コクシジウム症ワクチンの使用のための方法および組成物
本発明はＥｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンに関し、このワクチンは、膜への係留のための疎水性シグナル配列につながれるか、または分泌を可能にするための疎水性分泌シグナルおよび切断部位につながれた（異種）プロモーターと、ｒ５６、８２ｋＤａ、および／またはＴＦＰ２５０抗原に由来するものなどのＥｉｍｅｒｉａ抗原ＯＲＦのインフレーム挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとをインフレームで含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の優先権を主張する。上記米国仮特許出願の全容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、トリのワクチン接種のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
コクシジウム症は、世界的に非常に重要なニワトリの疾患である。それはブロイラー産業だけでも年間１０億ＵＳＤを超える推定損失をもたらす。コクシジウム症は、７種のアピコンプレクサの寄生原虫Ｅｉｍｅｒｉａの感染によってもたらされる。これら７種のうちでも、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａおよびＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａが最も問題であると考えられている。コクシジウム症の症状は、気力低下、貧血、水様下痢または血性下痢（感染する種による）、体重減少および飼料効率比の低下を含む。
【０００４】
Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫の生育および伝播は特にニワトリに蔓延している。なぜならこれらのトリは典型的に稠密な条件下で飼育されているために、衛生管理を維持することがきわめて困難だからである。これらの条件下で抗コクシジウム薬物を使用することは、抵抗性が発達するため、かつ窮屈な給餌環境においてこうした薬物を持続的に投与することが困難であるために効果がない。さらに、抗コクシジウム薬は抗菌効果も有しており、餌内に抗生物質を使用することは望ましくないとされている。
【０００５】
米国農務省（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ：ＵＳＤＡ）は、家禽の餌に加えられてニワトリ腸内におけるＥｉｍｅｒｉａ段階の細胞内発達を防ぐ抗コクシジウム薬物の使用に、米国および世界的なブロイラー産業が大きく頼っていることを認識している。肉製品に薬物が残留することを防ぐやり方として、ニワトリが市場に送られる約１週間前に薬物が餌から取除かれる。抗コクシジウム薬物はトリコクシジウム症を防ぐための主要な手段であり続けているが、ＵＳＤＡは、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫がこうした薬物に耐性となり得るため、代替的な制御方策の開発が必要だと述べている。
【０００６】
コクシジウム症と戦うための代替的な解決策の１つは、有効なワクチンを開発することであろう。低用量の病原性または弱毒化Ｅｉｍｅｒｉａ種接合子嚢の混合物の投与が検討されてきたが、それはまだ実際に有効な介入として証明されていない。ニワトリはＥｉｍｅｒｉａに対する免疫を発達させるため、コクシジウム症に対する「サブユニット」ワクチンを開発するためにかなりの努力が費やされている。こうしたワクチンは、遺伝子操作技術を用いて、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のタンパク質成分を生成するだろう。このアプローチの背後にある根拠は、バクテリアの無害な実験株を用いて、胚内（卵の中）または孵化時のニワトリを免疫化するために用いられ得る「組み換え」タンパク質を生成できるということである。もし成功すれば、ニワトリは寄生虫の表面に通常存在するタンパク質によって免疫化されるため、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染に耐性となる。しかしながら、ＵＳＤＡによると、今日までの努力は実を結ぶには至っておらず、トリコクシジウム症を予防するために利用可能な商業的サブユニットワクチンは未だに存在しない。
【０００７】
ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は当該産業において何らかの承認を得ているワクチンであり、これは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの発生のマクロガメトサイト（雌性）段階から単離された３つの主要なアフィニティ精製された全長ネイティブ抗原（５６ｋＤａ、８２ｋＤａおよび２３０ｋＤａ）を用いて、産卵する雌鳥の産卵期が始まる直前に雌鳥にワクチン接種することに基づいている。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、ｍａｘｉｍａおよびｔｅｎｅｌｌａに対する免疫を含む、ブロイラーに感染するコクシジウム種に対する交差免疫を誘発する。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は産卵時点前の若雌鳥を免疫化するために用いられる。免疫種畜は卵黄を通じて特定の抗体をブロイラーに移し、孵化後の生育初期にそれらを遮蔽し、一方では農場で自然にコクシジウムに晒される。この露出によって母性保護の際に免疫がもたらされ、それがブロイラーのライフサイクルの初期段階でブロイラーに移される。保護的な移行抗体が卵黄を介して子供のヒヨコに移され、ヒヨコは高力価の移行抗体を有して孵化する。これらの移行抗体は、ヒヨコの生育期間の最初の２〜３週間にわたり、接合子嚢脱落を低減させるように作用する。これは次に、ピーク同腹仔接合子嚢カウント（ｐｅａｋ ｌｉｔｔｅｒ ｏｏｃｙｓｔ ｃｏｕｎｔｓ）を６０〜８０％低下させ、これは通常は３〜５週齢で起こる。
【０００８】
しかしながら、このワクチンは母子免疫をブロイラーに移すことができるものであり、餌に抗コクシジウム薬を入れることなくブロイラーを飼育できるという事実にもかかわらず、その免疫は、ブロイラーのライフサイクルの初期段階で母鳥からブロイラーに移されるという点において間接的な免疫である。ブロイラーがその免疫を保持することを確かめるための仕組みはなく、孵化後のブロイラーまたはヒヨコに直接投与できるワクチンは現在入手不可能である。このことから、母鳥から免疫を適切に受取らなかったブロイラー、または免疫を失って追加免疫を必要とするより高齢のブロイラーの間でコクシジウム症が広がる可能性が残っている。実際に、ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）の製造者は、ＣｏｘＡｂｉｃは種畜にワクチン接種するために用いられるものであって、その種畜のブロイラーヒヨコのみを保護することを示している。ＥＬＩＳＡ法によって定めるとき、母子免疫は約１４日間またはもう少し長く持続する。それらのトリがライフサイクルのもっと後の年齢でさまざまな種のＥｉｍｅｒｉａに晒されれば、もはや母子免疫は存在しないため、より高齢のトリは保護されないままとなる。
【０００９】
ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）ワクチンには、それが種畜ニワトリへの注射によって投与されるというさらなる欠点もある。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）のためのワクチン接種スケジュールにおいては、若雌鳥は飼育の間に２回のワクチン注射を受ける必要があり、その２回の注射の間を少なくとも４週間あける必要がある。第１の注射は１２週齢から１５週齢で行なわれてもよい；第２の注射は１８週齢から２１週齢で行なわれてもよい。よってこのワクチンの投与モードは、大集団のブロイラーニワトリへの直接投与に容易に適応できない。
【００１０】
上述のとおり、ブロイラーニワトリの処置のためのワクチンを得ることには主要な商業的誘因がある。ニワトリに注射する必要のあるワクチンは、大集団のニワトリへの投与に対して実用的ではない。したがって、コクシジウム症の有害な影響に対する保護をもたらすためにブロイラーニワトリに容易に投与され得るワクチンが要求されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特定の局面において、本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンを提供することによって、コクシジウム症ワクチンに対する要求に対処するものであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１２】
特定の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードする。他の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原をコードする。さらに付加的な実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする。特定の他の例示的な実施形態において、マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原と組み合わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードするＯＲＦを含む。
【００１３】
コクシジウム症ワクチンは、あらゆるトリウイルスから調製されてもよい。好ましくは、コクシジウム症ワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１２のゲノムからなる群より選択されるトリアデノウイルスゲノムを用いる。特定の実施形態において、トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである。
【００１４】
組み換え組み換えトリアデノウイルスベクターはさらに、目的のＯＲＦの挿入のためのクローニング部位のすぐ上流に切断配列を含んでもよく、前記ベクターからの発現産物は可溶性産物を生成する。
【００１５】
例示的な実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。残基７０〜１０３５によってコードされるヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。配列番号１４には全長のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ Ｒ５６をコードする配列も示されており、この配列は配列番号１の配列内に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基１０３〜１０６に示されている。さらに他の実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６フラグメント、または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする。特定の代替的な実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる。残基６４４８〜７０８３によってコードされるヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。配列番号１６には全長のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ ＴＦＰ２５０をコードする配列も示されており、この配列は配列番号３の配列内に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基２３１〜２３３に示されている。
【００１６】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの組成物および使用方法も意図されており、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１７】
別の実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの調製および使用を教示し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列に作動可能に連結されたプロモーターと、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１８】
さらなる実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの組成物および使用方法に関し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１９】
本発明は、上記コクシジウム症ワクチン組成物の組み合わせを含む多価コクシジウム症ワクチン調製物も意図している。
【００２０】
加えて、多価コクシジウム症ワクチン調製物は、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（Ｃｈｉｃｋｅｎ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＤＶ）、トリインフルエンザ（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＡＩ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、およびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明の例示的な方法は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感染に対して被験体を免疫化することに関し、この方法は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態において、投与するステップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むＦＡＶベクターによって前記被験体を免疫化したときにみられる免疫よりも増強されたレベルの免疫を誘発する。
【００２２】
好ましくは、この方法はニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種の処置のために使用される。好ましくは、その鳥種はニワトリである。特定の実施形態において、ニワトリは成体のブロイラーニワトリである。
【００２３】
投与は、たとえば前記被験体への前記ワクチンの噴霧、食物中の前記ワクチンの前記被験体への給餌、および前記被験体の飲用供給物中への前記ワクチンの提供などを含むあらゆる従来の投与経路によるものであってもよい。
【００２４】
本発明の別の方法は、ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法を含み、この方法は、被験体に本発明のいずれかのワクチンを投与するステップと、前記ニワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与するステップとを含む。
【００２５】
この併用療法は、種畜雌鳥にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与して孵化の際にヒヨコに免疫を与え、本発明の前記ワクチンを孵化後のｄａｙ１およびそれより後にヒヨコに投与し、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与するというものである。
【００２６】
本発明の他の局面は、トリアデノウイルスゲノムを含むトリアデノウイルスベクターを記載し、これは異種プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配列はマルチプルクローニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目的のＯＲＦを挿入することによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とインフレームで前記目的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる。
【００２７】
特定の実施形態において、疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発現された宿主細胞から分泌されることを可能にするための切断部位を含む。他の実施形態においては、シグナル配列が切断部位を含有しないことによって、宿主細胞の細胞表面に係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる。
【００２８】
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦの挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも意図される。いくつかの実施形態において、ベクターは、目的のＯＲＦの挿入のためのクローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含んでいてもよく、前記ベクターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する。
【００２９】
疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも開示される。
【００３０】
別の実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３１】
さらなる実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３２】
さらなる実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３３】
さらに付加的な実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを記載する。
【００３４】
膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも意図される。
【００３５】
上記に概説したワクチンにおいて、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４のヌクレオチド７０〜１０３５の核酸配列、または配列番号１４のヌクレオチド７０〜１０３５のフラグメントからなる。たとえば、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントからなる切断型ｒ５６フラグメントをコードする。
【００３６】
他の実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号３に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる。
【００３７】
分泌を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる分泌シグナル配列を含んでもよい。特定の実施形態において、分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグナル配列からなる群より選択される。
【００３８】
アンカー産物を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる膜アンカーシグナル配列を含んでもよい。特定の実施形態において、膜アンカーシグナル配列は、トリインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列からなる群より選択される。
【００３９】
記載されるいずれの発現ベクターも、本明細書に記載される方法における使用のためにワクチンに容易に配合され得る。
【００４０】
例示的な方法は、トリ集団における免疫応答を誘発する方法を含み、この方法は前記集団にこうしたワクチンを投与するステップを含む。
【００４１】
コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する好ましい方法は、本発明の組み換えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンの投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い免疫応答を誘発する。
【００４２】
本明細書に記載される組み換えトリアデノウイルスベクターを含む単離細胞も意図される。
【００４３】
組み換えトリアデノウイルスベクターのいずれかを適切な賦形剤と有利に組み合わせて、動物、特にトリの処置のための薬学的処方物を生成してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明のＦＡＶに基づくベクターの概略を示す図である。
