サッカリド抗原のためのグリコセラミドアジュバント
本発明は：（ａ）キャリアに結合されるサッカリド抗原；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバントを含有する組成物およびキットを提供する。さらに本発明は、組成物を使用する処置の方法を提供する。α−グリコシルセラミドによる抗サッカリド免疫応答の抑制は、キャリアに結合しているサッカリドにより逆転され得る。本発明の組成物中に含まれるアジュバントは、当該分野において公知の任意の適したα−グリコシルセラミドであり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、特にサッカリド抗原のためのワクチンアジュバントの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景分野）
ワクチンは、しばしば追加免疫活性に対するアジュバントを含む。公知のアジュバントの例として、アルミニウム塩、水中油型乳剤、サポニン、サイトカイン、脂質およびＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。近年、アルミニウム塩およびモノホスホリル脂質ＭＦ５９ＴＭのみが、ヒトでの使用について認可されている。しかしながら、アルミニウム塩は安全性の注意を必要とし、いくつかの抗原と不適合性である。それゆえ、さらにアジュバントを開発する必要がある。
【０００４】
αーガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、糖脂質、より具体的にはグリコシルセラミドであり、本来海洋性の海綿から単離される［非特許文献１］。α−ＧａｌＣｅｒは、不変異体のナチュラルキラーＴ細胞に対してＭＨＣクラスＩ様分子である、ＣＤ１ｄにより提示され、腫瘍細胞に対するナチュラルキラーＴ細胞応答を誘導する能力について本来調べられた［特許文献１］。不変異体のナチュラルキラーＴ細胞はまた、Ｂ細胞活性を誘導することが示されており、Ｂ細胞増殖および抗体産生を増強する［非特許文献２、非特許文献３］。近年、α−ＧａｌＣｅｒは、種々の共投与タンパク質抗原に関してアジュバントとして作用することが示されている［特許文献２］。照射されたスポロゾイトまたはマラリア抗原を発現している組み換えウイルスとα−ＧａｌＣｅｒとの共投与は、マウスにおいて防御性抗マラリア免疫のレベルを増強することが示されている［非特許文献４］。α−ＧａｌＣｅｒはまた、ＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子をコードしているＤＮＡワクチンに関してアジュバントとしてはたらくことが示されている［非特許文献５］。
【０００５】
しかしながら、すべてのワクチンがタンパク質抗原を含有するわけではない。いくつかの市販のワクチンは、サッカリド抗原を含有する。例えば、ＰｎｅｕｍｏｖａｘＴＭは、２３の肺炎球菌血清型由来のサッカリド抗原を含有する。ＭｅｎｃｅｖａｘＴＭおよびＭｅｎｏｍｕｎｅＴＭは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５由来のサッカリド抗原を含有する髄膜炎菌ワクチンである。それゆえ、サッカリド抗原に対するアジュバントとしてα−ＧａｌＣｅｒの使用を広げることが所望される。
【０００６】
ＤＮＡおよびタンパク質抗原に対するアジュバントとしてのα−ＧａｌＣｅｒとの成功にもかかわらず、本発明者らは、驚くことに、いくつかのサッカリド抗原に関してアジュバントとして作用しないことを見出した。対照的に、これら抗原とα−ＧａｌＣｅｒとの投与は、アジュバントを用いないコントロールに比較して、抗体力価の実質的な減少を引き起こすことが見出されている。
【特許文献１】欧州特許出願公開第１０１８５４８号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０９８１２号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｔｏｒｉら、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」、１９９４年、５０：ｐ.２７７１〜２７８３
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２００３年、２１：Ｓ２／４８〜Ｓ２／５４
【非特許文献３】Ｇａｌｌｉら、「Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ」、２００３年、１９７：ｐ.１０５１〜１０５７
【非特許文献４】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａら、「Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ」、２００２年、５：ｐ.６１７〜６２４
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇら、要旨３９６、第１０回 Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、α−ＧａｌＣｅｒが存在する場合の、抗サッカリド抗体応答の阻害の問題を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
驚くことに、サッカリド抗原がキャリアに結合体化される場合、α−ＧａｌＣｅｒの存在下おける抗サッカリド免疫応答の抑制は逆転され得、サッカリド抗原に対する免疫応答はさらに増強され得ることが見出されている。それゆえ、本発明は、（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバント、を含む組成物を提供する。
【０００９】
（α−グリコシルセラミドアジュバント）
本発明の組成物中に含まれるアジュバントは、当該分野において公知の任意の適したα−グリコシルセラミドであり得る。好ましくは、α−グリコシルセラミドアジュバントは、式（Ｉ）の化合物：
【００１０】
【化１】
であり、ここで、
Ｒ１はＨまたはＯＨを表し、
Ｘは１と３０との間の整数を表し、
Ｒ２は以下（ａ）〜（ｅ）からなる群；
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３
から選択される置換基を表し（ここでＹは、５と１７の間の整数を表す）、
Ｒ３はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３またはモノサッカリドを表し、
Ｒ４はＯＨまたはモノサッカリドを表し、
Ｒ５はＨ、ＯＨまたはモノサッカリドを表し、
Ｒ６はＨ、ＯＨまたはモノサッカリドを表し、そして
Ｒ７はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたはモノサッカリドを表す。
【００１１】
Ｘは、好ましくは７と２７との間であり、より好ましくは９と２４との間であり、そしてより好ましくは１３と２０との間である。Ｙは、好ましくは７と１５との間であり、さらに好ましくは９と１３との間である。
【００１２】
Ｒ３がモノサッカリドである場合、好ましくはα−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１３】
Ｒ４がモノサッカリドである場合、好ましくは、β−Ｄ−ガラクトフラノースまたはＮ−アセチルα−Ｄ−ガラクトピラノースから選択される。
【００１４】
Ｒ５がモノサッカリドである場合、好ましくは、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１５】
Ｒ６がモノサッカリドである場合、好ましくは、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１６】
Ｒ７がモノサッカリドである場合、好ましくは、メチルα−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチルα−Ｄ−グルコピラノシドまたはメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドから選択される。
【００１７】
好ましくは、Ｒ５およびＲ６は異なる。好ましくは、Ｒ５およびＲ６の１つはＨである。
【００１８】
本発明の組成物の含有物として適したα−グリコシルセラミドアジュバントのさらなる例は、参考文献２に提供される。
【００１９】
好ましくは、α−グリコシルセラミドアジュバントは、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）（すなわち、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝ＨかつＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）である。本発明の組成物に含まれるα−ＧａｌＣｅｒは、直接海洋性の海綿体から単離されてもよいし、または化学的に合成された生成物であってもよい。本発明の組成物での使用に適したα−ガラクトシルセラミドの例は、参考文献８に提供される。好ましいα−ガラクトシルセラミドは、ＫＲＮ７０００であり、これは式（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオールを有する。ＫＲＮ７０００の合成は、参考文献８に記載される。
【００２０】
α−グリコシルセラミドアジュバントはまた、α−ＧａｌＣｅｒに比較して脂肪アシル鎖および／またはスフィンゴシン鎖が切り取られたα−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログであり得る。α−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログの例は、参考文献９に提供される。α−ＧａｌＣｅｒの好ましい短縮型アナログは、「ＯＣＨ」であり、好ましいα−ＧａｌＣｅｒに比較して、脂肪アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、そしてスフィンゴシン鎖は９つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ２＝ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝ＨおよびＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）。さらに好ましいα−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログは、α−ＧａｌＣｅｒに比較して、脂肪アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、そしてスフィンゴシン鎖が７つまたは３つの炭化水素の切断を有するアナログを含む（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝Ｈ、Ｒ７＝ＣＨ２ＯＨおよびＲ２は、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）６ＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）１０ＣＨ３である）。
【００２１】
（サッカリド抗原）
好ましくは、本発明の組成物に含まれるキャリアに結合体化されるサッカリド抗原は、細菌性サッカリドであり、特に細菌性莢膜サッカリドである。
【００２２】
本発明の組成物に含まれる得る細菌性莢膜サッカリドの例としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型またはＶＩＩＩ型）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（代表的株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどが挙げられる。本発明の組成物に含まれ得る他のサッカリドとしては、グルカン（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるもののような真菌性グルカン）および真菌性莢膜サッカリド（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの莢膜由来）が挙げられる。
【００２３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ（ＭｅｎＡ）莢膜は、Ｃ３およびＣ４の位置に部分的にＯ−アシル化を有する（α１→６）連結Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（ＭｅｎＢ）莢膜は、（α２→８）連結シアル酸のホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）莢膜サッカリドは、７および／または８の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する（α２→９）連結シアル酸のホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５サッカリドは、シアル酸−ガラクトースジサッカリドユニット［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］からなるポリマーである。これはシアル酸の７および９の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する［１０］。ジサッカリド反復ユニットがガラクトースの代わりにグルコースを含む［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］ことを除いて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙサッカリドは、血清群Ｗ１３５サッカリドに類似している。これはまた、シアル酸の７および９の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する。
【００２４】
ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜（Ｈｉｂ）サッカリドは、リボース、リビトールおよびリン酸塩のポリマー［「ＰＲＰ」、（ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）］である。
【００２５】
本発明の組成物は、サッカリド抗原結合体の混合物を含有し得る。好ましくは、本発明の組成物は、１つより多いＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群由来のサッカリド抗原を含有し、例えば、組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど由来のサッカリド結合体を含有し得る。好ましい組成物は、血清群ＣおよびＹ由来のサッカリド結合体を含有する。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含有する。
【００２６】
混合物が血清群Ａ由来の髄膜炎菌性サッカリドおよび少なくとも１つの他の血清群サッカリドを含む場合、任意の他の血清群サッカリドに対するＭｅｎＡサッカリドの比（ｗ／ｗ）は１より大（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより高い）であり得る。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来のサッカリドに関する好ましい比は：１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。
【００２７】
さらに好ましい本発明の組成物は、Ｈｉｂサッカリド結合体および少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群由来のサッカリド結合体、好ましくは１つより多いＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群由来のサッカリド結合体を含有する。例えば、本発明の組成物は、Ｈｉｂ結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来の結合体を含み得る。
【００２８】
本発明は、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリド結合体を含有する組成物を含む。好ましくは、この組成物は、１つより多いＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型を含有する。好ましい組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ（７−バレント）由来のサッカリド結合体を含有する。組成物はさらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１および５（９−バレント）由来のサッカリド結合体を含有し得るか、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、３および７Ｆ（１１−バレント）由来のサッカリド結合体を含有し得る。
【００２９】
さらに本発明の好ましい組成物は、肺炎球菌サッカリド結合体およびＨｉｂおよび／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のサッカリド結合体を含有する。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体ならびにＨｉｂサッカリド結合体を含有し得る。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含有し得る。本発明に従う組成物はまた、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体、Ｈｉｂサッカリド結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含み得る。
【００３０】
個々のサッカリド抗原結合体の防御効果は、それらを組み合わせることにより除かれないことが好ましいが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得る。
【００３１】
（莢膜サッカリド抗原の調製）
莢膜サッカリド抗原の調製のための方法は、周知である。例えば参考文献１１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のサッカリド抗原の調製を記載する。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のサッカリド抗原の調製は、参考文献１２の第１４章に記載される。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原およびサッカリド結合体の調製は、当該分野において記載されている。例えば、ＰｒｅｖｅｎａｒＴＭは、７バレントの肺炎球菌結合体ワクチンである。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のサッカリド抗原の調製のためのプロセスは、参考文献１３および１４に詳細に記載される。
【００３２】
サッカリド抗原は、化学的に修飾され得る。例えば、１つ以上のヒドロキシル基を保護基で置換して修飾され得る。アセチル基が保護基で置換され加水分解が妨げられる場合、これは特に髄膜炎菌血清型Ａに有用である［１５］。そのような修飾サッカリドは、本発明の意味においては、なお血清型Ａサッカリドである。
【００３３】
莢膜サッカリドはオリゴサッカリドの形成において使用され得る。これらは精製した莢膜ポリサッカリドの断片化により（例えば加水分解により）簡便に形成され、通常その後所望されるサイズの断片に精製される。
【００３４】
ポリサッカリドの断片化は、好ましくは、オリゴサッカリドにおける３０未満の最終的な平均重合度（ＤＰ）を与えるために実施され得る。ＤＰは簡便に、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色アッセイにより測定され得る［１６］。
【００３５】
加水分解が実施される場合、加水分解物は、一般的に短い長さのオリゴサッカリドを除去するためにサイズ分類される［１７］。これは限外濾過に続くイオン交換クロマトグラフィーのような種々の方法で達成され得る。約６以下の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは血清型Ａにおいて除去され、そして約４未満の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは血清型Ｗ１３５およびＹにおいて除去される。
【００３６】
（キャリア）
好ましくは、キャリアはタンパク質である。本発明の組成物においてサッカリド抗原に結合体化される好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような細菌毒素である。適したキャリアタンパク質としては、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体［１８〜２０］、ジフテリアトキソイド、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［２１］、合成ペプチド［２２、２３］、熱ショックタンパク質［２４、２５］、百日咳タンパク質［２６、２７］、サイトカイン［２８］、リンホカイン［２８］、ホルモン［２８］、成長因子［２８］、Ｎ１９タンパク質［３０］のような、種々の病原体由来抗原の複合ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［２９］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［３１、３２］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［３３］、肺炎球菌溶血素［３４］、鉄取り込みタンパク質［３５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［３６］などが挙げられる。
