クロマトグラフィカラムのための充填システムおよび方法
本発明は、クロマトグラフィ媒体でクロマトグラフィカラムを充填するためのシステムおよびこれらのカラムで使用するための充填方法に関する。詳細には、本発明は、粒子状媒体のベッドを目標のベッド高さまで圧縮するための外部駆動手段を利用する、クロマトグラフィカラムを充填するための方法およびシステムに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィ媒体でクロマトグラフィカラムを充填するためのシステムおよびそのようなカラムで使用するための充填方法に関する。より具体的には、本発明は、クロマトグラフィカラム内へのクロマトグラフィ媒体の充填を改良するための充填システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィで使用されるカラムは、通常、キャリア液が流通している多孔質のクロマトグラフィ媒体を囲んでいる管状体を有しており、キャリア液と多孔質媒体の固相との間での物質捕集によって分離が行われる。あらゆる分離処理の前に、ベッドは、カラムに導入される必要があるスラリーの粒子状物質が最初に用意される必要がある。ベッド形成の過程は「充填処置（ｐａｃｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」といわれ、適正に充填されたベッドは、充填ベッドを収容するカラムの性能を左右する重要な要因となる。充填処置の目標は、最適圧縮量（最適圧縮率）で圧縮されたベッドを得ることである。
【０００３】
詳細には、多孔質媒体は、通常は一方の端部からコラム内へとポンプ輸送、注入または吸引される、「スラリー」として知られている離散粒子の懸濁液を圧密することによって形成される。充填ベッドへのスラリーの圧密は、通常、スラリーを粒子保持フィルターでろ過し、さらに形成されたろ過ケークを圧縮することによって実現され、その結果、スラリーが重力のみの作用下で沈殿して沈殿ベッドを形成する場合に占める体積より小さい体積で充填される。圧縮の程度はクロマトグラフィ媒体のタイプに依存するが、通常は２％から２０％の間である。その後のクロマトグラフィ分離の効率は、充填ベッドの液体入口および出口のところにある液体分配・収集システムによって決まるが、主に、形成された充填ベッドの均質性および安定性によって決まる。充填ベッドが均質でなく安定していない場合、ベッドで行われるクロマトグラフィ分離に有害作用を及ぼす。充填ベッドの均質性および安定性は、各々のカラムサイズ（幅または直径）、ベッド高さおよびベッド媒体に対して経験的に決定されなければならない最適な圧縮の度合いに依存する。カラムを充填するためのいくつかの方法が知られている（例えば米国特許出願公開第２００３／０１４６１５９号明細書を参照されたい）。「フローパッキング（ｆｌｏｗ ｐａｃｋｉｎｇ）」は、分析カラム（すなわち、カラム直径が約１〜１０ｍｍのカラム）、半調製カラム（すなわち、カラム直径が１０〜１００ｍｍのカラム）のまたはさらに大きいカラムの分離に通常利用される方法である。フローパッキングでは、カラムの一方の端部がフリットまたはフィルターで閉じられている。他方の端部では、充填物のスラリーまたは懸濁液がカラムチューブ内へポンプ輸送または注入される。ろ過ベッドがフリットのところに構築され、これはろ過ケークが形成されるまで成長する。その後、ベッドは、動作中に使用される流量を超える流量で複数（約３〜１０）のカラム体積の充填用溶媒を濾すことにより、その「目標のベッド高さ」までさらに圧縮される。圧密およびその後の圧縮は、ベッドを通って濾される液体流れの流量を維持するのに必要な圧力勾配に対するベッドの反動である浸透力の影響下で行われる。流れによってベッドが圧縮されると、流れは停止され、カラムの底部にある出口が閉じられ、アダプタまたは上側端部セルが圧縮ベッドの目標高さに調節される。この調節は、圧縮ベッドの弛緩が目標ベッド高さを超えるのを回避するために迅速に行われる。
【０００４】
このフローパッキング方法には、このように圧縮される充填物のベッドが流れ圧縮（ｆｌｏｗ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）ステップの間において軸方向で不均質になり、カラムの出口の近傍で圧縮が最も大きくなり、充填ベッドの頂部のところではゼロ圧縮となってしまう、という欠点がある。それにより、充填用の流れが停止されて上側端部セルが所定の位置に移動させられた後でベッドが大きく弛緩してしまい、粒子状物質を再配置しなければならない場合がある。この方法に伴うベッド圧縮の変動により、媒体のタイプおよび充填ベッドの幾何構造によってはベッドの安定性およびカラムの効率が不十分になる場合がある。
【０００５】
フローパッキングの標準的な方法は、分取クロマトグラフィで使用される大孔径カラムに適していない場合がある。とりわけ、ある充填流量を加えること、したがってそれ以降の作業で必要となる圧力よりも実質的に大きな充填圧力を加えることを必要とする装置を設計することは、しばしば望ましくない。この問題に対処するために、機械的に軸方向に圧縮することに依拠した充填方法が使用される。軸方向に圧縮する方法では、アダプタ（端部セル）の軸方向の運動によってベッドの圧縮が実現される。これにより、充填中におけるカラム空間での高い液圧の必要性が取り除かれる。軸方向に圧縮する方法の別の利点は、ベッドが軸方向に均等に圧縮されことにより、フローパッキング方法で発生する弛緩および粒子の再配置の問題が回避されることである。
【０００６】
ベッド圧縮およびベッド空隙率の径方向における変動は記載した両方の方法で発生するが、これは壁面摩擦作用に起因する。径方向の不均質性による影響は、ベッドの幾何形状すなわち直径と高さの比によって決まる。上述したように、軸方向における圧縮およびベッド空隙率の変動は、フローパッキング方法と軸方向に圧縮する方法とでは実質的に異なる。
【０００７】
軸方向に圧縮することの欠点は、この方法を使用して充填されるカラムが、端部セルを移動させるための手段とこの移動を制御するための手段とを必要とすることである。移動のための典型的な方法は電動機駆動装置または液圧システムである。これらはカラムに装着されるまたはカラムに取り付けられるように構築されることから、軸方向に圧縮するカラムのコストおよび機械的複雑さはフローパッキングカラムより実質的に増大される。
【０００８】
あらゆる圧密および圧縮に先んじて、媒体はカラムに導入される必要がある。大型のカラムは、好適には、スラリーを中央スラリーノズルまたは中央スラリーバルブを通してカラムに注入することによって用意される。これにより、衛生上の理由で好適である閉じられたシステムによるアプローチが可能となる。スラリーバルブ設計をベースとしたカラムは、移動式アダプタを使用する軸方向圧縮パッキング用または固定式端部セルを使用するフローパッキング用に設計され得る。
定義
「分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）」は、天然起源または合成起源の物質、化合物または化学物質として、あるいは、それらの反応生成物または誘導体または代謝物質として定義される。不正確さを回避するために、この用語は、タンパク質、ペプチド類、アミノ酸類および核酸などの生物学的分子、ならびに、薬物および／またはプロドラッグなどの合成分子を含む。
【０００９】
「媒体（ｍｅｄｉｕｍ）」は、その中でクロマトグラフィ分離が起こっている任意の物質として定義される。媒体の例には、イオン交換クロマトグラフィ分離、サイズ排除クロマトグラフィ分離、アフィニティクロマトグラフィ分離（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、および、逆相クロマトグラフィ分離を引き起こす物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
「使い捨て」カラムは、非使い捨てカラムの場合に必要となる設置作業および修正／確認作業を軽減するためのクロマトグラフィ媒体の前処理を特徴とする。少なくとも、前処理には多孔質媒体のベッドの形成が含まれる。追加の前処理は、汚染微生物数の低減、消毒、発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）などであってよい。
【００１１】
使い捨てカラムはシングルユースカラムとして使用されてよく、これは、反復使用の前に充填ベッドの修正（例えば、試験、確認など）を必要とするクリーニング・レジメ（ｃｌｅａｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅ）を使用者が実施しないことを意味する。
【００１２】
使い捨てカラムの一実施形態は、クロマトグラフィ媒体で予め充填された状態で搬送される完成されたカラムである。
【００１３】
使い捨てカラムの別の実施形態は、運用中に充填ベッドの１つまたは複数の横方向表面に作用する圧力および荷重に抵抗して充填ベッドに寸法安定性をもたらすように設計されたフレームまたは容器に相当する第１の装置と、多孔質媒体またはベッドを収容するコンテナ、シェル、カートリッジまたはバッグなどに相当する、運用中においては第１の装置に取り付けられる第２の装置とから構成される。後者の実施形態では、多孔質媒体は二次コンテナ内に収容されて取り替えることができるが、フレームは再使用可能である。この場合、運用に必要となる多孔質媒体の圧縮の度合いは、収容されている媒体をフレーム内に挿入した後で調節され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１６６８１６号明細書および国際公開第２００５／００９５８５号を参照されたい）。
【００１４】
「カラムに一体化されておらずかつその外部にある駆動手段」とは、カラムを充填するときのみ使用され、カラムの動作中ではカラムから取り除かれるまたは取り外される、分離式の実在物である駆動手段を意味する。したがって、エンドユーザがカラムを運用するとき、この駆動手段はなく、カラムにも取り付けられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、従来技術の方法の欠点を克服する充填方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の主な利点は、軸方向に圧縮する方法によって充填ベッドが用意されることにより、軸方向圧縮カラムに対して従来の解決策で必要とされるようなカラム構造の高い機械的複雑さを必要とすることなく、ベッドの向上した安定性および高いカラム効率が得られることである。これにより大幅なコスト削減が可能となる。
【００１７】
本発明の方法の別の利点は、圧縮が、流れ圧縮（ｆｌｏｗ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）で必要とされるような高圧力ではなく、圧縮フレームなどの外付け駆動手段によって主として実現されることから、本発明の方法が低圧流体処理装置（例えば、蠕動ポンプ）と適合性を有していることである。
【００１８】
