含む可能性が示された。
【００４５】
２．２ ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片に隣接するＤＮＡの配列決定
ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片に隣接するＤＮＡの配列分析は、ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を含む２個のコスミドクローンを同定することで行った。このｏｒｆ４ｐａｒを含む２個のコスミドクローン、１４Ｅ１０および６Ｇ９は、ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子の内部にある０．４６ｋｂのＳａｌＩ断片を用いて探索されたエス・クラヴリゲルスｐＷＥ１５（プロメガ、マディソン、ＷＩ）コスミドバンクから単離された。これらのコスミドは一連の消化およびサザンハイブリダイゼーション実験を行って部分的にマッピングされている（In．Nucleic acid techniques in bacterial systematics．Ed．Stackebrandt、EおよびGoodfellow、M (1991） John WileyおよびSons、p205-248）。両方のコスミドをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化して、１４Ｅ１０の挿入サイズがおよそ４５ｋｂであること、および６Ｇ９がおよそ４０ｋｂであることを示した。これら２つのコスミド挿入は約２０ｋｂのオーバーラップＤＮＡを有し、ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片の上流および下流領域の配列を分析するためにＤＮＡを得た。
【００４６】
ＤＮＡの配列情報は、基本的にはＣＡ２１０８１１３に記載のように作成した。ダイナミック・イーティー・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit）(アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、ユルフェ湾（Baie d'Urfe）、ケベック、カナダ）を用いた。およそ１３．３キロベースの連続ＤＮＡ配列が生成された。これらの実験で生成されたエス・クラヴリゲルス染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１６に示す。
【００４７】
多くの読み取り枠を同定したところ、それらは以前に開示されたｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ６(ＣＡ２１０８１１３）と非常に高い相同性を示した。これらの遺伝子は互いに関連してゲノム内に位置しており、クラブラン酸クラスター内の遺伝子の位置と同じ組織では近傍にあることが分かった。遺伝子ｏｒｆ２ｐａｒ、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ４ｐａｒは互いに隣接しており、それらの対応遺伝子ｏｒｆ２、ｏｒｆ３およびｏｒｆ４と同じ方向にある。しかしながら、ｃａｓ１は、ｃａｓ２がクラブラン酸経路ではｏｒｆ４に向かい合っているがクラバムクラスター内では入れ替わっているために、ｏｒｆ４ｐａｒの下流には存在しない(Mosherら (1999） 前掲）。その他のクラブラン酸クラスターとパラログ配置との間にある差異としては、ｏｒｆ６ｐａｒはｏｒｆ４ｐａｒと先端で向かい合っているため（end-on-end）、ｏｒｆ２ｐａｒ−４ｐａｒと同じ方向にないが、ｏｒｆ６はクラブラン酸クラスター中のｏｒｆ２−４と同じ方向にある点が挙げられる。驚くべきことに、ｏｒｆ６ｐａｒの直ぐ上流にある遺伝子は、クラブラン酸クラスターではなく、クラバムクラスターにおけるパラログ遺伝子であることが明らかとなった。ｃａｓ１とクラスターを形成していることが明らかとされたｃｖｍ６遺伝子のパラログであるため、この遺伝子をｃｖｍ６ｐａｒと称する(Mosherら (1999） 前掲）。このｃｖｍ６遺伝子は、クラバム産生に関与する酵素をコードしている（WO98/33896中、ｏｒｆｄｗｎ３）。
【００４８】
ｃｖｍ６ｐａｒに隣接して位置する新規遺伝子をｃｖｍ７ｐａｒと称する。この遺伝子はｃｖｍ７と相同性を示し、クラバムクラスター中のｃｖｍ３の上流に位置している（本明細書中以下にさらに記載する）。ｃｖｍ７の上流には新規の読み取り枠が存在し、センサーキナーゼをコードすると考えられる。それは５５５個のアミノ酸のポリペプチドをコードしており、２成分の応答調節遺伝子のセンサーキナーゼドメインと良い類似性を示す。
【００４９】
２．３ 読み取り枠の機能解析
配列番号．１６に示すＤＮＡ配列のコンピューター解析により、７個の読み取り枠の存在が示された。それぞれの遺伝子の詳細を表１に示す。
【表１】
【００５０】
エス・クラヴリゲルスにより産生されるクラブラン酸および／またはクラバムの生合成において、これらのＯＲＦがどのような役割を果たしているかを評価するため、挿入不活化変異体を基本的に上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように遺伝子置換して作製した。しかしながら、これらの破壊による表現型を最終的に明らかとするには、野生型エス・クラヴリゲルスだけでなく、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ６およびｃｖｍ６それぞれの発現が既に欠損しているエス・クラヴリゲルス株についても、ｏｒｆ３ｐａｒ、ｏｒｆ４ｐａｒ、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｃｖｍ６ｐａｒを破壊することが重要と考えられる。ｏｒｆ３、４および６の変異体は、米国特許番号第6,332,106号に記載のように作製し、ｃｖｍ６変異体はWO98/33896に記載のように作製した。
【００５１】
実施例３−ｏｒｆ４およびｏｒｆ４ｐａｒの解析
３．１ ｏｒｆ４変異体の構築
ｏｒｆ４（ｐａｈ）について破壊された変異体は米国特許番号第6,332,106号に記載のように作製した。
【００５２】
３．２ ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の構築
ｐＯ４Ｈ−４（４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片をｐＵＣ１２０のＮｃｏＩ部位中にクローニングしたもの(VieiraおよびMessing 1987前掲））をＫｐｎＩで消化し（１箇所はクローニングした断片中にあり、もう一箇所はベクター中にある）、再びライゲーションしてｏｒｆ４ｐａｒを運搬するＤＮＡ挿入部分のサイズを１．７ｋｂにまで減少させて、プラスミドｐ４Ｋ−１を得た。p４ｋ−１内のｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を、その中心にあるＥｃｏＮＩ部位により消化し、ｐＵＣ１２０ａｐｒ（Trepanierら (2002） Microbiology 148: 643-656）由来のアプラマイシン（apramycin）(ａｐｒ）耐性遺伝子カセットを、それらの両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、挿入して破壊した。次いで、破壊されたｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を運搬するＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ挿入部分を、ｐＤＡ５０１のＥｃｏＲＩ部位に、挿入配列とベクターの両方の末端を平滑化した後に挿入した。ｐＤＡ５０１は、ストレプトマイセスプラスミドｐＩＪ４８６（Kieser、Tら(2000）前掲）と大腸菌プラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ストラタジーン）とをそれらのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いて融合させて調製されたシャトルベクターである。その結果得られた構築物、６ｐＤＡＢを用いてＳ．リヴィダンス（lividans）ＴＫ２４、および最終的には野生型エス・クラヴリゲルスをを形質転換してチオストレプトン（thiostrepton）（ｔｈｉｏ５μｇ／ｍｌ）およびアプラマイシン（ａｐｒ２０μｇ／ｍｌ）耐性にした。
遺伝子置換変異体は上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように作製した
【００５３】
３．３ ｏｆｒ４／ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ４（ｔｈｉｏｒ）の破壊構築物を用いてｏｒｆ４ｐａｒ(ａｐｒｒ）変異体のプロトプラストを形質転換することで二重変異体を作製する、アプローチを行った(Aidooら(1994）Gene．147:41-6）。ｏｒｆ４ｐａｒ変異体由来のプロトプラスト調製物を、Ｓ．リヴィダンスから単離されたｏｒｆ４破壊構築物を用いて形質転換した。形質転換体を５μｇ／ｍｌのチオストレプトンおよび５０μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（ｈｙｇ）上で選択した。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００５４】
３．４ ｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／４ｐａｒ破壊の効果を試験するために、それぞれの単離体由来の胞子を、２０ｍｌのシード培地（seed medium）（欧州特許番号第0349 121号）中に植菌し、振盪しながら２６℃で２日間生育させた。次いで、そのシード培地１ｍｌを最終段階（final stage）ソイ培地（欧州特許番号第0349 121号）中に植菌し、振盪しながら最大３日間２６℃で生育させた。３日間生育させた後の最終段階ブロスの一部を回収して、ＨＰＬＣにより(Mosherら(1999前掲）および／またはイミダゾール誘導化比色試験（Bird、A.Eら (1982） Analyst、107: 1241-1245、並びにFoulston、M.およびReading、C．(1982） Antimicrob．Agents Chemother.、22:753-762）の使用により、クラブラン酸産生能を分析した
【００５５】
ｏｒｆ４破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４破壊体をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が７１％減少していた。
この結果により、破壊によるｏｒｆ４の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００５６】
ｏｒｆ４ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体５ｐＤＡを、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が１２％減少していた。
この結果により、破壊によるｏｒｆ４ｐａｒの除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ４のように、この遺伝子はクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００５７】
ｏｒｆ４／ｏｒｆ４ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４遺伝子の両方のコピーを欠損している変異体Ａ４−Ａ１および３Ａ３−Ａ３をソイ培地中で生育させた場合、クラブラン酸産生を検出できなかった。
この結果により、試験した条件下では、二重破壊により変異体がクラブラン酸を生成できなくなったことから、ｏｒｆ４およびｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子の両方がクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００５８】
３．５ サザン解析
ｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／４ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００５９】
実施例４−ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの解析
４．１ ｏｒｆ６変異体の構築
ｏｒｆ６変異体は米国特許第6,332,106号に記載のように作製した。
【００６０】
４．２ ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子は、そのコード領域の中程にあるＲｓｒＩＩ部位中にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）を導入することで破壊した。これを達成するために、このｐＯ４Ｈ−４をＫｐｎＩで消化してｏｒｆ４ｐａｒを取り除き、セルフライゲーションすることでｐ５Ｋ−６を得た。ｐ５Ｋ−６をＲｓｒＩＩで消化して、ｐＦＤＮｅｏ−Ｓ(DenisおよびBrzezinski (1992） Gene 111:115-118）からＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片として切り出されたネオマイシン耐性遺伝子を、その両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、挿入した。構築物ｐＮｅｏ５Ｋ−６Ａが得られ、それはｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子と同じ方向にｎｅｏＲ遺伝子を有していた。
【００６１】
ｐＮｅｏ５Ｋ−６Ａｔｓｒ＃１４と称されるシャトルベクターは、ＢｇｌＩＩを用いて直鎖にした６．２Ｋｂ断片のｐＩＪ４８６を、ｐＮｅｏ５Ｋ−６ＡのＢａｍＨＩポリリンカー部位中に挿入することで構築した。シャトルベクターを用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、および最終的にエス・クラヴリゲルスＷＴを形質転換して、チオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性にした。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００６２】
４．３ ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ二重変異体は、ｏｒｆ６(ａｐｒｒ）を用いてｏｒｆ６ｐａｒ(ｎｅｏｒ）変異体のプロトプラストを形質転換することによって作製した（Mosherら（1999）前掲）。ｏｒｆ６ｐａｒ変異体由来のプロトプラスト調製物を、Ｓ．リヴィダンスから単離したｏｒｆ６破壊構築物を用いて形質転換した。形質転換体は５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン（ａｐｒ）で選択した。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００６３】
４．４ ｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の発酵培養
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ破壊の効果を試験するため、それぞれの単離体由来の胞子をセクション３．４で既に記載したように試験した。
【００６４】
ｏｒｆ６変異体の発酵解析
ｏｒｆ６遺伝子に欠損のある変異体６−１Ａをソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が５７％減少した。この結果により、破壊によるｏｒｆ６の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００６５】
ｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体１４−２Ｂ（２）をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が２７％減少した。この結果により、破壊によるｏｒｆ６ｐａｒの除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ６のように、この遺伝子はクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００６６】
ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の発酵解析
ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの両方に欠損のある２重離変異体(two separete mutant）をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が６５％減少した。
この結果により、この遺伝子のいずれかのコピーの欠損がクラブラン酸産生の低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの両方がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。この両方の遺伝子のコピーを不活性化することにより、クラブラン酸産生能は完全に喪失することはないが、より低下した。
【００６７】
４．５ サザン解析
ｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００６８】
実施例５−ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒの解析
５．１ ｃｖｍ６変異体の構築
ｃｖｍ６について破壊された変異体の構築は、WO98/33896 (ｃｖｍ６はｏｒｆｄｗｎ３である）に既に記載されている。
【００６９】
５．２ ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の構築
ｃｖｍ６ｐａｒを含む１．７ＫｂのＳａｌＩ断片はｐＯ４Ｈ−４から得られ、ｐＵＣ１１８のＳａｌＩ部位中にライゲーションした。この結果得られたプラスミドをＥｃｏＮＩで消化し、ｃｖｍ６ｐａｒの内部にある１４０ｂｐの断片を切り出した。この断片の代わりに、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片として切り出されるｐＦＤＮｅｏ−Ｓ由来のネオマイシン耐性遺伝子を、両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、ｃｖｍ６ｐａｒ中にライゲーションした。ｎｅｏＲマーカーをｃｖｍ６ｐａｒと同じ方向で挿入した。ネオマイシンを含むＳａｌＩ断片をＥｃｏＲＩを用いて切り出し、シャトルベクターｐＵＷＬ−ＫＳ（Weimeier、U.F (1995） Gene 165:149-150）のＥｃｏＲＩ部位中に挿入した。この構築物をｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕと称する。
【００７０】
プラスミドｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕを用いて、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４、そして最終的にはエス・クラヴリゲルスを形質転換した。この結果得られるｃｖｍ６ｐａｒ：：ｎｅｏ形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＭＹＭ培地上で選択し、次いで非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、二重クロスオーバー変異体を得た。
【００７１】
５．３ ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の構築
また、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４から単離された構築物ｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕ（ａｐｒＲカセットがｃｖｍ６遺伝子と同じ方向でｃｖｍ６中に挿入されている）を用いて、ｃｖｍ６変異体５６−３Ａを形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＭＹＭ培地上で生育させた。この変異体を上記のように非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、二重クロスオーバー変異体を単離した。
【００７２】
５．４ ｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の発酵培養
β−ラクタム生合成におけるｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒの破壊の効果を試験するためセクション３．４に既に記載したようにそれぞれの単離体由来の胞子を試験した。
【００７３】
ｃｖｍ６変異体の発酵解析
ＷＯ９８／３３８９６において、ｃｖｍ６遺伝子に欠損のある変異体５６−１Ａ、５６−３Ａ、５７−１Ｃおよび５７−２Ｂをソイ培地中で培養した場合、クラブラン酸レベルが向上し（対照株の１２５−１４１％）、かつクラバム−２−カルボキシレートや２−ヒドロキシメチルクラバムのレベルが大きく低下することが報告された。
【００７４】
これらの結果は、ｃｖｍ６遺伝子は５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることを示している。ｃｖｍ６の破壊は、クラバムの低下だけでなくクラブラン酸の増大を同時にもたらした。
【００７５】
ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の発酵解析
ｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体３Ａ１、３Ａ２、２Ａ−６、２Ｂ−１および２Ｂ−２をソイ培地中で発酵培養させ、β−ラクタム代謝産物の産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が６−１１％増大した。クラバム−２−カルボキシレートおよびアラニルクラバムの産生は消失し、２−ヒドロキシメチルクラバムレベルは５０−８５％低下した。
【００７６】
これらの結果により、ｃｖｍ６のように、ｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子は５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることが示される。ｃｖｍ６ｐａｒの破壊は、クラバムの低下だけでなく、クラブラン酸の増大を同時にもたらした。
【００７７】
ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ二重変異体の発酵解析
ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子の両方に欠損のある変異体Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｃ−１およびＣ−２をソイ培地中で生育させ、それらのβ−ラクタム代謝産物の産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。クラブラン酸の産生は１２−２７％増大し、アラニルクラバムおよびクラバム２−カルボキシレートの産生は消失し、２−ヒドロキシメチルクラバムレベルは７０−８３％低下した。
【００７８】
これらの結果により、ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒの単一変異のように、ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ二重変異体はクラブラン酸レベルを向上させたことから、いずれの遺伝子も５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることが示された。
【００７９】
５．５ サザン解析
ｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていることが確認された。
【００８０】
実施例６−ｏｒｆ３及びｏｒｆ３ｐａｒの解析
６．１ ｏｒｆ３変異体の構築
ｏｒｆ３について破壊された変異体は米国特許第6,332,106号に記載のように作製した。
【００８１】
６．２ ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ３ｐａｒの破壊用鋳型（disruption template）として、プラスミドｐ５．７ＥｃｏＲＩ ｒｅｆ（ｐＪＯＥに基づくｈｙｇ(pJOE based hyg））を用いた。このプラスミド中の挿入部分はおよそ５．７Ｋｂであり、プラスミドｐＪＯＥ８２９内で運搬される全部、ｃｖｍ６ｐａｒの一部、ｏｒｆ６ｐａｒ、ｏｒｆ４ｐａｒ、ｏｒｆ３ｐａｒの全部、およびｏｒｆ２ｐａｒの一部を含む（Kieser、Tら．(2000）; Aidooら．(1994） Gene．147:41-6）。この破壊用ベクターは、ＦｓｅＩ消化されたｐ５．７ＥｃｏＲＩ中へのチオストレプトン耐性カセットのライゲーションにより構築される（前掲のAidooら）。ＦｓｅＩ特異部位はｏｒｆ３ｐａｒの開始点から５０７ｂｐの挿入部分内にある。適当な構築物を得て、次いでそれを用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、そしてエス・クラヴリゲルス野生型を形質転換する。第一の形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびヒグロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）上で選択した。この変異体を上記のように非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、予想される二重クロスオーバー変異体を単離した。
【００８２】
６．３ ｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の構築
セクション６．２に記載のｏｒｆ３ｐａｒ破壊用カセットは、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４から単離し、それを用いてｏｒｆ３：：ａｐｒａ変異体を形質転換した。形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびヒグロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭＹＭ培地上で選択した。変異体を選択なしに２回の胞子形成を行わせ、二重クロスオーバー変異体を上記のように単離した。
【００８３】
６．４ ｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒの破壊の影響を試験するため、セクション３．４で既に記載したように、それぞれの単離体由来の胞子を試験した。
【００８４】
ｏｒｆ３変異体の発酵解析
変異体Ａｐ３−１、Ａｐ３−２およびＡｐ３−３をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は３１−７１％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ３遺伝子の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００８５】
ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵培養
変異体３Ａ−１および３Ａ−２をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は９％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ３ｐａｒ遺伝子の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、クラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００８６】
ｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵培養
ｏｒｆ３遺伝子の両方のコピーに欠損のある変異体１１−１、１１−２、２−１および２−２をソイ培地で培養した場合に、野生型エス・クラヴリゲルスと比較すると、クラブラン酸生合成は完全に消失していた。
この結果により、試験した条件下では、二重破壊により変異体がクラブラン酸を生成できなくなったことから、ｏｒｆ３およびｏｒｆ３ｐａｒの両方がクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００８７】
６．５ サザン解析
ｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴付けした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００８８】
実施例７−ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒの解析
７．１ ｏｒｆ２変異体の構築
ｏｒｆ２について破壊された変異体は、当初は、米国特許第6,332,106に記載のように作製した。最初のｏｒｆ２変異体は２回の遺伝子置換を行い、アプラマイシン耐性遺伝子を除去し、それを単一フレームシフト変異への置き換えを施した。このプラスミドを用いて、中央に位置するＮｏｔＩ部位中にアプラマイシン耐性遺伝子カセットを挿入することによって破壊されたｏｒｆ２遺伝子と共にｐＵＣ１１９／ｐＩＪ４８６シャトルベクター上で運搬されるエス・クラヴリゲルスＤＮＡの２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片から形成される最初のｏｒｆ２変異体を作製した（米国特許第6,332,106）。２回目の変異導入に用いた破壊用プラスミド構築物は、ＮｏｔＩ処理してアプラマイシン耐性遺伝子カセットを切り出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して突出端（overhanging ends）を埋め、次いでリライゲーションしてプラスミドを環状化することによって最初の破壊用プラスミドから誘導した。この結果得られたプラスミド構築物は、破壊されたＮｃｏＩ部位の位置に導入されたフレームシフトを有する以外は完全なｏｒｆ２遺伝子を運搬する。次いで、この構築物を用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、および最初のＳ．クリヴリゲルスｏｒｆ２変異体を形質転換した。第一の形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）上で選択し、次いで非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。予想される二重クロスオーバー変異体を、それらのアプラマイシン耐性喪失に基づいて同定した。
【００８９】
７．２ ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ２ｐａｒ変異体は、ＲＥＤＩＲＥＣＴ (プラントバイオサイエンスリミテッド（Plant Bioscience Limited）の登録商標、ノリッジ、U.K）として知られているＰＣＲに基づくターゲティングキット（targeting kit）を用いて作製した。プラスミドｐＩＪ７９０およびｐＩＪ７７３、並びに宿主株である大腸菌ＢＷ２５１１３をキットの一部として用いた。この特別な応用に対し、アプラマイシン耐性遺伝子を挿入することでｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子が破壊されるように設計された、一組のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＫＴＡ１４:５'−ＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’および
ＫＴＡ１５:５'−ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴ−３'
を合成した。ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子破壊用カセットは、プラスミドｐＩＪ７７３をテンプレートとして用い、上記２本のプライマーを用いたＰＣＲにより生成した。用いたＰＣＲ条件は、ジメチルスルホキシドを使用しないことを除いて、取り扱い説明書に記載のものであった。次いで、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊用カセットを、ｏｒｆ２ｐａｒを運搬するコスミド１４Ｅ１０（上記）を用いて予め形質転換された大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０中にエレクトロトランスフォーメーション（electrotransformation）により導入した。ｐＩＪ７９−プラスミドの欠落を促進するために３７℃で一晩生育させた後、コスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子が破壊されたことを確認するために解析を行った。次いで、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊されたコスミドＤＮＡを接合により野生型エス・クラヴリゲルス中に移行させた。接合は、トランス接合の回復のために５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを添加したＡＳ−１培地（Baltz、R．H．Genetic recombination by protoplast fusion in Streptomyces．Dev．Ind．Microbiol 21 (1980） 43-54）を用いたことを除いて、上記のKieser、T.ら(2000）に記載のように実施した。アプラマイシン耐性エス・クラヴリゲルストランス接合体は、上記のParadkarおよびJensen(1995）に記載のように遺伝子置換変異体を生成するために非選択条件下で１回の胞子形成を行わせた。
