ジェミニウイルス持続耐性を特徴とする形質転換植物の作製方法
本発明は、導入遺伝子が病原体に由来する適切に修飾されたポリヌクレオチド配列からなる、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓに対する永続的耐性を持つ形質転換植物を作製する方法に関係する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジェミニウイルスに対して持続的耐性を持つ形質転換植物の作製方法に関係する。
【０００２】
特に本発明は、導入遺伝子がジェミニウイルス（ｇｅｍｉｎｉ ｖｉｒｕｓｅｓ）により誘発される転写後遺伝子抑制（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の無効な標的を生じるように適切に修飾された病原体に由来するポリヌクレオチド配列を含む、ジェミニウイルスに対して持続的耐性を持つ形質転換植物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジェミニウイルスは、広範囲のそして多様なクラスの植物ウイルスであり、種々の農産物として価値のある植物に感染して重大な収穫減少を生じさせることが知られている。このウイルスは双球状の二十面体の二つの粒子からなるビリオンを特徴とする。１個又は２個の環状・一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）からなるそのゲノムは、感染した細胞の核の中で二本鎖中間体を介して複製する（Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【０００４】
ジェミニウイルス科は、媒介昆虫、宿主範囲及びゲノムの構造に基づいて、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ及びＴｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓと命名された４つの属に分類されている（Ｂｒｉｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５； Ｆａｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０００５】
コナジラミ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉにより伝達されるトマト植物の重大な病気は以前から「トマト黄化葉巻病（ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｖｅ ｃｕｒｌ）」として中東、東南アジア及びアフリカの地域で知られていた（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。１００％の収穫喪失を生じることがある（Ｐｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）この病気は、続いて西地中海に広がり、サルジニア、シシリー及びスペインに達し（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、そしてアメリカ（Ｐｏｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）にも広がった。
【０００６】
最近この病気の病原体が同定及び単離され、ジェミニウイルス科、Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスであった。系統研究により、Ｂｅｇｏｍｏｖiｒｕｓの地理的起源：アジア、アフリカ及びアメリカの違いによって異なるウイルス種の存在が明らかにされた（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０００７】
トマト黄化葉巻病サルジニアウイルス（ＴＹＬＣＳＶ）種のゲノムは単一分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）である（Ｋｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＤＮＡは二方向に転写され、図１に示すようにウイルス鎖（Ｖ）の上に２個、Ｖ１及びＶ２、及び相補鎖（Ｃ）の上に４個、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４の６個のオープンリードフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。Ｃ１とＶ２のＯＲＦの間に、全てのジェミニウイルス科のゲノムに存在するものに類似した遺伝子間領域（ＩＲ）と言われる非コード領域がある。ＴＹＬＣＳＶのゲノム構成は、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）及びアフリカキャッサバウイルス（ＡＣＭＶ）のような二分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの構成成分Ａのものに構造的に類似している。二分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの場合には、構成成分Ａの相補鎖上に存在するＯＲＦの名称は：ＡＬ１又はＡＣ１、ＡＬ２又はＡＣ２、ＡＬ３又はＡＣ３、ＡＬ４又はＡＣ４であり、一方ウイルス鎖上はＡＲ１又はＡＶ１、ＡＲ２又はＡＶ２であり；成分Ｂの相補鎖上は：ＢＬ１又はＢＣ１であり、ウイルス鎖上はＢＲ１又はＢＶ１である。
【０００８】
Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉにより伝達されるジェミニウイルス感染の制御のために今日まで使用された方法は、高価な微細メッシュの網の使用（生鮮販売トマトの栽培用）及び特に反復殺虫剤処理（生鮮販売及び加工用トマトの栽培）に基づいている。そのような方法は生産費用の増加と農業従事者及び消費者の健康に重大な危険を生じる。さらに殺虫剤イミダクロプリドに耐性のＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ集団の発生が既に報告されている（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０００９】
耐性の栽培種の開発は、ウイルス感染を制御するために最も実用的でしかも経済的な方法である。トマト黄化葉巻病の原因となるジェミニウイルスに対する耐性を導入するための古典的な育種計画は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎの野生種の耐性遺伝子をトマトの栽培種に導入することに基づいていた。これによって種々のレベルのＴＹＬＣＳＶ耐性の系統が得られ、そして市販され、最も良好な系統は症状の減少及びウイルス複製の低下を示した。しかし、低い平均的な耐性レベルの植物は、さらに感染を広げる潜在的貯蔵所である。
【００１０】
考慮すべきその他の重要な点は、得られた系統の農学的特徴は、必ずしも最適ではないが、育種計画に使用した栽培用トマトの遺伝子型の特徴を反映していることである。
【００１１】
トマト黄化葉巻病を生じるウイルスに免疫を持つ、すなわち症状もウイルスのＤＮＡ複製もないトマトの系統はまだ発表されていない。
【００１２】
遺伝子工学の出現により、植物ウイルスに対する耐性特性の導入に関する新しい展望が開けた。殆どの方法は、目的の植物における病原体由来配列の導入及び発現、病原体由来耐性（ＰＤＲ）に基づいている（Ｓａｎｆｏｒｄ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８５； Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８６； Ｔａｖａｚｚａ ａｎｄ Ｌｕｃｉｏｌｉ，１９９３）。
【００１３】
そのような方法はＲＮＡゲノムを持つ植物ウイルスに対する耐性特性の導入については応用に成功したが（Ｂｅａｃｈｙ，１９９７）、ＤＮＡゲノムを持つジェミニウイルスの場合には、病原体由来配列の発現により持続的抵抗力及び／又は耐性を持つ植物は作製されていない。
【００１４】
病原体由来配列の発現により達成されるウイルス耐性の導入の機序は二つの大きなクラスに分類することができる：
ａ）例えば、ドミナントネガティブ突然変異体のような病原体タンパク質の発現により仲介される耐性；
ｂ）転写後遺伝子抑制により仲介される耐性（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９６； Ｂｅａｃｈｙ，１９９７； Ｚａｉｔｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ，２０００）。
【００１５】
転写後遺伝子抑制は、標的ＲＮＡに相同的な配列を持つ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形成に続く特異的ＲＮＡの分解を伴う、真核生物においていたるところで存在する過程（ｕｂｉｑｕｉｔａｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ）である。
【００１６】
導入遺伝子に相同的なｄｓＲＮＡの生成を誘発することができる様々な状況があり得るが（異常なトランスジェニックＲＮＡの転写、トランスジェニックＲＮＡにおける充分な長さの反転及び反復配列の存在、反転及び反復した多重コピーとして植物ゲノムにおける導入遺伝子の取り込み）、ｄｓＲＮＡが作られた後は、後者は認識されそしてｓｉＲＮＡと呼ばれる約２１〜２６ヌクレオチドのｄｓＲＮＡの短い分子に分解される。
【００１７】
次いでこのｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと命名された多重タンパク質複合体に取り込まれ、このＲＩＳＣはｓｉＲＮＡと相同の配列を持つ全てのＲＮＡを分解することができる。したがって、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ抑制特異性を決定する因子であり、そして指定された配列に関連するその存在は、そのＲＮＡ配列が転写後に抑制されることを一義的に確立する。
【００１８】
したがって、ウイルスＲＮＡゲノムに由来する配列の転写後抑制を生じる形質転換植物は、相同的ウイルス及び導入遺伝子と密接に関連するヌクレオチド配列を持つウイルスに対して耐性である。
【００１９】
導入遺伝子抑制はウイルス感染によっても誘発することができる。
【００２０】
事実、導入遺伝子のヌクレオチド配列が感染ウイルスゲノムの部分に相同である場合には、ウイルス複製は、初期は抑制されない導入遺伝子の抑制を誘発することができる。抑制機構の活性化は、誘発ＲＮＡに相同な配列を持つＲＮＡ分子の特異的分解を伴う。
【００２１】
直接的結果として、ウイルスによる抑制の活性化はウイルス及びウイルスゲノムに対し相同であるトランスジェニックｍＲＮＡ配列の両者の分解に関連している。これにより初期の感染段階の後宿主が回復し、新しく成長した部分にはウイルスがないことが証明される。回復現象に続いて成長する植物組織の特別な性質は、同じウイルスによる次の感染に対して高度の耐性を持っていることである。
【００２２】
この転写後遺伝子抑制に仲介される耐性は、ヌクレオチドレベルにおける認識に基づいているので、導入遺伝子が由来したウイルスゲノムに高い相同性を持つウイルス単離株にのみ耐性を示す。しかし、病原体タンパク質の発現に基づく方法では、通常ヌクレオチドの観点からは密接に関係しないウイルス株または単離株に対しても耐性の植物が作られる。
【００２３】
導入遺伝子抑制は温度により影響され、１５℃未満の温度において不活性になることも示されている（Ｓｚｉｔｔｙａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、１５℃未満の温度範囲の屋外条件に暴露される植物は抑制仲介耐性を失うことがある。
【００２４】
ＲＮＡゲノムウイルスに対する耐性を持つ形質転換植物は、数年前に導入遺伝子抑制に基づいた機序により達成されたが、これまでそのような方法をジェミニウイルス（ＤＮＡゲノム−ウイルス）に応用して成功できたという報告はない、ということを忘れてはならない。
【００２５】
広範囲のジェミニウイルスに対して耐性を持つ植物を得るための最も良い方法は、干渉する生成物がタンパク質である方法であることは明らかである。耐性の範囲が広いことは作製される植物の農学的及び商業的価値を増加させることは明らかである。
【００２６】
それに関係して、ジェミニウイルスに対する耐性又は免疫の高いレベルを持つ植物を得るために、ジェミニウイルスが複製するＲｅｐタンパク質の機能喪失変異体の形質転換植物における発現が使用されている。
【００２７】
ＴＹＬＣＳＶの切断した複製Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ−２１０）の発現はウイルス感染に対する耐性を付与することができるが、ウイルスは経時的にそれに打ち勝つことができるのでそのような耐性は持続しないことが、文献において知られている。
【００２８】
Ｔｏｍａｔｏ ４７ｘ ｗｔ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｌｉｎｅ １０２．２２（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種（ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）Ｒｅｐ−２１０発現形質転換植物の耐性分析の結果を表１及び２にそれぞれ示す。
【００２９】
表１及び２に報告された結果から、病原体由来配列の導入遺伝子発現により仲介されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性が経時的に消失することが明らかに推測される。
【００３０】
同様に、二分節ジェミニウイルス「アフリカキャッサバモザイクウイルス」のＲｅｐのドミナントネガティブ突然変異の導入遺伝子発現により誘発される耐性も、経時的に消失する（Ｓａｎｇａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００３１】
その他の例は、種間交配トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｘ Ｌ． ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）におけるＴＹＬＣＶキャプシドタンパク質の導入遺伝子発現によって示され、これはウイルス感染に対して部分的耐性を付与する（Ｋｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この場合においてでも、キャプシドタンパク質の発現により仲介された耐性は永く持続せず、農学的観点からは有用性がなかった。
【００３２】
上記に照らして、ジェミニウイルスに対して長期間持続する耐性を得るために、ジェミニウイルスに由来するポリヌクレオチド配列を上手に使用する新しい方法に対する要求があることは明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明の著者らは今回、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的としてジェミニウイルスに対する耐性レベルを持続する形質転換植物を得られるように適当に修飾された、病原体由来ウイルスタンパク質をコードし、宿主にウイルス耐性を付与することができるポリヌクレオチド配列を作製した。
【００３４】
実験による事実で著者らは、耐性の消失そしてそれによるジェミニウイルスに対する持続的耐性を達成する困難さは、転写後に導入遺伝子を抑制し、そして感染ウイルスに相同の配列を持つ導入遺伝子が転写後抑制される植物内で分散する、ジェミニウイルスの予期せざる能力によるものであることを示す。
【００３５】
図２及び３にそれぞれ示すように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ 系統 １０２．２２の形質転換植物及びＴｏｍａｔｏ ４７ｘ ｗｔの植物の両者において、耐性を消失させるウイルスの能力は同じウイルスによる導入遺伝子抑制及び抑制された植物中に分散するウイルスの予期せざる能力により生じる。
【００３６】
導入遺伝子Ｒｅｐ−２１０が転写後抑制される植物の中において分散するＴＹＬＣＳＶの能力は、図４における記述によりさらに詳しく説明されている。
結果は、Ｒｅｐ−２１０タンパク質の不在、及び導入遺伝子相同ｓｉＲＮＡの同時発生によって示されるように、アグロ接種（ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）以前に転写後抑制されている形質転換トマト植物４７ ｘ １０Ｄ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、対照と同様にＴＹＬＣＳＶ感染に感受性であることを示している。
【００３７】
上記より、ＲＮＡウイルスとは異なり、ジェミニウイルスはウイルス遺伝子配列の能動的抑制によって阻止されないことになる。このことは使用される形質転換植物の種類又はアグロ感染又はＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉによるウイルスの接種方法に制限されない。事実、表３に示すように、対照植物の９０％から１００％が感染する程度に植物当たりのウイルス保有Ｂｅｍｉｓｉａの数を減らすと、導入遺伝子が転写後抑制された形質転換植物（系統２０１）の約４０％は感染しないか又は遅れて感染するが、一方より高い接種濃度においては、ウイルス保有昆虫によりチャレンジされた植物は、アグロ接種を使用して行った実験と同様にすべて感染した。
ａ 植物当たり７匹のウイルス保有昆虫で２日間
ｂ 植物当たり３５匹のウイルス保有昆虫で５日間
ｃ 接種後の週
【００３８】
したがって、耐性を試験し、そして（図２，３及び４及び表１及び２に示すような）経時的持続を評価するために使用したウイルスのアグロ接種条件が、高い又は非常に高いウイルス圧力条件に対応することを、考慮することが重要である。この実験的方法が、ウイルス感染に対する非常に高い耐性レベル又は免疫を持ち、したがって非常に高い商業的価値のある形質転換植物の同定を可能にする。
【００３９】
かくして、病原体由来配列の発現によるジェミニウイルスに対する耐性特性の導入は、導入遺伝子を転写後抑制し、そして抑制植物中において分散するジェミニウイルスの予期せざる能力により限定される。
【００４０】