【図２】図２は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのｒ５６タンパク質を含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３】図３は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのＴＦＰ２５０タンパク質を含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図４Ａ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（１９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５〜１２４である。
【図４Ｂ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（１９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５〜１２４である。
【図５】図５は、発現カセットの化学合成のためのスキームを示す図である。
【図６】図６は、構築物を調製するためのＰＣＲ増幅のためのスキームを示す図である。
【図７】図７は、配列の挿入のためのマルチプルクローニング部位の使用のためのスキームを示す図である。
【図８】図８は、以前に添付物にて「ｐ１２３２＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマインターフェロンの分泌シグナルを有するＣＭＶＰ−ＴＦＰ２５０−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号１７として本明細書に示される。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号１８によってコードされており、これは配列番号１７のヌクレオチド５６２９．．５７１２に位置し、配列番号１９のタンパク質に翻訳される。切断型ＴＦＰ２５０挿入物は配列番号２０の配列によってコードされており、これは配列番号１７のヌクレオチド５７１３から６３４８に位置し、配列番号２１の配列に翻訳される。このプラスミドは、位置４９６５．．．５６２３にＣＭＶプロモーター配列を有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図９】図９は、以前に添付物にて「ｐ１２２３＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマインターフェロンの分泌シグナルを有するＭＬＰ−Ｒ５６−ｐＡ−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号２２として本明細書に示される。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号２３によってコードされており、これは配列番号２２のヌクレオチド５３８１．．５４６１に位置し、配列番号６のタンパク質に翻訳される。切断型Ｒ５６挿入物は配列番号２４の配列によってコードされており、これは配列番号２２のヌクレオチド５４６２から６４３０に位置し、配列番号２５の配列に翻訳される。このプラスミドは、ヌクレオチド５３８１...５４６１にＭＬＰ配列を有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｍａｘｉｍａのＲ５６配列（配列番号２）およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａのＲ５６配列（配列番号２９）の比較を示す図である。シグナル配列を欠いた切断型Ｒ５６の配列（配列番号３０）も示される。この図面の下側部分は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの切断型Ｒ５６（配列番号３１）とＥ．ｍａｘｉｍａの切断型Ｒ５６（配列番号３２）との配列比較を示す。この配列情報図は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｍａｘｉｍａ（配列番号３３）およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（配列番号３４）の短縮バージョンのＲ５６を示す図である。この配列情報図は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、ブロイラーニワトリの集団に、コクシジウム症に対するこうしたトリの防御免疫のために投与できる組み換えウイルスワクチン組成物の調製方法および使用に関する。このワクチンは孵化後のトリに投与でき、注射による投与は必要なく、代わりに経口、食物供給、飲用供給物を通じて、またはエアロゾルスプレーとして投与されてもよい。本発明のワクチン構築物の利点は、免疫原を内部発現させるのではなく、免疫原の発現が感染細胞の細胞外部位に送達されるように指示することである。本明細書に記載されるワクチンの場合、こうして免疫原が粘膜細胞（例、鼻腔、気道、胃腸管、腸粘膜などにおける粘膜細胞）の外表面に送達されることによって、細胞内での送達免疫原の発現では免疫原が適切な免疫応答機構に効率的に接触しないおそれがあるのに対し、免疫応答が迅速に開始され得る部位に免疫原を提示する。
【００４６】
既存のワクチンは、いくつかの理由から有効なコクシジウム症ワクチンに対する当該技術分野の長年にわたる要求を満たしていない。第１に、コクシジウム症を処置するために現在利用可能なワクチンであるＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、母鳥にしか免疫を与えず、その免疫が卵黄を通じてブロイラー集団に移ることに頼っている。母子免疫は、卵の孵化後最初の約１４日間という比較的短期間しか持続しない。よって、これはブロイラーニワトリにおいて特定的に長期の応答を誘発するために有効なワクチンではない。さらに、このワクチンは注射を介して投与される。このことからも、このワクチンは高齢のトリの大集団を処置するために有効でないものとなる。
【００４７】
コクシジウム症に対する既存の処置の問題点に対処するため、本発明者らはブロイラーに防御免疫を与えるための新たなワクチンを開発した。このワクチンは、サブユニットワクチンにおけるＥｉｍｅｒｉａ抗原の発現をもたらすトリアデノウイルス発現系に基づくものである。この抗原は疎水性シグナル配列とインフレームで発現され、ワクチンが投与されたニワトリにおけるウイルス感染細胞の細胞表面に提示されるか、または代替的に、発現ベクター中の疎水性シグナル配列が切断シグナルをも含む場合には、こうした感染ニワトリにおける細胞外ドメインに分泌される。これらの特徴、ならびに組み換えトリアデノウイルスコクシジウム症ワクチンを用いるための方法および組成を、本明細書の下記においてさらに詳しく説明する。
【００４８】
一般的に、本発明のワクチンは、トリアデノウイルスゲノムでできた、図１に示されるとおりに構築された発現ベクターで構成される。トリまたは家禽アデノウイルス（ｆｏｗｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＦＡＶ）は当業者に周知であり、広範囲にわたって特徴付けられている。たとえば、家禽アデノウイルスタイプ１株ＣＥＬＯ（ヒヨコ胚致死孤児（ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｌｅｔｈａｌ ｏｒｐｈａｎ）に対するもの）と呼ばれるトリアデノウイルスが記載されている（Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９３９−４９（１９９６）；Ｌｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５（Ｐｔ １０）：１８１７−２５（１９８４）；Ｍａｙ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：４８３−９（１９７５）；Ｌｅｈｒｍａｎｎ，Ｈ．，Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６５１７−２５（１９９９）；Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３１６８−７７（１９９７））。遺伝子療法、ならびにヒトおよび動物、特にトリにおける感染性疾患に対するワクチンでの使用のために、ベクターを形成するためのＣＥＬＯの使用および操作方法は、たとえば米国特許第６，３３５，０１６号などにも広範囲に記載されている。ＣＥＬＯ（ＦＡＶ１またはＦＡＶ Ａ）の完全なゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ４６９３３；ＮＣ＿００１７２０およびＡＣ＿００００１４に見出されるであろう。
【００４９】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において用いられる家禽アデノウイルスベクターは、たとえば米国特許出願第０８／４４８，６１７号および第０９／２７２，０３２号に記載されるものなどの家禽アデノウイルスベクター（ＦＡＶ）であり、本明細書においてその内容は引用により援用される。特に好ましい実施形態において、このベクターはＦＡＶ血清型８（以後「ＦＡＶ８」）の右側端部を含む。ＦＡＶ８の全ヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号５として示される。ＦＡＶ８発現ベクターの全ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５５９１１にも含まれている。ＦＡＶ８の単離および生成のための方法は、米国特許第６，２９６，８５２号（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する）に記載されている。
【００５０】
ＦＡＶ９（ＦＡＶ Ｄとも呼ばれる）はＣａｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐｔ １０），２５０７−２５１６（１９９８）に記載されており、その完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８３９７５およびＮＣ＿０００８９９に示されている。
【００５１】
ＦＡＶの配列の教示が当業者に公知であるため、本発明のワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１、ＦＡＶ１２またはあらゆる後に単離される血清型の家禽アデノウイルスを用いて容易に調製され得る（ウイルスの分類についてはＭｏｎｒｅａｌ，Ｇ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｖ．４，ｐ．１−２７（１９９２）を参照）。米国特許第６，２９６，８５２号に記載されるとおり、ＦＡＶ ＣＦＡ２０（ＦＡＶ血清型１０である）、ＣＦＡ１５（血清型１０）ならびにＣＦＡ４０およびＣＦＡ４４（両方とも血清型８）ならびにＦＡＶ ＣＦＡ１５およびＣＦＡ１９（血清型９）は、ワクチン生成のために特に有用であり得る。
【００５２】
本明細書で調製されるワクチンにおいて使用されるプロモーターは、ＦＡＶ構築物中の目的の異種コード領域の発現を駆動できるあらゆるプロモーターであってもよい。こうしたプロモーターは、トリアデノウイルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＭＬＰ）、ＣＭＶｐ、ＰＧＫ−、Ｅ１−、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶＧ２）、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ−４０最初期プロモーター、Ｔ４後期プロモーター、およびＨＳＶ−Ｉ ＴＫ（ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝子プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ））ＬＴＲ（長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ））およびＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝子プロモーターを含むがそれに限定されない。ＦＡＶ ＭＬＰのＤＮＡ配列は、米国特許第６，２９６，８５２号の図５に示されている。多くの他の哺乳動物またはトリのプロモーターが当業者に公知であり、それらが用いられてもよい。
【００５３】
本明細書に記載されるワクチンに使用されるプロモーターは、目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域の核酸配列とインフレームでつながれた疎水性シグナル配列のインフレーム融合物の発現を駆動する。疎水性シグナル配列は、家禽アデノウイルス発現ベクターに感染した宿主細胞の外膜を標的として、または特定的にそこに向けて目的のペン（ｐｅｎ）リーディングフレームまたはコード領域の発現を行なわせるために用いられ得るあらゆる配列であってもよい。本発明において、このＦＡＶに基づく発現ベクターはニワトリに感染させることが意図される。ＦＡＶは典型的に、たとえばニワトリの腸管、気道または胃腸管などに見出され得る、ニワトリの粘膜細胞、肝細胞および上皮細胞に感染する。よって疎水性シグナル配列は、目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域の発現をこれらの粘膜細胞の細胞表面に輸送するものである。こうして目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域を動物の粘膜細胞の細胞表面に提示することによって、免疫応答の開始をそれほど効果的に促進できないおそれのある動物細胞内での発現とは対照的に、本発明のワクチンは、免疫応答を効果的に開始できる内部部位に抗原を最も効果的に送達できる。今説明しているワクチンの使用によるこの発現産物の細胞外分泌によって、野生型免疫原によってワクチンを調製したときにみられるものよりも大きい抗体免疫応答および抗体生成がもたらされる。
【００５４】
真核細胞において、分泌タンパク質は、疎水性シグナル配列によって小胞体膜を標的とする。本発明はこの性質を用いて、異種疎水性シグナル配列を利用してワクチンにおける所与のタンパク質の発現を細胞表面に向ける。
【００５５】
本明細書で用いられるウイルスベクターは、ＯＲＦの発現産物が発現の際に切断型ＯＲＦタンパク質の（感染細胞からの）分泌を可能にするように改変されたＯＲＦをコードするか、または感染細胞の表面にタンパク質を直接発現させるような核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含む、組み換えベクターである。たとえば、目的のＯＲＦは、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、またはインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質からのシグナル配列とインフレームで発現される。用いられ得る他のシグナル配列は、たとえば乳清リンタンパク質シグナル配列；α−１酸糖タンパク質；α−サイロトロピン；メクラウナギからのインスリン；アンコウからのインスリン；ヒトインスリン；ラットインスリンＩまたはＩＩ；ヒツジβ−カゼイン；ヒツジχ−カゼイン；ヒツジα−ラクトアルブミン；ヒツジβ−ラクトグロブリン；ヒツジα−ｓｌカゼイン、およびヒツジα−ｓ２カゼイン；ＶＳウイルス糖タンパク質；雄鳥ＶＬＤＬ−１１；ミツバチメリチン；ラットラクチン；ヒト胎盤ラクトゲン；ヒトβ−絨毛性ゴナドトロピン；ヒトα−絨毛性ゴナドトロピン；ウサギウテログロビン；ラット成長ホルモン；ヒト成長ホルモン、ヒト；ウシ成長ホルモン；ウシ副甲状腺ホルモン；ラットレラキシン；ラット血清アルブミン；ヒト血清アルブミン；ラット肝臓アルブミン；ニワトリトロポエラスチンＢ；ニワトリオボムコイド；ニワトリリゾチーム；ニワトリコンアルブミン；ヒトα−１アンチトリプシン；ラット前立腺結合タンパク質；ラット前立腺結合タンパク質ｃ２；ＡＤウイルス糖タンパク質；ラットアポリポタンパク質Ａｌ；狂犬病ウイルス糖タンパク質；ヒトインフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ赤血球凝集素；ヒトインフルエンザＪａｐ赤血球凝集素；トリインフルエンザＦＰＶ赤血球凝集素；ヒト白血球インターフェロン；ヒト免疫インターフェロン；ヒト線維芽細胞インターフェロン；マウスχ−免疫グロブリン；マウスλ−免疫グロブリン；マウスχ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；マウス胚ＶＨ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；イヌトリプシノゲン１；イヌトリプシノゲン２＋３；イヌキモトリプシノゲン２；イヌカルボキシペプチダーゼＡｌ；イヌアミラーゼ；マウスアミラーゼ；ラットアミラーゼ；ウサギα−ラクトアルブミン；ブタα−ラクトアルブミン；ラットカルボキシペプチダーゼＡ；ウシＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ヒトＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタガストリン；マウスレニン；トリパノソーマ糖タンパク質；ナマズソマトスタチン；アンコウソマトスタチン；ラットカルシトニン；およびアンコウグルカゴンのシグナル配列などを含む。これらのシグナル配列の各々は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３ １７−２１（１９８３）の図１に示されており、本明細書における使用のために容易に適応され得る。前述の参考文献の図１からのシグナル配列を本明細書の図４に転載している。
【００５６】
所与のタンパク質に対するこれらおよびその他のシグナルペプチド部位は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定できる。たとえば、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０サーバ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．＆Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．（２００４）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３−７９５）を用いてシグナルペプチド部位を予測できる。加えて、シグナル配列の決定を容易にするために利用可能なウェブサイトもあり、たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／などを参照されたい。発現された産物を細胞表面に輸送できる疎水性配列である限り、使用されるシグナル配列の正確な同一性は重要ではない。
【００５７】
好ましい実施形態において、シグナル配列は、そのシグナル配列を切断して付加タンパク質をこうした細胞の細胞外スペースに分泌させることを可能にするための切断部位を含む。特に好ましい実施形態においては、ニワトリガンマＩＦＮからのシグナル配列を用いて本発明のこの局面が示され、これは配列ＭＴＣＱＴＹＮＬＦＶＬＳＶＩＭＩＹＹＧＨＴＡＳＳＬＮＬ（配列番号６）を含み、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＴＡ ＡＡＴ ＣＴＴ（配列番号７）によってコードされ、ブタガンマＩＦＮに対する疎水性シグナル配列はＭＳＹＴＴＹＦＬＡＦＱＬＣＶＴＬＣＦＳＧＳＹＣ（配列番号８）であり、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＴＡＣ ＴＧＣ（配列番号９）によってコードされ、ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２に対する疎水性シグナル配列はＭＫＶＫＬＬＩＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩ（配列番号１０）であり、これは配列ａｔｇ ａａａ ｇｔａ ａａａ ｃｔａ ｃｔｇ ａｔｃ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｔ ａｃａ ｔｔｔ ａｃａ ｇｃｔ ａｃａ ｔａｔ ｇｃａ ｇａｃ ａｃａ ａｔａ（配列番号１１）によってコードされる。これらの例示的な配列の各々も切断部位を含み、そこにシグナルペプチダーゼが作用して発現ＯＲＦの放出をもたらす。
【００５８】
プロモーターと、切断部位を含んでも含まなくてもよい疎水性シグナル配列とに加えて、発現ベクターはポリアデニル化配列をさらに含む。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ分子を細胞質におけるエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出、および翻訳を助ける。ほぼすべての真核生物ｍＲＮＡはポリアデニル化されている。当業者は、タンパク質の組み換え発現のためにポリＡテール配列をルーチン的に付加する。
【００５９】
本発明のベクターに挿入されるＯＲＦまたはその他の外来配列は、本明細書に記載されるＦＡＶベクターを使用して発現されることが望まれるあらゆるＯＲＦまたはその他の外来配列であってもよい。これらその他の外来配列は、１つもしくはそれ以上のＯＲＦ、または目的の発現産物、または遺伝子ではないが治療上の目的での他の機能を有するその他のヌクレオチド配列からなっていてもよい。