【００９０】
７．３ ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ２ｐａｒ変異体を作製するために用いたＰＣＲに基づくターゲティング法（セクション７．２）を、ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ二重変異体を作製するのにも用いた。この場合、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊されたコスミドＤＮＡは、野生型株中よりも上記のｏｒｆ２変異体（セクション７．１）中に接合させた。アプラマイシ耐性エス・クラヴリゲルストランス接合体を、上記のように遺伝子置換を受けた単一ゲノム変異体の胞子を得るために、非選択条件下で１回の胞子形成を行わせた。
【００９１】
７．４ ｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／２ｐａｒ破壊の効果を試験するため、それぞれの単離体由来の胞子をセクション３．４に既に記載したように試験した。
【００９２】
ｏｒｆ２変異体の発酵解析
ｏｒｆ２遺伝子の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は９５−９８％低下した（Jensenら (2000）前掲）。
この結果により、破壊によるｏｒｆ２遺伝子の除去によってクラブラン酸産生に大きな低下が引き起こされたことから、この遺伝子がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００９３】
ｏｒｆ２ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は１０−３０％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の除去によってクラブラン酸産生に低下が引き起こされたことから、ｏｒｆ２のように、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００９４】
ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ両方の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生を野生型Ｓ，クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ変異体を含む株からは、クラブラン酸産生を検出できなかった。この結果により、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の二重変異は変異体をクラブラン酸生成できなくるすことから、試験した条件下では、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒの両方の遺伝子がクラブラン酸産生に寄与していることが確認された。
【００９５】
サザン解析
ｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／２ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴付けした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていることが確認された。
【００９６】
実施例８−ｃｖｍ７およびｃｖｍ７ｐａｒの解析
配列解析により、このパラログクラスターにおいて２種の遺伝子がさらに同定されたが、クラブラン酸またはｃｖｍ遺伝子クラスターのいずれのパラログであるかは明らかではなかった。これらの遺伝子のいずれかは、まだ同定されていないｃｖｍ遺伝子のパラログである可能性があり、それを決定することは重要であった。従って、ｃｖｍクラスター（WO98/33896）の配列をｃｖｍ３（WO98/33896においてはｏｒｆｕｐ３）の下流を伸張させた。
【００９７】
８．１ ｃｖｍクラスター配列の伸張
コスミド１０Ｄ７（WO98/33896に記載されている）を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで消化した。この消化により、ｃａｓＩおよびｃｖｍ１を含む６．８キロベースのＤＮＡ断片を単離し、ｐＵＣ１１９に基づくプラスミド中にクローニングした。その結果得られたプラスミドｐＣＥＣ０１９をテンプレートとして用いて、ＷＯ９８／３３８９６に報告されている部分的なｃｖｍ３遺伝子を完成させることのできる配列情報を得た。さらに、この配列情報から、その断片中には不完全ではあるが別の読み取り枠、ｃｖｍ７の存在が示唆された。このｃｖｍ７遺伝子の配列を完成させるために、コスミド１０Ｄ７から隣接するＳａｃＩ断片、１．９ｋｂ断片をサブクローニングした。配列情報は、ｃｖｍ７遺伝子の開始コドンを同定することができる部分までの、残りのｃｖｍ７遺伝子を含む最後のクローンから得られた。まとめることで、さらに約３．９ｋｂの新たなＤＮＡ配列を作成することができ、それを配列番号．１７に記載した。
【００９８】
８．２ 配列解析
ｃｖｍ７のサイズおよびｃｖｍクラスターの残りの部分に関する方向を、図２にて図式的に示す。配列のホモロジー検索により、この遺伝子が転写調節遺伝子と相同性を共有していることが示された。さらに、ｃｖｍ７は、既知のクラブラン酸またはクラバム生合成遺伝子のパラログとは明らかに異なっており、パラログクラスターで同定された２個の遺伝子の１個と３３％同一であった。このように、ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒがパラログであることが示されたことから、この配列データにより、ｃｖｍ７およびｃｖｍ７ｐａｒが５Ｓクラバム生合成に関与する遺伝子のパラログであると結論付けることができる。
【００９９】
（配列の簡単な説明）
配列番号：１ ｃｖｍ６ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：２ ｃｖｍ７ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：３ ｃｖｍ６ｐａｒａポリペプチド
配列番号：４ ｃｖｍ７ｐａｒａポリペプチド
配列番号：５ ｃｖｍ６読み取り枠
配列番号：６ ｃｖｍ７読み取り枠
配列番号：７ ｃｖｍ１読み取り枠
配列番号：８ ｃｖｍ２読み取り枠
配列番号：９ ｃｖｍ３読み取り枠
配列番号：１０ ｃｖｍ４読み取り枠
配列番号：１１ ｃｖｍ５読み取り枠
配列番号：１２ ｏｒｆ２ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１３ ｏｒｆ３ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１４ ｏｒｆ４ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１５ ｏｒｆ６ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１６ パラログクラスター
配列番号：１７ 伸張されたｃｖｍクラスター(下線した配列はWO98/33896で開示された配列を超えた新規の配列を意味する）
配列番号：１８ ｏｒｆ２ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：１９ ｏｒｆ３ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：２０ ｏｒｆ４ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：２１ ｃｖｍ６ポリペプチド
配列番号：２２ ｃｖｍ３ポリペプチド
配列番号：２３ ｏｒｆ６ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２４ ｏｒｆ４ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２５ ｏｒｆ３ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２６ ｏｒｆ２ｐａｒａポリペプチド
【０１００】
配列
配列番号：１ ｃｖｍ６ｐａｒａ
【化１】
【０１０１】
配列番号：２ ｃｖｍ７ｐａｒａ
【化２】
【０１０２】
配列番号：３ ｃｖｍ６ｐａｒａポリペプチド
【化３】
【０１０３】
配列番号：４ ｃｖｍ７ｐａｒａポリペプチド
【化４−１】
【化４−２】
【０１０４】
配列番号：５ ｃｖｍ６
【化５】
【０１０５】
配列番号：６ ｃｖｍ７
【化６−１】
【化６−２】
【０１０６】
配列番号：７ ｃｖｍ１
【化７】
【０１０７】
配列番号：８ ｃｖｍ２
【化８】
【０１０８】
配列番号：９ ｃｖｍ３
【化９】
【０１０９】
配列番号：１０ ｃｖｍ４
【化１０】
【０１１０】
配列番号：１１ ｃｖｍ５
【化１１−１】
【化１１−２】
【０１１１】
配列番号：１２ ｏｒｆ２ｐａｒａ
【化１２】
【０１１２】
配列番号：１３ ｏｒｆ３ｐａｒａ
【化１３】
【０１１３】
配列番号：１４ ｏｒｆ４ｐａｒａ
【化１４】
【０１１４】
配列番号：１５ ｏｒｆ６ｐａｒａ
【化１５−１】
【化１５−２】
【０１１５】
配列番号：１６ ｐａｒａクラスター
【化１６−１】
【化１６−２】
【化１６−３】
【０１１６】
配列番号：１７ ｃｖｍクラスター
【化１７−１】
【化１７−２】
【化１７−３】
【化１７−４】
【化１７−５】
【化１７−６】
【０１１７】
配列番号：１８ ｏｒｆ２ｐａｒ逆相補鎖
【化１８】
【０１１８】
配列番号：１９ ｏｒｆ３ｐａｒ逆相補鎖
【化１９】
【０１１９】
配列番号：２０ ｏｒｆ４ｐａｒ逆相補鎖
【化２０−１】
【化２０−２】
【０１２０】
配列番号：２１ ｃｖｍ６ポリペプチド
【化２１】
【０１２１】
配列番号：２２ ｃｖｍ３ポリペプチド
【化２２】
【０１２２】
配列番号：２３ ｏｒｆ６ｐａｒポリペプチド
【化２３】
【０１２３】
配列番号：２４ ｏｒｆ４ｐａｒポリペプチド
【化２４】
【０１２４】
配列番号：２５ ｏｒｆ３ｐａｒポリペプチド
【化２５】
【０１２５】
配列番号：２６ ｏｒｆ２ｐａｒポリペプチド
【化２６】
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】パラログクラスターの図。転写の方向をそれぞれの遺伝子について示す（矢印の方向）。
【図２】ｃｖｍ７の公開されたｃｖｍクラスター（WO98/33896）に対する方向性。
【図３】パラログクラスターの注釈付き配列。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラバム（clavam）、例えばクラブラン酸の製造を改良する新規方法に関する。また、本発明は増量のクラブラン酸の産生能を有する新規ＤＮＡ配列および新規微生物も提供する。
【０００２】
微生物、特にストレプトマイセス種は、クラブラン酸やその他のクラバム、セファロスポリン、ポリケチド、セファマイシン、ツニカマイシン、ホロマイシン（holomycin）およびペニシリンを含む数多くの抗生物質を産生する。この微生物により産生される抗生物質の絶対量および相対量を操作できるようにすることに大きな関心があるため、その生合成経路の代謝機構や遺伝的機構を調査する研究が数多くされてきた（Demain、A.L．(1990） 「50 years of Penicillin applications、history and trends」中の「Biosynthesis and regulation of β-lactam antibiotics.」）。
【０００３】
ストレプトマイセス・クラヴリゲルス（Streptomyces clavuligerus；以下、エス・クラヴリゲルスという）は、２つの主たる群の抗生物質、１つはセファマイシン、セファロスポリンおよびペニシリン(Demain、A.L．(1990）前掲）であり、もう１つはクラバムを含む抗生物質を産生する。クラバムは、独断的に、その環の立体化学に応じて５Ｓおよび５Ｒクラバムの２つのグループに分けることができる。抗生物質オーグメンチン（Augmentin）(グラクソスミスクラインの登録商標）の成分であり商業的に重要なクラバムクラブラン酸は、５Ｒクラバムである。５Ｓクラバムの例としては、クラバム-２-カルボキシレート (Ｃ−２−Ｃ）、２−ヒドロキシメチルクラバム(２ＨＭＣ）およびアラニルクラバム（Brownら．(1979） J．Chem．Soc．Chem．pp282-283）がある。
【０００４】
クラブラン酸産生に関する生合成酵素および制御タンパク質をコードする遺伝子は、セファマイシンＣ産生に関与する遺伝子に隣接するクラスター中に位置しており、エス・クラヴリゲルスのゲノム内で抗生物質関連遺伝子のスーパークラスターを形成している(Alexanderら．(1998） J.Bacteriol．180:4068-79）。例えば、クラブラン酸の先駆体である、クラバミン酸の産生に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ｏｒｆ２（ｃｅａＳ）(Khaleeliら．(1999） J．Am．Chem．Soc．121:9223-9224）、ｏｒｆ３(ｂｌｓ）(BachmannおよびTownsend (1998） Chem．Commun.:2325-2326）、ｏｒｆ４（ｐａｈ）(Wuら．(1995） J．Bacteriol．177:3714-3720）、ｏｒｆ５（ｃａｓ２）(Marshら．(1992） Biochemistry．31:12648-57）および場合によってはｏｒｆ６（Kershawら．(2002） Eur．J．Biochem．269,2052-2059）が挙げられ、それらは全てクラブラン酸クラスター内に位置している。ｏｒｆ２−６における破壊は、その変異体培養菌を澱粉アスパラギン培地（Starch asparagines medium）上で生育させた場合に、クラブラン酸産生を完全に喪失させる。(Aidoo、K.Aら．(1993） p219-236 In．V.P．Gullo、J.C．Hunter-Cevera、R．CooperおよびR．K．Johnson (著）、Developments in Industrial Microbiology series、vol.33 Society for Industrial Microbiology、Fredericksburg、Va.）。しかし、この喪失は、用いる培養基の条件に依存しており、ソイ培地（Soy medium）上で生育させた場合には(Saloweら．(1990） Biochemistry 29: 6499-6508）、クラブラン酸産生が部分的に回復する(Jensenら．(2002） Antimicrob．Agents and Chemother．44: 720-726）。この現象は、エス・クラヴリゲルスのゲノム中に存在する他の遺伝子が特定の条件下で、これらの遺伝子の活性の喪失を何らかの方法で補い得ることを示している。あるいは、ソイ培地に１つまたはそれ以上のｏｒｆ２−６によって産生される代謝産物が少量含まれており、それによって、これらの遺伝子が破壊された株でも少量のクラブラン酸を生産できるようになっている可能性がある。
【０００５】
上記Ｍａｒｓｈら（1992）は、エス・クラヴリゲルスが２コピーのｃａｓ遺伝子（ｃａｓ１およびｃａｓ２）を有していると報告した。ｃａｓ１はクラブラン酸遺伝子クラスターと関連していないが、ｃａｓ２に対して高い相同性を示す。ｃａｓ２の破壊は、その培養菌をソイ培地上で生育させた場合にクラブラン酸産生を３５％低下させ、培養菌を澱粉アスパラギン（ＳＡ）培地上で培養した場合には完全に産生を停止させる（ParadkarおよびJensen 1995 J.Bact 177: 1307-1314）。ｃａｓ１遺伝子の破壊は、ＳＡ培地上では野生型に近いレベルのクラブラン酸を産生するが、ソイ培地上で培養した場合には野生型よりも３１−７３％低いクラブラン酸量を産生する突然変異体を与える（Mosherら(1999） Antimicrob．Agents and Chemother．43: 1215-1224）。また、ｃａｓ１およびｃａｓ２の両方の遺伝子とも破壊された変異体株では、試験したどの発酵条件下でもクラブラン酸を産生しないことが報告されている。興味深いことに、ｃａｓ１周辺の遺伝子を配列決定したところ、クラブラン酸産生に関与する新たな遺伝子は見つからなかったが、その代わり５Ｓクラバム生合成に関与する新規遺伝子が６種類（ｃｖｍ１〜６と称する）同定された（Mosherら(1999）前掲）。さらに、これら５Ｓクラバム−特異的遺伝子の研究によって、遺伝子工学的方法を用いた遺伝子の破壊が、その変異体株の生産するクラブラン酸レベルを向上させ、さらに５Ｓクラバム産生レベルを劇的に低下させることが示された(WO98/33896）。ある５Ｓクラバムは毒性であることが知られているため、英国および米国の薬局方ではそのレベルを厳しく規制していることから、５Ｓクラバムにおける、特に５Ｓクラバム クラバム−２−カルボキシレートにおける産生の低下は、クラブラン酸の商業的生産に特に重要である。
