コリスチンの精製方法および精製コリスチン成分
本発明は、酢酸および高エタノール濃度中のコリスチン塩基をカラムに装填する工程と低エタノール濃度で溶出する工程とが行われる、逆相クロマトグラフィーを用いるコリスチンの精製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性菌、特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）における増大する多剤耐性は重大問題を提起している。制限された治療選択肢は、感染病臨床医および微生物学者にコリスチン（ポリミキシンＥとも呼ばれる）、ポリミキシンＢと似ているが、それと同一ではないポリミキシン抗生物質の臨床応用を再評価するように強いている。コリスチンは、そのより幅広い治療指数のためにポリミキシンＢよりも明らかな利点を有する可能性がある。
【０００３】
コリスチンは、バチルス・ポリミキサ・バル．コリスチヌス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ｖａｒ．ｃｏｌｉｓｔｉｎｕｓ）から１９４７年に初めて単離され、発酵によって産生されるポリペプチドの混合物からなる。主成分はポリミキシンＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ１−Ｉｌｅである（図１）。
【０００４】
商業的には、コリスチンは、腸除染のために経口で、皮膚感染症のために粉末として局所的に使用される、硫酸コリスチンとして、ならびに非経口でおよび吸入によって使用される、コリスチメタン酸ナトリウムとして世に出ている。コリスチメタン酸ナトリウムは毒性が少なく、そして望ましくない副作用がコリスチンより少ないことが分かっているが、効能もまた弱い（Ｆａｌａｇａｓ ａｎｄ ＫａｓｉｏｋｏｕによるＣｒｉｔｉｃａｌ
Ｃａｒｅ ２００６，１０：Ｒ２７（ｄｏｉ：１０．１１８６／ｃｃ３９９５を参照されたい）。
【０００５】
硫酸コリスチンは多くの場合、軟膏、耳科用懸濁液ならびに耳科用液および点眼剤に調合される。硫酸コリスチンはまた、腸感染症を治療するために、または結腸細菌叢を抑えるために懸濁液または錠剤として経口で投与される。
【０００６】
コリスチメタン酸ナトリウムは、包嚢性線維症患者において緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症を治療するために使用されてもよいコリスチンの半合成プロドラッグであり、それは多剤耐性アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）感染症を治療するために最近使われるようになってきた。コリスチメタン酸ナトリウムはまた、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）髄膜炎／脳室炎において髄腔内におよび脳室内に投与されている。コリスチメタン酸ナトリウムは、水溶液中で容易に加水分解されて様々なメタンスルホン化誘導体になり、分析するのが非常に困難である。
【０００７】
コリスチンは５０数年前に臨床診療へ導入されたので、その特性は、たとえば薬理学、毒物学、不純物の内容などに関連した特有の要件で、決して最新薬ほどには完全に文書に記録されなかった。
【０００８】
このため、商業的に入手可能なコリスチン製品は、主成分ポリミキシンＥ１に加えて、大部分は発酵プロセスに由来する、多くの関連の活性および不活性の物質／不純物を含有する。コリスチンの典型的なＨＰＬＣクロマトグラムが図２に示される。
【０００９】
市販コリスチンの主成分、ポリミキシンＥ１は、典型的には乾燥製品の約６０％を構成する。コリスチン製品中の関連物質の幾つかは特性化されているが（図１）、ほとんどの不純物は依然として知られていない。硫酸コリスチンの最小効能は、ＵＳＰ（米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ））によって規定されているように「５００μｇ／ｍｇ以上」であるが、各成分の明確な抗菌活性はほとんど知られていない。
【００１０】
この製品は５０年を超える間使用されてきたが、コリスチンの標準化投薬も、薬理学または薬物動態学に関して公表された詳細な試行もまったくない。ほとんどの感染症に対する最適投薬は、それ故知られていない。同様に、各製剤に対する推奨「最大」用量は異なる。各国は、コリスチンの異なるジェネリック製剤を有し、推奨用量は製造業者に依存するであろう。
【００１１】
硫酸コリスチンおよびコリスチメタン酸ナトリウムは両方とも静脈内におよびエアゾールとして投与されてもよいが、投薬は複雑である。幾つかの製造業者からのコリスチメタン酸ナトリウムは、国際単位で処方されているが、他の製造業者からの同じ製品は、コリスチン塩基のミリグラム単位で処方されている。用量の規制または標準化がこのように完全に不在であることにより、静脈内コリスチン投薬はあらゆる医師にとって悪夢となる。
【００１２】
静脈内治療で記載される主毒性は、肝臓毒性（肝臓への損傷）および神経毒性（神経への損傷）であるが、これは、以前に投与された非常に高い用量が、現在あらゆる製造業者によって推奨されている用量よりはるかに高く、そして腎疾患に対して調整がまったく行われなかったことを反映している可能性がある。噴霧治療で記載されている主毒性は気管支痙攣である。
【００１３】
支持データの不在下に、コリスチンの毒性の幾つかは現在の市販製品中に存在する関連物質および不純物のせいである可能性があると推測し得る。そしてさらに、「不純な」コリスチンを出発原料として使用してコリスチメタン酸塩プロドラッグを合成するときに、各関連物質および不純物は、幾つかのメタンスルホン酸塩誘導体の基盤を形成し、それによって非常に複雑な最終製品を生み出すであろうが−個々の物質それぞれの毒物学的特性は不明である。
【００１４】
上記の毒物学的および薬理学的考察に基づき、「モノ成分」の各種のコリスチンを医療目的のために使用することに大きな利点が見出され得る。かかるモノ成分コリスチンは、非常に高い割合（現在の６０％に比べて、＞９０％）の主成分ポリミキシンＥ１を含有し、すべての主な不純物が同定され、特性化された状態であろう。
【００１５】
モノ成分コリスチンは、幾つかの利点：
１）主成分（ＰＥ１）、関連物質および不純物の毒物学的寄与を明らかにする可能性
２）新たなおよびより正確な薬理学的なおよび薬物動態学的な研究に適した製品
３）様々な不明確な物質を生み出すことなく、明確な誘導体、たとえばコリスチメタン酸塩を合成する可能性
４）規制手順を簡略化する、コリスチンおよびコリスチメタン酸塩の両方についてのより良好なおよびより正確な分析方法を開発する可能性
５）明らかな薬理学的および毒物学的データに基づく一義的な投薬推奨
６）大きい需要のある、「現代的」抗生物質へのコリスチンのアップグレード
を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
モノ成分コリスチンの工業的に拡大可能な製造方法は、特許文献にもまたはパブリックドメインの他のどこにも記載されていないので、かかる製品の製造方法を開発することが本発明者の目標であった。
【００１７】
第２のより長期の目標は、以前のポリミキシン群の研究と比較するために、精製ＰＥ１をインビトロおよびインビボ有効性の新たな研究にならびに毒物学的研究にかけることであろう。かかるランダム化されかつ管理された試行は、ポリミキシンの有効性および安全性に関する様々な問題（ＭｉｃｈｏｌｏｐｏｕｌｏｓおよびＦａｌａｇａｓによる、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．２００８ Ａｐｒ；２４（２）：３７７−９１）をさらに明らかにするために早急に必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、コリスチン成分、特に主成分、ポリミキシンＥ１の精製方法に関する。
本発明は、コリスチンの主成分であるポリミキシンＥ１の実質的に純粋な（９０〜９８％純度）、コリスチンモノ成分と呼ばれる製剤の製造方法に関する。
【００１９】
本方法は、低毒性の溶媒を用いる簡単なクロマトグラフ法である。本方法は、ポリミキシンＥ１の精製を９０％超の純度まで可能にする、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、引き続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む。
【００２０】
本方法は、
・ 酢酸および高（４Ｍ）エタノール濃度中のコリスチン塩基をＲＰカラムに装填する工程
・ 低（１．６〜２Ｍ）エタノール濃度で溶出する工程
によって特徴づけられる。
【００２１】
意外にも、本方法は、他の主なコリスチン成分からポリミキシンＥ１を効率的に分離するために用いることができる。
好適なＲＰ材料の特定を含む作業は、１０×２５０ｍｍスチールカラムでの実験室規模で行われた。
【００２２】
Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、１５μｍ（Ｃ８）が、実験室規模でのコリスチン塩基からのＰＥ１の精製のための好適な樹脂であることが分かり、この実験室方法は、１グラムから５０×８５０ｍｍスチールカラムでの５０グラムレベルへとスケールアップされた。
【００２３】
コリスチン塩基が２４％（４Ｍ）エタノールおよび０．１Ｍ酢酸に溶解され、そしてポリミキシンＥ分画へと分離される方法が開発された。主成分、ＰＥ１は、６０％の典型的な回収率および９４〜９８％の相対クロマトグラフ純度で単離された。
【００２４】
欧州薬局方（ＥＰ）では、硫酸コリスチンのバッチ／ロットの効能は、「そのままで」ＨＰＬＣによって測定される、ポリミキシン因子ＰＥ１、ＰＥ２、ＰＥ３、ＰＥ１−ＩｌｅおよびＰＥ１−７ＭＯＡの合計の％含有率と定義されている。これらの因子の全体効能は７７．０％以上を構成するべきである。さらに、ＥＰは、次のように具体的な因子の最大限度（ＮＭＴ（ｎｏｔ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）；以下）を明確に提示している：ＰＥ１−Ｉｌｅ（ＮＭＴ １０％）、ＰＥ１−７ＭＯＡ（ＮＭＴ １０％）、ＰＥ３（ＮＭＴ １０％）、および主要不純物 ＮＭＴ ４％。
【００２５】
記載される精製方法を用いて、最終製品は次のような典型的な組成を有する：ＰＥ１（
９４〜９８％）、ＰＥ２（０〜０．１）、ＰＥ３（０．０）、ＰＥ１−Ｉｌｅ（０．２〜１．０％）、ＰＥ１−７ＭＯＡ（０．５〜２．０％）、および総残存不純物 ０．５〜２．０％。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】硫酸コリスチンの主成分、硫酸ポリミキシンＥ１および関連物質の分子構造。
【図２】コリスチン欧州薬局方標準品のＨＰＬＣクロマトグラム
【図３】コリスチン塩基の精製中の分画番号の関数としての相対クロマトグラフ純度を示すグラフ（グラフ中のｆ１−Ｅ１およびｆ２−Ｅ１は、本出願の説明部分ではｆ１とまとめて言われ；ｅＥ１はｅ１／ｅ２と等しく、ｅｅＥ１はｅ３と等しく、一方ｅｅｅ…は微量の未知不純物の合計である）。
【図４】コリスチン塩基の精製中の分画番号の関数としての様々な成分のピーク面積を示すグラフ（グラフ中のｆ１−Ｅ１およびｆ２−Ｅ１は、本出願の明細書部分ではｆ１とまとめて言われ；ｅＥ１はｅ１／ｅ２と等しく、ｅｅＥ１はｅ３と等しく、一方ｅｅｅ…は微量の未知不純物の合計である）。
【図５】主な不純物と一緒のコリスチンモノ成分（ＰＥ１）のＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
「コリスチン」は、主成分がポリミキシンＥ１またはその塩である抗生物質ペプチド成分のあらゆる混合物をカバーすることが意図される。
「ポリミキシンＥ１」は、以前はコリスチンＡと称された化合物、ならびに
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓによって７７２２−４４−３と指定された化合物、
ならびに
Ｎ２−（６−メチル−１−オキソオクチル）−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｄ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−スレオニン環状（１０−４）−ペプチド、
ならびに
コリスチンＩＶ
を包含することが意図される。
【００２８】
「コリスチン塩基」は、３０〜７０％のポリミキシンＥ１を含むあらゆるコリスチンを包含することが意図される。
「硫酸コリスチン」は、コリスチンのあらゆる硫酸塩を包含することが意図される。
【００２９】
「コリスチメタン酸塩」は、コリスチンのあらゆるメタンスルホン化誘導体を包含することが意図される。
「組成物」は、３つ以上の異なる化合物を含むあらゆる混合物、たとえば２つの活性医薬原料の混合物、または１つの活性医薬原料と１つ以上の医薬賦形剤との混合物である。
【００３０】
本出願に用いられる用語「成分」または「いくつかの成分」は、組成物中の具体的な化合物を意味している。したがって、「微量の成分」は組成物中に比較的少量で見いだされる化合物である。
【００３１】
「医薬組成物」は、インビボで使用するのに好適なあらゆる組成物である。かかる組成物はしたがって、皮膚に、皮下に、静脈内に、非経口で、経口でなどで投与することがで
きる。
【００３２】
「分離」は、所望の化合物が別の化合物から（分析上または分取上）分割されるあらゆる方法である。
「精製」は、所望の化合物の濃度が上げられるあらゆる分離方法である。
【００３３】
「クロマトグラフィー」は、固定相と移動相とを含むあらゆる精製技法である。
「固定相」は、化合物を保持することができるリガンドを含むあらゆる表面である。
「リガンド」は、化合物の結合が起こる、固定相の部分である。
【００３４】
「移動相」は、一定の方向に固定相を通ってまたは固定相に沿って浸透することができるあらゆる流体、溶媒、液体または混合物である。
