グループＢストレプトコッカス・タイプＩＩおよびタイプＶ多糖−蛋白質接合ワクチン
【課題】グループＢストレプトコッカス・タイプII（ＧＢＳ II）及び／又はグループＢストレプトコッカス・タイプＶ（ＧＢＳ Ｖ）による感染に対して、人間を含む哺乳類を免疫化させるワクチン及び方法を提供すること。
【解決手段】グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）タイプＶバクテリアに由来する莢膜多糖と、蛋白質成分を含み、該多糖成分のシアル酸残基で終わる２以上の側鎖が、第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされており、該多糖の分子量が５０００ダルトン以上であることを特徴とする抗原接合分子。
【解決手段】グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）タイプＶバクテリアに由来する莢膜多糖と、蛋白質成分を含み、該多糖成分のシアル酸残基で終わる２以上の側鎖が、第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされており、該多糖の分子量が５０００ダルトン以上であることを特徴とする抗原接合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
グループＢストレプトコッカス・タイプIIおよびタイプＶ多糖−蛋白質接合ワクチン発明は、１９９２年９月２４日に出願された米国特許出願第０７／９４９，９７０号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の権利に関する説明
発明は、国立衛生研究所の支給するＮＩＨ交付金Ａ１２３３３９、Ａ１３０６２８およびＡ１２８０４０により、政府の援助で行われた。政府は、本発明に若干の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
発明は、蛋白質に共役結合したグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖（capsular polysaccharide）から成る抗原接合分子（antigenic conjugate molecule）に関する。また本発明は、グループＢストレプトコッカス・タイプII（ＧＢＳII）および／またはタイプＶ（ＧＢＳＶ）による感染に対してヒトを包含する哺乳動物を免疫するワクチンおよび方法に関する。本発明の接合分子から成る多価ワクチンおよび他の病原菌に対する抗原も請求される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
グループＢストレプトコッカス類（ＧＢＳ）による感染は、発展途上国での新生児における敗血症および髄膜炎の最も普通の共通の原因である（３、３１）。米国の二三のセンターからの最近の報告は、多分早期の診断および集中医療の結果として、１９７０年代からの一連の報告におけるよりも低い死亡率（９ないし１３％）を示している（１、１０）。それにもかかわらず、致死感染がやはり起こっており、同じように見過ごせないのは、ＧＢＳ髄膜炎の生存者の５０％までが難聴および軽度の学習能力欠失から強い運動、知覚および認識の損傷に亘る慢性の神経学的損傷を持っている（３）。改良された診断または治療でなく予防が、ＧＢＳに関連する罹患率および死亡率を減らすのに一番重要な効果を持つようである。
【０００５】
ＧＢＳの莢膜多糖特異性の抗体は実験動物（２３、２４）およびヒト幼児（４、５）の両方を保護するようであるので、若干の多糖を精製し、実験的ワクチンとして健常成人で試験した（６）。安全で有効なＧＢＳワクチンが入手可能であれば、妊娠前または妊娠中の女性に投与して、子宮内の胎児に移行し、新生児の感染を防御する抗体を誘発することができる。ボランティアで試験した三種のＧＢＳ多糖（タイプＩａ、II、III）のうち、タイプIIは最高の免疫原性を有し、事前非免疫の受容体の８８％にタイプII特異性の抗体応答を誘発する（６）。種々のＧＢＳの血清型がＧＢＳ感染の患者のパーセントに重大な寄与をすることが従来認められてきたが、タイプＶはＧＢＳ感染の高いパーセントの原因となるとは考えられて来なかった。新生児では、タイプIIＧＢＳ感染からの保護に必要な特定の抗体の水準は正確には明示されていないが、２または３μｇ／ｍｌと評価されてきた（６）。保護に必要な最小量をごく僅かに超える抗体応答を達成するワクチン受容体では、母体のＩｇＧの胎児または後期感染開始の幼児への不完全な移行のため、胎盤を通って移行する母体の抗体の量は、早産児を保護するのには不充分である。新生児内の母体の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の半減期は約２５日であるからである（１３）。予防接種への特定の抗体の応答の規模が大きい場合、この二群の患者内の幼児の多くは保護される。母体のＩｇＧの胎児への移行は、第三の３ケ月期の間を通じて増加し、そのため母体の抗体水準が高いほど、保護は早くなり、すなわち、早熟度の高い幼児を保護する（１６）。同様に、母体の水準が高いと、幼児内での母体の抗体の持続が長くなり、そのためさらに後期開始の疾患を保護する。
【０００６】
種々の細菌性多糖抗体の免疫原性が、多糖または誘導体オリゴ糖への適当な担体蛋白質の接続によって増加されてきた（２、１４，１７−１９、２２、２７、２９、３０、３４）。多糖−蛋白質接合ワクチンに望まれる性質には、多糖の高い免疫原性、ブースター投与量への高いハプテン特異性抗体応答、およびＩｇＧクラスの抗体の優勢が含まれる。最近我々は、指定の蛋白質カップリングの部位として側鎖シアル酸部分を使用することによって、ＧＢＳIII−破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンを開発することに成功した（３３）。III−ＴＴワクチンは、ＧＢＳタイプIII−特異性のオプソニン活性の抗体を誘発し、非共役のタイプIII多糖はウサギにおいて非免疫原性であった（３３）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明は、タイプIIまたはタイプＶの多糖成分のシアル酸残基中で終わる２以上の側鎖が第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされていることを特徴とする、グループＢストレプトコッカス・タイプIIから誘導された莢膜多糖と蛋白質成分を含む抗原接合分子、またはグループＢストレプトコッカス・タイプＶから誘導された莢膜多糖と蛋白質成分から成る抗原接合分子である。
【０００８】
更に、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖と蛋白質との接合分子を製造するための方法において、
（ａ）グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖を、多糖の骨格に結合した二つ以上の末端シアル酸残基中にアルデヒド基を導入するのに充分な過ヨウ素酸酸化に供し；
（ｂ）酸化されたグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖を、還元的アミノ化によって蛋白質に結合させて、莢膜多糖と蛋白質の間に第二アミン結合を形成させる
ことから成る方法も請求されている。
【０００９】
また、上記の方法で製造された接合分子も請求されている。
【００１０】
本発明は、さらに上記の接合分子のそれぞれから成るワクチンも請求する。さらに本発明は、本発明の接合分子およびグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶ以外の病原性物質に対する抗体の製造を誘発しうる他の免疫原性分子の少なくとも一種を含む多価ワクチンを請求する。特に、ＧＢＳタイプIIおよび／またはＧＢＳタイプＶの接合分子を含むことに加えて、本発明による多価ワクチンはさらにグループＢストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、III、IVおよびヘモフィラス・インフルエンゼ・タイプｂおよびエシェリキア・コリ・タイプＫ１から成る群から選ばれた病原体に抗体の産生を誘発できる他の免疫原性分子を含む。
【００１１】
本発明の別の実施態様では、誕生時の新生児における感染症に対する保護を生じさせるのに充分な量、ワクチンの投与の前または後に身籠もった胎児に推移しうる抗体を産生するために、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、女性に投薬することを特徴とする、新生児を免疫性にする方法が請求される。
【００１２】
本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、成人に投与することを特徴とする、成人を免疫性にする方法も請求する。さらに、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶに感染される危険性のある人に、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量で投薬することを特徴とする、成人を免疫性にする方法も請求する。
【００１３】
本発明の別の実施態様においては、上記のグループに積極的に投与できる血清または血漿を供給できるボランティアのワクチン受容体に、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、投与する。本発明はまた、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶ感染される危険性のある新生児、小児または成人を含む人を免疫する方法も提供する。危険性のある人には、癌または糖尿病を含む種々の原因で免疫系が抑制されている人を含んでもよく、癌または糖尿病に限定されない。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、乳牛に投薬することから成る、乳牛類のウシ乳腺炎に対する免疫法である。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
項目１．グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶバクテリアから誘導される群から選ばれる莢膜多糖と、蛋白質成分を含み、この多糖成分のシアル酸残基で終わる２以上の側鎖が、第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされており、上記多糖の分子量が５０００ダルトン以上であることを特徴とする抗原接合分子。
項目２．各多糖の末端シアル酸残基の５〜５０％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目１の接合分子。
項目３．各多糖の末端シアル酸残基の５〜２５％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目２の接合分子。
項目４．各多糖の末端シアル酸残基の５〜１０％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目３の接合分子。
項目５．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖の末端シアル酸残基の７％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目４の接合分子。
項目６．上記抗原接合分子が０．２ミクロンのフィルターを通して濾過減菌されうる項目１の接合分子。
項目７．上記多糖成分が約５，０００〜１，０００，０００ダルトンの分子量を有する項目１の接合分子。
項目８．上記多糖成分が約５０，０００〜５００，０００ダルトンの分子量を有する項目７の接合分子。
項目９．上記多糖がＧＢＳタイプＶであり、各多糖の末端シアル酸残基の約２５％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目１の接合分子。
項目１０．上記多糖成分が約１００，０００〜３００，０００ダルトンの分子量を有する項目８の接合分子。
項目１１．上記多糖成分が約２００，０００ダルトンの分子量を有する項目９の接合分子。
項目１２．上記蛋白質が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ（交差反応物質）１９７からなる群から選ばれる項目１の接合分子。
項目１３．グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶバクテリアの莢膜多糖と蛋白質の接合分子を製造する方法であって、（ａ）グループＢのストレプトコッカス・タイプIIの莢膜多糖を、該多糖の骨格にリンクした２以上の末端シアル酸残基にアルデヒド基を導入するに充分なだけ、過ヨウ素酸化し、（ｂ）酸化されたグループＢのストレプトコッカス・タイプIIの莢膜多糖を、還元的アミノ化によって、蛋白質と連結させ、莢膜多糖と蛋白質の間に第二アミン結合を生じさせることを特徴とする方法。
項目１４．各多糖のシアル酸残基の約５〜５０％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１３の方法。
項目１５．各多糖のシアル酸残基の約５〜２５％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１４の方法。
項目１６．各多糖のシアル酸残基の約５〜１０％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１５の方法。