【０００６】
クラブラン酸生合成の理解が進んだにもかかわらず、医薬産業ではより望ましい目標に向けて、今尚、経費上の理由および安全上の理由の両面からクラブラン酸の生産方法の改善が継続されている。
【０００７】
以下の定義は、本明細書中で頻出する特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【０００８】
本明細書中で用いられる「遺伝子」には、遺伝子の機能または発現に必要ないずれかの調節領域も含まれる。
【０００９】
本明細書中で用いられる「ｃｖｍ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６またはｃｖｍ７のいずれかを意味する。
【００１０】
本明細書中で用いられる「ｃｖｍｐａｒａ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｃｖｍ６ｐａｒａまたはｃｖｍ７ｐａｒａのいずれかを意味する。
【００１１】
本明細書中で用いられる「ｏｒｆ」遺伝子は、上記で定義した遺伝子ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８のいずれかを意味する。
【００１２】
本明細書中で用いられる「ｏｒｆｐａｒａ」は、上記で定義した遺伝子ｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａまたはｏｒｆ６ｐａｒａのいずれかを意味する。
【００１３】
本明細書中で用いられる「破壊（された）」は、（５Ｓクラバム産生に関する）遺伝子の活性を、例えば抗生物質耐性遺伝子、好ましくはアプロマイシン（Paradkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）前掲）を用いた挿入不活性化またはその他の突然変異技術（例えば、上記 Sambrookら (1989）に開示された技術）によって、低下もしくは消失させることを意味する。その他の突然変異技術には、別のＤＮＡ（抗生物質体制遺伝子でないもの）の挿入、遺伝子配列中の１個またはそれ以上の塩基を交換するか、もしくは遺伝子の配列中への１個またはそれ以上の塩基を挿入する部位特異的変異導入のいずれかが含まれる。
【００１４】
本明細書中で用いられる「欠失（された）」は、欠失が行われる前には、その遺伝子またはその断片を含んでいたより大きなポリヌクレオチドから、前記遺伝子または前記断片を欠失（除去）することを意味する。欠失を生じさせるポリヌクレオチドを、遺伝子置換技術（ParadkarおよびJensen (1995）前掲）によって微生物のゲノムに導入すると、遺伝子またはそれにコードされたタンパク質の活性が消失または低下し、その微生物によって産生される５Ｓクラバムのレベルが減少する。この欠失は、大規模（例えば、調節管理領域を含むか含まない完全な読み取り枠）であっても小規模（例えば、フレームシフト変異となる単一塩基）であってもよい。
【００１５】
本明細書中で用いられる「減少（された）」は、本発明の微生物によって産生される５Sクラバムのレベルが、関連する読み取り枠が破壊も欠失もされていない、相当するエス・クラヴリゲルス株で産生されるレベルよりも低いことを意味する。従って、この相当するエス・クラヴリゲルスは、読み取り枠に破壊や欠失を順次導入して本発明の微生物を作る「親」株である。
【００１６】
本明細書中で用いられる「少なくとも維持（された）」は、本発明の微生物において産生されるクラブラン酸レベルが、関連する読み取り枠が破壊も欠失もされていない相当するエス・クラヴリゲルス株において産生されるレベルと同等またはそれ以上であることを意味する。従って、この相当するエス・クラヴリゲルスは、読み取り枠に破壊や欠失を順次導入して本発明の微生物を作る「親」株である。
【００１７】
本発明は、新たに同定されたエス・クラヴリゲルス遺伝子を用いたクラブラン酸を生成する新規方法に関する。ｏｒｆ４から誘導されたプローブを用いることで、エス・クラヴリゲルスゲノムの断片を単離し、そして、それが破壊された場合にエス・クラヴリゲルスにおける５Ｓおよび５Ｒクラバム生合成に影響を及ぼすことが示された遺伝子が多数含まれることを明らかにした。断片の配列を分析することで、ｏｒｆ４に対して高い相同性を示す遺伝子（本明細書中以下、ｏｒｆ４ｐａｒと称する）の存在が示された。しかしながら、驚くべきことに、このｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子に隣接した領域の配列をさらに分析することで、クラブラン酸（ｃａｓ２クラスター）および５Ｓクラバム（ｃａｓ１クラスター）のいずれにおいても、既に同定された遺伝子のパラロガスを含む新しい遺伝子のクラスターが明らかとなった。
【００１８】
従って、本発明は、５Ｓクラバム生合成に重要な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠は上記エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生を減少させ、およびクラブラン酸産生が少なくとも維持されることとなるように破壊または欠失されており、その読み取り枠が以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ(配列番号:１）;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ(配列番号:２）;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６(配列番号:５）;または
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７(配列番号:６）
から選択される、エス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、５Ｓクラバム生合成に重要な読み取り枠の１つまたはそれ以上の相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が上記エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生を減少させ、およびクラブラン酸産生が少なくとも維持されるように破壊または欠失されており、その読み取り枠が以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１(配列番号:７）、ｃｖｍ２(配列番号:８）、ｃｖｍ３(配列番号:９）、ｃｖｍ４(配列番号:１０）、ｃｖｍ５(配列番号:１１）、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ;または
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から選択される、エス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００２０】
遺伝子ｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５およびｃｖｍ６は、上記のMosherら(1999）およびWO98/33896に開示されている(ｃｖｍ１はｏｒｆｕｐ１であり、ｃｖｍ２はｏｒｆｕｐ２、ｃｖｍ３はｏｒｆｕｐ３、ｃｖｍ４はｏｒｄｗｎ１、ｃｖｍ５はｏｒｆｄｗｎ２、並びにｃｖｍ６はｏｒｆｄｗｎ３である）。さらなる５Ｓクラバム（ｃａｓ１）クラスターの５Ｓクラバム特異的遺伝子であるとして見出されたｃｖｍ７遺伝子は、本発明を成した研究中に同定され、本明細書中以下に開示する。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物の作製に用いられるｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ７ｐａｒａ読み取り枠を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドには以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６;
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７;
ｅ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７またはｃｖｍ７ｐａｒａ;あるいは
ｆ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７またはｃｖｍ６ｐａｒａ、
から成る群から選択される読み取り枠が含まれる。
【００２２】
その他の態様において、本発明は、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物の作製に用いることができる、本明細書中で開示するｃｖｍポリヌクレオチドをクローニングおよび操作するためのベクターを提供する。また、本発明のエス・クラヴリゲルス微生物を作製するための、これらベクターの使用方法も提供する。
【００２３】
ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ７ｐａｒａによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により提供される（それぞれ配列番号：３および配列番号：４）。
【００２４】
さらに、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドであって、その読み取り枠が以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ（配列番号:１２）、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ（配列番号:１３）、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ（配列番号:１４）、および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ（配列番号:１５）、
から成る群から選択されるポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドであって、その読み取り枠が、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０（カナダ特許出願番号2108113およびJensen,S.Eら(2000） Antimicrob．Agents Chemother 44:720-6）、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２（Li、R.Nら(2000） J．Bacteriol 182:4087-95）、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８（国際特許出願番号 PCT/GB02/04989）から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子と組み合わされる、以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
を１つまたはそれ以上を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを、それを用いることで高いレベルのクラブラン酸を産生することができるストレプトマイセス・クラヴリゲルス株を作製するための上記ベクターの使用方法と共に、提供する。
【００２７】
そのように作製されたストレプトマイセス・クラヴリゲルス株、および発酵によりクラブラン酸を産生させるためにそれらを使用する方法もまた提供される。
【００２８】
このように、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリヌクレオチドを含むベクターを有するストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
の群から選択される微生物をさらに提供する。
【００２９】
さらなる態様について、本発明は、クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含むポリペプチドを含むベクターを有するストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物であって、その読み取り枠が、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０（カナダ特許出願番号2108113 およびJensen、S.Eら(2000） Antimicrob．Agents Chemother 44:720-6）、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２（Li、R.Nら(2000） J．Bacteriol 182:4087-95）、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８（国際特許出願番号 PCT/GB02/04989）から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子と組み合わされる、以下：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
から成る群から選択される、ストレプトマイセス・クラヴリゲルス微生物を提供する。
【００３０】
また本発明は、前記開示の他に破壊もしくは欠失された５Ｓ遺伝子と組み合わされていても良い１つまたはそれ以上の破壊もしくは欠失されたｃｖｍ６ｐａｒａまたはｃｖｍ７ｐａｒａ遺伝子と、前記開示の他にクラブラン酸生合成遺伝子（ｏｒｆ２〜ｏｒｆ１８遺伝子から選択される）と組み合わされていても良いｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａまたはｏｒｆ６ｐａｒａ遺伝子を含むベクターとの組み合わせを含む、エス・クラヴリゲルス微生物にも関する。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示された配列、並びに上記のMosherら(1999）、WO98/33896、カナダ特許出願番号2108113、Jensen、S.Eら (2000）前掲、Li、R.Nら(2000）前掲、および前記の国際特許出願番号PCT/GB02/04989に記載の配列を用いた、一般的なクローニング技術、例えばＰＣＲ法またはライブラリースクリーニング法によって単離することができる。このようなクローニング方法の例としては、例えば、Sambrook、J.ら (1989） モレキュラー・クローニング、ライブラリー・マニュアル(第２版）コールド・スプリンガー・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリンガー・ハーバー、ニューヨーク（Molecular cloning、a laboratory manual (2nd Ed） Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York）に記載されている。
【００３２】
それぞれの読み取り枠を含むポリヌクレオチドは、当分野で周知の技術を用いて、単離され、そして上記のように種々組み合わせてベクター中にライゲーションして一体とすることができる。ベクターは、達成される機能、例えばクローニング、発現、遺伝子不活性化または遺伝子置換のためのエス・クラヴリゲルスなどへの運搬によって選択されよう。いずれの場合においても、当業者であればベクターの変種を利用でき、それらは当分野で周知である。例えば、そのようなベクターとしては、上記Sambrook、Jら(1989）の一般的なクローニングベクター、上記Hopwood、D.Aら(1985）のストレプトマイセス用ベクター、上記ParadkarおよびJensen (1995）、上記Mosherら(1999）および上記WO98/33896の遺伝子破壊用および遺伝子置換用ベクター、並びに上記CA2108113のストレプトマイセス・クラヴリゲルスの遺伝子発現に好適なベクターが知られている。しかしながら、ベクターの選択は、本明細書中に開示したものだけに限定されるものではない。
