グルタチオンの製造方法
【課題】グルタチオンの経済的な工業生産方法を提供する。
【解決手段】グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【解決手段】グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵母によるグルタチオンを製造する方法に関し、更に詳しくはグルタチオンを菌体外に生産する方法に関する。グルタチオンは、食品又は医薬品又は化粧品として有用である。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。
【０００３】
グルタチオンの製造方法には発酵法、有機合成法、および酵素法があるが、工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。発酵法により生産した場合、有機合成法や酵素法のように菌体外で生産する場合に比べ、菌体内で生産されるが故に生産物であるグルタチオンが安定であるというメリットがあるが、その菌体内含量が低いというデメリットがあった。これまで、培養菌体中のグルタチオン含量を向上させ、生産性を向上させるために、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１、２、３）やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献４、５、６、７、８）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加すること（特許文献９、１０、１１、１２）が試みられてきた。しかし、菌体内のグルタチオン含量に限りがあり、また培地中の菌体濃度にも限界があるため、発酵法では培養液量あたりのグルタチオン生産量は十分ではなかった。
【０００４】
一方、生産量を向上させるために、微生物菌体を界面活性剤、有機溶剤、細胞壁溶解酵素などで処理して細胞膜の透過性を高め、その処理菌体をグルタチオンの構成成分であるグルタミン酸、システイン、グリシンと接触させることにより、菌体外でグルタチオンを生産する酵素法が報告されている（特許文献１２、１３、１４、１５）。しかしながら、これらの方法において界面活性剤のみの処理ではグルタチオンの生産量は満足のいくものではなく（特許文献１４）、また高価なアデノシンー５’−３リン酸（ＡＴＰ）（特許文献１５）や細胞壁溶解酵素（特許文献１４）を界面活性剤とともに使用する方法は、生産コストがアップし、いずれの方法も工業的には実施しうるものではなかった。
【０００５】
また、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）が存在することが知られていたが、グルタチオンを生産する方法において、γ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠損することの有用性は知られていなかった。
このような背景のもと、菌体外にグルタチオンを生産する方法において、簡便で安価にその生産性を向上させる方法の開発が待望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献２】特開２００４−１８０５０９号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１９６３号公報
【特許文献４】特開昭６１−５２２９９号公報
【特許文献５】特開昭６２−２７５６８５号公報
【特許文献６】特開昭６３−１２９９８５号公報
【特許文献７】特開昭６４−５１０９８号公報
【特許文献８】特開平４−１７９４８４号公報
【特許文献９】特公昭５４−９９７号公報
【特許文献１０】特開昭４８−９２５７９号公報
【特許文献１１】特開昭５１−１３９６８６号公報
【特許文献１２】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献１３】特開昭５１−１４４７８９号公報
【特許文献１４】特開昭５３−９４０９０号公報
【特許文献１５】特開昭６０−２７３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、グルタチオンの経済的な工業生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）が存在するが、このγ−ＧＴＰ活性を低下させるあるいは欠損させた酵母菌を用いると、酵素法において、グルタチオンを菌体外に高濃度で生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法、
（２）γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である（１）に記載のグルタチオンの製造方法、
（３）微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、（１）または（２）に記載のグルタチオンの製造方法。
（４）グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である（１）〜（３）のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、
（５）酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である（４）に記載のグルタチオンの製造方法、
（６）膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、
（７）膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である（６）記載のグルタチオンの製造方法、
（８）界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である（７）記載のグルタチオンの製造方法、
（９）γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、高価なＡＴＰや細胞壁分解酵素を使用することなく、比較的安価な界面活性剤および／または有機溶剤などの膜処理剤で処理した酵母培養菌体を用いると、酵素法においてグルタチオンを菌体外に効率よく生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１〜２における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【図２】実施例２及び比較例３における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【図３】比較例４〜６における、菌体内でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明のグルタチオンの製造方法は、グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いて酵素法によりグルタチオンを微生物菌体外に生産する方法において、該微生物としてγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以降γ−ＧＴＰと記す）活性の低下した株を使用する。
【００１３】
グルタチオンの生産能を有する微生物とは、グルタチオンの生産能を有する微生物であれば、特に制限はなく、例えば、酵母、細菌が挙げられる。細菌としては大腸菌(Escherichia coli)が挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlesbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンディダ・トロピカリス(Candida toropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ(Schizosaccaromyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Toluropsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Toluropsis petrophophilum)などのトルロプシス属、その他ピキア（Pichia）属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられる。これら微生物の野生株、突然変異処理や遺伝子操作によりグルタチオンの合成に関与する酵素活性が高められた改良株を使用することができる。中でも、グルタチオンの生産性が高い、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましい。
【００１４】
中でも本発明者らの検討結果によれば、サッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。
【００１５】
遺伝子操作によりグルタチオン合成酵素であるγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を導入し、高発現するようにし、後述のようにγ―ＧＰＴ遺伝子を破壊した酵母がさらに好ましい。遺伝子の導入方法は特に限定されず、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法が可能であり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などが挙げられる。