「逆相クロマトグラフィー」は、より極性のまたは帯電した成分が、極性の少ない成分より先に溶出されるあらゆるクロマトグラフィーである。
【００３５】
「疎水性相互作用クロマトグラフィー」は、固定相の非極性リガンドと非極性化合物または化合物の非極性部分との間の相互作用に基づくあらゆるクロマトグラフィーである。
「高エタノール濃度」は、容積の２０％以上、典型的には２０％〜３０％のエタノール濃度を意味する。
【００３６】
「低エタノール濃度」は、容積の２０％未満、典型的には１０％〜１５％のエタノール濃度を意味する。
「％ｖ／ｖ」は容積百分率を意味する。
【００３７】
市販のコリスチン塩基は、ポリミキシンＥ１、ポリミキシンＥ２、ポリミキシンＥ３、およびポリミキシンＥ１−イソロイシンを含む、多くの密接に関係したデカペプチド−脂肪酸アミドの混合物である（図１）。
【００３８】
コリスチン塩基から主成分ポリミキシンＥ１（ＰＥ１）を単離したいという熱望は、高い相対クロマトグラフ純度（＞９０％）のＰＥ１の単離、および取得のために逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ法が、好適であるかどうかの研究につながった。
【００３９】
文献はＲＰ分離法をほんのわずかしか提供せず、使用される主な有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールである。これらの溶媒は毒性があり、パイロットおよび大規模生産では回避されるべきである。しかし、０〜６０％のエタノールグラジエントを用いる硫酸コリスチンでのマイクログラムレベルのＣ１８−ＨＰＬＣ分離試行は、ポリミキシンＥ１用の工業的に有用な精製方法のために比較的非毒性の溶媒エタノールを使用することが可能であるかもしれないことを全く意外にも示唆した。
【００４０】
出発原料、コリスチン塩基は、発酵および精製によって製造され、バルク物質硫酸コリスチンの製造における中間体である。出発原料は、バッチ間で数パーセント変動して、約６０％のＰＥ１を含有する。当初の目標は、９０％超の硫酸ポリミキシンＥ１の相対クロマトグラフ純度を達成することであった。これを目標として、様々なカラム材料が、エタノールをベースとする溶出系で選別された。
【００４１】
ポリミキシンＥ１（図１）は、極性のデカペプチド部分および非極性の脂肪酸部分のためにイオン性洗剤特質を有する。この分子は、６−メチル−オクタンアシル化線状トリペプチドに結合した環状ヘプタペプチドからなる。この分子は、１，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）の６つの部分を含有し、そのうちの１つが３つのペプチド結合に関与するので、それらの相当するアンモニア（ＮＨ４＋）基と平衡にある５つの第一級アミノ基が存在し、
分子の強い極性部分を構成する。
【００４２】
ＲＰ−樹脂とこの分子との間の分子相互作用は、脂肪酸部分とペプチド部分の非極性領域とで起こると予測される。
ＨＰＬＣ分画およびＨＰＣＬプールを監視するために、分析ＨＰＬＣ法が標準方法をベースとして開発された。改良された方法は、従来のＨＰＬＣ法を用いたときには目に見えなかった、ＰＥ１主ピーク下の少量の関連成分（ｆ１、ｅ１、ｅ２）を明らかに見えるようにした。
実験の部
分取ＨＰＬＣ
１０×２５０カラム：ミリグラム規模でカラム材料を選別するために、スチールカラム１０×２５０ｍｍを使用した。このカラムに、９６％エタノールに懸濁された様々な被験樹脂を充填した。
【００４３】
５０×８３０カラム：グラム規模での分取精製のために、５０×８５０ｍｍスチールカラムを以下に記載されるように使用した。選択されたカラム材料、約１ｋｇのＭｅｒｃｋ
ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ６０ ＲＰ ｓｅｌｅｃｔ Ｂ（１５μｍ）を９６％エタノールに懸濁させ、カラムに充填した。上部フランジを取り付け、すべての過剰のエタノールが除去されるまでピストンを５０バールで上向きに押し進めた。１ｍｌの０．１ｍｇ／ｍｌのヨウ化カリウム溶液を適用することによってカラムを試験し、吸収を２２７ｎｍ、ＡＵＦＳ＝０．０５および流量５５．５ｍｌ／分で測定した。記録されたピークは、満足のいく対称的な狭いガウス（Ｇａｕｓｓ）曲線であった。
【００４４】
分取ＨＰＬＣシステムは、
カラム：Ｄａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ａ／Ｓによって生み出される動的軸圧縮ありの１０×２５０ｍｍステンレススチールＭｅｒｃｋカラムおよび５０×８５０ｍｍステンレススチールカラム
ポンプ：低圧側に混合バルブ付きの４つの異なる溶媒入口を持った、０．５〜１５０ｍｌ／分の流量間隔のＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４８６調節可能な吸光度検出器（Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
積分器：Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
分画収集器：Ｗａｔｅｒｓ分画収集器（Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）
からなった。
【００４５】
溶出液の吸光度は、酢酸についてカット−オフされる、２３０ｎｍで検出した。より短い波長では、溶出液は余りにも多い干渉を示した。ミリグラム規模での分画は２５ｍｌ試験管に集め、一方グラム規模での分画は２５０ｍｌのＢｌｕｅｃａｐボトルに集めた。
【００４６】
各ＨＰＬＣラン後の１０×２５０ｍｍおよび５０×８５０ｍｍカラムの再生は、０．１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中に２４％エタノールおよび５０％の１，２−プロピレングリコールを含有する混合物を使用した。時々、高い逆圧が５０×８５０ｍｍカラムで観察され、そのカラムはそのとき充填し直すかまたは圧力が正常になるまで９６％エタノールでフラッシュした。
分析ＨＰＬＣ：
用いられるカラムは、移動相としてアセトニトリルを使ってＮｏｖａｐａｋ ４，６×１５０、４μｍ、Ｃ１８であった。ＣＨ３ＣＮ溶液の濃度を２１％から（１０分の定組成ラン後に）３０％まで５分の時間間隔の間に上げた。カラムは温度自動調節しなかったが
、周囲温度（２３±２℃）でランを行った。
【００４７】
分析ＨＰＬＣシステムは、
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａｐａｋ ４，６×１５０、４μ Ｃ１８および等価の４，６×２５０カラム
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓポンプ制御モジュール（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｕｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｍｏｄｕｌｅ）付き２ｐｓｃ．Ｗａｔｅｒｓ ５１０
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４９０ Ｅプログラム可能な多波長検出器（Ｗａｔｅｒｓ ４９０ Ｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｍｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
分画収集器：Ｗａｔｅｒｓ ７１７ プラス オートサンプラー（Ｗａｔｅｒｓ ７１７
ｐｌｕｓ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）
からなった。
【００４８】
このシステムは、ＷａｔｅｒｓソフトウェアＭｉｌｌｅｎｉｕｍによって制御された。試験される樹脂の総覧：
１）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．９３０３ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８、２５〜４０μｍ、バッチ：Ｌ ２７５７０３ ６１４。
【００４９】
２）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．９３２４ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８、２５〜４０μｍ、バッチ：Ｌ ２４０１２４ ５４１。
３）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１１０２３ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、１５μｍ、（Ｃ８）、バッチ：Ｌ １３９９２３ ６３３．
４）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１５０３８５ Ｈｉｂａｒ Ｆｅｒｔｉｇｓａｅｕｌｅ ＲＴ
ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ、ＲＰ−１８、１５μｍ、Ｃａｔ．５００１４。
【００５０】
５）Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ Ｋｒｏｍａｓｉｌ−１００Å、Ｃ８、１６μｍ、バッチ：ＤＴ００２６。
６）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１ Ｓ、３５μｍ、Ｌｏｔ
Ｎｏ．２３７７０３１９。
【００５１】
７）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｎｏ．２２２２７ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐ Ｅｔｈｅｒ、３５μｍ、弱疎水性
８）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｎｏ．２２２２５ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐ Ｂｕｔｙｌ、３５μｍ、強疎水性
１０×２５０カラム試行のための化学薬品：
硫酸コリスチン、バッチ：Ａ４６６０３１４、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
コリスチン塩基、バッチ：Ａ１５５１７０１、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
エタノール、９６％、「Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ」、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
メタノール、Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｏｌｖ ｎｏ．６０１８
ジメチルスルホキシド、Ｍｅｒｃｋ Ｕｖａｓｏｌ Ｎｏ．２９５０
１，２−プロパンジオール ｒｅｉｎｓｔ、Ｍｅｒｃｋ ｎｏ．７４７８
２−プロパノール、ＬｉＣｈｒｏｓｏｌｖグラジエントグレード、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１０４０
酢酸、１００％ Ｇ．Ｒ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６３
１−メチルピロリドン−（２）ｚ．ｓ．、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．８０６０７２
トリエチルアミン、Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｏ．２５１０８
テトラヒドロフラン、Ｆｌｕｋａ Ｎｏ．８７３６７
酢酸アンモニウム ｐ．ａ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１１１６
硫酸アンモニウム ｐ．ａ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１２１７
硫酸９８％ｐ．ａ．
水酸化ナトリウムペレット、ＧＲ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６４９８
Ｍｉｌｉ−Ｑ水、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｌａｂ．、Ｒ ＆ Ｄ、ＦＣＤ、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、タイプＨＶ膜フィルター、０，４５μｍ。
５０×８２５カラム試行のための化学薬品：
Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ製のエタノール ９６％および９９，９％
酢酸、１００％ Ｇ．Ｒ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６３
水酸化ナトリウムペレット、ＧＲ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６４９８
ＮａＯＨ、２７％ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｐｔ．
水酸化カリウム、ＵＳＰ ＸＩＸ、Ｆｅｒａｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｎｏ．２０９０７
１０×２５０カラム試行：
