本発明は、コイルドコイルおよび／またはテザーを用いて構築された改変タンパク質複合体および、このような複合体、例えば多特異性抗体または他の多特異性Ｆｃ含有複合体の作製、使用および精製方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)式Ｉの７アミノ酸繰り返しを含む第一コイルドコイルドメイン(ＣＣ)とＶＨドメインとを含む第一ポリペプチドであって、
(Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７)ｎ (式Ｉ)
Ｘ１は疎水性アミノ酸残基又はアスパラギンであり、
Ｘ２、Ｘ３およびＸ６は各々任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ５およびＸ７は各々荷電アミノ酸残基である、第一ポリペプチドと、
(ｂ)式ＩＩの７アミノ酸繰り返しを含む第二コイルドコイルドメイン(ＣＣ)とＶＨドメインとを含む第二ポリペプチドであって、
(Ｘ'１Ｘ'２Ｘ'３Ｘ'４Ｘ'５Ｘ'６Ｘ'７)ｎ (式ＩＩ)
Ｘ'１は疎水性アミノ酸残基又はアスパラギンであり、
Ｘ'２、Ｘ'３およびＸ'６は各々任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ'４は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ'５およびＸ'７は各々荷電アミノ酸残基である、第二ポリペプチドと、
を含む抗体であって、
このとき式ＩおよびＩＩのｎが２以上であり、そして、
各々の７アミノ酸繰り返しにおいて、第一ＣＣは第二ＣＣ内のＸ'７残基に対して電荷が逆であるＸ５残基を含み、第一ＣＣは第二ＣＣ内のＸ'５残基に対して電荷が逆であるＸ７残基を含む、抗体。
【請求項２】
第一および第二のポリペプチドがそれぞれＶＨおよびＣＨ1ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
第一および第二のポリペプチドがそれぞれさらにヒンジドメインを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
第一および第二のポリペプチドがそれぞれさらにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一に記載の抗体。
【請求項５】
第一および第二のポリペプチドがそれぞれ、ＶＨ、ＣＨ1、ヒンジ、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを、Ｎ末端からＣ末端の方向で互いに関連してＶＨ−ＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3に配して含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がさらに第三および第四のポリペプチドを含み、このとき該第三ポリペプチドが第一ＶＬドメインを含み、該第四ポリペプチドが第二ＶＬドメインを含む、請求項１から５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項７】
第一ポリペプチドのＶＨドメインがテザーによって第三ポリペプチドのＶＬドメインに連結され、第二ポリペプチドのＶＨドメインがテザーによって第四ポリペプチドのＶＬドメインに連結される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
第三ポリペプチドがさらに第一ＣＬドメインを含み、このとき該第一のＶＬおよびＣＬドメインがＮ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＬで第三ポリペプチド内に互いに関連して配置されており、第四ポリペプチドがさらに第二ＣＬドメインを含み、このとき該第二のＶＬおよびＣＬドメインがＮ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＬで第四ポリペプチド内に互いに関連して配置されている、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記第一ＶＬドメインおよび前記第二ＶＬドメインの配列が同じである、請求項６から８のいずれか一に記載の抗体。
【請求項１０】
前記第一または前記第二のポリペプチドのうちの少なくとも１のＶＨのＮ末端が、テザーによりＣＬのＣ末端に連結している、請求項１から９のいずれか一に記載の抗体。
【請求項１１】
(ａ)式Ｉの７アミノ酸繰り返しを含む第一コイルドコイルドメイン(ＣＣ)とＶＨドメインとを含む第一ポリペプチドであって、
(Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７)ｎ (式Ｉ)
Ｘ１は疎水性アミノ酸残基又はアスパラギンであり、
Ｘ２、Ｘ３およびＸ６は各々任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ５およびＸ７は各々荷電アミノ酸残基である、第一ポリペプチドと、
(ｂ)式ＩＩの７アミノ酸繰り返しを含む第二コイルドコイル(ＣＣ)とＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含む第二ポリペプチドであって、
(Ｘ'１Ｘ'２Ｘ'３Ｘ'４Ｘ'５Ｘ'６Ｘ'７)ｎ (式ＩＩ)
Ｘ'１は疎水性アミノ酸残基又はアスパラギンであり、
Ｘ'２、Ｘ'３およびＸ'６は各々任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ'４は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ'５およびＸ'７は各々荷電アミノ酸残基である、第二ポリペプチドと、
を含んでなる抗体であって、
このとき式ＩおよびＩＩのｎは２以上であり、
各々の７アミノ酸繰り返しにおいて、第一ＣＣは第二ＣＣ内のＸ'７残基に対して電荷が逆であるＸ５残基を含み、第一ＣＣは第二ＣＣ内のＸ'５残基に対して電荷が逆であるＸ７残基を含む、抗体。