【００３７】
サッカリド抗原のキャリアへの結合は、好ましくは−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質のリシン残基の側鎖またはアルギニン残基の側鎖における）を介する。サッカリドは遊離アルデヒド基を有する場合、このアルデヒド基は、キャリア中のアミンと反応して、還元アミノ化により結合体を形成する。結合はまた、−ＳＨ基（例えば、システイン残基の側鎖における）を介し得る。
【００３８】
組成物が１つより多いサッカリド抗原を含有する場合、１つより多いキャリアを使用することが可能である（例えば、キャリア抑制の危険性を減少させるために）。従って、異なるキャリアが異なるサッカリド抗原について用いられ得る。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａサッカリドは、ＣＲＭ１９７に結合体化される一方で、Ｃ型サッカリドは、破傷風トキソイドに結合体化され得る。ある特定のサッカリド抗原に１つより多いキャリアを使用することもまた可能である。このサッカリドは、２つの群にあり、いくつかはＣＲＭ１９７に結合体化され、そしてその他は破傷風トキソイドに結合される。しかしながら一般的に、同じキャリアをすべてのサッカリドに使用することが好ましい。
【００３９】
単一キャリアタンパク質は１つより多いサッカリド抗原を保持する［３７、３８］。例えば、単一キャリアタンパク質は、異なる病原体由来のサッカリドまたは同じ病原体の異なる血清型由来のサッカリドに結合体化し得る。この目的を果たすために、異なるサッカリドが結合体化反応の前に混合され得る。しかしながら一般的に、各血清群について別個の結合体を有することが好ましく、異なるサッカリドは結合体化後に混合される。別々の結合体は、同じキャリアをベースにし得る。
【００４０】
１：５（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち、過剰のサッカリド）との間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましく、同様に１：１．２５と１：２．５との間の比が好ましい。
【００４１】
結合体は、結合体化において遊離キャリアとともに使用され得る［３９］。所定のキャリアタンパク質が本発明の組成物において遊離型および結合型の両方で存在する場合、好ましくは、非結合型形態は、全体として組成物の総キャリアタンパク質量のたったの５％にすぎず、さらに好ましくは重量で２％未満の存在である。
【００４２】
結合体化の後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドは別々にされ得る。多くの適した方法があり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる［参考文献４０および４１などを参照のこと］。
【００４３】
任意の適した結合体化反応が、必要とされる場合、任意の適したリンカーとともに使用され得る。
【００４４】
サッカリドは代表的に、結合体化前に活性化されるかまたは機能化される。活性化には、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［４２、４３など］）のようなシアニル化試薬が関与し得る。他の適した技術では、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（参考文献４４の緒言も参照のこと）を使用する。
【００４５】
リンカー基を介する連結は、任意の公知の手順を使用して作られ得、例えば、この手順は、参考文献４５および４６に記載される。結合の１つの型としては、ポリサッカリドの還元アミノ化が挙げられ、生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一方の端に結合させ、次いでタンパク質をこのアジピン酸リンカー基のもう一方の端に結合させる［４７、４８］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［４９］、ニトロフェニル−エチルアミン［５０］、ハロアシルハライド［５１］、グリコシド結合［５２］、６−アミノカプロン酸［５３］、ＡＤＨ［５４］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５５］などが挙げられる。リンカーの使用の代替として、直接的連結が使用され得る。タンパク質への直接的連結は、例えば参考文献５６および５７に記載されるように、ポリサッカリドの酸化およびその後のタンパク質との還元アミノ化を包含する。
【００４６】
アミノ基のサッカリドへの導入（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２で置換することによる）に続きアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドジエステル）を用いる誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスが好ましい。
【００４７】
結合後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドは、別々にされ得る。多くの適した方法があり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる［参考文献５８および５９などを参照のこと］。
【００４８】
本発明の組成物が脱重合化サッカリドを含有する場合、脱重合は結合体化より前に行うことが好ましい。
【００４９】
（組成物のさらなる抗原性化合物）
本発明の組成物は、少なくとも１つのキャリアに結合体化されたサッカリド抗原を含有する。しかしながら、本発明の組成物は、上に記載されるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原に加え、１つ以上の以下の抗原を含有し得る：
−参考文献６０〜６６のもののような、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原。タンパク質「２８７」（以下を参照のこと）および誘導体（例えば「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
−参考文献６７、６８、６９、７０などに開示されるもののような、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物。
−Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質抗原（例えば、参考文献７１に開示されるようなＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３由来）。
−不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、７２、７３；参考文献７８の第１５章］。
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、７３、７４；参考文献７８の第１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば７５］。
−必要に応じてペルタクチンおよび／または凝集原２および凝集原３とも組み合わせた、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）のような、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献７６および７７；参考文献７８の第２１章］。
−ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原［参考文献７８の第１３章］。
−破傷風トキソイドのような破傷風抗原［例えば、参考文献７８の第２７章］。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、参考文献６０、６１、６２］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、８６］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献８７］。
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、８８、８９；参考文献７８の第２４章］。
−凍結乾燥不活化ウイルス［例えば９１、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］のような狂犬病抗原［例えば９０］。
−麻疹、ムンプスおよび／または風疹抗原［例えば、参考文献７８の第１９章、第２０章および２６章］。
−ＣａｇＡ［９２〜９５］、ＶａｃＡ［９６、９７］、ＮＡＰ［９８、９９、１００］、ＨｏｐＸ［例えば１０１］、ＨｏｐＹ［例えば１０１］のようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原および／またはウレアーゼ。
−血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原［例えば、参考文献７８の１７章および１８章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば１０２］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ストレプトコッカスＢ群）由来のタンパク質抗原［例えば、１０３、１０４］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ストレプトコッカスＡ群）由来の抗原［例えば、１０４、１０５、１０６］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば１０７］。
−呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［１０８、１０９］）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［１１０］）のようなパラミクソウイルス由来の抗原。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ［例えば、１１１、１１２、１１３］由来の抗原
−黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、４つの血清型のデング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルスのようなフラビウイルス科ファミリー（フラビウイルス属）のウイルス由来の抗原。
−古典的なブタ熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢性ウイルスおよび／またはボーダー病ウイルス由来のようなペスチウイルス抗原
−例えばパラボウイルスＢ１９由来のパラボウイルス抗原。
【００５０】
混合物は、さらにこれら抗原を１つ以上含有し、必要とされる場合解毒化され得る（例えば、化学的手法および／または遺伝子的手法による百日咳毒素の解毒化）。
【００５１】
ジフテリア抗原が混合物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。
【００５２】
混合物中の抗原は、代表的にそれぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分である。
【００５３】
混合物中のタンパク質抗原の代替物として、抗原をコードしている核酸が使用され得る。従ってこの混合物のタンパク質成分が、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミドの形成におけるＤＮＡ）により置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原を模倣したタンパク質（例えばミモトープ［１１４］または抗イディオタイプの抗原）を含み得る。
【００５４】
（薬学的組成物の処方物）
本発明の結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントは、免疫原性組成物およびワクチンへの封入に特に適している。それゆえ本発明のプロセスは、免疫原性組成物またはワクチンとして結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントを処方する工程を包含し得る。本発明は、この方法において得ることのできる組成物およびワクチンを提供する。
【００５５】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、キャリアタンパク質に結合体化されたサッカリド抗原およびα−グリコシルセラミドアジュバントに加え、代表的に「薬学的に受容可能なキャリア」を含み、このキャリアは、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体では誘導しない任意のキャリアを含む。適したキャリアは、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１１５］、脂質凝集体（油滴またはリポソームのような）および不活化ウイルス粒子のような、代表的に大きく、ゆっくり代謝される巨大分子である。そのようなキャリアは当業者において周知である。本ワクチンはまた、水、生理食塩水、グリセロールなどのような希釈剤を含み得る。さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などのような補助剤が存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、参考文献１１６において入手可能である。
【００５６】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効量のサッカリド抗原、および必要とされるならば、上記に言及した任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単回用量または一連の投与の一部としてかのいずれかにおいて、個体に投与する量が、処置または予防に関して有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体的状態、年齢、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫システムの能力、所望される予防の度合い、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価および他の関連要因に依存して変化する。この量は、比較的広い範囲になることが期待され、この範囲は、慣習的な試験を通して決定され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュール（例えば、追加免疫投薬が挙げられる）であり得る。
【００５７】
本ワクチンは、他の免疫調節物質と併用して投与され得る。α−グリコシルセラミドは、本発明の免疫原性組成物内においてアジュバントとして作用する。本ワクチンは、付加的なアジュバントを含み得る。そのようなアジュバントとして以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明における、アジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩のような無機塩類が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などのような無機塩類［例えば、参考文献１１７の第８章および第９章を参照のこと］、または異なるミネラル化合物の混合物を含む。この化合物は任意の適した形態（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）をとり、吸着することが好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る［１１８］。
【００５８】
代表的なリン酸アルミニウムアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間で、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌにおいて含まれる非結晶性のヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムを用いる吸着が、例えば１用量あたりの結合体あたり５０μｇと１００μｇとの間のＡｌ３＋で用いられ得る。リン酸アルミニウムを吸着に使用し、抗原をアジュバントに吸着させないことが所望される場合、このことは溶液中に遊離リン酸イオンを含むことにより（例えば、リン酸緩衝液の使用により）促進される。
【００５９】
Ｂ．油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、ＭＦ５９［参考文献１１７の第１０章、参考文献１１９も参照のこと］（ミクロ流動器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子に処方される５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５）のようなスクアレン−水乳剤が挙げられる。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もまた使用され得る。
【００６０】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１１７の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根さらに花においてさえ見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、シュッコンカスミソウ（ブライデスベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（サボンソウ根）から、商業的に入手され得る。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１のような精製処方物およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販される。
【００６１】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製される。これらの技術を使用して精製された特定の画分が同定されており、その精製画分としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献１２０に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含み得る［１２１］。
【００６２】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１１７の第２３章］。ＩＳＣＯＭとしては、代表的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭとしては、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上が挙げられる。ＩＳＣＯＭは、さらに参考文献１２１〜１２３に記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは余分な界面活性剤を含まない［１２４］。
【００６３】
サポニンベースのアジュバントの開発についての概説は、参考文献１２５および１２６に見出され得る。
【００６４】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的に、必要に応じてリン脂質と組み合わせられるかまたは処方されるウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に、いかなる天然のウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質は組換えによって産生されるか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（ＨＡまたはＮＡのような）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（コアタンパク質またはカプシドタンパク質のような）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒト乳頭腫ウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡ−ファージ由来のタンパク質、Ｑβ−ファージ由来のタンパク質（コートタンパク質のような）、ＧＡ−ファージ由来のタンパク質、ｆｒ−ファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質、およびＴｙ由来のタンパク質（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１のような）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１２７〜１３２でさらに考察される。ビロソームはさらに、例えば、参考文献１３３で考察される。
【００６５】
Ｅ．細菌性または微生物性誘導体
本発明における使用に適したアジュバントとしては、腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素、ならびにそれらの解毒誘導体のような細菌性または微生物性の誘導体が挙げられる。