次のクロマトグラフ樹脂は、樹脂への強い結合、顕著な尾引き、低いクロマトグラフ純度または低い回収率のいずれかのために、分離目的には不適当であることが分かった：ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１ Ｓ；ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐエーテル、３５μｍ、ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐブチル、３５μｍ；Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８、２５〜４０μｍ；Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｂａｒ Ｆｅｒｔｉｇｓａｅｕｌｅ ＲＴ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ、ＲＰ−１８、１５μｍ；Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ Ｋｒｏｍａｓｉｌ−１００Å、Ｃ８、１６μｍ
１１ｍｇの硫酸コリスチンを適用された、ｐＨ約３，５（５０ｍＭのＨＡｃ）で６０分の間に０％〜６０％のエタノールグラジエントでのＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８、２５〜４０μｍを使った１回目の１０×２５０カラム試行については、良好な収率で約９０％の相対クロマトグラフ純度（ＲＣＰ）が得られた。しかし、同じ条件で４５分の間に１０〜２５％エタノールグラジエントを適用することによってエタノール濃度を下げようと試みたとき、分離はまったく観察されず、顕著な尾引きが観察された。
【００５２】
ｐＨ＝２．５で５ｍＭのＮＨ４ＨＳＯ４での同様な試行は、カラムへの化合物の完全な結合をもたらした。この実験、および同様の実験は、選択された条件でのＰＥ１精製のためには、硫酸コリスチンよりもむしろ、コリスチン塩基が使用されるべきであることを強く示唆した。
【００５３】
１，２−プロピレングリコール（１，２−ＰＧ）をエタノールの一部の代用として、たとえば２４％エタノールおよび２０％の１，２−ＰＧの濃度レベルで添加し、そして酢酸レベル（ｐＨ＝３）を約１％に上げた場合、これは、意外にも、７０％収率で約９０％のＲＣＰでＰＥ１生成物を与えた。
【００５４】
これらの初期実験に基づき、酢酸が樹脂（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８）と溶出液との間の化合物平衡にプラスの影響を及ぼすこと、そして硫酸コリスチンの代わりに希酢酸に溶解されたコリスチン塩基をむしろ使用すべきであることが結論づけられた。しかし、１，２−プロピレングリコール／エタノール混合物の使用は、このカラム材料で顕著な圧力降下をもたらし、この特定の樹脂および溶媒混合物はそれ故スケールアップのために不適当であると考えられた。
【００５５】
脂肪酸部分および非極性アミノ酸がカラム結合に関与するだけでなく、アミノ基およびアンモニウム基もまた関与することが明らかになった。
上記の実験は、幾つかの意外な結果、たとえばａ）ＥＨＳにやさしい溶媒エタノールがコリスチンの逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ分離のための溶出液として有用であること、およびｂ）分離は、さらなる精製のために硫酸コリスチンを使用する代わりに酢酸の存在下にコリスチン塩基で行うべきであることを与えた。樹脂ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８は有望な分離特性を示したが、それがスケールアップに好適であると分かったわけでない。
【００５６】
商業的に入手可能なクロマトグラフ媒体のリストは広範囲に及ぶが、徹底的な選別および選択によって我々は、Ｍｅｒｃｋ製の好適な候補、すなわちＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ １５μｍ（Ｃ８）を特定することに成功した。
【００５７】
０．１Ｍ酢酸中５〜２４％エタノールの直線的グラジエントの使用は、尾引きがほとんどない有望な分離を与えた。０．１Ｍ酢酸中（ｐＨ＝３）５〜１５％エタノールのグラジエントはうまくいくが、８５〜９０％ＰＥ１にすぎないＲＣＰであり、かつ低収率である。
【００５８】
逆エタノールグラジエント（すなわち、高濃度での適用およびより低濃度での溶出）を試してみたときに大きな飛躍的前進が実現した。以下のパラメータでの第１試行は、９０〜９５％ＰＥ１および約７０％収率でプールを与えることが判明した：
平衡：０，１Ｍ酢酸中５％エタノール
適用：０，１Ｍ酢酸中４ｍｌの３０％エタノールに溶解させた１１０ｍｇのコリスチン塩基
溶出液：６０℃の温度での０，１Ｍ酢酸中１５％エタノール
温度：４０℃
溶出液流量：２．２２ｍｌ／分
固相と溶出液との間のコリスチン成分の平衡をより速く達成させるために、より高い温度を選択したが、実験は、より高い温度が結果にいかなる著しい影響も及ぼさないことを示した。カラムオーブンおよび溶出液相の両方の温度をそれ故、プール純度および収率のいかなる有意な変化もなしに４０°／６０°から３５°／５０°に下げた。最後に、０．１Ｍ酢酸中５〜１５％エタノールグラジエントは３０°／４０°でランが実行されて良好な結果であり、逆グラジエントが相対クロマトグラフ純度、収率および尾引きプロフィールの大きいプラスの変化に実際に関与することを確認した。
【００５９】
修正された分析ＨＰＬＣ法が開発作業中に実行されたこと、ならびにこの新しい方法が以前には主なＥ１ピークに隠されていた、幾つかの関連物質、ｆ１およびｅ１／ｅ２を明らかに見えるようにしたことが指摘されるべきである。
【００６０】
関連物質ｆ１はＰＥ１ピークの前に溶出し、一方物質ｅ１／ｅ２はＰＥ１ピークの尾部に２つの、多かれ少なかれ分裂した最大部を持つ二重ピークとして溶出する。これらの２つの物質はＰＥ１から分離するのが特に困難であり、分取ＨＰＬＣ法の将来の最適化における精製課題を構成する。ＰＥ１と関連物質との分離が、ＨＰＬＣ分画の関数として成分の分布を示す略図で例示されている、特に図３および図４を参照されたい。
【００６１】
図３でポリミキシンＥ１の相対クロマトグラフ純度を、分画番号の関数として関連物質と比較する。ＰＥ１から分離するのが最も困難である関連物質はｅ１／ｅ２であり、一方Ｅ１−イソロイシン、ｆ１およびｅ３（ｅ１／ｅ２の後に溶出する）は除去するのがより容易である。図４は収率視点からの結果を示しており、ここでは、成分ピークの積分が分画番号の関数としてプロットされている。主なプールは典型的には分画７〜１２に及んでいるが、純度は、分画選択を狭くすることによって上げることができる。
【実施例】
【００６２】
コリスチン塩基からのポリムキシン（ｐｏｌｙｍｕｘｉｎ）Ｅ１の精製手順
実施例１−ＲＰ−ＨＰＬＣ精製；ミニ分取規模
機器：スチールカラム １０×２５０ｍｍ（φ＝１０ｍｍ）
Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００ Ｐｒｅｐ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｙｓｔｅｍ
Ｗａｔｅｒｓ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
樹脂：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ：１１０２３．
流量：２．２２ｍｌ／分（３００×７００ｍｍへのスケールアップ時は約２Ｌ／分）
λ：２３０ｎｍ
ＡＵＦＳ：２（検出器感度 ほぼ最低レベル）
Ａ緩衝液：Ｍｉｌｉ−Ｑ水中の０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１２％エタノール（９６％）
適用溶液：５酸当量のＣＨ３ＣＯＯＨ 約２，５ミリモル 約０，１５ｍｌの１００％ＣＨ３ＣＯＯＨ（１７Ｍ）の添加による０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１５ｍｌの２４％エタノール（９６％からの）に溶解されたコリスチン塩基、６００ｍｇ 約０，５ミリモル；２ＭのＮａＯＨでｐＨ＝７．５に調整された；溶液は膜濾過される（０．４５μｍ）
１）カラムの平衡：Ａ緩衝液で平衡にされる
２）適用：供給管を通して酢酸コリスチン溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を２．２２ｍｌ／分で適用し、これに１ｍｌのＡ緩衝液が続く
３）溶出：カラムをＡ緩衝液で直ちに溶出し、溶出液を１ｍｌ分画 約２．２２ｍｌにて集める。
【００６３】
４）カラムの洗浄：５ｍｌの９６％エタノールを適用し、これに吸収がゼロレベルまで低下してしまうまでＡ緩衝液が続く
５）ＨＰＬＣ分析：Ｅ１の面積が２０〜３０×１０６ＡＵに達するまで試料を希釈する；高コリスチン標準は典型的には２０×１０６ＡＵに達する；Ｃｏｌｉｓｔｉｎ ＮｏｖａＳを用いて試料を分析する（３０分ラン）。
実施例２−ＲＰ−ＨＰＬＣ精製；パイロット規模：
機器：スチールカラム ５０×８３０ｍｍ（φ＝５０ｍｍ）、「Ｄａｎ−プロセス」
Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００ Ｐｒｅｐ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｙｓｔｅｍ
Ｗａｔｅｒｓ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
樹脂：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ：１１０２３、１Ｋｇ
流量：６５ｍｌ／分（３００×７００ｍｍへのスケールアップ時は約２Ｌ／分）
λ：２３０ｎｍ
ＡＵＦＳ：２（検出器感度 ほぼ最低レベル）
Ａ緩衝液：Ｍｉｌｉ−Ｑ水中の０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１２％エタノール（９６％
）
適用溶液：コリスチン塩基、５０ｇ約４２ミリモル（そのままで）を、５．８３酸当量のＣＨ３ＣＯＯＨ 約２４５ミリモル 約１４，５ｍｌの１００％ＣＨ３ＣＯＯＨ（１７Ｍ）の添加による１０００ｍｌの２４％エタノール（９６％）に溶解させる；ｐＨを２ＭのＮａＯＨでｐＨ＝７．５に調整する；溶液を、フィルター助剤としてＣｅｌｉｔｅを使用して膜濾過する（０．４５）
イオン強度：４〜６ｍＳ／ｃｍ
１）カラムの平衡：Ａ緩衝液で平衡させる
２）適用：酢酸コリスチン溶液（４８ｍｇ／ｍｌ）を１４分の間６５ｍｌ／分で適用し、引き続きＡ緩衝液を０．１分の間約４３．５ｇ適用する
３）溶出：カラムをＡ緩衝液で、吸収が漸近線０．０１０Ｖ±１０ｍＶに降下してしまうまで溶出し、溶出液を３分間で約５８５ｍｌ、１８分画に集める
４）カラムの洗浄：２４％エタノールと５０％の１，２−プロパンジオールとの混合物２００ｍｌ（５０ｍｌ／分で４分）を適用し、これに吸収がゼロレベルまで低下してしまうまでＡ緩衝液が続く
５）ＨＰＬＣ分析：Ｅ１の面積が２０〜３０×１０６ＡＵに達するまで試料を希釈する（５×）；高コリスチン標準は典型的には２０×１０６ＡＵに達する；Ｃｏｌｉｓｔｉｎ
ＮｏｖａＳを用いて試料を分析する（３０分ラン）。
実施例３−全精製および最終ハンドリング；大規模
硫酸コリスチンモノ成分（ポリミキシンＥ１）は発酵産物であり、それは、その初登場が発酵したブロス中であることを暗示する。ポリミキシンＥ１を、多種多様な不純物と１リットル当たりたったの２、３グラムのポリミキシンＥ１および関連物質とを含有するブロスから回収し、精製する。
【００６４】
発酵ブロスからの回収は、コリスチン（ポリミキシンＥ１）および関連物質の沈澱と遠心分離による一次分離とを含む。二次精製は、逆相クロマトグラフィーおよび沈澱からなり、ポリミキシンＥ１に関してより純粋な生成物をもたらす。硫酸コリスチンモノ成分生成物中に存在する関連物質および不純物は、主として共発酵物質である。
【００６５】
コリスチンの発酵中に、構造上関連した成分の複雑な混合物が、各バシラス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）株に特有の比で生成する。例えば、
− たとえばポリミキシンＥ１（６−メチルオクタン酸の）か、ポリミキシンＥ２（７−メチルオクタン酸の）かのどちらかを生み出す、脂肪酸鎖の変化であり、
− 分子中のアミノ酸の置換、たとえばコリスチン中のＤ−ロイシンがＤ−フェニルアラニンで置き換えられる場合には、関連抗生物質ポリミキシンＢの生成である。ポリミキシンＥ１中のＬ−ロイシンがイソロイシンで置き換えられる場合には、ポリミキシンＥ１−イソロイシンが生成される。
分取ＨＰＬＣによる精製
次の緩衝液を調製する：
緩衝液Ｉ：１．６〜２Ｍエタノールおよび０．１〜０．１５Ｍ酢酸。この緩衝液を、使用直前に０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
緩衝液ＩＩ：約６．８Ｍの１，２−プロパンジオール、約４Ｍエタノールおよび約０．１Ｍ酢酸。この緩衝液を、使用直前に０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
【００６６】
約４８リットルの容積のＨＰＬＣカラム（直径３０ｃｍ）を、約４０リットルの緩衝液Ｉと平衡させる。流量は０．８〜１．２ ｌ／分である（同じ流量をすべてのＨＰＬＣ工程について用いる）。カラムを、約８リットルの緩衝液ＩＩ、引き続き約５０リットルの緩衝液ＩでまたはＵＶ信号が基線に戻るまで再生する。
【００６７】
真空乾燥したコリスチン塩基バッチ、１０００〜１５００ｇを秤量し、２０〜３０リッ