さらに著者らは、図５に示すように、ＴＹＬＣＳＶのプラス鎖（Ｖ１及びＶ２）及びマイナス鎖（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，及びＣ４）のいずれの転写物も、野生型植物の正常な感染の際に、ウイルスの転写後抑制を受けることを示す。このことから、これらがウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は無効の標的になるように適切に修飾されなければ、同じ病原体に由来する配列の発現により長期間の耐性を達成することは不可能となる。しかし、本発明により適切に突然変異した配列又は選抜された配列を植物ゲノム中に導入することにより、既知方法によっては達成されない、ジェミニウイルスに対して長期間持続する耐性を得ることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
したがって、本発明の目的は、ジェミニウイルスに由来するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列は、ウイルスの転写後抑制の標的で無いか又は無効の標的であることを特徴とし、そして、
ａ）それに対し耐性が要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下のヌクレオチド相同性；
ｂ）それに対し耐性が要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して１７ヌクレオチド以下、好ましくは８ヌクレオチド以下、より好ましくは５ヌクレオチド以下のＲＮＡ転写物の連続相同性；
ｃ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して３０ヌクレオチド以下、好ましくは２０ヌクレオチド以下、より好ましくは９ヌクレオチド以下の１置換を含む配列の最大長；
を有し、
該ポリヌクレオチド配列は、それによって形質転換された植物、組織又は植物細胞全体に、ジェミニウイルスに対する持続的耐性を付与することができる前記ポリヌクレオチド配列である。
【００４２】
本発明によるポリヌクレオチド配列は、野生型又は合成又は突然変異誘起により作製され、そしてそれによってコードされたジェミニウイルス由来アミノ酸配列はウイルス感染を妨害する野生型又は突然変異配列である。
【００４３】
したがって、本発明は、上記のａ）、ｂ）及びｃ）において定義し、特定した原理に従ってそれに対する耐性を導入することを要求される、ジェミニウイルスの対応するゲノム配列に対してヌクレオチドレベルで異なるように、適切に変更されているか又は野生型のジェミニウイルスのポリヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明のその他の目的は、ジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列は、転写後抑制の標的で無いか又無効の標的であることを特徴とし、そしてそれに対する耐性が要求されるジェミニウイルスの配列に対して殆ど１００％に等しい相同性を有し、そして同様の妨害能力を維持していたとしても、元の配列に対してｓｉＲＮＡ群が過小になるように短縮化されている。
【００４５】
本発明によるポリヌクレオチド配列を構築する遺伝子配列は、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓのようなジェミニウイルスから導くことができ、特に表４に示した種及びその単離株、より特異的にはトマト黄化葉巻病ウイルスの種及び表５に示したその単離株から導くことができる。
【００４６】
Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの種は、好ましくはＴＹＬＣＣＮＶ， ＴＹＬＣＧＶ， ＴＹＬＣＭａｌＶ， ＴＹＬＣＳＶ， ＴＹＬＣＴＨＶ， ＴＹＬＣＶ， ＡＣＭＶ， ＢＧＭＶ， ＣａＬＣｕＶ， ＴｏＣＭｏＶ， ＴＧＭＶ， ＴｏＧＭｏＶ， ＴｏＭＨＶ， ＴｏＭｏＴＶ， ＴｏＭｏＶ， ＴｏＲＭＶ， ＴｏＳＬＣＶ， ＴｏＳＲＶ， ワタ葉巻（ＣＬＣｒＶ， ＣＬＣｕＡＶ， ＣｌＣｕＧＶ， ＣＬＣｕＫＶ， ＣＬＣｕＭＶ， ＣＬＣｕＲＶ），東アフリカキャッサバモザイク（ＥＡＣＭＣＶ， ＥＡＣＭＭＶ， ＥＡＣＭＶ， ＥＡＣＭＺＶ），ジャガイモ黄化モザイク（ＰＹＭＰＶ， ＰＹＭＴＶ， ＰＹＭＶ）， カボチャ葉巻（ＳＬＣＣＮＶ， ＳＬＣＶ， ＳＬＣＹＶ），サツマイモ葉巻（ＳＰＬＣＧＶ， ＳＰＬＣＶ）， タバコ葉巻（ＴｂＬＣＪＶ， ＴｂＬＣＫｏＶ， ＴｂＬＣＹＮＶ， ＴｂＬＣＺＶ）、トマト葉巻（ＴｏＬＣＢＶ， ＴｏＬＣＢＤＶ， ＴｏＬＣＧＶ， ＴｏＬＣＫＶ， ＴｏＬＣＬＶ， ＴｏＬＣＭＶ， ＴｏＬＣＮＤＶ， ＴｏＬＣＳＬＶ， ＴｏＬＣＴＷＶ， ＴｏＬＣＶＶ， ＴｏＬＣＶ），及びそれらの単離株である。
【００４７】
他の属、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓに属するジェミニウイルスのその他の好ましい種は、ＷＤＶ， ＭＳＶ， ＳＳＶ， ＢＹＤＶ， ＴＹＤＶ， ＢＣＴＶ及びその単離株である。
【００４８】
ジェミニウイルスのゲノムに属する遺伝子配列は、配列Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１， Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１、特に既に記述されたジェミニウイルスの配列Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１及びその単離株であり得る。
【００４９】
本発明の目的のポリヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列は、それを発現する植物にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる病原体由来タンパク質である。したがって、本発明の該妨害タンパク質は安定的に発現し、タンパク質産物が耐性を誘発できる分子機構とは別の持続的耐性を付与する。
【００５０】
病原体由来タンパク質は、キャプシドタンパク質、複製関連ウイルスタンパク質（Ｒｅｐ）、遺伝子Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１によりコードされているタンパク質であり得る。
【００５１】
上記の条件を満たす可能性のあるポリヌクレオチド配列の例は図１６Ａ及び１６Ｂに記述されており、これらの図はいずれのヌクレオチド配列も同じウイルスタンパク質をコードしている、ＴＹＬＣＳＶのＲｅｐ−２１０タンパク質をコードしている野生型ヌクレオチド配列と感染ウイルスにより誘発される転写後分解の標的とならないように修飾された合成ヌクレオチド配列との整列を示す。
【００５２】
このポリヌクレオチド配列により形質転換することができる植物、組織又は植物細胞は、トマト、コショウ、タバコ、サツマイモ、ワタ、メロン、カボチャ、マニオック、ジャガイモ、マメ、ダイズ、ムングマメ、ビート、サトウキビ、トウモロコシ、コムギであり得る。
【００５３】
本発明のその他の目的は、５’−３’方向に下記を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む構築体である：
ａ）該植物又は組織又は形質転換細胞においてプロモーターとして作用するポリヌクレオチド配列；
ｂ）ジェミニウイルスの遺伝子間領域に属するか又は属さない、コード領域の５’位置に存在する非翻訳ポリヌクレオチド配列；
ｃ）本発明によるポリヌクレオチド配列又はそのフラグメント又は変異体；
ｄ）該ポリヌクレオチド配列の３’の位置に存在する、転写のターミネーターとして作用する配列。
【００５４】
既に記述した構築を含む発現ベクターは本発明の別の目的である。
【００５５】
更に、本発明の目的は、そのゲノムに本発明のポリヌクレオチド配列を含む植物、組織又は形質転換植物細胞、その子孫並びに種子である。
【００５６】
最後に、本発明の目的は、ジェミニウイルスに対する持続的耐性を持つ形質転換植物、組織又はその植物細胞を作製する方法であって、
ａ）ジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるアミノ酸配列をコードするウイルス遺伝子配列を「同定」又は「選択」し；
ｂ）感染するジェミニウイルスによって誘発される転写後抑制の影響を受けない標的とするように該ウイルス遺伝子配列の突然変異誘起又は「選抜」を行い；
ｃ）既に記述した構築体を介して、ステップｂ）において得られた、変異され若しくは選抜されたジェミニウイルスの遺伝子配列を、植物、組織又はその植物細胞に挿入する；
ステップを含む、前記方法である。
【００５７】
本発明の方法のステップａ）に関して、用語「同定」はジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる該ウイルス遺伝子配列の実験的認定を意味し、一方、用語「選択」はジェミニウイルスに対する持続性のない耐性を付与することができる既に使用し得るウイルス遺伝子配列の認定を意味する。したがって、本発明による方法はさらに、既知配列を使用することにより生じるジェミニウイルスに対する耐性の消失の問題に対する解決策を提供する。
【００５８】
特に、ステップｂ）において予想される突然変異誘起は、それに対する耐性を獲得することが要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して、90％以下の、好ましくは80％以下の、より好ましくは70％以下のヌクレオチド相同性を維持して行われ、ジェミニウイルスの対応する配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が１７ヌクレオチド以下、好ましくは８ヌクレオチド以下、より好ましくは５ヌクレオチド以下であり、そして元来の遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大の長さが３０ヌクレオチドを超えない、好ましくは２０ヌクレオチドを超えない、より好ましくは９ヌクレオチド以下であるように分布している。
【００５９】
本発明によりステップａ）において同定又は選択されたポリヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列は、野生型ウイルスタンパクに対して１００％の相同性を有するタンパク質である可能性がある。
【００６０】
この突然変異誘起は、ジェミニウイルスに対する耐性を付与するタンパク質の能力を減少させないヌクレオチド配列上の全ての突然変異を含んでいる。可能性のある突然変異は、サイレント点突然変異及び類似の生化学的性質を持つアミノ酸との置換を生じる突然変異の両者又は欠失及び/又は挿入及び/又は置換である。
【００６１】
その他には、本発明の方法のステップｂ）における突然変異誘起は、感染ウイルスにより作られたｓｉＲＮＡの天然の集団において、該配列が類似の妨害能力を保持したまま元来の配列に関して少なく表現されるような、末端のポリヌクレオチド配列の欠失からなる。
【００６２】
その他には、本発明の方法のステップｂ）における「選抜」の本質は、転写後抑制の標的とならないように、又は無効の標的であるように、求められている耐性の対象となるジェミニウイルスとはヌクレオチドのレベルにおいて異なるジェミニウイルスの野生型配列の認定にある。
【００６３】
特に、本発明の方法のステップｂ）における突然変異誘起作用は、ｓｉＲＮＡの集団において野生型タンパク質をコードする配列に対して過小であり、そして該短縮化されたタンパク質はジェミニウイルスに対する耐性を付与する能力を維持している該遺伝子配列の最小領域が同定されるまで、ステップａ）のウイルス遺伝子配列３’又は５’領域を欠失することからなることができる。
【００６４】
さらに、本発明の方法のステップａ）のウイルス遺伝子配列は、ＴＹＬＣＳＶ Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子の配列であり得、そのアミノ酸配列は、例えばＲｅｐ−１３０のような野生型ウイルスタンパク質に比較して短縮化されたタンパク質であり得る。
【００６５】
本発明による合成的ポリヌクレオチド配列の種々の農学的応用の中で、特に興味のあるものはＴＹＬＣＳＶに対する耐性を持つトマト植物を得るためにそれを使用することである。
【００６６】
この特別な態様において、短縮化されたウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ−２１０）をコードする形質転換用ポリヌクレオチド配列は、３’欠失により修飾され、耐性を付与する能力を保持しつつ、ＴＹＬＣＳＶ−誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的を生じた。
【００６７】
特に、放射性ＲＮＡプローブとのストリンジェントハイブリダイゼーションを使用して、図６及び７に示されるように、野生型植物におけるＴＹＬＣＳＶの感染の際に作られるウイルス由来ｓｉＲＮＡの集団において少ないＴＹＬＣＳＶゲノムの転写領域が同定された。この領域は、ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐをコードする遺伝子の最初の３９０ヌクレオチドに相当する。その転写物はウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的であり、安定的に発現し、持続的耐性を生じるＲｅｐ−１３０タンパク質をコードしている。
【００６８】
したがって、本発明の特別な態様において、ＴＹＬＣＳＶのような、本発明のポリヌクレオチド配列によりコードされているジェミニウイルスのアミノ酸配列は、短縮されたＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）であり得る。この場合に、転写後抑制の無効な標的とされ又は標的にならないようにされたウイルス遺伝子配列は配列番号８である。
【００６９】
本発明のその他の目的は、ステップｂ）における突然変異誘起が、ジェミニウイルスに対する耐性を付与し、且つ転写後抑制の無効な標的又は非標的にする、コードアミノ酸配列の能力を維持しているステップａ）のウイルス遺伝子配列のサイレント点突然変異からなる上記の方法である。
【００７０】
特に、ステップａ）のウイルス遺伝子配列はＴＹＬＣＳＶ（配列番号１２）の場合にはＶ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子であり得、特別な態様において、転写後抑制の無効な標的又は非標的にするウイルス遺伝子配列は配列番号６である。
【００７１】
さらに、ステップａ）のウイルス遺伝子配列はＴＹＬＣＳＶ Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子であり得、この場合に転写後抑制の無効な標的又は非標的にするウイルス遺伝子配列は配列番号２又は配列番号４であり得る。
【００７２】
ここで、添付した個々の図を参照しつつ、好ましい態様に従って、非限定的な説明により本発明を記述する。
【００７３】
図１は、トマト黄化葉巻病ウイルスＳａｒｄｉｎｉａ種（ＴＹＬＣＳＶ）のゲノムを示す。ＤＮＡは双方向性に転写されており、部分的に又は完全にオーバーラップする６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ウイルス鎖（Ｖ）上の２個、Ｖ１及びＶ２、及び相補鎖（Ｃ）上の４個、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４）を含んでいる。
【００７４】
図２は、ＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（系統１０２．２２）におけるＲｅｐ−２１０タンパク質の発現を示す。記号（−）、（＋）及びＮＩは、健康、感染及び非接種植物をそれぞれ意味する。分析は、ＴＹＬＣＳＶのアグロ接種前（０ ｗｐｉ）及びその後４及び８週間後（それぞれ４及び８ ｗｐｉ）に行った。
【００７５】
図３は、ＴＹＬＣＳＶでのアグロ接種前（０ ｗｐｉ）及びその２２週間後（２２ ｗｐｉ）のトマト植物（系統 ４７ Ｘ ｗｔ）におけるＲｅｐ−２１０タンパク質及び形質転換ｍＲＮＡの発現を示す。記号（＋）及び（−）はそれぞれ特定した時期において植物が感染しているか又は健康であるかを意味する。
【００７６】
図４は、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種前の形質転換トマト植物（４７ Ｘ １０Ｄ系統）における相対的転写に相当するＲｅｐ−２１０タンパク質及びｓｉＲＮＡの発現の分析を示す。パネルの記号（＋）及び（−）は、それぞれＣ１のセンス及びアンチセンスの導入遺伝子の存在及び非存在を意味し；ｗｔは対照の野生型植物を意味し；ｓｉＲＮＡのパネル下側の記号（＋）、（−）及びＮＩは、ウイルスの存在（＋）及び非存在（−）をそれぞれ、そして対照としての非アグロ接種を意味する。
【００７７】
図５は、ＴＹＬＣＳＶ−感染野生型トマト植物（検体１〜４）及び対照としての非感染植物（検体Ｃ）から抽出した小型ＲＮＡのノーザンブロットを示す。Ｍは分子量マーカーを意味する。
【００７８】
図６は、ＴＹＬＣＳＶのゲノムに対する小型妨害ＲＮＡの分布分析を示す。最上段は、ＴＹＬＣＳＶゲノムの直線的地図；転写物は矢印により示されている（Ｖ１及びＶ２はウイルスゲノムと同方向、そしてＣ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４は相補的方向）；ウイルスゲノム地図の下の９個の空ボックスは９個のＰＣＲフラグメント（それぞれ約３００ヌクレオチド長）を表し、その中にゲノムが分割され、そしてその臭化エチジュウム染色及びＴＹＬＣＳＶ感染トマト植物から抽出したｓｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションが示されている。ＩＲは１０番目のＰＣＲフラグメントを示し、ＴＹＬＣＳＶゲノムの非転写遺伝子間領域に相当する。パネルの下の数字は、各ＰＣＲフラグメントに関するハイブリダイゼーションシグナルのパーセンテージを意味する。
【００７９】
図７は、非アグロ接種（検体Ｃ）又はＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種（検体１及び２）野生型トマト植物における接種４週間後におけるｓｉＲＮＡの存在の分析を示す；特に、Ｒｅｐ−２１０（プローブＡ）及びＲｅｐ−１３０（プローブＢ）の転写物に対応するｓｉＲＮＡを分析した；左パネルの列１００及び５０はそれぞれ、プローブＡ及びＢの両者に相同なオリゴヌクレオチドの１００及び５０ｐｇに対応する。
【００８０】
図８は、ｐＴＯＭ１３０プラスミドのＲｅｐ−１３０（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。大文字は、ＴＹＬＣＳＶに属するものでなく、クローニングに由来するヌクレオチド；下線の付いた配列はクローニングに使用したＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位に対応する。開始及び終結コドンは太文字で記述されており、一方Ｃ４タンパク質発現を除去するために導入された突然変異はイタリックの太文字である。
【００８１】