【００１６】
本発明でγ−ＧＴＰ活性の低下した株としては、野生株と比較してγ−ＧＴＰ活性が低下していればよく、特に限定されないが、例えば、γ−ＧＴＰ活性が低下または消失されるように改変された株が挙げられる。γ−ＧＴＰ活性が低下または消失するように改変された株は、遺伝子操作的手法で得ることが可能である。例えば、γ−ＧＴＰ遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、または酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換により取得することが出来る。
【００１７】
具体的には、宿主微生物のゲノム配列のうち、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の５´領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｆを合成する。一方で、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の３´領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｒを合成する。次に、選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦおよびＤＮＡ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを宿主微生物に導入する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。γ−ＧＴＰ遺伝子と選択マーカー遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００１８】
また、γ−ＧＴＰ活性が低下または欠失されるように改変された株は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、ＵＶ照射などの通常の変異処理によって取得することもできる。
【００１９】
これら微生物の培養は通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等をほどよく含有しておれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【００２０】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【００２１】
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【００２２】
更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【００２３】
培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。
【００２４】
培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、さらに好ましくは４．５〜５．５に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量(通気量)は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、総容量２Ｌのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは２８〜３２℃である。
【００２５】
培地中への初期細胞濃度（植菌濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）で好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。
【００２６】
グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する酵母にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度および菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。
【００２７】
培養された菌体を適当な膜処理剤で前処理した後、例えばリン酸バッファー等の反応液中で、グルコース、およびグルタチオンを構成する３つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンと接触させることによりグルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。
【００２８】
また、培養された菌体を含む培養液に、直接、適当な膜処理剤を添加し、さらにグルコース、およびグルタチオンを構成する３つの前記アミノ酸と接触させることでも、グルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。
【００２９】
膜処理剤、グルコース、およびグルタチオンを構成する３つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンの添加のタイミングとしてはグルタチオンの生成能を有する微生物の培養の途中あるいは培養終了時、あるいはその直前のいずれも適用できるが、工業的には生産速度を高める上で、菌体濃度が高く、さらにはグルタチオン合成酵素活性も高められている培養終了時あるいはその直前が好ましい。
【００３０】
膜処理剤としては、界面活性剤および／または有機溶剤が用いられる。
【００３１】
界面活性剤としてはセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレンステアリルアミン、テトラデシルアミン酢酸塩、アルキルイニダゾリン４級塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム・クロライドなどのカチオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどのアニオン系界面活性剤、イソオクチルフェニルポリエトキシアルコール（商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ ２０）などの非イオン系界面活性剤、ジメチルアルキルベタインなどの両性界面活性剤、ヘキサデシルジメチルアミンなどのアミン系の界面活性剤などいずれも使用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤が合成反応速度の向上、グルタチオンの菌体外への漏出促進の面でより効果的で好ましい。
【００３２】
有機溶剤としてはトルエン、キシレン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが使用できる。
【００３３】
本発明で使用する膜処理剤の濃度としては０．０１〜２．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０２〜１．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．１〜０．６％（ｗ／ｖ）である。
【００３４】
膜処理された菌体と接触せしめてグルタチオンを得るための反応溶液は、グルタチオンを構成するアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンを含む。ここで用いるグルタミン酸は、ナトリウム塩、カリウム塩などの誘導体であってもよく、またシステイン、グリシンはその塩酸塩などの誘導体であっても良い。基質溶液中の各アミノ酸濃度は反応液中の菌濃度にもよるが、好ましくは１〜８００ｍＭ、より好ましくは５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００３５】
生産反応中のｐＨは使用する酵母にもよるが、好ましくは４〜１０、より好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８、同様に温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは２５〜４０℃に維持される。
【００３６】
反応溶液としては、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸−リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーが挙げられる。また、上述のように、培養終了後の菌体を含む培養液中で反応を行うことも可能である。
【００３７】
反応液中の菌体量は、好ましくは５０〜２５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）、より好ましくは１００〜２００（ｇ−湿菌体／Ｌ）である。５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）未満では菌体量が少なく反応速度が遅くなる傾向があり、２５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）より多いと反応液の混合状態が悪くなり、やはり反応速度が低下する傾向があるので好ましくない。