【請求項１２】
第一ポリペプチドがＶＨおよびＣＨ1ドメインを含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
第一ポリペプチドがさらにヒンジドメインを含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
第一ポリペプチドがさらにＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含む、請求項１２または１３に記載の抗体。
【請求項１５】
第一ポリペプチドが、ＶＨ、ＣＨ1、ヒンジ、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを、Ｎ末端からＣ末端の方向で互いに関連してＶＨ−ＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3に配して含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体がさらに第三ポリペプチドを含み、このときこの第三ポリペプチドがＶＬドメインを含む、請求項１１から１５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項１７】
前記第三ポリペプチドがさらにＣＬドメインを含み、ＶＬおよびＣＬドメインがＮ末端からＣ末端の方向で互いに関連してＶＬ−ＣＬに配置されている、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記第一ポリペプチドのＶＨのＮ末端がテザーによりＣＬのＣ末端に連結している、請求項１１から１７のいずれか一に記載の抗体。
【請求項１９】
Ｘ１、Ｘ'１、Ｘ４およびＸ'４の何れかの疎水性アミノ酸残基が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびメチオニンからなる群から選択される、請求項１から１８のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２０】
Ｘ５、Ｘ'５、Ｘ７およびＸ'７の何れかの荷電アミノ酸残基が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１から１９のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２１】
前記第一ＣＣの少なくとも一の７アミノ酸繰り返しにおいて、Ｘ１がアスパラギンであり、それぞれのＸ'１が前記第二ＣＣの少なくとも一の７アミノ酸繰り返しにおいてアスパラギンである、請求項１から２０のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２２】
(ａ)第一ＣＣが７アミノ酸繰り返しを含み、このとき
Ｘ１がロイシン又はアスパラギンであり、
Ｘ２がアラニン又はグルタミンであり、
Ｘ３がアラニン又はグルタミンであり、
Ｘ４がロイシンであり、
Ｘ５がグルタミン酸であり、
Ｘ６がリジン又はトリプトファンであり、そして
Ｘ７がグルタミン酸であり、そして、
(ｂ)第二ＣＣが７アミノ酸繰り返しを含み、このとき
Ｘ'１がロイシン又はアスパラギンであり、
Ｘ'２がアラニン又はグルタミンであり、
Ｘ'３がアラニン又はグルタミンであり、
Ｘ'４がロイシンであり、
Ｘ'５がリジンであり、
Ｘ'６がリジン又はトリプトファンであり、そして
Ｘ'７がリジンである
、請求項１から２１のいずれか一に記載に記載の抗体。
【請求項２３】
ｎが３以上である、請求項１から２２のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２４】
ｎが４以上である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記第一または前記第二のＣＣのうちの少なくとも１が、抗体の定常ドメインにＣ末端で連結している、請求項１から２４のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２６】
前記定常ドメインがＣＨ3ドメインであり、第一ＣＣが第一ポリペプチドのＣＨ3ドメインにＣ末端で連結し、第二ＣＣが第二ポリペプチドのＣＨ3ドメインにＣ末端で連結している、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
連結が、切断可能なリンカー配列によるものである、請求項２５または２６の抗体。
【請求項２８】
Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位が、前記第一または前記第二のＣＣのうちの少なくとも１にＮ末端で位置する、請求項１から２７のいずれか一に記載の抗体。
【請求項２９】
ＶＬ、ＣＬ、テザー、ＶＨ、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを、Ｎ末端からＣ末端の方向で互いに関連してＶＬ−ＣＬ−テザー−ＶＨ−ＣＨ1−ＣＨ2−ＣＨ3(式ＩＩＩ)に配して含む第一ポリペプチドを含んでなる抗体。
【請求項３０】
抗体がさらに式ＩＩＩの第二ポリペプチドを含む、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体が多特異性である、請求項１から９および３０のいずれか一に記載の抗体。
【請求項３２】
抗体が少なくとも２の抗原を結合することができる、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体が同じ抗原上の少なくとも２のエピトープを結合することができる、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体が二重特異性である、請求項１から９および３０のいずれか一に記載の抗体。
【請求項３５】