【００６６】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６つのアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、参考文献５５に開示される。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過されるほど十分に小さい［１３４］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）のようなモノホスホリル脂質Ａ模倣物が挙げられる［１３５、１３６］。
【００６７】
脂質Ａ誘導体としては、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の脂質Ａの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献１３７および１３８に記載される。
【００６８】
本発明における、アジュバントとしての使用に適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンへのリン酸結合により連結される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【００６９】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾物のようなヌクレオチド修飾物／アナログを含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献１３９、１４０および１４１は、可能なアナログ置換（例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１４２〜１４７においてさらに考察される。
【００７０】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはモチーフＴＴＣＧＴＴのようなＴＬＲ９に関し得る［１４８］。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのようなＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのようなＣｐＧ配列は、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１４９〜１５１において考察される。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００７１】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、その３’末端で結合され得、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成する。例えば、参考文献１４８および１５２〜１５４を参照のこと。
【００７２】
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または百日咳菌（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献１５５に記載され、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１５６に記載される。毒素または類毒素は、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒性の変異を含み；好ましくは、Ｂサブユニットは変異されない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２のような解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１５７〜１６４に見出され得る。アミノ酸置換に関する数の参照は、好ましくは、参考文献１６５に記載のＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントをベースとし、特にその全体が本明細書中において参考として援用される。
【００７３】
Ｆ．ヒト免疫調節因子
本発明において、アジュバントとして使用に適したヒト免疫調節因子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１６６］など）［１６７］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子のようなサイトカインが挙げられる。
【００７４】
Ｇ．生体付着物および粘膜付着物
生体付着物および粘膜付着物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適した生体付着物としては、エステル型のヒアルロン酸マイクロスフィア［１６８］または架橋したポリ（アクリル酸）の誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロースのような粘膜付着物が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る[１６９]。
【００７５】
Ｈ．微粒子
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒子、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）は、生体分解性および非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成され、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、必要に応じて負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を用いて）を有するように処理される。
【００７６】
Ｉ．リポソーム（参考文献１１７の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献１７０〜１７２に記載される。
【００７７】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる[１７３]。そのような処方物はさらに、オクトキシノールとの組み合わせでポリオキシエチレンソルビタンエステルのサーファクタント[１７４]および少なくとも１つのオクトキシノールのようなさらなる非イオン性サーファクタントとの組み合わせでポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルのサーファクタントを含む[１７５]。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００７８】
Ｋ．ポリホスファザン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば参考文献１７６および１７７に記載される。
【００７９】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【００８０】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントを使用するために適したイミダゾキノロン化合物の例としては、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）が挙げられ、さらに参考文献１７８および１７９に記載される。
【００８１】
本発明はまた、上記に同定される１つ以上のアジュバントの局面の組み合わせを含む。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油型乳剤［１８０］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［１８１］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［１８２］；（５）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤と３ｄＭＰＬとの組み合わせ［１８３］；（６）大きい粒子サイズの乳剤を生成するためにサブミクロン乳剤中に微流動化させるかまたはボルテックスされたかのいずれかである、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）；ならびに（８）１つ以上の無機塩類（アルミニウム塩のような）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬのような）。
【００８２】
免疫刺激物質として作用する他の基質は、参考文献１１７の第７章に開示される。
【００８３】
（医学的方法および医学的使用）
一度処方されると、本発明の組成物は、直接被験体に投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特にヒト被験体が処置され得る。本ワクチンは特に、ワクチン接種をされる子供および１０代に有用である。これらは、全身ルートおよび／または粘膜ルートにより送達され得る。
【００８４】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され；注射前の液体ビヒクルのなかで溶液に適した固体の形態または懸濁液に適した固体の形態もまた調製され得る。本調製物はまた、アジュバントの効果を増強するために乳化されるか、またはリポソームにカプセル化され得る。本組成物の直接的な送達は、一般的に非経口的である（例えば、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかへの注射により、あるいは組織の間質に送達されることにより）。本組成物はまた、病巣に投与され得る。他の投与様式としては、経口投与、肺内投与、坐剤および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ)または経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば参考文献１８４を参照のこと）、針無しおよびハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュールであり得る（例えば、ブースター投薬を含む）。
【００８５】
本発明のワクチンは、好ましくは無菌である。これらは、好ましくは発熱物質を含まない。これらは好ましくは、例えばｐＨ６とｐＨ８との間、一般的には約ｐＨ７に緩衝化される。ワクチンが水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝液の使用が好ましい［１８５］。
【００８６】
本発明のワクチンは、低レベル（例えば＜０．０１％）で界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０のようなＴｗｅｅｎ）を含み得る。本発明のワクチンは、特に凍結乾燥される場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロース（例えば、約１５ｍｇ／ｍｌ）を含有し得る。
【００８７】
個々の抗原の至適用量は、経験的に評価され得る。しかしながら、一般的に本発明のサッカリド抗原は、１用量あたり各サッカリド０．１μｇと１００μｇとの間の用量で、代表的に０．５ｍｌの投薬容量を用いて投与される。この用量は、代表的に１用量あたり５μｇと２０μｇとの間のサッカリドである。これらの値は、サッカリドとして測定される。
【００８８】
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち感染を予防する）であるか治療的（すなわち感染後の疾患を治療するため）であるかのいずれかであってもよいが、代表的に予防的である。
【００８９】
本発明は、医薬における使用のためにキャリアタンパク質およびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を提供する。
【００９０】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明に従って、患者にワクチンを投与する工程を包含する。特に、本発明は患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは、髄膜炎菌性の疾患、肺炎球菌性の疾患またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して防御的であり、そして体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を含み得る。この患者は、成人または小児であり得る。この患者は、０〜６ヶ月齢、６〜１２ヶ月齢、１〜５年齢、５〜１５年齢、１５〜５５年齢または５５年齢より上の年齢であり得る。好ましくは、この患者は、子供である。本方法は、髄膜炎菌、肺炎球菌またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対してすでに初回免疫されている患者において、追加免疫応答を惹起し得る。
【００９１】
サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントは、同時に、連続的に、または別々に投与され得る。例えば、α−グリコシルセラミドアジュバントは、サッカリド抗原結合体の投与前に哺乳動物を初回免疫するために投与され得るか、またはサッカリド抗原結合体の投与後その結合体に対する哺乳動物の免疫応答を高めるために投与され得る。１つより多いサッカリド抗原結合体が投与される場合、このサッカリド抗原結合体は同時に投与され得、α−グリコシルセラミドアジュバントが投与されると、このサッカリド抗原結合体の混合物に別々に、同時にまたは連続的に投与され得る。
【００９２】
免疫応答を惹起する本方法は、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の初回用量を投与する工程を包含し、そして続いてキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の任意の第２の非アジュバント性用量を投与する工程を包含する。サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントの初回用量は、同時に、連続的にまたは別々に投与され得る。
【００９３】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここでこの医薬はα−グリコシルセラミドアジュバントとともに投与される。
【００９４】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用を提供し、ここでこの医薬はキャリアに結合体化されたサッカリド抗原とともに投与される。
【００９５】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供する。
【００９６】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここでこの患者は、α−グリコシルセラミドアジュバントを用いて前処置されている。
【００９７】
さらに本発明は、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用を提供し、ここで患者は、キャリアに結合体化されたサッカリドを用いて前処置されている。
【００９８】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここで該患者は、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を用いて前処置されている。
【００９９】
本医薬は、好ましくは免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。本医薬は、好ましくは予防および／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎菌、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである。従って、細菌性髄膜炎のこの予防および／または処置が好ましい。
【０１００】
ワクチンは、標準的動物モデルにおいて試験され得る（参考文献１８６を参照のこと）。
【０１０１】
さらに本発明は：ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原およびｂ）α−グリコシルセラミドアジュバントを含むキットを提供する。
【０１０２】
（定義）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、または何かの付加を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１０３】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１０４】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであり得る。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【実施例】
【０１０５】
（本発明を実施するための様式）
（実施例１：α−ＧａｌＣｅｒは、サッカリド抗原に対する免疫応答を抑制する）
５匹の６週齢の雌性マウス（系統：Ｃ５７ＢＬ／６）４群を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）の２３個の異なる血清群由来の２３個のポリサッカリドの混合物３．５μｇ〜１０μｇ、または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は、１００μｌの容量で筋肉内であった。４群すべてのマウスを、１２週後３．５〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫した。この免疫スケジュールを図１Ａに示す。
【０１０６】
このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後および追加免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスは、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたマウスに比較して、減少したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価（特に初回投薬後（図３Ａ））を示した（図２および図３）。このことは、α−ＧａｌＣｅｒがサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制することを示している。
【０１０７】
１８〜２２週後、マウスを屠殺し、脾臓中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数をＥｌｉｓｐｏｔにより決定した。α−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスの脾臓もまた、ＰＢＳを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスの脾臓に比較して、少ない数のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞を含んでいた（図４）。これらの結果は、α−ＧａｌＣｅｒがサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制するという示唆を支持する。
【０１０８】
さらなる実験を、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスにおいて観察されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する低い抗体応答が不変異体ナチュラルキラーＴ細胞を必要とするか評価するために実施した。６週齢の雌性マウスの４群（Ｃ５７Ｌ／６ ＷＴ、ＣＤ１ｄ＋／−、ＣＤ１ｄ−／−、またはＪＡ１８−／−）を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は５０μｌの容量で筋肉内であった。このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。この免疫スケジュールを図１Ｂに示す。
【０１０９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたＣ５７Ｌ／６野生型マウスは、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＣＤ５７Ｌ／６野生型マウスに比較して、減少したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価を示した（図８Ａ）。このことにより、α−ＧａｌＣｅｒがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制することが確認された。
【０１１０】
対照的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＪＡ１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたＪＡ１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価に有意な差はなかった（図８Ｂ〜８Ｄ）。これらの結果は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリドに対する応答のα−ＧａｌＣｅｒ誘導性の阻害が、不変異体ＮＫＴ細胞を必要とすることを示唆している。