本発明の方法の別の利点は、カラムの充填／詰込（ｆｉｌｌｉｎｇ）が閉じられたシステムとして実行され得ることであり、これは、カラムが、予め滅菌処理されたカラムおよび予め滅菌処理されたクロマトグラフィ媒体から始まる無菌状態下で詰込／充填することさえできるということも意味する。したがって、この方法は、「すぐに処理することができる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓ）」カラムまたは「使い捨て」カラムに使用され得る。
【００１９】
さらに別の利点は、クロマトグラフィカラムが拡大縮小可能であることである（すなわち、カラムサイズを増大または縮小させることにより予測可能な性能が得られる）。これは、スラリーノズルを介したカラムの詰込が高いアダプタ位置のところでの軸方向の圧縮ステップの前に行われることに起因する。これにより、固定式端部セルを使用するように設計されたカラムをベースとした、ノズルを用いたフローパッキングと比較して、カラムの断面積全体にわたってスラリーを均質に分散させることが可能となる（例えば、米国特許第６，５２４，４８４号明細書を参照されたい）。フローパッキングの場合、充填は、目標のベッド高さである一定のベッド高さのところで行われる必要があり、それにより、充填ベッドの密度および圧縮がそれぞれ径方向において変動してしまう可能性がある。
【００２０】
本発明の方法の別の利点は、ベッド形成の開始の前にすべてのスラリーが導入される必要があるわけではないことから、カラムが従来技術の軸方向圧縮カラムと同じくらいの長さである必要がないことである。
【００２１】
本発明の別の利点は、既知の方法を使用したシステムと比較して必要となるアダプタ（端部ユニット）の行程が最小になり、それにより小型の構造が可能となることである。
【００２２】
本発明に第１の態様によると、目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドを備える軸方向流れクロマトグラフィカラム（ａｘｉａｌ ｆｌｏｗ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を充填する方法が提供される。
【００２３】
このカラムは、
長尺管状側壁を有するハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１のユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２のユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によってベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと、
を有し、
前記第１の端部ユニットが、前記粒子状媒体で前記ベッド空間を満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有し、
前記方法が、
ｉ．前記第１のフィルターと前記第２のフィルターとの間の軸方向の間隔を、目標のベッド高さの距離を超える距離に調節するステップと、
ｉｉ．中に粒子状媒体のベッドを形成するために、前記第１のバルブ手段を介して前記粒子状媒体の懸濁液を前記ベッド空間へ導入するステップと、
ｉｉｉ．前記目標のベッド高さを得るために、前記第１および／または第２の端部フィルターの軸方向の移動により前記粒子状媒体のベッドを圧縮するステップと
を含み、
ステップｉｉｉ）が、前記カラムに一体化されておらずかつその外部にある前記駆動手段によって実現される、ことを特徴とする。
【００２４】
本発明の第２の態様によると、目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドを備える軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムが提供される。このシステムは、
ｉ．長尺管状側壁を含むハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたヘッド空間を画定する、前記第１の端部ユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２の端部ユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと
を有するカラムにおいて、
前記第１の端部ユニットが、前記ベッド空間を前記粒子状媒体で満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有する、
カラム、ならびに、
ｉｉ．前記カラムに一体化されておらずかつその外部にあることを特徴とする駆動手段、
を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】基本的な特徴を示した、従来技術のクロマトグラフィカラムの概略横断面図である。
【図２】三次元で概略的に示した、本発明による方法を使用して充填され得るクロマトグラフィカラムの横断面図である。
【図３】三次元で概略的に示した、本発明による方法を使用して充填され得るクロマトグラフィカラムの別の実施形態の横断面図である。
【図４】本発明による方法を使用して充填されるクロマトグラフィカラムの三次元概略図である。
【図５】本発明による方法を使用して軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムの概略図である。
【図６】上昇流モード（点線）および下降流モード（実線）の両方における、本発明に従って充填されたクロマトグラフィカラムでのアセトンのクロマトグラフィ分離を示したクロマトグラムである。
【図７】減少したプレート高さおよび非対称因子を溶出ピークから計算する方法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１は、従来技術で知られているクロマトグラフィカラム１の一般的な構成要素を概略的に示している（例えば、米国特許第６，５２４，４８４号明細書を参照されたい）。このカラムは、例えば、ステンレス鋼の、または、半透明であってよい高強度／強化ポリマー材料の流体不透過性円筒形側壁１１を有する。側壁１１の開いた頂端部および底端部は、頂端部組立体またはユニット１２および底端部組立体またはユニット１３によって閉じられる。各端部ユニットは、ステンレス鋼、または、例えばポリプロピレンといった高強度エンジニアリングプラスチック材料で好適には作られる、円筒壁１１の開口部を塞ぐように封止的に嵌合される流体不透過性端部プレート３を有する。端部プレートは、端部プレートの外側表面を受け止めておりかつ側壁を越えて径方向に延在してフランジ２２を保持している状態に金属プレート２を維持することによって支持される。フランジ２２には調節可能テンションロッド１４が貫通して固定されている。これらは頂部組立体１２と底部組立体１３とを連結し、この構造体が高い流体圧力に耐えるのを助ける。
【００２７】
各端部プレート３は、カラムの外側と側壁１１および端部組立体１２、１３によって画定される充填ベッド空間９と連通させるための中央貫通開口部３１を有する。開口部３１を介しての侵入路は、接続マニホルド８を介して外部に接続される分離した導管に細分化される。
【００２８】
通常はフィルター付きまたは織られたプラスチックまたは鋼であるフィルター層４が、端部プレート３の内側表面のところでベッド空間９の領域全体に延在している。端部プレート３の内側表面３５は、フィルター層４と内側表面３５との間に分散チャネル３４を画定するために、フィルター層４の裏側で例えば図に示したように円錐形に窪んでおり、好適には支持リブ（図示せず）を使用してフィルター層４を裏側から支持している。移動相用導管３３である連絡導管の１つは、この分散チャネル３４に入るように内部へ開いており、同時に、マニホルド８の移動相用接続部８１に向かって外部に開いている。
【００２９】
マニホルド８から、アクセスバルブ装置５が端部プレート開口部３１を通って内側に突出しており、さらにフィルター層４の中央オリフィス４１を封止的に通っている。アクセスバルブ５は、マニホルド８からの１つまたは複数の導管のベッド空間９への直接、すなわちフィルター層４を迂回する連絡を制御する。ここに示したのは、マニホルド８のコネクタ８２を介して外部に接続されている、バルブ５によって制御される第１のバルブ付き導管５１および第２のバルブ付き導管６１である。
【００３０】
粒子状固定相材料の充填ベッドが、頂部フィルター層４と底部フィルター層４との間のベッド空間９を満たしている。固定相が好適にはカラムの上側端部片のところにあるアクセスバルブ５を介してスラリーの形態でベッド空間内に導入されるときに、充填ベッドが上述した「フローパッキング」方法によって形成され得る。余分な液体は、ベッド、フィルター層４、分散チャネル３４、導管３３を通過し、コネクタ８１を介して除去される（矢印Ｂ）。固定相はフィルター層４によって保持されることから、ベッドはこの処理全体を通して成長する。圧密およびその後の圧縮は、浸透力（すなわち、ベッドを通って濾される液体流れの流量を維持するのに必要な圧力勾配に対するベッドの反動）の影響下で行われる。成長するベッドは、非常に高い流量でスラリーを導入することによって大幅に圧縮される。充填流量を最適化することにより、充填ベッドのための所望の圧縮係数が得られる。流れによってベッドが圧縮され、所望の量の固定相がカラムに加えられると、スラリー流れは停止され、アクセスバルブ５が閉じられる。この方法は、この処理全体を通して端部プレート３が固定されたベッド高さ（目標のベッド高さ）のところにくるように上側端部プレート３を調節することを一切必要としない。
【００３１】
固定相のベッドを圧縮するための代替の方法は、アダプタまたは端部プレート３の軸方向の移動による機械的な軸方向の圧縮を加えることである。これは、カラムに取り付けられるまたはカラム内に組み込まれる電動機駆動装置または液圧システム（図１では図示しない）によって実現される。
【００３２】
カラムが充填されてバルブ装置５が閉じられた後、移動相が移動相用コネクタ８１を介して供給され（矢印Ａ）、導管３３を通過して分散チャネル３４に入りさらにフィルター層４を通過し、充填ベッド通って下方向に溶出し、それによりその成分または分析物の分離が実現される。しかるべき収集時には、溶出液（ｌｉｑｕｉｄ ｅｌｕａｔｅ）は、底端部組立体１３のフィルター層４を通過し、底端部組立体１３の移動相用コネクタ８１を通って外に出る（矢印Ｂ）。これは、クロマトグラフィ分離がカラムを通る移動相の下方向への移動によって実施されることから、「下降流」クロマトグラフィの一例であるが、別法として、単にポンプを使用して移動相がカラムを上方向に通過するようにして流れの方向を逆転させることにより、「上昇流」クロマトグラフィによっても分離が実現され得ることを当業者は理解するであろう。この形態の場合、移動相はコネクタ８１のところでカラムに入り（矢印Ｂ）、固定相または粒子状媒体を通って上方向に移動し、カラムの頂部のところにあるコネクタ８１（矢印Ａ）から収集される。
【００３３】