図９は、上の各列に示されている突然変異Ｒｅｐタンパク質を発現するプラスミドと共に、ＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）で共遺伝子導入された野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストからの総核酸抽出物のサザンブロットを示す。
【００８２】
図１０は、突然変異Ｒｅｐタンパク質を発現するプラスミドと共にｐＴＯＭ６プラスミドで共遺伝子導入された野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の定量的分析を示す。
【００８３】
図１１は、Ｒｅｐ−１３０−発現形質転換植物を得るために使用されたｐＴＯＭ１３０プラスミドの模式図を示す。ＬＢ及びＲＢは左及び右境界をそれぞれ意味する；ｐＥ３５Ｓは複製されたＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ３５Ｓプロモーターを表す；Ｒｅｐ−１３０（配列番号８）はＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）をコードする配列である；ｔ３５ＳはＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ３５Ｓのターミネーター；ｔＮＯＳはノパリン合成酵素をコードする遺伝子のターミネーターである；ｎｐｔＩＩはネオマイシンホスフォトランスフェラーゼをコードする配列である；ｐＮＯＳはノパリン合成酵素の遺伝子のプロモーターである；Ｋａｎはカナマイシン耐性の遺伝子である。
【００８４】
図１２は、ｐＴＯＭ１３０で形質転換した形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈaｍｉａｎａ植物（系統３００〜３０９）におけるＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）発現の分析を示す。
【００８５】
図１３は、Ｒｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）（系統３００， ３０１， ３０３）又はＲｅｐ−２１０タンパク質（１０２．２２）のいずれかを発現する野生型（ｗｔ）及び形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の分析を示す。
【００８６】
図１４は、ｐＴＯＭ１３０（系統４０２， ４０３， ４０６， ４１１， ４１３， ４１６， ４１７）で形質転換された形質転換Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物におけるＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）発現の分析を示す。形質転換Ｒｅｐ−１３０発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（系統３０３）から抽出されたタンパク質が陽性対照として使用された。
【００８７】
図１５は、Ｒｅｐ−１３０を発現するｐＴＯＭ１３０（系統４０６）で形質転換されたＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ形質転換植物と非形質転換野生型植物の間の比較を示す。
【００８８】
図１６Ａ及びＢは、Ｒｅｐ−２１０をコードする合成配列の二つの例（配列番号２，配列番号４）を示す。ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列（Ｓｅｑ＿ｃｏｄ＿Ｒｅｐ２１０＿ｗｉｌｄ＿ｔｙｐｅ，上側；配列番号１）及びウイルス誘発転写後抑制の無効な標的となるように修飾された合成ヌクレオチド配列（Ｓｅｑ＿ｃｏｄ＿Ｒｅｐ２１０＿ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ＿ｍｉｎｕｓ、下側；配列番号２、配列番号４）の間の整列が示されている。合成配列において、野生型配列に対して突然変異を生じているヌクレオチドは網掛け文字で示されている。
【００８９】
図１７は、プラスミド野生型遺伝子ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）及び合成遺伝子Ｒｅｐ−２１０抑制マイナスＢ（配列番号４），（プラスミドｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎ）によりコードされているＲｅｐ−２１０タンパク質のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の中へのアグロ浸潤による一過性発現の分析を示す。
【００９０】
図１８は、ａ）Ｒｅｐ−２１０ 配列番号１の野生型遺伝子を発現するｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）プラスミド（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、系統１〜３；ｂ）Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現するｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミド（Ｒｅｐ−２１０抑制マイナスＢ；配列番号４）系統４〜６；ｃ）空のクローニングプラスミドｐＢＩＮ１９ 系統７〜９、を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株の共アグロ浸潤によるウイルス複製の一過性阻害のアッセイを示す。
【００９１】
図１９は、Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子、Ｒｅｐ−２１０−抑制マイナスＢ、配列番号４（系統 ５０６，５０８Ａ及び５０８Ｂ）を含むｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミドで形質転換された形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるＲｅｐ−２１０タンパク質の発現の分析を示す。Ｒｅｐ−２１０発現形質転換トマト植物から抽出されたタンパク質を陽性対照として使用した。
【００９２】
図２０は、ｐＴＯＭ １０２（系統１０２．２２，Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）又はｐＴＯＭ １０２Ｓｙｎ（系統５０６）で形質転換された形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種後のＲｅｐ−２１０タンパク質の発現の分析を示す。分析は、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種前（０ｗｐｉ）及び５週間後（５ｗｐｉ）に実施した。
【００９３】
図２１は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型（ＷＴ）又はｐＴＯＭ １０２（系統１０２．２２，Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）又はｐＴＯＭ １０２Ｓｙｎ（系統５０６）のいずれかで形質転換された形質転換植物の２，３，４，５ ｗｐｉ（このｗｐｉはアグロ接種後の週の数を意味する）における「ドット−ブロット」による感染の分析を示す。
【００９４】
図２２は、ＣＰをコードする合成配列の例を示す。ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ（ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ，上側；配列番号１２）をコードする野生型ヌクレオチド配列及びウイルス誘発転写後分解の極めて無効な標的または非標的となるように修飾された合成ヌクレオチド配列（ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ抑制マイナス、下側；配列番号６）の間の整列が示されている。合成配列において、野生型配列に対して突然変異を生じているヌクレオチドは網掛け文字で示されている。
【００９５】
実施例１：ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ない（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）ＴＹＬＣＳＶゲノムの領域の同定。
野生型植物のＴＹＬＣＳＶによる自然の感染において、ＴＹＬＣＳＶゲノムの両鎖により転写されたウイルス配列は、ゲノムの種々な部分に相同的なｓｉＲＮＡの存在によって示されるように、転写後遺伝子抑制の標的である（図５）。図５には、ＴＹＬＣＳＶに感染した野生型トマト植物（検体１〜４）及び非感染対照（検体Ｃ）から抽出された総ＲＮＡのノーザンブロットが示されている。使用されたプローブ及び制限部位は各パネルの横に示されている。またｓｉＲＮＡの推定分子量が記述されている。
【００９６】
ＴＹＬＣＳＶゲノムの一部の領域が他の領域よりも転写後遺伝子抑制の効果が少ない標的であるか否かを評価するために、ウイルスゲノムの位置に関してｓｉＲＮＡの分布を系統的に調べた。したがって、特異的オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより得られるそれぞれ約３００塩基対である９個の連続するフラグメントにＴＹＬＣＳＶゲノムを分割した（図６に示されている）。アガロースゲル電気泳動の後、該フラグメントの同量をナイロンフィルターに移した。アガロースゲルに負荷したＰＣＲフラグメントの定量はソフトウエアＡｉｄａにより行った。ＴＹＬＣＳＶ感染トマト植物により作られたｓｉＲＮＡを総ＲＮＡから開始して精製し、末端を標識して、ＴＹＬＣＳＶゲノムの数領域を含むフィルター上でプローブとして使用した（Ｓｚｉｔｔｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。負荷したフラグメントの同量に対して、異なる強度のハイブリダイゼーションシグナルを生じ、これをＴＹＰＨＯＯＮ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により評価した。その結果、ウイルスゲノムの数領域についてｓｉＲＮＡの異なる分布が検出された（図６）。
【００９７】
実施例２：ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ないＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の領域の同定。
ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ないＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の領域を同定するために、健康及びＴＹＬＣＳＶ感染の両トマト植物から総ＲＮＡ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を抽出した。
【００９８】
該ＲＮＡの３０マイクログラムを８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ノーザンブロットを介して毛管現象によりナイロンフィルターに移した。二つの同一のレプリカを作り、図７に示すように、それぞれについてＣ１遺伝子の５’領域の異なる部分に相当するプローブとのハイブリダイゼーションを行った。一つのフィルターは、４２ｎｔの非翻訳リーダー配列及びＣ１遺伝子の最初の６３０ヌクレオチド（Ｃ１遺伝子の約３/５）からなるＣ１遺伝子の５’部分に由来するプローブ（プローブＡ）とハイブリダイズし、他のフィルターは４２ｎｔの非翻訳リーダー配列及びＣ１遺伝子の最初の３９０ヌクレオチドからなるＣ１遺伝子の５’部分に由来するプローブ（プローブＢ）とハイブリダイズした。
【００９９】
（二つの独立した標識に由来する）二つの異なるプローブにより得られた結果を定量的に比較するために、両プローブに相補的な４０オリゴヌクレオチドの同スカラー量を両レプリカに負荷した。列１００及び５０は、それぞれ該オリゴヌクレオチドの１００及び５０ピコグラムに対応する。オリゴヌクレオチドの泳動を示すパネルは、ｓｉＲＮＡを含むそれぞれのパネルと並べてあるが、オリゴヌクレオチドとｓｉＲＮＡは異なる分子量を有するので、図の位置はゲル上の位置に対応しない。
【０１００】
平均長７５ヌクレオチドのフラグメントを得るために、インビトロ転写の後の両プローブにアルカリ加水分解を行った（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションは、Ｄａｌｍａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００により記述されている緩衝液中において１６時間３９℃で行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２Ｘ ＳＳＣ，０．２％ ＳＤＳ中で２回４０℃において１０分間、２回４５℃において１０分間、そして１回５０℃において１０分間洗った。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡ集団においてＣ１遺伝子の近位５’領域が過度に少ないことが明らかである。特に、ＴＹＰＨＯＯＮ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行われた結果の定量的分析により、この５’領域に対応するｓｉＲＮＡは２１０アミノ酸をコードするヌクレオチドまで続いている領域に対応するｓｉＲＮＡ（プローブＡ）に比較して約２５％（プローブＢ）であることが明らかにされた。したがって、該５’領域はウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的である。
【０１０３】
これらの結果は、実施例１に記述した方法を使用して、すなわち、Ｃ１遺伝子の二つの異なる領域に対応するＰＣＲフラグメントをＴＹＬＣＳＶに感染したトマト植物から抽出したｓｉＲＮＡの集団とハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。
【０１０４】
実施例３：短縮ＲｅｐをコードするＣ１遺伝子５’部分のポリヌクレオチド配列の構築体。
以前に示されたように（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、Ｒｅｐ−２１０形質転換植物は長期に持続しない耐性及び変化した表現型を示す。
【０１０５】
図１において知ることが出来るように、Ｃ４遺伝子は短縮されたＣ１遺伝子の中に異なるリーディングフレームとして組み込まれている。
【０１０６】
ジェミニウイルスＣ４遺伝子の導入遺伝子発現は表現型の変換を誘発する（Ｋｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１０７】
従って、Ｃ４ ＯＲＦを発現できない短縮化Ｃ１構築体がいくつか設計された。
【０１０８】
Ｃ４（−）突然変異株を得るために、二点突然変異の導入によりＣ４配列中に終結コドンが導入された。特に、図８に記述されたｐＴＯＭ１３０配列（配列番号８）に関して、ヌクレオチド２３３における突然変異は、Ｃ４をコードするリーディングフレームのＴＣＡコドン（セリンをコードする）をＴＧＡ（ｏｐａｌ）に変換するＣからＧへの変換を含む。さらに、ヌクレオチド２３１の突然変異は、Ｃ１をコードするリーディングフレーム中でロイシンコドンを復活させるＣからＴへの変換からなる（ＣＴＣがＴＴＧになる、植物では良く現れる）。
【０１０９】
そのためＣ４タンパク質の翻訳はわずか１０アミノ酸で中断され、一方Ｃ１タンパク質のアミノ酸配列は変化しない。二つの導入された突然変異は、Ｃ１リーディングフレーム中ではロイシンコドンを植物におけるコドン使用に適合するように維持しつつ、Ｃ４リーディングフレーム中に「強力な」終結コドンを発生させる条件に基づく多数の可能性のある突然変異の中から選択された。
【０１１０】
突然変異誘起は以下の突然変異オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより行われた。
【０１１１】
Ｃ４プラスプライマー（配列番号１０）：５’−ＣＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＡＴ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＡ Ｇ−３’
【０１１２】
Ｃ４マイナスプライマー（配列番号１１）：５'−Ｃ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧ−３’（ＴＹＬＣＳＶの２４１９−２４４８，Ｋｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１）
【０１１３】
二つの突然変異プライマーのそれぞれは、鋳型としてｐＧＥＭ１０２を使用する二つの別々のＰＣＲ反応において外部プライマーと共に使用される（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０１１４】
特に、外部オリゴヌクレオチドはＲｅｖ及びＵｎｉｖ（Ｍ１３／ｐＵＣ配列分析プライマー ｎ．１２３３及び１２２４）である。Ｕｎｉｖ／Ｃ４プラスにより行われる反応により５３７ｂｐフラグメントが得られ、一方Ｒｅｖ／Ｃ４マイナスによる反応からは３５１ｂｐフラグメントが得られた。
【０１１５】
得られた生成物は、二つの外部プライマーを使用して行われた続く増幅反応に鋳型として使用された。
【０１１６】
得られたＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化され、ｐＪＩＴ６０の対応する部位にクローニングされ、こうしてｐＪＩＴＲ２１０を得た。いずれの場合も、クローンを検証するために配列分析を行った。
【０１１７】
実施例４：植物細胞の中に発現したときにウイルス複製を阻害できるＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の最小５’領域の同定。
ＴＹＬＣＳＶに対する耐性を付与することが出来るＣ１遺伝子の最小５’末端領域を明確にするために、Ｃ１遺伝子の３’−末端欠失突然変異株のシリーズをｐＪＩＴ６０発現ベクター中にクローニングし、ｐＪＴＲシリーズを得た。
【０１１８】
ウイルス配列を、末端に制限部位を含む特異的プライマーを使用して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によるＰＣＲにより増幅した。
【０１１９】
Ｒｅｐ−２１０をコードし、内部のＣ４タンパク質の終結コドンを含む、以前に記述したｐＪＩＴＲ２１０プラスミドを鋳型として使用した。増幅反応により得られたフラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素で消化し、ｐＪＩＴ６０の対応する部位にクローニングして、ｐＪＴＲシリーズを得た。
【０１２０】