【００６０】
しかしながら特定の実施形態において、本発明は、コクシジウム症に対してニワトリにワクチン接種するためのサブユニットワクチンとして使用されるベクターを記載する。この状況において、目的のＯＲＦはアピコンプレクサの原虫寄生体Ｅｉｍｅｒｉａの抗原をコードするものである。より特定的には、ＯＲＦは、米国特許第７，４２３，１３７号（本明細書において引用により援用される）に記載されるとおりの５６ｋＤａ、８２ｋＤａおよび２３０ｋＤａの抗原からなる群より選択される。より特定的には、本発明者らは、５６ｋＤａ（本明細書では代替的にｒ５６と呼ばれる）または２３０ｋＤａ（本明細書では代替的にＴＰＦ２５０と呼ばれる）抗原の全長配列をＦＡＶに組み込んでも有効なワクチンが生成されないことを見出した。しかし、切断型ｒ５６配列を用いると、ワクチンは効果的に免疫応答を誘発する。ｒ５６の全長アミノ酸配列を配列番号２に示しており、このタンパク質配列は配列番号１の配列によってコードされ、ｒ５６をコードする全長遺伝子も配列番号１４に示されている。加えて、５６ｋＤａ抗原をコードするプラスミドは、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２４００の下で公的に入手可能である。５６ｋＤａ抗原によって形質転換されたバクテリア細胞も、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２４０１の下で入手可能である。したがって特定の実施形態において、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断型ｒ５６が用いられる。ｒ５６の配列は配列番号２のアミノ酸２４〜３４５を含むものであり、これは配列番号１４の配列７０〜１０３５によってコードされてもよい。本発明の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は、切断型ｒ５６を感染細胞の細胞表面に係留する疎水性シグナル配列とインフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフレームであることによって、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ｒ５６は細胞の細胞外スペースに放出される。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリインフルエンザＨＡ抗原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症ワクチンが提供される。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シグナル配列が、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチンが提供される。特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型ｒ５６の細胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたｒ５６を細胞外スペースに放出するワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。
【００６１】
さらに他の例示的な実施形態においては、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断型ＴＦＰ２５０が用いられる。ＴＦＰ２５０の全長配列は配列番号４に示されており、これは配列番号３または配列番号１６によってコードされる。２５０ｋＤａ抗原をコードするプラスミドは、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２３９６の下で公的に入手可能である。この抗原によって形質転換されたバクテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９７の下で入手可能である。本明細書における好ましいワクチンに用いられるＴＦＰ２５０の配列は、配列番号４のアミノ酸２１４９〜２３６１またはアミノ酸２１５０〜２３６１を含むものであり、それはそれぞれ配列番号１６の配列６４４４〜７０８３および２１４９〜２３６１によってコードされてもよい。本発明の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２５０の切断型配列は、切断型ＴＦＰ２５０を感染細胞の細胞表面に係留する疎水性シグナル配列とインフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２５０の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフレームであることによって、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ＴＦＰ２５０は細胞の細胞外スペースに放出される。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリインフルエンザＨＡ抗原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症ワクチンが提供される。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シグナル配列が、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチンが提供される。特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型ＴＦＰ２５０の細胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたＴＦＰ２５０を細胞外スペースに放出するワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。
【００６２】
類似の態様で、Ｅｉｍｅｒｉａの８２ｋＤａ抗原を発現するワクチンと組み合わせてワクチンを調製してもよいことが意図される。８２ｋＤａ（本明細書においてはｇａｍ８２とも呼ばれる）抗原は、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２３９８の下で公的に入手可能であり、８２ｋＤａ抗原によって形質転換されたバクテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９９で入手可能である（本明細書の添付物に示されている）。本発明のワクチンのいずれかが、既存のワクチン投与プロトコルと組み合わせて使用されてもよい。たとえば、種畜、ヒヨコおよび高齢のニワトリにおいて防御免疫を生成するために、本明細書に記載されるワクチンをＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）と組み合わせて使用してもよい。
【００６３】
本明細書に記載される実施例の多くがＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの抗原から調製されたワクチンに関するが、当業者は他のＥｉｍｅｒｉａ種からの相同配列を用いてこうしたワクチンを調製してもよいことが容易に明らかになるだろう。当業者は、従来の分子生物学技術を用いてＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａからのオープンリーディングフレームの上記配列に対する相同性を介して、こうした適切なＤＮＡ配列を容易に同定できる。よって、他のＥｉｍｅｒｉａ種、たとえばＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉなどに由来する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのｒ５６、ＴＦＰ２５および８２ｋＤａのＯＲＦの相同体は、本明細書に記載されるコクシジウム症ワクチンの調製物に対して特定的に意図される。これに関して、配列番号１２はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａのｒ５６の配列を提供する。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのｒ５６配列が有効であることが示されれば、当業者は本明細書に記載される方法および組成物に用いるために他のＥｉｍｅｒｉａ種からのｒ５６の相同体を容易に同定できるだろう。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓもしくはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉ、または免疫学的に交差反応性の抗原を発現する微生物による感染に対して被験体を免疫化する方法を提供するために用いられ、この方法は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特に好ましい実施形態において、被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種を含むがそれに限定されない鳥種である。特に好ましい実施形態において、その鳥種はニワトリであり、より特定的にはブロイラーニワトリである。
【００６５】
このワクチンは、ワクチン接種に典型的に用いられるあらゆる経路によって投与されてもよく、その経路は、全身的（たとえば、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻腔内、非経口的、腸管内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または頭蓋内など）、経口投与、エアロゾル化、または肺内注入によるものを含むがそれに限定されない。投与は単一用量で行なわれてもよいし、特定の時間間隔後に１回またはそれ以上繰り返される用量で行なわれてもよい。適切な投与経路および投与量は状況（たとえば、処置される個体、処置される障害、または目的のポリペプチドのＯＲＦもしくはフラグメントなど）によって変わるが、当業者によって定められ得る。
【００６６】
このワクチンは従来の投与計画に従って投与されてもよく、たとえば投与量処方に適合する態様の単一または繰り返し投与として、予防的に有効な量、すなわちトリ（特に家禽）において病原性のＥｉｍｅｒｉａ寄生虫による攻撃に対する免疫を誘導する前記抗原を発現できる組み換え微生物または免疫化抗原の量にて投与されてもよい。免疫とは、ワクチン接種後のトリの集団において、ワクチン接種していないグループに比べて有意なレベルの防御が誘導されることとして定義される。特定の実施形態において、与えられる免疫は増強された免疫であり、ここで本発明のワクチンは、ワクチン接種後のトリの集団において、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むサブユニットＦＡＶベクターによってトリがワクチン接種されるときにみられる防御よりも有効なレベルの防御を誘導する。この、より効果的なワクチン接種が観察されるのは、このサブユニットワクチンが全長配列から調製されたサブユニットワクチンよりも高い安定性を有するためである。
【００６７】
本発明のワクチンは、感染動物が脱落させる接合子嚢の数を減らすかもしれない。通常、脱落した接合子嚢は群の他の動物に感染する。よって脱落した接合子嚢の数が減少することによって、その後感染される動物の数も減少し、さらに脱落した接合子嚢の数が減少することによって、感染性負荷の減少がもたらされる。特定の実施形態において、本発明のワクチンは、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染によって攻撃されたときに、トリにおける盲腸の病変の数を低減させる。
【００６８】
典型的に、生ウイルスベクターワクチンのニワトリ当りの用量率は１０２から１０１０ｐｆｕの範囲であってもよい（ただし、たとえばＨＶＴに対しては＜１０００ｐｆｕでも十分であり得る）。
【００６９】
本発明のワクチンは、同じおよび／もしくは他のＥｉｍｅｒｉａ種の他の抗原性成分、ならびに／または家禽病原性ウイルスもしくは微生物に由来する付加的な免疫原および／もしくはこれらの免疫原をコードする核酸配列と効果的に混合されてもよい。こうした混合ワクチンは、トリの群における寄生虫負荷を減少でき、コクシジウム症に対する防御のレベルを増加でき、加えて他の家禽病原体に対する防御ができる。こうした他の免疫原は、たとえばマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血剤（ＣＭ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、またはＥ．ｃｏｌｉからなる家禽病原性ウイルスまたは微生物の群から選択されてもよい。よって本発明は多価ワクチンを意図している。特に好ましい多価ワクチンは、上述のｒ５６発現ベクターを、上述のＴＦＰ２５０を発現する家禽アデノウイルスベクターと組み合わせるか、および／または上述の８２ｋＤａ抗原を発現する家禽アデノウイルスベクターと組み合わせたもので構成される、本発明のコクシジウム症ワクチンである。
【００７０】
ＦＡＶに基づくサブユニットワクチン中で発現されるＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型抗原から調製される本発明のワクチンの特定の利点は、それらをエアロゾルスプレーもしくは点眼剤によって投与してもよいし、ブロイラートリの飲水、胚内もしくはトリの餌に入れて投与するか、またはトリによって摂取されるゲルマトリックスとして配合してもよいことから、これらのワクチンが典型的な過密条件下であってもブロイラートリの大規模ワクチン接種に適用可能なことである。よって好ましくは、ワクチンはその投与を達成するためにワクチンの噴霧を容易にする賦形剤とともに調製されてもよい。
【００７１】
本発明のこれらのワクチンは、新たに孵化したヒヨコに噴霧または給餌されてもよいし、より高齢のトリに同様に噴霧および給餌されてもよい。
【００７２】
本発明のワクチンは、ｒ５６の全長配列またはＴＦＰ２５０の全長配列によって作製された同様のワクチンよりも明白な免疫応答を生じてより良い免疫を与える態様で、Ｅｉｍｅｒｉａ感染の病原性の影響から家禽を保護することができる。
【００７３】
本発明に従うワクチンは、たとえば上述した家禽アデノウイルスベクターを医薬的に許容できる担体と単に混合することによって作られてもよい。医薬的に許容できる担体とは、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を与えない、少なくともその動物がワクチン接種されないときの疾病によってみられる影響よりも過度の悪影響を与えない化合物と理解される。医薬的に許容できる担体は、たとえば滅菌水または滅菌生理食塩水などであってもよい。より複雑な形では、担体はたとえば緩衝液などであってもよい。
【００７４】
代替的には、本発明のコクシジウム症ワクチンはアジュバントをも含有してもよい。一般的にアジュバントは、非特異的態様で宿主の免疫応答を高める物質を含む。当該技術分野において、いくつかの異なるアジュバントが公知である。アジュバントの例は、フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ポリマーならびにポリアミン、たとえばデキストラン硫酸、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびピランなどである。同じく非常に適切なのは、表面活性物質、たとえばＳｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、ヘキサデシルアミン、リゾレシチン、メトキシヘキサデシルグリセロールなど、およびＱｕｉｌｌ Ａ（登録商標）などのサポニンである。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチドがしばしば用いられる。これらのアジュバントの次に、免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ＩＳＣＯＭＳ）、ミネラルオイル、たとえばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）など、植物油またはそのエマルション、およびＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅが有利に用いられてもよい。このワクチンは「媒体」をも含んでもよい。媒体とは、ポリペプチドがそれに共有結合することなく付着するような化合物のことである。よく用いられる媒体化合物は、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸化物、硫酸化物または酸化物、シリカ、カオリンおよびベントナイトなどである。媒体中に抗原が部分的に埋込まれるような、こうした媒体の特殊な形がいわゆるＩＳＣＯＭである（欧州特許第１０９．９４２号、欧州特許第１８０．５６４号、欧州特許第２４２．３８０号）。
【００７５】
ワクチン組成物は、たとえば分解されやすいポリペプチドの分解を防ぐため、ワクチンの有効期間を増すため、または凍結乾燥効率を改善するための安定剤をさらに含んでもよい。有用な安定剤は、スキムミルク、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、たとえばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミンまたはカゼインまたはその分解産物など、および緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などを含む。
【００７６】
凍結乾燥材料は、何年間も保存して生存可能に保つことができる。凍結乾燥材料に対する保存温度は、材料に有害になることなく零度より高くてもよい。特定の局面において、ワクチンは凍結乾燥される。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明に従うワクチンの生成を示すものである。これらの実施例においては、家禽アデノウイルス血清型８（ｆｏｗｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８：ＦＡＶ８）が用いられた。この送達系を用いることの主要な利点は、適切な標的組織（この場合には腸粘膜）へのサブユニットワクチン送達のためのベクターとして弱毒化ＦＡＶ８を利用できることにある。
【００７８】
実施例１
構築物の調製および分析
本実施例においては、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のマクロガメトサイト段階からの最も免疫原性の高いタンパク質の１つである組み換えタンパク質ｒ５６をＦＡＶ８ベクターにクローニングした。加えて、Ｅｉｍｅｒｉａ雄核発生段階からの別の免疫原性タンパク質である組み換えタンパク質ＴＦＰ２５０を別のＦＡＶ８ベクターに別個にクローニングした。このＴＦＰ２５０のＯＲＦは、前の研究でやはりＥｉｍｅｒｉａによる攻撃感染に対する部分的防御免疫を誘導することが示されたミクロネームタンパク質（寄生虫侵入に関与する小器官）の部分をコードしている。
【００７９】
形成された発現構築物を以下の２つの表に示す。
【００８０】
【化１】
【００８１】
【化２】
このベクター系を用いてニワトリにおける免疫応答を最大限にするために、これら２つのタンパク質をコードする各ＯＲＦを３つのＦＡＶ８発現構築物に別々にクローニングして、ネイティブタンパク質、膜に係留されたバージョンのタンパク質、および分泌形の抗原のいずれかを発現させた。後者の２つのＦＡＶ８構築物は、目的のＯＲＦの上流に適切なシグナル配列を融合することによって得られた。送達ベクターとしてＦＡＶ８を用いたことにより、ワクチンを安価に大規模に投与できるため、かなり大きなブロイラー市場に導入される可能性を有する最終生成物が提供される。
【００８２】
驚くべきことに、全長ｒ５６がＦＡＶ８ベクターにクローニングされたとき、それはベクター内で不安定であるために、サブユニットワクチンとして送達されたときにも適切な防御免疫を提供できないことが見出された。しかし、切断型バージョンの抗原を用いたときには、免疫が明確に示された。
【００８３】
３つのバージョンのｒ５６および３つのバージョンのＴＦＰ２５０を生成した。バージョン１はＵＴＳから供給されたネイティブＯＲＦであり、そのコード領域をＦＡＶ発現カセットに挿入した以外は変更していないものである。バージョン２は、シグナル配列を加えることによってｒ５６またはＴＦＰ２５０が細胞から分泌されるようにしたものである。バージョン３にもシグナル配列が付加されているが、これはｒ５６またはＴＦＰ２５０を細胞膜に向けるためのものである。
【００８４】
下記の表は第１の研究の結果をまとめたものである：
【００８５】
【表１】
組み換えウイルスが得られたことを確認するために、従来の手段を用いてウイルスを単離してプラーク精製した。加えてＰＣＲを用いて、組み換えＦＡＶのＤＮＡから単離された、挿入されたｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡ全体、ならびに各セクション（プロモーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０およびポリＡ）の増幅を確認した。プロモーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡからなる挿入発現カセット全体を含む、組み換えＦＡＶから単離したＤＮＡについても、両方向の配列決定を行なって配列挿入物の忠実度を確認した。抗ｒ５６または抗ＴＦＰ２５０血清を用いてタンパク質発現を確認した。