図１および上述の説明は、構成要素の一般的関係および典型的な形態の運用を例証したものである。当業者は、別の特定の構造および運用形態も異なる種類の処理に適する場合があることを理解するであろうが、このことは以下の記載より明らかとなる。
【００３４】
図２は本発明によるカラムの横断面図を示している。カラム１０１は、管状ハウジング１１１と、共にｏリング１０７／１０８によって液密シールを形成するように固定された第１の端部ユニット１１２（部分的に示した）および第２の端部ユニット１１３と、ヘッド１１６を有するテンションロッド１１４とを有する。第１のフィルター１０４および第２のフィルター１０６がそれぞれ第１の端部ユニット１１２および第２の端部ユニット１１３に隣接している。これらのフィルター１０４、１０６は、側壁１１１と共に、粒子状媒体のベッドを収容するためのベッド空間１０９を画定している。
【００３５】
ハウジング１１１および端部ユニット１１２、１１３は、通常、ステンレス鋼またはポリプロピレンなどの高強度プラスチック材料から構成される。好適な実施形態では、カラムが生物活性物質の分離に使用される場合、米国薬方局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ（ＵＳＰ））＜８８＞ｃｌａｓｓ ＶＩに従って、人の免疫応答を誘発することがないように、材料は生物学的に不活性のものとなる。ヘッド１１６を備えるテンションロッド１１４は端部ユニット１１２、１１３をハウジング１１１に固定し、高い操作圧力に耐えることができる液密ベッド空間１０９が形成される。
【００３６】
フィルター１０４、１０６は、各々、端部ユニット１１２、１１３の内部面上に位置されており、ベッド空間を画定して（側壁１１１と共に）ベッド空間１０９からの粒子状媒体の漏れを防止する働きをする。端部ユニット１１２および１１３は（その結果、それらに隣接している第１のフィルター１０４および第２のフィルター１０６も）、互いに対して軸方向に移動可能である。図２では、端部ユニット１１２はハウジング１１内で第２の端部ユニット１１３に対して軸方向に移動可能であるが、これらの端部ユニットの一方または両方が（その結果、フィルター１０４、１０６も）互いに対して軸方向に移動可能であるような別の実施形態も可能であることを理解されたい。
【００３７】
ベッド空間１０９には、最初に、第１のフィルター１０４と第２のフィルター１０６との間の距離が目標のベッド高さを超えるように第１の端部ユニット１１２の高さ調節することにより粒子状媒体のベッドが充填される。この状態では、固定ロッド１１４およびヘッド１１６はカラムに取り付けられていない。端部ユニット間の距離は外部駆動装置または圧縮フレーム（図示せず）によって固定される。次いで、粒子状媒体のスラリーまたは懸濁液が、中央孔１２１およびノズル１２４を有するバルブ手段１２０を介してカラム内に導入される。懸濁液がベッド空間１０９に加えられるのと同時に、ポート１４０を介してベッド空間１０９から余分な液体を除去して、粒子状媒体の安定したベッドを作り出すことができる。所望の量の固定相が導入された後、バルブ手段１２０およびノズル１２４を閉じられる。その後、安定したベッドは、外部駆動装置または圧縮フレーム（図示せず）によって実行される端部ユニット１１２およびフィルター１０４の軸方向の移動によって圧縮され、目標のベッド高さが得られる。一体化部品ではなくカラム構造体でもない外部駆動装置は、所望される目標ベッド高さを得るために手動でまたはソフトウェア手段によって制御されてよい。その後、端部ユニットはそれぞれ固定ロッド（１１４）およびヘッド（１１６）の助けによって互いに対して固定され、次いでカラムが外部駆動装置または圧縮フレームから取り外される。
【００３８】
図２では、ノズル１２４が、ベッド空間１０９に露出される充填位置にある状態で示されているが、ノズル１２４はカラムの詰込後に頂端部プレート１１２内の閉位置まで引き戻され得ることを理解されたい。ノズル１２４およびバルブ手段１２０は、拘束装置（図示せず）によって開位置または閉位置のどちらか一方に拘束される。ベッド空間内へのスラリーの分散さらには充填を促進するような多様なノズルが使用され得る。充填バルブおよび充填ノズルでの開閉機能を実現するための１つの代替形態は、ベッド空間内に固定されている（したがって、引き戻し可能ではない）ノズルを備えることであり、このノズルは、その位置に応じてノズルを開くおよび／または閉じるノズルの内側または外側にある移動可能要素またはスリーブに隣接して位置される。
【００３９】
カラム上で分離するための１つまたは複数の分析物または物質を含有する移動相または液体が第１のポート１３３を介して加えられる。次いで、液体は第１のフィルター１０４を通過し、上述したように粒子状媒体で充填されたベッド空間１０９に入る。このように粒子状媒体上へと導入された分析物（複数可）のクロマトグラフィ分離は、移動相の導入および移動相の溶出によって実施される。最後に、移動相は、第２のフィルター１０６を通過し、第２のポート１４０を介してカラムから出る。その後、異なる分析物を含有する移動相の得られるフラクションを収集できる。
【００４０】
このカラムは、上述した「下降流」モード、または、移動相がカラムを上方へと移動するように移動相の流れ方向が逆転された「上昇流」モードのいずれか一方で運用されてよいことを当業者は理解するであろう。上昇流モードでは、移動相は第２のポート１４０を介してカラムに入り、ベッド空間１０９内の粒子状媒体のベッドを通って上方へ移動し、収集されるために第１のポート１３３のところでカラムから出る。
【００４１】
図３は本発明によるカラムの横断面図である。このカラムは図２のカラムに類似しており、多くの特徴が図２において説明した特徴と同一である。したがって、このカラムは、粒子状媒体の懸濁液をベッド空間２０９内に加えるためのバルブ手段２２０と、移動相の付加または収集のための第１のポート２３３とを有している。しかし、このカラムは、第２の端部ユニット２１３を通ってベッド空間２０９まで（中空部材２６０を介して）流体連通して延在している通路２４２を含む第２のポート２４０を有しており、そこから流体が付加または収集されるという点で、上述した実施形態とは異なる。図から明らかなように、第２のポート２４０は第１のポート２３３と基本的に同じレベルすなわち高さにあることから、カラムに移動相を加えたりカラムから移動相を収集したりするのを容易にしている。この構成は、カラムの設置を補助し、吸引（ｓｉｐｈｏｎｉｎｇ）の危険性を軽減し、カラム内に空気が入る可能性を低下させるという別の利点を有する。
【００４２】
この構成部品の構成は図２で説明した構成とは異なる。カラム２０１は、管状ハウジング２１１、共にｏリング２０７／２０８によって液密シールを形成するように固定された第１の端部ユニット２１２（部分的に示した）および第２の端部ユニット２１３と、ヘッド２１６を有するテンションロッド２１４とを有する。第１のフィルター２０４および第２のフィルター２０６はそれぞれ第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３に隣接している。これらのフィルター２０４、２０６は、側壁２１１と共に、粒子状媒体のベッドを収容するためのベッド空間２０９を画定している。第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３は、手動でまたはソフトウェアの制御下で自動で作動され得る、アクチュエータ、プレスまたはフレームなどの外部駆動装置（図示せず）によって互いに対して軸方向に移動可能である。フィルター２０４、２０６は第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３に隣接しており、これらの端部ユニットと共に互いに対して軸方向に移動可能である。示した実施形態では、端部ユニット２１２および第１のフィルター２０４のみが第２の端部ユニット２１３およびフィルター２０６に対して軸方向に移動可能であるが、これらの端部ユニットおよびフィルターの一方の側または両方の側が他方側に対して軸方向に移動可能であるような別の実施形態も可能であることを理解されたい。
【００４３】
カラムは、図２に示した目標のベッド高さまで粒子状媒体のベッドで充填される。第１の端部ユニット２１２の高さは、第１のフィルター２０４と第２のフィルター２０６との間の距離が目標のベッド高さを超えるように外部駆動装置（図示せず）によって調節される。次いで、粒子状媒体のスラリーまたは懸濁液が、中央孔２２１およびノズル２２４を有するバルブ手段２２０を介してカラム内に導入される。余分な液体は通路２４２およびポート２４０を介してベッド空間２０９から除去されてよく、それにより粒子状媒体の安定したベッドが作られる。その後、安定したベッドは、外部駆動装置（図示せず）によって実行される端部ユニット２１２およびフィルター２０４の軸方向の移動によって圧縮され、目標のベッド高さが得られる。外部駆動装置は、所望される目標ベッド高さを得るために手動でまたはソフトウェア手段によって制御されてよい。その後、端部ユニットはそれぞれ固定ロッド（２１４）およびヘッド（２１６）の助けによって互いに対して固定される。
【００４４】
カラム上で分離するための１つまたは複数の分析物または物質を含有する移動相または液体が第１のポート２３３を介して加えられる。次いで、液体はフィルター２０４を通過し、上述したように粒子状媒体で充填されたベッド空間２０９に入る。このように粒子状媒体上へと導入された分析物（複数可）のクロマトグラフィ分離は、移動相の導入および移動相の溶出によって実施される。最後に、移動相は、第２のフィルター２０６を通過し、通路２４２を介して第２のポート２４０まで到達してカラムから出る。その後、異なる分析物を含有する移動相の得られるフラクションを収集できる。
【００４５】
このカラムは、上述した「下降流」モード、または、移動相がカラムを上方へと移動するように移動相の流れ方向が逆転された「上昇流」モードのいずれか一方で運用されてよいことを当業者は理解するであろう。上昇流モードでは、移動相は第２のポート２４０を介してカラムに入り、通路２４２に沿ってベッド空間２０９内の粒子状媒体のベッドを通って上方へ移動して、収集されるために第１のポート２３３のところでカラムから出る。
【００４６】
示した実施形態では、中空部材２６０は、カラムの一体化された部分である。しかし、適切な材料（例えば、ポリプロピレン、ポリウレタンなど）から作られたコネクタおよび適当な管材料を使用することで、中空部材２６０はカラムに一体化される必要がなくなることを理解されたい。
【００４７】
移動相の適用と収集とが単一の端部ユニット上の同じ高さのところで行われることにより使用形態が単純化され、オペレータのアクセスおよび取り扱いの点でみると、空気がシステムに侵入する危険性が軽減され、カラムを調節するのに必要となる空間が減少する。
【００４８】
