グアイアコール産生菌の検出法および検出キット
【課題】果汁原料などの検体中に存在するグアイアコール産生菌を検出するための迅速かつ簡便な方法の提供。
【解決手段】検体中のグアイアコール産生菌の検出方法であって、次式：
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を平板培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする方法。
【解決手段】検体中のグアイアコール産生菌の検出方法であって、次式：
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を平板培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は果汁原料中のグアイアコール産生菌の検出法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
果汁飲料や果汁加工食品の原料となる果汁には、通常の酸性飲料や食品の加熱殺菌条件下でも生存しうる耐熱性好酸性菌（ＴＡＢ）が含まれることが知られている。代表的な耐熱性好酸性菌であるAlicyclobacillus属の細菌のうち、Alicyclobacillus acidoterrestris（ＡＡＴ）およびAlicyclobacillus acidiphilus（ＡＡＰ）は、グアイアコール産生菌であることが知られている（以下、グアイアコール産生菌という）。特に、ＡＡＴは、バニリンおよびバニリン酸を経てグアイアコールを産生する菌であることが報告されている。（果汁協会報２００５年１２月号、p.1-15；非特許文献２）。グアイアコールは、毒性はないが異臭を有しているため、製品中にグアイアコール産生菌が含まれると、飲料の風味が著しく悪化する。特に、原料果汁中のＡＡＴが問題になることが多くみられた。したがって、原料果汁や果汁飲料製品中のグアイアコール産生菌の存在を検査することは、原料および製品の品質管理において非常に重要である。
【０００３】
ＡＡＴの検出方法としては、バニリンを添加した液体培地に果汁飲料を添加して培養し、グアイアコールの臭気を官能検査で確認する方法（特開平７−１２３９９８；特許文献１）、検体を含む培養液をバニリン酸の存在下でインキュベーションし、生成するグアイアコールを、さらにペルオキシダーゼ法による処理により呈色させて、定性または特別な装置を用いた分光定量分析によりグアイアコール産生菌の存在を確認する方法（特開２００４−２０１６６８；特許文献２）、グアイアコール生成酵素遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより検出する方法（特開２００３−０００２５９；特許文献３）等が知られている。
【０００４】
現在広く用いられているＡＡＴの検出方法は、上記の特許文献２の技術を基にするもので、検体をバニリン酸を含む液体培地で培養して、生成したグアイアコールを検出することにより、間接的にＡＡＴの有無を判別するペルオキシターゼ法である。
【０００５】
しかしながら、ペルオキシターゼ法では、液体培地中でＡＡＴを増殖させるために、適切な前培養が必要となるため、作業が煩雑になり、結果を得るまでに時間を要することになる。例えば、検体のＡＡＴを定量的に検出するために、まず平板培地でコロニーを形成させ、複数のコロニーを釣菌し、それぞれのコロニーをさらに液体培地で培養するという、煩雑な作業と４〜６日間の期間が必要となる。
【０００６】
さらに、ペルオキシダーゼ法によりＡＡＴの有無を判別する場合には、ペルオキシダーゼの作用によりグアイアコールがテトラグアイアコールに変換され、褐色に着色することで判別するため、検体がこの色調に近いオレンジ果汁などの原料や培地である場合には判別が難しくなる。原料のロットや培地のオートクレーブ条件などによる影響も合わせると、目視で比色判定するためには、判定者に相当の熟練が必要である。また、正確な判定のためには、検体ごとおよび培地ごとに検量線を作成したうえで、分光光度計で分析するか、ＧＣ−ＭＳで分析する必要があり、高価な分析機器や煩雑な作業がさらに必要となる。
【０００７】
一方、固体培地を用いる方法として知られている、３０℃培養法の原理は、培養温度によりグアイアコール産生菌とグアイアコール非産生菌との選別を行うことにある。例えば、ＡＡＴの生育至適温度（４０〜５０℃）より低い３０℃で培養を行いコロニーの有無を確認する。しかし、３０℃培養では、ＡＡＴの生育も低下するため、ＡＡＴの検出感度が低下するばかりか、生育温度域の低い対象外のグアイアコール非産生菌が検出されることがある。このため、３０℃培養法を行う場合、前培養を行いＡＡＴの検出感度を上げているが、この場合、全工程で８〜１０日という時間を要するばかりか、選択性も十分とは言えない。さらに、前培養を行うため定量性が得られないという問題がある。
【０００８】
さらに、柑橘系の果物やぶどうに含まれるポリフェノール類等の成分がＡＡＴの増殖を阻害することが知られている。このため、１００％果汁などの果汁濃度の高い原料を検査する場合には、検体を適切に希釈して試験する必要がある。例えば、オレンジ果汁では１％に希釈してから試験するが、果汁の種類や産地によって希釈率を検討することが必要となり、上記の各試験の操作をさらに複雑にしている。
【０００９】
したがって、複雑な操作や高価な機器や作業者の熟練を必要とせずに、原料果汁にグアイアコール産生菌が存在するか否かを短時間で正確に判断する方法が求められている。さらに、果実生産地や果汁原料製造施設でも検査できる簡便な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平７−１２３９９８
【特許文献２】特開２００４−２０１６６８
【特許文献３】特開２００３−０００２５９
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「耐熱性好酸性細菌統一検査法ハンドブック」、社団法人日本果汁協会、２００５年 Ｐ．２５
【非特許文献２】果汁協会報２００５年１２月号 ｐ．１−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、果汁原料などの検体中に存在するグアイアコール産生菌を検出するための、迅速かつ簡便な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、メトキシフェノール骨格を有する化合物を特定の濃度範囲で含む固体培地を用いることにより、培地上でグアイアコール産生菌のみが選択的に増殖してコロニーを形成しうることを見いだした。固体培地上のコロニー形成を検出することにより、被検サンプル中に存在するグアイアコール産生菌の有無を簡便に検出することができ、さらに、コロニーを計数することにより、被検サンプル中に存在するグアイアコール産生菌の数を簡便に測定することができる。
【００１４】
本発明は、次式：