【００８６】
図２および図３は、さまざまな構築物からのｒ５６およびＴＦＰ２５０のタンパク質分析を示す。異なるＦＡＶ８構築物をＬＭＨ細胞系統に感染させることによって、タンパク質発現実験を行なった。これらの構築物は、すべてのタンパク質発現バージョン（ネイティブ、分泌および膜アンカー）とともに、異なるプロモーター（ＭＬＰまたはＣＭＶｐ）の制御下で設計された。陰性対照として、未感染のＬＭＨ細胞およびＦＡＶ８ベクターのみを感染させた細胞を用いた。組み換え５６に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてｒ５６抗原を検出し、組み換えペプチドに対するマウス抗血清を用いてＴＦＰ２５０を検出した。タンパク質バンドは、クローニングされた部分遺伝子フラグメントから予測されたペプチドの予想サイズに基づく適切な分子量のところに現れた。組み換えＴＦＰ２５０（図３）に対するレーン３および４にみられるスメアは、ペプチドと宿主細胞材料との凝集によるもののようであった。
【００８７】
この結果から、明確なバンドを示さなかったＴＦＰ２５０膜アンカー構築物を除くすべての構築物はよく発現されることが示された。明確なバンドを示さなかったのは、発現されたタンパク質が膜に係留して、膜からの抽出後に高次構造が変化したためかもしれない。
【００８８】
当業者にとって、多くの異なる可能性が利用可能である。必要な構築物を作製するために、３つの実施例を以下に示す。図５には、制限酵素部位、目的のＯＲＦ（たとえば切断型ｒ５６、８２ｋＤａタンパク質またはＴＦＰ２５０など）とインフレームのシグナル配列、および構築物をＦＡＶの右手端部発現カセットに挿入させるための第２の制限酵素部位の化学合成のためのスキームが示されている。
【００８９】
代替的に、（図６）当業者は、適切なＲＥ部位およびインフレームのシグナル配列を有するプライマーを用いて、目的のＯＲＦから所望の配列をＰＣＲ増幅してもよい。
【００９０】
他の実施例において、当業者はＦＡＶ ＲＨＥ発現カセットを構築して、プロモーターおよびシグナル配列、次いでシグナル配列とインフレームで目的のＯＲＦを挿入するためのＭＣＳを含ませてもよい（図７）。
【００９１】
実施例２
防御免疫応答の誘導
本実施例は、ＦＡＶ８−ｒ５６およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ベクターが、Ｅ．ｍａｘｉｍａの発生を妨げて寄生虫病変を防ぐような防御免疫応答を誘導する能力をテストするものである。
【００９２】
【表２】
病変を生成するために必要な接合子嚢の数を評価するために予備試験が行なわれ、その試験では３０羽のＳＰＦニワトリを可搬性の清潔なケージ内でコクシジウム症のない条件下（清潔度、水および餌）で飼育する。ニワトリに毎週飲水を通じてアンプロリウムを投与することによって、攻撃前にコクシジウム感染を防ぐための処置をする。ｄａｙ２８にニワトリは経口で適切な数のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ接合子嚢の攻撃を受ける（表２を参照）。ｄａｙ３４に病変スコア付け（投与量レベル当り少なくとも５羽のニワトリ）を行なう。平均３〜４の最も一貫した病変スコアを有するグループを選択して、試験で用いられる高攻撃投与量に供する。予備試験に用いられたのと同じバッチの接合子嚢を２％重クロム酸カリウム中で４℃にて保存し、試験に用いる。
【００９３】
次いで、Ａｒｍｉｄａｌｅ近郊の孵化場から得られた４００羽のＳＰＦニワトリ（最初の３週間で最高１０％の死亡率を許容）、および胚内免疫化のための１８日インキュベーションの１８０個の受精卵に対して予備試験を行なう。
【００９４】
以下のワクチンおよび対照が用いられる：
対照：ワクチン接種なし（陰性対照）；ＦＡＶ８ベクターのみ（陰性対照）；ｒ５６タンパク質のワクチン接種；およびＴＦＰ２５０タンパク質のワクチン接種。テストされるワクチンは、以下のとおりのＦＡＶ８構築物に基づくワクチンである：ＦＡＶ８−ｒ５６ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ｒ５６ Ｎ末端膜アンカー；ＦＡＶ８−ｒ５６分泌形；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ Ｎ末端膜アンカー、およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０分泌形。
【００９５】
ＦＡＶ８構築物の力価は用量当り１×１０８となる。以下に記載されるとおり、ワクチンは経口、胚内、または皮下ワクチン接種によって投与される。
【００９６】
経口ワクチン投与に対しては、２１ゲージのブラントチップ（ｂｌｕｎｔ−ｔｉｐ）針に接続した１ｍｌシリンジを用いる。トリを垂直に保持し、そっと口を開かせて、後鼻孔の割れ目の前部にブラントチップ針を挿入する。ワクチンをゆっくりと投与して、ワクチンが嚥下される前に後鼻孔の割れ目および中咽頭を浸すようにさせる。この態様で、ワクチンが投与される際に上咽頭のほとんど、および口腔のほぼ全体がワクチンに接触する。
【００９７】
１８日インキュベーションにおける胚内ワクチン接種に対しては、１８０個の卵が尿膜腔液中に、日齢ヒヨコに用いられるのと同じ用量レベルでウイルスの注射を受ける（グループ５、６、１７、１８、２３および２４の卵、各々以下の表３を参照）。
【００９８】
組み換え抗原を用いた皮下および筋肉内ワクチン接種に対しては、バクテリアを発酵濃度の１０倍に濃縮して、下記の尿素緩衝液中での超音波処理によって溶解する：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、６Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、さらに０．８μＭフィルタで濾過する。各２５ｍｌのＣＥサンプルならびに尿素緩衝液およびＰＢＳから１００ｍｌのエマルション（２５％水相）を調製する。この試験にはフロイントの完全アジュバントが用いられ、エマルションは注射の直前に調製される。
【００９９】
各ニワトリは、最初にｄａｙ１に用量当り０．５ｍｌを皮下にワクチン接種され、次いでｄａｙ１４に用量当り０．５ｍｌを筋肉内に追加される。
【０１００】
下記の表はワクチン接種に対する実験設計をまとめたものである。
【０１０１】
【表３】
コクシジウム症の混入を避けるために、ｄａｙ７、１４および２１にニワトリの飲水中のアンプロリウムでニワトリを毎週処置する。さらに、隔離飼育器、設備などを徹底的に洗浄し、すべての作業者が入室の際に着替えることによってコクシジウムの感染を防ぐ。ｄａｙ２６に糞便サンプルを取ってＥｉｍｅｒｉａ接合子嚢の存在をテストする。ｄａｙ２８に、接合子嚢排出の測定に用いられるニワトリは、経口的に１００個のＥ．ｍａｘｉｍａ胞子形成接合子嚢の攻撃を受け、病変スコアに対するニワトリは、予備試験で決定された顕著な病態をもたらす数の胞子形成接合子嚢を受取る（２０〜５０，０００）。
【０１０２】
上記の試験は以下のスケジュールに従う。
【０１０３】
卵インキュベーションのｄａｙ１８に、グループ３、９および１２の第１の胚内ワクチン接種。
【０１０４】
卵インキュベーションのｄａｙ２１に、胚内ワクチン接種グループからのヒヨコが３つの別個の卵インキュベータ内で孵化。
【０１０５】
ｄａｙ１に、その他すべてのグループの第１のワクチン接種を行なう。
【０１０６】
ｄａｙ１４に、すべてのヒヨコ（グループ３、９および１２を含む）の第２のワクチン接種を行なう。
【０１０７】
ｄａｙ２８に、血清学的テストのためにニワトリから採血してから、病変スコア付けに対してはニワトリ当りに必要な正しい数の接合子嚢（予備試験の結果に基づく）によって、接合子嚢カウントに対してはニワトリ当り１００個の接合子嚢によって、Ｅ．ｍａｘｉｍａによる攻撃を受けさせる。
【０１０８】
ｄａｙ３４に、大投与量の接合子嚢を受けたグループに対する病変スコア付けを行なう。
【０１０９】
ｄａｙ３４〜ｄａｙ３７に、１００個の接合子嚢に感染されたヒヨコの各グループからの糞便を単一のプールに集め、ｄａｙ３７にすべてのサンプルに対して接合子嚢カウントを行なう。
【０１１０】
ｄａｙ４２（感染後１４日）に血清学的テストのためにトリから採血し、屠殺する。
【０１１１】
免疫応答の評価のためのインビトロテストを行ない、ここでは免疫化の４週間後（ｄａｙ２８）にＦＡＶ８被覆プレート（ＴｒｏｐＢｉｏ Ｌｔｄ．）上で血清学テストを行なって、ＦＡＶ８構築物の感染を確認する（すべての群に対して）。免疫化４週間後の血清および攻撃後１４日の血清に対しても、ＡＰＧＡ、ｒ５６およびＴＦＰ２５０被覆プレート上でＥＬＩＳＡアッセイが行なわれる（すべてのグループに対して）。さらに、正の対照血清として抗ｒ５６／ＡＰＧＡ／抗ＴＦＰ２５０／を、陰性対照として正常なニワトリ血清を用いた、調製用ガメトサイトおよび組み換えＴＦＰ２５０含有ブロットによるウエスタンブロットを用いて、タンパク質分析を行なう。
【０１１２】
上に示すとおりに行なわれた最初の試験において、最高の防御を有したワクチン接種グループは、平均病変スコアがそれぞれ１．３１および１．３６のｒ５６分泌グループおよびｒ５６ネイティブグループであることが見出され、ここでスコア１はブロイラーニワトリにおける良好な能力結果を得るために許容できると考えられる。対照グループにおける平均病変スコア２．３７と、ワクチン接種グループにおける１．３１との差は、病気のニワトリと防御されたニワトリとの間の格差によるものと明確にいえる。
【０１１３】
病変スコア付けおよび接合子嚢カウントの両方に基づいて、ｒ５６分泌構築物を含むＦＡＶ８ベクターは１日齢のヒヨコにおける防御の誘導に非常に良好に働くことが結論付けられた。胚内免疫化によってこの構築物によるワクチン接種を受けたグループは、こうした高レベルの防御を示さなかった。この理由は、孵化が早かったためにヒヨコがウイルスに晒される時間が十分でなかったためだと考えられる。それにもかかわらず、胚内ワクチン接種はなおも将来のワクチン接種に対する実行可能で経済的なアプローチである。１日齢のヒヨコの経口ワクチン接種は効果的であることが証明されたことから、こうしたトリにワクチンを噴霧または給餌することが、ブロイラーに長期の免疫を与える有用な方法となることが期待される。
【０１１４】
ｒ５６構築物によって良好な結果を提供したことに加え、病変スコア付けおよび接合子嚢カウントの両方によって、ＴＦＰ２５０分泌構築物も顕著な（２０〜３０％低いが）レベルの防御免疫を誘導することが見出された。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の優先権を主張する。上記米国仮特許出願の全容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、トリのワクチン接種のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
コクシジウム症は、世界的に非常に重要なニワトリの疾患である。それはブロイラー産業だけでも年間１０億ＵＳＤを超える推定損失をもたらす。コクシジウム症は、７種のアピコンプレクサの寄生原虫Ｅｉｍｅｒｉａの感染によってもたらされる。これら７種のうちでも、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａおよびＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａが最も問題であると考えられている。コクシジウム症の症状は、気力低下、貧血、水様下痢または血性下痢（感染する種による）、体重減少および飼料効率比の低下を含む。
【０００４】
Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫の生育および伝播は特にニワトリに蔓延している。なぜならこれらのトリは典型的に稠密な条件下で飼育されているために、衛生管理を維持することがきわめて困難だからである。これらの条件下で抗コクシジウム薬物を使用することは、抵抗性が発達するため、かつ窮屈な給餌環境においてこうした薬物を持続的に投与することが困難であるために効果がない。さらに、抗コクシジウム薬は抗菌効果も有しており、餌内に抗生物質を使用することは望ましくないとされている。
【０００５】
米国農務省（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ：ＵＳＤＡ）は、家禽の餌に加えられてニワトリ腸内におけるＥｉｍｅｒｉａ段階の細胞内発達を防ぐ抗コクシジウム薬物の使用に、米国および世界的なブロイラー産業が大きく頼っていることを認識している。肉製品に薬物が残留することを防ぐやり方として、ニワトリが市場に送られる約１週間前に薬物が餌から取除かれる。抗コクシジウム薬物はトリコクシジウム症を防ぐための主要な手段であり続けているが、ＵＳＤＡは、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫がこうした薬物に耐性となり得るため、代替的な制御方策の開発が必要だと述べている。
【０００６】
コクシジウム症と戦うための代替的な解決策の１つは、有効なワクチンを開発することであろう。低用量の病原性または弱毒化Ｅｉｍｅｒｉａ種接合子嚢の混合物の投与が検討されてきたが、それはまだ実際に有効な介入として証明されていない。ニワトリはＥｉｍｅｒｉａに対する免疫を発達させるため、コクシジウム症に対する「サブユニット」ワクチンを開発するためにかなりの努力が費やされている。こうしたワクチンは、遺伝子操作技術を用いて、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のタンパク質成分を生成するだろう。このアプローチの背後にある根拠は、バクテリアの無害な実験株を用いて、胚内（卵の中）または孵化時のニワトリを免疫化するために用いられ得る「組み換え」タンパク質を生成できるということである。もし成功すれば、ニワトリは寄生虫の表面に通常存在するタンパク質によって免疫化されるため、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染に耐性となる。しかしながら、ＵＳＤＡによると、今日までの努力は実を結ぶには至っておらず、トリコクシジウム症を予防するために利用可能な商業的サブユニットワクチンは未だに存在しない。
【０００７】
ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は当該産業において何らかの承認を得ているワクチンであり、これは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの発生のマクロガメトサイト（雌性）段階から単離された３つの主要なアフィニティ精製された全長ネイティブ抗原（５６ｋＤａ、８２ｋＤａおよび２３０ｋＤａ）を用いて、産卵する雌鳥の産卵期が始まる直前に雌鳥にワクチン接種することに基づいている。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、ｍａｘｉｍａおよびｔｅｎｅｌｌａに対する免疫を含む、ブロイラーに感染するコクシジウム種に対する交差免疫を誘発する。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は産卵時点前の若雌鳥を免疫化するために用いられる。免疫種畜は卵黄を通じて特定の抗体をブロイラーに移し、孵化後の生育初期にそれらを遮蔽し、一方では農場で自然にコクシジウムに晒される。この露出によって母性保護の際に免疫がもたらされ、それがブロイラーのライフサイクルの初期段階でブロイラーに移される。保護的な移行抗体が卵黄を介して子供のヒヨコに移され、ヒヨコは高力価の移行抗体を有して孵化する。これらの移行抗体は、ヒヨコの生育期間の最初の２〜３週間にわたり、接合子嚢脱落を低減させるように作用する。これは次に、ピーク同腹仔接合子嚢カウント（ｐｅａｋ ｌｉｔｔｅｒ ｏｏｃｙｓｔ ｃｏｕｎｔｓ）を６０〜８０％低下させ、これは通常は３〜５週齢で起こる。
【０００８】
しかしながら、このワクチンは母子免疫をブロイラーに移すことができるものであり、餌に抗コクシジウム薬を入れることなくブロイラーを飼育できるという事実にもかかわらず、その免疫は、ブロイラーのライフサイクルの初期段階で母鳥からブロイラーに移されるという点において間接的な免疫である。ブロイラーがその免疫を保持することを確かめるための仕組みはなく、孵化後のブロイラーまたはヒヨコに直接投与できるワクチンは現在入手不可能である。このことから、母鳥から免疫を適切に受取らなかったブロイラー、または免疫を失って追加免疫を必要とするより高齢のブロイラーの間でコクシジウム症が広がる可能性が残っている。実際に、ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）の製造者は、ＣｏｘＡｂｉｃは種畜にワクチン接種するために用いられるものであって、その種畜のブロイラーヒヨコのみを保護することを示している。ＥＬＩＳＡ法によって定めるとき、母子免疫は約１４日間またはもう少し長く持続する。それらのトリがライフサイクルのもっと後の年齢でさまざまな種のＥｉｍｅｒｉａに晒されれば、もはや母子免疫は存在しないため、より高齢のトリは保護されないままとなる。
【０００９】
ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）ワクチンには、それが種畜ニワトリへの注射によって投与されるというさらなる欠点もある。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）のためのワクチン接種スケジュールにおいては、若雌鳥は飼育の間に２回のワクチン注射を受ける必要があり、その２回の注射の間を少なくとも４週間あける必要がある。第１の注射は１２週齢から１５週齢で行なわれてもよい；第２の注射は１８週齢から２１週齢で行なわれてもよい。よってこのワクチンの投与モードは、大集団のブロイラーニワトリへの直接投与に容易に適応できない。
【００１０】
上述のとおり、ブロイラーニワトリの処置のためのワクチンを得ることには主要な商業的誘因がある。ニワトリに注射する必要のあるワクチンは、大集団のニワトリへの投与に対して実用的ではない。したがって、コクシジウム症の有害な影響に対する保護をもたらすためにブロイラーニワトリに容易に投与され得るワクチンが要求されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特定の局面において、本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンを提供することによって、コクシジウム症ワクチンに対する要求に対処するものであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１２】
特定の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードする。他の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原をコードする。さらに付加的な実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする。特定の他の例示的な実施形態において、マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原と組み合わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードするＯＲＦを含む。
【００１３】
コクシジウム症ワクチンは、あらゆるトリウイルスから調製されてもよい。好ましくは、コクシジウム症ワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１２のゲノムからなる群より選択されるトリアデノウイルスゲノムを用いる。特定の実施形態において、トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである。
【００１４】
組み換え組み換えトリアデノウイルスベクターはさらに、目的のＯＲＦの挿入のためのクローニング部位のすぐ上流に切断配列を含んでもよく、前記ベクターからの発現産物は可溶性産物を生成する。
【００１５】
例示的な実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。残基７０〜１０３５によってコードされるヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。配列番号１４には全長のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ Ｒ５６をコードする配列も示されており、この配列は配列番号１の配列内に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基１０３〜１０６に示されている。さらに他の実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６フラグメント、または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする。特定の代替的な実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる。残基６４４８〜７０８３によってコードされるヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。配列番号１６には全長のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ ＴＦＰ２５０をコードする配列も示されており、この配列は配列番号３の配列内に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基２３１〜２３３に示されている。