【０１１１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＪＡ２１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスの抗体力価に比較して、α−ＧａｌＣｅｒ非存在下でＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＣ５７Ｌ／６野生型マウスにおいて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は低かった（図９）。これらの結果は、不変異体ＮＫＴ細胞が、α−ＧａｌＣｅｒ非存在下でさえＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリドに対する抗体応答に負の作用を有し得、この負の作用がα−ＧａｌＣｅｒ存在下においてさらに強力であることを示している。
【０１１２】
さらなる実験が、α−ＧａｌＣｅｒによるサッカリド抗原に対する免疫応答の抑制が、６週齢と８週齢の間のマウスにおいてみられることを実証している（図１０）。
【０１１３】
（実施例２：α−ＧａｌＣｅｒは、サッカリド抗原結合体に対する免疫応答を増強する）
α−ＧａｌＣｅｒをＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）由来のサッカリド抗原とともに投与したときに観察された抗体力価の減少と対照的に、α−ＧａｌＣｅｒの投与は、キャリアタンパク質に結合体化されたサッカリドに対する抗体応答を増強させた。
【０１１４】
Ｈｉｂヒト血清アルブミン結合体（Ｈｉｂ−ＨＳＡ）およびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスは、Ｈｉｂ−ＨＳＡ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスよりかなり高いＨｉｂ特異的Ｉｇ力価を示した（図１１）。同様に、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いる免疫は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスに比較して、ＭｅｎＣ特異的Ｉｇ力価における有意な増加を示した（図７、図１Ｃのスケジュールに従って免疫された）。
【０１１５】
図５に示されるように、ＭｅｎＣに対する抗体応答はＭｅｎＣのみを用いて免疫されたマウスにおいて観察されなかったが、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスは、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスに比較してＭｅｎＣ−特異的抗体力価における有意な上昇を示した。結合体とα−ＧａｌＣｅｒとの混合は、サッカリドおよび結合体の両方に対する抗体応答を増強した。
【０１１６】
ＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いる免疫はまた、ＭｅｎＡ−特異的Ｉｇ力価における上昇を生じた（図６）。しかしながら、同時に実施された実験において、非結合体化ＭｅｎＡサッカリドにおけるα−ＧａｌＣｅｒの強力な阻害作用は観察されなかった。
【０１１７】
まとめると、α−ＧａｌＣｅｒはサッカリド抗原に対する免疫応答を阻害し得るが、この作用は逆転され得、そしてサッカリド抗原がキャリア結合体化される場合、サッカリド抗原に対する免疫応答はα−ＧａｌＣｅｒにより増強され得る。
【０１１８】
本発明は例示のみによって記載されており、詳細の改変は本発明の精神および範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。６週齢の雌性マウスの４群（Ｃ５７Ｌ／６ ＷＴ、ＣＤ１ｄ＋／−、ＣＤ１ｄ−／−、またはＪＡ１８−／−）を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）の２３の異なる血清群由来のポリサッカリドの混合物３．５μｇ〜１０μｇ、または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）および０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は５０μｌの容量で筋肉内であった。このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し（４ｄｐ１、８ｄｐ１、１２ｄｐ１）、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。初回免疫から１０週後または１２週後に、すべてのマウスを、ＳＰのみ３．５μｇ〜１０μｇの追加免疫用量を用いて免疫した。このマウスを追加免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し（４ｄｐ２、８ｄｐ２、１２ｄｐ２）、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。初回免疫から１８〜２２週後、このマウスを屠殺し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞をＥｌｉｓｐｏｔにより決定した。
【０１２５】
Ｂ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。図１−Ａと同様であるが、免疫には５０μｌ中３．５μｇのＳＰを使用した。
【０１２６】
Ｃ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいて、タンパク質キャリアと単純に結合体化されたまたは混合された異なるサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１０群を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）１０μｇのＭｅｎＣポリサッカリド、４）２０μｇのＣＲＭタンパク質キャリア、５）３０μｇのＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体、６）ＣＲＭタンパク質キャリアを混合された１０μｇＭｅｎＣポリサッカリド、または３）〜６）の組成物およびα−ＧａｌＣｅｒ（７〜１０の群）を用いて、０日に初回免疫した。マウスを、初回免疫してから２週間後および４週間後に初回免疫した同じ組成物を用いて追加免疫した。マウスを、最初の初回免疫から２週後、４週後および６週後（２ｗｐ１、２ｗｐ２および２ｗｐ３）に採血し、ＭｅｎＣポリサッカリドおよびＣＲＭキャリアの両方に対する抗体のレベルを測定した。
【図２】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたマウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスにおいて低い。３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）のみ（黒四角）または３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（白四角）を用いて初回免疫してから４日後、８日後および１２日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価（幾何平均）を示す（＊はＳＰのみに対するｐ＜０．０５を示し、＊＊はＳＰのみに対するｐ＜０．０１を示す）。
【図３】Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫および追加免疫されたマウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は低い。Ａ）３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびＰＢＳを用いて初回免疫してから８日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）（黒）または３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫してから８日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）（グレイ）。（これらのデータは、４つの実験からプールされる）。Ｂ）３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いる追加免疫から８日後の、同じマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）。（これらのデータは、実験１８、１９および２９よりプールされる）。３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて初回免疫されたマウスの結果を黒で示し、３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスの結果をグレイで示す。
【図４】ＰＢＳを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスに比較して、α−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫しＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスにおいて、１０６個の脾細胞あたりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数は少ない。２つの群のマウスを、０日に０．１μｇまたは１．０μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（ａＧＣ）を用いて初回免疫し、１２週後１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）を用いて免疫した。第３群のマウスを、０日にＰＢＳを用いて免疫し、１２週後に１１．５μｇのＳＰを用いて免疫した。第４群のマウスを、０日および１２週後の両方にＰＢＳを用いて免疫した。最初の初回免疫から２２週後、マウスを屠殺し、１０６個の脾細胞あたりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数をＥｌｉｓｐｏｔにより測定した。
【図５】α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体においてＭｅｎＣサッカリドおよびＣＲＭタンパク質キャリアの両方に対する特異的抗体応答を増強する。野生型マウスを、ＣＲＭタンパク質キャリアを用いて混合された１０μｇのＭｅｎＣポリサッカリド、２０μｇＣＲＭタンパク質キャリア、１０μｇＭｅｎＣポリサッカリド（ＭｅｎＣ＋ＣＲＭ）または３０μｇのＭｅｎ−ＣＲＭ結合体、あるいはα−ＧａｌＣｅｒを用いて混合された同じ組成物を用いて免疫した。マウスを、初回免疫してから２週間後および４週間後に初回免疫した同じ組成物を用いて追加免疫した。図の一番上の線は、ＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体のみ（黒）、あるいはＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒ（グレイ）を用いて免疫されたマウスにおける、第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第２免疫から１週間後（２ｗｐ２）のＭｅｃ−特異的Ｉｇ力価を示す。図の２番目の線は、ＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体のみ（黒）、あるいはＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒ（グレイ）を用いて免疫されたマウスにおける、第２免疫から２週間後（２ｗｐ２）および第３免疫から２週間後（２ｗｐ３）のＣＲＭ−特異的Ｉｇ力価を示す。
【図６】α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体に対する免疫応答を増強する。マウスを、α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいて、１０μｇのＭｅｎＡポリサッカリドまたはＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫した。ＭｅｎＡポリサッカリドに対する抗体力価を、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に測定した。α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＡポリサッカリドに対する免疫応答を増強した。
【図７】抗体応答は、α−ＧａｌＣｅｒおよびＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫されたマウスにおいて増強される。マウスを、ＰＢＳ（黒）またはα−ＧａｌＣｅｒと混合された３０μｇのＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫した。各群のマウスを３回免疫した。ＭｅｎＣ特異的力価を、第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第３免疫から１週間後（１ｗｐ３）に測定した。
【図８】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する応答のα−ＧａｌＣｅｒ誘導性の阻害は、不変異体ＮＫＴ細胞を必要とする。３．５μｇＳＰのみ（グレイの記号）または３．５μｇＳＰおよび０．１μｇα−ＧａｌＣｅｒ（黒の記号）を用いてマウスを初回免疫してから４日後、８日後および１２日後のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルを：Ａ）野生型マウス、Ｂ）Ｊａ１８−／−マウス、Ｃ）ｍＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＤ）ｍＣＤ１ｄ−／＋マウスにおいて比較した。α−ＧａｌＣｅｒと組み合わせてＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて免疫されたＪａ１８−／−マウス、ＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＣＤ１ｄ−／＋マウスと比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて免疫されたＪａ１８−／−マウス、ＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＣＤ１ｄ−／＋マウスにおける抗体力価に有意な差は見られなかった。
【図９】不変異体ＮＫＴは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する抗体応答に対して負の調節役割を有する。図１Ｂにおけるプロトコールに従って、単にＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いてマウスを初回投与してから４日後、８日後および１２日後のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベル（ＩｇＭ力価幾何平均）を比較した。図９Ａは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７ｍＣＤ１ｄ＋／−マウスにおける抗体力価（三角）と比較する。図９Ｂは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７ｍＣＤ１ｄ−／−マウスにおける抗体力価（三角）と比較する。図９Ｃは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７Ｊａ２８１−／−マウスにおける抗体力価（丸）と比較する。野生型マウスにおける抗体力価は、Ｊａ２８１−／−マウス、ＣＤ１−／−マウスおよびＣＤ１＋／−マウスより低い。
【図１０】α−ＧａｌＣｅｒは、３〜８週齢のマウスにおいてＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒに対する免疫応答を抑制する。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ抗体のレベル（幾何平均）を３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）のみ（白）または３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（黒）を用いて２週齢（２Ｗ）、３週齢（３Ｗ）、４週齢（４Ｗ）、５週齢（５Ｗ）および６〜８週齢（６〜８Ｗ）のマウスを初回免疫から８日後比較される。
【図１１】抗体応答は、α−ＧａｌＣｅｒおよびＨｉｂ−ＨＳＡ結合体を用いて免疫されたマウスにおいて増強される。マウスを、ＰＢＳ（検出されるには非常に低い結果）、α−ＧａｌＣｅｒ（斜線）またはＭＦ５９（グレイ）を用いて混合された、１５μｇのＨｉｂ−ヒト血清アルブミン（Ｈｉｂ−ＨＳＡ）結合体を用いて免疫した。各群のマウスを３回免疫した。Ｈｉｂ特異的力価を第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第３免疫から１週間後（１ｗｐ３）測定した。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、特にサッカリド抗原のためのワクチンアジュバントの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景分野）
ワクチンは、しばしば追加免疫活性に対するアジュバントを含む。公知のアジュバントの例として、アルミニウム塩、水中油型乳剤、サポニン、サイトカイン、脂質およびＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。近年、アルミニウム塩およびモノホスホリル脂質ＭＦ５９ＴＭのみが、ヒトでの使用について認可されている。しかしながら、アルミニウム塩は安全性の注意を必要とし、いくつかの抗原と不適合性である。それゆえ、さらにアジュバントを開発する必要がある。
【０００４】
αーガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、糖脂質、より具体的にはグリコシルセラミドであり、本来海洋性の海綿から単離される［非特許文献１］。α−ＧａｌＣｅｒは、不変異体のナチュラルキラーＴ細胞に対してＭＨＣクラスＩ様分子である、ＣＤ１ｄにより提示され、腫瘍細胞に対するナチュラルキラーＴ細胞応答を誘導する能力について本来調べられた［特許文献１］。不変異体のナチュラルキラーＴ細胞はまた、Ｂ細胞活性を誘導することが示されており、Ｂ細胞増殖および抗体産生を増強する［非特許文献２、非特許文献３］。近年、α−ＧａｌＣｅｒは、種々の共投与タンパク質抗原に関してアジュバントとして作用することが示されている［特許文献２］。照射されたスポロゾイトまたはマラリア抗原を発現している組み換えウイルスとα−ＧａｌＣｅｒとの共投与は、マウスにおいて防御性抗マラリア免疫のレベルを増強することが示されている［非特許文献４］。α−ＧａｌＣｅｒはまた、ＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子をコードしているＤＮＡワクチンに関してアジュバントとしてはたらくことが示されている［非特許文献５］。
【０００５】
しかしながら、すべてのワクチンがタンパク質抗原を含有するわけではない。いくつかの市販のワクチンは、サッカリド抗原を含有する。例えば、ＰｎｅｕｍｏｖａｘＴＭは、２３の肺炎球菌血清型由来のサッカリド抗原を含有する。ＭｅｎｃｅｖａｘＴＭおよびＭｅｎｏｍｕｎｅＴＭは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５由来のサッカリド抗原を含有する髄膜炎菌ワクチンである。それゆえ、サッカリド抗原に対するアジュバントとしてα−ＧａｌＣｅｒの使用を広げることが所望される。
【０００６】
ＤＮＡおよびタンパク質抗原に対するアジュバントとしてのα−ＧａｌＣｅｒとの成功にもかかわらず、本発明者らは、驚くことに、いくつかのサッカリド抗原に関してアジュバントとして作用しないことを見出した。対照的に、これら抗原とα−ＧａｌＣｅｒとの投与は、アジュバントを用いないコントロールに比較して、抗体力価の実質的な減少を引き起こすことが見出されている。
【特許文献１】欧州特許出願公開第１０１８５４８号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０９８１２号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｔｏｒｉら、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」、１９９４年、５０：ｐ.２７７１〜２７８３
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２００３年、２１：Ｓ２／４８〜Ｓ２／５４
【非特許文献３】Ｇａｌｌｉら、「Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ」、２００３年、１９７：ｐ.１０５１〜１０５７
【非特許文献４】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａら、「Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ」、２００２年、５：ｐ.６１７〜６２４