【化１】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含む好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする、検体中のグアイアコール産生菌の検出方法を提供する。具体的には、従来の方法で必要とされていた前培養や定性分析のために必要な処理（ペルオキシターゼ法による呈色）を要せず、直接検出でき、かつ直接定量できる方法を提供する。好ましくは、化合物は、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される。さらに好ましくは、化合物は、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸である。
【００１５】
特に好ましくは、好酸性菌用固体培地は、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する。より好ましくは、好酸性菌用固体培地は５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下、さらに好ましくは５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する。好ましくは、平板培養は２０℃〜５５℃、より好ましくは、３０℃〜４５℃、特に好ましくは、３０℃（２７℃〜３３℃）で行われる。本発明においては、±１０％程度の温度のずれであれば同様の効果が期待できる。
【００１６】
別の観点においては、本発明は、検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットであって、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する滅菌された好酸性菌用固体培地を含むグアイアコール産生菌検出キットを提供する。
【００１７】
さらに別の観点においては、本発明は、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する好酸性菌用固体培地からなる、グアイアコール産生菌選択培地を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法を用いることにより、果汁原料などの検体中に存在するグアイアコール産生菌を迅速かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のグアイアコール産生菌検出方法は、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を平板培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする。グアイアコール産生菌は、バニリンおよびバニリン酸を経てグアイアコールを産生する。フェルラ酸はバニリンの関連物質であるが、ＡＡＴによるグアイアコール産生には直接関与しないことが報告されている。本発明は、バニリン酸がグアイアコール産生菌の増殖を阻害しないが、グアイアコールを産生しないAlicyclobacillus 属の細菌の増殖を阻害するという発見に基づくものである。これまで、ＡＡＴがバニリン酸を含む培地中でグアイアコールを生成しうることは知られていたが、バニリン酸を含む固体培地中で、グアイアコール産生菌とグアイアコール非産生菌との増殖速度が異なることは、本発明において初めて見いだされたものである。本発明の方法にしたがえば、グアイアコール非産生菌の増殖が抑制されることにより、グアイアコール産生菌が優先的に増殖するので、グアイアコール産生菌を選択的に検出することができる。
【００２０】
本発明の方法によって検査すべき検体は、飲食品の原料、半加工品および製品であって、耐熱性好酸性菌を含むことが疑われる検体である。具体的には、酸性果汁原料であるオレンジ果汁、りんご果汁、みかん果汁等、これらの半加工品、これらの濃縮果汁、ならびにこれらの果汁原料を用いて製造される飲料および食品が挙げられる。また、耐熱性好酸性菌は飲食品の殺菌のために通常用いられる加熱処理条件では完全に死滅しないこと、阻害物質の存在のために濃い果汁中では増殖しないが希釈果汁を含む製品中で増殖する場合もあることから、原料および製品の性質および流通の形態に応じて、品質管理に必要と考えられる任意の試料を検体とすることができる。本発明の方法によれば、従来の方法で必要とされていた、前培養や確認の為の処理（ペルオキシターゼ法による呈色）を要せず、グアイアコール産生菌を直接検出でき、かつ培地中のコロニーの数を計測することにより、直接定量することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明の方法に基づくグアイアコール産生菌培地や、それを利用するグアイアコール産生菌検出キットは、前培養や確認の為の処理に用いる器具や試薬を要しないので、迅速かつ簡便なうえ、コンパクトなものとすることができる。
【００２２】
本発明の方法において検出すべきグアイアコール産生菌は、主として、これまでに同定されているAlicyclobacillus acidoterrestris（ＡＡＴ）およびAlicyclobacillus acidiphilus（ＡＡＰ）である。これらのうちＡＡＴは果汁原料からしばしば検出されるが、ＡＡＰはまれである。このことから、品質管理上は基本的にＡＡＴを検出できれば十分と言えるが、本発明の方法は、下記に説明されるように、培地中のバニリン酸の含有量を変えることにより、ＡＡＴのみを検出できる条件で実施することも、ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出できる条件で実施することもできる。本発明の方法は、グアイアコールを産生しうる他のAlicyclobacillus 属の細菌の検出にも用いることができる。このような細菌については、いくつかの報告があるが、まだ詳細には調べられていない。一方、グアイアコールを産生しないAlicyclobacillus 属の細菌としては、Alicyclobacillus acidocaldarius、Alicyclobacillus pomorum、などが知られている。
【００２３】
本発明の方法においては、グアイアコール産生菌のみが選択的にコロニーを形成する選択培地として、次式：
【化２】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される、メトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地を用いる。
【００２４】
メトキシフェノール骨格を有する化合物として好ましいものは、バニリン（R=C(O)H）、バニリン酸（R=COOH）、フェルラ酸（R=CH=CH-COOH）、グアイアコール（R=H）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド（R=CH=CH-C(O)H）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸（R=CH2CH2COOH）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール（R=CH2OH）、メトキシハイドロキノン（R=OH）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒド（R=C(O)CH3）、および４-ビニルグアイアコール（R=CH2=CH2）である。これらの化合物はすべて、フェルラ酸の代謝産物として微生物により生産されることが報告されている。