【００３８】
反応溶液には、必要に応じて反応を促進する成分を添加することもできる。反応を促進する成分としては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム化合物および酵素反応のエネルギー源としてのグルコース、廃糖蜜、ハイテストモラセス、コーンスティープリカーなど、さらには補酵素であるニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビン−アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが挙げられる。必要に応じてこれらを添加すれば反応効率を一層高めることが出来る。
【００３９】
菌体外に生産されたグルタチオンの精製方法としては通常の方法が適用できる。すなわち菌体をろ別（遠心分離）後、例えば銅塩沈殿、またはイオン交換樹脂等を用いて精製し、真空凍結乾燥により粗グルタチオン粉末を得、アルコール沈殿操作を数回繰り返すことにより、精製グルタチオンを得ることが出来る。
【００４０】
本発明者らの検討結果によれば、興味深いことに、通常の発酵法により菌体内にグルタチオンを蓄積させる方法でγ−ＧＴＰ活性が低下あるいは欠失した株を用いた場合には、γ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠失させる前の親株との比較においてグルタチオン生産量の向上効果は認められず、本発明の方法で開示されたような膜処理剤と接触させることにより細胞膜の透過性を促進し、グルタチオンを酵素法により菌体外に生産するようにした場合にのみ顕著なグルタチオンの生産性向上効果が認められた。
【００４１】
この理由については現時点では明らかではないが、熊谷の報告（非特許文献：化学と生物，２４，１３５，（１９８６））によればγ−ＧＴＰは細胞内で細胞膜上あるいはペリプラズム空間に局在していることが示唆されている。このようなγ−ＧＴＰの細胞内局在を考えると、通常の培養で、発酵法によりグルタチオンを菌体内に蓄積させた場合は菌体外に漏出するグルタチオンは極僅かであり、これらが細胞膜を通過する際にγ−ＧＴＰと接触、分解されてもその量が僅かであると考えられる。したがってγ−ＧＴＰ活性が低下あるいは欠失していない親株との比較において蓄積量には向上効果が認められなかったのではないかと推察される。
【００４２】
一方、膜処理剤を用い、酵素法により菌体外にグルタチオンを生産する方法ではグルタチオンの膜透過性が増し、グルタチオンが漏出する際、容易にγ−ＧＴＰと接触しやすくなる、またγ−ＧＴＰも菌体外に漏洩し、菌体外でのグルタチオンの分解も一層促進されるのではないかと考えられる。したがって本発明の方法で開示された菌体外にグルタチオンを生産する方法ではγ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠失させた株を用いることにより、顕著な生産性向上効果が認められたのではないかと推察している。
【００４３】
次に本発明の方法を、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（製造例１）ＧＳＨ１、２増強株の作成方法
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ１)をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＴＴＧＧＧＣ−３’（配列番号１）および５’−ＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＴ−３’(配列番号２)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳｐｅIおよびＢｇｌＩＩで消化して、２０３９ｂｐのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ＳｐｅI−ＢｇｌＩＩ断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ：１４５：７０１−７０８（２００９））に記載のｐＧＫ４０２のＳｐｅI−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、γ−グルタミルシステイン合成酵素発現プラスミドｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳを得た。
【００４５】
また、グルタチオン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ２)をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧ−３’(配列番号４)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳａｌIおよびＢｇｌＩＩで消化して、１４７８ｂｐのグルタチオン合成酵素遺伝子ＳａｌI−ＢｇｌＩＩ断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０５のＳａｌI−ＢｇｌＩ消化部位に連結し、グルタチオン合成酵素発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＧＳを得た。
【００４６】
得られたプラスミドｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳおよびｐＧＫ４０５−ＧＳを制限酵素ＳｔｕIおよびＥｃｏＲＩで消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳを得た。
【００４７】
（製造例２）ＧＳＨ１、２増強＋γ−ＧＴＰ欠損株の作成方法
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株のゲノム配列のうち、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列ｃｉｓ２の上流領域５０塩基と相同な配列およびｈｉｓ３遺伝子の開始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｆを合成する。一方で、ｃｉｓ２遺伝子配列の下流領域５０塩基と相同な配列およびｈｉｓ３遺伝子の終止コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｒを合成する。次に、ｈｉｓ３遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦおよびＤＮＡ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡをＹＰＨ４９９株に導入した。ＤＮＡは、酢酸リチウムを用いた形質転換法により宿主に導入した。γ−ＧＴＰ遺伝子とｈｉｓ３遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、ヒスチジンを含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。この結果、組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を得た。
【００４８】
（実施例１）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００４９】
培養後の酵母菌体を回収し、湿重量２ｇの酵母菌体に、反応液（０．２Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．０），０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ ｍＭ ＣａＣｌ２，０．４ Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，１０ ｍＭ Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ，１０ ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ）２０ｍｌを添加し、バッフル付き三角フラスコにて３７℃、２００ｒｐｍで２４時間反応させた。
【００５０】
反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
グルタチオンは次のようにして分析した。サンプリングした培養液１０ｍｌを遠心分離により上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を２回繰り返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−８０℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に５ｍｌのＨＰＬＣ移動相（３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２０％（ｗ／ｖ）1−ヘプタンスルホン酸Ｎａ，９６．８％リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．８））を添加、懸濁し、その１ｍｌを８５℃で５分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。