増幅忠実度及びベクター挿入ジャンクションを確認するために、全ての最終クローンを配列分析した。全ての増幅配列の長さと正確な位置を表６に記述した。
【０１２１】
ＴＹＬＣＳＶに対する耐性を付与する各Ｒｅｐ欠失突然変異株の能力は、各突然変異株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）によるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型プロトプラストの共遺伝子導入アッセイにより評価し、次いでサザンブロットによりウイルスゲノムの複製レベルを分析した。得られた結果を図９及び１０に示した。
（１）ＴＹＬＣＳＶゲノムのヌクレオチド番号はＫｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９１に従う。
【０１２２】
プロトプラスト共遺伝子導入、総核酸抽出及びサザン分析は既に記述した方法（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００１）に従って行った。
【０１２３】
各プロトプラスト検体からの総核酸抽出物を、Ｒｅｐ−２１０をコードする配列及び対照として使用したｐＧＥＭ−Ｐプラスミドに対応するジゴキシゲニン−標識ＲＮＡプローブでサザンブロットすることにより分析した。特に、図９は総核酸のサザンブロットを表しているが、その中のｓｃＤＮＡ及びｓｓＤＮＡはそれぞれＴＹＬＣＳＶの超らせん（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）及び１本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡを意味する。
【０１２４】
ＴＹＬＣＳＶゲノムの複製に対するいくつかのＲｅｐの短縮型の発現の影響を正確に定量的に分析するために、Ｒｅｐの最初の５４ Ｎ−末端アミノ酸をコードする領域に対応する３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブでサザン分析を行い、フィルター上で検出された各バンドに対応する放射能レベルを、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｉｍａｇｅｒ装置（Ｃａｎｂｅｒｒａ， Ｐａｃｋａｒｄ）での分析により評価した。
【０１２５】
各突然変異構築を重複して、独立した３回の実験においてアッセイした。図１０に記述される値は３回の独立した実験の２又は３回の共遺伝子導入の平均を示す。
【０１２６】
ｐＧＥＭ−Ｐ対照プラスミドと共にｐＴＯＭ６で行った共遺伝子導入実験におけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルは１００％に等しいと考えられた。
【０１２７】
特に、図１０は定量的分析を示し、ヒストグラムの白及び黒のバーはそれぞれ超らせん及び１本鎖ＤＮＡの量を表し；エラーバーは平均標準偏差を示す。
【０１２８】
図９及び１０を観察することにより示されるように、Ｒｅｐタンパク質の最初の１３０ Ｎ−末端アミノ酸は殆ど完全にウイルス複製を阻害するのに充分であるが、一方最初の１２０ Ｎ−末端アミノ酸の発現は影響を及ぼさない。
【０１２９】
実施例５．Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ形質転換植物の作製。
プロトプラストにおける一過性発現により評価されたＲｅｐ突然変異株によるＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する能力の分析により、前の実施例で記述された最小の突然変異株はそれでもなお有効にＲｅｐ−１３０（配列番号９）をコードしていることが示された。
【０１３０】
また、Ｒｅｐ−１３０をコードするＣ１遺伝子の近位５’部分はＲｅｐ−２１０をコードする配列に比較して転写後遺伝子抑制の効果の少ない標的であることが、既に他の実施例において明らかにされている。
【０１３１】
従って、Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ形質転換植物が得られた。この目的のために、ｐＪＴＲ１３０のＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをｐＢＩＮ１９のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより図１１に示されたｐＴＯＭ１３０プラスミドが得られた。
【０１３２】
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａをｐＴＯＭ１３０プラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐＧＶ２２６０ Ｃ５８株で形質転換し、そしてカナマイシン耐性植物を記述されているように再生した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０１３３】
図１２に示すように、導入遺伝子の存在についてＰＣＲ分析により、Ｒｅｐ−１３０タンパク質の発現についてウエスタンブロットにより、一次形質転換体を分析した。
【０１３４】
形質転換（３００〜３０９）植物又は野生型対照（ｗｔ）植物から得られたタンパク質抽出物を、記述されているように抗−ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐウサギポリクロナール一次抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０１３５】
実施例６：ｐＴＯＭ１３０構築で安定的に形質転換され、Ｒｅｐ−１３０を発現する植物細胞はＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する。
Ｒｅｐ−１３０により付与された耐性を早期に評価するために、いくつかの一次形質転換Ｒｅｐ−１３０発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物から単離したプロトプラストをＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）で感染させた。
【０１３６】
形質転換系統は、ウエスタンブロット分析により明らかであるように（図１２）、高いＲｅｐ−１３０発現により選択された。
該形質転換プロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型及びＲｅｐ−２１０発現形質転換プロトプラスト（系統１０２．２２）において観察されたレベルと比較した。
【０１３７】
特に、図１３は野生型（ｗｔ）及びＲｅｐ−１３０（配列番号９）（系統３００，３０１，３０３）又はＲｅｐ−２１０（系統１０２．２２）のいずれかを発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の分析を示す。Ｒｅｐ−２１０転写物に対応するジゴキシゲニン−標識ＲＮＡプローブを使用するサザンブロットにより、いくつかのプロトプラスト検体からの総核酸抽出物を分析した。
【０１３８】
Ｒｅｐ−１３０形質転換プロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルを野生型プロトプラストにおいて観察されるレベルと比較するために、野生型プロトプラストから抽出された総核酸も、図１３に示すように、１：１０及び１：５０希釈の後に負荷した。
【０１３９】
実施例７：Ｒｅｐ−１３０を発現するトマト形質転換植物の作製。
前記実施例に記述されているように、プロトプラスト中の一過性発現により評価した、Ｒｅｐ変異株によるＴＹＬＣＳＶ複製阻害の能力の分析により、最小変異株はなお有効にＲｅｐ−１３０をコードしていることが示された。
【０１４０】
既に示したように、Ｒｅｐ−１３０をコードするＣ１遺伝子の近位５’部分は、Ｒｅｐ−２１０をコードする配列に比較して転写後遺伝子抑制の無効な標的である。
【０１４１】
したがって、Ｒｅｐ−１３０を発現する形質転換トマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｃｖ． Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）の作製を行った。
【０１４２】
ｐＴＯＭ１３０プラスミド（図１１）を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐＧＶ２２６０ Ｃ５８株を使用してトマトを形質転換し、カナマイシン耐性植物を記述のように再生した（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。
【０１４３】
ＰＣＲ分析により導入遺伝子の存在について、そしてウエスタンブロットによりＲｅｐ−１３０タンパク質の発現について一次形質転換体を分析した（図１４）。
【０１４４】
抗−ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐポリクロナールウサギ一次抗体を記述（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のように使用するウエスタンブロットにより、形質転換植物（系統４００）又は野生型対照植物（ｗｔ）から得たタンパク質抽出物を分析した。
【０１４５】
Ｒｅｐ−１３０タンパク質を発現する形質転換トマト植物は全て、表現型からは野生型植物と区別することはできない（図１５）。
【０１４６】
実施例８：Ｒｅｐ−１３０を発現するｐＴＯＭ１３０構築により形質転換された植物におけるＴＹＬＣＳＶに対する持続的耐性の実証。
Ｒｅｐ−１３０発現により付与されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性の持続を評価するために、Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｒ１形質転換植物にＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株をアグロ接種した。
【０１４７】
以前に報告したように、耐性をアッセイし、経時的な安定性を評価するために使用されるアグロ接種によるウイルス投与は、高い又は非常に高いウイルス圧力条件（ｈｉｇｈ ｏｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｖｉｒａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に相当する。
【０１４８】
植物の感染は、コートタンパク質遺伝子に特異的なジゴキシゲニン−標識プローブを使用する“ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｉｎｔｉｎｇ”アッセイにより１週間間隔で評価した。
【０１４９】
表７の結果は、Ｒｅｐ−２１０を発現する形質転換植物に関する表２に記述した結果と異なり、Ｒｅｐ−１３０タンパク質を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、ＴＹＬＣＳＶをアグロ接種した場合に長期間持続する耐性を示すことを示している。このことは、接種後２及び６週間における耐性植物の比較により推測することができる。
【０１５０】
さらに、形質転換Ｒ２トマト植物において、Ｒｅｐ−１３０発現により付与されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性の安定性が評価された。
【０１５１】
ＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１＋ｐＣＨ３２株を植物にアグロ接種した。耐性の評価及びその経時的安定性の評価のために使用したアグロ接種条件は、高い又は非常に高いウイルス圧力条件に相当する。
【０１５２】
コートタンパク質遺伝子に特異的な放射能標識プローブを使用するドット−ブロットアッセイにより１又は２週間ごとに感染を評価した。
【０１５３】
ＴＹＬＣＳＶ感染性クローンでアグロ接種した場合に、Ｒｅｐ−１３０を発現するトマト形質転換植物は長期間持続する耐性を示すことを、表８の結果は示している。このことは接種後３及び１２週間後における耐性植物の比較から推測することができる。
【０１５４】
したがって、それをコードする配列はウイルス−誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的であり、そしてＲｅｐは、さらに変異していたとしても、ウイルス耐性を付与する能力を維持している故に、耐性はＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）の存在及びＴＹＬＣＳＶを接種された形質転換植物の安定的にＲｅｐ−１３０を発現する能力に関連している。
【０１５５】
実施例９：感染性ウイルスによって誘発される転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は極めて無効な標的となるように修飾され、ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列の構築。
形質転換植物においてＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質の長期間持続する発現を達成するために、本発明の方法を使用して、感染性ウイルスによって誘発される転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は極めて無効な標的であるＲｅｐ−２１０タンパク質をコードすることができる合成ポリヌクレオチド配列が作製された。
【０１５６】
さらに、以下の条件が続く：
- 合成ポリヌクレオチド配列は、Ｃ４タンパク質をコードすることはできず、Ｒｅｐ−１３０（配列番号８；配列番号９）について記述したように、位置２３１及び２３３に図８に示されたのと同じ突然変異を持つ；
- 導入された突然変異は全てサイレントである、すなわち、合成ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質生成物は、野生型ウイルス配列によりコードされているタンパク質生成物と一致する；
- 突然変異はトマト遺伝子におけるコドン使用頻度にしたがって導入された；特に、可能な限り、トマトにおいてより高頻度に使用されているコドンを選択した；
- 導入した突然変異は、ポリアデニル化又はスプライシングシグナル、潜在変異などのような特別な機能を持つ配列の形成の可能性を排除するために全てチェックした。
【０１５７】
上記基準に従って、Ｒｅｐ−２１０をコードする二つの合成配列が設計された（図１６Ａ及びＢ，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５）。
【０１５８】
合成Ｒｅｐ−２１０サイレンシングマイナスＢ遺伝子（配列番号４）の配列に５’の非翻訳リーダー配列及び３’の終結コドンを加えた。
【０１５９】
特に、５’−３’方向に非翻訳リーダー配列、Ｒｅｐ−２１０をコードする合成配列（図１６Ｂ；配列番号４，配列番号５）及び終結コドンを含むポリヌクレオチド配列は、“ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ”修正作用を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、オリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ ａｎｄ Ｌａｕｒｅｎｃｅ， １９９２； Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）から始まるＰＣＲにより組み立てられた。
【０１６０】
合成遺伝子を次いでＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ ３５Ｓの転写終結配列の転写制御の下にｐＪＩＴ６０プラスミド中にクローニングし、ｐＪＴ６０Ｓｙｎを作製した。次いで、ｐＪＴ６０ＳｙｎプラスミドからＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩによる制限により、５’−３’方向に；３５Ｓプロモーター、Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子、３５Ｓターミネーターを含むカセットを取り出し、バイナリープラスミドｐＢＩＮ１９発生ｐＴＯＭ１０２ＳｙｎのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローニングした。
【０１６１】
実施例１０：Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子によるウイルス複製の阻害の評価。
ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎで形質転換されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を使用するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアグロ浸潤により、合成遺伝子によりコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質の正しい発現をチェックした。ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）で形質転換された株Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を陽性対照として使用し、一方陰性対照としてバイナリープラスミドｐＢＩＮ１９で形質転換された株Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を使用した。ウエスタンブロット分析（図１７）は合成遺伝子によりコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質の発現を示す。
【０１６２】
ｐＴＯＭ１０２ＳｙｎによってコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質のＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する能力を評価するために、一過性の共アグロ浸潤アッセイを行った。ａ）ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミド；ｂ）ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）プラスミド；ｃ）ｐＢＩＮ１９バイナリープラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２株で、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉を共アグロ浸潤した。浸潤後７２時間の共アグロ浸潤組織から抽出した総核酸のサザン分析によりＴＹＬＣＳＶ複製を評価した。この分析により、合成遺伝子（ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎ）及び野生型遺伝子ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）により発現されるＲｅｐ−２１０タンパク質は、同様にＴＹＬＣＳＶ複製を阻害することが示された（図１８）。