【００２５】
特に好ましくは、メトキシフェノール骨格を有する化合物として、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを用いる。あるいは、バニリン、バニリン酸およびフェルラ酸の２種または３種を混合して用いてもよい。好酸性菌用培地としては、好酸性菌用に一般的に用いられる培地であればいずれのものを用いてもよい。好ましくは、入手が容易であり、研究の蓄積のあるＹＳＧ培地（酵母エキス、可溶性デンプン、グルコースを含む、ｐＨ３．０〜４．０）を用いる。バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸はいずれも市販されている。培地に添加すべきバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸の濃度は、ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出すべきか、またはＡＡＴのみでよいかによって、以下のように選択することができる。
【００２６】
ＡＡＴが検出できればよい場合には、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸を用いることができる。好ましくは、バニリン酸の濃度は５０〜２２５ｐｐｍであり、より好ましくは７５〜２００ｐｐｍであり、さらに好ましくは１００〜２００ｐｐｍである。バニリンを用いる場合には、５００ｐｐｍ以上であればよく、好ましくは９００〜１０００ｐｐｍである。フェルラ酸を用いる場合には、２５ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの濃度であり、好ましくは約５０ｐｐｍである。
【００２７】
ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出したい場合には、５０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍのバニリン酸を用いることができる。従来の方法は、主としてグアイアコール産生菌の中でも特に汚染の可能性の高いＡＡＴについてのみ検査するために用いられているが、本発明の方法では、バニリン酸の添加量を適宜選択することにより、ＡＡＰなどの他のグアイアコール産生菌も検出することができる。
【００２８】
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸以外の、メトキシフェノール骨格を有する化合物についても、下記の実施例と同様にして、最適な濃度を求めることができる。
【００２９】
固体培地は、定法にしたがって、ＹＳＧ培地に寒天および所定量のメトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を加えて、滅菌した後、寒天を固化させることにより製造することができる。培地のｐＨが低いため、培地と寒天を一緒にオートクレーブ処理すると良好に固化しない場合があるので、寒天量を適宜調節するか、培地と寒天を別々に滅菌した後に混合するか、あるいは中性付近のｐＨの培地と寒天を滅菌した後に酸を加えてｐＨを調節することが好ましい。固体培地は塗抹用にシャーレ中に作成してもよく、混釈用にフラスコ、ボトルなどの中に作成してもよい。
【００３０】
本発明の方法においては、検体をそのままで、あるいは適宜希釈して、固体培地に加えて平板培養する。コロニーの計数を容易にするために、検体は、段階希釈（１，１／１０，１／１００など）して用いても良い。また、Alicyclobacillus 属の細菌は芽胞を形成するため、検体を培地に加える前に７０℃で２０分間程度熱処理してヒートショックを与え、菌体を活性化することが好ましい。混釈法により検出する場合には、寒天培地を融解して検体を加え、混和した後にシャーレに移して固化させる。塗抹法により検出する場合には、シャーレ中の固体培地上に検体を塗抹すればよい。メンブレンフィルター法により検出する場合には、検体をメンブレンフィルターを通して濾過した後、このフィルターをシャーレ中の固体培地上に置く。
【００３１】
培養は、グアイアコール産生菌の生育温度域（２０℃〜５５℃）であればいずれの温度で行ってもよいが、グアイアコール非産生菌からの選択性を高めるためには、５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、さらに好ましくは４０℃以下、特に好ましくは３０℃（２７℃〜３３℃）で行う。なお、本発明においては、±１０％程度の温度のずれであれば同様の効果が期待できる。本発明においては、驚くべきことに、バニリン酸を固体培地に添加することにより、グアイアコール産生菌の検出感度が非常に向上することが見いだされた。例えば、７５ｐｐｍのバニリン酸を含む固体培地で、ＡＡＴを３０℃で５日間培養すると、同じ培地で４５℃、３日間培養したときと同じ数のコロニーが形成されることが確認された。このことは、ＡＡＴの生育温度域において、正確に定量できることを示している。すなわち、本発明の方法は、検出感度を著しく高めることから、前培養が不要であるだけではなく、より正確な定量が迅速かつ簡便に行える画期的な方法である。さらに、低温とバニリン酸の影響から、対象外の菌が検出されることもない。また、バニリン酸の代わりにバニリンまたはフェルラ酸を用いた場合にも、同様の傾向が認められた。
【００３２】
培養を所定時間、例えば３〜５日間行った後に、目視でコロニーの有無を調べることにより、検体中にグアイアコール産生菌が存在するか否かを判定することができる。また、コロニーの数を計測することにより、検体の希釈率から容易に検体中の菌体の数を求めることができる。本発明の方法にしたがえば、特別な装置や熟練を必要とせずに、簡便に正確な定量的データを得ることができる。
【００３３】
別の観点においては、本発明は、検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットを提供する。このキットは、少なくとも、次式：
【化３】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される、メトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地を含む。好酸性菌用固体培地は、滅菌されシャーレ中に作成された形で提供してもよく、混釈用にフラスコ、ボトルなどの中に作成された形で提供してもよい。メンブレンフィルター法用のキットは、メンブレンフィルターおよび濾過装置をさらに含んでいてもよい。キットはさらに、希釈列作成用のプレート、陽性対照用のグアイアコール産生菌および使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸を添加したＹＳＧ寒天培地を用いて、耐熱性好酸性菌（ＴＡＢ）がコロニーを形成しうるか否かを調べた。使用した菌株は、A.acidoterrestris ATCC49025、A.acidiphilus JCM21417、A.acidocaldarius ATCC27009、A.pomorum JCM21459の４菌株である。このうち、A.acidoterrestris ATCC49025、A.acidiphilus JCM21417は、グアイアコールを産生する菌株として報告されている。