項目１７．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖のシアル酸残基の７％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１６の方法。
項目１８．各多糖のシアル酸残基の約５〜５０％が蛋白質に共有結合的にリンクされる項目１３の方法。
項目１９．各多糖のシアル酸残基の約５〜２５％が蛋白質に共有結合的にリンクされる項目１８の方法。
項目２０．各多糖のシアル酸残基の約５〜１０％が蛋白質に共役結合的にリンクされる項目１９の方法。
項目２１．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖のシアル酸残基の約５％が共有結合的に蛋白質にリンクされる項目１９の方法。
項目２２．上記多糖がＧＢＳタイプＶであり、各多糖の末端シアル酸残基の約２５％が蛋白質にリンクされる項目１３の方法。
項目２３．項目１３の方法により製造される接合分子。
項目２４．項目１の接合分子を含むワクチン。
項目２５．項目１の接合分子と、グループＢのストレプトコッカス・タイプII以外の病原性物質に対する抗体の産出を引き出しうる他の免疫原性分子の少なくとも一種を含む多価ワクチン。
項目２６．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III、IVおよびＶ、ヘモフィラス・インフルエンザ・タイプｂ及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２５の多価ワクチン。
項目２７．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III、ヘモフィラス・インフルエンザ・タイプｂ及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２６の多価ワクチン。
項目２８．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２７の多価ワクチン。
項目２９．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、IIIからなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２８の多価ワクチン。
項目３０．項目１の接合分子を、免疫原性量、女性に投薬し、十分量のワクチンの投薬の前又は後に身籠った胎児に移行しうる抗体を産出させ、誕生時の新生児における感染症に対する保護を生じさせることを特徴とする新生児を免疫性にする方法。
項目３１．上記ワクチンが、妊娠前に投薬される項目３０の方法。
項目３２．上記ワクチンが約１０歳から５０歳の間の女性に投薬される項目３０の方法。
項目３３．上記ワクチンが、妊娠期間中に投薬される項目３０の方法。
項目３４．項目１の接合分子を含むワクチンを人に免疫原性量で投薬する人を免疫性にする方法。
項目３５．項目１の接合分子を含むワクチンを、グループＢのストレプトコッカス・タイプII又はタイプＶにより感染される危険性のある人に免疫原性量で投薬する成人を免疫性にする方法。
項目３６．上記ワクチンを免疫系が抑制される人に投薬する項目３５の方法。
項目３７．免疫抑制が癌又は糖尿病からなる群から選ばれる病気によるものである項目３６の方法。
項目３８．上記ワクチンが、薬学的に許容される担体で、投薬される項目３７の方法。
項目３９．項目１の接合分子を含むワクチンを、免疫原性量、乳牛に投薬することを特徴とする牛類の乳腺炎に対して乳牛類を免疫性にする方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組成物を、妊娠前または妊娠中の女性に投与することによって、子宮内の胎児に移行し、新生児のグループＢストレプトコッカス類（ＧＢＳ）による感染を防御する抗体を誘発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】タイプIIＧＢＳ莢膜多糖のヘプタサッカライド繰り返し単位の構造（９２０）。
【図２】ＧＢＳタイプII多糖競合ＥＬＩＳＡ。タイプII多糖を塗布したプレートにII−ＴＴワクチン抗体結合の抑制剤としてＧＢＳタイプＩａ（白丸）、タイプII（黒丸）、およびタイプIII（黒三角）の多糖が使用された。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図３】ＧＢＳタイプII多糖競合ＥＬＩＳＡ。天然（黒丸）および脱シアリル化またはコア（□）タイプII多糖をII−ＴＴワクチンで誘発した抗体の抑制剤として使用した。データ点は、三回の測定の平均（標準偏差つき）である。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図４】タイプＶＧＢＳ莢膜多糖の繰り返し単位の構造。
【図５】ＧＢＳタイプＶ多糖競合ＥＬＩＳＡ。ＧＢＳタイプＩａ（−黒三角−）、タイプＩＢ（−黒三角−）、タイプII（− −）、タイプIII（−０−）、タイプＶ（−黒四角−）、およびタイプVI（−白四角−）多糖を、Ｖ−ＴＴワクチンで誘発した抗体の抑制剤として使用した。データ点は、二回の測定の平均である。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図６】ＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチンに起こったウサギ抗血清によってオプソニン化されたＧＢＳタイプＶ株ＣＪＢ１１１のヒト末梢血リンパ球によるインビトロのオプソニン食作用的死滅。Ｃ’は補体である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施態様の説明
本発明は、莢膜多糖成分と蛋白質成分とから成る抗原接合分子に関する。
【００１８】
細菌株．ＧＢＳタイプII菌株１８ＲＳ２１およびタイプＩａ菌株０９０は、もともとロックフェラー大学の故レベッカ・ランスフィールドから入手したもので、冷凍培養物として−８０℃で保存した。菌株１８ＲＳ２１は、インビトロおよびインビボの検定に使用し、接合ワクチンに使用したタイプII莢膜多糖の原料であった。二種のＧＢＳタイプIIの臨床単離物（菌株Ｓ１６およびＳ２０）およびタイプIII菌株７８１は、チャンニング・ラボラトリーの培養物コレクションから入手した。
【００１９】
以前はヒトのＧＢＳ感染の数に大きく寄与するとは考えられていなかったが、最近の証拠はタイプＶの血清型がＧＢＳ感染の約１５％に寄与することを示している。ＧＢＳ−タイプＶ接合ワクチンを調製するために、ＧＢＳタイプＶ菌株１１６９−ＮＴ１はチェコ共和国、プラハ、衛生疫学研究所のＪ．ジェリンコバ博士から入手し、冷凍培養物として−８０℃で保存した。菌株１１６９−ＮＴ１は、インビトロおよびインビボの検定に使用し、接合ワクチンに使用したタイプＶ莢膜多糖の原料であった。ＧＢＳタイプＶ菌株ＣＪＢ１１１は、もともとベイラー大学のキャロル・ベイカー博士から入手した。
【００２０】
ＧＢＳタイプII多糖またはタイプＶ多糖のＴＴへの接合．タイプIII多糖の精製に以前記載されている方法によって、タイプII莢膜多糖を菌株１８ＲＳ２１から精製した（３３）。タイプII多糖の単量体ＴＴへの接合は、ＴＴのＧＢＳタイプIII多糖への接合のために以前詳細に記載された方法を使って実施した（３３）。要するに、天然のタイプII多糖はセファローズＣＬ−６Ｂカラム（１．６×８５ｃｍ；ファーマシア・ファインケミカルズ）上でサイズ画分した。主ピークの中央で溶出する物質をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥して、相対分子量２００，０００の物質を得た。この物質の５００ＭＨｚでの1Ｈ−核磁気共鳴分光分析により、天然タイプII多糖構造（２０）およびグループＢ抗原（２６）の不存在が確認された。本発明の接合分子に使用するのに適した多糖は、分子量が広範囲に変化してもよい。多糖成分の好ましい分子量は、約５，０００および１，０００，０００ダルトンの間である。もっと好ましい範囲は、１００，０００と３００，０００の間である。１００，０００から３００，０００の範囲の中で、約２００，０００ダルトンの分子量を持つ多糖が好ましい。
【００２１】
サイズ画分されたタイプII多糖は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる穏和な酸化に供された（１８）。この過程で、多糖上のシアル酸残基の一部がシアル酸の炭素８個の同族体である、５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−ガラクトシルオクツロソン酸に変化した（３３）。酸化されたシアル酸残基の百分率は、前述のようなシアル酸残基およびその酸化誘導体のガスクロマトグラフィー−質量分光分析によって評価された（３３）。好ましくは、各ＧＢＳタイプII多糖のシアル酸残基の約５ないし５０％が、変性されて蛋白質に結合可能になる。最も好ましくは、ＧＢＳタイプII多糖のシアル酸残基の約５ないし２５％が、変性されて蛋白質に結合可能になる。
【００２２】
ＧＢＳタイプII多糖の約５ないし１０％の変性が最も好ましい。末端シアル酸残基の約５ないし８０％の変性を達成するために、ＧＢＳタイプＶを酸化して、反応性のアルデヒドを生成するのが好ましい。末端シアル酸残基の約１０ないし５０％の変性が最も好ましい。
【００２３】
本発明の接合分子の蛋白質成分は、どんな生物学的に許容される蛋白質でもよい。好ましい蛋白質としては、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、およびＣＲＮ197のような交差反応的物質がある。
【００２４】
酸化されたタイプII多糖は、前述のような還元的アミノ化によって、単量体の破傷風トキソイド（「ＴＴ」）（カナダ、モントリオール、アーノルド・フラッピピャー研究所）に還元的アミノ化で結合させた（３３）。ＴＴはやはり前述されたゲル濾過クロマトグラフィーによってその単量体に精製された（３３）。要するに、過ヨウ素酸塩で処理されたタイプII多糖１０ｍｇおよび精製ＴＴ１０ｍｇを０．６ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．１）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）をその混合物に加えて３７℃で５日間培養した。接合の進行は、スーパーローズ６（ファーマシア）ゲル濾過カラム上での少量の反応生成物の高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって監視した。反応は、（高分子量の接合体を示す）カラムの空隙容積で溶出するピークの高さが一定になった時に終了した。接合体は、前述のようにバイオゲルＡ、０．５Ｍ（カリフォルニア州、リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ）のカラム上でのクロマトグラフィーで精製した（３３）。ワクチンの蛋白質含有量は、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、ロウリらの方法（２５）で評価した。炭水化物の含有量は、精製したタイプII多糖を標準として使用して、デュボアらの方法（１１）で分析した。
【００２５】
タイプＶ莢膜多糖は、前述のタイプIII多糖の精製法で、ＧＢＳタイプＶ１１６９−ＮＴ１細胞から精製した（３３）。タイプＶ多糖の単量体ＴＴへの接合は、ＴＴのＧＢＳタイプIII多糖への接合について前述した方法を使って実施した（３３）。
【００２６】
天然のタイプＶ多糖は、２００，０００の相対分子量を有した。５００ＭＨｚにおけるＨ−核磁気共鳴分光分析によるこの物質の分析で、天然のタイプＶの構造（２）およびグループＢ抗原の不存在が確認された（２６）。
【００２７】
蛋白質に結合させるために、タイプＶ多糖の末端シアル酸残基に反応性のアルデヒド基を導入するために、タイプＶ多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる穏和な酸化に供した（８）。この過程の結果、多糖上のシアル酸残基の一部が、シアル酸の炭素８個の同族体である、５−アセトイミド−３，５−ジデオキ−Ｄ−ガラクトシルオクツロソン酸に変換された（３３）。酸化されたシアル酸残基の百分率は、シアル酸残基およびその酸化誘導体のガスクロマトグラフィー−質量分析によって評価した。
【００２８】
酸化されたタイプＶ多糖は、前述の還元的アミノ化によって単量体ＴＴ（カナダ、モントリオール、アーマンド・フラッピアー研究所）に結合させた（３３）。ＴＴは、やはり前述したゲル濾過クロマトグラフィーでそのモノマーに精製した（３３）。要するに、８．６ｍｇの過沃素酸処理したタイプＶ多糖および８．７ｍｇの精製したＴＴを、０．５ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．２）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３１．５ｍｇ）をこの混合物に加えて３７℃で１０日培養した。接合の進行は、スーパーローズ６（ファーマシア）ゲル濾過カラム上で分析した少量の反応混合物の高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）で監視した。反応は、（高分子量の接合体を示す）カラムの空隙容積で溶出するピークの高さが一定になった時に終了した。接合物は、流動緩衝液として０．０１Ｍの燐酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌプラス０．０１％のチメロサールを使用して、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファーマシア）の２．６×９１ｃｍのカラム上でのクロマトグラフィーで精製した。ワクチンの蛋白質含有量は、ウシ血清アルブミンを標準として、ロウリーらの方法（２５）で評価した。炭水化物含有量は、ガラクトースを標準として、デュボアらの方法（１１）で評価した。