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇら、要旨３９６、第１０回 Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、α−ＧａｌＣｅｒが存在する場合の、抗サッカリド抗体応答の阻害の問題を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
驚くことに、サッカリド抗原がキャリアに結合体化される場合、α−ＧａｌＣｅｒの存在下おける抗サッカリド免疫応答の抑制は逆転され得、サッカリド抗原に対する免疫応答はさらに増強され得ることが見出されている。それゆえ、本発明は、（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバント、を含む組成物を提供する。
【０００９】
（α−グリコシルセラミドアジュバント）
本発明の組成物中に含まれるアジュバントは、当該分野において公知の任意の適したα−グリコシルセラミドであり得る。好ましくは、α−グリコシルセラミドアジュバントは、式（Ｉ）の化合物：
【００１０】
【化１】
であり、ここで、
Ｒ１はＨまたはＯＨを表し、
Ｘは１と３０との間の整数を表し、
Ｒ２は以下（ａ）〜（ｅ）からなる群；
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３
から選択される置換基を表し（ここでＹは、５と１７の間の整数を表す）、
Ｒ３はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３またはモノサッカリドを表し、
Ｒ４はＯＨまたはモノサッカリドを表し、
Ｒ５はＨ、ＯＨまたはモノサッカリドを表し、
Ｒ６はＨ、ＯＨまたはモノサッカリドを表し、そして
Ｒ７はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたはモノサッカリドを表す。
【００１１】
Ｘは、好ましくは７と２７との間であり、より好ましくは９と２４との間であり、そしてより好ましくは１３と２０との間である。Ｙは、好ましくは７と１５との間であり、さらに好ましくは９と１３との間である。
【００１２】
Ｒ３がモノサッカリドである場合、好ましくはα−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１３】
Ｒ４がモノサッカリドである場合、好ましくは、β−Ｄ−ガラクトフラノースまたはＮ−アセチルα−Ｄ−ガラクトピラノースから選択される。
【００１４】
Ｒ５がモノサッカリドである場合、好ましくは、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１５】
Ｒ６がモノサッカリドである場合、好ましくは、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースまたはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択される。
【００１６】
Ｒ７がモノサッカリドである場合、好ましくは、メチルα−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチルα−Ｄ−グルコピラノシドまたはメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドから選択される。
【００１７】
好ましくは、Ｒ５およびＲ６は異なる。好ましくは、Ｒ５およびＲ６の１つはＨである。
【００１８】
本発明の組成物の含有物として適したα−グリコシルセラミドアジュバントのさらなる例は、参考文献２に提供される。
【００１９】
好ましくは、α−グリコシルセラミドアジュバントは、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）（すなわち、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝ＨかつＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）である。本発明の組成物に含まれるα−ＧａｌＣｅｒは、直接海洋性の海綿体から単離されてもよいし、または化学的に合成された生成物であってもよい。本発明の組成物での使用に適したα−ガラクトシルセラミドの例は、参考文献８に提供される。好ましいα−ガラクトシルセラミドは、ＫＲＮ７０００であり、これは式（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオールを有する。ＫＲＮ７０００の合成は、参考文献８に記載される。
【００２０】
α−グリコシルセラミドアジュバントはまた、α−ＧａｌＣｅｒに比較して脂肪アシル鎖および／またはスフィンゴシン鎖が切り取られたα−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログであり得る。α−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログの例は、参考文献９に提供される。α−ＧａｌＣｅｒの好ましい短縮型アナログは、「ＯＣＨ」であり、好ましいα−ＧａｌＣｅｒに比較して、脂肪アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、そしてスフィンゴシン鎖は９つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ２＝ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝ＨおよびＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）。さらに好ましいα−ＧａｌＣｅｒの短縮型アナログは、α−ＧａｌＣｅｒに比較して、脂肪アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、そしてスフィンゴシン鎖が７つまたは３つの炭化水素の切断を有するアナログを含む（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝Ｈ、Ｒ７＝ＣＨ２ＯＨおよびＲ２は、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）６ＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）１０ＣＨ３である）。
【００２１】
（サッカリド抗原）
好ましくは、本発明の組成物に含まれるキャリアに結合体化されるサッカリド抗原は、細菌性サッカリドであり、特に細菌性莢膜サッカリドである。
【００２２】
本発明の組成物に含まれる得る細菌性莢膜サッカリドの例としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型またはＶＩＩＩ型）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（代表的株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどが挙げられる。本発明の組成物に含まれ得る他のサッカリドとしては、グルカン（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるもののような真菌性グルカン）および真菌性莢膜サッカリド（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの莢膜由来）が挙げられる。
【００２３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ（ＭｅｎＡ）莢膜は、Ｃ３およびＣ４の位置に部分的にＯ−アシル化を有する（α１→６）連結Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（ＭｅｎＢ）莢膜は、（α２→８）連結シアル酸のホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）莢膜サッカリドは、７および／または８の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する（α２→９）連結シアル酸のホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５サッカリドは、シアル酸−ガラクトースジサッカリドユニット［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］からなるポリマーである。これはシアル酸の７および９の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する［１０］。ジサッカリド反復ユニットがガラクトースの代わりにグルコースを含む［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］ことを除いて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙサッカリドは、血清群Ｗ１３５サッカリドに類似している。これはまた、シアル酸の７および９の位置で可変性のＯ−アセチル化を有する。
【００２４】
ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜（Ｈｉｂ）サッカリドは、リボース、リビトールおよびリン酸塩のポリマー［「ＰＲＰ」、（ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）］である。
【００２５】
本発明の組成物は、サッカリド抗原結合体の混合物を含有し得る。好ましくは、本発明の組成物は、１つより多いＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群由来のサッカリド抗原を含有し、例えば、組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど由来のサッカリド結合体を含有し得る。好ましい組成物は、血清群ＣおよびＹ由来のサッカリド結合体を含有する。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含有する。
【００２６】
混合物が血清群Ａ由来の髄膜炎菌性サッカリドおよび少なくとも１つの他の血清群サッカリドを含む場合、任意の他の血清群サッカリドに対するＭｅｎＡサッカリドの比（ｗ／ｗ）は１より大（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより高い）であり得る。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来のサッカリドに関する好ましい比は：１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。
【００２７】
さらに好ましい本発明の組成物は、Ｈｉｂサッカリド結合体および少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群由来のサッカリド結合体、好ましくは１つより多いＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群由来のサッカリド結合体を含有する。例えば、本発明の組成物は、Ｈｉｂ結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来の結合体を含み得る。
【００２８】
本発明は、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリド結合体を含有する組成物を含む。好ましくは、この組成物は、１つより多いＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型を含有する。好ましい組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ（７−バレント）由来のサッカリド結合体を含有する。組成物はさらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１および５（９−バレント）由来のサッカリド結合体を含有し得るか、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、３および７Ｆ（１１−バレント）由来のサッカリド結合体を含有し得る。
【００２９】
さらに本発明の好ましい組成物は、肺炎球菌サッカリド結合体およびＨｉｂおよび／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のサッカリド結合体を含有する。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体ならびにＨｉｂサッカリド結合体を含有し得る。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含有し得る。本発明に従う組成物はまた、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のサッカリド結合体、Ｈｉｂサッカリド結合体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のサッカリド結合体を含み得る。
【００３０】
個々のサッカリド抗原結合体の防御効果は、それらを組み合わせることにより除かれないことが好ましいが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得る。
【００３１】
（莢膜サッカリド抗原の調製）
莢膜サッカリド抗原の調製のための方法は、周知である。例えば参考文献１１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のサッカリド抗原の調製を記載する。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のサッカリド抗原の調製は、参考文献１２の第１４章に記載される。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原およびサッカリド結合体の調製は、当該分野において記載されている。例えば、ＰｒｅｖｅｎａｒＴＭは、７バレントの肺炎球菌結合体ワクチンである。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のサッカリド抗原の調製のためのプロセスは、参考文献１３および１４に詳細に記載される。
【００３２】
サッカリド抗原は、化学的に修飾され得る。例えば、１つ以上のヒドロキシル基を保護基で置換して修飾され得る。アセチル基が保護基で置換され加水分解が妨げられる場合、これは特に髄膜炎菌血清型Ａに有用である［１５］。そのような修飾サッカリドは、本発明の意味においては、なお血清型Ａサッカリドである。
【００３３】
莢膜サッカリドはオリゴサッカリドの形成において使用され得る。これらは精製した莢膜ポリサッカリドの断片化により（例えば加水分解により）簡便に形成され、通常その後所望されるサイズの断片に精製される。
【００３４】
ポリサッカリドの断片化は、好ましくは、オリゴサッカリドにおける３０未満の最終的な平均重合度（ＤＰ）を与えるために実施され得る。ＤＰは簡便に、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色アッセイにより測定され得る［１６］。
【００３５】
加水分解が実施される場合、加水分解物は、一般的に短い長さのオリゴサッカリドを除去するためにサイズ分類される［１７］。これは限外濾過に続くイオン交換クロマトグラフィーのような種々の方法で達成され得る。約６以下の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは血清型Ａにおいて除去され、そして約４未満の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは血清型Ｗ１３５およびＹにおいて除去される。
【００３６】
（キャリア）
好ましくは、キャリアはタンパク質である。本発明の組成物においてサッカリド抗原に結合体化される好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような細菌毒素である。適したキャリアタンパク質としては、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体［１８〜２０］、ジフテリアトキソイド、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［２１］、合成ペプチド［２２、２３］、熱ショックタンパク質［２４、２５］、百日咳タンパク質［２６、２７］、サイトカイン［２８］、リンホカイン［２８］、ホルモン［２８］、成長因子［２８］、Ｎ１９タンパク質［３０］のような、種々の病原体由来抗原の複合ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［２９］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［３１、３２］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［３３］、肺炎球菌溶血素［３４］、鉄取り込みタンパク質［３５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［３６］などが挙げられる。
【００３７】
サッカリド抗原のキャリアへの結合は、好ましくは−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質のリシン残基の側鎖またはアルギニン残基の側鎖における）を介する。サッカリドは遊離アルデヒド基を有する場合、このアルデヒド基は、キャリア中のアミンと反応して、還元アミノ化により結合体を形成する。結合はまた、−ＳＨ基（例えば、システイン残基の側鎖における）を介し得る。
【００３８】
組成物が１つより多いサッカリド抗原を含有する場合、１つより多いキャリアを使用することが可能である（例えば、キャリア抑制の危険性を減少させるために）。従って、異なるキャリアが異なるサッカリド抗原について用いられ得る。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａサッカリドは、ＣＲＭ１９７に結合体化される一方で、Ｃ型サッカリドは、破傷風トキソイドに結合体化され得る。ある特定のサッカリド抗原に１つより多いキャリアを使用することもまた可能である。このサッカリドは、２つの群にあり、いくつかはＣＲＭ１９７に結合体化され、そしてその他は破傷風トキソイドに結合される。しかしながら一般的に、同じキャリアをすべてのサッカリドに使用することが好ましい。
【００３９】
単一キャリアタンパク質は１つより多いサッカリド抗原を保持する［３７、３８］。例えば、単一キャリアタンパク質は、異なる病原体由来のサッカリドまたは同じ病原体の異なる血清型由来のサッカリドに結合体化し得る。この目的を果たすために、異なるサッカリドが結合体化反応の前に混合され得る。しかしながら一般的に、各血清群について別個の結合体を有することが好ましく、異なるサッカリドは結合体化後に混合される。別々の結合体は、同じキャリアをベースにし得る。
【００４０】
１：５（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち、過剰のサッカリド）との間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましく、同様に１：１．２５と１：２．５との間の比が好ましい。
【００４１】
結合体は、結合体化において遊離キャリアとともに使用され得る［３９］。所定のキャリアタンパク質が本発明の組成物において遊離型および結合型の両方で存在する場合、好ましくは、非結合型形態は、全体として組成物の総キャリアタンパク質量のたったの５％にすぎず、さらに好ましくは重量で２％未満の存在である。
【００４２】
結合体化の後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドは別々にされ得る。多くの適した方法があり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる［参考文献４０および４１などを参照のこと］。
【００４３】
任意の適した結合体化反応が、必要とされる場合、任意の適したリンカーとともに使用され得る。
【００４４】
サッカリドは代表的に、結合体化前に活性化されるかまたは機能化される。活性化には、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［４２、４３など］）のようなシアニル化試薬が関与し得る。他の適した技術では、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（参考文献４４の緒言も参照のこと）を使用する。
【００４５】
リンカー基を介する連結は、任意の公知の手順を使用して作られ得、例えば、この手順は、参考文献４５および４６に記載される。結合の１つの型としては、ポリサッカリドの還元アミノ化が挙げられ、生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一方の端に結合させ、次いでタンパク質をこのアジピン酸リンカー基のもう一方の端に結合させる［４７、４８］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［４９］、ニトロフェニル−エチルアミン［５０］、ハロアシルハライド［５１］、グリコシド結合［５２］、６−アミノカプロン酸［５３］、ＡＤＨ［５４］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５５］などが挙げられる。リンカーの使用の代替として、直接的連結が使用され得る。タンパク質への直接的連結は、例えば参考文献５６および５７に記載されるように、ポリサッカリドの酸化およびその後のタンパク質との還元アミノ化を包含する。
【００４６】