【００３６】
ＹＳＧ培地（メルク（株）、ＹＧＳ Ａｇａｒ）２０．０ｇとバニリン酸（和光純薬工業（株））（０〜２５０ｍｇ）を水１０００ｇに加温溶解し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分間）を実施した。約５０℃に冷却後、１０％硫酸にてｐＨを３．７に調製し、平板培地を作製した。
【００３７】
各菌株の菌液に、７０℃、２０分間のヒートショックを実施した。菌液をリン酸緩衝生理食塩水にて段階希釈して、１０３ＣＦＵ／ｍＬとして、１００μＬずつを平板培地に塗沫して培養した。４５℃で３日間培養後、形成したコロニーを目視にて確認した。
【００３８】
バニリン酸を７５ｐｐｍ添加した場合には、グアイアコール産生菌２菌種は無添加培地と同等レベル以上検出したが、その他の２菌種はコロニーを１つも検出しなかった。バニリン酸を１００ｐｐｍ添加した場合には、A.acidoterrestris ATCC49025は無添加培地と同等レベル以上検出したが、その他の３菌種はコロニーを１つも検出しなかった。さらに、バニリン酸を１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ添加した水準においても、A.acidoterrestris ATCC49025は無添加培地と同等レベルの検出性を示した。バニリン酸を２２５ｐｐｍ添加するとＡＡＴの検出感度が低下し、２５０ｐｐｍ以上では検出されなかった。
【００３９】
次に、バニリン酸の代わりに、バニリンまたはフェルラ酸を用いて、同様の実験を行ったが、培地が固化し難い場合には、適宜寒天量を調節した。実施例１の結果を下記の表にまとめて示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例２
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸を添加したＹＳＧ寒天培地を用いて、培養温度によるA.acidoterrestris ATCC49025のコロニー検出率の相違を調べた。ＹＳＧ培地にバニリン酸７５ｐｐｍを加えて、実施例１と同様にして固体培地を作成し、同数のA.acidoterrestris ATCC49025を含む菌液を平板培地に塗沫して、４５℃または３０℃で培養した。対照として無添加のＹＳＧ培地を用いた。
【００４２】
４５℃で３日間培養したときのコロニー数と、３０℃で５日間培養したときのコロニー数を下記の表に示す。値は無添加ＹＳＧ培地で４５℃、３日間培養したときのコロニー数を１００としたときの相対値である。
【００４３】
【表２】
【００４４】
無添加ＹＳＧ培地を用いて３０℃で５日間培養すると、４５℃で３日間培養したときに比べて十分なコロニーが検出できなかった。このことは、３０℃培養法では、前培養が必須であることを裏付けている。
【００４５】
一方、バニリン酸７５ｐｐｍを加えると、４５℃では無添加の培地に比べて多くコロニーが検出された。このことは、バニリン酸の添加によりA.acidoterrestris ATCC49025のコロニー形成が促進され、検出感度が高まったことを示唆する。バニリン酸７５ｐｐｍの代わりに、バニリン酸５０ｐｐｍ、バニリン７５０ｐｐｍ、またはフェルラ酸２５ｐｐｍ用いた場合も、検出感度が高くなった。
【００４６】
さらに、バニリン酸７５ｐｐｍを添加した場合には、３０℃で５日間培養した場合でも、４５℃３日間とほぼ同数のコロニーが検出された。バニリン酸の存在がグアイアコール非産生菌の増殖を抑制するという実施例１の結果と合わせると、検体をバニリン酸含有培地を用いて３０℃で培養することにより、グアイアコール産生菌を高い感度と特異性をもって検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法は、飲食品およびその製造原料の品質管理に有用である。本発明の方法は、従来の方法で必要とされていた、前培養や確認の為の処理（ぺルオキシターゼ法による呈色）を要せず、直接グアイアコール産生菌を検出でき、かつ直接定量できるので、品質に悪影響を与える菌の検出のための時間と費用を大幅に削減できる。さらに、本発明の方法に基づくグアイアコール産生菌検出キットは、前培養や確認の為の処理に用いる器具、試薬を要しない、コンパクトで簡便なものであり、迅速に検出できるので、産業上の有用性が高い。
【技術分野】
【０００１】
本発明は果汁原料中のグアイアコール産生菌の検出法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
果汁飲料や果汁加工食品の原料となる果汁には、通常の酸性飲料や食品の加熱殺菌条件下でも生存しうる耐熱性好酸性菌（ＴＡＢ）が含まれることが知られている。代表的な耐熱性好酸性菌であるAlicyclobacillus属の細菌のうち、Alicyclobacillus acidoterrestris（ＡＡＴ）およびAlicyclobacillus acidiphilus（ＡＡＰ）は、グアイアコール産生菌であることが知られている（以下、グアイアコール産生菌という）。特に、ＡＡＴは、バニリンおよびバニリン酸を経てグアイアコールを産生する菌であることが報告されている。（果汁協会報２００５年１２月号、p.1-15；非特許文献２）。グアイアコールは、毒性はないが異臭を有しているため、製品中にグアイアコール産生菌が含まれると、飲料の風味が著しく悪化する。特に、原料果汁中のＡＡＴが問題になることが多くみられた。したがって、原料果汁や果汁飲料製品中のグアイアコール産生菌の存在を検査することは、原料および製品の品質管理において非常に重要である。
【０００３】
ＡＡＴの検出方法としては、バニリンを添加した液体培地に果汁飲料を添加して培養し、グアイアコールの臭気を官能検査で確認する方法（特開平７−１２３９９８；特許文献１）、検体を含む培養液をバニリン酸の存在下でインキュベーションし、生成するグアイアコールを、さらにペルオキシダーゼ法による処理により呈色させて、定性または特別な装置を用いた分光定量分析によりグアイアコール産生菌の存在を確認する方法（特開２００４−２０１６６８；特許文献２）、グアイアコール生成酵素遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより検出する方法（特開２００３−０００２５９；特許文献３）等が知られている。
【０００４】
現在広く用いられているＡＡＴの検出方法は、上記の特許文献２の技術を基にするもので、検体をバニリン酸を含む液体培地で培養して、生成したグアイアコールを検出することにより、間接的にＡＡＴの有無を判別するペルオキシターゼ法である。
【０００５】
しかしながら、ペルオキシターゼ法では、液体培地中でＡＡＴを増殖させるために、適切な前培養が必要となるため、作業が煩雑になり、結果を得るまでに時間を要することになる。例えば、検体のＡＡＴを定量的に検出するために、まず平板培地でコロニーを形成させ、複数のコロニーを釣菌し、それぞれのコロニーをさらに液体培地で培養するという、煩雑な作業と４〜６日間の期間が必要となる。
【０００６】