トルの４Ｍエタノールに懸濁させる。この懸濁液を、３０分間撹拌しながら０．３Ｍ酢酸を加えることによって溶解させる。ｐＨを水酸化ナトリウムで約７．５に調整し、この溶液を膜フィルター、０．４５μｍを通して濾過する。酢酸コリスチン溶液をＨＰＬＣカラムに通し、樹脂に結合させる。ＨＰＬＣカラムを約１６０リットルの緩衝液Ｉで溶出する。溶出液を分画にて集める。あらかじめ設定した規格に適合する分画を集め、一方分画の残りを捨てる。ポリミキシンＥ１に関して少なくとも９２％の純度のバッチを分画からプールする。ポリミキシンＥ１の濃縮および過剰のエタノールの除去を逆浸透によって行う。プールを約５０ｇ／ｌに濃縮し、その後ＤＩ水（約８容積）で透析する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による精製
次の緩衝液を調製する：
較正緩衝液：約２００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨを希アンモニアで約７に調整する溶出緩衝液：約２００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨを酢酸で約３．７に調整する
約９０リットルの容積のＨＩＣカラム（直径３５ｃｍ）を、２５０リットルの較正緩衝液、流量約１．７ ｌ／分、引き続き約２００リットルの溶出緩衝液、流量約１．０ ｌ／分で平衡させる。
【００６８】
逆浸透からの酢酸コリスチン溶液中の塩含有率を、（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えることによって約２００ｍＭに調整し、ｐＨを希アンモニアで約７に調整する。酢酸コリスチン溶液の濃度は１５〜２０ｇ／ｌである。この溶液を流量９５０〜１０５０ｍｌ／分でＨＩＣカラムに通す。溶出は床容積の１０倍で進行する。溶出液分画の収集はＰＬＣによって自動的に行われる。試料を各分画から抜き出し、分析する。あらかじめ設定した規格に適合する分画をプールし、ポリミキシンＥ１に関して９４〜９８％の純度のバッチをもたらす。ポリミキシンＥ１の濃縮および硫酸アンモニウムの除去を、１０〜２０ｇ／ｌの濃度まで限外濾過によって行う。
コリスチン塩基モノ成分の沈澱
この溶液をＤＩ水で１０ｇ／ｌに希釈し、それが均質になるまで撹拌する。ｐＨを水酸化ナトリウムで９．６〜９．８に調整し、撹拌を続行し、その間にコリスチン塩基モノ成分が沈澱する。この沈澱をフィルタープレス上での濾過によって回収する。濾過が完了したとき、ケーキを約８００リットルのＤＩ水で洗浄し、ＤＩ水を空気で置き換える、コリスチンモノ成分ケーキをフィルタープレスから取り出し、冷凍機に貯蔵する。
硫酸コリスチンモノ成分への変換
コリスチン塩基モノ成分を、撹拌しながらＤＩ水に懸濁させ、溶解させる。ｐＨを希硫酸で５．０に調整する。この溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
凍結乾燥、ミリングおよび貯蔵
濾過した溶液をステンレススチール冷凍乾燥トレーに満たし、範囲−２５℃→＋４５℃のＰＩＣ制御温度分布を用いて約７０時間凍結乾燥させる。乾燥品を凍結乾燥機から取り出し、所望の粒子分布を得るためにミルにかける。
分析ＨＰＬＣ法
方法１：発酵からコリスチン塩基までの製造過程管理のためのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ６０００Ａ／５１０
注入器：ＷＩＳＰ ７１２ Ａ
検出器：Ｍｏｄｅｌ ４４１
プレフィルター：Ｇｕａｒｄ Ｐａｋ、Ｒｅｓｏｌｖｅ Ｃ１８（除外してもよい）
カラム：Ｒｅｓｏｌｖｅ Ｃ１８、１０×８．５ミクロンまたはＮｏｖａ−Ｐａｋ、４ミクロン
カラム付属品：ＲＣＭ ８×１０
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
方法：定組成法
移動相：
緩衝液：硫酸ナトリウム十水和物、１６．１ｇ（０．０５Ｍ）濃度、酢酸、０．５６ｍｌ（０．０１Ｍ）トリエチルアミン ２０ｍｌ（０．１５Ｍ）、水で１０００ｍｌにする。ｐＨをリン酸で２．５に調整する。
【００６９】
代わりの緩衝液：硫酸ナトリウム ０．０４Ｍ、メタンスルホン酸 ０．５６Ｍ、トリエチルアミン ０．０８７Ｍ、ｐＨを３．０に。
使用前に、アセトニトリル、１７０ｇを緩衝液に溶解させて１０００ｍｌにする。
【００７０】
この溶液をヘリウムで１５分間脱気する。
アッセイ手順：
流量：１．５ｍｌ／分、あるいは１．０ｍｌ／分。
【００７１】
温度：周囲温度。
注入量：２０マイクロＬ、あるいは２５。
検出：２１４ｎｍ、０．１ ＡＵＦＳまたは１．０ ＡＵＦＳ。
【００７２】
ランニング時間：３０分。
標準品：１ｍｇ／ｍｌにするために水に溶解された、硫酸コリスチンの基準標準品
標準品：コリスチン塩基、０．１Ｍ塩酸中１．０ｍｇ／ｍｌ
分析試料：０．５〜１ｍｇ／ｍｌを含有するように希釈する。希釈剤：３％リン酸、４０ｍｌ、およびアセトニトリル、６０ｍｌ。濁っている場合は遠心分離。
方法２：最終バルク製品までのコリスチン塩基についてのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ５１０
注入器：７１７プラス自動サンプラー
検出器：４９０Ｅ
プレフィルター：Ｇｕａｒｄ Ｐａｋ、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８
カラム：Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８、６０Å、４μｍ、１５０×４．６ｍｍ
カラムオーブン：Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
Ｍｏｄｅｌ ７９５５
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
試薬：
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
トリエチルアミン、ＨＰＬＣグレード
メタンスルホン酸、≧９９％
Ｍｉｌｉ−Ｑ水
緩衝液：硫酸ナトリウム、無水、２８．４ｇ（０．１０Ｍ）、トリエチルアミン １４．０ｍｌ（０．５５Ｍ）、メタンスルホン酸 １０．０ｍｌ（０．０６Ｍ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２０００ｍｌにする。
【００７３】
緩衝液を、０．４５μｍフィルターを通して真空濾過する。
Ａ溶出液：５０％緩衝液、３５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１５％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
【００７４】
Ｂ溶出液：５０％緩衝液、２０％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、３０％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
試料調製：
酢酸コリスチン：０．０５Ｍ酢酸中１〜２ｇ／ｌ。３０分間撹拌し、０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過する。
標準品：
２つの工場内標準品、高活性（２０００μｇ／ｍｇ）の１つおよび低活性（４００μｇ／ｍｇ）の１つを調製する。
【００７５】
アッセイ手順：
流量：０．８ｍｌ／分
カラムの温度：２５℃
検出：２１４ｎｍ
時定数：１．０秒
ＡＵＦＳ：１．０００ＡＵ
Ａｕｔｏ ｚｅｒｏ：オン
Ｗｉｓｐ温度：２５℃
注入量：２０μｌ／ラン
グラジエントプログラム：
【００７６】
【表１】
【００７７】
溶出液Ａをブラインドとして使用し、標準品および試料から差し引く。
方法３：硫酸コリスチンモノ成分についてのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ５１０
注入器：７１７プラス自動サンプラー
検出器：４９０Ｅ
カラム：Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８、６０Å、４μｍ、２５０×４，６ｍｍ
カラムオーブン：Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
Ｍｏｄｅｌ ７９５５
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
試薬：
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード
メタンスルホン酸、≧９９％
トリエチルアミン、ＨＰＬＣグレード
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
緩衝液：硫酸ナトリウム、無水、２８．４ｇ（０．１０Ｍ）、トリエチルアミン １４．０ｍｌ（０．５５Ｍ）、メタンスルホン酸 １０．０ｍｌ（０．０６Ｍ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２０００ｍｌにする。
【００７８】
緩衝液を、０．４５μｍフィルターを通して真空濾過する。
Ａ溶出液：５０％緩衝液、３５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１５％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
【００７９】
Ｂ溶出液：５０％緩衝液、２０％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、３０％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
試料調製：
硫酸コリスチンモノ成分：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中２．８ｍｇ／ｍｌ。１５分間撹拌し、０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過する。
【００８０】
アッセイ手順：
流量：１．０ｍｌ／分
検出波長：２１４ｎｍ
カラム温度：２５℃
注入量：４０μｌ
オートサンプラー温度：２５℃
グラジエントプログラム：
【００８１】
【表２】
【００８２】
参考文献
１）Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｋ．（１９６３）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｌｏｓｔｉｎ：ＩＩＩ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｌｉｓｔｉｎ Ａ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：４１２−４１８
２）Ｅｌｖｅｒｄａｍ，Ｉ．，Ｐ．Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｅ．Ｌｕｎｄ（１９８１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ ａｎｄ Ｅ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（２１８）６５３−６６１
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性菌、特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）における増大する多剤耐性は重大問題を提起している。制限された治療選択肢は、感染病臨床医および微生物学者にコリスチン（ポリミキシンＥとも呼ばれる）、ポリミキシンＢと似ているが、それと同一ではないポリミキシン抗生物質の臨床応用を再評価するように強いている。コリスチンは、そのより幅広い治療指数のためにポリミキシンＢよりも明らかな利点を有する可能性がある。
【０００３】
コリスチンは、バチルス・ポリミキサ・バル．コリスチヌス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ｖａｒ．ｃｏｌｉｓｔｉｎｕｓ）から１９４７年に初めて単離され、発酵によって産生されるポリペプチドの混合物からなる。主成分はポリミキシンＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ１−Ｉｌｅである（図１）。
【０００４】
商業的には、コリスチンは、腸除染のために経口で、皮膚感染症のために粉末として局所的に使用される、硫酸コリスチンとして、ならびに非経口でおよび吸入によって使用される、コリスチメタン酸ナトリウムとして世に出ている。コリスチメタン酸ナトリウムは毒性が少なく、そして望ましくない副作用がコリスチンより少ないことが分かっているが、効能もまた弱い（Ｆａｌａｇａｓ ａｎｄ ＫａｓｉｏｋｏｕによるＣｒｉｔｉｃａｌ
Ｃａｒｅ ２００６，１０：Ｒ２７（ｄｏｉ：１０．１１８６／ｃｃ３９９５を参照されたい）。
【０００５】
硫酸コリスチンは多くの場合、軟膏、耳科用懸濁液ならびに耳科用液および点眼剤に調合される。硫酸コリスチンはまた、腸感染症を治療するために、または結腸細菌叢を抑えるために懸濁液または錠剤として経口で投与される。
【０００６】
コリスチメタン酸ナトリウムは、包嚢性線維症患者において緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症を治療するために使用されてもよいコリスチンの半合成プロドラッグであり、それは多剤耐性アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）感染症を治療するために最近使われるようになってきた。コリスチメタン酸ナトリウムはまた、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）髄膜炎／脳室炎において髄腔内におよび脳室内に投与されている。コリスチメタン酸ナトリウムは、水溶液中で容易に加水分解されて様々なメタンスルホン化誘導体になり、分析するのが非常に困難である。
【０００７】
コリスチンは５０数年前に臨床診療へ導入されたので、その特性は、たとえば薬理学、毒物学、不純物の内容などに関連した特有の要件で、決して最新薬ほどには完全に文書に記録されなかった。