【００１６】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの組成物および使用方法も意図されており、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１７】
別の実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの調製および使用を教示し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列に作動可能に連結されたプロモーターと、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１８】
さらなる実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの組成物および使用方法に関し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。
【００１９】
本発明は、上記コクシジウム症ワクチン組成物の組み合わせを含む多価コクシジウム症ワクチン調製物も意図している。
【００２０】
加えて、多価コクシジウム症ワクチン調製物は、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（Ｃｈｉｃｋｅｎ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＤＶ）、トリインフルエンザ（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＡＩ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、およびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明の例示的な方法は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感染に対して被験体を免疫化することに関し、この方法は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態において、投与するステップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むＦＡＶベクターによって前記被験体を免疫化したときにみられる免疫よりも増強されたレベルの免疫を誘発する。
【００２２】
好ましくは、この方法はニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種の処置のために使用される。好ましくは、その鳥種はニワトリである。特定の実施形態において、ニワトリは成体のブロイラーニワトリである。
【００２３】
投与は、たとえば前記被験体への前記ワクチンの噴霧、食物中の前記ワクチンの前記被験体への給餌、および前記被験体の飲用供給物中への前記ワクチンの提供などを含むあらゆる従来の投与経路によるものであってもよい。
【００２４】
本発明の別の方法は、ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法を含み、この方法は、被験体に本発明のいずれかのワクチンを投与するステップと、前記ニワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与するステップとを含む。
【００２５】
この併用療法は、種畜雌鳥にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与して孵化の際にヒヨコに免疫を与え、本発明の前記ワクチンを孵化後のｄａｙ１およびそれより後にヒヨコに投与し、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与するというものである。
【００２６】
本発明の他の局面は、トリアデノウイルスゲノムを含むトリアデノウイルスベクターを記載し、これは異種プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配列はマルチプルクローニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目的のＯＲＦを挿入することによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とインフレームで前記目的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる。
【００２７】
特定の実施形態において、疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発現された宿主細胞から分泌されることを可能にするための切断部位を含む。他の実施形態においては、シグナル配列が切断部位を含有しないことによって、宿主細胞の細胞表面に係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる。
【００２８】
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦの挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも意図される。いくつかの実施形態において、ベクターは、目的のＯＲＦの挿入のためのクローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含んでいてもよく、前記ベクターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する。
【００２９】
疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも開示される。
【００３０】
別の実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３１】
さらなる実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３２】
さらなる実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。
【００３３】
さらに付加的な実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを記載する。
【００３４】
膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターも意図される。
【００３５】
上記に概説したワクチンにおいて、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４のヌクレオチド７０〜１０３５の核酸配列、または配列番号１４のヌクレオチド７０〜１０３５のフラグメントからなる。たとえば、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントからなる切断型ｒ５６フラグメントをコードする。
【００３６】
他の実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号３に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる。
【００３７】
分泌を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる分泌シグナル配列を含んでもよい。特定の実施形態において、分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグナル配列からなる群より選択される。
【００３８】
アンカー産物を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる膜アンカーシグナル配列を含んでもよい。特定の実施形態において、膜アンカーシグナル配列は、トリインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列からなる群より選択される。
【００３９】
記載されるいずれの発現ベクターも、本明細書に記載される方法における使用のためにワクチンに容易に配合され得る。
【００４０】
例示的な方法は、トリ集団における免疫応答を誘発する方法を含み、この方法は前記集団にこうしたワクチンを投与するステップを含む。
【００４１】
コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する好ましい方法は、本発明の組み換えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンの投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い免疫応答を誘発する。
【００４２】
本明細書に記載される組み換えトリアデノウイルスベクターを含む単離細胞も意図される。
【００４３】
組み換えトリアデノウイルスベクターのいずれかを適切な賦形剤と有利に組み合わせて、動物、特にトリの処置のための薬学的処方物を生成してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明のＦＡＶに基づくベクターの概略を示す図である。
【図２】図２は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのｒ５６タンパク質を含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３】図３は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのＴＦＰ２５０タンパク質を含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図４Ａ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（１９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５〜１２４である。
【図４Ｂ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（１９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５〜１２４である。
【図５】図５は、発現カセットの化学合成のためのスキームを示す図である。
【図６】図６は、構築物を調製するためのＰＣＲ増幅のためのスキームを示す図である。
【図７】図７は、配列の挿入のためのマルチプルクローニング部位の使用のためのスキームを示す図である。
【図８】図８は、以前に添付物にて「ｐ１２３２＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマインターフェロンの分泌シグナルを有するＣＭＶＰ−ＴＦＰ２５０−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号１７として本明細書に示される。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号１８によってコードされており、これは配列番号１７のヌクレオチド５６２９．．５７１２に位置し、配列番号１９のタンパク質に翻訳される。切断型ＴＦＰ２５０挿入物は配列番号２０の配列によってコードされており、これは配列番号１７のヌクレオチド５７１３から６３４８に位置し、配列番号２１の配列に翻訳される。このプラスミドは、位置４９６５．．．５６２３にＣＭＶプロモーター配列を有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図９】図９は、以前に添付物にて「ｐ１２２３＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマインターフェロンの分泌シグナルを有するＭＬＰ−Ｒ５６−ｐＡ−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号２２として本明細書に示される。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号２３によってコードされており、これは配列番号２２のヌクレオチド５３８１．．５４６１に位置し、配列番号６のタンパク質に翻訳される。切断型Ｒ５６挿入物は配列番号２４の配列によってコードされており、これは配列番号２２のヌクレオチド５４６２から６４３０に位置し、配列番号２５の配列に翻訳される。このプラスミドは、ヌクレオチド５３８１...５４６１にＭＬＰ配列を有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図である。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖）および配列番号２８（タンパク質配列）である。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｍａｘｉｍａのＲ５６配列（配列番号２）およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａのＲ５６配列（配列番号２９）の比較を示す図である。シグナル配列を欠いた切断型Ｒ５６の配列（配列番号３０）も示される。この図面の下側部分は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの切断型Ｒ５６（配列番号３１）とＥ．ｍａｘｉｍａの切断型Ｒ５６（配列番号３２）との配列比較を示す。この配列情報図は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｍａｘｉｍａ（配列番号３３）およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（配列番号３４）の短縮バージョンのＲ５６を示す図である。この配列情報図は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、ブロイラーニワトリの集団に、コクシジウム症に対するこうしたトリの防御免疫のために投与できる組み換えウイルスワクチン組成物の調製方法および使用に関する。このワクチンは孵化後のトリに投与でき、注射による投与は必要なく、代わりに経口、食物供給、飲用供給物を通じて、またはエアロゾルスプレーとして投与されてもよい。本発明のワクチン構築物の利点は、免疫原を内部発現させるのではなく、免疫原の発現が感染細胞の細胞外部位に送達されるように指示することである。本明細書に記載されるワクチンの場合、こうして免疫原が粘膜細胞（例、鼻腔、気道、胃腸管、腸粘膜などにおける粘膜細胞）の外表面に送達されることによって、細胞内での送達免疫原の発現では免疫原が適切な免疫応答機構に効率的に接触しないおそれがあるのに対し、免疫応答が迅速に開始され得る部位に免疫原を提示する。
【００４６】
既存のワクチンは、いくつかの理由から有効なコクシジウム症ワクチンに対する当該技術分野の長年にわたる要求を満たしていない。第１に、コクシジウム症を処置するために現在利用可能なワクチンであるＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、母鳥にしか免疫を与えず、その免疫が卵黄を通じてブロイラー集団に移ることに頼っている。母子免疫は、卵の孵化後最初の約１４日間という比較的短期間しか持続しない。よって、これはブロイラーニワトリにおいて特定的に長期の応答を誘発するために有効なワクチンではない。さらに、このワクチンは注射を介して投与される。このことからも、このワクチンは高齢のトリの大集団を処置するために有効でないものとなる。
【００４７】
コクシジウム症に対する既存の処置の問題点に対処するため、本発明者らはブロイラーに防御免疫を与えるための新たなワクチンを開発した。このワクチンは、サブユニットワクチンにおけるＥｉｍｅｒｉａ抗原の発現をもたらすトリアデノウイルス発現系に基づくものである。この抗原は疎水性シグナル配列とインフレームで発現され、ワクチンが投与されたニワトリにおけるウイルス感染細胞の細胞表面に提示されるか、または代替的に、発現ベクター中の疎水性シグナル配列が切断シグナルをも含む場合には、こうした感染ニワトリにおける細胞外ドメインに分泌される。これらの特徴、ならびに組み換えトリアデノウイルスコクシジウム症ワクチンを用いるための方法および組成を、本明細書の下記においてさらに詳しく説明する。
【００４８】
一般的に、本発明のワクチンは、トリアデノウイルスゲノムでできた、図１に示されるとおりに構築された発現ベクターで構成される。トリまたは家禽アデノウイルス（ｆｏｗｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＦＡＶ）は当業者に周知であり、広範囲にわたって特徴付けられている。たとえば、家禽アデノウイルスタイプ１株ＣＥＬＯ（ヒヨコ胚致死孤児（ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｌｅｔｈａｌ ｏｒｐｈａｎ）に対するもの）と呼ばれるトリアデノウイルスが記載されている（Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９３９−４９（１９９６）；Ｌｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５（Ｐｔ １０）：１８１７−２５（１９８４）；Ｍａｙ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：４８３−９（１９７５）；Ｌｅｈｒｍａｎｎ，Ｈ．，Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６５１７−２５（１９９９）；Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３１６８−７７（１９９７））。遺伝子療法、ならびにヒトおよび動物、特にトリにおける感染性疾患に対するワクチンでの使用のために、ベクターを形成するためのＣＥＬＯの使用および操作方法は、たとえば米国特許第６，３３５，０１６号などにも広範囲に記載されている。ＣＥＬＯ（ＦＡＶ１またはＦＡＶ Ａ）の完全なゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ４６９３３；ＮＣ＿００１７２０およびＡＣ＿００００１４に見出されるであろう。
【００４９】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において用いられる家禽アデノウイルスベクターは、たとえば米国特許出願第０８／４４８，６１７号および第０９／２７２，０３２号に記載されるものなどの家禽アデノウイルスベクター（ＦＡＶ）であり、本明細書においてその内容は引用により援用される。特に好ましい実施形態において、このベクターはＦＡＶ血清型８（以後「ＦＡＶ８」）の右側端部を含む。ＦＡＶ８の全ヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号５として示される。ＦＡＶ８発現ベクターの全ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５５９１１にも含まれている。ＦＡＶ８の単離および生成のための方法は、米国特許第６，２９６，８５２号（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する）に記載されている。
【００５０】
ＦＡＶ９（ＦＡＶ Ｄとも呼ばれる）はＣａｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐｔ １０），２５０７−２５１６（１９９８）に記載されており、その完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８３９７５およびＮＣ＿０００８９９に示されている。
【００５１】
ＦＡＶの配列の教示が当業者に公知であるため、本発明のワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１、ＦＡＶ１２またはあらゆる後に単離される血清型の家禽アデノウイルスを用いて容易に調製され得る（ウイルスの分類についてはＭｏｎｒｅａｌ，Ｇ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｖ．４，ｐ．１−２７（１９９２）を参照）。米国特許第６，２９６，８５２号に記載されるとおり、ＦＡＶ ＣＦＡ２０（ＦＡＶ血清型１０である）、ＣＦＡ１５（血清型１０）ならびにＣＦＡ４０およびＣＦＡ４４（両方とも血清型８）ならびにＦＡＶ ＣＦＡ１５およびＣＦＡ１９（血清型９）は、ワクチン生成のために特に有用であり得る。
【００５２】