アミノ基のサッカリドへの導入（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２で置換することによる）に続きアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドジエステル）を用いる誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスが好ましい。
【００４７】
結合後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドは、別々にされ得る。多くの適した方法があり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる［参考文献５８および５９などを参照のこと］。
【００４８】
本発明の組成物が脱重合化サッカリドを含有する場合、脱重合は結合体化より前に行うことが好ましい。
【００４９】
（組成物のさらなる抗原性化合物）
本発明の組成物は、少なくとも１つのキャリアに結合体化されたサッカリド抗原を含有する。しかしながら、本発明の組成物は、上に記載されるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原に加え、１つ以上の以下の抗原を含有し得る：
−参考文献６０〜６６のもののような、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原。タンパク質「２８７」（以下を参照のこと）および誘導体（例えば「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
−参考文献６７、６８、６９、７０などに開示されるもののような、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物。
−Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質抗原（例えば、参考文献７１に開示されるようなＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３由来）。
−不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、７２、７３；参考文献７８の第１５章］。
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、７３、７４；参考文献７８の第１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば７５］。
−必要に応じてペルタクチンおよび／または凝集原２および凝集原３とも組み合わせた、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）のような、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献７６および７７；参考文献７８の第２１章］。
−ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原［参考文献７８の第１３章］。
−破傷風トキソイドのような破傷風抗原［例えば、参考文献７８の第２７章］。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、参考文献６０、６１、６２］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、８６］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献８７］。
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、８８、８９；参考文献７８の第２４章］。
−凍結乾燥不活化ウイルス［例えば９１、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］のような狂犬病抗原［例えば９０］。
−麻疹、ムンプスおよび／または風疹抗原［例えば、参考文献７８の第１９章、第２０章および２６章］。
−ＣａｇＡ［９２〜９５］、ＶａｃＡ［９６、９７］、ＮＡＰ［９８、９９、１００］、ＨｏｐＸ［例えば１０１］、ＨｏｐＹ［例えば１０１］のようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原および／またはウレアーゼ。
−血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原［例えば、参考文献７８の１７章および１８章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば１０２］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ストレプトコッカスＢ群）由来のタンパク質抗原［例えば、１０３、１０４］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ストレプトコッカスＡ群）由来の抗原［例えば、１０４、１０５、１０６］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば１０７］。
−呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［１０８、１０９］）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［１１０］）のようなパラミクソウイルス由来の抗原。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ［例えば、１１１、１１２、１１３］由来の抗原
−黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、４つの血清型のデング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルスのようなフラビウイルス科ファミリー（フラビウイルス属）のウイルス由来の抗原。
−古典的なブタ熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢性ウイルスおよび／またはボーダー病ウイルス由来のようなペスチウイルス抗原
−例えばパラボウイルスＢ１９由来のパラボウイルス抗原。
【００５０】
混合物は、さらにこれら抗原を１つ以上含有し、必要とされる場合解毒化され得る（例えば、化学的手法および／または遺伝子的手法による百日咳毒素の解毒化）。
【００５１】
ジフテリア抗原が混合物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。
【００５２】
混合物中の抗原は、代表的にそれぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分である。
【００５３】
混合物中のタンパク質抗原の代替物として、抗原をコードしている核酸が使用され得る。従ってこの混合物のタンパク質成分が、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミドの形成におけるＤＮＡ）により置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原を模倣したタンパク質（例えばミモトープ［１１４］または抗イディオタイプの抗原）を含み得る。
【００５４】
（薬学的組成物の処方物）
本発明の結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントは、免疫原性組成物およびワクチンへの封入に特に適している。それゆえ本発明のプロセスは、免疫原性組成物またはワクチンとして結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントを処方する工程を包含し得る。本発明は、この方法において得ることのできる組成物およびワクチンを提供する。
【００５５】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、キャリアタンパク質に結合体化されたサッカリド抗原およびα−グリコシルセラミドアジュバントに加え、代表的に「薬学的に受容可能なキャリア」を含み、このキャリアは、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体では誘導しない任意のキャリアを含む。適したキャリアは、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１１５］、脂質凝集体（油滴またはリポソームのような）および不活化ウイルス粒子のような、代表的に大きく、ゆっくり代謝される巨大分子である。そのようなキャリアは当業者において周知である。本ワクチンはまた、水、生理食塩水、グリセロールなどのような希釈剤を含み得る。さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などのような補助剤が存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、参考文献１１６において入手可能である。
【００５６】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効量のサッカリド抗原、および必要とされるならば、上記に言及した任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単回用量または一連の投与の一部としてかのいずれかにおいて、個体に投与する量が、処置または予防に関して有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体的状態、年齢、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫システムの能力、所望される予防の度合い、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価および他の関連要因に依存して変化する。この量は、比較的広い範囲になることが期待され、この範囲は、慣習的な試験を通して決定され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュール（例えば、追加免疫投薬が挙げられる）であり得る。
【００５７】
本ワクチンは、他の免疫調節物質と併用して投与され得る。α−グリコシルセラミドは、本発明の免疫原性組成物内においてアジュバントとして作用する。本ワクチンは、付加的なアジュバントを含み得る。そのようなアジュバントとして以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明における、アジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩のような無機塩類が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などのような無機塩類［例えば、参考文献１１７の第８章および第９章を参照のこと］、または異なるミネラル化合物の混合物を含む。この化合物は任意の適した形態（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）をとり、吸着することが好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る［１１８］。
【００５８】
代表的なリン酸アルミニウムアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間で、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌにおいて含まれる非結晶性のヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムを用いる吸着が、例えば１用量あたりの結合体あたり５０μｇと１００μｇとの間のＡｌ３＋で用いられ得る。リン酸アルミニウムを吸着に使用し、抗原をアジュバントに吸着させないことが所望される場合、このことは溶液中に遊離リン酸イオンを含むことにより（例えば、リン酸緩衝液の使用により）促進される。
【００５９】
Ｂ．油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、ＭＦ５９［参考文献１１７の第１０章、参考文献１１９も参照のこと］（ミクロ流動器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子に処方される５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５）のようなスクアレン−水乳剤が挙げられる。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もまた使用され得る。
【００６０】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１１７の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根さらに花においてさえ見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、シュッコンカスミソウ（ブライデスベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（サボンソウ根）から、商業的に入手され得る。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１のような精製処方物およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販される。
【００６１】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製される。これらの技術を使用して精製された特定の画分が同定されており、その精製画分としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献１２０に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含み得る［１２１］。
【００６２】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１１７の第２３章］。ＩＳＣＯＭとしては、代表的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭとしては、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上が挙げられる。ＩＳＣＯＭは、さらに参考文献１２１〜１２３に記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは余分な界面活性剤を含まない［１２４］。
【００６３】
サポニンベースのアジュバントの開発についての概説は、参考文献１２５および１２６に見出され得る。
【００６４】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的に、必要に応じてリン脂質と組み合わせられるかまたは処方されるウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に、いかなる天然のウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質は組換えによって産生されるか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（ＨＡまたはＮＡのような）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（コアタンパク質またはカプシドタンパク質のような）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒト乳頭腫ウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡ−ファージ由来のタンパク質、Ｑβ−ファージ由来のタンパク質（コートタンパク質のような）、ＧＡ−ファージ由来のタンパク質、ｆｒ−ファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質、およびＴｙ由来のタンパク質（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１のような）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１２７〜１３２でさらに考察される。ビロソームはさらに、例えば、参考文献１３３で考察される。
【００６５】
Ｅ．細菌性または微生物性誘導体
本発明における使用に適したアジュバントとしては、腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素、ならびにそれらの解毒誘導体のような細菌性または微生物性の誘導体が挙げられる。
【００６６】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６つのアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、参考文献５５に開示される。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過されるほど十分に小さい［１３４］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）のようなモノホスホリル脂質Ａ模倣物が挙げられる［１３５、１３６］。
【００６７】
脂質Ａ誘導体としては、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の脂質Ａの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献１３７および１３８に記載される。
【００６８】
本発明における、アジュバントとしての使用に適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンへのリン酸結合により連結される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【００６９】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾物のようなヌクレオチド修飾物／アナログを含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献１３９、１４０および１４１は、可能なアナログ置換（例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１４２〜１４７においてさらに考察される。
【００７０】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはモチーフＴＴＣＧＴＴのようなＴＬＲ９に関し得る［１４８］。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのようなＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのようなＣｐＧ配列は、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１４９〜１５１において考察される。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００７１】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、その３’末端で結合され得、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成する。例えば、参考文献１４８および１５２〜１５４を参照のこと。
【００７２】
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または百日咳菌（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献１５５に記載され、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１５６に記載される。毒素または類毒素は、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒性の変異を含み；好ましくは、Ｂサブユニットは変異されない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２のような解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１５７〜１６４に見出され得る。アミノ酸置換に関する数の参照は、好ましくは、参考文献１６５に記載のＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントをベースとし、特にその全体が本明細書中において参考として援用される。
【００７３】
Ｆ．ヒト免疫調節因子
本発明において、アジュバントとして使用に適したヒト免疫調節因子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１６６］など）［１６７］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子のようなサイトカインが挙げられる。
【００７４】
Ｇ．生体付着物および粘膜付着物
生体付着物および粘膜付着物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適した生体付着物としては、エステル型のヒアルロン酸マイクロスフィア［１６８］または架橋したポリ（アクリル酸）の誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロースのような粘膜付着物が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る[１６９]。