【０００８】
このため、商業的に入手可能なコリスチン製品は、主成分ポリミキシンＥ１に加えて、大部分は発酵プロセスに由来する、多くの関連の活性および不活性の物質／不純物を含有する。コリスチンの典型的なＨＰＬＣクロマトグラムが図２に示される。
【０００９】
市販コリスチンの主成分、ポリミキシンＥ１は、典型的には乾燥製品の約６０％を構成する。コリスチン製品中の関連物質の幾つかは特性化されているが（図１）、ほとんどの不純物は依然として知られていない。硫酸コリスチンの最小効能は、ＵＳＰ（米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ））によって規定されているように「５００μｇ／ｍｇ以上」であるが、各成分の明確な抗菌活性はほとんど知られていない。
【００１０】
この製品は５０年を超える間使用されてきたが、コリスチンの標準化投薬も、薬理学または薬物動態学に関して公表された詳細な試行もまったくない。ほとんどの感染症に対する最適投薬は、それ故知られていない。同様に、各製剤に対する推奨「最大」用量は異なる。各国は、コリスチンの異なるジェネリック製剤を有し、推奨用量は製造業者に依存するであろう。
【００１１】
硫酸コリスチンおよびコリスチメタン酸ナトリウムは両方とも静脈内におよびエアゾールとして投与されてもよいが、投薬は複雑である。幾つかの製造業者からのコリスチメタン酸ナトリウムは、国際単位で処方されているが、他の製造業者からの同じ製品は、コリスチン塩基のミリグラム単位で処方されている。用量の規制または標準化がこのように完全に不在であることにより、静脈内コリスチン投薬はあらゆる医師にとって悪夢となる。
【００１２】
静脈内治療で記載される主毒性は、肝臓毒性（肝臓への損傷）および神経毒性（神経への損傷）であるが、これは、以前に投与された非常に高い用量が、現在あらゆる製造業者によって推奨されている用量よりはるかに高く、そして腎疾患に対して調整がまったく行われなかったことを反映している可能性がある。噴霧治療で記載されている主毒性は気管支痙攣である。
【００１３】
支持データの不在下に、コリスチンの毒性の幾つかは現在の市販製品中に存在する関連物質および不純物のせいである可能性があると推測し得る。そしてさらに、「不純な」コリスチンを出発原料として使用してコリスチメタン酸塩プロドラッグを合成するときに、各関連物質および不純物は、幾つかのメタンスルホン酸塩誘導体の基盤を形成し、それによって非常に複雑な最終製品を生み出すであろうが−個々の物質それぞれの毒物学的特性は不明である。
【００１４】
上記の毒物学的および薬理学的考察に基づき、「モノ成分」の各種のコリスチンを医療目的のために使用することに大きな利点が見出され得る。かかるモノ成分コリスチンは、非常に高い割合（現在の６０％に比べて、＞９０％）の主成分ポリミキシンＥ１を含有し、すべての主な不純物が同定され、特性化された状態であろう。
【００１５】
モノ成分コリスチンは、幾つかの利点：
１）主成分（ＰＥ１）、関連物質および不純物の毒物学的寄与を明らかにする可能性
２）新たなおよびより正確な薬理学的なおよび薬物動態学的な研究に適した製品
３）様々な不明確な物質を生み出すことなく、明確な誘導体、たとえばコリスチメタン酸塩を合成する可能性
４）規制手順を簡略化する、コリスチンおよびコリスチメタン酸塩の両方についてのより良好なおよびより正確な分析方法を開発する可能性
５）明らかな薬理学的および毒物学的データに基づく一義的な投薬推奨
６）大きい需要のある、「現代的」抗生物質へのコリスチンのアップグレード
を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
モノ成分コリスチンの工業的に拡大可能な製造方法は、特許文献にもまたはパブリックドメインの他のどこにも記載されていないので、かかる製品の製造方法を開発することが本発明者の目標であった。
【００１７】
第２のより長期の目標は、以前のポリミキシン群の研究と比較するために、精製ＰＥ１をインビトロおよびインビボ有効性の新たな研究にならびに毒物学的研究にかけることであろう。かかるランダム化されかつ管理された試行は、ポリミキシンの有効性および安全性に関する様々な問題（ＭｉｃｈｏｌｏｐｏｕｌｏｓおよびＦａｌａｇａｓによる、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．２００８ Ａｐｒ；２４（２）：３７７−９１）をさらに明らかにするために早急に必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、コリスチン成分、特に主成分、ポリミキシンＥ１の精製方法に関する。
本発明は、コリスチンの主成分であるポリミキシンＥ１の実質的に純粋な（９０〜９８％純度）、コリスチンモノ成分と呼ばれる製剤の製造方法に関する。
【００１９】
本方法は、低毒性の溶媒を用いる簡単なクロマトグラフ法である。本方法は、ポリミキシンＥ１の精製を９０％超の純度まで可能にする、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、引き続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む。
【００２０】
本方法は、
・ 酢酸および高（４Ｍ）エタノール濃度中のコリスチン塩基をＲＰカラムに装填する工程
・ 低（１．６〜２Ｍ）エタノール濃度で溶出する工程
によって特徴づけられる。
【００２１】
意外にも、本方法は、他の主なコリスチン成分からポリミキシンＥ１を効率的に分離するために用いることができる。
好適なＲＰ材料の特定を含む作業は、１０×２５０ｍｍスチールカラムでの実験室規模で行われた。
【００２２】
Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、１５μｍ（Ｃ８）が、実験室規模でのコリスチン塩基からのＰＥ１の精製のための好適な樹脂であることが分かり、この実験室方法は、１グラムから５０×８５０ｍｍスチールカラムでの５０グラムレベルへとスケールアップされた。
【００２３】
コリスチン塩基が２４％（４Ｍ）エタノールおよび０．１Ｍ酢酸に溶解され、そしてポリミキシンＥ分画へと分離される方法が開発された。主成分、ＰＥ１は、６０％の典型的な回収率および９４〜９８％の相対クロマトグラフ純度で単離された。
【００２４】
欧州薬局方（ＥＰ）では、硫酸コリスチンのバッチ／ロットの効能は、「そのままで」ＨＰＬＣによって測定される、ポリミキシン因子ＰＥ１、ＰＥ２、ＰＥ３、ＰＥ１−ＩｌｅおよびＰＥ１−７ＭＯＡの合計の％含有率と定義されている。これらの因子の全体効能は７７．０％以上を構成するべきである。さらに、ＥＰは、次のように具体的な因子の最大限度（ＮＭＴ（ｎｏｔ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）；以下）を明確に提示している：ＰＥ１−Ｉｌｅ（ＮＭＴ １０％）、ＰＥ１−７ＭＯＡ（ＮＭＴ １０％）、ＰＥ３（ＮＭＴ １０％）、および主要不純物 ＮＭＴ ４％。
【００２５】
記載される精製方法を用いて、最終製品は次のような典型的な組成を有する：ＰＥ１（
９４〜９８％）、ＰＥ２（０〜０．１）、ＰＥ３（０．０）、ＰＥ１−Ｉｌｅ（０．２〜１．０％）、ＰＥ１−７ＭＯＡ（０．５〜２．０％）、および総残存不純物 ０．５〜２．０％。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】硫酸コリスチンの主成分、硫酸ポリミキシンＥ１および関連物質の分子構造。
【図２】コリスチン欧州薬局方標準品のＨＰＬＣクロマトグラム
【図３】コリスチン塩基の精製中の分画番号の関数としての相対クロマトグラフ純度を示すグラフ（グラフ中のｆ１−Ｅ１およびｆ２−Ｅ１は、本出願の説明部分ではｆ１とまとめて言われ；ｅＥ１はｅ１／ｅ２と等しく、ｅｅＥ１はｅ３と等しく、一方ｅｅｅ…は微量の未知不純物の合計である）。
【図４】コリスチン塩基の精製中の分画番号の関数としての様々な成分のピーク面積を示すグラフ（グラフ中のｆ１−Ｅ１およびｆ２−Ｅ１は、本出願の明細書部分ではｆ１とまとめて言われ；ｅＥ１はｅ１／ｅ２と等しく、ｅｅＥ１はｅ３と等しく、一方ｅｅｅ…は微量の未知不純物の合計である）。
【図５】主な不純物と一緒のコリスチンモノ成分（ＰＥ１）のＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
「コリスチン」は、主成分がポリミキシンＥ１またはその塩である抗生物質ペプチド成分のあらゆる混合物をカバーすることが意図される。
「ポリミキシンＥ１」は、以前はコリスチンＡと称された化合物、ならびに
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓによって７７２２−４４−３と指定された化合物、
ならびに
Ｎ２−（６−メチル−１−オキソオクチル）−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｄ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−２，４−ジアミノブタノイル−Ｌ−スレオニン環状（１０−４）−ペプチド、
ならびに
コリスチンＩＶ
を包含することが意図される。
【００２８】
「コリスチン塩基」は、３０〜７０％のポリミキシンＥ１を含むあらゆるコリスチンを包含することが意図される。
「硫酸コリスチン」は、コリスチンのあらゆる硫酸塩を包含することが意図される。
【００２９】
「コリスチメタン酸塩」は、コリスチンのあらゆるメタンスルホン化誘導体を包含することが意図される。
「組成物」は、３つ以上の異なる化合物を含むあらゆる混合物、たとえば２つの活性医薬原料の混合物、または１つの活性医薬原料と１つ以上の医薬賦形剤との混合物である。
【００３０】
本出願に用いられる用語「成分」または「いくつかの成分」は、組成物中の具体的な化合物を意味している。したがって、「微量の成分」は組成物中に比較的少量で見いだされる化合物である。
【００３１】
「医薬組成物」は、インビボで使用するのに好適なあらゆる組成物である。かかる組成物はしたがって、皮膚に、皮下に、静脈内に、非経口で、経口でなどで投与することがで
きる。
【００３２】
「分離」は、所望の化合物が別の化合物から（分析上または分取上）分割されるあらゆる方法である。
「精製」は、所望の化合物の濃度が上げられるあらゆる分離方法である。
【００３３】
「クロマトグラフィー」は、固定相と移動相とを含むあらゆる精製技法である。
「固定相」は、化合物を保持することができるリガンドを含むあらゆる表面である。
「リガンド」は、化合物の結合が起こる、固定相の部分である。
【００３４】
「移動相」は、一定の方向に固定相を通ってまたは固定相に沿って浸透することができるあらゆる流体、溶媒、液体または混合物である。
「逆相クロマトグラフィー」は、より極性のまたは帯電した成分が、極性の少ない成分より先に溶出されるあらゆるクロマトグラフィーである。
【００３５】
「疎水性相互作用クロマトグラフィー」は、固定相の非極性リガンドと非極性化合物または化合物の非極性部分との間の相互作用に基づくあらゆるクロマトグラフィーである。
「高エタノール濃度」は、容積の２０％以上、典型的には２０％〜３０％のエタノール濃度を意味する。
【００３６】
「低エタノール濃度」は、容積の２０％未満、典型的には１０％〜１５％のエタノール濃度を意味する。
「％ｖ／ｖ」は容積百分率を意味する。
【００３７】
市販のコリスチン塩基は、ポリミキシンＥ１、ポリミキシンＥ２、ポリミキシンＥ３、およびポリミキシンＥ１−イソロイシンを含む、多くの密接に関係したデカペプチド−脂肪酸アミドの混合物である（図１）。
【００３８】
コリスチン塩基から主成分ポリミキシンＥ１（ＰＥ１）を単離したいという熱望は、高い相対クロマトグラフ純度（＞９０％）のＰＥ１の単離、および取得のために逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ法が、好適であるかどうかの研究につながった。
【００３９】
文献はＲＰ分離法をほんのわずかしか提供せず、使用される主な有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールである。これらの溶媒は毒性があり、パイロットおよび大規模生産では回避されるべきである。しかし、０〜６０％のエタノールグラジエントを用いる硫酸コリスチンでのマイクログラムレベルのＣ１８−ＨＰＬＣ分離試行は、ポリミキシンＥ１用の工業的に有用な精製方法のために比較的非毒性の溶媒エタノールを使用することが可能であるかもしれないことを全く意外にも示唆した。
【００４０】
出発原料、コリスチン塩基は、発酵および精製によって製造され、バルク物質硫酸コリスチンの製造における中間体である。出発原料は、バッチ間で数パーセント変動して、約６０％のＰＥ１を含有する。当初の目標は、９０％超の硫酸ポリミキシンＥ１の相対クロマトグラフ純度を達成することであった。これを目標として、様々なカラム材料が、エタノールをベースとする溶出系で選別された。
【００４１】
ポリミキシンＥ１（図１）は、極性のデカペプチド部分および非極性の脂肪酸部分のためにイオン性洗剤特質を有する。この分子は、６−メチル−オクタンアシル化線状トリペプチドに結合した環状ヘプタペプチドからなる。この分子は、１，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）の６つの部分を含有し、そのうちの１つが３つのペプチド結合に関与するので、それらの相当するアンモニア（ＮＨ４＋）基と平衡にある５つの第一級アミノ基が存在し、
分子の強い極性部分を構成する。
【００４２】
ＲＰ−樹脂とこの分子との間の分子相互作用は、脂肪酸部分とペプチド部分の非極性領域とで起こると予測される。