【００５１】
（比較例１）親株の菌体外でのグルタチオン生産
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子を導入せず、野生型γ−ＧＴＰ遺伝子を有しているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ４９９株を使用した以外は実施例１と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５２】
（比較例２）遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は実施例１と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５３】
実施例１、比較例１及び２の結果を図１に示す。図１からわかるように、親株であるＹＰＨ４９９株のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が３０５ｍｇ／ｌであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が４３０ｍｇ／ｌと高まった。この結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５４】
また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が５１０ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を上回り、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５５】
（実施例２）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００５６】
培養終了後の培養液にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．４％），ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ），ＣａＣｌ２（１０ｍＭ），Ｇｌｕｃｏｓｅ（０．４Ｍ），Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（５００ｍＭ），Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（１２０ｍＭ），Ｇｌｙｃｉｎｅ（６０ｍＭ）（括弧内の記載は、培養終了後の培養液量を基準に計算した）を直接添加し、バッフル付き三角フラスコにて３７℃、２００ｒｐｍで２４時間反応させた。
反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５７】
（比較例３）遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は実施例２と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５８】
実施例２及び比較例３の結果を図２に示す。図２からわかるように、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が１４５０ｍｇ／ｌであったのに対し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が３３００ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を上回り、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５９】
（比較例４）親株の菌体内でのグルタチオン生産
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ１)及びグルタチオン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ２)を導入せず、野生型γ−ＧＴＰ遺伝子を有しているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ４９９株を、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００６０】
培養終了後の培養液から菌体を回収し、菌体中のグルタチオン含量、菌濃度（ＯＤ６００）を測定した。得られた菌体中のグルタチオン含量および菌濃度を掛け合わせることで、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６１】
（比較例５）遺伝子組換え株の菌体内でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は比較例４と同様にして、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６２】
（比較例６）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体内でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を使用した以外は比較例４と同様にして、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６３】
比較例４〜６の結果を図３に示す。図３からわかるように、親株であるＹＰＨ４９９株のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が２６ｍｇ／ｌであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が５３ｍｇ／ｌと高まった。本結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が４６ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株よりも低く、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果は菌体内にグルタチオンを蓄積させる従来の方法では認められなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵母によるグルタチオンを製造する方法に関し、更に詳しくはグルタチオンを菌体外に生産する方法に関する。グルタチオンは、食品又は医薬品又は化粧品として有用である。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。
【０００３】
グルタチオンの製造方法には発酵法、有機合成法、および酵素法があるが、工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。発酵法により生産した場合、有機合成法や酵素法のように菌体外で生産する場合に比べ、菌体内で生産されるが故に生産物であるグルタチオンが安定であるというメリットがあるが、その菌体内含量が低いというデメリットがあった。これまで、培養菌体中のグルタチオン含量を向上させ、生産性を向上させるために、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１、２、３）やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献４、５、６、７、８）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加すること（特許文献９、１０、１１、１２）が試みられてきた。しかし、菌体内のグルタチオン含量に限りがあり、また培地中の菌体濃度にも限界があるため、発酵法では培養液量あたりのグルタチオン生産量は十分ではなかった。
【０００４】
一方、生産量を向上させるために、微生物菌体を界面活性剤、有機溶剤、細胞壁溶解酵素などで処理して細胞膜の透過性を高め、その処理菌体をグルタチオンの構成成分であるグルタミン酸、システイン、グリシンと接触させることにより、菌体外でグルタチオンを生産する酵素法が報告されている（特許文献１２、１３、１４、１５）。しかしながら、これらの方法において界面活性剤のみの処理ではグルタチオンの生産量は満足のいくものではなく（特許文献１４）、また高価なアデノシンー５’−３リン酸（ＡＴＰ）（特許文献１５）や細胞壁溶解酵素（特許文献１４）を界面活性剤とともに使用する方法は、生産コストがアップし、いずれの方法も工業的には実施しうるものではなかった。
【０００５】
また、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）が存在することが知られていたが、グルタチオンを生産する方法において、γ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠損することの有用性は知られていなかった。