【００２９】
II−ＴＴワクチンおよびＶ−ＴＴワクチンによるウサギのワクチン接種．体重が約３ｋｇである３羽の雌のニュージーランド白ウサギ（マサチューセッツ州、アムハースト、ミルブルック農場）の群を、それぞれ合計容積２ｍｌに完全フロイントアジュバントで乳化した、未結合の天然タイプII多糖またはII−ＴＴワクチンの５０μｇで、背部の４箇所に皮下接種した。これらの動物は、２０日目および４１日目に不完全フロイントアジュバントで調製したワクチンのブースター注射（５０μｇ）を受けた。０、２０、３４、４１、５５および７０日目に各動物から血清を得て、無菌濾過し、−８０℃で貯蔵した。
【００３０】
約３ｋｇの１羽の雌のニュージーランド白ウサギ（マサチューセッツ州、アムハースト、ミルブルック農場）を、合計容積２ｍｌにミョウバンと混合したＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチン５０μｇで、背部の４箇所に皮下接種した。この動物は、２２日目および４２日目にミョウバンで調製したワクチンのブースター注射（５０μｇ）を受けた。０、３５、５６および９１日目にその動物から血清を得て、無菌濾過し、−８０℃で貯蔵した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ．ＧＢＳタイプII−特異性のウサギ抗体を、アルカリホスファターゼ（カリフォルニア州、バーリンガム、タゴ・インコーポレーテッド）に接合したヤギ抗−ウサギＩｇＧで、１／３，０００の希釈で、酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量した。マイクロタイタープレート（イムロン２；バージニア州、シャンティイー、ダイナテック・ラボラトリーズ）に、前記のようにウエルあたり１００ｎｇのポリ−Ｌ−リシンに結合した精製タイプII多糖を塗布した（１５、３３）。抗体価を逆数希釈として記録し、１／８００の希釈時に対照血清（全ＢＧＳ１８ＲＳ２１細胞に生じたウサギ抗血清）を含むウエルが０．５のＡ405に達したとき、≧０．３のＡ405を示した。接合ワクチンの蛋白質部分に特異的な抗体の量は、単量体ＴＴ（ウエルあたり１００ｎｇ）を塗布したプレートを使用してＥＬＩＳＡで評価した。ＴＴ−特異性のＩｇＧ価（タイター）を逆数希釈として記録し、基体であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ１０４ホスファターゼ基体錠；シグマ・ケミカル・カンパニー）の添加後、≧０．３のＡ405を示した。
【００３２】
ＧＢＳタイプＶ−特異性のウサギ抗体も、アルカリホスファターゼ（カリフォルニア州、バーリンガム、タゴ・インコーポレーテッド）に接合したヤギ抗−ウサギＩｇＧで、１／３，０００の希釈で、ＥＬＩＳＡによって定量した。マイクロタイタープレート（イムロン２；バージニア州、シャンティイー、ダイナテック・ラボラトリーズ）に、前記のようにウエルあたり１００ｎｇのポリ−Ｌ−リシンに結合した精製タイプＶ多糖を塗布した（１５）。抗体価を逆数希釈として記録し、１／３０００の希釈時に対照血清（全タイプＶ菌株１１６９−ＮＴ１）を含むウエルが０．３のＡ405に達したとき、≧０．３のＡ405を示した。
【００３３】
免疫ウサギ血清からのＩｇＧおよびＩｇＭの分離．７０日目に得られた、別記（２８）のようにII−ＴＴに育成した免疫ウサギ血清のプール品０．５ｍｌから免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）を分離するのに、蛋白質Ａ−アガロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィー（イリノイ州、ロックフォード、ピアス・ケミカル・カンパニー）を使用した。抗体クラスの分離は、１／５００の希釈で使用したヤギ抗−ウサギＩｇＧ（γおよびＬ鎖特異性；タゴ）および１１／２００の希釈で使用したヤギ抗−ウサギＩｇＭ（μ鎖特異性；ニューヨーク州、ウエストバリー、セラーラブ）でタイプII多糖を塗布したＥＬＩＳＡプレートで確認した。
【００３４】
競合ＥＬＩＳＡ．II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ血清の特異性は、抑制剤として同質（タイプII）及び異質（タイプＩａ及びIII）多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって決定された。ワクチン誘導されプールされたウサギ血清（７０日目に得られた）のエピトープ特異性は、抗体結合の抑制剤として、先天及び脱シアル化されたタイプII多糖及びβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いて試験された。先天タイプII多糖は、８０℃で２時間、６％酢酸で処理することにより脱シアル化された。多糖抑制剤は、順次４倍希釈し、II−ＴＴワクチンを用いたワクチン接種後７０日目に得られたプールされたウサギ血清（１００００倍希釈）の当容積（７５μｌ）と混合した。それから、この混合物（１００μｌ）を、タイプII多糖コートされたＥＬＩＳＡウエルに添加した。アルカリ性ホスファターゼ接合した抗ウサギＩｇＧが、１／３０００の希釈割合で第二抗体として使用された。結果が、以下に示されている。％抑制＝〔抑制剤なしのＡ405−抑制剤を用いたＡ405）／抑制剤なしのＡ405〕×１００
ＧＢＳ Ｖ−ＴＴウサギ抗血清の血清タイプ特異性は、ＧＢＳタイプ特異多糖類Ｉａ、Ｉｂ）II、III、Ｖ及びVIを用いて評価された。ＥＬＩＳＡウエルは、ポリ−Ｌ−リジンにリンクしたＧＢＳタイプＶ多糖を含む１００ｎｇ／ウエルでコートされた。Ｖ−ＴＴワクチンに対するウサギ抗血清で、１／６０００に希釈されたものは、各多糖抑制剤を用いて培養された。培養された抗血清は、ＥＬＩＳＡウエルに添加され、このプレートは、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体（１／３０００希釈）と、これまでに詳述されている基質（２８）を用いて処理された。
【００３５】
インビトロにおけるＧＢＳの抗体媒介死滅．ヒトの末梢血白血球により引き続いて死滅させるためのＧＢＳ細胞をオプソニン化するためのワクチン誘発ウサギ抗体の能力を、インビトロオプソノ食作用アッセイ（７、８）により評価した。
【００３６】
ＧＢＳタイプＶ反応性抗体のオプソノ食作用活性を測定するための反応アッセイは、３００μｌの緩衝液における１．５×１０7白血球（ＷＢＣ）；５０μｌにおける３×１０6ＣＦＵのタイプＶ ＧＢＳ菌株ＣＪＢ １１１；ヒト補体（ＧＢＳタイプＶ菌株細胞を用いて吸収された）（５０μｌ）；抗体−抗Ｖ−ＴＴ熱不活性化（５０μｌ）；変性されたイーグル培地（５０μｌ）を培養することによって行われた。混合物は、３７℃にて６０分間混合しながら培養した。ＧＢＳコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）における違いは、標準プレートカウント法により３７℃にて１時間、引き続いて培養して測定された。
【００３７】
ワクチン誘導されたウサギ抗体によるマウスの受動的防御．１０匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交雌マウス（タコニックファームス、ジャーマンタウン、Ｎ．Ｙ．）のグループで、各マウスの体重が１８〜２０ｇであるものに、タイプII多糖又はII−ＴＴワクチンのいずれかでワクチン接種したウサギからプールされた血清（７０日）0.2ｍｌを腹腔内的に注入した。タイプII多糖を用いて免疫化したウサギからの７０日目に得られたプールされた血清のＥＬＩＳＡによって測定された力値（タイター）は１００であり、II−ＴＴワクチンの場合は１２８００であった。５匹のマウスの対照グループには、プールされた事前免疫ウサギ血清又は結合されないＴＴを生じさせるプールされた抗血清（２７）を投与した。２４時間後に、１．０ｍｌのトッド−ヘウィットブロスの全量において、マウスは、タイプII菌株１８ＲＳ２１（１．５×１０5ＣＦＵ／マウス）を用いて誘発した。各菌株に対する誘発投薬量は、事前に同じ体重で同じ月齢のマウスの９０％以上が死に至るように決定された。生き残ったマウスを、３日間引き続いて毎日数えた。
【００３８】
統計分析．致死ＧＢＳ感染に対したマウスを受動的に防御する異なったウサギ血清の能力を比較するために、フィッシャーズの正確試験が使用された。
【００３９】
結果
II−ＴＴワクチン及びＶ−ＴＴワクチンの調製及び組成物．ＧＢＳ II−ＴＴワクチン及びＧＢＳ Ｖ−ＴＴワクチンを、ＧＢＳタイプIII結合ワクチンの構成について以前に詳述された方法によって調製した（３３）。タイプII ＧＢＳ多糖の制御された過ヨウ素酸塩の酸化により、ガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析によって決定されたものとして、７％の多糖のシアル酸残基の変化が起こった。単−ＴＴは、還元性アミノ化により、タイプII多糖上の変異したシアル酸位置に共有結合で結合した。この精製されたII−ＴＴワクチンは、３２％（ｗｔ／ｗｔ）の蛋白質及び６８％（ｗｔ／ｗｔ）の炭水化物を含んでいた。II−ＴＴワクチンの最終収量は７．８ｍｇ、３９％であった。
【００４０】
タイプＶ ＧＢＳ多糖の制御された過ヨウ素酸塩の酸化により、この多糖において約８％、２５％及び５０％のシアル酸残基の変化が生じた。単一のＴＴは、還元性アミノ化によって、タイプＶ多糖上の変化したシアル酸位置に共有結合で結合した。多糖類は酸化された結果、そのシアル酸残基の約８％が変化し、蛋白質のモル比に対して低い多糖を有する接合体が生じた。末端のシアル酸残基の２５又は５０％が変化した多糖類は、蛋白質のモル比に対してより望ましい多糖を有する接合分子が生じた。シアル酸残基の２５％が変化したＧＢＳタイプＶ多糖類を、表Ｉに示される生化学的な特徴を有する接合ワクチンを製造するのに使用した。
【００４１】
【表１】
ウサギにおけるII−ＴＴワクチン及びＶ−ＴＴワクチンの免疫原性．II−ＴＴワクチン及び先天タイプIII多糖の免疫原性を、ウサギにおいて比較した。タイプII特異抗体における増加は、II−ＴＴワクチンの初期投薬の後に観察された（表２）。ワクチンのブースター投与により、更に抗体応答が増加した。抗体レベルは、変化せずに維持されるか、あるいは、４１日の第２のブースター投与の後にわずかに上昇し、この研究の残りの間を通して維持された（表２）。II−ＴＴワクチンとは対照的に、結合していない先天ＧＢＳタイプII多糖は、特異的な抗体応答をもたらさなかった（表２）。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された動物はまた、ＴＴに対する抗体を生成し、前免疫レベルを越えて、約３−１ｏｇ10増加を達成した。
【００４２】
【表２】
Ｖ−ＴＴワクチン（２５％まで多糖が酸化された）の免疫原性もまた、ウサギにおいて評価した。抗体（ＩｇＧ）レベルは、第１及び第２のタイプＶ−IIワクチンの投薬の後に増加し、この研究を実施する間、維持された（表３）。
【００４３】
【表３】
ワクチン誘発されたウサギの血清の抗原性．蛋白質キャリヤーへの多糖の接合は、その先天的な形態で多糖において見い出されている重要な抗原エピトープを変化させることはない。我々は、抑制剤として同種及び異種ＧＢＳ多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって、II−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性を試験した。４５０ｎｇ／ｍｌの濃度にて先天タイプII多糖は、ウサギ抗体の結合の５０％を抑制し、II−ＴＴワクチンか生じた（図２）。ＧＢＳタイプＩａ及びタイプIII多糖類は、５００μｇ／ｍｌよりも高い濃度であってもII−ＴＴワクチンを生じさせる血清の結合を抑制しなかった（図２）。これらの結果は、標的抗原に対するII−ＴＴワクチン誘発された抗体の血清タイプ特異性を証明しており、接合ワクチンの多糖部分の抗原エピトープの保存を示している。
【００４４】
シアル酸によって影響されたエピトープが、II−ＴＴワクチンの調製の間に維持されるかどうかを調べるために、先天及び脱シアル化されたタイプIII多糖が、II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗体の結合の抑制剤として競合ＥＬＩＳＡにおいて使用された。この多糖の脱シアル化は、８０℃にて２時間、６％酢酸を用いた処理によって行われた。シアル酸残基の定量的な除去は、標準としてのＮ−アセチルノイラミン酸（シグマ）を用いて、チオバルビツール酸アッセイ（３２）によって行われた。Superose ６ ＦＰＬＣカラム（ＬＫＢ−ファルマシア、スウェーデン）における、酸処理を行う前の先天タイプII多糖のＫavは０．４９であり、一方、酸処理された多糖のＫavは０．５２であり、先天多糖が重量で２０％になるような側鎖のシアル酸残基の損失により、多糖の分子の大きさにわずかな縮小が示された。ｍｌあたりの脱シアル化したＧＢＳタイプIIが２００μｇであっても、先天タイプII多糖に対するII−ＴＴワクチン抗体の３３％の結合によって抑制された（図３）。II−ＴＴワクチン抗血清による脱シアル化又はコアタイプII多糖が相対的に認識しにくいことは、免疫電気泳動ゲルによって確かめられ、このゲルは、（示されてはいないが）コアタイプII多糖ではなく、先天のものと一緒に生成した沈降素バンドを示していた。先天タイプII多糖に対するII−ＴＴワクチン抗血清の結合は（示されてはいないが）０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で使用されたβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースによって抑制することができなかった。