図４は、カラムの外部特徴が明らかとされている、カラム径の大きい図３のカラムの三次元概略図である。このカラムは、圧縮ステップ時に移動可能である第１の端部ユニット３１７と、第２の端部ユニット３１８と、ハウジング３１１とを有しており、これらは、テンションロッド３１４およびヘッド３１６によって固定されて共に液密シールを形成している。スラリー形態の粒子状媒体がバルブ手段３２０を介してベッド空間（図示せず）に導入されてよい。第１のポート３３３は、粒子状媒体上で分離される分析物（複数可）を含有する移動相または液体用の導管として働く。カラムの基部にある出口（図示せず）を介してベッド空間と流体連通している中空部材３６０が第２のポート３４０内まで続いており、カラムから溶出される移動相の適当なフラクションがそこから収集され得る。示されるように、第２のポート３４０は第１のポート３３３と基本的に同じレベルすなわち高さにあり、移動相はそこを通って導入（収集）され得る。この構成により、使用者の操作および試料の取り扱いが容易になる。図４に示した実施形態では、カラムの容量は約１０リットルである。典型的には０．１リットルから２０００リットルの範囲である、広範囲のカラム容量が可能であることを理解されたい。このカラムを使い捨てカラムとして使用する場合、好ましい容量は０．５リットルから５０リットルの範囲である。
【００４９】
図５は、本発明による方法を使用して軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムの概略図である。このシステムは上記の図２で説明したカラム４０１を有する。このカラムは、第２の端部ユニット（図示せず）および第２のフィルター４０６に対する、カラムのベッド空間４０９内にある軸方向に移動可能な第１の端部ユニット（図示せず）および第１のフィルター（４０４）の高さをプラットホーム４７２および４７４を用いて調節することができる（圧縮フレームなどの）外部駆動手段４７０に接続されている。
【００５０】
初めに、カラムからのまたは少なくとも底部分散システムおよびフィルター層からの空気の除去を促進するために、このシステムには、出口バルブ４５０と流体連通しているポンプ４８５を介してコンテナ４８０から液体が注入される。余分な液体または空気は、カラム４０１の上側入口／出口ポートを介してカラムから除去されて、廃棄物４６０として外に出されることが可能である。圧力センサ４９０が、注入段階および／またはその後の充填段階におけるカラム内の圧力を監視する。
【００５１】
第１の端部ユニットおよびフィルター４０４は、初めは、第１のフィルター４０４と第２のフィルターＯ４０６との間の距離がベッド空間４０９内の目標のベッド高さの距離を超えるように位置Ｈ０（図では４７４Ｏとして示されている）のところに合わされている。その後、スラリーまたは懸濁液の形態のコンテナ４３０内の粒子状媒体が、ポンプ４３５による圧力下で入口バルブ４２０を通してカラムベッド空間４０９内に導入される。バルブ４３３を介した貯蔵部４３１からの充填用液体でコンテナ４３０をすすぐことにより、コンテナ４３０内に残っているいかなる残留スラリーもベッド空間４０９内へ洗い流すことができる。スラリーがベッド空間４０９内へと導入されると同時に、ベッド空間内に媒体の安定したベッドを作り出すために余分な液体が出口４４０を介して除去されてよい。この余分な液体は出口バルブ４５０を通過し、その後廃棄物４６０として放出される。圧密ステップの間、カラムベッド空間４０９内の圧力は、センサ４９０によって監視されており、多様な度合いの充填ベッドの予圧を得るためにポンプ４３５の流量を調節することによって調節され得る。
【００５２】
最後に、プラットホーム４７４を位置ＨＦ（図では４７４Ｆとして示される）まで下げて、第１のフィルター４０４を第２のフィルター４０６に対して軸方向に移動させることにより、ベッドを目標のベッド高さまで圧縮することが実現される。充填処理では、クロマトグラフィ媒体のタイプに応じて、フローパッキングによる予圧および軸方向の圧縮による最終的な圧縮を様々な度合いに制御することができる。上側端部ユニットを最終位置ＨＦまで下げた後、カラム端部ユニットは固定ロッドによって固定されてよく、カラムは圧縮フレームから取り外されてよい。
【００５３】
図５および上記の説明はカラムを充填する方法を例証したものである。ポンプ、容器およびセンサの別の構成も可能であることを当業者は理解するであろう。汚染微生物数の制御レベルに関する要求基準を満たしている使い捨てカラムまたは無菌状態で作られるカラムを充填する場合、バッグおよび管材料などの使い捨ての液体処理装置を使用することが好ましい。
【００５４】
図６は、下降流モード（実線）および上昇流モード（点線）の両方で運用された本発明による１０リットルカラムで行われたトレーサーパルス実験例によるクロマトグラフィ分離効率を示している。このカラムは、本発明の方法を使用して、８５μｍのアガロース粒子径のＣａｐｔｏ（商標）Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、スウェーデン、ウプサラ）のベッドで充填された。カラムは１０．８Ｌの容積、２６３ｍｍの直径、および、２００ｍｍのベッド高さを有する。トレーサー物質としてアセトン（充填ベッド容積の１％）を使用し、移動相として水を用いてアセトンをカラムから溶出させ、吸収度を２８０ｎｍで監視した。下の表１から分かるように、下降流モード（実線）および上昇流モード（点線）のいずれにおいても、８５μｍのアガロース媒体を用いて優れたカラム効率が観測された。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１のデータは、以下に記載した方法で図６のクロマトグラムから得られたものである。
【００５７】
カラム効率の測定値として、低減されたプレート高さが、図７に示すように、溶出ピークの高さの半分のところのピーク幅Ｗｈを使用して決定される。この手順は、ガウス形状のピークに対して有効である近似である。実際に、溶出ピークは理想的なガウス形状から得られることが多く、ピークのひずみ度（ｐｅａｋ ｓｋｅｗｎｅｓｓ）はいわゆる非対称因子Ａｆによって定性的に説明される。ここで、ＲＴＤの「リーディング」は１未満のＡｆによって示され、「テイリング」は１を超えるＡｆによって示される。非対称因子に対して一般に適用される合格基準は０．８＜Ａｆ＜１．５〜１．８であり、これは用途タイプによって決まる。
【００５８】
【数１】
【００５９】
Ａｆ＝ｂ／ａ （図７参照）
Ａｆ 非対称因子
ｄｐ 粒子径
ｈ 低減されたプレート高さ
ＨＥＴＰ 理論段に相当する高さ
Ｌ ベッド高さ、充填ベッド
ｕｓ 充填ベッドの空塔速度
ＶＲ 保持容量
ｗｈ 最大ピーク高さの５０％のところのピーク幅
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィ媒体でクロマトグラフィカラムを充填するためのシステムおよびそのようなカラムで使用するための充填方法に関する。より具体的には、本発明は、クロマトグラフィカラム内へのクロマトグラフィ媒体の充填を改良するための充填システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィで使用されるカラムは、通常、キャリア液が流通している多孔質のクロマトグラフィ媒体を囲んでいる管状体を有しており、キャリア液と多孔質媒体の固相との間での物質捕集によって分離が行われる。あらゆる分離処理の前に、ベッドは、カラムに導入される必要があるスラリーの粒子状物質が最初に用意される必要がある。ベッド形成の過程は「充填処置（ｐａｃｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」といわれ、適正に充填されたベッドは、充填ベッドを収容するカラムの性能を左右する重要な要因となる。充填処置の目標は、最適圧縮量（最適圧縮率）で圧縮されたベッドを得ることである。
【０００３】
詳細には、多孔質媒体は、通常は一方の端部からコラム内へとポンプ輸送、注入または吸引される、「スラリー」として知られている離散粒子の懸濁液を圧密することによって形成される。充填ベッドへのスラリーの圧密は、通常、スラリーを粒子保持フィルターでろ過し、さらに形成されたろ過ケークを圧縮することによって実現され、その結果、スラリーが重力のみの作用下で沈殿して沈殿ベッドを形成する場合に占める体積より小さい体積で充填される。圧縮の程度はクロマトグラフィ媒体のタイプに依存するが、通常は２％から２０％の間である。その後のクロマトグラフィ分離の効率は、充填ベッドの液体入口および出口のところにある液体分配・収集システムによって決まるが、主に、形成された充填ベッドの均質性および安定性によって決まる。充填ベッドが均質でなく安定していない場合、ベッドで行われるクロマトグラフィ分離に有害作用を及ぼす。充填ベッドの均質性および安定性は、各々のカラムサイズ（幅または直径）、ベッド高さおよびベッド媒体に対して経験的に決定されなければならない最適な圧縮の度合いに依存する。カラムを充填するためのいくつかの方法が知られている（例えば米国特許出願公開第２００３／０１４６１５９号明細書を参照されたい）。「フローパッキング（ｆｌｏｗ ｐａｃｋｉｎｇ）」は、分析カラム（すなわち、カラム直径が約１〜１０ｍｍのカラム）、半調製カラム（すなわち、カラム直径が１０〜１００ｍｍのカラム）のまたはさらに大きいカラムの分離に通常利用される方法である。フローパッキングでは、カラムの一方の端部がフリットまたはフィルターで閉じられている。他方の端部では、充填物のスラリーまたは懸濁液がカラムチューブ内へポンプ輸送または注入される。ろ過ベッドがフリットのところに構築され、これはろ過ケークが形成されるまで成長する。その後、ベッドは、動作中に使用される流量を超える流量で複数（約３〜１０）のカラム体積の充填用溶媒を濾すことにより、その「目標のベッド高さ」までさらに圧縮される。圧密およびその後の圧縮は、ベッドを通って濾される液体流れの流量を維持するのに必要な圧力勾配に対するベッドの反動である浸透力の影響下で行われる。流れによってベッドが圧縮されると、流れは停止され、カラムの底部にある出口が閉じられ、アダプタまたは上側端部セルが圧縮ベッドの目標高さに調節される。この調節は、圧縮ベッドの弛緩が目標ベッド高さを超えるのを回避するために迅速に行われる。
【０００４】
このフローパッキング方法には、このように圧縮される充填物のベッドが流れ圧縮（ｆｌｏｗ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）ステップの間において軸方向で不均質になり、カラムの出口の近傍で圧縮が最も大きくなり、充填ベッドの頂部のところではゼロ圧縮となってしまう、という欠点がある。それにより、充填用の流れが停止されて上側端部セルが所定の位置に移動させられた後でベッドが大きく弛緩してしまい、粒子状物質を再配置しなければならない場合がある。この方法に伴うベッド圧縮の変動により、媒体のタイプおよび充填ベッドの幾何構造によってはベッドの安定性およびカラムの効率が不十分になる場合がある。
【０００５】