【００３３】
さらに、ｏｒｆ２ｐａｒａ、ｏｒｆ３ｐａｒａ、ｏｒｆ４ｐａｒａ、ｏｒｆ５ｐａｒａおよびｏｒｆ６ｐａｒａ遺伝子を含む遺伝子の組み合わせにおいて、当業者であれば、本来のプロモーターもしくはストレプトマイセス・クラヴリゲルス背景でも機能する異種プロモーターのいずれかの転写プロモーター、あるいは実際にそれぞれの読み取り枠の発現を随意に活性化できる形式のその他の調節配列と関連させて、それぞれの読み取り枠を好適に確実に配置させるための好適なＤＮＡ構築物を設計することができるであろう。
【００３４】
次いで、ポリヌクレオチドの操作、特にストレプトマイセス・クラヴリゲルス背景への導入については、一般的な方法、例えば上記のHopwood、D.Aら(1985）に開示されているような方法に従って、実施することができる。遺伝子配列の破壊、次いで遺伝子置換は、上記のParadkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）の方法に従って実施することができる。遺伝子の欠失は、慣用技術、例えばWO98/33896に開示されている技術を用いて実施することができる。
【００３５】
本発明の微生物は、限定するものではないが、ストレプトマイセス・クラヴリゲルスＡＴＣＣ２７０６４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、マナッサス、バージニア、USA）、あるいはＮＲＲＬ ３５８５（ノース・リージョン・リサーチ・ラボラトリー（Northern Regional Research Laboratory）、ピオリア、イリノイ、USA）として入手できるものを含む、ストレプトマイセス・クラヴリゲルス株から作製することができる。例えば、遺伝子工学技術によって作製されるもの、または株改良法(strain improvement method）によって作製されるものを含む、ストレプトマイセス・クラヴリゲルスの変異株も用いることができる。そのような株の例としては、ＷＯ９８／３３８９６に開示されているようなストレプトマイセス・クラヴリゲルス株５６−１Ａ、５６−３Ａ、５７−２Ｂ、５７−１Ｃ、６０−１Ａ、６０−２Ａ、６０−３Ａ、６１−１Ａ、６１−２Ａ、６１−３Ａまたは６１−４Ａが挙げられる。
【００３６】
このように、別の態様において、本発明は上記のポリヌクレオチドを単離し、前記ポリヌクレオチドを操作し、その操作したポリヌクレオチドを前記の好適な微生物に導入し、クラブラン酸を産生する条件下でその好適な微生物を発酵培養することで産生されるクラブラン酸を単離および精製することを含む、好適な微生物におけるクラブラン酸産生を改良する方法に関する。前記ポリヌクレオチドの操作は、ｃｖｍ遺伝子と一緒に用いられることあるｃｖｍｐａｒａ遺伝子の場合に遺伝子配列を破壊又は欠失させる方法、あるいはｏｒｆ遺伝子と一緒に用いられることあるｏｒｆｐａｒａ遺伝子の場合に発現に好適なベクター中に挿入する方法があり得る。
【００３７】
好適な微生物はストレプトマイセス・クラヴリゲルスであることが好ましい。
その発酵、単離および精製法は当分野で周知であり、例えば発酵法は英国特許出願１，５０８，９７７に開示されている。抗菌製剤の調製にクラブラン酸を用いる方法は同様に当分野において周知である。
【００３８】
実施例
実施例１−材料および方法
実施例において、すべての方法は特に規定しない限り、上記のSambrook、Jら、上記のHopwood、D.Aら．(1985）およびKieser、Tら(2000）、Practical Streptomyces Geneticsに記載のものである。形質転換法もまた、上記のParadkar、A.SおよびJensen、S.E (1995）に記載されている。
【００３９】
１．１ 細菌株、培地および培養条件
ストレプトマイセス・クラヴリゲルス ＮＲＲＬ ３５８５はノース・リージョン・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、ＩＬ）から入手した。エス・クラヴリゲルスはＭＹＭアガー（Stuttard、C．(1982） J．Gen．Microbiol．128:115-121）またはＩＳＰ培地＃４アガープレート（Difco、Detroit、MI）のいずれかを用いて維持した。
【００４０】
染色体ＤＮＡを単離するために培養菌を、Alexanderら(1998） J.Bact．180:4068-79に記載のように、トリプチケース・ソイ・ブロース（trypticase soy broth）とＹＥＭＥとの２：３混合物上で生育させた。クラブラン酸および他のクラバム代謝産物の産生物を分析するために培養菌を、特に規定しない限り、ソイ培地（欧州特許第0349 121号）上で生育させた。液体培養菌はすべて２６℃で２５０ｒｐｍの回転攪拌器上で生育させた。
【００４１】
大腸菌におけるＤＮＡ操作はＸＬ−１ブルー株(ストラタジーン、La Jolla、CA）を用いて行った。大腸菌の培養液は、３７℃のＬＢアガー上で維持、およびＬＢ培地の液体培養液中で生育させた(Sambrook、Jら(1989）前掲）。プラスミドを含む培養菌に適切レベルの抗生物質を付加した。
【００４２】
１．２ ＤＮＡ操作
標準的なＤＮＡ操作、例えばプラスミド単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、平滑末端断片の生成、ライゲーション、ニックトランスレーション法によるＤＮＡプローブ３２Ｐの標識化および大腸菌の形質転換などは、上記のSambrook J等(1989）に記載のように行った。ストレプトマイセスｓｐｐ．からのプラスミドおよびゲノムＤＮＡの単離は、上記のKieser、Tら(2000）に記載のように実施した。コスミドｐＷＥ１５におけるエス・クラヴリゲルスのゲノムＤＮＡ断片ライブラリーの構築は製品取り扱い説明書（ストラタジーン）に従って実施した。
【００４３】
エス・クラヴリゲルスＤＮＡ断片のサザン分析を、上記のSambrook、Jら(1989）に記載のように非常に厳密に実施した。ハイブリダイゼーション膜を、いずれも６５℃で３０分間の２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ洗浄を２度行い、３０分間の０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳの洗浄を１度行った。
【００４４】
実施例２−パラログクラスターＤＮＡ断片の調製
２．１ ｏｒｆ４パラログのクローニング及びヌクレオチド配列決定
ｏｒｆ４遺伝子（ＣＡ２１０８１１３）を用いて探索した場合の強いハイブリダイゼーションシグナルや非常に弱いハイブリダイゼーションシグナルと、ＮｃｏＩ消化したエス・クラヴリゲルス染色体ＤＮＡのサザンブロットとの間に一致が見られた。この強いシグナルはｏｒｆ４遺伝子に相当したが、非常に弱いシグナルを示した遺伝子の正体は不明であった。従って、この遺伝子をクローン化することにした。この目的を達成するために、そのサイズがおよそ４−５ｋｂのエス・クラヴリゲルスＤＮＡ由来のＮｃｏＩ断片を、ＮｃｏＩ消化したｐＵＣ１２０（Vieira、JおよびJ Messing (1987） Methods Enzymol．153、3-11）中にライゲーションし、コロニーブロットハイブリダイゼーション法を用い、ｏｒｆ４遺伝子をプローブとして使用してスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを陽性の可能性のあるクローンから単離し、４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片化を行って確認した。代表クローンとしてｐＯ４Ｈ−４を選び、更に研究した。この４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片の配列決定を行った。配列を分析することで、３種の遺伝子が同定され、そのうちの１つはｏｒｆ４と相同性があり、それをｏｒｆ４ｐａｒと命名した。残りの２つの遺伝子はｏｒｆ６およびｃｖｍ６と相同性を有していることが判明し、それらをｏｒｆ６ｐａｒおよびｃｖｍ６ｐａｒと命名した。この結果から、ＤＮＡのこの領域がクラブラン酸生合成遺伝子クラスターまたはｃｖｍクラバム生合成遺伝子クラスターのいずれかのパラログ遺伝子クラスターを含む可能性が示された。
【００４５】
２．２ ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片に隣接するＤＮＡの配列決定
ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片に隣接するＤＮＡの配列分析は、ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を含む２個のコスミドクローンを同定することで行った。このｏｒｆ４ｐａｒを含む２個のコスミドクローン、１４Ｅ１０および６Ｇ９は、ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子の内部にある０．４６ｋｂのＳａｌＩ断片を用いて探索されたエス・クラヴリゲルスｐＷＥ１５（プロメガ、マディソン、ＷＩ）コスミドバンクから単離された。これらのコスミドは一連の消化およびサザンハイブリダイゼーション実験を行って部分的にマッピングされている（In．Nucleic acid techniques in bacterial systematics．Ed．Stackebrandt、EおよびGoodfellow、M (1991） John WileyおよびSons、p205-248）。両方のコスミドをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化して、１４Ｅ１０の挿入サイズがおよそ４５ｋｂであること、および６Ｇ９がおよそ４０ｋｂであることを示した。これら２つのコスミド挿入は約２０ｋｂのオーバーラップＤＮＡを有し、ｏｒｆ４ｐａｒを含む４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片の上流および下流領域の配列を分析するためにＤＮＡを得た。
【００４６】
ＤＮＡの配列情報は、基本的にはＣＡ２１０８１１３に記載のように作成した。ダイナミック・イーティー・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit）(アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、ユルフェ湾（Baie d'Urfe）、ケベック、カナダ）を用いた。およそ１３．３キロベースの連続ＤＮＡ配列が生成された。これらの実験で生成されたエス・クラヴリゲルス染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１６に示す。
【００４７】
多くの読み取り枠を同定したところ、それらは以前に開示されたｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ６(ＣＡ２１０８１１３）と非常に高い相同性を示した。これらの遺伝子は互いに関連してゲノム内に位置しており、クラブラン酸クラスター内の遺伝子の位置と同じ組織では近傍にあることが分かった。遺伝子ｏｒｆ２ｐａｒ、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ４ｐａｒは互いに隣接しており、それらの対応遺伝子ｏｒｆ２、ｏｒｆ３およびｏｒｆ４と同じ方向にある。しかしながら、ｃａｓ１は、ｃａｓ２がクラブラン酸経路ではｏｒｆ４に向かい合っているがクラバムクラスター内では入れ替わっているために、ｏｒｆ４ｐａｒの下流には存在しない(Mosherら (1999） 前掲）。その他のクラブラン酸クラスターとパラログ配置との間にある差異としては、ｏｒｆ６ｐａｒはｏｒｆ４ｐａｒと先端で向かい合っているため（end-on-end）、ｏｒｆ２ｐａｒ−４ｐａｒと同じ方向にないが、ｏｒｆ６はクラブラン酸クラスター中のｏｒｆ２−４と同じ方向にある点が挙げられる。驚くべきことに、ｏｒｆ６ｐａｒの直ぐ上流にある遺伝子は、クラブラン酸クラスターではなく、クラバムクラスターにおけるパラログ遺伝子であることが明らかとなった。ｃａｓ１とクラスターを形成していることが明らかとされたｃｖｍ６遺伝子のパラログであるため、この遺伝子をｃｖｍ６ｐａｒと称する(Mosherら (1999） 前掲）。このｃｖｍ６遺伝子は、クラバム産生に関与する酵素をコードしている（WO98/33896中、ｏｒｆｄｗｎ３）。
【００４８】
ｃｖｍ６ｐａｒに隣接して位置する新規遺伝子をｃｖｍ７ｐａｒと称する。この遺伝子はｃｖｍ７と相同性を示し、クラバムクラスター中のｃｖｍ３の上流に位置している（本明細書中以下にさらに記載する）。ｃｖｍ７の上流には新規の読み取り枠が存在し、センサーキナーゼをコードすると考えられる。それは５５５個のアミノ酸のポリペプチドをコードしており、２成分の応答調節遺伝子のセンサーキナーゼドメインと良い類似性を示す。
【００４９】
２．３ 読み取り枠の機能解析
配列番号．１６に示すＤＮＡ配列のコンピューター解析により、７個の読み取り枠の存在が示された。それぞれの遺伝子の詳細を表１に示す。
【表１】
【００５０】
エス・クラヴリゲルスにより産生されるクラブラン酸および／またはクラバムの生合成において、これらのＯＲＦがどのような役割を果たしているかを評価するため、挿入不活化変異体を基本的に上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように遺伝子置換して作製した。しかしながら、これらの破壊による表現型を最終的に明らかとするには、野生型エス・クラヴリゲルスだけでなく、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ６およびｃｖｍ６それぞれの発現が既に欠損しているエス・クラヴリゲルス株についても、ｏｒｆ３ｐａｒ、ｏｒｆ４ｐａｒ、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｃｖｍ６ｐａｒを破壊することが重要と考えられる。ｏｒｆ３、４および６の変異体は、米国特許番号第6,332,106号に記載のように作製し、ｃｖｍ６変異体はWO98/33896に記載のように作製した。
【００５１】
実施例３−ｏｒｆ４およびｏｒｆ４ｐａｒの解析
３．１ ｏｒｆ４変異体の構築
ｏｒｆ４（ｐａｈ）について破壊された変異体は米国特許番号第6,332,106号に記載のように作製した。
【００５２】
３．２ ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の構築
ｐＯ４Ｈ−４（４．３ｋｂのＮｃｏＩ断片をｐＵＣ１２０のＮｃｏＩ部位中にクローニングしたもの(VieiraおよびMessing 1987前掲））をＫｐｎＩで消化し（１箇所はクローニングした断片中にあり、もう一箇所はベクター中にある）、再びライゲーションしてｏｒｆ４ｐａｒを運搬するＤＮＡ挿入部分のサイズを１．７ｋｂにまで減少させて、プラスミドｐ４Ｋ−１を得た。p４ｋ−１内のｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を、その中心にあるＥｃｏＮＩ部位により消化し、ｐＵＣ１２０ａｐｒ（Trepanierら (2002） Microbiology 148: 643-656）由来のアプラマイシン（apramycin）(ａｐｒ）耐性遺伝子カセットを、それらの両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、挿入して破壊した。次いで、破壊されたｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子を運搬するＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ挿入部分を、ｐＤＡ５０１のＥｃｏＲＩ部位に、挿入配列とベクターの両方の末端を平滑化した後に挿入した。ｐＤＡ５０１は、ストレプトマイセスプラスミドｐＩＪ４８６（Kieser、Tら(2000）前掲）と大腸菌プラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ストラタジーン）とをそれらのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いて融合させて調製されたシャトルベクターである。その結果得られた構築物、６ｐＤＡＢを用いてＳ．リヴィダンス（lividans）ＴＫ２４、および最終的には野生型エス・クラヴリゲルスをを形質転換してチオストレプトン（thiostrepton）（ｔｈｉｏ５μｇ／ｍｌ）およびアプラマイシン（ａｐｒ２０μｇ／ｍｌ）耐性にした。
遺伝子置換変異体は上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように作製した
【００５３】