【００４５】
ＧＢＳタイプＶ−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性は、抑制剤として同種及び異種ＧＢＳ多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって試験された。先天タイプＶ多糖は、タイプＶ−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗体の結合を効果的に抑制した（図５）。ＧＢＳタイプＩａ、タイプＩｂ、タイプII、タイプIII及びタイプＶＩは、タイプＶ−ＴＴワクチンを生じさせる血清の結合を効果的に抑制しなかった（図５）。これらの結果は、標的抗原に対するタイプＶ−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性を示している。
【００４６】
ＧＢＳワクチン誘発された抗体のインビトロ活性．インビトロにおける人間の末梢血白血球による死滅のためのＧＢＳをオプソニン化するための免疫血清の能力は、動物防御実験（２７、３３）におけるＧＢＳに対する防御効能と関連があった。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された３羽のウサギに生じた抗体は、１．８１ｏｇ10以上にまでＧＢＳタイプII菌株１８ＲＳ２１の死滅を促進した（表４）。前もって免疫化したウサギの血清又は、先天ＧＢＳタイプII多糖又は結合していないＴＴを用いてワクチン接種されたウサギからの血清は、インビトロにおけるＧＢＳの死滅を促進しなかった（表４）。ワクチン誘発されたウサギ抗体は、２つのＧＢＳタイプII臨床隔離集団（菌株Ｓ１６及びＳ２０）の人間の血液白血球による死滅を、前免疫化ウサギ血清に比べて、１．８１ｏｇ10以上にまで促進した（表５）。タイプII−ＴＴワクチンに対するウサギ血清は、異種（タイプＩａ及びIII）ＧＢＳ菌株のインビトロにおける死滅を促進することがないので、血清タイプ特異性であることがわかった（表５）。
【００４７】
【表４】
【００４８】
【表５】
蛋白質Ａ親和性−精製されたＩｇＧ及びＩｇＭは、タイプII−ＴＴワクチンを生じさせるプールされた血清から得られた（２８）。各Ｉｇフラクションの特異性は、クラス特異性二次抗体を用いたＥＬＩＳＡによって確認された。ＩｇＭ及びＩｇＧフラクションのＡ405Ｓ（１／１００に希釈）は、μ鎖特異性接合体を伴い、それぞれ０．３８４及び０．００９であり、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（γ及び軽鎖特異性）を伴い、それぞれ０．０８６及び２．３６７であった。分離されたＩｇＭ及びＩｇＧは、人間の血液白血球によるタイプII ＧＢＳのオプソニン死滅を促進させる能力について試験された。タイプII−ＴＴワクチンを生じさせる分画されていない血清を１：１００に希釈し、同様の血清からのＩｇＧフラクションの等量１：１００希釈は、タイプII ＧＢＳの死滅を、それぞれ１．６５±０．２２及び０．９５±０．０９ １ｏｇ10まで促進した。対照的に、タイプII ＧＢＳは死滅されることはなく、オプソノ食作用アッセイにおいて、前免疫血清（−０．３９±０．１３ １ｏｇ10）及び、タイプII−ＴＴワクチンを生じさせる血清からの、ＩｇＭを多く含むフラクションの存在下で成長した。
【００４９】
人間の血液白血球によるＧＢＳタイプＶ菌株（ＣＪＢ １１１）の死滅を促進するための、ＧＢＳタイプＶ−ＴＴワクチン誘発されたウサギ抗血清の能力もまた、インビトロにおけるオプソノ食作用アッセイによって評価された（８）。図６に示されるように、１０％の濃度でのＧＢＳタイプＶ−ＴＴ抗血清は、コントロールに対応するＧＢＳタイプＶ菌株ＣＪＢ １１１を効果的に最適化した。制御反応条件は、抗血清のない補体（１０％）、補体のない抗血清（１０％）、抗血清（１％）及び補体であった。
【００５０】
マウス防御アッセイ．ワクチン誘発された抗体のインビボでの防御能力を試験するために、タイプII ＧＢＳ １８ＲＳ２１を用いて誘発する前に、マウスは、プールされたII−ＴＴワクチン血清（７０日）２４時間を用いて受動的に免疫化された。前もって、誘発投薬量は、試験されたマウスの９０〜１００％が致死するように決定した。完全（１００％）な防御は、ＧＢＳ II−ＴＴワクチンを生じさせる血清を与えられたマウスのグループに生じる一方、事前にワクチン血清を与えた５匹のマウスの１匹しか生存しなかった（表６）。結合していないタイプII多糖又は結合していないＴＴのいずれかを用いてワクチン接種されたウサギからの血清を受けたマウスの中では生き残ったものはなかった（表６）。
【００５１】
【表６】
最初に髄膜炎菌性多糖（１８）を生ずるＧＢＳタイプIII多糖を用いた結合したストラテギー（strategy）は、全てのＧＢＳ莢膜多糖抗原に適用できる。なぜならば、これらは全てシアル酸を含むからである。しかしながら、ジ又はトリサッカライド側鎖の末端サッカライドとしてのシアル酸を有する、他のＧＢＳ多糖類に類似せず、ＧＢＳタイプII多糖は、２つのモノサッカライド側鎖（９、２０）の一つに唯一の糖としてシアル酸を有する繰り返しユニットを持っている。ＧＢＳタイプII接合ワクチンを構成する際、我々は、タイプII多糖上のシアル酸残基の７％を酸化し、多糖がＴＴに結合するための位置として、これらを使用した。精製されたII−ＴＴワクチンは、スーパーローズ６カラム（１０6以上の分子量に一致する）の空隙容量で溶出し、６８％（ｗｔ／ｗｔ）炭水化物及び３２％（ｗｔ／ｗｔ）蛋白質からなっていた。
【００５２】
アジュバントを用いて乳化されたタイプII−ＴＴワクチンは、タイプII多糖特異抗体をもたらすことのない、結合していない先天タイプII多糖とは対照的に、ウサギにおいて免疫性があった。免疫化された３羽のウサギのうちの２羽は、II−ＴＴワクチンの単一投薬後３週間、強く応答した。最適タイプ特異抗体は、II−ＴＴワクチンのブースター投与後３週間、全ての３羽のウサギにおいて達成された。タイプII特異抗体価の更なる増加は、II−ＴＴワクチンの３回目投薬後には観察されなかった。インビトロ及びインビボ実験からの結果は、II−ＴＴワクチンを生じさせる抗体が、タイプIIＧＢＳに対して機能的に活性であることを示していた。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された３羽のウサギのそれぞれからの血清は、人間の末梢白血球によるタイプII ＧＢＳのインビトロでの死滅を促進し、タイプIIＧＢＳの致死量に対して完全（１００％）保護を有した非近交マウスをもたらした。II−ＴＴワクチン抗血清は、同種ＧＢＳ菌株（１８ＲＳ２１、Ｓ１６、及びＳ２０）に対してはオプソニン的に活性であったが、異種ＧＢＳ血清タイプ（タイプ１ａ及びIII）は試験されていない。
【００５３】
先天タイプII多糖が、タイプII多糖コートＥＬＩＳＡウエルへのII−ＴＴワクチン抗血清の結合を抑制する一方、たとえ２００μｇ／ｍｌの濃度で使用されたとしても、脱シアル化されたタイプII多糖と共に４０％以下の抑制が得られた。
この結果は、タイプII多糖の重要な抗原決定基が、シアル酸残基の存在に依存していることを示している。この結果は、これらが全てのタイプII生物を生じさせるウサギ抗血清を共に得られることを証明している（２１）。しかしながら、抑制剤としてβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いたＥＬＩＳＡ抑制実験は、II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗血清が、ガラクトース特異抗体を含まないことを示していた。タイプII先天多糖へのII−ＴＴワクチン抗血清の結合の抑制は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いた場合にも得られなかった。それゆえ、側鎖ガラクトースは、多糖がＴＴに結合された際に、タイプII多糖の免疫優性エピトープであるとは思われない。これらの結果は、免疫化学研究とは対照的に、全てのタイプIIＧＢＳ生物（１２、２１）を生じさせるウサギ血清を用いて実施され、この生物においては、ガラクトース側鎖が、シアル酸依存エピトープと共に、タイプII多糖の２つの免疫優性位置の一つになっているものと思われる。以前の研究（１２、２１）において使用され、しかもｐＨ調整条件にて培養されていない全てのタイプIIＧＢＳ細胞は、ある程度、シアル酸が欠けた多糖を有しているかも知れない。これらの状況の下では、側鎖ガラクトースは、主な抗原性エピトープであるように思われる。II−ＴＴワクチンを合成するために使用したタイプII多糖の原料は、ｐＨ７．０に維持されたタイプIIＧＢＳ培地であった。最終分析から、シアル酸が〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）の多糖から構成されていることが確認された。我々は、ＴＴへの結合タイプII多糖は、多糖の立体配座を変え、これによって、ホスト免疫系による確認に利用できないガラクトースエピトープを与える可能性を否定することができない。II−ＴＴワクチン誘発されたウサギ抗血清は、ガラクトース特異抗体が欠けていたが、タイプIIＧＢＳ生物に対してインビトロ及びインビボにて充分に機能した。シアル酸残基のいくつかの化学的修飾も、引き続いて起こるこれらの位置へのＴＴの結合もどちらも、官能タイプII特異抗体をもたらすのに必要な臨界抗原エピトープを変化させない。II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ血清からの精製されたＩｇＧが、人間の白血球によるタイプIIＧＢＳのインビトロにおける死滅を促進させることは、タイプII多糖の免疫原性がＴＴへの接合により増加するということだけでなく、機能ＩｇＧ抗体がもたらされることを示唆している。
【００５４】
ＧＢＳタイプＶ莢膜多糖は、隣接した糖残基上の２つの異なる側鎖を含むトリサッカライド骨格からなる繰り返しユニット構造を有している。（参考文献３５：図４）。ＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチン調合物の一つでは、タイプＶ多糖における長い側鎖（即ち３糖残基）上のシアル酸残基の２５％が酸化された。この酸化されたシアル酸残基は、ＴＴにタイプＶ多糖が結合するための位置として使用された。この精製されたタイプＶ−ＴＴワクチンは、３８％（ｗｔ／ｗｔ）のＴＴと６２％（ｗｔ／ｗｔ）の炭水化物からなっていた。ミョウバンと混合されたＶ−ＴＴワクチンは、ウサギにおいて免疫原性であることが示された。タイプＶ−ＴＴワクチンの最初の投与及びブースター投与の後に、強い作用が観察された。又、第２のブースター投与では、タイプＶ多糖ＩｇＧ価における更なる増加が生じた。タイプＶ−ＴＴ誘発アッセイの血清特異性は、競合ＥＬＩＳＡによって示された。Ｖ−ＴＴワクチンに対する生じたウサギ抗血清は、ヒト白血球及び補体の存在下でインビトロにてタイプＶ ＧＢＳを死滅させる能力により証明されるものとして機能的に活性である。
【００５５】
III−ＴＴワクチンと同様に、II−ＴＴワクチンは、活性多糖と比較してウサギにおいて改良された免疫原性を示し、多糖の構造、ＴＴが結合される多糖上のシアル酸の位置及びワクチン組成物が違っているにもかかわらず、ウサギにおいてオプソニン的に活性なＩｇＧをもたらす。又、タイプＶ−ＴＴワクチンは、ウサギにおいて免疫原性であること、及び、インビボにて抗体を機能的に誘導可能であることが明らかとなった。我々は、この計画のＧＢＳ多糖−蛋白質接合体が究極的に、人間の病気に最もしばしば関連のあるＧＢＳ血清タイプに対して保護をもたらし得る多価ＧＢＳワクチンの成分を構成していると推察している。
【００５６】
更に、我々は、ワクチンが、製薬学的に受容可能なキャリヤーに接合分子を添加することによって、本発明の接合分子から製造できると考えている。恐らく、本発明の抗原分子における架橋の程度は、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌することのできるワクチンを提供するのに充分な範囲に制御される。このようなワクチンは可溶性であることが好ましい。免疫法は、受容株哺乳類にワクチンを注入することによって行うことができ、必要であれば一度、それに引き続いてブースター注入を行う。投与されるべきワクチンの充分な投薬量は、存在する多糖の量に基づくことができる。接合ワクチンの多糖成分の３〜８０μｇの範囲を投与することができる。
【００５７】
（参考文献）
【００５８】
【表７−１】
【００５９】
【表７−２】
【００６０】
【表７−３】
【００６１】
【表７−４】
【００６２】
【表７−５】
【００６３】
【表７−６】
我々は、これまで、本発明の多くの具体例を述べてきたが、基本構想は、本発明の方法を使用するこの他の具体例を提供するために変更できることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例によってこれまでに示してきた特殊な具体例よりも、これに添付した請求の範囲によって定義されていることが理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