フローパッキングの標準的な方法は、分取クロマトグラフィで使用される大孔径カラムに適していない場合がある。とりわけ、ある充填流量を加えること、したがってそれ以降の作業で必要となる圧力よりも実質的に大きな充填圧力を加えることを必要とする装置を設計することは、しばしば望ましくない。この問題に対処するために、機械的に軸方向に圧縮することに依拠した充填方法が使用される。軸方向に圧縮する方法では、アダプタ（端部セル）の軸方向の運動によってベッドの圧縮が実現される。これにより、充填中におけるカラム空間での高い液圧の必要性が取り除かれる。軸方向に圧縮する方法の別の利点は、ベッドが軸方向に均等に圧縮されことにより、フローパッキング方法で発生する弛緩および粒子の再配置の問題が回避されることである。
【０００６】
ベッド圧縮およびベッド空隙率の径方向における変動は記載した両方の方法で発生するが、これは壁面摩擦作用に起因する。径方向の不均質性による影響は、ベッドの幾何形状すなわち直径と高さの比によって決まる。上述したように、軸方向における圧縮およびベッド空隙率の変動は、フローパッキング方法と軸方向に圧縮する方法とでは実質的に異なる。
【０００７】
軸方向に圧縮することの欠点は、この方法を使用して充填されるカラムが、端部セルを移動させるための手段とこの移動を制御するための手段とを必要とすることである。移動のための典型的な方法は電動機駆動装置または液圧システムである。これらはカラムに装着されるまたはカラムに取り付けられるように構築されることから、軸方向に圧縮するカラムのコストおよび機械的複雑さはフローパッキングカラムより実質的に増大される。
【０００８】
あらゆる圧密および圧縮に先んじて、媒体はカラムに導入される必要がある。大型のカラムは、好適には、スラリーを中央スラリーノズルまたは中央スラリーバルブを通してカラムに注入することによって用意される。これにより、衛生上の理由で好適である閉じられたシステムによるアプローチが可能となる。スラリーバルブ設計をベースとしたカラムは、移動式アダプタを使用する軸方向圧縮パッキング用または固定式端部セルを使用するフローパッキング用に設計され得る。
定義
「分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）」は、天然起源または合成起源の物質、化合物または化学物質として、あるいは、それらの反応生成物または誘導体または代謝物質として定義される。不正確さを回避するために、この用語は、タンパク質、ペプチド類、アミノ酸類および核酸などの生物学的分子、ならびに、薬物および／またはプロドラッグなどの合成分子を含む。
【０００９】
「媒体（ｍｅｄｉｕｍ）」は、その中でクロマトグラフィ分離が起こっている任意の物質として定義される。媒体の例には、イオン交換クロマトグラフィ分離、サイズ排除クロマトグラフィ分離、アフィニティクロマトグラフィ分離（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、および、逆相クロマトグラフィ分離を引き起こす物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
「使い捨て」カラムは、非使い捨てカラムの場合に必要となる設置作業および修正／確認作業を軽減するためのクロマトグラフィ媒体の前処理を特徴とする。少なくとも、前処理には多孔質媒体のベッドの形成が含まれる。追加の前処理は、汚染微生物数の低減、消毒、発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）などであってよい。
【００１１】
使い捨てカラムはシングルユースカラムとして使用されてよく、これは、反復使用の前に充填ベッドの修正（例えば、試験、確認など）を必要とするクリーニング・レジメ（ｃｌｅａｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅ）を使用者が実施しないことを意味する。
【００１２】
使い捨てカラムの一実施形態は、クロマトグラフィ媒体で予め充填された状態で搬送される完成されたカラムである。
【００１３】
使い捨てカラムの別の実施形態は、運用中に充填ベッドの１つまたは複数の横方向表面に作用する圧力および荷重に抵抗して充填ベッドに寸法安定性をもたらすように設計されたフレームまたは容器に相当する第１の装置と、多孔質媒体またはベッドを収容するコンテナ、シェル、カートリッジまたはバッグなどに相当する、運用中においては第１の装置に取り付けられる第２の装置とから構成される。後者の実施形態では、多孔質媒体は二次コンテナ内に収容されて取り替えることができるが、フレームは再使用可能である。この場合、運用に必要となる多孔質媒体の圧縮の度合いは、収容されている媒体をフレーム内に挿入した後で調節され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１６６８１６号明細書および国際公開第２００５／００９５８５号を参照されたい）。
【００１４】
「カラムに一体化されておらずかつその外部にある駆動手段」とは、カラムを充填するときのみ使用され、カラムの動作中ではカラムから取り除かれるまたは取り外される、分離式の実在物である駆動手段を意味する。したがって、エンドユーザがカラムを運用するとき、この駆動手段はなく、カラムにも取り付けられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、従来技術の方法の欠点を克服する充填方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の主な利点は、軸方向に圧縮する方法によって充填ベッドが用意されることにより、軸方向圧縮カラムに対して従来の解決策で必要とされるようなカラム構造の高い機械的複雑さを必要とすることなく、ベッドの向上した安定性および高いカラム効率が得られることである。これにより大幅なコスト削減が可能となる。
【００１７】
本発明の方法の別の利点は、圧縮が、流れ圧縮（ｆｌｏｗ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）で必要とされるような高圧力ではなく、圧縮フレームなどの外付け駆動手段によって主として実現されることから、本発明の方法が低圧流体処理装置（例えば、蠕動ポンプ）と適合性を有していることである。
【００１８】
本発明の方法の別の利点は、カラムの充填／詰込（ｆｉｌｌｉｎｇ）が閉じられたシステムとして実行され得ることであり、これは、カラムが、予め滅菌処理されたカラムおよび予め滅菌処理されたクロマトグラフィ媒体から始まる無菌状態下で詰込／充填することさえできるということも意味する。したがって、この方法は、「すぐに処理することができる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓ）」カラムまたは「使い捨て」カラムに使用され得る。
【００１９】
さらに別の利点は、クロマトグラフィカラムが拡大縮小可能であることである（すなわち、カラムサイズを増大または縮小させることにより予測可能な性能が得られる）。これは、スラリーノズルを介したカラムの詰込が高いアダプタ位置のところでの軸方向の圧縮ステップの前に行われることに起因する。これにより、固定式端部セルを使用するように設計されたカラムをベースとした、ノズルを用いたフローパッキングと比較して、カラムの断面積全体にわたってスラリーを均質に分散させることが可能となる（例えば、米国特許第６，５２４，４８４号明細書を参照されたい）。フローパッキングの場合、充填は、目標のベッド高さである一定のベッド高さのところで行われる必要があり、それにより、充填ベッドの密度および圧縮がそれぞれ径方向において変動してしまう可能性がある。
【００２０】
本発明の方法の別の利点は、ベッド形成の開始の前にすべてのスラリーが導入される必要があるわけではないことから、カラムが従来技術の軸方向圧縮カラムと同じくらいの長さである必要がないことである。
【００２１】
本発明の別の利点は、既知の方法を使用したシステムと比較して必要となるアダプタ（端部ユニット）の行程が最小になり、それにより小型の構造が可能となることである。
【００２２】
本発明に第１の態様によると、目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドを備える軸方向流れクロマトグラフィカラム（ａｘｉａｌ ｆｌｏｗ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を充填する方法が提供される。
【００２３】
このカラムは、
長尺管状側壁を有するハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１のユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２のユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によってベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと、
を有し、
前記第１の端部ユニットが、前記粒子状媒体で前記ベッド空間を満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有し、
前記方法が、
ｉ．前記第１のフィルターと前記第２のフィルターとの間の軸方向の間隔を、目標のベッド高さの距離を超える距離に調節するステップと、
ｉｉ．中に粒子状媒体のベッドを形成するために、前記第１のバルブ手段を介して前記粒子状媒体の懸濁液を前記ベッド空間へ導入するステップと、
ｉｉｉ．前記目標のベッド高さを得るために、前記第１および／または第２の端部フィルターの軸方向の移動により前記粒子状媒体のベッドを圧縮するステップと
を含み、
ステップｉｉｉ）が、前記カラムに一体化されておらずかつその外部にある前記駆動手段によって実現される、ことを特徴とする。
【００２４】
本発明の第２の態様によると、目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドを備える軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムが提供される。このシステムは、
ｉ．長尺管状側壁を含むハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたヘッド空間を画定する、前記第１の端部ユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２の端部ユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと
を有するカラムにおいて、
前記第１の端部ユニットが、前記ベッド空間を前記粒子状媒体で満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有する、
カラム、ならびに、
ｉｉ．前記カラムに一体化されておらずかつその外部にあることを特徴とする駆動手段、
を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】基本的な特徴を示した、従来技術のクロマトグラフィカラムの概略横断面図である。
【図２】三次元で概略的に示した、本発明による方法を使用して充填され得るクロマトグラフィカラムの横断面図である。