【０１６３】
実施例１１：Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の作製。
Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を得るために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの円盤状に切った葉を、ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ ４４０４株を使用して形質転換し、そして記述（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のようにカナマイシン耐性植物を再生した。
【０１６４】
一次形質転換体を、ウエスタンブロット分析によりＲｅｐ−２１０タンパク質の発現について分析した。中程度のレベルのＲｅｐ−２１０を蓄積した４つの一次形質転換体、５０６，５０８，５１７及び５３７系統をその他の試験のために選択した。図１９は５０６，５０８Ａ及び５０８Ｂ植物から抽出したタンパク質のウエスタン分析を示す。
【０１６５】
実施例１２：Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子のために形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における耐性の安定性。
形質転換植物により生産されるＲｅｐ−２１０の量とＴＹＬＣＳＶに対する耐性の間に正相関があることを、著者らは既に示した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。Ｒｅｐ−２１０タンパク質を中程度のレベルに蓄積するｐＴＯＭ１０２構築で形質転換した形質転換植物は、非形質転換植物と同様にウイルス感染に対して感受性である（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６及び未発表データ）。これらの植物において低レベルのＲｅｐ−２１０タンパク質はウイルスの複製を完全に阻害するには不十分であるので、早期にウイルス誘発転写後抑制が確立して耐性喪失の原因となるＲｅｐ−２１０タンパク質蓄積の劇的減少を生じてしまう。
【０１６６】
合成遺伝子によりコードされるＲｅｐ−２１０タンパク質がウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的でないか又は無効の標的であり、したがってウイルス感染を経時的に制御するか否かを評価するために、Ｒｅｐ−２１０の類似する量を発現する系統１０２．２２形質転換植物（Ｒ３）及び系統５０６形質転換植物（Ｒ０）（図２０、０ ｗｐｉ）をＴＹＬＣＳＶでアグロ接種し、ＴＹＬＣＳＶの蓄積を１週間隔でドットブロットにより分析した。予想されるように（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、中程度のレベルのＲｅｐ−２１０タンパク質を蓄積する形質転換Ｒ３系統１０２．２２植物（図２１、５〜８）は、非形質転換植物（図２１、１〜４）と同様に感受性である。ドットブロット分析により示されるように（図１２、９〜１２）、合成構築（Ｒ０系統５０６）による形質転換植物はウイルス感染に対して抵抗性であり、限定された量のウイルスを蓄積したのみである。興味あることに、ウイルスが有効に転写後抑制を行えないために、合成遺伝子、Ｒｅｐ−２１０は接種後５週間でもまだ蓄積し（図２０、５ ｗｐｉ）、経時的にＴＹＬＣＳＶ複製を阻害した（図２１、９〜１２）。
【０１６７】
この実施例に記述した結果は、病原体由来ポリペプチド配列が感染するウイルスによる転写後遺伝子抑制の標的とならないか又は無効の標的になるように適切に選択されるか又は修飾され場合には、病原体由来ポリヌクレオチド配列からなる導入遺伝子を植物中に発現させることにより、ジェミニウイルスに対する長期間持続する耐性を得ることが可能であることを示している。
【０１６８】
実施例１３：ＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質をコードし、感染するウイルスにより誘発される転写後分解の標的とならないか又は極めて無効な標的となるように修飾された合成ポリヌクレオチド配列の構築。
上に報告したように、種間交配トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｘ Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）におけるＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質の形質転換発現はウイルス感染に対する部分耐性を付与する（Ｋｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。またこの場合に、キャプシドタンパク質の発現に仲介される耐性は長期間持続しない。
【０１６９】
形質転換植物によるＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質（ＣＰ）の安定した発現を得るために、ＣＰをコードすることができ、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的を生じる合成ポリヌクレオチド配列が作製された。
【０１７０】
本発明の方法を使用して、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的とならないか又は極めて無効な標的となる必要条件を充たすように、合成ポリヌクレオチド配列は設計された。
【０１７１】
さらに、以下の条件が続く：
- 導入された突然変異は全てサイレントである、すなわち、合成ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質生成物は、野生型ウイルス配列によりコードされているタンパク質生成物と全く一致する；
- 導入された突然変異はトマト遺伝子におけるコドン使用頻度を考慮する；特に、可能な限り、トマトにおいてより高頻度に使用されているコドンを選択した；
- 導入した突然変異は、ポリアデニル化シグナル又はスプライシングシグナル、潜在変異などのような特別な機能を持つ配列の形成の可能性を排除するために全てチェックした。
【０１７２】
上記の条件にしたがって、ＣＰをコードする合成配列は設計された（配列番号１２）（図２２、ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ サイレンシングマイナス、配列番号６，配列番号７）。
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジェミニウイルスに対して持続的耐性を持つ形質転換植物の作製方法に関係する。
【０００２】
特に本発明は、導入遺伝子がジェミニウイルス（ｇｅｍｉｎｉ ｖｉｒｕｓｅｓ）により誘発される転写後遺伝子抑制（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の無効な標的を生じるように適切に修飾された病原体に由来するポリヌクレオチド配列を含む、ジェミニウイルスに対して持続的耐性を持つ形質転換植物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジェミニウイルスは、広範囲のそして多様なクラスの植物ウイルスであり、種々の農産物として価値のある植物に感染して重大な収穫減少を生じさせることが知られている。このウイルスは双球状の二十面体の二つの粒子からなるビリオンを特徴とする。１個又は２個の環状・一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）からなるそのゲノムは、感染した細胞の核の中で二本鎖中間体を介して複製する（Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【０００４】
ジェミニウイルス科は、媒介昆虫、宿主範囲及びゲノムの構造に基づいて、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ及びＴｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓと命名された４つの属に分類されている（Ｂｒｉｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５； Ｆａｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０００５】
コナジラミ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉにより伝達されるトマト植物の重大な病気は以前から「トマト黄化葉巻病（ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｖｅ ｃｕｒｌ）」として中東、東南アジア及びアフリカの地域で知られていた（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。１００％の収穫喪失を生じることがある（Ｐｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）この病気は、続いて西地中海に広がり、サルジニア、シシリー及びスペインに達し（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、そしてアメリカ（Ｐｏｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）にも広がった。
【０００６】
最近この病気の病原体が同定及び単離され、ジェミニウイルス科、Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスであった。系統研究により、Ｂｅｇｏｍｏｖiｒｕｓの地理的起源：アジア、アフリカ及びアメリカの違いによって異なるウイルス種の存在が明らかにされた（Ｃｚｏｓｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０００７】
トマト黄化葉巻病サルジニアウイルス（ＴＹＬＣＳＶ）種のゲノムは単一分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）である（Ｋｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＤＮＡは二方向に転写され、図１に示すようにウイルス鎖（Ｖ）の上に２個、Ｖ１及びＶ２、及び相補鎖（Ｃ）の上に４個、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４の６個のオープンリードフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。Ｃ１とＶ２のＯＲＦの間に、全てのジェミニウイルス科のゲノムに存在するものに類似した遺伝子間領域（ＩＲ）と言われる非コード領域がある。ＴＹＬＣＳＶのゲノム構成は、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）及びアフリカキャッサバウイルス（ＡＣＭＶ）のような二分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの構成成分Ａのものに構造的に類似している。二分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの場合には、構成成分Ａの相補鎖上に存在するＯＲＦの名称は：ＡＬ１又はＡＣ１、ＡＬ２又はＡＣ２、ＡＬ３又はＡＣ３、ＡＬ４又はＡＣ４であり、一方ウイルス鎖上はＡＲ１又はＡＶ１、ＡＲ２又はＡＶ２であり；成分Ｂの相補鎖上は：ＢＬ１又はＢＣ１であり、ウイルス鎖上はＢＲ１又はＢＶ１である。
【０００８】
Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉにより伝達されるジェミニウイルス感染の制御のために今日まで使用された方法は、高価な微細メッシュの網の使用（生鮮販売トマトの栽培用）及び特に反復殺虫剤処理（生鮮販売及び加工用トマトの栽培）に基づいている。そのような方法は生産費用の増加と農業従事者及び消費者の健康に重大な危険を生じる。さらに殺虫剤イミダクロプリドに耐性のＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ集団の発生が既に報告されている（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０００９】
耐性の栽培種の開発は、ウイルス感染を制御するために最も実用的でしかも経済的な方法である。トマト黄化葉巻病の原因となるジェミニウイルスに対する耐性を導入するための古典的な育種計画は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎの野生種の耐性遺伝子をトマトの栽培種に導入することに基づいていた。これによって種々のレベルのＴＹＬＣＳＶ耐性の系統が得られ、そして市販され、最も良好な系統は症状の減少及びウイルス複製の低下を示した。しかし、低い平均的な耐性レベルの植物は、さらに感染を広げる潜在的貯蔵所である。
【００１０】
考慮すべきその他の重要な点は、得られた系統の農学的特徴は、必ずしも最適ではないが、育種計画に使用した栽培用トマトの遺伝子型の特徴を反映していることである。
【００１１】
トマト黄化葉巻病を生じるウイルスに免疫を持つ、すなわち症状もウイルスのＤＮＡ複製もないトマトの系統はまだ発表されていない。
【００１２】
遺伝子工学の出現により、植物ウイルスに対する耐性特性の導入に関する新しい展望が開けた。殆どの方法は、目的の植物における病原体由来配列の導入及び発現、病原体由来耐性（ＰＤＲ）に基づいている（Ｓａｎｆｏｒｄ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８５； Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８６； Ｔａｖａｚｚａ ａｎｄ Ｌｕｃｉｏｌｉ，１９９３）。
【００１３】
そのような方法はＲＮＡゲノムを持つ植物ウイルスに対する耐性特性の導入については応用に成功したが（Ｂｅａｃｈｙ，１９９７）、ＤＮＡゲノムを持つジェミニウイルスの場合には、病原体由来配列の発現により持続的抵抗力及び／又は耐性を持つ植物は作製されていない。
【００１４】
病原体由来配列の発現により達成されるウイルス耐性の導入の機序は二つの大きなクラスに分類することができる：
ａ）例えば、ドミナントネガティブ突然変異体のような病原体タンパク質の発現により仲介される耐性；
ｂ）転写後遺伝子抑制により仲介される耐性（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９６； Ｂｅａｃｈｙ，１９９７； Ｚａｉｔｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ，２０００）。
【００１５】
転写後遺伝子抑制は、標的ＲＮＡに相同的な配列を持つ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形成に続く特異的ＲＮＡの分解を伴う、真核生物においていたるところで存在する過程（ｕｂｉｑｕｉｔａｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ）である。
【００１６】
導入遺伝子に相同的なｄｓＲＮＡの生成を誘発することができる様々な状況があり得るが（異常なトランスジェニックＲＮＡの転写、トランスジェニックＲＮＡにおける充分な長さの反転及び反復配列の存在、反転及び反復した多重コピーとして植物ゲノムにおける導入遺伝子の取り込み）、ｄｓＲＮＡが作られた後は、後者は認識されそしてｓｉＲＮＡと呼ばれる約２１〜２６ヌクレオチドのｄｓＲＮＡの短い分子に分解される。
【００１７】
次いでこのｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと命名された多重タンパク質複合体に取り込まれ、このＲＩＳＣはｓｉＲＮＡと相同の配列を持つ全てのＲＮＡを分解することができる。したがって、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ抑制特異性を決定する因子であり、そして指定された配列に関連するその存在は、そのＲＮＡ配列が転写後に抑制されることを一義的に確立する。
【００１８】
したがって、ウイルスＲＮＡゲノムに由来する配列の転写後抑制を生じる形質転換植物は、相同的ウイルス及び導入遺伝子と密接に関連するヌクレオチド配列を持つウイルスに対して耐性である。
【００１９】
導入遺伝子抑制はウイルス感染によっても誘発することができる。
【００２０】
事実、導入遺伝子のヌクレオチド配列が感染ウイルスゲノムの部分に相同である場合には、ウイルス複製は、初期は抑制されない導入遺伝子の抑制を誘発することができる。抑制機構の活性化は、誘発ＲＮＡに相同な配列を持つＲＮＡ分子の特異的分解を伴う。
【００２１】
直接的結果として、ウイルスによる抑制の活性化はウイルス及びウイルスゲノムに対し相同であるトランスジェニックｍＲＮＡ配列の両者の分解に関連している。これにより初期の感染段階の後宿主が回復し、新しく成長した部分にはウイルスがないことが証明される。回復現象に続いて成長する植物組織の特別な性質は、同じウイルスによる次の感染に対して高度の耐性を持っていることである。
【００２２】
この転写後遺伝子抑制に仲介される耐性は、ヌクレオチドレベルにおける認識に基づいているので、導入遺伝子が由来したウイルスゲノムに高い相同性を持つウイルス単離株にのみ耐性を示す。しかし、病原体タンパク質の発現に基づく方法では、通常ヌクレオチドの観点からは密接に関係しないウイルス株または単離株に対しても耐性の植物が作られる。
【００２３】
導入遺伝子抑制は温度により影響され、１５℃未満の温度において不活性になることも示されている（Ｓｚｉｔｔｙａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、１５℃未満の温度範囲の屋外条件に暴露される植物は抑制仲介耐性を失うことがある。
【００２４】
ＲＮＡゲノムウイルスに対する耐性を持つ形質転換植物は、数年前に導入遺伝子抑制に基づいた機序により達成されたが、これまでそのような方法をジェミニウイルス（ＤＮＡゲノム−ウイルス）に応用して成功できたという報告はない、ということを忘れてはならない。
【００２５】