ＨＰＬＣ分画およびＨＰＣＬプールを監視するために、分析ＨＰＬＣ法が標準方法をベースとして開発された。改良された方法は、従来のＨＰＬＣ法を用いたときには目に見えなかった、ＰＥ１主ピーク下の少量の関連成分（ｆ１、ｅ１、ｅ２）を明らかに見えるようにした。
実験の部
分取ＨＰＬＣ
１０×２５０カラム：ミリグラム規模でカラム材料を選別するために、スチールカラム１０×２５０ｍｍを使用した。このカラムに、９６％エタノールに懸濁された様々な被験樹脂を充填した。
【００４３】
５０×８３０カラム：グラム規模での分取精製のために、５０×８５０ｍｍスチールカラムを以下に記載されるように使用した。選択されたカラム材料、約１ｋｇのＭｅｒｃｋ
ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ６０ ＲＰ ｓｅｌｅｃｔ Ｂ（１５μｍ）を９６％エタノールに懸濁させ、カラムに充填した。上部フランジを取り付け、すべての過剰のエタノールが除去されるまでピストンを５０バールで上向きに押し進めた。１ｍｌの０．１ｍｇ／ｍｌのヨウ化カリウム溶液を適用することによってカラムを試験し、吸収を２２７ｎｍ、ＡＵＦＳ＝０．０５および流量５５．５ｍｌ／分で測定した。記録されたピークは、満足のいく対称的な狭いガウス（Ｇａｕｓｓ）曲線であった。
【００４４】
分取ＨＰＬＣシステムは、
カラム：Ｄａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ａ／Ｓによって生み出される動的軸圧縮ありの１０×２５０ｍｍステンレススチールＭｅｒｃｋカラムおよび５０×８５０ｍｍステンレススチールカラム
ポンプ：低圧側に混合バルブ付きの４つの異なる溶媒入口を持った、０．５〜１５０ｍｌ／分の流量間隔のＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４８６調節可能な吸光度検出器（Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
積分器：Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
分画収集器：Ｗａｔｅｒｓ分画収集器（Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）
からなった。
【００４５】
溶出液の吸光度は、酢酸についてカット−オフされる、２３０ｎｍで検出した。より短い波長では、溶出液は余りにも多い干渉を示した。ミリグラム規模での分画は２５ｍｌ試験管に集め、一方グラム規模での分画は２５０ｍｌのＢｌｕｅｃａｐボトルに集めた。
【００４６】
各ＨＰＬＣラン後の１０×２５０ｍｍおよび５０×８５０ｍｍカラムの再生は、０．１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中に２４％エタノールおよび５０％の１，２−プロピレングリコールを含有する混合物を使用した。時々、高い逆圧が５０×８５０ｍｍカラムで観察され、そのカラムはそのとき充填し直すかまたは圧力が正常になるまで９６％エタノールでフラッシュした。
分析ＨＰＬＣ：
用いられるカラムは、移動相としてアセトニトリルを使ってＮｏｖａｐａｋ ４，６×１５０、４μｍ、Ｃ１８であった。ＣＨ３ＣＮ溶液の濃度を２１％から（１０分の定組成ラン後に）３０％まで５分の時間間隔の間に上げた。カラムは温度自動調節しなかったが
、周囲温度（２３±２℃）でランを行った。
【００４７】
分析ＨＰＬＣシステムは、
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａｐａｋ ４，６×１５０、４μ Ｃ１８および等価の４，６×２５０カラム
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓポンプ制御モジュール（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｕｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｍｏｄｕｌｅ）付き２ｐｓｃ．Ｗａｔｅｒｓ ５１０
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４９０ Ｅプログラム可能な多波長検出器（Ｗａｔｅｒｓ ４９０ Ｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｍｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
分画収集器：Ｗａｔｅｒｓ ７１７ プラス オートサンプラー（Ｗａｔｅｒｓ ７１７
ｐｌｕｓ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）
からなった。
【００４８】
このシステムは、ＷａｔｅｒｓソフトウェアＭｉｌｌｅｎｉｕｍによって制御された。試験される樹脂の総覧：
１）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．９３０３ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８、２５〜４０μｍ、バッチ：Ｌ ２７５７０３ ６１４。
【００４９】
２）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．９３２４ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８、２５〜４０μｍ、バッチ：Ｌ ２４０１２４ ５４１。
３）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１１０２３ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、１５μｍ、（Ｃ８）、バッチ：Ｌ １３９９２３ ６３３．
４）Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１５０３８５ Ｈｉｂａｒ Ｆｅｒｔｉｇｓａｅｕｌｅ ＲＴ
ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ、ＲＰ−１８、１５μｍ、Ｃａｔ．５００１４。
【００５０】
５）Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ Ｋｒｏｍａｓｉｌ−１００Å、Ｃ８、１６μｍ、バッチ：ＤＴ００２６。
６）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１ Ｓ、３５μｍ、Ｌｏｔ
Ｎｏ．２３７７０３１９。
【００５１】
７）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｎｏ．２２２２７ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐ Ｅｔｈｅｒ、３５μｍ、弱疎水性
８）ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｎｏ．２２２２５ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐ Ｂｕｔｙｌ、３５μｍ、強疎水性
１０×２５０カラム試行のための化学薬品：
硫酸コリスチン、バッチ：Ａ４６６０３１４、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
コリスチン塩基、バッチ：Ａ１５５１７０１、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
エタノール、９６％、「Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ」、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
メタノール、Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｏｌｖ ｎｏ．６０１８
ジメチルスルホキシド、Ｍｅｒｃｋ Ｕｖａｓｏｌ Ｎｏ．２９５０
１，２−プロパンジオール ｒｅｉｎｓｔ、Ｍｅｒｃｋ ｎｏ．７４７８
２−プロパノール、ＬｉＣｈｒｏｓｏｌｖグラジエントグレード、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１０４０
酢酸、１００％ Ｇ．Ｒ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６３
１−メチルピロリドン−（２）ｚ．ｓ．、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．８０６０７２
トリエチルアミン、Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｏ．２５１０８
テトラヒドロフラン、Ｆｌｕｋａ Ｎｏ．８７３６７
酢酸アンモニウム ｐ．ａ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１１１６
硫酸アンモニウム ｐ．ａ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１２１７
硫酸９８％ｐ．ａ．
水酸化ナトリウムペレット、ＧＲ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６４９８
Ｍｉｌｉ−Ｑ水、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｌａｂ．、Ｒ ＆ Ｄ、ＦＣＤ、Ａｘｅｌｌｉａ ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＤＫ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、タイプＨＶ膜フィルター、０，４５μｍ。
５０×８２５カラム試行のための化学薬品：
Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ製のエタノール ９６％および９９，９％
酢酸、１００％ Ｇ．Ｒ．Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６３
水酸化ナトリウムペレット、ＧＲ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．６４９８
ＮａＯＨ、２７％ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｐｔ．
水酸化カリウム、ＵＳＰ ＸＩＸ、Ｆｅｒａｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｎｏ．２０９０７
１０×２５０カラム試行：
次のクロマトグラフ樹脂は、樹脂への強い結合、顕著な尾引き、低いクロマトグラフ純度または低い回収率のいずれかのために、分離目的には不適当であることが分かった：ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１ Ｓ；ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐエーテル、３５μｍ、ＴｏｏｓｏＨａａｓ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＤ−Ｐブチル、３５μｍ；Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８、２５〜４０μｍ；Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｂａｒ Ｆｅｒｔｉｇｓａｅｕｌｅ ＲＴ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ、ＲＰ−１８、１５μｍ；Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ Ｋｒｏｍａｓｉｌ−１００Å、Ｃ８、１６μｍ
１１ｍｇの硫酸コリスチンを適用された、ｐＨ約３，５（５０ｍＭのＨＡｃ）で６０分の間に０％〜６０％のエタノールグラジエントでのＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８、２５〜４０μｍを使った１回目の１０×２５０カラム試行については、良好な収率で約９０％の相対クロマトグラフ純度（ＲＣＰ）が得られた。しかし、同じ条件で４５分の間に１０〜２５％エタノールグラジエントを適用することによってエタノール濃度を下げようと試みたとき、分離はまったく観察されず、顕著な尾引きが観察された。
【００５２】
ｐＨ＝２．５で５ｍＭのＮＨ４ＨＳＯ４での同様な試行は、カラムへの化合物の完全な結合をもたらした。この実験、および同様の実験は、選択された条件でのＰＥ１精製のためには、硫酸コリスチンよりもむしろ、コリスチン塩基が使用されるべきであることを強く示唆した。
【００５３】
１，２−プロピレングリコール（１，２−ＰＧ）をエタノールの一部の代用として、たとえば２４％エタノールおよび２０％の１，２−ＰＧの濃度レベルで添加し、そして酢酸レベル（ｐＨ＝３）を約１％に上げた場合、これは、意外にも、７０％収率で約９０％のＲＣＰでＰＥ１生成物を与えた。
【００５４】
これらの初期実験に基づき、酢酸が樹脂（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８）と溶出液との間の化合物平衡にプラスの影響を及ぼすこと、そして硫酸コリスチンの代わりに希酢酸に溶解されたコリスチン塩基をむしろ使用すべきであることが結論づけられた。しかし、１，２−プロピレングリコール／エタノール混合物の使用は、このカラム材料で顕著な圧力降下をもたらし、この特定の樹脂および溶媒混合物はそれ故スケールアップのために不適当であると考えられた。
【００５５】
脂肪酸部分および非極性アミノ酸がカラム結合に関与するだけでなく、アミノ基およびアンモニウム基もまた関与することが明らかになった。