さらに、ペルオキシダーゼ法によりＡＡＴの有無を判別する場合には、ペルオキシダーゼの作用によりグアイアコールがテトラグアイアコールに変換され、褐色に着色することで判別するため、検体がこの色調に近いオレンジ果汁などの原料や培地である場合には判別が難しくなる。原料のロットや培地のオートクレーブ条件などによる影響も合わせると、目視で比色判定するためには、判定者に相当の熟練が必要である。また、正確な判定のためには、検体ごとおよび培地ごとに検量線を作成したうえで、分光光度計で分析するか、ＧＣ−ＭＳで分析する必要があり、高価な分析機器や煩雑な作業がさらに必要となる。
【０００７】
一方、固体培地を用いる方法として知られている、３０℃培養法の原理は、培養温度によりグアイアコール産生菌とグアイアコール非産生菌との選別を行うことにある。例えば、ＡＡＴの生育至適温度（４０〜５０℃）より低い３０℃で培養を行いコロニーの有無を確認する。しかし、３０℃培養では、ＡＡＴの生育も低下するため、ＡＡＴの検出感度が低下するばかりか、生育温度域の低い対象外のグアイアコール非産生菌が検出されることがある。このため、３０℃培養法を行う場合、前培養を行いＡＡＴの検出感度を上げているが、この場合、全工程で８〜１０日という時間を要するばかりか、選択性も十分とは言えない。さらに、前培養を行うため定量性が得られないという問題がある。
【０００８】
さらに、柑橘系の果物やぶどうに含まれるポリフェノール類等の成分がＡＡＴの増殖を阻害することが知られている。このため、１００％果汁などの果汁濃度の高い原料を検査する場合には、検体を適切に希釈して試験する必要がある。例えば、オレンジ果汁では１％に希釈してから試験するが、果汁の種類や産地によって希釈率を検討することが必要となり、上記の各試験の操作をさらに複雑にしている。
【０００９】
したがって、複雑な操作や高価な機器や作業者の熟練を必要とせずに、原料果汁にグアイアコール産生菌が存在するか否かを短時間で正確に判断する方法が求められている。さらに、果実生産地や果汁原料製造施設でも検査できる簡便な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平７−１２３９９８
【特許文献２】特開２００４−２０１６６８
【特許文献３】特開２００３−０００２５９
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「耐熱性好酸性細菌統一検査法ハンドブック」、社団法人日本果汁協会、２００５年 Ｐ．２５
【非特許文献２】果汁協会報２００５年１２月号 ｐ．１−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、果汁原料などの検体中に存在するグアイアコール産生菌を検出するための、迅速かつ簡便な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、メトキシフェノール骨格を有する化合物を特定の濃度範囲で含む固体培地を用いることにより、培地上でグアイアコール産生菌のみが選択的に増殖してコロニーを形成しうることを見いだした。固体培地上のコロニー形成を検出することにより、被検サンプル中に存在するグアイアコール産生菌の有無を簡便に検出することができ、さらに、コロニーを計数することにより、被検サンプル中に存在するグアイアコール産生菌の数を簡便に測定することができる。
【００１４】
本発明は、次式：
【化１】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含む好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする、検体中のグアイアコール産生菌の検出方法を提供する。具体的には、従来の方法で必要とされていた前培養や定性分析のために必要な処理（ペルオキシターゼ法による呈色）を要せず、直接検出でき、かつ直接定量できる方法を提供する。好ましくは、化合物は、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される。さらに好ましくは、化合物は、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸である。
【００１５】
特に好ましくは、好酸性菌用固体培地は、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する。より好ましくは、好酸性菌用固体培地は５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下、さらに好ましくは５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する。好ましくは、平板培養は２０℃〜５５℃、より好ましくは、３０℃〜４５℃、特に好ましくは、３０℃（２７℃〜３３℃）で行われる。本発明においては、±１０％程度の温度のずれであれば同様の効果が期待できる。
【００１６】
別の観点においては、本発明は、検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットであって、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する滅菌された好酸性菌用固体培地を含むグアイアコール産生菌検出キットを提供する。
【００１７】
さらに別の観点においては、本発明は、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する好酸性菌用固体培地からなる、グアイアコール産生菌選択培地を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法を用いることにより、果汁原料などの検体中に存在するグアイアコール産生菌を迅速かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のグアイアコール産生菌検出方法は、メトキシフェノール骨格を有する化合物、特にバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を平板培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする。グアイアコール産生菌は、バニリンおよびバニリン酸を経てグアイアコールを産生する。フェルラ酸はバニリンの関連物質であるが、ＡＡＴによるグアイアコール産生には直接関与しないことが報告されている。本発明は、バニリン酸がグアイアコール産生菌の増殖を阻害しないが、グアイアコールを産生しないAlicyclobacillus 属の細菌の増殖を阻害するという発見に基づくものである。これまで、ＡＡＴがバニリン酸を含む培地中でグアイアコールを生成しうることは知られていたが、バニリン酸を含む固体培地中で、グアイアコール産生菌とグアイアコール非産生菌との増殖速度が異なることは、本発明において初めて見いだされたものである。本発明の方法にしたがえば、グアイアコール非産生菌の増殖が抑制されることにより、グアイアコール産生菌が優先的に増殖するので、グアイアコール産生菌を選択的に検出することができる。
【００２０】