グループＢストレプトコッカス・タイプIIおよびタイプＶ多糖−蛋白質接合ワクチン発明は、１９９２年９月２４日に出願された米国特許出願第０７／９４９，９７０号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の権利に関する説明
発明は、国立衛生研究所の支給するＮＩＨ交付金Ａ１２３３３９、Ａ１３０６２８およびＡ１２８０４０により、政府の援助で行われた。政府は、本発明に若干の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
発明は、蛋白質に共役結合したグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖（capsular polysaccharide）から成る抗原接合分子（antigenic conjugate molecule）に関する。また本発明は、グループＢストレプトコッカス・タイプII（ＧＢＳII）および／またはタイプＶ（ＧＢＳＶ）による感染に対してヒトを包含する哺乳動物を免疫するワクチンおよび方法に関する。本発明の接合分子から成る多価ワクチンおよび他の病原菌に対する抗原も請求される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
グループＢストレプトコッカス類（ＧＢＳ）による感染は、発展途上国での新生児における敗血症および髄膜炎の最も普通の共通の原因である（３、３１）。米国の二三のセンターからの最近の報告は、多分早期の診断および集中医療の結果として、１９７０年代からの一連の報告におけるよりも低い死亡率（９ないし１３％）を示している（１、１０）。それにもかかわらず、致死感染がやはり起こっており、同じように見過ごせないのは、ＧＢＳ髄膜炎の生存者の５０％までが難聴および軽度の学習能力欠失から強い運動、知覚および認識の損傷に亘る慢性の神経学的損傷を持っている（３）。改良された診断または治療でなく予防が、ＧＢＳに関連する罹患率および死亡率を減らすのに一番重要な効果を持つようである。
【０００５】
ＧＢＳの莢膜多糖特異性の抗体は実験動物（２３、２４）およびヒト幼児（４、５）の両方を保護するようであるので、若干の多糖を精製し、実験的ワクチンとして健常成人で試験した（６）。安全で有効なＧＢＳワクチンが入手可能であれば、妊娠前または妊娠中の女性に投与して、子宮内の胎児に移行し、新生児の感染を防御する抗体を誘発することができる。ボランティアで試験した三種のＧＢＳ多糖（タイプＩａ、II、III）のうち、タイプIIは最高の免疫原性を有し、事前非免疫の受容体の８８％にタイプII特異性の抗体応答を誘発する（６）。種々のＧＢＳの血清型がＧＢＳ感染の患者のパーセントに重大な寄与をすることが従来認められてきたが、タイプＶはＧＢＳ感染の高いパーセントの原因となるとは考えられて来なかった。新生児では、タイプIIＧＢＳ感染からの保護に必要な特定の抗体の水準は正確には明示されていないが、２または３μｇ／ｍｌと評価されてきた（６）。保護に必要な最小量をごく僅かに超える抗体応答を達成するワクチン受容体では、母体のＩｇＧの胎児または後期感染開始の幼児への不完全な移行のため、胎盤を通って移行する母体の抗体の量は、早産児を保護するのには不充分である。新生児内の母体の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の半減期は約２５日であるからである（１３）。予防接種への特定の抗体の応答の規模が大きい場合、この二群の患者内の幼児の多くは保護される。母体のＩｇＧの胎児への移行は、第三の３ケ月期の間を通じて増加し、そのため母体の抗体水準が高いほど、保護は早くなり、すなわち、早熟度の高い幼児を保護する（１６）。同様に、母体の水準が高いと、幼児内での母体の抗体の持続が長くなり、そのためさらに後期開始の疾患を保護する。
【０００６】
種々の細菌性多糖抗体の免疫原性が、多糖または誘導体オリゴ糖への適当な担体蛋白質の接続によって増加されてきた（２、１４，１７−１９、２２、２７、２９、３０、３４）。多糖−蛋白質接合ワクチンに望まれる性質には、多糖の高い免疫原性、ブースター投与量への高いハプテン特異性抗体応答、およびＩｇＧクラスの抗体の優勢が含まれる。最近我々は、指定の蛋白質カップリングの部位として側鎖シアル酸部分を使用することによって、ＧＢＳIII−破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンを開発することに成功した（３３）。III−ＴＴワクチンは、ＧＢＳタイプIII−特異性のオプソニン活性の抗体を誘発し、非共役のタイプIII多糖はウサギにおいて非免疫原性であった（３３）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明は、タイプIIまたはタイプＶの多糖成分のシアル酸残基中で終わる２以上の側鎖が第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされていることを特徴とする、グループＢストレプトコッカス・タイプIIから誘導された莢膜多糖と蛋白質成分を含む抗原接合分子、またはグループＢストレプトコッカス・タイプＶから誘導された莢膜多糖と蛋白質成分から成る抗原接合分子である。
【０００８】
更に、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖と蛋白質との接合分子を製造するための方法において、
（ａ）グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖を、多糖の骨格に結合した二つ以上の末端シアル酸残基中にアルデヒド基を導入するのに充分な過ヨウ素酸酸化に供し；
（ｂ）酸化されたグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶの莢膜多糖を、還元的アミノ化によって蛋白質に結合させて、莢膜多糖と蛋白質の間に第二アミン結合を形成させる
ことから成る方法も請求されている。
【０００９】
また、上記の方法で製造された接合分子も請求されている。
【００１０】
本発明は、さらに上記の接合分子のそれぞれから成るワクチンも請求する。さらに本発明は、本発明の接合分子およびグループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶ以外の病原性物質に対する抗体の製造を誘発しうる他の免疫原性分子の少なくとも一種を含む多価ワクチンを請求する。特に、ＧＢＳタイプIIおよび／またはＧＢＳタイプＶの接合分子を含むことに加えて、本発明による多価ワクチンはさらにグループＢストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、III、IVおよびヘモフィラス・インフルエンゼ・タイプｂおよびエシェリキア・コリ・タイプＫ１から成る群から選ばれた病原体に抗体の産生を誘発できる他の免疫原性分子を含む。
【００１１】
本発明の別の実施態様では、誕生時の新生児における感染症に対する保護を生じさせるのに充分な量、ワクチンの投与の前または後に身籠もった胎児に推移しうる抗体を産生するために、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、女性に投薬することを特徴とする、新生児を免疫性にする方法が請求される。
【００１２】
本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、成人に投与することを特徴とする、成人を免疫性にする方法も請求する。さらに、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶに感染される危険性のある人に、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量で投薬することを特徴とする、成人を免疫性にする方法も請求する。
【００１３】
本発明の別の実施態様においては、上記のグループに積極的に投与できる血清または血漿を供給できるボランティアのワクチン受容体に、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、投与する。本発明はまた、グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶ感染される危険性のある新生児、小児または成人を含む人を免疫する方法も提供する。危険性のある人には、癌または糖尿病を含む種々の原因で免疫系が抑制されている人を含んでもよく、癌または糖尿病に限定されない。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、本発明の接合分子から成るワクチンを免疫原性量、乳牛に投薬することから成る、乳牛類のウシ乳腺炎に対する免疫法である。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
項目１．グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶバクテリアから誘導される群から選ばれる莢膜多糖と、蛋白質成分を含み、この多糖成分のシアル酸残基で終わる２以上の側鎖が、第二アミン結合で蛋白質にそれぞれリンクされており、上記多糖の分子量が５０００ダルトン以上であることを特徴とする抗原接合分子。
項目２．各多糖の末端シアル酸残基の５〜５０％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目１の接合分子。
項目３．各多糖の末端シアル酸残基の５〜２５％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目２の接合分子。
項目４．各多糖の末端シアル酸残基の５〜１０％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目３の接合分子。
項目５．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖の末端シアル酸残基の７％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目４の接合分子。
項目６．上記抗原接合分子が０．２ミクロンのフィルターを通して濾過減菌されうる項目１の接合分子。
項目７．上記多糖成分が約５，０００〜１，０００，０００ダルトンの分子量を有する項目１の接合分子。
項目８．上記多糖成分が約５０，０００〜５００，０００ダルトンの分子量を有する項目７の接合分子。
項目９．上記多糖がＧＢＳタイプＶであり、各多糖の末端シアル酸残基の約２５％が、蛋白質にリンクされるのに有用である項目１の接合分子。
項目１０．上記多糖成分が約１００，０００〜３００，０００ダルトンの分子量を有する項目８の接合分子。
項目１１．上記多糖成分が約２００，０００ダルトンの分子量を有する項目９の接合分子。
項目１２．上記蛋白質が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ（交差反応物質）１９７からなる群から選ばれる項目１の接合分子。
項目１３．グループＢストレプトコッカス・タイプIIまたはタイプＶバクテリアの莢膜多糖と蛋白質の接合分子を製造する方法であって、（ａ）グループＢのストレプトコッカス・タイプIIの莢膜多糖を、該多糖の骨格にリンクした２以上の末端シアル酸残基にアルデヒド基を導入するに充分なだけ、過ヨウ素酸化し、（ｂ）酸化されたグループＢのストレプトコッカス・タイプIIの莢膜多糖を、還元的アミノ化によって、蛋白質と連結させ、莢膜多糖と蛋白質の間に第二アミン結合を生じさせることを特徴とする方法。
項目１４．各多糖のシアル酸残基の約５〜５０％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１３の方法。
項目１５．各多糖のシアル酸残基の約５〜２５％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１４の方法。
項目１６．各多糖のシアル酸残基の約５〜１０％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１５の方法。
項目１７．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖のシアル酸残基の７％が酸化されて、蛋白質に連結可能なアルデヒド群を形成する項目１６の方法。
項目１８．各多糖のシアル酸残基の約５〜５０％が蛋白質に共有結合的にリンクされる項目１３の方法。
項目１９．各多糖のシアル酸残基の約５〜２５％が蛋白質に共有結合的にリンクされる項目１８の方法。
項目２０．各多糖のシアル酸残基の約５〜１０％が蛋白質に共役結合的にリンクされる項目１９の方法。
項目２１．上記多糖がＧＢＳタイプIIであり、各多糖のシアル酸残基の約５％が共有結合的に蛋白質にリンクされる項目１９の方法。
項目２２．上記多糖がＧＢＳタイプＶであり、各多糖の末端シアル酸残基の約２５％が蛋白質にリンクされる項目１３の方法。
項目２３．項目１３の方法により製造される接合分子。
項目２４．項目１の接合分子を含むワクチン。
項目２５．項目１の接合分子と、グループＢのストレプトコッカス・タイプII以外の病原性物質に対する抗体の産出を引き出しうる他の免疫原性分子の少なくとも一種を含む多価ワクチン。
項目２６．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III、IVおよびＶ、ヘモフィラス・インフルエンザ・タイプｂ及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２５の多価ワクチン。