本明細書で調製されるワクチンにおいて使用されるプロモーターは、ＦＡＶ構築物中の目的の異種コード領域の発現を駆動できるあらゆるプロモーターであってもよい。こうしたプロモーターは、トリアデノウイルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＭＬＰ）、ＣＭＶｐ、ＰＧＫ−、Ｅ１−、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶＧ２）、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ−４０最初期プロモーター、Ｔ４後期プロモーター、およびＨＳＶ−Ｉ ＴＫ（ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝子プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ））ＬＴＲ（長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ））およびＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝子プロモーターを含むがそれに限定されない。ＦＡＶ ＭＬＰのＤＮＡ配列は、米国特許第６，２９６，８５２号の図５に示されている。多くの他の哺乳動物またはトリのプロモーターが当業者に公知であり、それらが用いられてもよい。
【００５３】
本明細書に記載されるワクチンに使用されるプロモーターは、目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域の核酸配列とインフレームでつながれた疎水性シグナル配列のインフレーム融合物の発現を駆動する。疎水性シグナル配列は、家禽アデノウイルス発現ベクターに感染した宿主細胞の外膜を標的として、または特定的にそこに向けて目的のペン（ｐｅｎ）リーディングフレームまたはコード領域の発現を行なわせるために用いられ得るあらゆる配列であってもよい。本発明において、このＦＡＶに基づく発現ベクターはニワトリに感染させることが意図される。ＦＡＶは典型的に、たとえばニワトリの腸管、気道または胃腸管などに見出され得る、ニワトリの粘膜細胞、肝細胞および上皮細胞に感染する。よって疎水性シグナル配列は、目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域の発現をこれらの粘膜細胞の細胞表面に輸送するものである。こうして目的のオープンリーディングフレームまたはコード領域を動物の粘膜細胞の細胞表面に提示することによって、免疫応答の開始をそれほど効果的に促進できないおそれのある動物細胞内での発現とは対照的に、本発明のワクチンは、免疫応答を効果的に開始できる内部部位に抗原を最も効果的に送達できる。今説明しているワクチンの使用によるこの発現産物の細胞外分泌によって、野生型免疫原によってワクチンを調製したときにみられるものよりも大きい抗体免疫応答および抗体生成がもたらされる。
【００５４】
真核細胞において、分泌タンパク質は、疎水性シグナル配列によって小胞体膜を標的とする。本発明はこの性質を用いて、異種疎水性シグナル配列を利用してワクチンにおける所与のタンパク質の発現を細胞表面に向ける。
【００５５】
本明細書で用いられるウイルスベクターは、ＯＲＦの発現産物が発現の際に切断型ＯＲＦタンパク質の（感染細胞からの）分泌を可能にするように改変されたＯＲＦをコードするか、または感染細胞の表面にタンパク質を直接発現させるような核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含む、組み換えベクターである。たとえば、目的のＯＲＦは、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、またはインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質からのシグナル配列とインフレームで発現される。用いられ得る他のシグナル配列は、たとえば乳清リンタンパク質シグナル配列；α−１酸糖タンパク質；α−サイロトロピン；メクラウナギからのインスリン；アンコウからのインスリン；ヒトインスリン；ラットインスリンＩまたはＩＩ；ヒツジβ−カゼイン；ヒツジχ−カゼイン；ヒツジα−ラクトアルブミン；ヒツジβ−ラクトグロブリン；ヒツジα−ｓｌカゼイン、およびヒツジα−ｓ２カゼイン；ＶＳウイルス糖タンパク質；雄鳥ＶＬＤＬ−１１；ミツバチメリチン；ラットラクチン；ヒト胎盤ラクトゲン；ヒトβ−絨毛性ゴナドトロピン；ヒトα−絨毛性ゴナドトロピン；ウサギウテログロビン；ラット成長ホルモン；ヒト成長ホルモン、ヒト；ウシ成長ホルモン；ウシ副甲状腺ホルモン；ラットレラキシン；ラット血清アルブミン；ヒト血清アルブミン；ラット肝臓アルブミン；ニワトリトロポエラスチンＢ；ニワトリオボムコイド；ニワトリリゾチーム；ニワトリコンアルブミン；ヒトα−１アンチトリプシン；ラット前立腺結合タンパク質；ラット前立腺結合タンパク質ｃ２；ＡＤウイルス糖タンパク質；ラットアポリポタンパク質Ａｌ；狂犬病ウイルス糖タンパク質；ヒトインフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ赤血球凝集素；ヒトインフルエンザＪａｐ赤血球凝集素；トリインフルエンザＦＰＶ赤血球凝集素；ヒト白血球インターフェロン；ヒト免疫インターフェロン；ヒト線維芽細胞インターフェロン；マウスχ−免疫グロブリン；マウスλ−免疫グロブリン；マウスχ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；マウス胚ＶＨ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；イヌトリプシノゲン１；イヌトリプシノゲン２＋３；イヌキモトリプシノゲン２；イヌカルボキシペプチダーゼＡｌ；イヌアミラーゼ；マウスアミラーゼ；ラットアミラーゼ；ウサギα−ラクトアルブミン；ブタα−ラクトアルブミン；ラットカルボキシペプチダーゼＡ；ウシＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ヒトＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタガストリン；マウスレニン；トリパノソーマ糖タンパク質；ナマズソマトスタチン；アンコウソマトスタチン；ラットカルシトニン；およびアンコウグルカゴンのシグナル配列などを含む。これらのシグナル配列の各々は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３ １７−２１（１９８３）の図１に示されており、本明細書における使用のために容易に適応され得る。前述の参考文献の図１からのシグナル配列を本明細書の図４に転載している。
【００５６】
所与のタンパク質に対するこれらおよびその他のシグナルペプチド部位は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定できる。たとえば、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０サーバ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．＆Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．（２００４）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３−７９５）を用いてシグナルペプチド部位を予測できる。加えて、シグナル配列の決定を容易にするために利用可能なウェブサイトもあり、たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／などを参照されたい。発現された産物を細胞表面に輸送できる疎水性配列である限り、使用されるシグナル配列の正確な同一性は重要ではない。
【００５７】
好ましい実施形態において、シグナル配列は、そのシグナル配列を切断して付加タンパク質をこうした細胞の細胞外スペースに分泌させることを可能にするための切断部位を含む。特に好ましい実施形態においては、ニワトリガンマＩＦＮからのシグナル配列を用いて本発明のこの局面が示され、これは配列ＭＴＣＱＴＹＮＬＦＶＬＳＶＩＭＩＹＹＧＨＴＡＳＳＬＮＬ（配列番号６）を含み、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＴＡ ＡＡＴ ＣＴＴ（配列番号７）によってコードされ、ブタガンマＩＦＮに対する疎水性シグナル配列はＭＳＹＴＴＹＦＬＡＦＱＬＣＶＴＬＣＦＳＧＳＹＣ（配列番号８）であり、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＴＡＣ ＴＧＣ（配列番号９）によってコードされ、ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２に対する疎水性シグナル配列はＭＫＶＫＬＬＩＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩ（配列番号１０）であり、これは配列ａｔｇ ａａａ ｇｔａ ａａａ ｃｔａ ｃｔｇ ａｔｃ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｔ ａｃａ ｔｔｔ ａｃａ ｇｃｔ ａｃａ ｔａｔ ｇｃａ ｇａｃ ａｃａ ａｔａ（配列番号１１）によってコードされる。これらの例示的な配列の各々も切断部位を含み、そこにシグナルペプチダーゼが作用して発現ＯＲＦの放出をもたらす。
【００５８】
プロモーターと、切断部位を含んでも含まなくてもよい疎水性シグナル配列とに加えて、発現ベクターはポリアデニル化配列をさらに含む。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ分子を細胞質におけるエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出、および翻訳を助ける。ほぼすべての真核生物ｍＲＮＡはポリアデニル化されている。当業者は、タンパク質の組み換え発現のためにポリＡテール配列をルーチン的に付加する。
【００５９】
本発明のベクターに挿入されるＯＲＦまたはその他の外来配列は、本明細書に記載されるＦＡＶベクターを使用して発現されることが望まれるあらゆるＯＲＦまたはその他の外来配列であってもよい。これらその他の外来配列は、１つもしくはそれ以上のＯＲＦ、または目的の発現産物、または遺伝子ではないが治療上の目的での他の機能を有するその他のヌクレオチド配列からなっていてもよい。
【００６０】
しかしながら特定の実施形態において、本発明は、コクシジウム症に対してニワトリにワクチン接種するためのサブユニットワクチンとして使用されるベクターを記載する。この状況において、目的のＯＲＦはアピコンプレクサの原虫寄生体Ｅｉｍｅｒｉａの抗原をコードするものである。より特定的には、ＯＲＦは、米国特許第７，４２３，１３７号（本明細書において引用により援用される）に記載されるとおりの５６ｋＤａ、８２ｋＤａおよび２３０ｋＤａの抗原からなる群より選択される。より特定的には、本発明者らは、５６ｋＤａ（本明細書では代替的にｒ５６と呼ばれる）または２３０ｋＤａ（本明細書では代替的にＴＰＦ２５０と呼ばれる）抗原の全長配列をＦＡＶに組み込んでも有効なワクチンが生成されないことを見出した。しかし、切断型ｒ５６配列を用いると、ワクチンは効果的に免疫応答を誘発する。ｒ５６の全長アミノ酸配列を配列番号２に示しており、このタンパク質配列は配列番号１の配列によってコードされ、ｒ５６をコードする全長遺伝子も配列番号１４に示されている。加えて、５６ｋＤａ抗原をコードするプラスミドは、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２４００の下で公的に入手可能である。５６ｋＤａ抗原によって形質転換されたバクテリア細胞も、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２４０１の下で入手可能である。したがって特定の実施形態において、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断型ｒ５６が用いられる。ｒ５６の配列は配列番号２のアミノ酸２４〜３４５を含むものであり、これは配列番号１４の配列７０〜１０３５によってコードされてもよい。本発明の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は、切断型ｒ５６を感染細胞の細胞表面に係留する疎水性シグナル配列とインフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフレームであることによって、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ｒ５６は細胞の細胞外スペースに放出される。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリインフルエンザＨＡ抗原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症ワクチンが提供される。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シグナル配列が、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチンが提供される。特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型ｒ５６の細胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたｒ５６を細胞外スペースに放出するワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。
【００６１】
さらに他の例示的な実施形態においては、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断型ＴＦＰ２５０が用いられる。ＴＦＰ２５０の全長配列は配列番号４に示されており、これは配列番号３または配列番号１６によってコードされる。２５０ｋＤａ抗原をコードするプラスミドは、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２３９６の下で公的に入手可能である。この抗原によって形質転換されたバクテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９７の下で入手可能である。本明細書における好ましいワクチンに用いられるＴＦＰ２５０の配列は、配列番号４のアミノ酸２１４９〜２３６１またはアミノ酸２１５０〜２３６１を含むものであり、それはそれぞれ配列番号１６の配列６４４４〜７０８３および２１４９〜２３６１によってコードされてもよい。本発明の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２５０の切断型配列は、切断型ＴＦＰ２５０を感染細胞の細胞表面に係留する疎水性シグナル配列とインフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２５０の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフレームであることによって、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ＴＦＰ２５０は細胞の細胞外スペースに放出される。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリインフルエンザＨＡ抗原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症ワクチンが提供される。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シグナル配列が、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチンが提供される。特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型ＴＦＰ２５０の細胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたＴＦＰ２５０を細胞外スペースに放出するワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。
【００６２】
類似の態様で、Ｅｉｍｅｒｉａの８２ｋＤａ抗原を発現するワクチンと組み合わせてワクチンを調製してもよいことが意図される。８２ｋＤａ（本明細書においてはｇａｍ８２とも呼ばれる）抗原は、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２３９８の下で公的に入手可能であり、８２ｋＤａ抗原によって形質転換されたバクテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９９で入手可能である（本明細書の添付物に示されている）。本発明のワクチンのいずれかが、既存のワクチン投与プロトコルと組み合わせて使用されてもよい。たとえば、種畜、ヒヨコおよび高齢のニワトリにおいて防御免疫を生成するために、本明細書に記載されるワクチンをＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）と組み合わせて使用してもよい。
【００６３】
本明細書に記載される実施例の多くがＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの抗原から調製されたワクチンに関するが、当業者は他のＥｉｍｅｒｉａ種からの相同配列を用いてこうしたワクチンを調製してもよいことが容易に明らかになるだろう。当業者は、従来の分子生物学技術を用いてＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａからのオープンリーディングフレームの上記配列に対する相同性を介して、こうした適切なＤＮＡ配列を容易に同定できる。よって、他のＥｉｍｅｒｉａ種、たとえばＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉなどに由来する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのｒ５６、ＴＦＰ２５および８２ｋＤａのＯＲＦの相同体は、本明細書に記載されるコクシジウム症ワクチンの調製物に対して特定的に意図される。これに関して、配列番号１２はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａのｒ５６の配列を提供する。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのｒ５６配列が有効であることが示されれば、当業者は本明細書に記載される方法および組成物に用いるために他のＥｉｍｅｒｉａ種からのｒ５６の相同体を容易に同定できるだろう。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓもしくはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉ、または免疫学的に交差反応性の抗原を発現する微生物による感染に対して被験体を免疫化する方法を提供するために用いられ、この方法は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特に好ましい実施形態において、被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種を含むがそれに限定されない鳥種である。特に好ましい実施形態において、その鳥種はニワトリであり、より特定的にはブロイラーニワトリである。
【００６５】
このワクチンは、ワクチン接種に典型的に用いられるあらゆる経路によって投与されてもよく、その経路は、全身的（たとえば、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻腔内、非経口的、腸管内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または頭蓋内など）、経口投与、エアロゾル化、または肺内注入によるものを含むがそれに限定されない。投与は単一用量で行なわれてもよいし、特定の時間間隔後に１回またはそれ以上繰り返される用量で行なわれてもよい。適切な投与経路および投与量は状況（たとえば、処置される個体、処置される障害、または目的のポリペプチドのＯＲＦもしくはフラグメントなど）によって変わるが、当業者によって定められ得る。
【００６６】
このワクチンは従来の投与計画に従って投与されてもよく、たとえば投与量処方に適合する態様の単一または繰り返し投与として、予防的に有効な量、すなわちトリ（特に家禽）において病原性のＥｉｍｅｒｉａ寄生虫による攻撃に対する免疫を誘導する前記抗原を発現できる組み換え微生物または免疫化抗原の量にて投与されてもよい。免疫とは、ワクチン接種後のトリの集団において、ワクチン接種していないグループに比べて有意なレベルの防御が誘導されることとして定義される。特定の実施形態において、与えられる免疫は増強された免疫であり、ここで本発明のワクチンは、ワクチン接種後のトリの集団において、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むサブユニットＦＡＶベクターによってトリがワクチン接種されるときにみられる防御よりも有効なレベルの防御を誘導する。この、より効果的なワクチン接種が観察されるのは、このサブユニットワクチンが全長配列から調製されたサブユニットワクチンよりも高い安定性を有するためである。
【００６７】