本発明の方法によって検査すべき検体は、飲食品の原料、半加工品および製品であって、耐熱性好酸性菌を含むことが疑われる検体である。具体的には、酸性果汁原料であるオレンジ果汁、りんご果汁、みかん果汁等、これらの半加工品、これらの濃縮果汁、ならびにこれらの果汁原料を用いて製造される飲料および食品が挙げられる。また、耐熱性好酸性菌は飲食品の殺菌のために通常用いられる加熱処理条件では完全に死滅しないこと、阻害物質の存在のために濃い果汁中では増殖しないが希釈果汁を含む製品中で増殖する場合もあることから、原料および製品の性質および流通の形態に応じて、品質管理に必要と考えられる任意の試料を検体とすることができる。本発明の方法によれば、従来の方法で必要とされていた、前培養や確認の為の処理（ペルオキシターゼ法による呈色）を要せず、グアイアコール産生菌を直接検出でき、かつ培地中のコロニーの数を計測することにより、直接定量することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明の方法に基づくグアイアコール産生菌培地や、それを利用するグアイアコール産生菌検出キットは、前培養や確認の為の処理に用いる器具や試薬を要しないので、迅速かつ簡便なうえ、コンパクトなものとすることができる。
【００２２】
本発明の方法において検出すべきグアイアコール産生菌は、主として、これまでに同定されているAlicyclobacillus acidoterrestris（ＡＡＴ）およびAlicyclobacillus acidiphilus（ＡＡＰ）である。これらのうちＡＡＴは果汁原料からしばしば検出されるが、ＡＡＰはまれである。このことから、品質管理上は基本的にＡＡＴを検出できれば十分と言えるが、本発明の方法は、下記に説明されるように、培地中のバニリン酸の含有量を変えることにより、ＡＡＴのみを検出できる条件で実施することも、ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出できる条件で実施することもできる。本発明の方法は、グアイアコールを産生しうる他のAlicyclobacillus 属の細菌の検出にも用いることができる。このような細菌については、いくつかの報告があるが、まだ詳細には調べられていない。一方、グアイアコールを産生しないAlicyclobacillus 属の細菌としては、Alicyclobacillus acidocaldarius、Alicyclobacillus pomorum、などが知られている。
【００２３】
本発明の方法においては、グアイアコール産生菌のみが選択的にコロニーを形成する選択培地として、次式：
【化２】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される、メトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地を用いる。
【００２４】
メトキシフェノール骨格を有する化合物として好ましいものは、バニリン（R=C(O)H）、バニリン酸（R=COOH）、フェルラ酸（R=CH=CH-COOH）、グアイアコール（R=H）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド（R=CH=CH-C(O)H）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸（R=CH2CH2COOH）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール（R=CH2OH）、メトキシハイドロキノン（R=OH）、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒド（R=C(O)CH3）、および４-ビニルグアイアコール（R=CH2=CH2）である。これらの化合物はすべて、フェルラ酸の代謝産物として微生物により生産されることが報告されている。
【００２５】
特に好ましくは、メトキシフェノール骨格を有する化合物として、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを用いる。あるいは、バニリン、バニリン酸およびフェルラ酸の２種または３種を混合して用いてもよい。好酸性菌用培地としては、好酸性菌用に一般的に用いられる培地であればいずれのものを用いてもよい。好ましくは、入手が容易であり、研究の蓄積のあるＹＳＧ培地（酵母エキス、可溶性デンプン、グルコースを含む、ｐＨ３．０〜４．０）を用いる。バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸はいずれも市販されている。培地に添加すべきバニリン、バニリン酸またはフェルラ酸の濃度は、ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出すべきか、またはＡＡＴのみでよいかによって、以下のように選択することができる。
【００２６】
ＡＡＴが検出できればよい場合には、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸を用いることができる。好ましくは、バニリン酸の濃度は５０〜２２５ｐｐｍであり、より好ましくは７５〜２００ｐｐｍであり、さらに好ましくは１００〜２００ｐｐｍである。バニリンを用いる場合には、５００ｐｐｍ以上であればよく、好ましくは９００〜１０００ｐｐｍである。フェルラ酸を用いる場合には、２５ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの濃度であり、好ましくは約５０ｐｐｍである。
【００２７】
ＡＡＴとＡＡＰの両方を検出したい場合には、５０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍのバニリン酸を用いることができる。従来の方法は、主としてグアイアコール産生菌の中でも特に汚染の可能性の高いＡＡＴについてのみ検査するために用いられているが、本発明の方法では、バニリン酸の添加量を適宜選択することにより、ＡＡＰなどの他のグアイアコール産生菌も検出することができる。
【００２８】
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸以外の、メトキシフェノール骨格を有する化合物についても、下記の実施例と同様にして、最適な濃度を求めることができる。
【００２９】
固体培地は、定法にしたがって、ＹＳＧ培地に寒天および所定量のメトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を加えて、滅菌した後、寒天を固化させることにより製造することができる。培地のｐＨが低いため、培地と寒天を一緒にオートクレーブ処理すると良好に固化しない場合があるので、寒天量を適宜調節するか、培地と寒天を別々に滅菌した後に混合するか、あるいは中性付近のｐＨの培地と寒天を滅菌した後に酸を加えてｐＨを調節することが好ましい。固体培地は塗抹用にシャーレ中に作成してもよく、混釈用にフラスコ、ボトルなどの中に作成してもよい。
【００３０】