３．３ ｏｆｒ４／ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ４（ｔｈｉｏｒ）の破壊構築物を用いてｏｒｆ４ｐａｒ(ａｐｒｒ）変異体のプロトプラストを形質転換することで二重変異体を作製する、アプローチを行った(Aidooら(1994）Gene．147:41-6）。ｏｒｆ４ｐａｒ変異体由来のプロトプラスト調製物を、Ｓ．リヴィダンスから単離されたｏｒｆ４破壊構築物を用いて形質転換した。形質転換体を５μｇ／ｍｌのチオストレプトンおよび５０μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（ｈｙｇ）上で選択した。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００５４】
３．４ ｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／ｏｒｆ４ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／４ｐａｒ破壊の効果を試験するために、それぞれの単離体由来の胞子を、２０ｍｌのシード培地（seed medium）（欧州特許番号第0349 121号）中に植菌し、振盪しながら２６℃で２日間生育させた。次いで、そのシード培地１ｍｌを最終段階（final stage）ソイ培地（欧州特許番号第0349 121号）中に植菌し、振盪しながら最大３日間２６℃で生育させた。３日間生育させた後の最終段階ブロスの一部を回収して、ＨＰＬＣにより(Mosherら(1999前掲）および／またはイミダゾール誘導化比色試験（Bird、A.Eら (1982） Analyst、107: 1241-1245、並びにFoulston、M.およびReading、C．(1982） Antimicrob．Agents Chemother.、22:753-762）の使用により、クラブラン酸産生能を分析した
【００５５】
ｏｒｆ４破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４破壊体をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が７１％減少していた。
この結果により、破壊によるｏｒｆ４の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００５６】
ｏｒｆ４ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体５ｐＤＡを、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が１２％減少していた。
この結果により、破壊によるｏｒｆ４ｐａｒの除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ４のように、この遺伝子はクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００５７】
ｏｒｆ４／ｏｒｆ４ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ４遺伝子の両方のコピーを欠損している変異体Ａ４−Ａ１および３Ａ３−Ａ３をソイ培地中で生育させた場合、クラブラン酸産生を検出できなかった。
この結果により、試験した条件下では、二重破壊により変異体がクラブラン酸を生成できなくなったことから、ｏｒｆ４およびｏｒｆ４ｐａｒ遺伝子の両方がクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００５８】
３．５ サザン解析
ｏｒｆ４、ｏｒｆ４ｐａｒおよびｏｒｆ４／４ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００５９】
実施例４−ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの解析
４．１ ｏｒｆ６変異体の構築
ｏｒｆ６変異体は米国特許第6,332,106号に記載のように作製した。
【００６０】
４．２ ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子は、そのコード領域の中程にあるＲｓｒＩＩ部位中にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）を導入することで破壊した。これを達成するために、このｐＯ４Ｈ−４をＫｐｎＩで消化してｏｒｆ４ｐａｒを取り除き、セルフライゲーションすることでｐ５Ｋ−６を得た。ｐ５Ｋ−６をＲｓｒＩＩで消化して、ｐＦＤＮｅｏ−Ｓ(DenisおよびBrzezinski (1992） Gene 111:115-118）からＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片として切り出されたネオマイシン耐性遺伝子を、その両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、挿入した。構築物ｐＮｅｏ５Ｋ−６Ａが得られ、それはｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子と同じ方向にｎｅｏＲ遺伝子を有していた。
【００６１】
ｐＮｅｏ５Ｋ−６Ａｔｓｒ＃１４と称されるシャトルベクターは、ＢｇｌＩＩを用いて直鎖にした６．２Ｋｂ断片のｐＩＪ４８６を、ｐＮｅｏ５Ｋ−６ＡのＢａｍＨＩポリリンカー部位中に挿入することで構築した。シャトルベクターを用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、および最終的にエス・クラヴリゲルスＷＴを形質転換して、チオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性にした。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００６２】
４．３ ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ二重変異体は、ｏｒｆ６(ａｐｒｒ）を用いてｏｒｆ６ｐａｒ(ｎｅｏｒ）変異体のプロトプラストを形質転換することによって作製した（Mosherら（1999）前掲）。ｏｒｆ６ｐａｒ変異体由来のプロトプラスト調製物を、Ｓ．リヴィダンスから単離したｏｒｆ６破壊構築物を用いて形質転換した。形質転換体は５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン（ａｐｒ）で選択した。第一の形質転換体を、上記のParadkarおよびJensen (1995）に記載のように、遺伝子複製変異体を形成させるため、非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。
【００６３】
４．４ ｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の発酵培養
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ破壊の効果を試験するため、それぞれの単離体由来の胞子をセクション３．４で既に記載したように試験した。
【００６４】
ｏｒｆ６変異体の発酵解析
ｏｒｆ６遺伝子に欠損のある変異体６−１Ａをソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が５７％減少した。この結果により、破壊によるｏｒｆ６の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００６５】
ｏｒｆ６ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体１４−２Ｂ（２）をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が２７％減少した。この結果により、破壊によるｏｒｆ６ｐａｒの除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ６のように、この遺伝子はクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００６６】
ｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体の発酵解析
ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの両方に欠損のある２重離変異体(two separete mutant）をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が６５％減少した。
この結果により、この遺伝子のいずれかのコピーの欠損がクラブラン酸産生の低下を引き起こしたことから、ｏｒｆ６およびｏｒｆ６ｐａｒの両方がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。この両方の遺伝子のコピーを不活性化することにより、クラブラン酸産生能は完全に喪失することはないが、より低下した。
【００６７】
４．５ サザン解析
ｏｒｆ６、ｏｒｆ６ｐａｒおよびｏｒｆ６／ｏｒｆ６ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００６８】
実施例５−ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒの解析
５．１ ｃｖｍ６変異体の構築
ｃｖｍ６について破壊された変異体の構築は、WO98/33896 (ｃｖｍ６はｏｒｆｄｗｎ３である）に既に記載されている。
【００６９】
５．２ ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の構築
ｃｖｍ６ｐａｒを含む１．７ＫｂのＳａｌＩ断片はｐＯ４Ｈ−４から得られ、ｐＵＣ１１８のＳａｌＩ部位中にライゲーションした。この結果得られたプラスミドをＥｃｏＮＩで消化し、ｃｖｍ６ｐａｒの内部にある１４０ｂｐの断片を切り出した。この断片の代わりに、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片として切り出されるｐＦＤＮｅｏ−Ｓ由来のネオマイシン耐性遺伝子を、両方の断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して平滑化した後に、ｃｖｍ６ｐａｒ中にライゲーションした。ｎｅｏＲマーカーをｃｖｍ６ｐａｒと同じ方向で挿入した。ネオマイシンを含むＳａｌＩ断片をＥｃｏＲＩを用いて切り出し、シャトルベクターｐＵＷＬ−ＫＳ（Weimeier、U.F (1995） Gene 165:149-150）のＥｃｏＲＩ部位中に挿入した。この構築物をｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕと称する。
【００７０】
プラスミドｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕを用いて、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４、そして最終的にはエス・クラヴリゲルスを形質転換した。この結果得られるｃｖｍ６ｐａｒ：：ｎｅｏ形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＭＹＭ培地上で選択し、次いで非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、二重クロスオーバー変異体を得た。
【００７１】
５．３ ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の構築
また、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４から単離された構築物ｐＮｅｏＳａｌ１．７Ｕ（ａｐｒＲカセットがｃｖｍ６遺伝子と同じ方向でｃｖｍ６中に挿入されている）を用いて、ｃｖｍ６変異体５６−３Ａを形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＭＹＭ培地上で生育させた。この変異体を上記のように非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、二重クロスオーバー変異体を単離した。
【００７２】
５．４ ｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の発酵培養
β−ラクタム生合成におけるｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒの破壊の効果を試験するためセクション３．４に既に記載したようにそれぞれの単離体由来の胞子を試験した。
【００７３】
ｃｖｍ６変異体の発酵解析
ＷＯ９８／３３８９６において、ｃｖｍ６遺伝子に欠損のある変異体５６−１Ａ、５６−３Ａ、５７−１Ｃおよび５７−２Ｂをソイ培地中で培養した場合、クラブラン酸レベルが向上し（対照株の１２５−１４１％）、かつクラバム−２−カルボキシレートや２−ヒドロキシメチルクラバムのレベルが大きく低下することが報告された。
【００７４】
これらの結果は、ｃｖｍ６遺伝子は５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることを示している。ｃｖｍ６の破壊は、クラバムの低下だけでなくクラブラン酸の増大を同時にもたらした。
【００７５】
ｃｖｍ６ｐａｒ変異体の発酵解析
ｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子に欠損のある変異体３Ａ１、３Ａ２、２Ａ−６、２Ｂ−１および２Ｂ−２をソイ培地中で発酵培養させ、β−ラクタム代謝産物の産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量が６−１１％増大した。クラバム−２−カルボキシレートおよびアラニルクラバムの産生は消失し、２−ヒドロキシメチルクラバムレベルは５０−８５％低下した。
【００７６】
これらの結果により、ｃｖｍ６のように、ｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子は５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることが示される。ｃｖｍ６ｐａｒの破壊は、クラバムの低下だけでなく、クラブラン酸の増大を同時にもたらした。
【００７７】
ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ二重変異体の発酵解析
ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒ遺伝子の両方に欠損のある変異体Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｃ−１およびＣ−２をソイ培地中で生育させ、それらのβ−ラクタム代謝産物の産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。クラブラン酸の産生は１２−２７％増大し、アラニルクラバムおよびクラバム２−カルボキシレートの産生は消失し、２−ヒドロキシメチルクラバムレベルは７０−８３％低下した。
【００７８】
これらの結果により、ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒの単一変異のように、ｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ二重変異体はクラブラン酸レベルを向上させたことから、いずれの遺伝子も５Ｓクラバムの有効な産生に必要であることが示された。
【００７９】
５．５ サザン解析
ｃｖｍ６、ｃｖｍ６ｐａｒおよびｃｖｍ６／ｃｖｍ６ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴づけした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていることが確認された。
【００８０】
実施例６−ｏｒｆ３及びｏｒｆ３ｐａｒの解析
６．１ ｏｒｆ３変異体の構築
ｏｒｆ３について破壊された変異体は米国特許第6,332,106号に記載のように作製した。
【００８１】