このような背景のもと、菌体外にグルタチオンを生産する方法において、簡便で安価にその生産性を向上させる方法の開発が待望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献２】特開２００４−１８０５０９号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１９６３号公報
【特許文献４】特開昭６１−５２２９９号公報
【特許文献５】特開昭６２−２７５６８５号公報
【特許文献６】特開昭６３−１２９９８５号公報
【特許文献７】特開昭６４−５１０９８号公報
【特許文献８】特開平４−１７９４８４号公報
【特許文献９】特公昭５４−９９７号公報
【特許文献１０】特開昭４８−９２５７９号公報
【特許文献１１】特開昭５１−１３９６８６号公報
【特許文献１２】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献１３】特開昭５１−１４４７８９号公報
【特許文献１４】特開昭５３−９４０９０号公報
【特許文献１５】特開昭６０−２７３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、グルタチオンの経済的な工業生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）が存在するが、このγ−ＧＴＰ活性を低下させるあるいは欠損させた酵母菌を用いると、酵素法において、グルタチオンを菌体外に高濃度で生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法、
（２）γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である（１）に記載のグルタチオンの製造方法、
（３）微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、（１）または（２）に記載のグルタチオンの製造方法。
（４）グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である（１）〜（３）のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、
（５）酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である（４）に記載のグルタチオンの製造方法、
（６）膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、
（７）膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である（６）記載のグルタチオンの製造方法、
（８）界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である（７）記載のグルタチオンの製造方法、
（９）γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、高価なＡＴＰや細胞壁分解酵素を使用することなく、比較的安価な界面活性剤および／または有機溶剤などの膜処理剤で処理した酵母培養菌体を用いると、酵素法においてグルタチオンを菌体外に効率よく生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１〜２における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【図２】実施例２及び比較例３における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【図３】比較例４〜６における、菌体内でのグルタチオン生産性を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明のグルタチオンの製造方法は、グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いて酵素法によりグルタチオンを微生物菌体外に生産する方法において、該微生物としてγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以降γ−ＧＴＰと記す）活性の低下した株を使用する。
【００１３】
グルタチオンの生産能を有する微生物とは、グルタチオンの生産能を有する微生物であれば、特に制限はなく、例えば、酵母、細菌が挙げられる。細菌としては大腸菌(Escherichia coli)が挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlesbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンディダ・トロピカリス(Candida toropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ(Schizosaccaromyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Toluropsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Toluropsis petrophophilum)などのトルロプシス属、その他ピキア（Pichia）属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられる。これら微生物の野生株、突然変異処理や遺伝子操作によりグルタチオンの合成に関与する酵素活性が高められた改良株を使用することができる。中でも、グルタチオンの生産性が高い、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましい。
【００１４】
中でも本発明者らの検討結果によれば、サッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。
【００１５】
遺伝子操作によりグルタチオン合成酵素であるγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を導入し、高発現するようにし、後述のようにγ―ＧＰＴ遺伝子を破壊した酵母がさらに好ましい。遺伝子の導入方法は特に限定されず、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法が可能であり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などが挙げられる。
【００１６】
本発明でγ−ＧＴＰ活性の低下した株としては、野生株と比較してγ−ＧＴＰ活性が低下していればよく、特に限定されないが、例えば、γ−ＧＴＰ活性が低下または消失されるように改変された株が挙げられる。γ−ＧＴＰ活性が低下または消失するように改変された株は、遺伝子操作的手法で得ることが可能である。例えば、γ−ＧＴＰ遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、または酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換により取得することが出来る。
【００１７】
具体的には、宿主微生物のゲノム配列のうち、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の５´領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｆを合成する。一方で、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の３´領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｒを合成する。次に、選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦおよびＤＮＡ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを宿主微生物に導入する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。γ−ＧＴＰ遺伝子と選択マーカー遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００１８】
また、γ−ＧＴＰ活性が低下または欠失されるように改変された株は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、ＵＶ照射などの通常の変異処理によって取得することもできる。
【００１９】
これら微生物の培養は通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等をほどよく含有しておれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【００２０】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【００２１】