広範囲のジェミニウイルスに対して耐性を持つ植物を得るための最も良い方法は、干渉する生成物がタンパク質である方法であることは明らかである。耐性の範囲が広いことは作製される植物の農学的及び商業的価値を増加させることは明らかである。
【００２６】
それに関係して、ジェミニウイルスに対する耐性又は免疫の高いレベルを持つ植物を得るために、ジェミニウイルスが複製するＲｅｐタンパク質の機能喪失変異体の形質転換植物における発現が使用されている。
【００２７】
ＴＹＬＣＳＶの切断した複製Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ−２１０）の発現はウイルス感染に対する耐性を付与することができるが、ウイルスは経時的にそれに打ち勝つことができるのでそのような耐性は持続しないことが、文献において知られている。
【００２８】
Ｔｏｍａｔｏ ４７ｘ ｗｔ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｌｉｎｅ １０２．２２（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種（ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）Ｒｅｐ−２１０発現形質転換植物の耐性分析の結果を表１及び２にそれぞれ示す。
【００２９】
表１及び２に報告された結果から、病原体由来配列の導入遺伝子発現により仲介されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性が経時的に消失することが明らかに推測される。
【００３０】
同様に、二分節ジェミニウイルス「アフリカキャッサバモザイクウイルス」のＲｅｐのドミナントネガティブ突然変異の導入遺伝子発現により誘発される耐性も、経時的に消失する（Ｓａｎｇａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００３１】
その他の例は、種間交配トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｘ Ｌ． ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）におけるＴＹＬＣＶキャプシドタンパク質の導入遺伝子発現によって示され、これはウイルス感染に対して部分的耐性を付与する（Ｋｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この場合においてでも、キャプシドタンパク質の発現により仲介された耐性は永く持続せず、農学的観点からは有用性がなかった。
【００３２】
上記に照らして、ジェミニウイルスに対して長期間持続する耐性を得るために、ジェミニウイルスに由来するポリヌクレオチド配列を上手に使用する新しい方法に対する要求があることは明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明の著者らは今回、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的としてジェミニウイルスに対する耐性レベルを持続する形質転換植物を得られるように適当に修飾された、病原体由来ウイルスタンパク質をコードし、宿主にウイルス耐性を付与することができるポリヌクレオチド配列を作製した。
【００３４】
実験による事実で著者らは、耐性の消失そしてそれによるジェミニウイルスに対する持続的耐性を達成する困難さは、転写後に導入遺伝子を抑制し、そして感染ウイルスに相同の配列を持つ導入遺伝子が転写後抑制される植物内で分散する、ジェミニウイルスの予期せざる能力によるものであることを示す。
【００３５】
図２及び３にそれぞれ示すように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ 系統 １０２．２２の形質転換植物及びＴｏｍａｔｏ ４７ｘ ｗｔの植物の両者において、耐性を消失させるウイルスの能力は同じウイルスによる導入遺伝子抑制及び抑制された植物中に分散するウイルスの予期せざる能力により生じる。
【００３６】
導入遺伝子Ｒｅｐ−２１０が転写後抑制される植物の中において分散するＴＹＬＣＳＶの能力は、図４における記述によりさらに詳しく説明されている。
結果は、Ｒｅｐ−２１０タンパク質の不在、及び導入遺伝子相同ｓｉＲＮＡの同時発生によって示されるように、アグロ接種（ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）以前に転写後抑制されている形質転換トマト植物４７ ｘ １０Ｄ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、対照と同様にＴＹＬＣＳＶ感染に感受性であることを示している。
【００３７】
上記より、ＲＮＡウイルスとは異なり、ジェミニウイルスはウイルス遺伝子配列の能動的抑制によって阻止されないことになる。このことは使用される形質転換植物の種類又はアグロ感染又はＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉによるウイルスの接種方法に制限されない。事実、表３に示すように、対照植物の９０％から１００％が感染する程度に植物当たりのウイルス保有Ｂｅｍｉｓｉａの数を減らすと、導入遺伝子が転写後抑制された形質転換植物（系統２０１）の約４０％は感染しないか又は遅れて感染するが、一方より高い接種濃度においては、ウイルス保有昆虫によりチャレンジされた植物は、アグロ接種を使用して行った実験と同様にすべて感染した。
ａ 植物当たり７匹のウイルス保有昆虫で２日間
ｂ 植物当たり３５匹のウイルス保有昆虫で５日間
ｃ 接種後の週
【００３８】
したがって、耐性を試験し、そして（図２，３及び４及び表１及び２に示すような）経時的持続を評価するために使用したウイルスのアグロ接種条件が、高い又は非常に高いウイルス圧力条件に対応することを、考慮することが重要である。この実験的方法が、ウイルス感染に対する非常に高い耐性レベル又は免疫を持ち、したがって非常に高い商業的価値のある形質転換植物の同定を可能にする。
【００３９】
かくして、病原体由来配列の発現によるジェミニウイルスに対する耐性特性の導入は、導入遺伝子を転写後抑制し、そして抑制植物中において分散するジェミニウイルスの予期せざる能力により限定される。
【００４０】
さらに著者らは、図５に示すように、ＴＹＬＣＳＶのプラス鎖（Ｖ１及びＶ２）及びマイナス鎖（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，及びＣ４）のいずれの転写物も、野生型植物の正常な感染の際に、ウイルスの転写後抑制を受けることを示す。このことから、これらがウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は無効の標的になるように適切に修飾されなければ、同じ病原体に由来する配列の発現により長期間の耐性を達成することは不可能となる。しかし、本発明により適切に突然変異した配列又は選抜された配列を植物ゲノム中に導入することにより、既知方法によっては達成されない、ジェミニウイルスに対して長期間持続する耐性を得ることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
したがって、本発明の目的は、ジェミニウイルスに由来するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列は、ウイルスの転写後抑制の標的で無いか又は無効の標的であることを特徴とし、そして、
ａ）それに対し耐性が要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下のヌクレオチド相同性；
ｂ）それに対し耐性が要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して１７ヌクレオチド以下、好ましくは８ヌクレオチド以下、より好ましくは５ヌクレオチド以下のＲＮＡ転写物の連続相同性；
ｃ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して３０ヌクレオチド以下、好ましくは２０ヌクレオチド以下、より好ましくは９ヌクレオチド以下の１置換を含む配列の最大長；
を有し、
該ポリヌクレオチド配列は、それによって形質転換された植物、組織又は植物細胞全体に、ジェミニウイルスに対する持続的耐性を付与することができる前記ポリヌクレオチド配列である。
【００４２】
本発明によるポリヌクレオチド配列は、野生型又は合成又は突然変異誘起により作製され、そしてそれによってコードされたジェミニウイルス由来アミノ酸配列はウイルス感染を妨害する野生型又は突然変異配列である。
【００４３】
したがって、本発明は、上記のａ）、ｂ）及びｃ）において定義し、特定した原理に従ってそれに対する耐性を導入することを要求される、ジェミニウイルスの対応するゲノム配列に対してヌクレオチドレベルで異なるように、適切に変更されているか又は野生型のジェミニウイルスのポリヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明のその他の目的は、ジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列は、転写後抑制の標的で無いか又無効の標的であることを特徴とし、そしてそれに対する耐性が要求されるジェミニウイルスの配列に対して殆ど１００％に等しい相同性を有し、そして同様の妨害能力を維持していたとしても、元の配列に対してｓｉＲＮＡ群が過小になるように短縮化されている。
【００４５】
本発明によるポリヌクレオチド配列を構築する遺伝子配列は、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓのようなジェミニウイルスから導くことができ、特に表４に示した種及びその単離株、より特異的にはトマト黄化葉巻病ウイルスの種及び表５に示したその単離株から導くことができる。
【００４６】
Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓの種は、好ましくはＴＹＬＣＣＮＶ， ＴＹＬＣＧＶ， ＴＹＬＣＭａｌＶ， ＴＹＬＣＳＶ， ＴＹＬＣＴＨＶ， ＴＹＬＣＶ， ＡＣＭＶ， ＢＧＭＶ， ＣａＬＣｕＶ， ＴｏＣＭｏＶ， ＴＧＭＶ， ＴｏＧＭｏＶ， ＴｏＭＨＶ， ＴｏＭｏＴＶ， ＴｏＭｏＶ， ＴｏＲＭＶ， ＴｏＳＬＣＶ， ＴｏＳＲＶ， ワタ葉巻（ＣＬＣｒＶ， ＣＬＣｕＡＶ， ＣｌＣｕＧＶ， ＣＬＣｕＫＶ， ＣＬＣｕＭＶ， ＣＬＣｕＲＶ），東アフリカキャッサバモザイク（ＥＡＣＭＣＶ， ＥＡＣＭＭＶ， ＥＡＣＭＶ， ＥＡＣＭＺＶ），ジャガイモ黄化モザイク（ＰＹＭＰＶ， ＰＹＭＴＶ， ＰＹＭＶ）， カボチャ葉巻（ＳＬＣＣＮＶ， ＳＬＣＶ， ＳＬＣＹＶ），サツマイモ葉巻（ＳＰＬＣＧＶ， ＳＰＬＣＶ）， タバコ葉巻（ＴｂＬＣＪＶ， ＴｂＬＣＫｏＶ， ＴｂＬＣＹＮＶ， ＴｂＬＣＺＶ）、トマト葉巻（ＴｏＬＣＢＶ， ＴｏＬＣＢＤＶ， ＴｏＬＣＧＶ， ＴｏＬＣＫＶ， ＴｏＬＣＬＶ， ＴｏＬＣＭＶ， ＴｏＬＣＮＤＶ， ＴｏＬＣＳＬＶ， ＴｏＬＣＴＷＶ， ＴｏＬＣＶＶ， ＴｏＬＣＶ），及びそれらの単離株である。
【００４７】
他の属、Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓに属するジェミニウイルスのその他の好ましい種は、ＷＤＶ， ＭＳＶ， ＳＳＶ， ＢＹＤＶ， ＴＹＤＶ， ＢＣＴＶ及びその単離株である。
【００４８】
ジェミニウイルスのゲノムに属する遺伝子配列は、配列Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１， Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１、特に既に記述されたジェミニウイルスの配列Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１及びその単離株であり得る。
【００４９】
本発明の目的のポリヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列は、それを発現する植物にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる病原体由来タンパク質である。したがって、本発明の該妨害タンパク質は安定的に発現し、タンパク質産物が耐性を誘発できる分子機構とは別の持続的耐性を付与する。
【００５０】
病原体由来タンパク質は、キャプシドタンパク質、複製関連ウイルスタンパク質（Ｒｅｐ）、遺伝子Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１によりコードされているタンパク質であり得る。
【００５１】
上記の条件を満たす可能性のあるポリヌクレオチド配列の例は図１６Ａ及び１６Ｂに記述されており、これらの図はいずれのヌクレオチド配列も同じウイルスタンパク質をコードしている、ＴＹＬＣＳＶのＲｅｐ−２１０タンパク質をコードしている野生型ヌクレオチド配列と感染ウイルスにより誘発される転写後分解の標的とならないように修飾された合成ヌクレオチド配列との整列を示す。
【００５２】
このポリヌクレオチド配列により形質転換することができる植物、組織又は植物細胞は、トマト、コショウ、タバコ、サツマイモ、ワタ、メロン、カボチャ、マニオック、ジャガイモ、マメ、ダイズ、ムングマメ、ビート、サトウキビ、トウモロコシ、コムギであり得る。
【００５３】
本発明のその他の目的は、５’−３’方向に下記を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む構築体である：
ａ）該植物又は組織又は形質転換細胞においてプロモーターとして作用するポリヌクレオチド配列；
ｂ）ジェミニウイルスの遺伝子間領域に属するか又は属さない、コード領域の５’位置に存在する非翻訳ポリヌクレオチド配列；
ｃ）本発明によるポリヌクレオチド配列又はそのフラグメント又は変異体；
ｄ）該ポリヌクレオチド配列の３’の位置に存在する、転写のターミネーターとして作用する配列。
【００５４】
既に記述した構築を含む発現ベクターは本発明の別の目的である。
【００５５】
更に、本発明の目的は、そのゲノムに本発明のポリヌクレオチド配列を含む植物、組織又は形質転換植物細胞、その子孫並びに種子である。
【００５６】
最後に、本発明の目的は、ジェミニウイルスに対する持続的耐性を持つ形質転換植物、組織又はその植物細胞を作製する方法であって、
ａ）ジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるアミノ酸配列をコードするウイルス遺伝子配列を「同定」又は「選択」し；
ｂ）感染するジェミニウイルスによって誘発される転写後抑制の影響を受けない標的とするように該ウイルス遺伝子配列の突然変異誘起又は「選抜」を行い；
ｃ）既に記述した構築体を介して、ステップｂ）において得られた、変異され若しくは選抜されたジェミニウイルスの遺伝子配列を、植物、組織又はその植物細胞に挿入する；
ステップを含む、前記方法である。
【００５７】
本発明の方法のステップａ）に関して、用語「同定」はジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる該ウイルス遺伝子配列の実験的認定を意味し、一方、用語「選択」はジェミニウイルスに対する持続性のない耐性を付与することができる既に使用し得るウイルス遺伝子配列の認定を意味する。したがって、本発明による方法はさらに、既知配列を使用することにより生じるジェミニウイルスに対する耐性の消失の問題に対する解決策を提供する。
【００５８】
特に、ステップｂ）において予想される突然変異誘起は、それに対する耐性を獲得することが要求されるジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に対して、90％以下の、好ましくは80％以下の、より好ましくは70％以下のヌクレオチド相同性を維持して行われ、ジェミニウイルスの対応する配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が１７ヌクレオチド以下、好ましくは８ヌクレオチド以下、より好ましくは５ヌクレオチド以下であり、そして元来の遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大の長さが３０ヌクレオチドを超えない、好ましくは２０ヌクレオチドを超えない、より好ましくは９ヌクレオチド以下であるように分布している。
【００５９】
本発明によりステップａ）において同定又は選択されたポリヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列は、野生型ウイルスタンパクに対して１００％の相同性を有するタンパク質である可能性がある。
【００６０】
この突然変異誘起は、ジェミニウイルスに対する耐性を付与するタンパク質の能力を減少させないヌクレオチド配列上の全ての突然変異を含んでいる。可能性のある突然変異は、サイレント点突然変異及び類似の生化学的性質を持つアミノ酸との置換を生じる突然変異の両者又は欠失及び/又は挿入及び/又は置換である。
【００６１】
その他には、本発明の方法のステップｂ）における突然変異誘起は、感染ウイルスにより作られたｓｉＲＮＡの天然の集団において、該配列が類似の妨害能力を保持したまま元来の配列に関して少なく表現されるような、末端のポリヌクレオチド配列の欠失からなる。
【００６２】
その他には、本発明の方法のステップｂ）における「選抜」の本質は、転写後抑制の標的とならないように、又は無効の標的であるように、求められている耐性の対象となるジェミニウイルスとはヌクレオチドのレベルにおいて異なるジェミニウイルスの野生型配列の認定にある。
【００６３】
特に、本発明の方法のステップｂ）における突然変異誘起作用は、ｓｉＲＮＡの集団において野生型タンパク質をコードする配列に対して過小であり、そして該短縮化されたタンパク質はジェミニウイルスに対する耐性を付与する能力を維持している該遺伝子配列の最小領域が同定されるまで、ステップａ）のウイルス遺伝子配列３’又は５’領域を欠失することからなることができる。
【００６４】
さらに、本発明の方法のステップａ）のウイルス遺伝子配列は、ＴＹＬＣＳＶ Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子の配列であり得、そのアミノ酸配列は、例えばＲｅｐ−１３０のような野生型ウイルスタンパク質に比較して短縮化されたタンパク質であり得る。
【００６５】
本発明による合成的ポリヌクレオチド配列の種々の農学的応用の中で、特に興味のあるものはＴＹＬＣＳＶに対する耐性を持つトマト植物を得るためにそれを使用することである。
【００６６】
この特別な態様において、短縮化されたウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ−２１０）をコードする形質転換用ポリヌクレオチド配列は、３’欠失により修飾され、耐性を付与する能力を保持しつつ、ＴＹＬＣＳＶ−誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的を生じた。