６．２ ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ３ｐａｒの破壊用鋳型（disruption template）として、プラスミドｐ５．７ＥｃｏＲＩ ｒｅｆ（ｐＪＯＥに基づくｈｙｇ(pJOE based hyg））を用いた。このプラスミド中の挿入部分はおよそ５．７Ｋｂであり、プラスミドｐＪＯＥ８２９内で運搬される全部、ｃｖｍ６ｐａｒの一部、ｏｒｆ６ｐａｒ、ｏｒｆ４ｐａｒ、ｏｒｆ３ｐａｒの全部、およびｏｒｆ２ｐａｒの一部を含む（Kieser、Tら．(2000）; Aidooら．(1994） Gene．147:41-6）。この破壊用ベクターは、ＦｓｅＩ消化されたｐ５．７ＥｃｏＲＩ中へのチオストレプトン耐性カセットのライゲーションにより構築される（前掲のAidooら）。ＦｓｅＩ特異部位はｏｒｆ３ｐａｒの開始点から５０７ｂｐの挿入部分内にある。適当な構築物を得て、次いでそれを用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、そしてエス・クラヴリゲルス野生型を形質転換する。第一の形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびヒグロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）上で選択した。この変異体を上記のように非選択条件下で２回の胞子形成を行わせて、予想される二重クロスオーバー変異体を単離した。
【００８２】
６．３ ｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の構築
セクション６．２に記載のｏｒｆ３ｐａｒ破壊用カセットは、Ｓ．リヴィダンスＴＫ２４から単離し、それを用いてｏｒｆ３：：ａｐｒａ変異体を形質転換した。形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）およびヒグロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭＹＭ培地上で選択した。変異体を選択なしに２回の胞子形成を行わせ、二重クロスオーバー変異体を上記のように単離した。
【００８３】
６．４ ｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒの破壊の影響を試験するため、セクション３．４で既に記載したように、それぞれの単離体由来の胞子を試験した。
【００８４】
ｏｒｆ３変異体の発酵解析
変異体Ａｐ３−１、Ａｐ３−２およびＡｐ３−３をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は３１−７１％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ３遺伝子の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、この遺伝子がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００８５】
ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵培養
変異体３Ａ−１および３Ａ−２をソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は９％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ３ｐａｒ遺伝子の除去がクラブラン酸レベルの低下を引き起こしたことから、クラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００８６】
ｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体の発酵培養
ｏｒｆ３遺伝子の両方のコピーに欠損のある変異体１１−１、１１−２、２−１および２−２をソイ培地で培養した場合に、野生型エス・クラヴリゲルスと比較すると、クラブラン酸生合成は完全に消失していた。
この結果により、試験した条件下では、二重破壊により変異体がクラブラン酸を生成できなくなったことから、ｏｒｆ３およびｏｒｆ３ｐａｒの両方がクラブラン酸生合成に寄与していると結論付けることができる。
【００８７】
６．５ サザン解析
ｏｒｆ３、ｏｒｆ３ｐａｒおよびｏｒｆ３／ｏｒｆ３ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴付けした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていたことが確認された。
【００８８】
実施例７−ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒの解析
７．１ ｏｒｆ２変異体の構築
ｏｒｆ２について破壊された変異体は、当初は、米国特許第6,332,106に記載のように作製した。最初のｏｒｆ２変異体は２回の遺伝子置換を行い、アプラマイシン耐性遺伝子を除去し、それを単一フレームシフト変異への置き換えを施した。このプラスミドを用いて、中央に位置するＮｏｔＩ部位中にアプラマイシン耐性遺伝子カセットを挿入することによって破壊されたｏｒｆ２遺伝子と共にｐＵＣ１１９／ｐＩＪ４８６シャトルベクター上で運搬されるエス・クラヴリゲルスＤＮＡの２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片から形成される最初のｏｒｆ２変異体を作製した（米国特許第6,332,106）。２回目の変異導入に用いた破壊用プラスミド構築物は、ＮｏｔＩ処理してアプラマイシン耐性遺伝子カセットを切り出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて処理して突出端（overhanging ends）を埋め、次いでリライゲーションしてプラスミドを環状化することによって最初の破壊用プラスミドから誘導した。この結果得られたプラスミド構築物は、破壊されたＮｃｏＩ部位の位置に導入されたフレームシフトを有する以外は完全なｏｒｆ２遺伝子を運搬する。次いで、この構築物を用いてＳ．リヴィダンスＴＫ２４、および最初のＳ．クリヴリゲルスｏｒｆ２変異体を形質転換した。第一の形質転換体をチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）上で選択し、次いで非選択条件下で２回の胞子形成を行わせた。予想される二重クロスオーバー変異体を、それらのアプラマイシン耐性喪失に基づいて同定した。
【００８９】
７．２ ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ２ｐａｒ変異体は、ＲＥＤＩＲＥＣＴ (プラントバイオサイエンスリミテッド（Plant Bioscience Limited）の登録商標、ノリッジ、U.K）として知られているＰＣＲに基づくターゲティングキット（targeting kit）を用いて作製した。プラスミドｐＩＪ７９０およびｐＩＪ７７３、並びに宿主株である大腸菌ＢＷ２５１１３をキットの一部として用いた。この特別な応用に対し、アプラマイシン耐性遺伝子を挿入することでｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子が破壊されるように設計された、一組のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＫＴＡ１４:５'−ＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’および
ＫＴＡ１５:５'−ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴ−３'
を合成した。ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子破壊用カセットは、プラスミドｐＩＪ７７３をテンプレートとして用い、上記２本のプライマーを用いたＰＣＲにより生成した。用いたＰＣＲ条件は、ジメチルスルホキシドを使用しないことを除いて、取り扱い説明書に記載のものであった。次いで、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊用カセットを、ｏｒｆ２ｐａｒを運搬するコスミド１４Ｅ１０（上記）を用いて予め形質転換された大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０中にエレクトロトランスフォーメーション（electrotransformation）により導入した。ｐＩＪ７９−プラスミドの欠落を促進するために３７℃で一晩生育させた後、コスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子が破壊されたことを確認するために解析を行った。次いで、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊されたコスミドＤＮＡを接合により野生型エス・クラヴリゲルス中に移行させた。接合は、トランス接合の回復のために５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを添加したＡＳ−１培地（Baltz、R．H．Genetic recombination by protoplast fusion in Streptomyces．Dev．Ind．Microbiol 21 (1980） 43-54）を用いたことを除いて、上記のKieser、T.ら(2000）に記載のように実施した。アプラマイシン耐性エス・クラヴリゲルストランス接合体は、上記のParadkarおよびJensen(1995）に記載のように遺伝子置換変異体を生成するために非選択条件下で１回の胞子形成を行わせた。
【００９０】
７．３ ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の構築
ｏｒｆ２ｐａｒ変異体を作製するために用いたＰＣＲに基づくターゲティング法（セクション７．２）を、ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ二重変異体を作製するのにも用いた。この場合、ｏｒｆ２ｐａｒ破壊されたコスミドＤＮＡは、野生型株中よりも上記のｏｒｆ２変異体（セクション７．１）中に接合させた。アプラマイシ耐性エス・クラヴリゲルストランス接合体を、上記のように遺伝子置換を受けた単一ゲノム変異体の胞子を得るために、非選択条件下で１回の胞子形成を行わせた。
【００９１】
７．４ ｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ変異体の発酵解析
クラブラン酸生合成におけるｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／２ｐａｒ破壊の効果を試験するため、それぞれの単離体由来の胞子をセクション３．４に既に記載したように試験した。
【００９２】
ｏｒｆ２変異体の発酵解析
ｏｒｆ２遺伝子の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は９５−９８％低下した（Jensenら (2000）前掲）。
この結果により、破壊によるｏｒｆ２遺伝子の除去によってクラブラン酸産生に大きな低下が引き起こされたことから、この遺伝子がクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００９３】
ｏｒｆ２ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン産生について野生型エス・クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、クラブラン酸の蓄積量は１０−３０％低下した。
この結果により、破壊によるｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の除去によってクラブラン酸産生に低下が引き起こされたことから、ｏｒｆ２のように、この遺伝子はクラブラン酸の有効な産生に必要であると結論付けることができる。
【００９４】
ｏｒｆ２／ｏｒｆ２ｐａｒ破壊体の発酵解析
ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ両方の欠損変異体を、ソイ培地中で発酵培養し、クラブラン酸産生を野生型Ｓ，クラヴリゲルスと比較した。７２時間生育させた後では、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ変異体を含む株からは、クラブラン酸産生を検出できなかった。この結果により、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒ遺伝子の二重変異は変異体をクラブラン酸生成できなくるすことから、試験した条件下では、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２ｐａｒの両方の遺伝子がクラブラン酸産生に寄与していることが確認された。
【００９５】
サザン解析
ｏｒｆ２、ｏｒｆ２ｐａｒおよびｏｒｆ２／２ｐａｒ変異体をサザン解析によりさらに特徴付けした。この結果により、これらの変異体では、関連する遺伝子の染色体コピーが期待されたように破壊されていることが確認された。
【００９６】
実施例８−ｃｖｍ７およびｃｖｍ７ｐａｒの解析
配列解析により、このパラログクラスターにおいて２種の遺伝子がさらに同定されたが、クラブラン酸またはｃｖｍ遺伝子クラスターのいずれのパラログであるかは明らかではなかった。これらの遺伝子のいずれかは、まだ同定されていないｃｖｍ遺伝子のパラログである可能性があり、それを決定することは重要であった。従って、ｃｖｍクラスター（WO98/33896）の配列をｃｖｍ３（WO98/33896においてはｏｒｆｕｐ３）の下流を伸張させた。
【００９７】
８．１ ｃｖｍクラスター配列の伸張
コスミド１０Ｄ７（WO98/33896に記載されている）を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで消化した。この消化により、ｃａｓＩおよびｃｖｍ１を含む６．８キロベースのＤＮＡ断片を単離し、ｐＵＣ１１９に基づくプラスミド中にクローニングした。その結果得られたプラスミドｐＣＥＣ０１９をテンプレートとして用いて、ＷＯ９８／３３８９６に報告されている部分的なｃｖｍ３遺伝子を完成させることのできる配列情報を得た。さらに、この配列情報から、その断片中には不完全ではあるが別の読み取り枠、ｃｖｍ７の存在が示唆された。このｃｖｍ７遺伝子の配列を完成させるために、コスミド１０Ｄ７から隣接するＳａｃＩ断片、１．９ｋｂ断片をサブクローニングした。配列情報は、ｃｖｍ７遺伝子の開始コドンを同定することができる部分までの、残りのｃｖｍ７遺伝子を含む最後のクローンから得られた。まとめることで、さらに約３．９ｋｂの新たなＤＮＡ配列を作成することができ、それを配列番号．１７に記載した。
【００９８】
８．２ 配列解析
ｃｖｍ７のサイズおよびｃｖｍクラスターの残りの部分に関する方向を、図２にて図式的に示す。配列のホモロジー検索により、この遺伝子が転写調節遺伝子と相同性を共有していることが示された。さらに、ｃｖｍ７は、既知のクラブラン酸またはクラバム生合成遺伝子のパラログとは明らかに異なっており、パラログクラスターで同定された２個の遺伝子の１個と３３％同一であった。このように、ｃｖｍ６およびｃｖｍ６ｐａｒがパラログであることが示されたことから、この配列データにより、ｃｖｍ７およびｃｖｍ７ｐａｒが５Ｓクラバム生合成に関与する遺伝子のパラログであると結論付けることができる。
【００９９】
（配列の簡単な説明）
配列番号：１ ｃｖｍ６ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：２ ｃｖｍ７ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：３ ｃｖｍ６ｐａｒａポリペプチド
配列番号：４ ｃｖｍ７ｐａｒａポリペプチド
配列番号：５ ｃｖｍ６読み取り枠
配列番号：６ ｃｖｍ７読み取り枠
配列番号：７ ｃｖｍ１読み取り枠
配列番号：８ ｃｖｍ２読み取り枠
配列番号：９ ｃｖｍ３読み取り枠
配列番号：１０ ｃｖｍ４読み取り枠
配列番号：１１ ｃｖｍ５読み取り枠
配列番号：１２ ｏｒｆ２ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１３ ｏｒｆ３ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１４ ｏｒｆ４ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１５ ｏｒｆ６ｐａｒａ読み取り枠
配列番号：１６ パラログクラスター
配列番号：１７ 伸張されたｃｖｍクラスター(下線した配列はWO98/33896で開示された配列を超えた新規の配列を意味する）
配列番号：１８ ｏｒｆ２ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：１９ ｏｒｆ３ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：２０ ｏｒｆ４ｐａｒａ読み取り枠(逆相補鎖）
配列番号：２１ ｃｖｍ６ポリペプチド
配列番号：２２ ｃｖｍ３ポリペプチド
配列番号：２３ ｏｒｆ６ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２４ ｏｒｆ４ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２５ ｏｒｆ３ｐａｒａポリペプチド