項目２７．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III、ヘモフィラス・インフルエンザ・タイプｂ及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２６の多価ワクチン。
項目２８．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、III及びＥ．コリ・タイプＫ１からなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２７の多価ワクチン。
項目２９．上記他の免疫原性分子が、グループＢのストレプトコッカス・タイプＩａ、Ｉｂ、II、IIIからなる群から選ばれる病原体に対する抗体の産出を引き出しうるものである項目２８の多価ワクチン。
項目３０．項目１の接合分子を、免疫原性量、女性に投薬し、十分量のワクチンの投薬の前又は後に身籠った胎児に移行しうる抗体を産出させ、誕生時の新生児における感染症に対する保護を生じさせることを特徴とする新生児を免疫性にする方法。
項目３１．上記ワクチンが、妊娠前に投薬される項目３０の方法。
項目３２．上記ワクチンが約１０歳から５０歳の間の女性に投薬される項目３０の方法。
項目３３．上記ワクチンが、妊娠期間中に投薬される項目３０の方法。
項目３４．項目１の接合分子を含むワクチンを人に免疫原性量で投薬する人を免疫性にする方法。
項目３５．項目１の接合分子を含むワクチンを、グループＢのストレプトコッカス・タイプII又はタイプＶにより感染される危険性のある人に免疫原性量で投薬する成人を免疫性にする方法。
項目３６．上記ワクチンを免疫系が抑制される人に投薬する項目３５の方法。
項目３７．免疫抑制が癌又は糖尿病からなる群から選ばれる病気によるものである項目３６の方法。
項目３８．上記ワクチンが、薬学的に許容される担体で、投薬される項目３７の方法。
項目３９．項目１の接合分子を含むワクチンを、免疫原性量、乳牛に投薬することを特徴とする牛類の乳腺炎に対して乳牛類を免疫性にする方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組成物を、妊娠前または妊娠中の女性に投与することによって、子宮内の胎児に移行し、新生児のグループＢストレプトコッカス類（ＧＢＳ）による感染を防御する抗体を誘発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】タイプIIＧＢＳ莢膜多糖のヘプタサッカライド繰り返し単位の構造（９２０）。
【図２】ＧＢＳタイプII多糖競合ＥＬＩＳＡ。タイプII多糖を塗布したプレートにII−ＴＴワクチン抗体結合の抑制剤としてＧＢＳタイプＩａ（白丸）、タイプII（黒丸）、およびタイプIII（黒三角）の多糖が使用された。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図３】ＧＢＳタイプII多糖競合ＥＬＩＳＡ。天然（黒丸）および脱シアリル化またはコア（□）タイプII多糖をII−ＴＴワクチンで誘発した抗体の抑制剤として使用した。データ点は、三回の測定の平均（標準偏差つき）である。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図４】タイプＶＧＢＳ莢膜多糖の繰り返し単位の構造。
【図５】ＧＢＳタイプＶ多糖競合ＥＬＩＳＡ。ＧＢＳタイプＩａ（−黒三角−）、タイプＩＢ（−黒三角−）、タイプII（− −）、タイプIII（−０−）、タイプＶ（−黒四角−）、およびタイプVI（−白四角−）多糖を、Ｖ−ＴＴワクチンで誘発した抗体の抑制剤として使用した。データ点は、二回の測定の平均である。結果は、抑制剤なしの対照ウエルのそれに対する抑制の百分率として表している。
【図６】ＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチンに起こったウサギ抗血清によってオプソニン化されたＧＢＳタイプＶ株ＣＪＢ１１１のヒト末梢血リンパ球によるインビトロのオプソニン食作用的死滅。Ｃ’は補体である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施態様の説明
本発明は、莢膜多糖成分と蛋白質成分とから成る抗原接合分子に関する。
【００１８】
細菌株．ＧＢＳタイプII菌株１８ＲＳ２１およびタイプＩａ菌株０９０は、もともとロックフェラー大学の故レベッカ・ランスフィールドから入手したもので、冷凍培養物として−８０℃で保存した。菌株１８ＲＳ２１は、インビトロおよびインビボの検定に使用し、接合ワクチンに使用したタイプII莢膜多糖の原料であった。二種のＧＢＳタイプIIの臨床単離物（菌株Ｓ１６およびＳ２０）およびタイプIII菌株７８１は、チャンニング・ラボラトリーの培養物コレクションから入手した。
【００１９】
以前はヒトのＧＢＳ感染の数に大きく寄与するとは考えられていなかったが、最近の証拠はタイプＶの血清型がＧＢＳ感染の約１５％に寄与することを示している。ＧＢＳ−タイプＶ接合ワクチンを調製するために、ＧＢＳタイプＶ菌株１１６９−ＮＴ１はチェコ共和国、プラハ、衛生疫学研究所のＪ．ジェリンコバ博士から入手し、冷凍培養物として−８０℃で保存した。菌株１１６９−ＮＴ１は、インビトロおよびインビボの検定に使用し、接合ワクチンに使用したタイプＶ莢膜多糖の原料であった。ＧＢＳタイプＶ菌株ＣＪＢ１１１は、もともとベイラー大学のキャロル・ベイカー博士から入手した。
【００２０】
ＧＢＳタイプII多糖またはタイプＶ多糖のＴＴへの接合．タイプIII多糖の精製に以前記載されている方法によって、タイプII莢膜多糖を菌株１８ＲＳ２１から精製した（３３）。タイプII多糖の単量体ＴＴへの接合は、ＴＴのＧＢＳタイプIII多糖への接合のために以前詳細に記載された方法を使って実施した（３３）。要するに、天然のタイプII多糖はセファローズＣＬ−６Ｂカラム（１．６×８５ｃｍ；ファーマシア・ファインケミカルズ）上でサイズ画分した。主ピークの中央で溶出する物質をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥して、相対分子量２００，０００の物質を得た。この物質の５００ＭＨｚでの1Ｈ−核磁気共鳴分光分析により、天然タイプII多糖構造（２０）およびグループＢ抗原（２６）の不存在が確認された。本発明の接合分子に使用するのに適した多糖は、分子量が広範囲に変化してもよい。多糖成分の好ましい分子量は、約５，０００および１，０００，０００ダルトンの間である。もっと好ましい範囲は、１００，０００と３００，０００の間である。１００，０００から３００，０００の範囲の中で、約２００，０００ダルトンの分子量を持つ多糖が好ましい。
【００２１】
サイズ画分されたタイプII多糖は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる穏和な酸化に供された（１８）。この過程で、多糖上のシアル酸残基の一部がシアル酸の炭素８個の同族体である、５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−ガラクトシルオクツロソン酸に変化した（３３）。酸化されたシアル酸残基の百分率は、前述のようなシアル酸残基およびその酸化誘導体のガスクロマトグラフィー−質量分光分析によって評価された（３３）。好ましくは、各ＧＢＳタイプII多糖のシアル酸残基の約５ないし５０％が、変性されて蛋白質に結合可能になる。最も好ましくは、ＧＢＳタイプII多糖のシアル酸残基の約５ないし２５％が、変性されて蛋白質に結合可能になる。
【００２２】
ＧＢＳタイプII多糖の約５ないし１０％の変性が最も好ましい。末端シアル酸残基の約５ないし８０％の変性を達成するために、ＧＢＳタイプＶを酸化して、反応性のアルデヒドを生成するのが好ましい。末端シアル酸残基の約１０ないし５０％の変性が最も好ましい。
【００２３】
本発明の接合分子の蛋白質成分は、どんな生物学的に許容される蛋白質でもよい。好ましい蛋白質としては、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、およびＣＲＮ197のような交差反応的物質がある。
【００２４】
酸化されたタイプII多糖は、前述のような還元的アミノ化によって、単量体の破傷風トキソイド（「ＴＴ」）（カナダ、モントリオール、アーノルド・フラッピピャー研究所）に還元的アミノ化で結合させた（３３）。ＴＴはやはり前述されたゲル濾過クロマトグラフィーによってその単量体に精製された（３３）。要するに、過ヨウ素酸塩で処理されたタイプII多糖１０ｍｇおよび精製ＴＴ１０ｍｇを０．６ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．１）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）をその混合物に加えて３７℃で５日間培養した。接合の進行は、スーパーローズ６（ファーマシア）ゲル濾過カラム上での少量の反応生成物の高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって監視した。反応は、（高分子量の接合体を示す）カラムの空隙容積で溶出するピークの高さが一定になった時に終了した。接合体は、前述のようにバイオゲルＡ、０．５Ｍ（カリフォルニア州、リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ）のカラム上でのクロマトグラフィーで精製した（３３）。ワクチンの蛋白質含有量は、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、ロウリらの方法（２５）で評価した。炭水化物の含有量は、精製したタイプII多糖を標準として使用して、デュボアらの方法（１１）で分析した。
【００２５】
タイプＶ莢膜多糖は、前述のタイプIII多糖の精製法で、ＧＢＳタイプＶ１１６９−ＮＴ１細胞から精製した（３３）。タイプＶ多糖の単量体ＴＴへの接合は、ＴＴのＧＢＳタイプIII多糖への接合について前述した方法を使って実施した（３３）。
【００２６】
天然のタイプＶ多糖は、２００，０００の相対分子量を有した。５００ＭＨｚにおけるＨ−核磁気共鳴分光分析によるこの物質の分析で、天然のタイプＶの構造（２）およびグループＢ抗原の不存在が確認された（２６）。
【００２７】
蛋白質に結合させるために、タイプＶ多糖の末端シアル酸残基に反応性のアルデヒド基を導入するために、タイプＶ多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる穏和な酸化に供した（８）。この過程の結果、多糖上のシアル酸残基の一部が、シアル酸の炭素８個の同族体である、５−アセトイミド−３，５−ジデオキ−Ｄ−ガラクトシルオクツロソン酸に変換された（３３）。酸化されたシアル酸残基の百分率は、シアル酸残基およびその酸化誘導体のガスクロマトグラフィー−質量分析によって評価した。
【００２８】
酸化されたタイプＶ多糖は、前述の還元的アミノ化によって単量体ＴＴ（カナダ、モントリオール、アーマンド・フラッピアー研究所）に結合させた（３３）。ＴＴは、やはり前述したゲル濾過クロマトグラフィーでそのモノマーに精製した（３３）。要するに、８．６ｍｇの過沃素酸処理したタイプＶ多糖および８．７ｍｇの精製したＴＴを、０．５ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．２）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３１．５ｍｇ）をこの混合物に加えて３７℃で１０日培養した。接合の進行は、スーパーローズ６（ファーマシア）ゲル濾過カラム上で分析した少量の反応混合物の高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）で監視した。反応は、（高分子量の接合体を示す）カラムの空隙容積で溶出するピークの高さが一定になった時に終了した。接合物は、流動緩衝液として０．０１Ｍの燐酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌプラス０．０１％のチメロサールを使用して、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファーマシア）の２．６×９１ｃｍのカラム上でのクロマトグラフィーで精製した。ワクチンの蛋白質含有量は、ウシ血清アルブミンを標準として、ロウリーらの方法（２５）で評価した。炭水化物含有量は、ガラクトースを標準として、デュボアらの方法（１１）で評価した。
【００２９】
II−ＴＴワクチンおよびＶ−ＴＴワクチンによるウサギのワクチン接種．体重が約３ｋｇである３羽の雌のニュージーランド白ウサギ（マサチューセッツ州、アムハースト、ミルブルック農場）の群を、それぞれ合計容積２ｍｌに完全フロイントアジュバントで乳化した、未結合の天然タイプII多糖またはII−ＴＴワクチンの５０μｇで、背部の４箇所に皮下接種した。これらの動物は、２０日目および４１日目に不完全フロイントアジュバントで調製したワクチンのブースター注射（５０μｇ）を受けた。０、２０、３４、４１、５５および７０日目に各動物から血清を得て、無菌濾過し、−８０℃で貯蔵した。
【００３０】