【００６７】
特に、放射性ＲＮＡプローブとのストリンジェントハイブリダイゼーションを使用して、図６及び７に示されるように、野生型植物におけるＴＹＬＣＳＶの感染の際に作られるウイルス由来ｓｉＲＮＡの集団において少ないＴＹＬＣＳＶゲノムの転写領域が同定された。この領域は、ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐをコードする遺伝子の最初の３９０ヌクレオチドに相当する。その転写物はウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的であり、安定的に発現し、持続的耐性を生じるＲｅｐ−１３０タンパク質をコードしている。
【００６８】
したがって、本発明の特別な態様において、ＴＹＬＣＳＶのような、本発明のポリヌクレオチド配列によりコードされているジェミニウイルスのアミノ酸配列は、短縮されたＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）であり得る。この場合に、転写後抑制の無効な標的とされ又は標的にならないようにされたウイルス遺伝子配列は配列番号８である。
【００６９】
本発明のその他の目的は、ステップｂ）における突然変異誘起が、ジェミニウイルスに対する耐性を付与し、且つ転写後抑制の無効な標的又は非標的にする、コードアミノ酸配列の能力を維持しているステップａ）のウイルス遺伝子配列のサイレント点突然変異からなる上記の方法である。
【００７０】
特に、ステップａ）のウイルス遺伝子配列はＴＹＬＣＳＶ（配列番号１２）の場合にはＶ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子であり得、特別な態様において、転写後抑制の無効な標的又は非標的にするウイルス遺伝子配列は配列番号６である。
【００７１】
さらに、ステップａ）のウイルス遺伝子配列はＴＹＬＣＳＶ Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子であり得、この場合に転写後抑制の無効な標的又は非標的にするウイルス遺伝子配列は配列番号２又は配列番号４であり得る。
【００７２】
ここで、添付した個々の図を参照しつつ、好ましい態様に従って、非限定的な説明により本発明を記述する。
【００７３】
図１は、トマト黄化葉巻病ウイルスＳａｒｄｉｎｉａ種（ＴＹＬＣＳＶ）のゲノムを示す。ＤＮＡは双方向性に転写されており、部分的に又は完全にオーバーラップする６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ウイルス鎖（Ｖ）上の２個、Ｖ１及びＶ２、及び相補鎖（Ｃ）上の４個、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４）を含んでいる。
【００７４】
図２は、ＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（系統１０２．２２）におけるＲｅｐ−２１０タンパク質の発現を示す。記号（−）、（＋）及びＮＩは、健康、感染及び非接種植物をそれぞれ意味する。分析は、ＴＹＬＣＳＶのアグロ接種前（０ ｗｐｉ）及びその後４及び８週間後（それぞれ４及び８ ｗｐｉ）に行った。
【００７５】
図３は、ＴＹＬＣＳＶでのアグロ接種前（０ ｗｐｉ）及びその２２週間後（２２ ｗｐｉ）のトマト植物（系統 ４７ Ｘ ｗｔ）におけるＲｅｐ−２１０タンパク質及び形質転換ｍＲＮＡの発現を示す。記号（＋）及び（−）はそれぞれ特定した時期において植物が感染しているか又は健康であるかを意味する。
【００７６】
図４は、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種前の形質転換トマト植物（４７ Ｘ １０Ｄ系統）における相対的転写に相当するＲｅｐ−２１０タンパク質及びｓｉＲＮＡの発現の分析を示す。パネルの記号（＋）及び（−）は、それぞれＣ１のセンス及びアンチセンスの導入遺伝子の存在及び非存在を意味し；ｗｔは対照の野生型植物を意味し；ｓｉＲＮＡのパネル下側の記号（＋）、（−）及びＮＩは、ウイルスの存在（＋）及び非存在（−）をそれぞれ、そして対照としての非アグロ接種を意味する。
【００７７】
図５は、ＴＹＬＣＳＶ−感染野生型トマト植物（検体１〜４）及び対照としての非感染植物（検体Ｃ）から抽出した小型ＲＮＡのノーザンブロットを示す。Ｍは分子量マーカーを意味する。
【００７８】
図６は、ＴＹＬＣＳＶのゲノムに対する小型妨害ＲＮＡの分布分析を示す。最上段は、ＴＹＬＣＳＶゲノムの直線的地図；転写物は矢印により示されている（Ｖ１及びＶ２はウイルスゲノムと同方向、そしてＣ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４は相補的方向）；ウイルスゲノム地図の下の９個の空ボックスは９個のＰＣＲフラグメント（それぞれ約３００ヌクレオチド長）を表し、その中にゲノムが分割され、そしてその臭化エチジュウム染色及びＴＹＬＣＳＶ感染トマト植物から抽出したｓｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションが示されている。ＩＲは１０番目のＰＣＲフラグメントを示し、ＴＹＬＣＳＶゲノムの非転写遺伝子間領域に相当する。パネルの下の数字は、各ＰＣＲフラグメントに関するハイブリダイゼーションシグナルのパーセンテージを意味する。
【００７９】
図７は、非アグロ接種（検体Ｃ）又はＴＹＬＣＳＶ−アグロ接種（検体１及び２）野生型トマト植物における接種４週間後におけるｓｉＲＮＡの存在の分析を示す；特に、Ｒｅｐ−２１０（プローブＡ）及びＲｅｐ−１３０（プローブＢ）の転写物に対応するｓｉＲＮＡを分析した；左パネルの列１００及び５０はそれぞれ、プローブＡ及びＢの両者に相同なオリゴヌクレオチドの１００及び５０ｐｇに対応する。
【００８０】
図８は、ｐＴＯＭ１３０プラスミドのＲｅｐ−１３０（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。大文字は、ＴＹＬＣＳＶに属するものでなく、クローニングに由来するヌクレオチド；下線の付いた配列はクローニングに使用したＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位に対応する。開始及び終結コドンは太文字で記述されており、一方Ｃ４タンパク質発現を除去するために導入された突然変異はイタリックの太文字である。
【００８１】
図９は、上の各列に示されている突然変異Ｒｅｐタンパク質を発現するプラスミドと共に、ＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）で共遺伝子導入された野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストからの総核酸抽出物のサザンブロットを示す。
【００８２】
図１０は、突然変異Ｒｅｐタンパク質を発現するプラスミドと共にｐＴＯＭ６プラスミドで共遺伝子導入された野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の定量的分析を示す。
【００８３】
図１１は、Ｒｅｐ−１３０−発現形質転換植物を得るために使用されたｐＴＯＭ１３０プラスミドの模式図を示す。ＬＢ及びＲＢは左及び右境界をそれぞれ意味する；ｐＥ３５Ｓは複製されたＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ３５Ｓプロモーターを表す；Ｒｅｐ−１３０（配列番号８）はＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）をコードする配列である；ｔ３５ＳはＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ３５Ｓのターミネーター；ｔＮＯＳはノパリン合成酵素をコードする遺伝子のターミネーターである；ｎｐｔＩＩはネオマイシンホスフォトランスフェラーゼをコードする配列である；ｐＮＯＳはノパリン合成酵素の遺伝子のプロモーターである；Ｋａｎはカナマイシン耐性の遺伝子である。
【００８４】
図１２は、ｐＴＯＭ１３０で形質転換した形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈaｍｉａｎａ植物（系統３００〜３０９）におけるＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）発現の分析を示す。
【００８５】
図１３は、Ｒｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）（系統３００， ３０１， ３０３）又はＲｅｐ−２１０タンパク質（１０２．２２）のいずれかを発現する野生型（ｗｔ）及び形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の分析を示す。
【００８６】
図１４は、ｐＴＯＭ１３０（系統４０２， ４０３， ４０６， ４１１， ４１３， ４１６， ４１７）で形質転換された形質転換Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物におけるＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）発現の分析を示す。形質転換Ｒｅｐ−１３０発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（系統３０３）から抽出されたタンパク質が陽性対照として使用された。
【００８７】
図１５は、Ｒｅｐ−１３０を発現するｐＴＯＭ１３０（系統４０６）で形質転換されたＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ形質転換植物と非形質転換野生型植物の間の比較を示す。
【００８８】
図１６Ａ及びＢは、Ｒｅｐ−２１０をコードする合成配列の二つの例（配列番号２，配列番号４）を示す。ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列（Ｓｅｑ＿ｃｏｄ＿Ｒｅｐ２１０＿ｗｉｌｄ＿ｔｙｐｅ，上側；配列番号１）及びウイルス誘発転写後抑制の無効な標的となるように修飾された合成ヌクレオチド配列（Ｓｅｑ＿ｃｏｄ＿Ｒｅｐ２１０＿ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ＿ｍｉｎｕｓ、下側；配列番号２、配列番号４）の間の整列が示されている。合成配列において、野生型配列に対して突然変異を生じているヌクレオチドは網掛け文字で示されている。
【００８９】
図１７は、プラスミド野生型遺伝子ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）及び合成遺伝子Ｒｅｐ−２１０抑制マイナスＢ（配列番号４），（プラスミドｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎ）によりコードされているＲｅｐ−２１０タンパク質のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の中へのアグロ浸潤による一過性発現の分析を示す。
【００９０】
図１８は、ａ）Ｒｅｐ−２１０ 配列番号１の野生型遺伝子を発現するｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）プラスミド（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、系統１〜３；ｂ）Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現するｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミド（Ｒｅｐ−２１０抑制マイナスＢ；配列番号４）系統４〜６；ｃ）空のクローニングプラスミドｐＢＩＮ１９ 系統７〜９、を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株の共アグロ浸潤によるウイルス複製の一過性阻害のアッセイを示す。
【００９１】
図１９は、Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子、Ｒｅｐ−２１０−抑制マイナスＢ、配列番号４（系統 ５０６，５０８Ａ及び５０８Ｂ）を含むｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミドで形質転換された形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるＲｅｐ−２１０タンパク質の発現の分析を示す。Ｒｅｐ−２１０発現形質転換トマト植物から抽出されたタンパク質を陽性対照として使用した。
【００９２】
図２０は、ｐＴＯＭ １０２（系統１０２．２２，Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）又はｐＴＯＭ １０２Ｓｙｎ（系統５０６）で形質転換された形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種後のＲｅｐ−２１０タンパク質の発現の分析を示す。分析は、ＴＹＬＣＳＶアグロ接種前（０ｗｐｉ）及び５週間後（５ｗｐｉ）に実施した。
【００９３】
図２１は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型（ＷＴ）又はｐＴＯＭ １０２（系統１０２．２２，Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）又はｐＴＯＭ １０２Ｓｙｎ（系統５０６）のいずれかで形質転換された形質転換植物の２，３，４，５ ｗｐｉ（このｗｐｉはアグロ接種後の週の数を意味する）における「ドット−ブロット」による感染の分析を示す。
【００９４】
図２２は、ＣＰをコードする合成配列の例を示す。ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ（ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ，上側；配列番号１２）をコードする野生型ヌクレオチド配列及びウイルス誘発転写後分解の極めて無効な標的または非標的となるように修飾された合成ヌクレオチド配列（ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ抑制マイナス、下側；配列番号６）の間の整列が示されている。合成配列において、野生型配列に対して突然変異を生じているヌクレオチドは網掛け文字で示されている。
【００９５】
実施例１：ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ない（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）ＴＹＬＣＳＶゲノムの領域の同定。
野生型植物のＴＹＬＣＳＶによる自然の感染において、ＴＹＬＣＳＶゲノムの両鎖により転写されたウイルス配列は、ゲノムの種々な部分に相同的なｓｉＲＮＡの存在によって示されるように、転写後遺伝子抑制の標的である（図５）。図５には、ＴＹＬＣＳＶに感染した野生型トマト植物（検体１〜４）及び非感染対照（検体Ｃ）から抽出された総ＲＮＡのノーザンブロットが示されている。使用されたプローブ及び制限部位は各パネルの横に示されている。またｓｉＲＮＡの推定分子量が記述されている。
【００９６】
ＴＹＬＣＳＶゲノムの一部の領域が他の領域よりも転写後遺伝子抑制の効果が少ない標的であるか否かを評価するために、ウイルスゲノムの位置に関してｓｉＲＮＡの分布を系統的に調べた。したがって、特異的オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより得られるそれぞれ約３００塩基対である９個の連続するフラグメントにＴＹＬＣＳＶゲノムを分割した（図６に示されている）。アガロースゲル電気泳動の後、該フラグメントの同量をナイロンフィルターに移した。アガロースゲルに負荷したＰＣＲフラグメントの定量はソフトウエアＡｉｄａにより行った。ＴＹＬＣＳＶ感染トマト植物により作られたｓｉＲＮＡを総ＲＮＡから開始して精製し、末端を標識して、ＴＹＬＣＳＶゲノムの数領域を含むフィルター上でプローブとして使用した（Ｓｚｉｔｔｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。負荷したフラグメントの同量に対して、異なる強度のハイブリダイゼーションシグナルを生じ、これをＴＹＰＨＯＯＮ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により評価した。その結果、ウイルスゲノムの数領域についてｓｉＲＮＡの異なる分布が検出された（図６）。
【００９７】
実施例２：ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ないＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の領域の同定。
ｓｉＲＮＡ集団において過度に少ないＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の領域を同定するために、健康及びＴＹＬＣＳＶ感染の両トマト植物から総ＲＮＡ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を抽出した。
【００９８】
該ＲＮＡの３０マイクログラムを８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ノーザンブロットを介して毛管現象によりナイロンフィルターに移した。二つの同一のレプリカを作り、図７に示すように、それぞれについてＣ１遺伝子の５’領域の異なる部分に相当するプローブとのハイブリダイゼーションを行った。一つのフィルターは、４２ｎｔの非翻訳リーダー配列及びＣ１遺伝子の最初の６３０ヌクレオチド（Ｃ１遺伝子の約３/５）からなるＣ１遺伝子の５’部分に由来するプローブ（プローブＡ）とハイブリダイズし、他のフィルターは４２ｎｔの非翻訳リーダー配列及びＣ１遺伝子の最初の３９０ヌクレオチドからなるＣ１遺伝子の５’部分に由来するプローブ（プローブＢ）とハイブリダイズした。
【００９９】
（二つの独立した標識に由来する）二つの異なるプローブにより得られた結果を定量的に比較するために、両プローブに相補的な４０オリゴヌクレオチドの同スカラー量を両レプリカに負荷した。列１００及び５０は、それぞれ該オリゴヌクレオチドの１００及び５０ピコグラムに対応する。オリゴヌクレオチドの泳動を示すパネルは、ｓｉＲＮＡを含むそれぞれのパネルと並べてあるが、オリゴヌクレオチドとｓｉＲＮＡは異なる分子量を有するので、図の位置はゲル上の位置に対応しない。
【０１００】