前記テザーが、グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)残基を含む、請求項７、１０、１８、２９または３０に記載の抗体。
【請求項３６】
前記テザーが、１５から５０のアミノ酸長である、請求項７、１０、１８、２９、３０または３５に記載の抗体。
【請求項３７】
前記テザーが、２０から２６のアミノ酸長である、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
前記テザーがＧＧＳリピートを含む、請求項７、１０、１８、２９、３０および３５から３７のいずれか一に記載の抗体。
【請求項３９】
前記テザーが切断可能である、請求項７、１０、１８、２９、３０および３５から３８のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４０】
前記抗体が、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を取り除く突然変異を含む、請求項２８から３９のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４１】
前記のＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を取り除く突然変異がヒンジドメインにある、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体がＫ222Ａ置換(ＥＵ番号付けシステム)を有する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記テザー又は前記リンカーは、以下のエンドペプチダーゼ：フューリン、トロンビン、Ｇｅｎｅｎａｓｅ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ(ＴＥＶ)、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ3プロテアーゼ(ＨＲＶ Ｃ3)およびキニノゲナーゼの一又は複数によって切断可能である、請求項２７または３９に記載の抗体。
【請求項４４】
前記テザー又は前記リンカーは、アスパラギン−グリシンペプチド結合を含む、請求項２７または３９に記載の抗体。
【請求項４５】
前記アスパラギン−グリシンペプチド結合がヒドロキシルアミンによって切断可能である、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が、細胞障害性剤にコンジュゲートした定常領域を含む、請求項１から４５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体が哺乳動物の細胞によって発現される、請求項１から４５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４８】
前記哺乳動物の細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体が、原核細胞によって発現される、請求項１から４５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項５０】
前記原核細胞が大腸菌である、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
請求項１から４５のいずれか一に記載の抗体をコードするベクターを含む細胞を培養培地内で培養する工程を含む、抗体の製造方法。
【請求項５２】
さらに、前記細胞又は前記培養培地から抗体を回収することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
さらに、
(ａ)プロテインＡを含むカラム上に前記抗体を捕捉し、
(ｂ)該カラムから抗体を溶出し、そして
(ｃ)カオトロピック剤又は中性界面活性剤を含有する溶液に溶出された抗体を希釈する
工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
カオトロピック剤又は中性界面活性剤の存在下でコイルドコイル含有抗体を維持することを含む、溶液中でコイルドコイル含有抗体を維持する方法。
【請求項５５】
前記のカオトロピック剤又は中性界面活性剤が、アルギニン、グアニジン-ＨＣｌ、尿素、過塩素酸リチウム、ヒスチジン、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、ツイーン、トリトンまたはＮＰ−４０である、請求項５３または５４に記載の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ−１】

【図１２Ａ−２】

【図１２Ｂ−１】

【図１２Ｂ−２】

【図１２Ｂ−３】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２９】

【図３０Ａ−１】

【図３０Ａ−２】

【図３０Ｂ−１】

【図３０Ｂ−２】

【図３０Ｃ−１】

【図３０Ｃ−２】

【図３０Ｃ−３】

【図３０Ｃ−４】

【図３０Ｃ−５】

【図３０Ｄ−１】

【図３０Ｄ−２】

【図３０Ｄ−３】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【公表番号】特表２０１３−５０５２３８（Ｐ２０１３−５０５２３８Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９７５２（Ｐ２０１２−５２９７５２）
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２５４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４６０５
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック，　インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】