配列番号：２６ ｏｒｆ２ｐａｒａポリペプチド
【０１００】
配列
配列番号：１ ｃｖｍ６ｐａｒａ
【化１】
【０１０１】
配列番号：２ ｃｖｍ７ｐａｒａ
【化２】
【０１０２】
配列番号：３ ｃｖｍ６ｐａｒａポリペプチド
【化３】
【０１０３】
配列番号：４ ｃｖｍ７ｐａｒａポリペプチド
【化４−１】
【化４−２】
【０１０４】
配列番号：５ ｃｖｍ６
【化５】
【０１０５】
配列番号：６ ｃｖｍ７
【化６−１】
【化６−２】
【０１０６】
配列番号：７ ｃｖｍ１
【化７】
【０１０７】
配列番号：８ ｃｖｍ２
【化８】
【０１０８】
配列番号：９ ｃｖｍ３
【化９】
【０１０９】
配列番号：１０ ｃｖｍ４
【化１０】
【０１１０】
配列番号：１１ ｃｖｍ５
【化１１−１】
【化１１−２】
【０１１１】
配列番号：１２ ｏｒｆ２ｐａｒａ
【化１２】
【０１１２】
配列番号：１３ ｏｒｆ３ｐａｒａ
【化１３】
【０１１３】
配列番号：１４ ｏｒｆ４ｐａｒａ
【化１４】
【０１１４】
配列番号：１５ ｏｒｆ６ｐａｒａ
【化１５−１】
【化１５−２】
【０１１５】
配列番号：１６ ｐａｒａクラスター
【化１６−１】
【化１６−２】
【化１６−３】
【０１１６】
配列番号：１７ ｃｖｍクラスター
【化１７−１】
【化１７−２】
【化１７−３】
【化１７−４】
【化１７−５】
【化１７−６】
【０１１７】
配列番号：１８ ｏｒｆ２ｐａｒ逆相補鎖
【化１８】
【０１１８】
配列番号：１９ ｏｒｆ３ｐａｒ逆相補鎖
【化１９】
【０１１９】
配列番号：２０ ｏｒｆ４ｐａｒ逆相補鎖
【化２０−１】
【化２０−２】
【０１２０】
配列番号：２１ ｃｖｍ６ポリペプチド
【化２１】
【０１２１】
配列番号：２２ ｃｖｍ３ポリペプチド
【化２２】
【０１２２】
配列番号：２３ ｏｒｆ６ｐａｒポリペプチド
【化２３】
【０１２３】
配列番号：２４ ｏｒｆ４ｐａｒポリペプチド
【化２４】
【０１２４】
配列番号：２５ ｏｒｆ３ｐａｒポリペプチド
【化２５】
【０１２５】
配列番号：２６ ｏｒｆ２ｐａｒポリペプチド
【化２６】
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】パラログクラスターの図。転写の方向をそれぞれの遺伝子について示す（矢印の方向）。
【図２】ｃｖｍ７の公開されたｃｖｍクラスター（WO98/33896）に対する方向性。
【図３】パラログクラスターの注釈付き配列。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５Ｓクラバム生合成に不可欠な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus；以下、エス・クラヴリゲルスという）微生物であって、該エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生が低下し、かつクラブラン酸の産生が少なくとも維持されるように、該読み取り枠が破壊または欠失されており、該読み取り枠が：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ（配列番号：１）;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ（配列番号：２）;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６（配列番号：５）;または
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７（配列番号：６）
から選択されるところの、エス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項２】
５Ｓクラバム生合成に不可欠な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、該エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生が低下し、かつクラブラン酸の産生が少なくとも維持されるように、該読み取り枠が破壊または欠失されており、該読み取り枠が：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１（配列番号：７）、ｃｖｍ２（配列番号：８）、ｃｖｍ３（配列番号：９）、ｃｖｍ４（配列番号：１０）、ｃｖｍ５（配列番号：１１）、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ；または
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から選択されるところの、エス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項３】
以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ；
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ；
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６；
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７；
ｅ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ；または
ｆ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から成る群から選択される読み取り枠を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該読み取り枠が：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ（配列番号：１２）、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ（配列番号：１３）、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ（配列番号：１４）および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ（配列番号：１５）
から成る群から選択されるところの、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該読み取り枠が１つまたはそれ以上の：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
を、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子との組み合わせにて含むところの、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ａ）配列番号：１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号：１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号：１７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
ｄ）配列番号：１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを含むエス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項９】
適当な微生物中でのクラブラン酸の生成を改良する方法であって、請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオヂドを単離する工程、該ポリヌクレオチドを操作する工程、その操作されたポリヌクレオチドを該適当な微生物に導入する工程、および該適当な微生物をクラブラン酸を産生する条件下で発酵培養する工程、
を含む、方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがｃｖｍまたはｃｖｍｐａｒａポリヌクレオチドであり、該操作がｃｖｍまたはｃｖｍｐａｒａ遺伝子配列を破壊または欠失することを含むところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドがｏｒｆまたはｏｒｆｐａｒａポリヌクレオチドであり、その操作が発現に好適なベクター中にポリヌクレオチドを挿入することを含むところの、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
好適な微生物がエス・クラヴリゲルスである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
５Ｓクラバム生合成に不可欠な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus；以下、エス・クラヴリゲルスという）微生物であって、該エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生が低下し、かつクラブラン酸の産生が少なくとも維持されるように、該読み取り枠が破壊または欠失されており、該読み取り枠が：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ（配列番号：１）;
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ（配列番号：２）;
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６（配列番号：５）;または
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７（配列番号：６）
から選択されるところの、エス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項２】
５Ｓクラバム生合成に不可欠な１つまたはそれ以上の読み取り枠に相当するＤＮＡを含むエス・クラヴリゲルス微生物であって、該エス・クラヴリゲルスによる５Ｓクラバムの産生が低下し、かつクラブラン酸の産生が少なくとも維持されるように、該読み取り枠が破壊または欠失されており、該読み取り枠が：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１（配列番号：７）、ｃｖｍ２（配列番号：８）、ｃｖｍ３（配列番号：９）、ｃｖｍ４（配列番号：１０）、ｃｖｍ５（配列番号：１１）、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ；または
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から選択されるところの、エス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項３】
以下：
ａ）ｃｖｍ６ｐａｒａ；
ｂ）ｃｖｍ７ｐａｒａ；
ｃ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよびｃｖｍ６；
ｄ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよびｃｖｍ７；
ｅ）ｃｖｍ６ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ７ｐａｒａ；または
ｆ）ｃｖｍ７ｐａｒａおよび１つまたはそれ以上のｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ５、ｃｖｍ６、ｃｖｍ７もしくはｃｖｍ６ｐａｒａ
から成る群から選択される読み取り枠を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該読み取り枠が：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ（配列番号：１２）、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ（配列番号：１３）、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ（配列番号：１４）および
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ（配列番号：１５）
から成る群から選択されるところの、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
クラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の酵素をコードする１つまたはそれ以上の読み取り枠を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該読み取り枠が１つまたはそれ以上の：
ａ）ｏｒｆ２ｐａｒａ、
ｂ）ｏｒｆ３ｐａｒａ、
ｃ）ｏｒｆ４ｐａｒａ、
ｄ）ｏｒｆ６ｐａｒａ
を、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７またはｏｒｆ１８から選択されるクラブラン酸生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子との組み合わせにて含むところの、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ａ）配列番号：１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号：１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号：１７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
ｄ）配列番号：１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを含むエス・クラヴリゲルス微生物。
【請求項９】
適当な微生物中でのクラブラン酸の生成を改良する方法であって、請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオヂドを単離する工程、該ポリヌクレオチドを操作する工程、その操作されたポリヌクレオチドを該適当な微生物に導入する工程、および該適当な微生物をクラブラン酸を産生する条件下で発酵培養する工程、
を含む、方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがｃｖｍまたはｃｖｍｐａｒａポリヌクレオチドであり、該操作がｃｖｍまたはｃｖｍｐａｒａ遺伝子配列を破壊または欠失することを含むところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドがｏｒｆまたはｏｒｆｐａｒａポリヌクレオチドであり、その操作が発現に好適なベクター中にポリヌクレオチドを挿入することを含むところの、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
好適な微生物がエス・クラヴリゲルスである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図３ｂ】
【図３ｄ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図３ｈ】
【図３ｉ】
【図３ｋ】
【図２】
【図３】
【図３ｂ】
【図３ｄ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図３ｈ】
【図３ｉ】
【図３ｋ】
【公表番号】特表２００６−５２３４４７（Ｐ２００６−５２３４４７Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５１４１（Ｐ２００６−５０５１４１）
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３８９
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【出願人】（３９９０５０９７６）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アルバータ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３８９
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【出願人】（３９９０５０９７６）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アルバータ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ
【Ｆターム（参考）】
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