【図３】三次元で概略的に示した、本発明による方法を使用して充填され得るクロマトグラフィカラムの別の実施形態の横断面図である。
【図４】本発明による方法を使用して充填されるクロマトグラフィカラムの三次元概略図である。
【図５】本発明による方法を使用して軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムの概略図である。
【図６】上昇流モード（点線）および下降流モード（実線）の両方における、本発明に従って充填されたクロマトグラフィカラムでのアセトンのクロマトグラフィ分離を示したクロマトグラムである。
【図７】減少したプレート高さおよび非対称因子を溶出ピークから計算する方法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１は、従来技術で知られているクロマトグラフィカラム１の一般的な構成要素を概略的に示している（例えば、米国特許第６，５２４，４８４号明細書を参照されたい）。このカラムは、例えば、ステンレス鋼の、または、半透明であってよい高強度／強化ポリマー材料の流体不透過性円筒形側壁１１を有する。側壁１１の開いた頂端部および底端部は、頂端部組立体またはユニット１２および底端部組立体またはユニット１３によって閉じられる。各端部ユニットは、ステンレス鋼、または、例えばポリプロピレンといった高強度エンジニアリングプラスチック材料で好適には作られる、円筒壁１１の開口部を塞ぐように封止的に嵌合される流体不透過性端部プレート３を有する。端部プレートは、端部プレートの外側表面を受け止めておりかつ側壁を越えて径方向に延在してフランジ２２を保持している状態に金属プレート２を維持することによって支持される。フランジ２２には調節可能テンションロッド１４が貫通して固定されている。これらは頂部組立体１２と底部組立体１３とを連結し、この構造体が高い流体圧力に耐えるのを助ける。
【００２７】
各端部プレート３は、カラムの外側と側壁１１および端部組立体１２、１３によって画定される充填ベッド空間９と連通させるための中央貫通開口部３１を有する。開口部３１を介しての侵入路は、接続マニホルド８を介して外部に接続される分離した導管に細分化される。
【００２８】
通常はフィルター付きまたは織られたプラスチックまたは鋼であるフィルター層４が、端部プレート３の内側表面のところでベッド空間９の領域全体に延在している。端部プレート３の内側表面３５は、フィルター層４と内側表面３５との間に分散チャネル３４を画定するために、フィルター層４の裏側で例えば図に示したように円錐形に窪んでおり、好適には支持リブ（図示せず）を使用してフィルター層４を裏側から支持している。移動相用導管３３である連絡導管の１つは、この分散チャネル３４に入るように内部へ開いており、同時に、マニホルド８の移動相用接続部８１に向かって外部に開いている。
【００２９】
マニホルド８から、アクセスバルブ装置５が端部プレート開口部３１を通って内側に突出しており、さらにフィルター層４の中央オリフィス４１を封止的に通っている。アクセスバルブ５は、マニホルド８からの１つまたは複数の導管のベッド空間９への直接、すなわちフィルター層４を迂回する連絡を制御する。ここに示したのは、マニホルド８のコネクタ８２を介して外部に接続されている、バルブ５によって制御される第１のバルブ付き導管５１および第２のバルブ付き導管６１である。
【００３０】
粒子状固定相材料の充填ベッドが、頂部フィルター層４と底部フィルター層４との間のベッド空間９を満たしている。固定相が好適にはカラムの上側端部片のところにあるアクセスバルブ５を介してスラリーの形態でベッド空間内に導入されるときに、充填ベッドが上述した「フローパッキング」方法によって形成され得る。余分な液体は、ベッド、フィルター層４、分散チャネル３４、導管３３を通過し、コネクタ８１を介して除去される（矢印Ｂ）。固定相はフィルター層４によって保持されることから、ベッドはこの処理全体を通して成長する。圧密およびその後の圧縮は、浸透力（すなわち、ベッドを通って濾される液体流れの流量を維持するのに必要な圧力勾配に対するベッドの反動）の影響下で行われる。成長するベッドは、非常に高い流量でスラリーを導入することによって大幅に圧縮される。充填流量を最適化することにより、充填ベッドのための所望の圧縮係数が得られる。流れによってベッドが圧縮され、所望の量の固定相がカラムに加えられると、スラリー流れは停止され、アクセスバルブ５が閉じられる。この方法は、この処理全体を通して端部プレート３が固定されたベッド高さ（目標のベッド高さ）のところにくるように上側端部プレート３を調節することを一切必要としない。
【００３１】
固定相のベッドを圧縮するための代替の方法は、アダプタまたは端部プレート３の軸方向の移動による機械的な軸方向の圧縮を加えることである。これは、カラムに取り付けられるまたはカラム内に組み込まれる電動機駆動装置または液圧システム（図１では図示しない）によって実現される。
【００３２】
カラムが充填されてバルブ装置５が閉じられた後、移動相が移動相用コネクタ８１を介して供給され（矢印Ａ）、導管３３を通過して分散チャネル３４に入りさらにフィルター層４を通過し、充填ベッド通って下方向に溶出し、それによりその成分または分析物の分離が実現される。しかるべき収集時には、溶出液（ｌｉｑｕｉｄ ｅｌｕａｔｅ）は、底端部組立体１３のフィルター層４を通過し、底端部組立体１３の移動相用コネクタ８１を通って外に出る（矢印Ｂ）。これは、クロマトグラフィ分離がカラムを通る移動相の下方向への移動によって実施されることから、「下降流」クロマトグラフィの一例であるが、別法として、単にポンプを使用して移動相がカラムを上方向に通過するようにして流れの方向を逆転させることにより、「上昇流」クロマトグラフィによっても分離が実現され得ることを当業者は理解するであろう。この形態の場合、移動相はコネクタ８１のところでカラムに入り（矢印Ｂ）、固定相または粒子状媒体を通って上方向に移動し、カラムの頂部のところにあるコネクタ８１（矢印Ａ）から収集される。
【００３３】
図１および上述の説明は、構成要素の一般的関係および典型的な形態の運用を例証したものである。当業者は、別の特定の構造および運用形態も異なる種類の処理に適する場合があることを理解するであろうが、このことは以下の記載より明らかとなる。
【００３４】
図２は本発明によるカラムの横断面図を示している。カラム１０１は、管状ハウジング１１１と、共にｏリング１０７／１０８によって液密シールを形成するように固定された第１の端部ユニット１１２（部分的に示した）および第２の端部ユニット１１３と、ヘッド１１６を有するテンションロッド１１４とを有する。第１のフィルター１０４および第２のフィルター１０６がそれぞれ第１の端部ユニット１１２および第２の端部ユニット１１３に隣接している。これらのフィルター１０４、１０６は、側壁１１１と共に、粒子状媒体のベッドを収容するためのベッド空間１０９を画定している。
【００３５】
ハウジング１１１および端部ユニット１１２、１１３は、通常、ステンレス鋼またはポリプロピレンなどの高強度プラスチック材料から構成される。好適な実施形態では、カラムが生物活性物質の分離に使用される場合、米国薬方局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ（ＵＳＰ））＜８８＞ｃｌａｓｓ ＶＩに従って、人の免疫応答を誘発することがないように、材料は生物学的に不活性のものとなる。ヘッド１１６を備えるテンションロッド１１４は端部ユニット１１２、１１３をハウジング１１１に固定し、高い操作圧力に耐えることができる液密ベッド空間１０９が形成される。
【００３６】
フィルター１０４、１０６は、各々、端部ユニット１１２、１１３の内部面上に位置されており、ベッド空間を画定して（側壁１１１と共に）ベッド空間１０９からの粒子状媒体の漏れを防止する働きをする。端部ユニット１１２および１１３は（その結果、それらに隣接している第１のフィルター１０４および第２のフィルター１０６も）、互いに対して軸方向に移動可能である。図２では、端部ユニット１１２はハウジング１１内で第２の端部ユニット１１３に対して軸方向に移動可能であるが、これらの端部ユニットの一方または両方が（その結果、フィルター１０４、１０６も）互いに対して軸方向に移動可能であるような別の実施形態も可能であることを理解されたい。
【００３７】
ベッド空間１０９には、最初に、第１のフィルター１０４と第２のフィルター１０６との間の距離が目標のベッド高さを超えるように第１の端部ユニット１１２の高さ調節することにより粒子状媒体のベッドが充填される。この状態では、固定ロッド１１４およびヘッド１１６はカラムに取り付けられていない。端部ユニット間の距離は外部駆動装置または圧縮フレーム（図示せず）によって固定される。次いで、粒子状媒体のスラリーまたは懸濁液が、中央孔１２１およびノズル１２４を有するバルブ手段１２０を介してカラム内に導入される。懸濁液がベッド空間１０９に加えられるのと同時に、ポート１４０を介してベッド空間１０９から余分な液体を除去して、粒子状媒体の安定したベッドを作り出すことができる。所望の量の固定相が導入された後、バルブ手段１２０およびノズル１２４を閉じられる。その後、安定したベッドは、外部駆動装置または圧縮フレーム（図示せず）によって実行される端部ユニット１１２およびフィルター１０４の軸方向の移動によって圧縮され、目標のベッド高さが得られる。一体化部品ではなくカラム構造体でもない外部駆動装置は、所望される目標ベッド高さを得るために手動でまたはソフトウェア手段によって制御されてよい。その後、端部ユニットはそれぞれ固定ロッド（１１４）およびヘッド（１１６）の助けによって互いに対して固定され、次いでカラムが外部駆動装置または圧縮フレームから取り外される。
【００３８】
図２では、ノズル１２４が、ベッド空間１０９に露出される充填位置にある状態で示されているが、ノズル１２４はカラムの詰込後に頂端部プレート１１２内の閉位置まで引き戻され得ることを理解されたい。ノズル１２４およびバルブ手段１２０は、拘束装置（図示せず）によって開位置または閉位置のどちらか一方に拘束される。ベッド空間内へのスラリーの分散さらには充填を促進するような多様なノズルが使用され得る。充填バルブおよび充填ノズルでの開閉機能を実現するための１つの代替形態は、ベッド空間内に固定されている（したがって、引き戻し可能ではない）ノズルを備えることであり、このノズルは、その位置に応じてノズルを開くおよび／または閉じるノズルの内側または外側にある移動可能要素またはスリーブに隣接して位置される。
【００３９】
カラム上で分離するための１つまたは複数の分析物または物質を含有する移動相または液体が第１のポート１３３を介して加えられる。次いで、液体は第１のフィルター１０４を通過し、上述したように粒子状媒体で充填されたベッド空間１０９に入る。このように粒子状媒体上へと導入された分析物（複数可）のクロマトグラフィ分離は、移動相の導入および移動相の溶出によって実施される。最後に、移動相は、第２のフィルター１０６を通過し、第２のポート１４０を介してカラムから出る。その後、異なる分析物を含有する移動相の得られるフラクションを収集できる。
【００４０】