【００７５】
Ｈ．微粒子
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒子、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）は、生体分解性および非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成され、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、必要に応じて負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を用いて）を有するように処理される。
【００７６】
Ｉ．リポソーム（参考文献１１７の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献１７０〜１７２に記載される。
【００７７】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる[１７３]。そのような処方物はさらに、オクトキシノールとの組み合わせでポリオキシエチレンソルビタンエステルのサーファクタント[１７４]および少なくとも１つのオクトキシノールのようなさらなる非イオン性サーファクタントとの組み合わせでポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルのサーファクタントを含む[１７５]。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００７８】
Ｋ．ポリホスファザン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば参考文献１７６および１７７に記載される。
【００７９】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【００８０】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントを使用するために適したイミダゾキノロン化合物の例としては、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）が挙げられ、さらに参考文献１７８および１７９に記載される。
【００８１】
本発明はまた、上記に同定される１つ以上のアジュバントの局面の組み合わせを含む。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油型乳剤［１８０］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［１８１］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［１８２］；（５）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤と３ｄＭＰＬとの組み合わせ［１８３］；（６）大きい粒子サイズの乳剤を生成するためにサブミクロン乳剤中に微流動化させるかまたはボルテックスされたかのいずれかである、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）；ならびに（８）１つ以上の無機塩類（アルミニウム塩のような）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬのような）。
【００８２】
免疫刺激物質として作用する他の基質は、参考文献１１７の第７章に開示される。
【００８３】
（医学的方法および医学的使用）
一度処方されると、本発明の組成物は、直接被験体に投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特にヒト被験体が処置され得る。本ワクチンは特に、ワクチン接種をされる子供および１０代に有用である。これらは、全身ルートおよび／または粘膜ルートにより送達され得る。
【００８４】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され；注射前の液体ビヒクルのなかで溶液に適した固体の形態または懸濁液に適した固体の形態もまた調製され得る。本調製物はまた、アジュバントの効果を増強するために乳化されるか、またはリポソームにカプセル化され得る。本組成物の直接的な送達は、一般的に非経口的である（例えば、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかへの注射により、あるいは組織の間質に送達されることにより）。本組成物はまた、病巣に投与され得る。他の投与様式としては、経口投与、肺内投与、坐剤および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ)または経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば参考文献１８４を参照のこと）、針無しおよびハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュールであり得る（例えば、ブースター投薬を含む）。
【００８５】
本発明のワクチンは、好ましくは無菌である。これらは、好ましくは発熱物質を含まない。これらは好ましくは、例えばｐＨ６とｐＨ８との間、一般的には約ｐＨ７に緩衝化される。ワクチンが水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝液の使用が好ましい［１８５］。
【００８６】
本発明のワクチンは、低レベル（例えば＜０．０１％）で界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０のようなＴｗｅｅｎ）を含み得る。本発明のワクチンは、特に凍結乾燥される場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロース（例えば、約１５ｍｇ／ｍｌ）を含有し得る。
【００８７】
個々の抗原の至適用量は、経験的に評価され得る。しかしながら、一般的に本発明のサッカリド抗原は、１用量あたり各サッカリド０．１μｇと１００μｇとの間の用量で、代表的に０．５ｍｌの投薬容量を用いて投与される。この用量は、代表的に１用量あたり５μｇと２０μｇとの間のサッカリドである。これらの値は、サッカリドとして測定される。
【００８８】
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち感染を予防する）であるか治療的（すなわち感染後の疾患を治療するため）であるかのいずれかであってもよいが、代表的に予防的である。
【００８９】
本発明は、医薬における使用のためにキャリアタンパク質およびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を提供する。
【００９０】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明に従って、患者にワクチンを投与する工程を包含する。特に、本発明は患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは、髄膜炎菌性の疾患、肺炎球菌性の疾患またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して防御的であり、そして体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を含み得る。この患者は、成人または小児であり得る。この患者は、０〜６ヶ月齢、６〜１２ヶ月齢、１〜５年齢、５〜１５年齢、１５〜５５年齢または５５年齢より上の年齢であり得る。好ましくは、この患者は、子供である。本方法は、髄膜炎菌、肺炎球菌またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対してすでに初回免疫されている患者において、追加免疫応答を惹起し得る。
【００９１】
サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントは、同時に、連続的に、または別々に投与され得る。例えば、α−グリコシルセラミドアジュバントは、サッカリド抗原結合体の投与前に哺乳動物を初回免疫するために投与され得るか、またはサッカリド抗原結合体の投与後その結合体に対する哺乳動物の免疫応答を高めるために投与され得る。１つより多いサッカリド抗原結合体が投与される場合、このサッカリド抗原結合体は同時に投与され得、α−グリコシルセラミドアジュバントが投与されると、このサッカリド抗原結合体の混合物に別々に、同時にまたは連続的に投与され得る。
【００９２】
免疫応答を惹起する本方法は、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の初回用量を投与する工程を包含し、そして続いてキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の任意の第２の非アジュバント性用量を投与する工程を包含する。サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントの初回用量は、同時に、連続的にまたは別々に投与され得る。
【００９３】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここでこの医薬はα−グリコシルセラミドアジュバントとともに投与される。
【００９４】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用を提供し、ここでこの医薬はキャリアに結合体化されたサッカリド抗原とともに投与される。
【００９５】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供する。
【００９６】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここでこの患者は、α−グリコシルセラミドアジュバントを用いて前処置されている。
【００９７】
さらに本発明は、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用を提供し、ここで患者は、キャリアに結合体化されたサッカリドを用いて前処置されている。
【００９８】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用を提供し、ここで該患者は、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を用いて前処置されている。
【００９９】
本医薬は、好ましくは免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。本医薬は、好ましくは予防および／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎菌、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである。従って、細菌性髄膜炎のこの予防および／または処置が好ましい。
【０１００】
ワクチンは、標準的動物モデルにおいて試験され得る（参考文献１８６を参照のこと）。
【０１０１】
さらに本発明は：ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原およびｂ）α−グリコシルセラミドアジュバントを含むキットを提供する。
【０１０２】
（定義）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、または何かの付加を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１０３】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１０４】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであり得る。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【実施例】
【０１０５】
（本発明を実施するための様式）
（実施例１：α−ＧａｌＣｅｒは、サッカリド抗原に対する免疫応答を抑制する）
５匹の６週齢の雌性マウス（系統：Ｃ５７ＢＬ／６）４群を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）の２３個の異なる血清群由来の２３個のポリサッカリドの混合物３．５μｇ〜１０μｇ、または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は、１００μｌの容量で筋肉内であった。４群すべてのマウスを、１２週後３．５〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫した。この免疫スケジュールを図１Ａに示す。
【０１０６】
このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後および追加免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスは、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたマウスに比較して、減少したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価（特に初回投薬後（図３Ａ））を示した（図２および図３）。このことは、α−ＧａｌＣｅｒがサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制することを示している。
【０１０７】
１８〜２２週後、マウスを屠殺し、脾臓中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数をＥｌｉｓｐｏｔにより決定した。α−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスの脾臓もまた、ＰＢＳを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスの脾臓に比較して、少ない数のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞を含んでいた（図４）。これらの結果は、α−ＧａｌＣｅｒがサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制するという示唆を支持する。
【０１０８】
さらなる実験を、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスにおいて観察されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する低い抗体応答が不変異体ナチュラルキラーＴ細胞を必要とするか評価するために実施した。６週齢の雌性マウスの４群（Ｃ５７Ｌ／６ ＷＴ、ＣＤ１ｄ＋／−、ＣＤ１ｄ−／−、またはＪＡ１８−／−）を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は５０μｌの容量で筋肉内であった。このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。この免疫スケジュールを図１Ｂに示す。
【０１０９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたＣ５７Ｌ／６野生型マウスは、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＣＤ５７Ｌ／６野生型マウスに比較して、減少したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価を示した（図８Ａ）。このことにより、α−ＧａｌＣｅｒがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリド抗原に対する免疫応答を抑制することが確認された。
【０１１０】
対照的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＪＡ１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたＪＡ１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価に有意な差はなかった（図８Ｂ〜８Ｄ）。これらの結果は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリドに対する応答のα−ＧａｌＣｅｒ誘導性の阻害が、不変異体ＮＫＴ細胞を必要とすることを示唆している。
【０１１１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＪＡ２１８−／−、ＣＤ１ｄ−／−およびＣＤ１ｄ−／＋マウスの抗体力価に比較して、α−ＧａｌＣｅｒ非存在下でＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたＣ５７Ｌ／６野生型マウスにおいて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は低かった（図９）。これらの結果は、不変異体ＮＫＴ細胞が、α−ＧａｌＣｅｒ非存在下でさえＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅサッカリドに対する抗体応答に負の作用を有し得、この負の作用がα−ＧａｌＣｅｒ存在下においてさらに強力であることを示している。
【０１１２】
さらなる実験が、α−ＧａｌＣｅｒによるサッカリド抗原に対する免疫応答の抑制が、６週齢と８週齢の間のマウスにおいてみられることを実証している（図１０）。
【０１１３】
（実施例２：α−ＧａｌＣｅｒは、サッカリド抗原結合体に対する免疫応答を増強する）
α−ＧａｌＣｅｒをＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）由来のサッカリド抗原とともに投与したときに観察された抗体力価の減少と対照的に、α−ＧａｌＣｅｒの投与は、キャリアタンパク質に結合体化されたサッカリドに対する抗体応答を増強させた。
【０１１４】
Ｈｉｂヒト血清アルブミン結合体（Ｈｉｂ−ＨＳＡ）およびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスは、Ｈｉｂ−ＨＳＡ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスよりかなり高いＨｉｂ特異的Ｉｇ力価を示した（図１１）。同様に、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いる免疫は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスに比較して、ＭｅｎＣ特異的Ｉｇ力価における有意な増加を示した（図７、図１Ｃのスケジュールに従って免疫された）。
【０１１５】
図５に示されるように、ＭｅｎＣに対する抗体応答はＭｅｎＣのみを用いて免疫されたマウスにおいて観察されなかったが、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫されたマウスは、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびＰＢＳを用いて免疫されたマウスに比較してＭｅｎＣ−特異的抗体力価における有意な上昇を示した。結合体とα−ＧａｌＣｅｒとの混合は、サッカリドおよび結合体の両方に対する抗体応答を増強した。
【０１１６】
ＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒを用いる免疫はまた、ＭｅｎＡ−特異的Ｉｇ力価における上昇を生じた（図６）。しかしながら、同時に実施された実験において、非結合体化ＭｅｎＡサッカリドにおけるα−ＧａｌＣｅｒの強力な阻害作用は観察されなかった。
【０１１７】
まとめると、α−ＧａｌＣｅｒはサッカリド抗原に対する免疫応答を阻害し得るが、この作用は逆転され得、そしてサッカリド抗原がキャリア結合体化される場合、サッカリド抗原に対する免疫応答はα−ＧａｌＣｅｒにより増強され得る。
【０１１８】
本発明は例示のみによって記載されており、詳細の改変は本発明の精神および範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。６週齢の雌性マウスの４群（Ｃ５７Ｌ／６ ＷＴ、ＣＤ１ｄ＋／−、ＣＤ１ｄ−／−、またはＪＡ１８−／−）を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒ）の２３の異なる血清群由来のポリサッカリドの混合物３．５μｇ〜１０μｇ、または４）３．５μｇ〜１０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）および０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて免疫した。免疫は５０μｌの容量で筋肉内であった。このマウスを、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し（４ｄｐ１、８ｄｐ１、１２ｄｐ１）、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。初回免疫から１０週後または１２週後に、すべてのマウスを、ＳＰのみ３．５μｇ〜１０μｇの追加免疫用量を用いて免疫した。このマウスを追加免疫から４日後、８日後および１２日後に採血し（４ｄｐ２、８ｄｐ２、１２ｄｐ２）、血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。初回免疫から１８〜２２週後、このマウスを屠殺し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞をＥｌｉｓｐｏｔにより決定した。