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【００２２】
更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【００２３】
培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。
【００２４】
培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、さらに好ましくは４．５〜５．５に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量(通気量)は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、総容量２Ｌのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは２８〜３２℃である。
【００２５】
培地中への初期細胞濃度（植菌濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）で好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。
【００２６】
グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する酵母にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度および菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。
【００２７】
培養された菌体を適当な膜処理剤で前処理した後、例えばリン酸バッファー等の反応液中で、グルコース、およびグルタチオンを構成する３つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンと接触させることによりグルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。
【００２８】
また、培養された菌体を含む培養液に、直接、適当な膜処理剤を添加し、さらにグルコース、およびグルタチオンを構成する３つの前記アミノ酸と接触させることでも、グルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。
【００２９】
膜処理剤、グルコース、およびグルタチオンを構成する３つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンの添加のタイミングとしてはグルタチオンの生成能を有する微生物の培養の途中あるいは培養終了時、あるいはその直前のいずれも適用できるが、工業的には生産速度を高める上で、菌体濃度が高く、さらにはグルタチオン合成酵素活性も高められている培養終了時あるいはその直前が好ましい。
【００３０】
膜処理剤としては、界面活性剤および／または有機溶剤が用いられる。
【００３１】
界面活性剤としてはセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレンステアリルアミン、テトラデシルアミン酢酸塩、アルキルイニダゾリン４級塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム・クロライドなどのカチオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどのアニオン系界面活性剤、イソオクチルフェニルポリエトキシアルコール（商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ ２０）などの非イオン系界面活性剤、ジメチルアルキルベタインなどの両性界面活性剤、ヘキサデシルジメチルアミンなどのアミン系の界面活性剤などいずれも使用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤が合成反応速度の向上、グルタチオンの菌体外への漏出促進の面でより効果的で好ましい。
【００３２】
有機溶剤としてはトルエン、キシレン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが使用できる。
【００３３】
本発明で使用する膜処理剤の濃度としては０．０１〜２．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０２〜１．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．１〜０．６％（ｗ／ｖ）である。
【００３４】
膜処理された菌体と接触せしめてグルタチオンを得るための反応溶液は、グルタチオンを構成するアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび／またはシスチン、グリシンを含む。ここで用いるグルタミン酸は、ナトリウム塩、カリウム塩などの誘導体であってもよく、またシステイン、グリシンはその塩酸塩などの誘導体であっても良い。基質溶液中の各アミノ酸濃度は反応液中の菌濃度にもよるが、好ましくは１〜８００ｍＭ、より好ましくは５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００３５】
生産反応中のｐＨは使用する酵母にもよるが、好ましくは４〜１０、より好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８、同様に温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは２５〜４０℃に維持される。
【００３６】
反応溶液としては、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸−リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーが挙げられる。また、上述のように、培養終了後の菌体を含む培養液中で反応を行うことも可能である。
【００３７】
反応液中の菌体量は、好ましくは５０〜２５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）、より好ましくは１００〜２００（ｇ−湿菌体／Ｌ）である。５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）未満では菌体量が少なく反応速度が遅くなる傾向があり、２５０（ｇ−湿菌体／Ｌ）より多いと反応液の混合状態が悪くなり、やはり反応速度が低下する傾向があるので好ましくない。
【００３８】
反応溶液には、必要に応じて反応を促進する成分を添加することもできる。反応を促進する成分としては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム化合物および酵素反応のエネルギー源としてのグルコース、廃糖蜜、ハイテストモラセス、コーンスティープリカーなど、さらには補酵素であるニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビン−アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが挙げられる。必要に応じてこれらを添加すれば反応効率を一層高めることが出来る。
【００３９】
菌体外に生産されたグルタチオンの精製方法としては通常の方法が適用できる。すなわち菌体をろ別（遠心分離）後、例えば銅塩沈殿、またはイオン交換樹脂等を用いて精製し、真空凍結乾燥により粗グルタチオン粉末を得、アルコール沈殿操作を数回繰り返すことにより、精製グルタチオンを得ることが出来る。
【００４０】
本発明者らの検討結果によれば、興味深いことに、通常の発酵法により菌体内にグルタチオンを蓄積させる方法でγ−ＧＴＰ活性が低下あるいは欠失した株を用いた場合には、γ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠失させる前の親株との比較においてグルタチオン生産量の向上効果は認められず、本発明の方法で開示されたような膜処理剤と接触させることにより細胞膜の透過性を促進し、グルタチオンを酵素法により菌体外に生産するようにした場合にのみ顕著なグルタチオンの生産性向上効果が認められた。
【００４１】
この理由については現時点では明らかではないが、熊谷の報告（非特許文献：化学と生物，２４，１３５，（１９８６））によればγ−ＧＴＰは細胞内で細胞膜上あるいはペリプラズム空間に局在していることが示唆されている。このようなγ−ＧＴＰの細胞内局在を考えると、通常の培養で、発酵法によりグルタチオンを菌体内に蓄積させた場合は菌体外に漏出するグルタチオンは極僅かであり、これらが細胞膜を通過する際にγ−ＧＴＰと接触、分解されてもその量が僅かであると考えられる。したがってγ−ＧＴＰ活性が低下あるいは欠失していない親株との比較において蓄積量には向上効果が認められなかったのではないかと推察される。
【００４２】
一方、膜処理剤を用い、酵素法により菌体外にグルタチオンを生産する方法ではグルタチオンの膜透過性が増し、グルタチオンが漏出する際、容易にγ−ＧＴＰと接触しやすくなる、またγ−ＧＴＰも菌体外に漏洩し、菌体外でのグルタチオンの分解も一層促進されるのではないかと考えられる。したがって本発明の方法で開示された菌体外にグルタチオンを生産する方法ではγ−ＧＴＰ活性を低下あるいは欠失させた株を用いることにより、顕著な生産性向上効果が認められたのではないかと推察している。