このカラムは、上述した「下降流」モード、または、移動相がカラムを上方へと移動するように移動相の流れ方向が逆転された「上昇流」モードのいずれか一方で運用されてよいことを当業者は理解するであろう。上昇流モードでは、移動相は第２のポート１４０を介してカラムに入り、ベッド空間１０９内の粒子状媒体のベッドを通って上方へ移動し、収集されるために第１のポート１３３のところでカラムから出る。
【００４１】
図３は本発明によるカラムの横断面図である。このカラムは図２のカラムに類似しており、多くの特徴が図２において説明した特徴と同一である。したがって、このカラムは、粒子状媒体の懸濁液をベッド空間２０９内に加えるためのバルブ手段２２０と、移動相の付加または収集のための第１のポート２３３とを有している。しかし、このカラムは、第２の端部ユニット２１３を通ってベッド空間２０９まで（中空部材２６０を介して）流体連通して延在している通路２４２を含む第２のポート２４０を有しており、そこから流体が付加または収集されるという点で、上述した実施形態とは異なる。図から明らかなように、第２のポート２４０は第１のポート２３３と基本的に同じレベルすなわち高さにあることから、カラムに移動相を加えたりカラムから移動相を収集したりするのを容易にしている。この構成は、カラムの設置を補助し、吸引（ｓｉｐｈｏｎｉｎｇ）の危険性を軽減し、カラム内に空気が入る可能性を低下させるという別の利点を有する。
【００４２】
この構成部品の構成は図２で説明した構成とは異なる。カラム２０１は、管状ハウジング２１１、共にｏリング２０７／２０８によって液密シールを形成するように固定された第１の端部ユニット２１２（部分的に示した）および第２の端部ユニット２１３と、ヘッド２１６を有するテンションロッド２１４とを有する。第１のフィルター２０４および第２のフィルター２０６はそれぞれ第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３に隣接している。これらのフィルター２０４、２０６は、側壁２１１と共に、粒子状媒体のベッドを収容するためのベッド空間２０９を画定している。第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３は、手動でまたはソフトウェアの制御下で自動で作動され得る、アクチュエータ、プレスまたはフレームなどの外部駆動装置（図示せず）によって互いに対して軸方向に移動可能である。フィルター２０４、２０６は第１の端部ユニット２１２および第２の端部ユニット２１３に隣接しており、これらの端部ユニットと共に互いに対して軸方向に移動可能である。示した実施形態では、端部ユニット２１２および第１のフィルター２０４のみが第２の端部ユニット２１３およびフィルター２０６に対して軸方向に移動可能であるが、これらの端部ユニットおよびフィルターの一方の側または両方の側が他方側に対して軸方向に移動可能であるような別の実施形態も可能であることを理解されたい。
【００４３】
カラムは、図２に示した目標のベッド高さまで粒子状媒体のベッドで充填される。第１の端部ユニット２１２の高さは、第１のフィルター２０４と第２のフィルター２０６との間の距離が目標のベッド高さを超えるように外部駆動装置（図示せず）によって調節される。次いで、粒子状媒体のスラリーまたは懸濁液が、中央孔２２１およびノズル２２４を有するバルブ手段２２０を介してカラム内に導入される。余分な液体は通路２４２およびポート２４０を介してベッド空間２０９から除去されてよく、それにより粒子状媒体の安定したベッドが作られる。その後、安定したベッドは、外部駆動装置（図示せず）によって実行される端部ユニット２１２およびフィルター２０４の軸方向の移動によって圧縮され、目標のベッド高さが得られる。外部駆動装置は、所望される目標ベッド高さを得るために手動でまたはソフトウェア手段によって制御されてよい。その後、端部ユニットはそれぞれ固定ロッド（２１４）およびヘッド（２１６）の助けによって互いに対して固定される。
【００４４】
カラム上で分離するための１つまたは複数の分析物または物質を含有する移動相または液体が第１のポート２３３を介して加えられる。次いで、液体はフィルター２０４を通過し、上述したように粒子状媒体で充填されたベッド空間２０９に入る。このように粒子状媒体上へと導入された分析物（複数可）のクロマトグラフィ分離は、移動相の導入および移動相の溶出によって実施される。最後に、移動相は、第２のフィルター２０６を通過し、通路２４２を介して第２のポート２４０まで到達してカラムから出る。その後、異なる分析物を含有する移動相の得られるフラクションを収集できる。
【００４５】
このカラムは、上述した「下降流」モード、または、移動相がカラムを上方へと移動するように移動相の流れ方向が逆転された「上昇流」モードのいずれか一方で運用されてよいことを当業者は理解するであろう。上昇流モードでは、移動相は第２のポート２４０を介してカラムに入り、通路２４２に沿ってベッド空間２０９内の粒子状媒体のベッドを通って上方へ移動して、収集されるために第１のポート２３３のところでカラムから出る。
【００４６】
示した実施形態では、中空部材２６０は、カラムの一体化された部分である。しかし、適切な材料（例えば、ポリプロピレン、ポリウレタンなど）から作られたコネクタおよび適当な管材料を使用することで、中空部材２６０はカラムに一体化される必要がなくなることを理解されたい。
【００４７】
移動相の適用と収集とが単一の端部ユニット上の同じ高さのところで行われることにより使用形態が単純化され、オペレータのアクセスおよび取り扱いの点でみると、空気がシステムに侵入する危険性が軽減され、カラムを調節するのに必要となる空間が減少する。
【００４８】
図４は、カラムの外部特徴が明らかとされている、カラム径の大きい図３のカラムの三次元概略図である。このカラムは、圧縮ステップ時に移動可能である第１の端部ユニット３１７と、第２の端部ユニット３１８と、ハウジング３１１とを有しており、これらは、テンションロッド３１４およびヘッド３１６によって固定されて共に液密シールを形成している。スラリー形態の粒子状媒体がバルブ手段３２０を介してベッド空間（図示せず）に導入されてよい。第１のポート３３３は、粒子状媒体上で分離される分析物（複数可）を含有する移動相または液体用の導管として働く。カラムの基部にある出口（図示せず）を介してベッド空間と流体連通している中空部材３６０が第２のポート３４０内まで続いており、カラムから溶出される移動相の適当なフラクションがそこから収集され得る。示されるように、第２のポート３４０は第１のポート３３３と基本的に同じレベルすなわち高さにあり、移動相はそこを通って導入（収集）され得る。この構成により、使用者の操作および試料の取り扱いが容易になる。図４に示した実施形態では、カラムの容量は約１０リットルである。典型的には０．１リットルから２０００リットルの範囲である、広範囲のカラム容量が可能であることを理解されたい。このカラムを使い捨てカラムとして使用する場合、好ましい容量は０．５リットルから５０リットルの範囲である。
【００４９】
図５は、本発明による方法を使用して軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムの概略図である。このシステムは上記の図２で説明したカラム４０１を有する。このカラムは、第２の端部ユニット（図示せず）および第２のフィルター４０６に対する、カラムのベッド空間４０９内にある軸方向に移動可能な第１の端部ユニット（図示せず）および第１のフィルター（４０４）の高さをプラットホーム４７２および４７４を用いて調節することができる（圧縮フレームなどの）外部駆動手段４７０に接続されている。
【００５０】
初めに、カラムからのまたは少なくとも底部分散システムおよびフィルター層からの空気の除去を促進するために、このシステムには、出口バルブ４５０と流体連通しているポンプ４８５を介してコンテナ４８０から液体が注入される。余分な液体または空気は、カラム４０１の上側入口／出口ポートを介してカラムから除去されて、廃棄物４６０として外に出されることが可能である。圧力センサ４９０が、注入段階および／またはその後の充填段階におけるカラム内の圧力を監視する。
【００５１】
第１の端部ユニットおよびフィルター４０４は、初めは、第１のフィルター４０４と第２のフィルターＯ４０６との間の距離がベッド空間４０９内の目標のベッド高さの距離を超えるように位置Ｈ０（図では４７４Ｏとして示されている）のところに合わされている。その後、スラリーまたは懸濁液の形態のコンテナ４３０内の粒子状媒体が、ポンプ４３５による圧力下で入口バルブ４２０を通してカラムベッド空間４０９内に導入される。バルブ４３３を介した貯蔵部４３１からの充填用液体でコンテナ４３０をすすぐことにより、コンテナ４３０内に残っているいかなる残留スラリーもベッド空間４０９内へ洗い流すことができる。スラリーがベッド空間４０９内へと導入されると同時に、ベッド空間内に媒体の安定したベッドを作り出すために余分な液体が出口４４０を介して除去されてよい。この余分な液体は出口バルブ４５０を通過し、その後廃棄物４６０として放出される。圧密ステップの間、カラムベッド空間４０９内の圧力は、センサ４９０によって監視されており、多様な度合いの充填ベッドの予圧を得るためにポンプ４３５の流量を調節することによって調節され得る。
【００５２】
最後に、プラットホーム４７４を位置ＨＦ（図では４７４Ｆとして示される）まで下げて、第１のフィルター４０４を第２のフィルター４０６に対して軸方向に移動させることにより、ベッドを目標のベッド高さまで圧縮することが実現される。充填処理では、クロマトグラフィ媒体のタイプに応じて、フローパッキングによる予圧および軸方向の圧縮による最終的な圧縮を様々な度合いに制御することができる。上側端部ユニットを最終位置ＨＦまで下げた後、カラム端部ユニットは固定ロッドによって固定されてよく、カラムは圧縮フレームから取り外されてよい。
【００５３】
図５および上記の説明はカラムを充填する方法を例証したものである。ポンプ、容器およびセンサの別の構成も可能であることを当業者は理解するであろう。汚染微生物数の制御レベルに関する要求基準を満たしている使い捨てカラムまたは無菌状態で作られるカラムを充填する場合、バッグおよび管材料などの使い捨ての液体処理装置を使用することが好ましい。
【００５４】
図６は、下降流モード（実線）および上昇流モード（点線）の両方で運用された本発明による１０リットルカラムで行われたトレーサーパルス実験例によるクロマトグラフィ分離効率を示している。このカラムは、本発明の方法を使用して、８５μｍのアガロース粒子径のＣａｐｔｏ（商標）Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、スウェーデン、ウプサラ）のベッドで充填された。カラムは１０．８Ｌの容積、２６３ｍｍの直径、および、２００ｍｍのベッド高さを有する。トレーサー物質としてアセトン（充填ベッド容積の１％）を使用し、移動相として水を用いてアセトンをカラムから溶出させ、吸収度を２８０ｎｍで監視した。下の表１から分かるように、下降流モード（実線）および上昇流モード（点線）のいずれにおいても、８５μｍのアガロース媒体を用いて優れたカラム効率が観測された。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１のデータは、以下に記載した方法で図６のクロマトグラムから得られたものである。