本発明の方法においては、検体をそのままで、あるいは適宜希釈して、固体培地に加えて平板培養する。コロニーの計数を容易にするために、検体は、段階希釈（１，１／１０，１／１００など）して用いても良い。また、Alicyclobacillus 属の細菌は芽胞を形成するため、検体を培地に加える前に７０℃で２０分間程度熱処理してヒートショックを与え、菌体を活性化することが好ましい。混釈法により検出する場合には、寒天培地を融解して検体を加え、混和した後にシャーレに移して固化させる。塗抹法により検出する場合には、シャーレ中の固体培地上に検体を塗抹すればよい。メンブレンフィルター法により検出する場合には、検体をメンブレンフィルターを通して濾過した後、このフィルターをシャーレ中の固体培地上に置く。
【００３１】
培養は、グアイアコール産生菌の生育温度域（２０℃〜５５℃）であればいずれの温度で行ってもよいが、グアイアコール非産生菌からの選択性を高めるためには、５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、さらに好ましくは４０℃以下、特に好ましくは３０℃（２７℃〜３３℃）で行う。なお、本発明においては、±１０％程度の温度のずれであれば同様の効果が期待できる。本発明においては、驚くべきことに、バニリン酸を固体培地に添加することにより、グアイアコール産生菌の検出感度が非常に向上することが見いだされた。例えば、７５ｐｐｍのバニリン酸を含む固体培地で、ＡＡＴを３０℃で５日間培養すると、同じ培地で４５℃、３日間培養したときと同じ数のコロニーが形成されることが確認された。このことは、ＡＡＴの生育温度域において、正確に定量できることを示している。すなわち、本発明の方法は、検出感度を著しく高めることから、前培養が不要であるだけではなく、より正確な定量が迅速かつ簡便に行える画期的な方法である。さらに、低温とバニリン酸の影響から、対象外の菌が検出されることもない。また、バニリン酸の代わりにバニリンまたはフェルラ酸を用いた場合にも、同様の傾向が認められた。
【００３２】
培養を所定時間、例えば３〜５日間行った後に、目視でコロニーの有無を調べることにより、検体中にグアイアコール産生菌が存在するか否かを判定することができる。また、コロニーの数を計測することにより、検体の希釈率から容易に検体中の菌体の数を求めることができる。本発明の方法にしたがえば、特別な装置や熟練を必要とせずに、簡便に正確な定量的データを得ることができる。
【００３３】
別の観点においては、本発明は、検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットを提供する。このキットは、少なくとも、次式：
【化３】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される、メトキシフェノール骨格を有する化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地を含む。好酸性菌用固体培地は、滅菌されシャーレ中に作成された形で提供してもよく、混釈用にフラスコ、ボトルなどの中に作成された形で提供してもよい。メンブレンフィルター法用のキットは、メンブレンフィルターおよび濾過装置をさらに含んでいてもよい。キットはさらに、希釈列作成用のプレート、陽性対照用のグアイアコール産生菌および使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸を添加したＹＳＧ寒天培地を用いて、耐熱性好酸性菌（ＴＡＢ）がコロニーを形成しうるか否かを調べた。使用した菌株は、A.acidoterrestris ATCC49025、A.acidiphilus JCM21417、A.acidocaldarius ATCC27009、A.pomorum JCM21459の４菌株である。このうち、A.acidoterrestris ATCC49025、A.acidiphilus JCM21417は、グアイアコールを産生する菌株として報告されている。
【００３６】
ＹＳＧ培地（メルク（株）、ＹＧＳ Ａｇａｒ）２０．０ｇとバニリン酸（和光純薬工業（株））（０〜２５０ｍｇ）を水１０００ｇに加温溶解し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分間）を実施した。約５０℃に冷却後、１０％硫酸にてｐＨを３．７に調製し、平板培地を作製した。
【００３７】
各菌株の菌液に、７０℃、２０分間のヒートショックを実施した。菌液をリン酸緩衝生理食塩水にて段階希釈して、１０３ＣＦＵ／ｍＬとして、１００μＬずつを平板培地に塗沫して培養した。４５℃で３日間培養後、形成したコロニーを目視にて確認した。
【００３８】
バニリン酸を７５ｐｐｍ添加した場合には、グアイアコール産生菌２菌種は無添加培地と同等レベル以上検出したが、その他の２菌種はコロニーを１つも検出しなかった。バニリン酸を１００ｐｐｍ添加した場合には、A.acidoterrestris ATCC49025は無添加培地と同等レベル以上検出したが、その他の３菌種はコロニーを１つも検出しなかった。さらに、バニリン酸を１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ添加した水準においても、A.acidoterrestris ATCC49025は無添加培地と同等レベルの検出性を示した。バニリン酸を２２５ｐｐｍ添加するとＡＡＴの検出感度が低下し、２５０ｐｐｍ以上では検出されなかった。
【００３９】
次に、バニリン酸の代わりに、バニリンまたはフェルラ酸を用いて、同様の実験を行ったが、培地が固化し難い場合には、適宜寒天量を調節した。実施例１の結果を下記の表にまとめて示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例２
バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸を添加したＹＳＧ寒天培地を用いて、培養温度によるA.acidoterrestris ATCC49025のコロニー検出率の相違を調べた。ＹＳＧ培地にバニリン酸７５ｐｐｍを加えて、実施例１と同様にして固体培地を作成し、同数のA.acidoterrestris ATCC49025を含む菌液を平板培地に塗沫して、４５℃または３０℃で培養した。対照として無添加のＹＳＧ培地を用いた。
【００４２】
４５℃で３日間培養したときのコロニー数と、３０℃で５日間培養したときのコロニー数を下記の表に示す。値は無添加ＹＳＧ培地で４５℃、３日間培養したときのコロニー数を１００としたときの相対値である。
【００４３】
【表２】
【００４４】
無添加ＹＳＧ培地を用いて３０℃で５日間培養すると、４５℃で３日間培養したときに比べて十分なコロニーが検出できなかった。このことは、３０℃培養法では、前培養が必須であることを裏付けている。
【００４５】
一方、バニリン酸７５ｐｐｍを加えると、４５℃では無添加の培地に比べて多くコロニーが検出された。このことは、バニリン酸の添加によりA.acidoterrestris ATCC49025のコロニー形成が促進され、検出感度が高まったことを示唆する。バニリン酸７５ｐｐｍの代わりに、バニリン酸５０ｐｐｍ、バニリン７５０ｐｐｍ、またはフェルラ酸２５ｐｐｍ用いた場合も、検出感度が高くなった。
【００４６】