【００４３】
次に本発明の方法を、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（製造例１）ＧＳＨ１、２増強株の作成方法
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ１)をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＴＴＧＧＧＣ−３’（配列番号１）および５’−ＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＴ−３’(配列番号２)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳｐｅIおよびＢｇｌＩＩで消化して、２０３９ｂｐのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ＳｐｅI−ＢｇｌＩＩ断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ：１４５：７０１−７０８（２００９））に記載のｐＧＫ４０２のＳｐｅI−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、γ−グルタミルシステイン合成酵素発現プラスミドｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳを得た。
【００４５】
また、グルタチオン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ２)をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧ−３’(配列番号４)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳａｌIおよびＢｇｌＩＩで消化して、１４７８ｂｐのグルタチオン合成酵素遺伝子ＳａｌI−ＢｇｌＩＩ断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０５のＳａｌI−ＢｇｌＩ消化部位に連結し、グルタチオン合成酵素発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＧＳを得た。
【００４６】
得られたプラスミドｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳおよびｐＧＫ４０５−ＧＳを制限酵素ＳｔｕIおよびＥｃｏＲＩで消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳを得た。
【００４７】
（製造例２）ＧＳＨ１、２増強＋γ−ＧＴＰ欠損株の作成方法
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株のゲノム配列のうち、γ−ＧＴＰ遺伝子をコードしている遺伝子配列ｃｉｓ２の上流領域５０塩基と相同な配列およびｈｉｓ３遺伝子の開始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｆを合成する。一方で、ｃｉｓ２遺伝子配列の下流領域５０塩基と相同な配列およびｈｉｓ３遺伝子の終止コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｒを合成する。次に、ｈｉｓ３遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦおよびＤＮＡ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡをＹＰＨ４９９株に導入した。ＤＮＡは、酢酸リチウムを用いた形質転換法により宿主に導入した。γ−ＧＴＰ遺伝子とｈｉｓ３遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、ヒスチジンを含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。この結果、組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を得た。
【００４８】
（実施例１）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００４９】
培養後の酵母菌体を回収し、湿重量２ｇの酵母菌体に、反応液（０．２Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．０），０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ ｍＭ ＣａＣｌ２，０．４ Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，１０ ｍＭ Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ，１０ ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ）２０ｍｌを添加し、バッフル付き三角フラスコにて３７℃、２００ｒｐｍで２４時間反応させた。
【００５０】
反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
グルタチオンは次のようにして分析した。サンプリングした培養液１０ｍｌを遠心分離により上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を２回繰り返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−８０℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に５ｍｌのＨＰＬＣ移動相（３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２０％（ｗ／ｖ）1−ヘプタンスルホン酸Ｎａ，９６．８％リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．８））を添加、懸濁し、その１ｍｌを８５℃で５分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。
【００５１】
（比較例１）親株の菌体外でのグルタチオン生産
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子を導入せず、野生型γ−ＧＴＰ遺伝子を有しているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ４９９株を使用した以外は実施例１と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５２】
（比較例２）遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は実施例１と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５３】
実施例１、比較例１及び２の結果を図１に示す。図１からわかるように、親株であるＹＰＨ４９９株のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が３０５ｍｇ／ｌであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が４３０ｍｇ／ｌと高まった。この結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５４】
また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が５１０ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を上回り、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５５】
（実施例２）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００５６】
培養終了後の培養液にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．４％），ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ），ＣａＣｌ２（１０ｍＭ），Ｇｌｕｃｏｓｅ（０．４Ｍ），Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（５００ｍＭ），Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（１２０ｍＭ），Ｇｌｙｃｉｎｅ（６０ｍＭ）（括弧内の記載は、培養終了後の培養液量を基準に計算した）を直接添加し、バッフル付き三角フラスコにて３７℃、２００ｒｐｍで２４時間反応させた。