上記の実験は、幾つかの意外な結果、たとえばａ）ＥＨＳにやさしい溶媒エタノールがコリスチンの逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ分離のための溶出液として有用であること、およびｂ）分離は、さらなる精製のために硫酸コリスチンを使用する代わりに酢酸の存在下にコリスチン塩基で行うべきであることを与えた。樹脂ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８は有望な分離特性を示したが、それがスケールアップに好適であると分かったわけでない。
【００５６】
商業的に入手可能なクロマトグラフ媒体のリストは広範囲に及ぶが、徹底的な選別および選択によって我々は、Ｍｅｒｃｋ製の好適な候補、すなわちＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ １５μｍ（Ｃ８）を特定することに成功した。
【００５７】
０．１Ｍ酢酸中５〜２４％エタノールの直線的グラジエントの使用は、尾引きがほとんどない有望な分離を与えた。０．１Ｍ酢酸中（ｐＨ＝３）５〜１５％エタノールのグラジエントはうまくいくが、８５〜９０％ＰＥ１にすぎないＲＣＰであり、かつ低収率である。
【００５８】
逆エタノールグラジエント（すなわち、高濃度での適用およびより低濃度での溶出）を試してみたときに大きな飛躍的前進が実現した。以下のパラメータでの第１試行は、９０〜９５％ＰＥ１および約７０％収率でプールを与えることが判明した：
平衡：０，１Ｍ酢酸中５％エタノール
適用：０，１Ｍ酢酸中４ｍｌの３０％エタノールに溶解させた１１０ｍｇのコリスチン塩基
溶出液：６０℃の温度での０，１Ｍ酢酸中１５％エタノール
温度：４０℃
溶出液流量：２．２２ｍｌ／分
固相と溶出液との間のコリスチン成分の平衡をより速く達成させるために、より高い温度を選択したが、実験は、より高い温度が結果にいかなる著しい影響も及ぼさないことを示した。カラムオーブンおよび溶出液相の両方の温度をそれ故、プール純度および収率のいかなる有意な変化もなしに４０°／６０°から３５°／５０°に下げた。最後に、０．１Ｍ酢酸中５〜１５％エタノールグラジエントは３０°／４０°でランが実行されて良好な結果であり、逆グラジエントが相対クロマトグラフ純度、収率および尾引きプロフィールの大きいプラスの変化に実際に関与することを確認した。
【００５９】
修正された分析ＨＰＬＣ法が開発作業中に実行されたこと、ならびにこの新しい方法が以前には主なＥ１ピークに隠されていた、幾つかの関連物質、ｆ１およびｅ１／ｅ２を明らかに見えるようにしたことが指摘されるべきである。
【００６０】
関連物質ｆ１はＰＥ１ピークの前に溶出し、一方物質ｅ１／ｅ２はＰＥ１ピークの尾部に２つの、多かれ少なかれ分裂した最大部を持つ二重ピークとして溶出する。これらの２つの物質はＰＥ１から分離するのが特に困難であり、分取ＨＰＬＣ法の将来の最適化における精製課題を構成する。ＰＥ１と関連物質との分離が、ＨＰＬＣ分画の関数として成分の分布を示す略図で例示されている、特に図３および図４を参照されたい。
【００６１】
図３でポリミキシンＥ１の相対クロマトグラフ純度を、分画番号の関数として関連物質と比較する。ＰＥ１から分離するのが最も困難である関連物質はｅ１／ｅ２であり、一方Ｅ１−イソロイシン、ｆ１およびｅ３（ｅ１／ｅ２の後に溶出する）は除去するのがより容易である。図４は収率視点からの結果を示しており、ここでは、成分ピークの積分が分画番号の関数としてプロットされている。主なプールは典型的には分画７〜１２に及んでいるが、純度は、分画選択を狭くすることによって上げることができる。
【実施例】
【００６２】
コリスチン塩基からのポリムキシン（ｐｏｌｙｍｕｘｉｎ）Ｅ１の精製手順
実施例１−ＲＰ−ＨＰＬＣ精製；ミニ分取規模
機器：スチールカラム １０×２５０ｍｍ（φ＝１０ｍｍ）
Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００ Ｐｒｅｐ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｙｓｔｅｍ
Ｗａｔｅｒｓ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
樹脂：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ：１１０２３．
流量：２．２２ｍｌ／分（３００×７００ｍｍへのスケールアップ時は約２Ｌ／分）
λ：２３０ｎｍ
ＡＵＦＳ：２（検出器感度 ほぼ最低レベル）
Ａ緩衝液：Ｍｉｌｉ−Ｑ水中の０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１２％エタノール（９６％）
適用溶液：５酸当量のＣＨ３ＣＯＯＨ 約２，５ミリモル 約０，１５ｍｌの１００％ＣＨ３ＣＯＯＨ（１７Ｍ）の添加による０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１５ｍｌの２４％エタノール（９６％からの）に溶解されたコリスチン塩基、６００ｍｇ 約０，５ミリモル；２ＭのＮａＯＨでｐＨ＝７．５に調整された；溶液は膜濾過される（０．４５μｍ）
１）カラムの平衡：Ａ緩衝液で平衡にされる
２）適用：供給管を通して酢酸コリスチン溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を２．２２ｍｌ／分で適用し、これに１ｍｌのＡ緩衝液が続く
３）溶出：カラムをＡ緩衝液で直ちに溶出し、溶出液を１ｍｌ分画 約２．２２ｍｌにて集める。
【００６３】
４）カラムの洗浄：５ｍｌの９６％エタノールを適用し、これに吸収がゼロレベルまで低下してしまうまでＡ緩衝液が続く
５）ＨＰＬＣ分析：Ｅ１の面積が２０〜３０×１０６ＡＵに達するまで試料を希釈する；高コリスチン標準は典型的には２０×１０６ＡＵに達する；Ｃｏｌｉｓｔｉｎ ＮｏｖａＳを用いて試料を分析する（３０分ラン）。
実施例２−ＲＰ−ＨＰＬＣ精製；パイロット規模：
機器：スチールカラム ５０×８３０ｍｍ（φ＝５０ｍｍ）、「Ｄａｎ−プロセス」
Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００ Ｐｒｅｐ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｙｓｔｅｍ
Ｗａｔｅｒｓ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−２０００ Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
樹脂：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ、Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ：１１０２３、１Ｋｇ
流量：６５ｍｌ／分（３００×７００ｍｍへのスケールアップ時は約２Ｌ／分）
λ：２３０ｎｍ
ＡＵＦＳ：２（検出器感度 ほぼ最低レベル）
Ａ緩衝液：Ｍｉｌｉ−Ｑ水中の０．１０ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ中１２％エタノール（９６％
）
適用溶液：コリスチン塩基、５０ｇ約４２ミリモル（そのままで）を、５．８３酸当量のＣＨ３ＣＯＯＨ 約２４５ミリモル 約１４，５ｍｌの１００％ＣＨ３ＣＯＯＨ（１７Ｍ）の添加による１０００ｍｌの２４％エタノール（９６％）に溶解させる；ｐＨを２ＭのＮａＯＨでｐＨ＝７．５に調整する；溶液を、フィルター助剤としてＣｅｌｉｔｅを使用して膜濾過する（０．４５）
イオン強度：４〜６ｍＳ／ｃｍ
１）カラムの平衡：Ａ緩衝液で平衡させる
２）適用：酢酸コリスチン溶液（４８ｍｇ／ｍｌ）を１４分の間６５ｍｌ／分で適用し、引き続きＡ緩衝液を０．１分の間約４３．５ｇ適用する
３）溶出：カラムをＡ緩衝液で、吸収が漸近線０．０１０Ｖ±１０ｍＶに降下してしまうまで溶出し、溶出液を３分間で約５８５ｍｌ、１８分画に集める
４）カラムの洗浄：２４％エタノールと５０％の１，２−プロパンジオールとの混合物２００ｍｌ（５０ｍｌ／分で４分）を適用し、これに吸収がゼロレベルまで低下してしまうまでＡ緩衝液が続く
５）ＨＰＬＣ分析：Ｅ１の面積が２０〜３０×１０６ＡＵに達するまで試料を希釈する（５×）；高コリスチン標準は典型的には２０×１０６ＡＵに達する；Ｃｏｌｉｓｔｉｎ
ＮｏｖａＳを用いて試料を分析する（３０分ラン）。
実施例３−全精製および最終ハンドリング；大規模
硫酸コリスチンモノ成分（ポリミキシンＥ１）は発酵産物であり、それは、その初登場が発酵したブロス中であることを暗示する。ポリミキシンＥ１を、多種多様な不純物と１リットル当たりたったの２、３グラムのポリミキシンＥ１および関連物質とを含有するブロスから回収し、精製する。
【００６４】
発酵ブロスからの回収は、コリスチン（ポリミキシンＥ１）および関連物質の沈澱と遠心分離による一次分離とを含む。二次精製は、逆相クロマトグラフィーおよび沈澱からなり、ポリミキシンＥ１に関してより純粋な生成物をもたらす。硫酸コリスチンモノ成分生成物中に存在する関連物質および不純物は、主として共発酵物質である。
【００６５】
コリスチンの発酵中に、構造上関連した成分の複雑な混合物が、各バシラス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）株に特有の比で生成する。例えば、
− たとえばポリミキシンＥ１（６−メチルオクタン酸の）か、ポリミキシンＥ２（７−メチルオクタン酸の）かのどちらかを生み出す、脂肪酸鎖の変化であり、
− 分子中のアミノ酸の置換、たとえばコリスチン中のＤ−ロイシンがＤ−フェニルアラニンで置き換えられる場合には、関連抗生物質ポリミキシンＢの生成である。ポリミキシンＥ１中のＬ−ロイシンがイソロイシンで置き換えられる場合には、ポリミキシンＥ１−イソロイシンが生成される。
分取ＨＰＬＣによる精製
次の緩衝液を調製する：
緩衝液Ｉ：１．６〜２Ｍエタノールおよび０．１〜０．１５Ｍ酢酸。この緩衝液を、使用直前に０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
緩衝液ＩＩ：約６．８Ｍの１，２−プロパンジオール、約４Ｍエタノールおよび約０．１Ｍ酢酸。この緩衝液を、使用直前に０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
【００６６】
約４８リットルの容積のＨＰＬＣカラム（直径３０ｃｍ）を、約４０リットルの緩衝液Ｉと平衡させる。流量は０．８〜１．２ ｌ／分である（同じ流量をすべてのＨＰＬＣ工程について用いる）。カラムを、約８リットルの緩衝液ＩＩ、引き続き約５０リットルの緩衝液ＩでまたはＵＶ信号が基線に戻るまで再生する。
【００６７】
真空乾燥したコリスチン塩基バッチ、１０００〜１５００ｇを秤量し、２０〜３０リッ
トルの４Ｍエタノールに懸濁させる。この懸濁液を、３０分間撹拌しながら０．３Ｍ酢酸を加えることによって溶解させる。ｐＨを水酸化ナトリウムで約７．５に調整し、この溶液を膜フィルター、０．４５μｍを通して濾過する。酢酸コリスチン溶液をＨＰＬＣカラムに通し、樹脂に結合させる。ＨＰＬＣカラムを約１６０リットルの緩衝液Ｉで溶出する。溶出液を分画にて集める。あらかじめ設定した規格に適合する分画を集め、一方分画の残りを捨てる。ポリミキシンＥ１に関して少なくとも９２％の純度のバッチを分画からプールする。ポリミキシンＥ１の濃縮および過剰のエタノールの除去を逆浸透によって行う。プールを約５０ｇ／ｌに濃縮し、その後ＤＩ水（約８容積）で透析する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による精製
次の緩衝液を調製する：
較正緩衝液：約２００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨを希アンモニアで約７に調整する溶出緩衝液：約２００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨを酢酸で約３．７に調整する
約９０リットルの容積のＨＩＣカラム（直径３５ｃｍ）を、２５０リットルの較正緩衝液、流量約１．７ ｌ／分、引き続き約２００リットルの溶出緩衝液、流量約１．０ ｌ／分で平衡させる。
【００６８】
逆浸透からの酢酸コリスチン溶液中の塩含有率を、（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えることによって約２００ｍＭに調整し、ｐＨを希アンモニアで約７に調整する。酢酸コリスチン溶液の濃度は１５〜２０ｇ／ｌである。この溶液を流量９５０〜１０５０ｍｌ／分でＨＩＣカラムに通す。溶出は床容積の１０倍で進行する。溶出液分画の収集はＰＬＣによって自動的に行われる。試料を各分画から抜き出し、分析する。あらかじめ設定した規格に適合する分画をプールし、ポリミキシンＥ１に関して９４〜９８％の純度のバッチをもたらす。ポリミキシンＥ１の濃縮および硫酸アンモニウムの除去を、１０〜２０ｇ／ｌの濃度まで限外濾過によって行う。
コリスチン塩基モノ成分の沈澱
この溶液をＤＩ水で１０ｇ／ｌに希釈し、それが均質になるまで撹拌する。ｐＨを水酸化ナトリウムで９．６〜９．８に調整し、撹拌を続行し、その間にコリスチン塩基モノ成分が沈澱する。この沈澱をフィルタープレス上での濾過によって回収する。濾過が完了したとき、ケーキを約８００リットルのＤＩ水で洗浄し、ＤＩ水を空気で置き換える、コリスチンモノ成分ケーキをフィルタープレスから取り出し、冷凍機に貯蔵する。
硫酸コリスチンモノ成分への変換
コリスチン塩基モノ成分を、撹拌しながらＤＩ水に懸濁させ、溶解させる。ｐＨを希硫酸で５．０に調整する。この溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
凍結乾燥、ミリングおよび貯蔵