約３ｋｇの１羽の雌のニュージーランド白ウサギ（マサチューセッツ州、アムハースト、ミルブルック農場）を、合計容積２ｍｌにミョウバンと混合したＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチン５０μｇで、背部の４箇所に皮下接種した。この動物は、２２日目および４２日目にミョウバンで調製したワクチンのブースター注射（５０μｇ）を受けた。０、３５、５６および９１日目にその動物から血清を得て、無菌濾過し、−８０℃で貯蔵した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ．ＧＢＳタイプII−特異性のウサギ抗体を、アルカリホスファターゼ（カリフォルニア州、バーリンガム、タゴ・インコーポレーテッド）に接合したヤギ抗−ウサギＩｇＧで、１／３，０００の希釈で、酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量した。マイクロタイタープレート（イムロン２；バージニア州、シャンティイー、ダイナテック・ラボラトリーズ）に、前記のようにウエルあたり１００ｎｇのポリ−Ｌ−リシンに結合した精製タイプII多糖を塗布した（１５、３３）。抗体価を逆数希釈として記録し、１／８００の希釈時に対照血清（全ＢＧＳ１８ＲＳ２１細胞に生じたウサギ抗血清）を含むウエルが０．５のＡ405に達したとき、≧０．３のＡ405を示した。接合ワクチンの蛋白質部分に特異的な抗体の量は、単量体ＴＴ（ウエルあたり１００ｎｇ）を塗布したプレートを使用してＥＬＩＳＡで評価した。ＴＴ−特異性のＩｇＧ価（タイター）を逆数希釈として記録し、基体であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ１０４ホスファターゼ基体錠；シグマ・ケミカル・カンパニー）の添加後、≧０．３のＡ405を示した。
【００３２】
ＧＢＳタイプＶ−特異性のウサギ抗体も、アルカリホスファターゼ（カリフォルニア州、バーリンガム、タゴ・インコーポレーテッド）に接合したヤギ抗−ウサギＩｇＧで、１／３，０００の希釈で、ＥＬＩＳＡによって定量した。マイクロタイタープレート（イムロン２；バージニア州、シャンティイー、ダイナテック・ラボラトリーズ）に、前記のようにウエルあたり１００ｎｇのポリ−Ｌ−リシンに結合した精製タイプＶ多糖を塗布した（１５）。抗体価を逆数希釈として記録し、１／３０００の希釈時に対照血清（全タイプＶ菌株１１６９−ＮＴ１）を含むウエルが０．３のＡ405に達したとき、≧０．３のＡ405を示した。
【００３３】
免疫ウサギ血清からのＩｇＧおよびＩｇＭの分離．７０日目に得られた、別記（２８）のようにII−ＴＴに育成した免疫ウサギ血清のプール品０．５ｍｌから免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）を分離するのに、蛋白質Ａ−アガロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィー（イリノイ州、ロックフォード、ピアス・ケミカル・カンパニー）を使用した。抗体クラスの分離は、１／５００の希釈で使用したヤギ抗−ウサギＩｇＧ（γおよびＬ鎖特異性；タゴ）および１１／２００の希釈で使用したヤギ抗−ウサギＩｇＭ（μ鎖特異性；ニューヨーク州、ウエストバリー、セラーラブ）でタイプII多糖を塗布したＥＬＩＳＡプレートで確認した。
【００３４】
競合ＥＬＩＳＡ．II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ血清の特異性は、抑制剤として同質（タイプII）及び異質（タイプＩａ及びIII）多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって決定された。ワクチン誘導されプールされたウサギ血清（７０日目に得られた）のエピトープ特異性は、抗体結合の抑制剤として、先天及び脱シアル化されたタイプII多糖及びβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いて試験された。先天タイプII多糖は、８０℃で２時間、６％酢酸で処理することにより脱シアル化された。多糖抑制剤は、順次４倍希釈し、II−ＴＴワクチンを用いたワクチン接種後７０日目に得られたプールされたウサギ血清（１００００倍希釈）の当容積（７５μｌ）と混合した。それから、この混合物（１００μｌ）を、タイプII多糖コートされたＥＬＩＳＡウエルに添加した。アルカリ性ホスファターゼ接合した抗ウサギＩｇＧが、１／３０００の希釈割合で第二抗体として使用された。結果が、以下に示されている。％抑制＝〔抑制剤なしのＡ405−抑制剤を用いたＡ405）／抑制剤なしのＡ405〕×１００
ＧＢＳ Ｖ−ＴＴウサギ抗血清の血清タイプ特異性は、ＧＢＳタイプ特異多糖類Ｉａ、Ｉｂ）II、III、Ｖ及びVIを用いて評価された。ＥＬＩＳＡウエルは、ポリ−Ｌ−リジンにリンクしたＧＢＳタイプＶ多糖を含む１００ｎｇ／ウエルでコートされた。Ｖ−ＴＴワクチンに対するウサギ抗血清で、１／６０００に希釈されたものは、各多糖抑制剤を用いて培養された。培養された抗血清は、ＥＬＩＳＡウエルに添加され、このプレートは、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体（１／３０００希釈）と、これまでに詳述されている基質（２８）を用いて処理された。
【００３５】
インビトロにおけるＧＢＳの抗体媒介死滅．ヒトの末梢血白血球により引き続いて死滅させるためのＧＢＳ細胞をオプソニン化するためのワクチン誘発ウサギ抗体の能力を、インビトロオプソノ食作用アッセイ（７、８）により評価した。
【００３６】
ＧＢＳタイプＶ反応性抗体のオプソノ食作用活性を測定するための反応アッセイは、３００μｌの緩衝液における１．５×１０7白血球（ＷＢＣ）；５０μｌにおける３×１０6ＣＦＵのタイプＶ ＧＢＳ菌株ＣＪＢ １１１；ヒト補体（ＧＢＳタイプＶ菌株細胞を用いて吸収された）（５０μｌ）；抗体−抗Ｖ−ＴＴ熱不活性化（５０μｌ）；変性されたイーグル培地（５０μｌ）を培養することによって行われた。混合物は、３７℃にて６０分間混合しながら培養した。ＧＢＳコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）における違いは、標準プレートカウント法により３７℃にて１時間、引き続いて培養して測定された。
【００３７】
ワクチン誘導されたウサギ抗体によるマウスの受動的防御．１０匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交雌マウス（タコニックファームス、ジャーマンタウン、Ｎ．Ｙ．）のグループで、各マウスの体重が１８〜２０ｇであるものに、タイプII多糖又はII−ＴＴワクチンのいずれかでワクチン接種したウサギからプールされた血清（７０日）0.2ｍｌを腹腔内的に注入した。タイプII多糖を用いて免疫化したウサギからの７０日目に得られたプールされた血清のＥＬＩＳＡによって測定された力値（タイター）は１００であり、II−ＴＴワクチンの場合は１２８００であった。５匹のマウスの対照グループには、プールされた事前免疫ウサギ血清又は結合されないＴＴを生じさせるプールされた抗血清（２７）を投与した。２４時間後に、１．０ｍｌのトッド−ヘウィットブロスの全量において、マウスは、タイプII菌株１８ＲＳ２１（１．５×１０5ＣＦＵ／マウス）を用いて誘発した。各菌株に対する誘発投薬量は、事前に同じ体重で同じ月齢のマウスの９０％以上が死に至るように決定された。生き残ったマウスを、３日間引き続いて毎日数えた。
【００３８】
統計分析．致死ＧＢＳ感染に対したマウスを受動的に防御する異なったウサギ血清の能力を比較するために、フィッシャーズの正確試験が使用された。
【００３９】
結果
II−ＴＴワクチン及びＶ−ＴＴワクチンの調製及び組成物．ＧＢＳ II−ＴＴワクチン及びＧＢＳ Ｖ−ＴＴワクチンを、ＧＢＳタイプIII結合ワクチンの構成について以前に詳述された方法によって調製した（３３）。タイプII ＧＢＳ多糖の制御された過ヨウ素酸塩の酸化により、ガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析によって決定されたものとして、７％の多糖のシアル酸残基の変化が起こった。単−ＴＴは、還元性アミノ化により、タイプII多糖上の変異したシアル酸位置に共有結合で結合した。この精製されたII−ＴＴワクチンは、３２％（ｗｔ／ｗｔ）の蛋白質及び６８％（ｗｔ／ｗｔ）の炭水化物を含んでいた。II−ＴＴワクチンの最終収量は７．８ｍｇ、３９％であった。
【００４０】
タイプＶ ＧＢＳ多糖の制御された過ヨウ素酸塩の酸化により、この多糖において約８％、２５％及び５０％のシアル酸残基の変化が生じた。単一のＴＴは、還元性アミノ化によって、タイプＶ多糖上の変化したシアル酸位置に共有結合で結合した。多糖類は酸化された結果、そのシアル酸残基の約８％が変化し、蛋白質のモル比に対して低い多糖を有する接合体が生じた。末端のシアル酸残基の２５又は５０％が変化した多糖類は、蛋白質のモル比に対してより望ましい多糖を有する接合分子が生じた。シアル酸残基の２５％が変化したＧＢＳタイプＶ多糖類を、表Ｉに示される生化学的な特徴を有する接合ワクチンを製造するのに使用した。
【００４１】
【表１】
ウサギにおけるII−ＴＴワクチン及びＶ−ＴＴワクチンの免疫原性．II−ＴＴワクチン及び先天タイプIII多糖の免疫原性を、ウサギにおいて比較した。タイプII特異抗体における増加は、II−ＴＴワクチンの初期投薬の後に観察された（表２）。ワクチンのブースター投与により、更に抗体応答が増加した。抗体レベルは、変化せずに維持されるか、あるいは、４１日の第２のブースター投与の後にわずかに上昇し、この研究の残りの間を通して維持された（表２）。II−ＴＴワクチンとは対照的に、結合していない先天ＧＢＳタイプII多糖は、特異的な抗体応答をもたらさなかった（表２）。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された動物はまた、ＴＴに対する抗体を生成し、前免疫レベルを越えて、約３−１ｏｇ10増加を達成した。
【００４２】
【表２】
Ｖ−ＴＴワクチン（２５％まで多糖が酸化された）の免疫原性もまた、ウサギにおいて評価した。抗体（ＩｇＧ）レベルは、第１及び第２のタイプＶ−IIワクチンの投薬の後に増加し、この研究を実施する間、維持された（表３）。
【００４３】
【表３】
ワクチン誘発されたウサギの血清の抗原性．蛋白質キャリヤーへの多糖の接合は、その先天的な形態で多糖において見い出されている重要な抗原エピトープを変化させることはない。我々は、抑制剤として同種及び異種ＧＢＳ多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって、II−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性を試験した。４５０ｎｇ／ｍｌの濃度にて先天タイプII多糖は、ウサギ抗体の結合の５０％を抑制し、II−ＴＴワクチンか生じた（図２）。ＧＢＳタイプＩａ及びタイプIII多糖類は、５００μｇ／ｍｌよりも高い濃度であってもII−ＴＴワクチンを生じさせる血清の結合を抑制しなかった（図２）。これらの結果は、標的抗原に対するII−ＴＴワクチン誘発された抗体の血清タイプ特異性を証明しており、接合ワクチンの多糖部分の抗原エピトープの保存を示している。
【００４４】
シアル酸によって影響されたエピトープが、II−ＴＴワクチンの調製の間に維持されるかどうかを調べるために、先天及び脱シアル化されたタイプIII多糖が、II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗体の結合の抑制剤として競合ＥＬＩＳＡにおいて使用された。この多糖の脱シアル化は、８０℃にて２時間、６％酢酸を用いた処理によって行われた。シアル酸残基の定量的な除去は、標準としてのＮ−アセチルノイラミン酸（シグマ）を用いて、チオバルビツール酸アッセイ（３２）によって行われた。Superose ６ ＦＰＬＣカラム（ＬＫＢ−ファルマシア、スウェーデン）における、酸処理を行う前の先天タイプII多糖のＫavは０．４９であり、一方、酸処理された多糖のＫavは０．５２であり、先天多糖が重量で２０％になるような側鎖のシアル酸残基の損失により、多糖の分子の大きさにわずかな縮小が示された。ｍｌあたりの脱シアル化したＧＢＳタイプIIが２００μｇであっても、先天タイプII多糖に対するII−ＴＴワクチン抗体の３３％の結合によって抑制された（図３）。II−ＴＴワクチン抗血清による脱シアル化又はコアタイプII多糖が相対的に認識しにくいことは、免疫電気泳動ゲルによって確かめられ、このゲルは、（示されてはいないが）コアタイプII多糖ではなく、先天のものと一緒に生成した沈降素バンドを示していた。先天タイプII多糖に対するII−ＴＴワクチン抗血清の結合は（示されてはいないが）０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で使用されたβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースによって抑制することができなかった。
【００４５】
ＧＢＳタイプＶ−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性は、抑制剤として同種及び異種ＧＢＳ多糖類を用いた競合ＥＬＩＳＡによって試験された。先天タイプＶ多糖は、タイプＶ−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗体の結合を効果的に抑制した（図５）。ＧＢＳタイプＩａ、タイプＩｂ、タイプII、タイプIII及びタイプＶＩは、タイプＶ−ＴＴワクチンを生じさせる血清の結合を効果的に抑制しなかった（図５）。これらの結果は、標的抗原に対するタイプＶ−ＴＴワクチン誘発された抗体の特異性を示している。
【００４６】