反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５７】
（比較例３）遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は実施例２と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を測定した。
【００５８】
実施例２及び比較例３の結果を図２に示す。図２からわかるように、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が１４５０ｍｇ／ｌであったのに対し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が３３００ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を上回り、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。
【００５９】
（比較例４）親株の菌体内でのグルタチオン生産
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ１)及びグルタチオン合成酵素遺伝子(ｇｓｈ２)を導入せず、野生型γ−ＧＴＰ遺伝子を有しているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ４９９株を、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＹＰＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。
【００６０】
培養終了後の培養液から菌体を回収し、菌体中のグルタチオン含量、菌濃度（ＯＤ６００）を測定した。得られた菌体中のグルタチオン含量および菌濃度を掛け合わせることで、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６１】
（比較例５）遺伝子組換え株の菌体内でのグルタチオン生産
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株を使用した以外は比較例４と同様にして、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６２】
（比較例６）遺伝子組換えγ−ＧＴＰ欠損株の菌体内でのグルタチオン生産
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株を使用した以外は比較例４と同様にして、培養液あたりのグルタチオン（ＧＳＨ）濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。
【００６３】
比較例４〜６の結果を図３に示す。図３からわかるように、親株であるＹＰＨ４９９株のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が２６ｍｇ／ｌであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が５３ｍｇ／ｌと高まった。本結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−ＧＴＰ遺伝子を破壊したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ、Δγ−ＧＴＰ株では、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が４６ｍｇ／ｌとＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＧＳ、ｐＧＫ４０２−γ−ＧＣＳ株よりも低く、γ−ＧＴＰ破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果は菌体内にグルタチオンを蓄積させる従来の方法では認められなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、
該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【請求項２】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である請求項１記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項３】
微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、請求項１または２記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項４】
グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である請求項１〜３のいずれか１項記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項５】
酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である請求項４記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項６】
膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、および、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む請求項１〜５のいずれか１項記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項７】
膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である請求項６記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項８】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である請求項７記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項９】
γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母。
【請求項１】
グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、
該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【請求項２】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である請求項１記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項３】
微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、請求項１または２記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項４】
グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である請求項１〜３のいずれか１項記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項５】
酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である請求項４記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項６】
膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、および、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む請求項１〜５のいずれか１項記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項７】
膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である請求項６記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項８】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である請求項７記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項９】
γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１００６２２（Ｐ２０１２−１００６２２Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５３８９７（Ｐ２０１０−２５３８９７）
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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