本発明のワクチンは、感染動物が脱落させる接合子嚢の数を減らすかもしれない。通常、脱落した接合子嚢は群の他の動物に感染する。よって脱落した接合子嚢の数が減少することによって、その後感染される動物の数も減少し、さらに脱落した接合子嚢の数が減少することによって、感染性負荷の減少がもたらされる。特定の実施形態において、本発明のワクチンは、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染によって攻撃されたときに、トリにおける盲腸の病変の数を低減させる。
【００６８】
典型的に、生ウイルスベクターワクチンのニワトリ当りの用量率は１０２から１０１０ｐｆｕの範囲であってもよい（ただし、たとえばＨＶＴに対しては＜１０００ｐｆｕでも十分であり得る）。
【００６９】
本発明のワクチンは、同じおよび／もしくは他のＥｉｍｅｒｉａ種の他の抗原性成分、ならびに／または家禽病原性ウイルスもしくは微生物に由来する付加的な免疫原および／もしくはこれらの免疫原をコードする核酸配列と効果的に混合されてもよい。こうした混合ワクチンは、トリの群における寄生虫負荷を減少でき、コクシジウム症に対する防御のレベルを増加でき、加えて他の家禽病原体に対する防御ができる。こうした他の免疫原は、たとえばマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血剤（ＣＭ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、またはＥ．ｃｏｌｉからなる家禽病原性ウイルスまたは微生物の群から選択されてもよい。よって本発明は多価ワクチンを意図している。特に好ましい多価ワクチンは、上述のｒ５６発現ベクターを、上述のＴＦＰ２５０を発現する家禽アデノウイルスベクターと組み合わせるか、および／または上述の８２ｋＤａ抗原を発現する家禽アデノウイルスベクターと組み合わせたもので構成される、本発明のコクシジウム症ワクチンである。
【００７０】
ＦＡＶに基づくサブユニットワクチン中で発現されるＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型抗原から調製される本発明のワクチンの特定の利点は、それらをエアロゾルスプレーもしくは点眼剤によって投与してもよいし、ブロイラートリの飲水、胚内もしくはトリの餌に入れて投与するか、またはトリによって摂取されるゲルマトリックスとして配合してもよいことから、これらのワクチンが典型的な過密条件下であってもブロイラートリの大規模ワクチン接種に適用可能なことである。よって好ましくは、ワクチンはその投与を達成するためにワクチンの噴霧を容易にする賦形剤とともに調製されてもよい。
【００７１】
本発明のこれらのワクチンは、新たに孵化したヒヨコに噴霧または給餌されてもよいし、より高齢のトリに同様に噴霧および給餌されてもよい。
【００７２】
本発明のワクチンは、ｒ５６の全長配列またはＴＦＰ２５０の全長配列によって作製された同様のワクチンよりも明白な免疫応答を生じてより良い免疫を与える態様で、Ｅｉｍｅｒｉａ感染の病原性の影響から家禽を保護することができる。
【００７３】
本発明に従うワクチンは、たとえば上述した家禽アデノウイルスベクターを医薬的に許容できる担体と単に混合することによって作られてもよい。医薬的に許容できる担体とは、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を与えない、少なくともその動物がワクチン接種されないときの疾病によってみられる影響よりも過度の悪影響を与えない化合物と理解される。医薬的に許容できる担体は、たとえば滅菌水または滅菌生理食塩水などであってもよい。より複雑な形では、担体はたとえば緩衝液などであってもよい。
【００７４】
代替的には、本発明のコクシジウム症ワクチンはアジュバントをも含有してもよい。一般的にアジュバントは、非特異的態様で宿主の免疫応答を高める物質を含む。当該技術分野において、いくつかの異なるアジュバントが公知である。アジュバントの例は、フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ポリマーならびにポリアミン、たとえばデキストラン硫酸、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびピランなどである。同じく非常に適切なのは、表面活性物質、たとえばＳｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、ヘキサデシルアミン、リゾレシチン、メトキシヘキサデシルグリセロールなど、およびＱｕｉｌｌ Ａ（登録商標）などのサポニンである。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチドがしばしば用いられる。これらのアジュバントの次に、免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ＩＳＣＯＭＳ）、ミネラルオイル、たとえばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）など、植物油またはそのエマルション、およびＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅが有利に用いられてもよい。このワクチンは「媒体」をも含んでもよい。媒体とは、ポリペプチドがそれに共有結合することなく付着するような化合物のことである。よく用いられる媒体化合物は、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸化物、硫酸化物または酸化物、シリカ、カオリンおよびベントナイトなどである。媒体中に抗原が部分的に埋込まれるような、こうした媒体の特殊な形がいわゆるＩＳＣＯＭである（欧州特許第１０９．９４２号、欧州特許第１８０．５６４号、欧州特許第２４２．３８０号）。
【００７５】
ワクチン組成物は、たとえば分解されやすいポリペプチドの分解を防ぐため、ワクチンの有効期間を増すため、または凍結乾燥効率を改善するための安定剤をさらに含んでもよい。有用な安定剤は、スキムミルク、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、たとえばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミンまたはカゼインまたはその分解産物など、および緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などを含む。
【００７６】
凍結乾燥材料は、何年間も保存して生存可能に保つことができる。凍結乾燥材料に対する保存温度は、材料に有害になることなく零度より高くてもよい。特定の局面において、ワクチンは凍結乾燥される。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明に従うワクチンの生成を示すものである。これらの実施例においては、家禽アデノウイルス血清型８（ｆｏｗｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８：ＦＡＶ８）が用いられた。この送達系を用いることの主要な利点は、適切な標的組織（この場合には腸粘膜）へのサブユニットワクチン送達のためのベクターとして弱毒化ＦＡＶ８を利用できることにある。
【００７８】
実施例１
構築物の調製および分析
本実施例においては、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のマクロガメトサイト段階からの最も免疫原性の高いタンパク質の１つである組み換えタンパク質ｒ５６をＦＡＶ８ベクターにクローニングした。加えて、Ｅｉｍｅｒｉａ雄核発生段階からの別の免疫原性タンパク質である組み換えタンパク質ＴＦＰ２５０を別のＦＡＶ８ベクターに別個にクローニングした。このＴＦＰ２５０のＯＲＦは、前の研究でやはりＥｉｍｅｒｉａによる攻撃感染に対する部分的防御免疫を誘導することが示されたミクロネームタンパク質（寄生虫侵入に関与する小器官）の部分をコードしている。
【００７９】
形成された発現構築物を以下の２つの表に示す。
【００８０】
【化１】
【００８１】
【化２】
このベクター系を用いてニワトリにおける免疫応答を最大限にするために、これら２つのタンパク質をコードする各ＯＲＦを３つのＦＡＶ８発現構築物に別々にクローニングして、ネイティブタンパク質、膜に係留されたバージョンのタンパク質、および分泌形の抗原のいずれかを発現させた。後者の２つのＦＡＶ８構築物は、目的のＯＲＦの上流に適切なシグナル配列を融合することによって得られた。送達ベクターとしてＦＡＶ８を用いたことにより、ワクチンを安価に大規模に投与できるため、かなり大きなブロイラー市場に導入される可能性を有する最終生成物が提供される。
【００８２】
驚くべきことに、全長ｒ５６がＦＡＶ８ベクターにクローニングされたとき、それはベクター内で不安定であるために、サブユニットワクチンとして送達されたときにも適切な防御免疫を提供できないことが見出された。しかし、切断型バージョンの抗原を用いたときには、免疫が明確に示された。
【００８３】
３つのバージョンのｒ５６および３つのバージョンのＴＦＰ２５０を生成した。バージョン１はＵＴＳから供給されたネイティブＯＲＦであり、そのコード領域をＦＡＶ発現カセットに挿入した以外は変更していないものである。バージョン２は、シグナル配列を加えることによってｒ５６またはＴＦＰ２５０が細胞から分泌されるようにしたものである。バージョン３にもシグナル配列が付加されているが、これはｒ５６またはＴＦＰ２５０を細胞膜に向けるためのものである。
【００８４】
下記の表は第１の研究の結果をまとめたものである：
【００８５】
【表１】
組み換えウイルスが得られたことを確認するために、従来の手段を用いてウイルスを単離してプラーク精製した。加えてＰＣＲを用いて、組み換えＦＡＶのＤＮＡから単離された、挿入されたｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡ全体、ならびに各セクション（プロモーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０およびポリＡ）の増幅を確認した。プロモーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡからなる挿入発現カセット全体を含む、組み換えＦＡＶから単離したＤＮＡについても、両方向の配列決定を行なって配列挿入物の忠実度を確認した。抗ｒ５６または抗ＴＦＰ２５０血清を用いてタンパク質発現を確認した。
【００８６】
図２および図３は、さまざまな構築物からのｒ５６およびＴＦＰ２５０のタンパク質分析を示す。異なるＦＡＶ８構築物をＬＭＨ細胞系統に感染させることによって、タンパク質発現実験を行なった。これらの構築物は、すべてのタンパク質発現バージョン（ネイティブ、分泌および膜アンカー）とともに、異なるプロモーター（ＭＬＰまたはＣＭＶｐ）の制御下で設計された。陰性対照として、未感染のＬＭＨ細胞およびＦＡＶ８ベクターのみを感染させた細胞を用いた。組み換え５６に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてｒ５６抗原を検出し、組み換えペプチドに対するマウス抗血清を用いてＴＦＰ２５０を検出した。タンパク質バンドは、クローニングされた部分遺伝子フラグメントから予測されたペプチドの予想サイズに基づく適切な分子量のところに現れた。組み換えＴＦＰ２５０（図３）に対するレーン３および４にみられるスメアは、ペプチドと宿主細胞材料との凝集によるもののようであった。
【００８７】
この結果から、明確なバンドを示さなかったＴＦＰ２５０膜アンカー構築物を除くすべての構築物はよく発現されることが示された。明確なバンドを示さなかったのは、発現されたタンパク質が膜に係留して、膜からの抽出後に高次構造が変化したためかもしれない。
【００８８】
当業者にとって、多くの異なる可能性が利用可能である。必要な構築物を作製するために、３つの実施例を以下に示す。図５には、制限酵素部位、目的のＯＲＦ（たとえば切断型ｒ５６、８２ｋＤａタンパク質またはＴＦＰ２５０など）とインフレームのシグナル配列、および構築物をＦＡＶの右手端部発現カセットに挿入させるための第２の制限酵素部位の化学合成のためのスキームが示されている。
【００８９】
代替的に、（図６）当業者は、適切なＲＥ部位およびインフレームのシグナル配列を有するプライマーを用いて、目的のＯＲＦから所望の配列をＰＣＲ増幅してもよい。
【００９０】
他の実施例において、当業者はＦＡＶ ＲＨＥ発現カセットを構築して、プロモーターおよびシグナル配列、次いでシグナル配列とインフレームで目的のＯＲＦを挿入するためのＭＣＳを含ませてもよい（図７）。
【００９１】
実施例２
防御免疫応答の誘導
本実施例は、ＦＡＶ８−ｒ５６およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ベクターが、Ｅ．ｍａｘｉｍａの発生を妨げて寄生虫病変を防ぐような防御免疫応答を誘導する能力をテストするものである。
【００９２】
【表２】
病変を生成するために必要な接合子嚢の数を評価するために予備試験が行なわれ、その試験では３０羽のＳＰＦニワトリを可搬性の清潔なケージ内でコクシジウム症のない条件下（清潔度、水および餌）で飼育する。ニワトリに毎週飲水を通じてアンプロリウムを投与することによって、攻撃前にコクシジウム感染を防ぐための処置をする。ｄａｙ２８にニワトリは経口で適切な数のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ接合子嚢の攻撃を受ける（表２を参照）。ｄａｙ３４に病変スコア付け（投与量レベル当り少なくとも５羽のニワトリ）を行なう。平均３〜４の最も一貫した病変スコアを有するグループを選択して、試験で用いられる高攻撃投与量に供する。予備試験に用いられたのと同じバッチの接合子嚢を２％重クロム酸カリウム中で４℃にて保存し、試験に用いる。
【００９３】
次いで、Ａｒｍｉｄａｌｅ近郊の孵化場から得られた４００羽のＳＰＦニワトリ（最初の３週間で最高１０％の死亡率を許容）、および胚内免疫化のための１８日インキュベーションの１８０個の受精卵に対して予備試験を行なう。
【００９４】
以下のワクチンおよび対照が用いられる：
対照：ワクチン接種なし（陰性対照）；ＦＡＶ８ベクターのみ（陰性対照）；ｒ５６タンパク質のワクチン接種；およびＴＦＰ２５０タンパク質のワクチン接種。テストされるワクチンは、以下のとおりのＦＡＶ８構築物に基づくワクチンである：ＦＡＶ８−ｒ５６ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ｒ５６ Ｎ末端膜アンカー；ＦＡＶ８−ｒ５６分泌形；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ Ｎ末端膜アンカー、およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０分泌形。
【００９５】
ＦＡＶ８構築物の力価は用量当り１×１０８となる。以下に記載されるとおり、ワクチンは経口、胚内、または皮下ワクチン接種によって投与される。
【００９６】
経口ワクチン投与に対しては、２１ゲージのブラントチップ（ｂｌｕｎｔ−ｔｉｐ）針に接続した１ｍｌシリンジを用いる。トリを垂直に保持し、そっと口を開かせて、後鼻孔の割れ目の前部にブラントチップ針を挿入する。ワクチンをゆっくりと投与して、ワクチンが嚥下される前に後鼻孔の割れ目および中咽頭を浸すようにさせる。この態様で、ワクチンが投与される際に上咽頭のほとんど、および口腔のほぼ全体がワクチンに接触する。
【００９７】
１８日インキュベーションにおける胚内ワクチン接種に対しては、１８０個の卵が尿膜腔液中に、日齢ヒヨコに用いられるのと同じ用量レベルでウイルスの注射を受ける（グループ５、６、１７、１８、２３および２４の卵、各々以下の表３を参照）。
【００９８】
組み換え抗原を用いた皮下および筋肉内ワクチン接種に対しては、バクテリアを発酵濃度の１０倍に濃縮して、下記の尿素緩衝液中での超音波処理によって溶解する：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、６Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、さらに０．８μＭフィルタで濾過する。各２５ｍｌのＣＥサンプルならびに尿素緩衝液およびＰＢＳから１００ｍｌのエマルション（２５％水相）を調製する。この試験にはフロイントの完全アジュバントが用いられ、エマルションは注射の直前に調製される。
【００９９】
各ニワトリは、最初にｄａｙ１に用量当り０．５ｍｌを皮下にワクチン接種され、次いでｄａｙ１４に用量当り０．５ｍｌを筋肉内に追加される。
【０１００】
下記の表はワクチン接種に対する実験設計をまとめたものである。
【０１０１】
【表３】
コクシジウム症の混入を避けるために、ｄａｙ７、１４および２１にニワトリの飲水中のアンプロリウムでニワトリを毎週処置する。さらに、隔離飼育器、設備などを徹底的に洗浄し、すべての作業者が入室の際に着替えることによってコクシジウムの感染を防ぐ。ｄａｙ２６に糞便サンプルを取ってＥｉｍｅｒｉａ接合子嚢の存在をテストする。ｄａｙ２８に、接合子嚢排出の測定に用いられるニワトリは、経口的に１００個のＥ．ｍａｘｉｍａ胞子形成接合子嚢の攻撃を受け、病変スコアに対するニワトリは、予備試験で決定された顕著な病態をもたらす数の胞子形成接合子嚢を受取る（２０〜５０，０００）。
【０１０２】
上記の試験は以下のスケジュールに従う。
【０１０３】
卵インキュベーションのｄａｙ１８に、グループ３、９および１２の第１の胚内ワクチン接種。
【０１０４】
卵インキュベーションのｄａｙ２１に、胚内ワクチン接種グループからのヒヨコが３つの別個の卵インキュベータ内で孵化。
【０１０５】
ｄａｙ１に、その他すべてのグループの第１のワクチン接種を行なう。
【０１０６】
ｄａｙ１４に、すべてのヒヨコ（グループ３、９および１２を含む）の第２のワクチン接種を行なう。
【０１０７】
ｄａｙ２８に、血清学的テストのためにニワトリから採血してから、病変スコア付けに対してはニワトリ当りに必要な正しい数の接合子嚢（予備試験の結果に基づく）によって、接合子嚢カウントに対してはニワトリ当り１００個の接合子嚢によって、Ｅ．ｍａｘｉｍａによる攻撃を受けさせる。
【０１０８】
ｄａｙ３４に、大投与量の接合子嚢を受けたグループに対する病変スコア付けを行なう。
【０１０９】
ｄａｙ３４〜ｄａｙ３７に、１００個の接合子嚢に感染されたヒヨコの各グループからの糞便を単一のプールに集め、ｄａｙ３７にすべてのサンプルに対して接合子嚢カウントを行なう。
【０１１０】
ｄａｙ４２（感染後１４日）に血清学的テストのためにトリから採血し、屠殺する。
【０１１１】
免疫応答の評価のためのインビトロテストを行ない、ここでは免疫化の４週間後（ｄａｙ２８）にＦＡＶ８被覆プレート（ＴｒｏｐＢｉｏ Ｌｔｄ．）上で血清学テストを行なって、ＦＡＶ８構築物の感染を確認する（すべての群に対して）。免疫化４週間後の血清および攻撃後１４日の血清に対しても、ＡＰＧＡ、ｒ５６およびＴＦＰ２５０被覆プレート上でＥＬＩＳＡアッセイが行なわれる（すべてのグループに対して）。さらに、正の対照血清として抗ｒ５６／ＡＰＧＡ／抗ＴＦＰ２５０／を、陰性対照として正常なニワトリ血清を用いた、調製用ガメトサイトおよび組み換えＴＦＰ２５０含有ブロットによるウエスタンブロットを用いて、タンパク質分析を行なう。
【０１１２】
上に示すとおりに行なわれた最初の試験において、最高の防御を有したワクチン接種グループは、平均病変スコアがそれぞれ１．３１および１．３６のｒ５６分泌グループおよびｒ５６ネイティブグループであることが見出され、ここでスコア１はブロイラーニワトリにおける良好な能力結果を得るために許容できると考えられる。対照グループにおける平均病変スコア２．３７と、ワクチン接種グループにおける１．３１との差は、病気のニワトリと防御されたニワトリとの間の格差によるものと明確にいえる。
【０１１３】
病変スコア付けおよび接合子嚢カウントの両方に基づいて、ｒ５６分泌構築物を含むＦＡＶ８ベクターは１日齢のヒヨコにおける防御の誘導に非常に良好に働くことが結論付けられた。胚内免疫化によってこの構築物によるワクチン接種を受けたグループは、こうした高レベルの防御を示さなかった。この理由は、孵化が早かったためにヒヨコがウイルスに晒される時間が十分でなかったためだと考えられる。それにもかかわらず、胚内ワクチン接種はなおも将来のワクチン接種に対する実行可能で経済的なアプローチである。１日齢のヒヨコの経口ワクチン接種は効果的であることが証明されたことから、こうしたトリにワクチンを噴霧または給餌することが、ブロイラーに長期の免疫を与える有用な方法となることが期待される。
【０１１４】
ｒ５６構築物によって良好な結果を提供したことに加え、病変スコア付けおよび接合子嚢カウントの両方によって、ＴＦＰ２５０分泌構築物も顕著な（２０〜３０％低いが）レベルの防御免疫を誘導することが見出された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項２】
目的の前記ＯＲＦは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原、およびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原からなる群より選択される抗原をコードする、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項３】