さらに、バニリン酸７５ｐｐｍを添加した場合には、３０℃で５日間培養した場合でも、４５℃３日間とほぼ同数のコロニーが検出された。バニリン酸の存在がグアイアコール非産生菌の増殖を抑制するという実施例１の結果と合わせると、検体をバニリン酸含有培地を用いて３０℃で培養することにより、グアイアコール産生菌を高い感度と特異性をもって検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法は、飲食品およびその製造原料の品質管理に有用である。本発明の方法は、従来の方法で必要とされていた、前培養や確認の為の処理（ぺルオキシターゼ法による呈色）を要せず、直接グアイアコール産生菌を検出でき、かつ直接定量できるので、品質に悪影響を与える菌の検出のための時間と費用を大幅に削減できる。さらに、本発明の方法に基づくグアイアコール産生菌検出キットは、前培養や確認の為の処理に用いる器具、試薬を要しない、コンパクトで簡便なものであり、迅速に検出できるので、産業上の有用性が高い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化４】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含む好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする、検体中のグアイアコール産生菌の検出方法。
【請求項２】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培養が２０℃〜５５℃で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
培養が２７℃〜３３℃で行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットであって、
次式：
【化５】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する滅菌された好酸性菌用固体培地を含むキット。
【請求項１０】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
次式：
【化６】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地からなる、グアイアコール産生菌検出培地。
【請求項１６】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項１５記載の培地。
【請求項１７】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項１５または１６に記載の培地。
【請求項１８】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１９】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項２０】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１】
次式：
【化４】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含む好酸性菌用固体培地上で検体もしくはその希釈物を培養し、形成されたコロニーを検出することを特徴とする、検体中のグアイアコール産生菌の検出方法。
【請求項２】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培養が２０℃〜５５℃で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
培養が２７℃〜３３℃で行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
検体中のグアイアコール産生菌を検出するためのキットであって、
次式：
【化５】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する滅菌された好酸性菌用固体培地を含むキット。
【請求項１０】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
好酸性菌用固体培地が５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
次式：
【化６】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基またはC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基およびアルケニル基は、-OH、-C(O)Hまたは-COOHで置換されていてもよい］
で表される化合物の１種またはそれ以上を含有する好酸性菌用固体培地からなる、グアイアコール産生菌検出培地。
【請求項１６】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、グアイアコール、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアクリルアルデヒド、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルプロピオン酸、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルメチルアルコール、メトキシハイドロキノン、４-ハイドロキシ-３-メトキシフェニルアセトアルデヒドおよび４-ビニルグアイアコールからなる群より選択される化合物の１種またはそれ以上を含有する、請求項１５記載の培地。
【請求項１７】
好酸性菌用固体培地が、バニリン、バニリン酸またはフェルラ酸のいずれかを含有する、請求項１５または１６に記載の培地。
【請求項１８】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上のバニリン酸、５００ｐｐｍ以上のバニリン、または２５ｐｐｍ以上のフェルラ酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１９】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上２２５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項２０】
好酸性菌用固体培地が、５０ｐｐｍ以上７５ｐｐｍ以下のバニリン酸を含有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【公開番号】特開２０１１−１９５０６（Ｐ２０１１−１９５０６Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２２７９６（Ｐ２００９−２２２７９６）
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００１０４３５３）カルピス株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００１０４３５３）カルピス株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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