【００５７】
カラム効率の測定値として、低減されたプレート高さが、図７に示すように、溶出ピークの高さの半分のところのピーク幅Ｗｈを使用して決定される。この手順は、ガウス形状のピークに対して有効である近似である。実際に、溶出ピークは理想的なガウス形状から得られることが多く、ピークのひずみ度（ｐｅａｋ ｓｋｅｗｎｅｓｓ）はいわゆる非対称因子Ａｆによって定性的に説明される。ここで、ＲＴＤの「リーディング」は１未満のＡｆによって示され、「テイリング」は１を超えるＡｆによって示される。非対称因子に対して一般に適用される合格基準は０．８＜Ａｆ＜１．５〜１．８であり、これは用途タイプによって決まる。
【００５８】
【数１】
【００５９】
Ａｆ＝ｂ／ａ （図７参照）
Ａｆ 非対称因子
ｄｐ 粒子径
ｈ 低減されたプレート高さ
ＨＥＴＰ 理論段に相当する高さ
Ｌ ベッド高さ、充填ベッド
ｕｓ 充填ベッドの空塔速度
ＶＲ 保持容量
ｗｈ 最大ピーク高さの５０％のところのピーク幅
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドで軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填する方法であって、
前記カラムが、
長尺管状側壁を有するハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１のユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２のユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと
を有し、
前記第１の端部ユニットが、前記粒子状媒体で前記ベッド空間を満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有し、
前記方法が、
ｉ．前記第１のフィルターと前記第２のフィルターとの間の軸方向の間隔を、前記目標のベッド高さの距離を超える距離に調節するステップと、
ｉｉ．中に粒子状媒体のベッドを形成するために、前記第１のバルブ手段を介して前記粒子状媒体の懸濁液を前記ベッド空間へ導入するステップと、
ｉｉｉ．前記目標のベッド高さを得るために、前記第１および／または第２の端部フィルターの軸方向の移動により前記粒子状媒体のベッドを圧縮するステップと
を含み、
前記ステップｉｉｉ）が、前記カラムに一体化されておらずかつその外部にある前記駆動手段によって実現される、ことを特徴とする、
方法。
【請求項２】
前記駆動手段が、アクチュエータ、プレスおよびフレームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子状媒体が、イオン交換媒体、逆相媒体、サイズ排除媒体およびアフィニティ媒体からなる群から選択されるクロマトグラフィ媒体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のバルブが一方向バルブである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カラムが使い捨てカラムである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉｉ）が、前記粒子状媒体の前記懸濁液を前記第１のバルブ手段を介して前記ベッド空間に導入しながら前記ベッド空間から余分な水を除去して、それによりその中に粒子状媒体の安定したベッドを作るステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドで軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムであって、
（ｉ）長尺管状側壁を含むハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１の端部ユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２の端部ユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと、
を有するカラムであって、
前記第１の端部ユニットが、前記ベッド空間を前記粒子状媒体で満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有する、
カラム、ならびに、
（ｉｉ）前記カラムに一体化されておらずかつその外部にあることを特徴とする駆動手段、
を有する、システム。
【請求項８】
前記駆動手段が、フレーム、プレスおよびアクチュエータからなる群から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１のバルブ手段が一方向バルブである、請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記カラムが使い捨てカラムである、請求項７から９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１】
目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドで軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填する方法であって、
前記カラムが、
長尺管状側壁を有するハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１のユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２のユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと
を有し、
前記第１の端部ユニットが、前記粒子状媒体で前記ベッド空間を満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有し、
前記方法が、
ｉ．前記第１のフィルターと前記第２のフィルターとの間の軸方向の間隔を、前記目標のベッド高さの距離を超える距離に調節するステップと、
ｉｉ．中に粒子状媒体のベッドを形成するために、前記第１のバルブ手段を介して前記粒子状媒体の懸濁液を前記ベッド空間へ導入するステップと、
ｉｉｉ．前記目標のベッド高さを得るために、前記第１および／または第２の端部フィルターの軸方向の移動により前記粒子状媒体のベッドを圧縮するステップと
を含み、
前記ステップｉｉｉ）が、前記カラムに一体化されておらずかつその外部にある前記駆動手段によって実現される、ことを特徴とする、
方法。
【請求項２】
前記駆動手段が、アクチュエータ、プレスおよびフレームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子状媒体が、イオン交換媒体、逆相媒体、サイズ排除媒体およびアフィニティ媒体からなる群から選択されるクロマトグラフィ媒体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のバルブが一方向バルブである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カラムが使い捨てカラムである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉｉ）が、前記粒子状媒体の前記懸濁液を前記第１のバルブ手段を介して前記ベッド空間に導入しながら前記ベッド空間から余分な水を除去して、それによりその中に粒子状媒体の安定したベッドを作るステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
目標のベッド高さの粒子状媒体のベッドで軸方向流れクロマトグラフィカラムを充填するシステムであって、
（ｉ）長尺管状側壁を含むハウジングと、
前記側壁によって分離されており、対向するように軸方向に隔置される第１および第２の端部ユニットであって、駆動手段により少なくとも一方の該ユニットが他方の該ユニットに対して軸方向に移動可能である、第１および第２の端部ユニットと、
前記側壁と共に、粒子状媒体のベッドを収容するための閉じられたベッド空間を画定する、前記第１の端部ユニットに隣接する第１のフィルターおよび前記第２の端部ユニットに隣接する第２のフィルターであって、該第１および／または第２のフィルターの相対的移動によって前記ベッド高さが変化する、第１および第２のフィルターと、
を有するカラムであって、
前記第１の端部ユニットが、前記ベッド空間を前記粒子状媒体で満たすための第１のバルブ手段と、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第１のポートとを有し、
前記第２の端部ユニットが、前記ベッド空間に液体を加えるまたはそこから液体を除去するための第２のポートを有する、
カラム、ならびに、
（ｉｉ）前記カラムに一体化されておらずかつその外部にあることを特徴とする駆動手段、
を有する、システム。
【請求項８】
前記駆動手段が、フレーム、プレスおよびアクチュエータからなる群から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１のバルブ手段が一方向バルブである、請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記カラムが使い捨てカラムである、請求項７から９のいずれか一項に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２０９９２（Ｐ２０１０−５２０９９２Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２１１８（Ｐ２００９−５５２１１８）
【出願日】平成２０年３月５日（２００８．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０２９１
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０９０８８２４０）ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー (22)
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月５日（２００８．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０２９１
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０９０８８２４０）ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー (22)
[ Back to top ]