ＧＢＳワクチン誘発された抗体のインビトロ活性．インビトロにおける人間の末梢血白血球による死滅のためのＧＢＳをオプソニン化するための免疫血清の能力は、動物防御実験（２７、３３）におけるＧＢＳに対する防御効能と関連があった。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された３羽のウサギに生じた抗体は、１．８１ｏｇ10以上にまでＧＢＳタイプII菌株１８ＲＳ２１の死滅を促進した（表４）。前もって免疫化したウサギの血清又は、先天ＧＢＳタイプII多糖又は結合していないＴＴを用いてワクチン接種されたウサギからの血清は、インビトロにおけるＧＢＳの死滅を促進しなかった（表４）。ワクチン誘発されたウサギ抗体は、２つのＧＢＳタイプII臨床隔離集団（菌株Ｓ１６及びＳ２０）の人間の血液白血球による死滅を、前免疫化ウサギ血清に比べて、１．８１ｏｇ10以上にまで促進した（表５）。タイプII−ＴＴワクチンに対するウサギ血清は、異種（タイプＩａ及びIII）ＧＢＳ菌株のインビトロにおける死滅を促進することがないので、血清タイプ特異性であることがわかった（表５）。
【００４７】
【表４】
【００４８】
【表５】
蛋白質Ａ親和性−精製されたＩｇＧ及びＩｇＭは、タイプII−ＴＴワクチンを生じさせるプールされた血清から得られた（２８）。各Ｉｇフラクションの特異性は、クラス特異性二次抗体を用いたＥＬＩＳＡによって確認された。ＩｇＭ及びＩｇＧフラクションのＡ405Ｓ（１／１００に希釈）は、μ鎖特異性接合体を伴い、それぞれ０．３８４及び０．００９であり、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（γ及び軽鎖特異性）を伴い、それぞれ０．０８６及び２．３６７であった。分離されたＩｇＭ及びＩｇＧは、人間の血液白血球によるタイプII ＧＢＳのオプソニン死滅を促進させる能力について試験された。タイプII−ＴＴワクチンを生じさせる分画されていない血清を１：１００に希釈し、同様の血清からのＩｇＧフラクションの等量１：１００希釈は、タイプII ＧＢＳの死滅を、それぞれ１．６５±０．２２及び０．９５±０．０９ １ｏｇ10まで促進した。対照的に、タイプII ＧＢＳは死滅されることはなく、オプソノ食作用アッセイにおいて、前免疫血清（−０．３９±０．１３ １ｏｇ10）及び、タイプII−ＴＴワクチンを生じさせる血清からの、ＩｇＭを多く含むフラクションの存在下で成長した。
【００４９】
人間の血液白血球によるＧＢＳタイプＶ菌株（ＣＪＢ １１１）の死滅を促進するための、ＧＢＳタイプＶ−ＴＴワクチン誘発されたウサギ抗血清の能力もまた、インビトロにおけるオプソノ食作用アッセイによって評価された（８）。図６に示されるように、１０％の濃度でのＧＢＳタイプＶ−ＴＴ抗血清は、コントロールに対応するＧＢＳタイプＶ菌株ＣＪＢ １１１を効果的に最適化した。制御反応条件は、抗血清のない補体（１０％）、補体のない抗血清（１０％）、抗血清（１％）及び補体であった。
【００５０】
マウス防御アッセイ．ワクチン誘発された抗体のインビボでの防御能力を試験するために、タイプII ＧＢＳ １８ＲＳ２１を用いて誘発する前に、マウスは、プールされたII−ＴＴワクチン血清（７０日）２４時間を用いて受動的に免疫化された。前もって、誘発投薬量は、試験されたマウスの９０〜１００％が致死するように決定した。完全（１００％）な防御は、ＧＢＳ II−ＴＴワクチンを生じさせる血清を与えられたマウスのグループに生じる一方、事前にワクチン血清を与えた５匹のマウスの１匹しか生存しなかった（表６）。結合していないタイプII多糖又は結合していないＴＴのいずれかを用いてワクチン接種されたウサギからの血清を受けたマウスの中では生き残ったものはなかった（表６）。
【００５１】
【表６】
最初に髄膜炎菌性多糖（１８）を生ずるＧＢＳタイプIII多糖を用いた結合したストラテギー（strategy）は、全てのＧＢＳ莢膜多糖抗原に適用できる。なぜならば、これらは全てシアル酸を含むからである。しかしながら、ジ又はトリサッカライド側鎖の末端サッカライドとしてのシアル酸を有する、他のＧＢＳ多糖類に類似せず、ＧＢＳタイプII多糖は、２つのモノサッカライド側鎖（９、２０）の一つに唯一の糖としてシアル酸を有する繰り返しユニットを持っている。ＧＢＳタイプII接合ワクチンを構成する際、我々は、タイプII多糖上のシアル酸残基の７％を酸化し、多糖がＴＴに結合するための位置として、これらを使用した。精製されたII−ＴＴワクチンは、スーパーローズ６カラム（１０6以上の分子量に一致する）の空隙容量で溶出し、６８％（ｗｔ／ｗｔ）炭水化物及び３２％（ｗｔ／ｗｔ）蛋白質からなっていた。
【００５２】
アジュバントを用いて乳化されたタイプII−ＴＴワクチンは、タイプII多糖特異抗体をもたらすことのない、結合していない先天タイプII多糖とは対照的に、ウサギにおいて免疫性があった。免疫化された３羽のウサギのうちの２羽は、II−ＴＴワクチンの単一投薬後３週間、強く応答した。最適タイプ特異抗体は、II−ＴＴワクチンのブースター投与後３週間、全ての３羽のウサギにおいて達成された。タイプII特異抗体価の更なる増加は、II−ＴＴワクチンの３回目投薬後には観察されなかった。インビトロ及びインビボ実験からの結果は、II−ＴＴワクチンを生じさせる抗体が、タイプIIＧＢＳに対して機能的に活性であることを示していた。II−ＴＴワクチンを用いてワクチン接種された３羽のウサギのそれぞれからの血清は、人間の末梢白血球によるタイプII ＧＢＳのインビトロでの死滅を促進し、タイプIIＧＢＳの致死量に対して完全（１００％）保護を有した非近交マウスをもたらした。II−ＴＴワクチン抗血清は、同種ＧＢＳ菌株（１８ＲＳ２１、Ｓ１６、及びＳ２０）に対してはオプソニン的に活性であったが、異種ＧＢＳ血清タイプ（タイプ１ａ及びIII）は試験されていない。
【００５３】
先天タイプII多糖が、タイプII多糖コートＥＬＩＳＡウエルへのII−ＴＴワクチン抗血清の結合を抑制する一方、たとえ２００μｇ／ｍｌの濃度で使用されたとしても、脱シアル化されたタイプII多糖と共に４０％以下の抑制が得られた。
この結果は、タイプII多糖の重要な抗原決定基が、シアル酸残基の存在に依存していることを示している。この結果は、これらが全てのタイプII生物を生じさせるウサギ抗血清を共に得られることを証明している（２１）。しかしながら、抑制剤としてβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いたＥＬＩＳＡ抑制実験は、II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ抗血清が、ガラクトース特異抗体を含まないことを示していた。タイプII先天多糖へのII−ＴＴワクチン抗血清の結合の抑制は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でβ−Ｏ−メチルガラクトピラノースを用いた場合にも得られなかった。それゆえ、側鎖ガラクトースは、多糖がＴＴに結合された際に、タイプII多糖の免疫優性エピトープであるとは思われない。これらの結果は、免疫化学研究とは対照的に、全てのタイプIIＧＢＳ生物（１２、２１）を生じさせるウサギ血清を用いて実施され、この生物においては、ガラクトース側鎖が、シアル酸依存エピトープと共に、タイプII多糖の２つの免疫優性位置の一つになっているものと思われる。以前の研究（１２、２１）において使用され、しかもｐＨ調整条件にて培養されていない全てのタイプIIＧＢＳ細胞は、ある程度、シアル酸が欠けた多糖を有しているかも知れない。これらの状況の下では、側鎖ガラクトースは、主な抗原性エピトープであるように思われる。II−ＴＴワクチンを合成するために使用したタイプII多糖の原料は、ｐＨ７．０に維持されたタイプIIＧＢＳ培地であった。最終分析から、シアル酸が〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）の多糖から構成されていることが確認された。我々は、ＴＴへの結合タイプII多糖は、多糖の立体配座を変え、これによって、ホスト免疫系による確認に利用できないガラクトースエピトープを与える可能性を否定することができない。II−ＴＴワクチン誘発されたウサギ抗血清は、ガラクトース特異抗体が欠けていたが、タイプIIＧＢＳ生物に対してインビトロ及びインビボにて充分に機能した。シアル酸残基のいくつかの化学的修飾も、引き続いて起こるこれらの位置へのＴＴの結合もどちらも、官能タイプII特異抗体をもたらすのに必要な臨界抗原エピトープを変化させない。II−ＴＴワクチンを生じさせるウサギ血清からの精製されたＩｇＧが、人間の白血球によるタイプIIＧＢＳのインビトロにおける死滅を促進させることは、タイプII多糖の免疫原性がＴＴへの接合により増加するということだけでなく、機能ＩｇＧ抗体がもたらされることを示唆している。
【００５４】
ＧＢＳタイプＶ莢膜多糖は、隣接した糖残基上の２つの異なる側鎖を含むトリサッカライド骨格からなる繰り返しユニット構造を有している。（参考文献３５：図４）。ＧＢＳタイプＶ−ＴＴ接合ワクチン調合物の一つでは、タイプＶ多糖における長い側鎖（即ち３糖残基）上のシアル酸残基の２５％が酸化された。この酸化されたシアル酸残基は、ＴＴにタイプＶ多糖が結合するための位置として使用された。この精製されたタイプＶ−ＴＴワクチンは、３８％（ｗｔ／ｗｔ）のＴＴと６２％（ｗｔ／ｗｔ）の炭水化物からなっていた。ミョウバンと混合されたＶ−ＴＴワクチンは、ウサギにおいて免疫原性であることが示された。タイプＶ−ＴＴワクチンの最初の投与及びブースター投与の後に、強い作用が観察された。又、第２のブースター投与では、タイプＶ多糖ＩｇＧ価における更なる増加が生じた。タイプＶ−ＴＴ誘発アッセイの血清特異性は、競合ＥＬＩＳＡによって示された。Ｖ−ＴＴワクチンに対する生じたウサギ抗血清は、ヒト白血球及び補体の存在下でインビトロにてタイプＶ ＧＢＳを死滅させる能力により証明されるものとして機能的に活性である。
【００５５】
III−ＴＴワクチンと同様に、II−ＴＴワクチンは、活性多糖と比較してウサギにおいて改良された免疫原性を示し、多糖の構造、ＴＴが結合される多糖上のシアル酸の位置及びワクチン組成物が違っているにもかかわらず、ウサギにおいてオプソニン的に活性なＩｇＧをもたらす。又、タイプＶ−ＴＴワクチンは、ウサギにおいて免疫原性であること、及び、インビボにて抗体を機能的に誘導可能であることが明らかとなった。我々は、この計画のＧＢＳ多糖−蛋白質接合体が究極的に、人間の病気に最もしばしば関連のあるＧＢＳ血清タイプに対して保護をもたらし得る多価ＧＢＳワクチンの成分を構成していると推察している。
【００５６】
更に、我々は、ワクチンが、製薬学的に受容可能なキャリヤーに接合分子を添加することによって、本発明の接合分子から製造できると考えている。恐らく、本発明の抗原分子における架橋の程度は、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌することのできるワクチンを提供するのに充分な範囲に制御される。このようなワクチンは可溶性であることが好ましい。免疫法は、受容株哺乳類にワクチンを注入することによって行うことができ、必要であれば一度、それに引き続いてブースター注入を行う。投与されるべきワクチンの充分な投薬量は、存在する多糖の量に基づくことができる。接合ワクチンの多糖成分の３〜８０μｇの範囲を投与することができる。
【００５７】
（参考文献）
【００５８】
【表７−１】
【００５９】
【表７−２】
【００６０】
【表７−３】
【００６１】
【表７−４】
【００６２】
【表７−５】
【００６３】
【表７−６】
我々は、これまで、本発明の多くの具体例を述べてきたが、基本構想は、本発明の方法を使用するこの他の具体例を提供するために変更できることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例によってこれまでに示してきた特殊な具体例よりも、これに添付した請求の範囲によって定義されていることが理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１３２７２７（Ｐ２００９−１３２７２７Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５７６７（Ｐ２００９−５５７６７）
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【分割の表示】特願２００５−１９６９０２（Ｐ２００５−１９６９０２）の分割
【原出願日】平成５年９月２４日（１９９３．９．２４）
【出願人】（５０００３４３６５）ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド (4)
【出願人】（５９１１０６９４５）ナショナル・リサーチ・カウンシル・オブ・カナダ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＣＡＮＡＤＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【分割の表示】特願２００５−１９６９０２（Ｐ２００５−１９６９０２）の分割
【原出願日】平成５年９月２４日（１９９３．９．２４）
【出願人】（５０００３４３６５）ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド (4)
【出願人】（５９１１０６９４５）ナショナル・リサーチ・カウンシル・オブ・カナダ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＣＡＮＡＤＡ
【Ｆターム（参考）】
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