前記マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原と組み合わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードするＯＲＦを含む、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項４】
前記トリアデノウイルスゲノムは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１２のゲノムからなる群より選択される、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項５】
前記トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項６】
前記組み換えトリアデノウイルスベクターは、目的の前記ＯＲＦの挿入のための前記クローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶性産物を生成する、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項７】
前記核酸は、
ａ）配列番号１３に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない、切断型Ｒ５６；
ｂ）配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型Ｒ５６フラグメント、または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする、切断型ｒ５６；
ｃ）配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、切断型ＴＦＰ２５０；および
ｄ）配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０
からなる群より選択される抗原をコードする、請求項２に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項８】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項９】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項１０】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項１１】
多価コクシジウム症ワクチン調製物であって、前記調製物は：
請求項７に記載のコクシジウム症ワクチン、
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン；ならびに／または
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン
を含む、多価コクシジウム症ワクチン調製物。
【請求項１２】
マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、トリインフルエンザ（ＡＩ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、およびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含む、請求項１１に記載の多価コクシジウム症ワクチン調製物。
【請求項１３】
Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感染に対して被験体を免疫化する方法であって、請求項１に記載のワクチンを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記投与するステップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むＦＡＶベクターによって前記被験体が免疫化されたときにみられる免疫よりも増強されたレベルの免疫を誘発する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記鳥種はニワトリである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニワトリは成体のブロイラーニワトリである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与するステップは、前記被験体に前記ワクチンを噴霧するステップ、前記被験体に食物中の前記ワクチンを給餌するステップ、および前記被験体の飲用供給物中に前記ワクチンを提供するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法であって、被験体に請求項１に記載のワクチンを投与するステップと、前記ニワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与するステップとを含む、併用ワクチン接種療法。
【請求項２０】
前記ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は種畜雌鳥に投与されることによって孵化の際にヒヨコに免疫を与え、請求項１に記載のワクチンは孵化後の１日目およびそれより後に前記ヒヨコに投与され、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与される、請求項１９に記載の併用ワクチン接種療法。
【請求項２１】
トリアデノウイルスゲノムを含む組み換えトリアデノウイルスベクターであって、異種プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配列はマルチプルクローニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目的のＯＲＦを挿入することによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とインフレームで前記目的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
前記疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発現された宿主細胞から分泌されることを可能にするための切断部位を含む、請求項２１に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
前記シグナル配列は切断部位を含有しないことによって、前記宿主細胞の前記細胞表面に係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる、請求項２１に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦの挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
前記目的のＯＲＦの前記挿入のための前記クローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する、請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型Ｒ５６フラグメントまたは配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルス。
【請求項３１】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１５０〜２３６１からなる切断型ｒ５６フラグメントをコードする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４４〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２７に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１４９〜２３６１からなる切断型ＴＦＰ２５０フラグメントをコードする、請求項２７に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３５】
前記分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３６】
前記膜アンカーシグナル配列は、トリインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、ワクチン。
【請求項３８】
トリ集団における免疫応答を誘発する方法であって、前記集団に請求項３８に記載のワクチンを投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する方法であって、請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンの投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い免疫応答を誘発する、方法。
【請求項４０】
請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、単離細胞。
【請求項４１】
請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターおよび適切な賦形剤を含む、薬学的処方物。
【請求項１】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項２】
目的の前記ＯＲＦは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原、およびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原からなる群より選択される抗原をコードする、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項３】
前記マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原と組み合わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードするＯＲＦを含む、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項４】
前記トリアデノウイルスゲノムは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１２のゲノムからなる群より選択される、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項５】
前記トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項６】
前記組み換えトリアデノウイルスベクターは、目的の前記ＯＲＦの挿入のための前記クローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶性産物を生成する、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項７】
前記核酸は、
ａ）配列番号１３に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない、切断型Ｒ５６；
ｂ）配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型Ｒ５６フラグメント、または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする、切断型ｒ５６；
ｃ）配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、切断型ＴＦＰ２５０；および
ｄ）配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０
からなる群より選択される抗原をコードする、請求項２に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項８】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項９】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項１０】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。
【請求項１１】
多価コクシジウム症ワクチン調製物であって、前記調製物は：
請求項７に記載のコクシジウム症ワクチン、
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８〜７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン；ならびに／または
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン
を含む、多価コクシジウム症ワクチン調製物。
【請求項１２】
マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、トリインフルエンザ（ＡＩ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、およびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含む、請求項１１に記載の多価コクシジウム症ワクチン調製物。
【請求項１３】
Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感染に対して被験体を免疫化する方法であって、請求項１に記載のワクチンを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記投与するステップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むＦＡＶベクターによって前記被験体が免疫化されたときにみられる免疫よりも増強されたレベルの免疫を誘発する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよびハトからなる群より選択される鳥種である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記鳥種はニワトリである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニワトリは成体のブロイラーニワトリである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与するステップは、前記被験体に前記ワクチンを噴霧するステップ、前記被験体に食物中の前記ワクチンを給餌するステップ、および前記被験体の飲用供給物中に前記ワクチンを提供するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法であって、被験体に請求項１に記載のワクチンを投与するステップと、前記ニワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与するステップとを含む、併用ワクチン接種療法。
【請求項２０】
前記ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は種畜雌鳥に投与されることによって孵化の際にヒヨコに免疫を与え、請求項１に記載のワクチンは孵化後の１日目およびそれより後に前記ヒヨコに投与され、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与される、請求項１９に記載の併用ワクチン接種療法。
【請求項２１】
トリアデノウイルスゲノムを含む組み換えトリアデノウイルスベクターであって、異種プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配列はマルチプルクローニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目的のＯＲＦを挿入することによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とインフレームで前記目的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
前記疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発現された宿主細胞から分泌されることを可能にするための切断部位を含む、請求項２１に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
前記シグナル配列は切断部位を含有しないことによって、前記宿主細胞の前記細胞表面に係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる、請求項２１に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦの挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
前記目的のＯＲＦの前記挿入のための前記クローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する、請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、
ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、
ｃ）ポリアデニル化シグナルと、
ｄ）トリアデノウイルスゲノムと
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０〜１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４５からなる切断型Ｒ５６フラグメントまたは配列番号２のアミノ酸２４〜３４５のフラグメントをコードする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルス。
【請求項３１】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１５０〜２３６１からなる切断型ｒ５６フラグメントをコードする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４４〜７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２７に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１４９〜２３６１からなる切断型ＴＦＰ２５０フラグメントをコードする、請求項２７に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３５】
前記分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３６】
前記膜アンカーシグナル配列は、トリインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、ワクチン。
【請求項３８】
トリ集団における免疫応答を誘発する方法であって、前記集団に請求項３８に記載のワクチンを投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する方法であって、請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンの投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い免疫応答を誘発する、方法。
【請求項４０】
請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、単離細胞。
【請求項４１】
請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターおよび適切な賦形剤を含む、薬学的処方物。
【図１】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１３５４８（Ｐ２０１３−５１３５４８Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９８５２（Ｐ２０１１−５３９８５２）
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１６１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８９６８
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４３７５９）ベクトジェン プロプライエタリー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１６１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８９６８
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４３７５９）ベクトジェン プロプライエタリー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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