濾過した溶液をステンレススチール冷凍乾燥トレーに満たし、範囲−２５℃→＋４５℃のＰＩＣ制御温度分布を用いて約７０時間凍結乾燥させる。乾燥品を凍結乾燥機から取り出し、所望の粒子分布を得るためにミルにかける。
分析ＨＰＬＣ法
方法１：発酵からコリスチン塩基までの製造過程管理のためのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ６０００Ａ／５１０
注入器：ＷＩＳＰ ７１２ Ａ
検出器：Ｍｏｄｅｌ ４４１
プレフィルター：Ｇｕａｒｄ Ｐａｋ、Ｒｅｓｏｌｖｅ Ｃ１８（除外してもよい）
カラム：Ｒｅｓｏｌｖｅ Ｃ１８、１０×８．５ミクロンまたはＮｏｖａ−Ｐａｋ、４ミクロン
カラム付属品：ＲＣＭ ８×１０
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
方法：定組成法
移動相：
緩衝液：硫酸ナトリウム十水和物、１６．１ｇ（０．０５Ｍ）濃度、酢酸、０．５６ｍｌ（０．０１Ｍ）トリエチルアミン ２０ｍｌ（０．１５Ｍ）、水で１０００ｍｌにする。ｐＨをリン酸で２．５に調整する。
【００６９】
代わりの緩衝液：硫酸ナトリウム ０．０４Ｍ、メタンスルホン酸 ０．５６Ｍ、トリエチルアミン ０．０８７Ｍ、ｐＨを３．０に。
使用前に、アセトニトリル、１７０ｇを緩衝液に溶解させて１０００ｍｌにする。
【００７０】
この溶液をヘリウムで１５分間脱気する。
アッセイ手順：
流量：１．５ｍｌ／分、あるいは１．０ｍｌ／分。
【００７１】
温度：周囲温度。
注入量：２０マイクロＬ、あるいは２５。
検出：２１４ｎｍ、０．１ ＡＵＦＳまたは１．０ ＡＵＦＳ。
【００７２】
ランニング時間：３０分。
標準品：１ｍｇ／ｍｌにするために水に溶解された、硫酸コリスチンの基準標準品
標準品：コリスチン塩基、０．１Ｍ塩酸中１．０ｍｇ／ｍｌ
分析試料：０．５〜１ｍｇ／ｍｌを含有するように希釈する。希釈剤：３％リン酸、４０ｍｌ、およびアセトニトリル、６０ｍｌ。濁っている場合は遠心分離。
方法２：最終バルク製品までのコリスチン塩基についてのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ５１０
注入器：７１７プラス自動サンプラー
検出器：４９０Ｅ
プレフィルター：Ｇｕａｒｄ Ｐａｋ、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８
カラム：Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８、６０Å、４μｍ、１５０×４．６ｍｍ
カラムオーブン：Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
Ｍｏｄｅｌ ７９５５
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
試薬：
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
トリエチルアミン、ＨＰＬＣグレード
メタンスルホン酸、≧９９％
Ｍｉｌｉ−Ｑ水
緩衝液：硫酸ナトリウム、無水、２８．４ｇ（０．１０Ｍ）、トリエチルアミン １４．０ｍｌ（０．５５Ｍ）、メタンスルホン酸 １０．０ｍｌ（０．０６Ｍ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２０００ｍｌにする。
【００７３】
緩衝液を、０．４５μｍフィルターを通して真空濾過する。
Ａ溶出液：５０％緩衝液、３５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１５％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
【００７４】
Ｂ溶出液：５０％緩衝液、２０％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、３０％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
試料調製：
酢酸コリスチン：０．０５Ｍ酢酸中１〜２ｇ／ｌ。３０分間撹拌し、０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過する。
標準品：
２つの工場内標準品、高活性（２０００μｇ／ｍｇ）の１つおよび低活性（４００μｇ／ｍｇ）の１つを調製する。
【００７５】
アッセイ手順：
流量：０．８ｍｌ／分
カラムの温度：２５℃
検出：２１４ｎｍ
時定数：１．０秒
ＡＵＦＳ：１．０００ＡＵ
Ａｕｔｏ ｚｅｒｏ：オン
Ｗｉｓｐ温度：２５℃
注入量：２０μｌ／ラン
グラジエントプログラム：
【００７６】
【表１】
【００７７】
溶出液Ａをブラインドとして使用し、標準品および試料から差し引く。
方法３：硫酸コリスチンモノ成分についてのＨＰＬＣ
機器：
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ ５１０
注入器：７１７プラス自動サンプラー
検出器：４９０Ｅ
カラム：Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｃ１８、６０Å、４μｍ、２５０×４，６ｍｍ
カラムオーブン：Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
Ｍｏｄｅｌ ７９５５
からなる、Ｗａｔｅｒｓ自動ＨＰＬＣ機器
試薬：
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード
メタンスルホン酸、≧９９％
トリエチルアミン、ＨＰＬＣグレード
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
緩衝液：硫酸ナトリウム、無水、２８．４ｇ（０．１０Ｍ）、トリエチルアミン １４．０ｍｌ（０．５５Ｍ）、メタンスルホン酸 １０．０ｍｌ（０．０６Ｍ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２０００ｍｌにする。
【００７８】
緩衝液を、０．４５μｍフィルターを通して真空濾過する。
Ａ溶出液：５０％緩衝液、３５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１５％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
【００７９】
Ｂ溶出液：５０％緩衝液、２０％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、３０％アセトニトリル。ｐＨをメタンスルホン酸で２．０に調整する。
試料調製：
硫酸コリスチンモノ成分：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中２．８ｍｇ／ｍｌ。１５分間撹拌し、０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過する。
【００８０】
アッセイ手順：
流量：１．０ｍｌ／分
検出波長：２１４ｎｍ
カラム温度：２５℃
注入量：４０μｌ
オートサンプラー温度：２５℃
グラジエントプログラム：
【００８１】
【表２】
【００８２】
参考文献
１）Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｋ．（１９６３）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｌｏｓｔｉｎ：ＩＩＩ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｌｉｓｔｉｎ Ａ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：４１２−４１８
２）Ｅｌｖｅｒｄａｍ，Ｉ．，Ｐ．Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｅ．Ｌｕｎｄ（１９８１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ ａｎｄ Ｅ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（２１８）６５３−６６１
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸および高エタノール濃度中のコリスチン塩基をカラムに装填する工程と
低エタノール濃度で溶出する工程と
を備える、逆相クロマトグラフィーによるコリスチンの精製方法。
【請求項２】
前記高エタノール濃度が２０％〜３０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高エタノール濃度が２０％〜２４％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高エタノール濃度が２４％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記低エタノール濃度が１０〜１５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記低エタノール濃度が１２％である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酢酸濃度が０，１Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
移動相のｐＨが７〜８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動相のｐＨが７，５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記高エタノール濃度が２４％であり、
前記低エタノール濃度が１２％であり、
前記酢酸濃度は０．１Ｍであり、
前記移動相のｐＨが７．５であり、そして
前記固定相がＣ８−樹脂である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって製造される製品。
【請求項１】
酢酸および高エタノール濃度中のコリスチン塩基をカラムに装填する工程と
低エタノール濃度で溶出する工程と
を備える、逆相クロマトグラフィーによるコリスチンの精製方法。
【請求項２】
前記高エタノール濃度が２０％〜３０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高エタノール濃度が２０％〜２４％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高エタノール濃度が２４％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記低エタノール濃度が１０〜１５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記低エタノール濃度が１２％である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酢酸濃度が０，１Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
移動相のｐＨが７〜８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動相のｐＨが７，５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記高エタノール濃度が２４％であり、
前記低エタノール濃度が１２％であり、
前記酢酸濃度は０．１Ｍであり、
前記移動相のｐＨが７．５であり、そして
前記固定相がＣ８−樹脂である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって製造される製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５０９３６５（Ｐ２０１３−５０９３６５Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５７１８（Ｐ２０１２−５３５７１８）
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４４７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１０７０
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０５３７１２３２）クセリア ファーマシューティカルズ エーピーエス (13)
【氏名又は名称原語表記】Ｘｅｌｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡｐＳ
【住所又は居所原語表記】１１ Ｄａｌｓｌａｎｄｓｇａｄｅ，ＤＫ−２３００ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｓ，ＤＥＮＭＡＲＫ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４４７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１０７０
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０５３７１２３２）クセリア ファーマシューティカルズ エーピーエス (13)
【氏名又は名称原語表記】Ｘｅｌｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡｐＳ
【住所又は居所原語表記】１１ Ｄａｌｓｌａｎｄｓｇａｄｅ，ＤＫ−２３００ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｓ，ＤＥＮＭＡＲＫ
【Ｆターム（参考）】
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