【０１２５】
Ｂ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。図１−Ａと同様であるが、免疫には５０μｌ中３．５μｇのＳＰを使用した。
【０１２６】
Ｃ）α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいて、タンパク質キャリアと単純に結合体化されたまたは混合された異なるサッカリドを用いるマウスの免疫スケジュール。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１０群を：１）ＰＢＳ、２）０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ、３）１０μｇのＭｅｎＣポリサッカリド、４）２０μｇのＣＲＭタンパク質キャリア、５）３０μｇのＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体、６）ＣＲＭタンパク質キャリアを混合された１０μｇＭｅｎＣポリサッカリド、または３）〜６）の組成物およびα−ＧａｌＣｅｒ（７〜１０の群）を用いて、０日に初回免疫した。マウスを、初回免疫してから２週間後および４週間後に初回免疫した同じ組成物を用いて追加免疫した。マウスを、最初の初回免疫から２週後、４週後および６週後（２ｗｐ１、２ｗｐ２および２ｗｐ３）に採血し、ＭｅｎＣポリサッカリドおよびＣＲＭキャリアの両方に対する抗体のレベルを測定した。
【図２】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫されたマウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスにおいて低い。３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）のみ（黒四角）または３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（白四角）を用いて初回免疫してから４日後、８日後および１２日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価（幾何平均）を示す（＊はＳＰのみに対するｐ＜０．０５を示し、＊＊はＳＰのみに対するｐ＜０．０１を示す）。
【図３】Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて初回免疫および追加免疫されたマウスに比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体力価は低い。Ａ）３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよびＰＢＳを用いて初回免疫してから８日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）（黒）または３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫してから８日後のマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）（グレイ）。（これらのデータは、４つの実験からプールされる）。Ｂ）３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いる追加免疫から８日後の、同じマウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ力価の変量（幾何平均）。（これらのデータは、実験１８、１９および２９よりプールされる）。３．５〜１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて初回免疫されたマウスの結果を黒で示し、３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫されたマウスの結果をグレイで示す。
【図４】ＰＢＳを用いて初回免疫され、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスに比較して、α−ＧａｌＣｅｒを用いて初回免疫しＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて追加免疫されたマウスにおいて、１０６個の脾細胞あたりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数は少ない。２つの群のマウスを、０日に０．１μｇまたは１．０μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（ａＧＣ）を用いて初回免疫し、１２週後１１．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）を用いて免疫した。第３群のマウスを、０日にＰＢＳを用いて免疫し、１２週後に１１．５μｇのＳＰを用いて免疫した。第４群のマウスを、０日および１２週後の両方にＰＢＳを用いて免疫した。最初の初回免疫から２２週後、マウスを屠殺し、１０６個の脾細胞あたりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的Ｂ細胞の数をＥｌｉｓｐｏｔにより測定した。
【図５】α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体においてＭｅｎＣサッカリドおよびＣＲＭタンパク質キャリアの両方に対する特異的抗体応答を増強する。野生型マウスを、ＣＲＭタンパク質キャリアを用いて混合された１０μｇのＭｅｎＣポリサッカリド、２０μｇＣＲＭタンパク質キャリア、１０μｇＭｅｎＣポリサッカリド（ＭｅｎＣ＋ＣＲＭ）または３０μｇのＭｅｎ−ＣＲＭ結合体、あるいはα−ＧａｌＣｅｒを用いて混合された同じ組成物を用いて免疫した。マウスを、初回免疫してから２週間後および４週間後に初回免疫した同じ組成物を用いて追加免疫した。図の一番上の線は、ＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体のみ（黒）、あるいはＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒ（グレイ）を用いて免疫されたマウスにおける、第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第２免疫から１週間後（２ｗｐ２）のＭｅｃ−特異的Ｉｇ力価を示す。図の２番目の線は、ＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体のみ（黒）、あるいはＭｅｎＣ、ＣＲＭ、ＭｅｎＣ＋ＣＲＭまたはＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体およびα−ＧａｌＣｅｒ（グレイ）を用いて免疫されたマウスにおける、第２免疫から２週間後（２ｗｐ２）および第３免疫から２週間後（２ｗｐ３）のＣＲＭ−特異的Ｉｇ力価を示す。
【図６】α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体に対する免疫応答を増強する。マウスを、α−ＧａｌＣｅｒ有りまたは無しにおいて、１０μｇのＭｅｎＡポリサッカリドまたはＭｅｎＡ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫した。ＭｅｎＡポリサッカリドに対する抗体力価を、初回免疫から４日後、８日後および１２日後に測定した。α−ＧａｌＣｅｒは、ＭｅｎＡポリサッカリドに対する免疫応答を増強した。
【図７】抗体応答は、α−ＧａｌＣｅｒおよびＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫されたマウスにおいて増強される。マウスを、ＰＢＳ（黒）またはα−ＧａｌＣｅｒと混合された３０μｇのＭｅｎＣ−ＣＲＭ結合体を用いて免疫した。各群のマウスを３回免疫した。ＭｅｎＣ特異的力価を、第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第３免疫から１週間後（１ｗｐ３）に測定した。
【図８】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する応答のα−ＧａｌＣｅｒ誘導性の阻害は、不変異体ＮＫＴ細胞を必要とする。３．５μｇＳＰのみ（グレイの記号）または３．５μｇＳＰおよび０．１μｇα−ＧａｌＣｅｒ（黒の記号）を用いてマウスを初回免疫してから４日後、８日後および１２日後のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベルを：Ａ）野生型マウス、Ｂ）Ｊａ１８−／−マウス、Ｃ）ｍＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＤ）ｍＣＤ１ｄ−／＋マウスにおいて比較した。α−ＧａｌＣｅｒと組み合わせてＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いて免疫されたＪａ１８−／−マウス、ＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＣＤ１ｄ−／＋マウスと比較して、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｕｒのみを用いて免疫されたＪａ１８−／−マウス、ＣＤ１ｄ−／−マウスおよびＣＤ１ｄ−／＋マウスにおける抗体力価に有意な差は見られなかった。
【図９】不変異体ＮＫＴは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリサッカリドに対する抗体応答に対して負の調節役割を有する。図１Ｂにおけるプロトコールに従って、単にＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒを用いてマウスを初回投与してから４日後、８日後および１２日後のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的抗体のレベル（ＩｇＭ力価幾何平均）を比較した。図９Ａは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７ｍＣＤ１ｄ＋／−マウスにおける抗体力価（三角）と比較する。図９Ｂは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７ｍＣＤ１ｄ−／−マウスにおける抗体力価（三角）と比較する。図９Ｃは、Ｃ５７野生型マウスにおける抗体力価（四角）を、Ｃ５７Ｊａ２８１−／−マウスにおける抗体力価（丸）と比較する。野生型マウスにおける抗体力価は、Ｊａ２８１−／−マウス、ＣＤ１−／−マウスおよびＣＤ１＋／−マウスより低い。
【図１０】α−ＧａｌＣｅｒは、３〜８週齢のマウスにおいてＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒに対する免疫応答を抑制する。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的ＩｇＭ抗体のレベル（幾何平均）を３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒ（ＳＰ）のみ（白）または３．５μｇのＳｔｒｅｐｔｏｐｕｒおよび０．１μｇのα−ＧａｌＣｅｒ（黒）を用いて２週齢（２Ｗ）、３週齢（３Ｗ）、４週齢（４Ｗ）、５週齢（５Ｗ）および６〜８週齢（６〜８Ｗ）のマウスを初回免疫から８日後比較される。
【図１１】抗体応答は、α−ＧａｌＣｅｒおよびＨｉｂ−ＨＳＡ結合体を用いて免疫されたマウスにおいて増強される。マウスを、ＰＢＳ（検出されるには非常に低い結果）、α−ＧａｌＣｅｒ（斜線）またはＭＦ５９（グレイ）を用いて混合された、１５μｇのＨｉｂ−ヒト血清アルブミン（Ｈｉｂ−ＨＳＡ）結合体を用いて免疫した。各群のマウスを３回免疫した。Ｈｉｂ特異的力価を第２免疫から１週間後（１ｗｐ２）および第３免疫から１週間後（１ｗｐ３）測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバント、を含有する、組成物。
【請求項２】
前記α−グリコシルセラミドアジュバントが、α−ガラクトシルセラミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記α−ガラクトシルセラミドが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオールである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サッカリド抗原が、細菌性莢膜サッカリドである、請求項１〜請求項３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌性莢膜サッカリドが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である、請求項４の組成物。
【請求項６】
１つより多いサッカリド結合体を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記キャリアがタンパク質である、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記キャリアがジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような細菌性毒素である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記医薬において使用するための、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化された、サッカリド抗原。
【請求項１０】
患者において免疫応答を惹起する方法であって、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントが同時に、連続的にまたは別々に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が、ナイセリア（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬が細菌性髄膜炎の予防および／または処置のためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用であって、該医薬がα−グリコシルセラミドアジュバントとともに投与される、使用。
【請求項１５】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用であって、該医薬がキャリアに結合体化されたサッカリド抗原とともに投与される、使用。
【請求項１６】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の使用。
【請求項１７】
患者において免疫応答を上昇させるための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用であって、患者がα−グリコシルセラミドアジュバントを用いて前処置される、使用。
【請求項１８】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用であって、該患者がキャリアに結合体化されたサッカリド結合体を用いて前処置される、使用。
【請求項１９】
前記医薬がナイセリア（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである、請求項１４〜請求項１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬が細菌性髄膜炎の予防および／または処置のためである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバントを含む、キット。
【請求項１】
（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド抗原；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバント、を含有する、組成物。
【請求項２】
前記α−グリコシルセラミドアジュバントが、α−ガラクトシルセラミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記α−ガラクトシルセラミドが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオールである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サッカリド抗原が、細菌性莢膜サッカリドである、請求項１〜請求項３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌性莢膜サッカリドが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である、請求項４の組成物。
【請求項６】
１つより多いサッカリド結合体を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記キャリアがタンパク質である、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記キャリアがジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような細菌性毒素である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記医薬において使用するための、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化された、サッカリド抗原。
【請求項１０】
患者において免疫応答を惹起する方法であって、キャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記サッカリド抗原結合体およびα−グリコシルセラミドアジュバントが同時に、連続的にまたは別々に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が、ナイセリア（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬が細菌性髄膜炎の予防および／または処置のためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用であって、該医薬がα−グリコシルセラミドアジュバントとともに投与される、使用。
【請求項１５】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用であって、該医薬がキャリアに結合体化されたサッカリド抗原とともに投与される、使用。
【請求項１６】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるキャリアおよびα−グリコシルセラミドアジュバントに結合体化されたサッカリド抗原の使用。
【請求項１７】
患者において免疫応答を上昇させるための医薬の製造におけるキャリアに結合体化されたサッカリド抗原の使用であって、患者がα−グリコシルセラミドアジュバントを用いて前処置される、使用。
【請求項１８】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造におけるα−グリコシルセラミドアジュバントの使用であって、該患者がキャリアに結合体化されたサッカリド結合体を用いて前処置される、使用。
【請求項１９】
前記医薬がナイセリア（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎、小胞炎、心膜炎、髄膜炎など）または肺炎球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）により引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである、請求項１４〜請求項１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬が細菌性髄膜炎の予防および／または処置のためである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
（ａ）キャリアに結合体化されたサッカリド；および（ｂ）α−グリコシルセラミドアジュバントを含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５１２３７１（Ｐ２００８−５１２３７１Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２９３９６（Ｐ２００７−５２９３９６）
【出願日】平成１７年９月７日（２００５．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２７８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２７６８５
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月７日（２００５．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２７８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２７６８５
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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