平均長７５ヌクレオチドのフラグメントを得るために、インビトロ転写の後の両プローブにアルカリ加水分解を行った（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションは、Ｄａｌｍａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００により記述されている緩衝液中において１６時間３９℃で行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２Ｘ ＳＳＣ，０．２％ ＳＤＳ中で２回４０℃において１０分間、２回４５℃において１０分間、そして１回５０℃において１０分間洗った。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡ集団においてＣ１遺伝子の近位５’領域が過度に少ないことが明らかである。特に、ＴＹＰＨＯＯＮ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行われた結果の定量的分析により、この５’領域に対応するｓｉＲＮＡは２１０アミノ酸をコードするヌクレオチドまで続いている領域に対応するｓｉＲＮＡ（プローブＡ）に比較して約２５％（プローブＢ）であることが明らかにされた。したがって、該５’領域はウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的である。
【０１０３】
これらの結果は、実施例１に記述した方法を使用して、すなわち、Ｃ１遺伝子の二つの異なる領域に対応するＰＣＲフラグメントをＴＹＬＣＳＶに感染したトマト植物から抽出したｓｉＲＮＡの集団とハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。
【０１０４】
実施例３：短縮ＲｅｐをコードするＣ１遺伝子５’部分のポリヌクレオチド配列の構築体。
以前に示されたように（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、Ｒｅｐ−２１０形質転換植物は長期に持続しない耐性及び変化した表現型を示す。
【０１０５】
図１において知ることが出来るように、Ｃ４遺伝子は短縮されたＣ１遺伝子の中に異なるリーディングフレームとして組み込まれている。
【０１０６】
ジェミニウイルスＣ４遺伝子の導入遺伝子発現は表現型の変換を誘発する（Ｋｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１０７】
従って、Ｃ４ ＯＲＦを発現できない短縮化Ｃ１構築体がいくつか設計された。
【０１０８】
Ｃ４（−）突然変異株を得るために、二点突然変異の導入によりＣ４配列中に終結コドンが導入された。特に、図８に記述されたｐＴＯＭ１３０配列（配列番号８）に関して、ヌクレオチド２３３における突然変異は、Ｃ４をコードするリーディングフレームのＴＣＡコドン（セリンをコードする）をＴＧＡ（ｏｐａｌ）に変換するＣからＧへの変換を含む。さらに、ヌクレオチド２３１の突然変異は、Ｃ１をコードするリーディングフレーム中でロイシンコドンを復活させるＣからＴへの変換からなる（ＣＴＣがＴＴＧになる、植物では良く現れる）。
【０１０９】
そのためＣ４タンパク質の翻訳はわずか１０アミノ酸で中断され、一方Ｃ１タンパク質のアミノ酸配列は変化しない。二つの導入された突然変異は、Ｃ１リーディングフレーム中ではロイシンコドンを植物におけるコドン使用に適合するように維持しつつ、Ｃ４リーディングフレーム中に「強力な」終結コドンを発生させる条件に基づく多数の可能性のある突然変異の中から選択された。
【０１１０】
突然変異誘起は以下の突然変異オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより行われた。
【０１１１】
Ｃ４プラスプライマー（配列番号１０）：５’−ＣＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＡＴ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＡＡ Ｇ−３’
【０１１２】
Ｃ４マイナスプライマー（配列番号１１）：５'−Ｃ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧ−３’（ＴＹＬＣＳＶの２４１９−２４４８，Ｋｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１）
【０１１３】
二つの突然変異プライマーのそれぞれは、鋳型としてｐＧＥＭ１０２を使用する二つの別々のＰＣＲ反応において外部プライマーと共に使用される（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０１１４】
特に、外部オリゴヌクレオチドはＲｅｖ及びＵｎｉｖ（Ｍ１３／ｐＵＣ配列分析プライマー ｎ．１２３３及び１２２４）である。Ｕｎｉｖ／Ｃ４プラスにより行われる反応により５３７ｂｐフラグメントが得られ、一方Ｒｅｖ／Ｃ４マイナスによる反応からは３５１ｂｐフラグメントが得られた。
【０１１５】
得られた生成物は、二つの外部プライマーを使用して行われた続く増幅反応に鋳型として使用された。
【０１１６】
得られたＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化され、ｐＪＩＴ６０の対応する部位にクローニングされ、こうしてｐＪＩＴＲ２１０を得た。いずれの場合も、クローンを検証するために配列分析を行った。
【０１１７】
実施例４：植物細胞の中に発現したときにウイルス複製を阻害できるＴＹＬＣＳＶ Ｃ１遺伝子の最小５’領域の同定。
ＴＹＬＣＳＶに対する耐性を付与することが出来るＣ１遺伝子の最小５’末端領域を明確にするために、Ｃ１遺伝子の３’−末端欠失突然変異株のシリーズをｐＪＩＴ６０発現ベクター中にクローニングし、ｐＪＴＲシリーズを得た。
【０１１８】
ウイルス配列を、末端に制限部位を含む特異的プライマーを使用して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によるＰＣＲにより増幅した。
【０１１９】
Ｒｅｐ−２１０をコードし、内部のＣ４タンパク質の終結コドンを含む、以前に記述したｐＪＩＴＲ２１０プラスミドを鋳型として使用した。増幅反応により得られたフラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素で消化し、ｐＪＩＴ６０の対応する部位にクローニングして、ｐＪＴＲシリーズを得た。
【０１２０】
増幅忠実度及びベクター挿入ジャンクションを確認するために、全ての最終クローンを配列分析した。全ての増幅配列の長さと正確な位置を表６に記述した。
【０１２１】
ＴＹＬＣＳＶに対する耐性を付与する各Ｒｅｐ欠失突然変異株の能力は、各突然変異株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）によるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型プロトプラストの共遺伝子導入アッセイにより評価し、次いでサザンブロットによりウイルスゲノムの複製レベルを分析した。得られた結果を図９及び１０に示した。
（１）ＴＹＬＣＳＶゲノムのヌクレオチド番号はＫｈｅｙｒ−Ｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９１に従う。
【０１２２】
プロトプラスト共遺伝子導入、総核酸抽出及びサザン分析は既に記述した方法（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００１）に従って行った。
【０１２３】
各プロトプラスト検体からの総核酸抽出物を、Ｒｅｐ−２１０をコードする配列及び対照として使用したｐＧＥＭ−Ｐプラスミドに対応するジゴキシゲニン−標識ＲＮＡプローブでサザンブロットすることにより分析した。特に、図９は総核酸のサザンブロットを表しているが、その中のｓｃＤＮＡ及びｓｓＤＮＡはそれぞれＴＹＬＣＳＶの超らせん（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）及び１本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡを意味する。
【０１２４】
ＴＹＬＣＳＶゲノムの複製に対するいくつかのＲｅｐの短縮型の発現の影響を正確に定量的に分析するために、Ｒｅｐの最初の５４ Ｎ−末端アミノ酸をコードする領域に対応する３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブでサザン分析を行い、フィルター上で検出された各バンドに対応する放射能レベルを、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｉｍａｇｅｒ装置（Ｃａｎｂｅｒｒａ， Ｐａｃｋａｒｄ）での分析により評価した。
【０１２５】
各突然変異構築を重複して、独立した３回の実験においてアッセイした。図１０に記述される値は３回の独立した実験の２又は３回の共遺伝子導入の平均を示す。
【０１２６】
ｐＧＥＭ−Ｐ対照プラスミドと共にｐＴＯＭ６で行った共遺伝子導入実験におけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルは１００％に等しいと考えられた。
【０１２７】
特に、図１０は定量的分析を示し、ヒストグラムの白及び黒のバーはそれぞれ超らせん及び１本鎖ＤＮＡの量を表し；エラーバーは平均標準偏差を示す。
【０１２８】
図９及び１０を観察することにより示されるように、Ｒｅｐタンパク質の最初の１３０ Ｎ−末端アミノ酸は殆ど完全にウイルス複製を阻害するのに充分であるが、一方最初の１２０ Ｎ−末端アミノ酸の発現は影響を及ぼさない。
【０１２９】
実施例５．Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ形質転換植物の作製。
プロトプラストにおける一過性発現により評価されたＲｅｐ突然変異株によるＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する能力の分析により、前の実施例で記述された最小の突然変異株はそれでもなお有効にＲｅｐ−１３０（配列番号９）をコードしていることが示された。
【０１３０】
また、Ｒｅｐ−１３０をコードするＣ１遺伝子の近位５’部分はＲｅｐ−２１０をコードする配列に比較して転写後遺伝子抑制の効果の少ない標的であることが、既に他の実施例において明らかにされている。
【０１３１】
従って、Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ形質転換植物が得られた。この目的のために、ｐＪＴＲ１３０のＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをｐＢＩＮ１９のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより図１１に示されたｐＴＯＭ１３０プラスミドが得られた。
【０１３２】
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａをｐＴＯＭ１３０プラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐＧＶ２２６０ Ｃ５８株で形質転換し、そしてカナマイシン耐性植物を記述されているように再生した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０１３３】
図１２に示すように、導入遺伝子の存在についてＰＣＲ分析により、Ｒｅｐ−１３０タンパク質の発現についてウエスタンブロットにより、一次形質転換体を分析した。
【０１３４】
形質転換（３００〜３０９）植物又は野生型対照（ｗｔ）植物から得られたタンパク質抽出物を、記述されているように抗−ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐウサギポリクロナール一次抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０１３５】
実施例６：ｐＴＯＭ１３０構築で安定的に形質転換され、Ｒｅｐ−１３０を発現する植物細胞はＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する。
Ｒｅｐ−１３０により付与された耐性を早期に評価するために、いくつかの一次形質転換Ｒｅｐ−１３０発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物から単離したプロトプラストをＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）で感染させた。
【０１３６】
形質転換系統は、ウエスタンブロット分析により明らかであるように（図１２）、高いＲｅｐ−１３０発現により選択された。
該形質転換プロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ野生型及びＲｅｐ−２１０発現形質転換プロトプラスト（系統１０２．２２）において観察されたレベルと比較した。
【０１３７】
特に、図１３は野生型（ｗｔ）及びＲｅｐ−１３０（配列番号９）（系統３００，３０１，３０３）又はＲｅｐ−２１０（系統１０２．２２）のいずれかを発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製の分析を示す。Ｒｅｐ−２１０転写物に対応するジゴキシゲニン−標識ＲＮＡプローブを使用するサザンブロットにより、いくつかのプロトプラスト検体からの総核酸抽出物を分析した。
【０１３８】
Ｒｅｐ−１３０形質転換プロトプラストにおけるＴＹＬＣＳＶ複製のレベルを野生型プロトプラストにおいて観察されるレベルと比較するために、野生型プロトプラストから抽出された総核酸も、図１３に示すように、１：１０及び１：５０希釈の後に負荷した。
【０１３９】
実施例７：Ｒｅｐ−１３０を発現するトマト形質転換植物の作製。
前記実施例に記述されているように、プロトプラスト中の一過性発現により評価した、Ｒｅｐ変異株によるＴＹＬＣＳＶ複製阻害の能力の分析により、最小変異株はなお有効にＲｅｐ−１３０をコードしていることが示された。
【０１４０】
既に示したように、Ｒｅｐ−１３０をコードするＣ１遺伝子の近位５’部分は、Ｒｅｐ−２１０をコードする配列に比較して転写後遺伝子抑制の無効な標的である。
【０１４１】
したがって、Ｒｅｐ−１３０を発現する形質転換トマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｃｖ． Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）の作製を行った。
【０１４２】
ｐＴＯＭ１３０プラスミド（図１１）を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐＧＶ２２６０ Ｃ５８株を使用してトマトを形質転換し、カナマイシン耐性植物を記述のように再生した（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。
【０１４３】
ＰＣＲ分析により導入遺伝子の存在について、そしてウエスタンブロットによりＲｅｐ−１３０タンパク質の発現について一次形質転換体を分析した（図１４）。
【０１４４】
抗−ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐポリクロナールウサギ一次抗体を記述（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のように使用するウエスタンブロットにより、形質転換植物（系統４００）又は野生型対照植物（ｗｔ）から得たタンパク質抽出物を分析した。
【０１４５】
Ｒｅｐ−１３０タンパク質を発現する形質転換トマト植物は全て、表現型からは野生型植物と区別することはできない（図１５）。
【０１４６】
実施例８：Ｒｅｐ−１３０を発現するｐＴＯＭ１３０構築により形質転換された植物におけるＴＹＬＣＳＶに対する持続的耐性の実証。
Ｒｅｐ−１３０発現により付与されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性の持続を評価するために、Ｒｅｐ−１３０を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｒ１形質転換植物にＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株をアグロ接種した。
【０１４７】
以前に報告したように、耐性をアッセイし、経時的な安定性を評価するために使用されるアグロ接種によるウイルス投与は、高い又は非常に高いウイルス圧力条件（ｈｉｇｈ ｏｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｖｉｒａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に相当する。
【０１４８】
植物の感染は、コートタンパク質遺伝子に特異的なジゴキシゲニン−標識プローブを使用する“ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｉｎｔｉｎｇ”アッセイにより１週間間隔で評価した。
【０１４９】
表７の結果は、Ｒｅｐ−２１０を発現する形質転換植物に関する表２に記述した結果と異なり、Ｒｅｐ−１３０タンパク質を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、ＴＹＬＣＳＶをアグロ接種した場合に長期間持続する耐性を示すことを示している。このことは、接種後２及び６週間における耐性植物の比較により推測することができる。
【０１５０】
さらに、形質転換Ｒ２トマト植物において、Ｒｅｐ−１３０発現により付与されたＴＹＬＣＳＶに対する耐性の安定性が評価された。
【０１５１】
ＴＹＬＣＳＶ感染性クローンを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１＋ｐＣＨ３２株を植物にアグロ接種した。耐性の評価及びその経時的安定性の評価のために使用したアグロ接種条件は、高い又は非常に高いウイルス圧力条件に相当する。
【０１５２】
コートタンパク質遺伝子に特異的な放射能標識プローブを使用するドット−ブロットアッセイにより１又は２週間ごとに感染を評価した。
【０１５３】
ＴＹＬＣＳＶ感染性クローンでアグロ接種した場合に、Ｒｅｐ−１３０を発現するトマト形質転換植物は長期間持続する耐性を示すことを、表８の結果は示している。このことは接種後３及び１２週間後における耐性植物の比較から推測することができる。
【０１５４】
したがって、それをコードする配列はウイルス−誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的であり、そしてＲｅｐは、さらに変異していたとしても、ウイルス耐性を付与する能力を維持している故に、耐性はＲｅｐ−１３０タンパク質（配列番号９）の存在及びＴＹＬＣＳＶを接種された形質転換植物の安定的にＲｅｐ−１３０を発現する能力に関連している。
【０１５５】
実施例９：感染性ウイルスによって誘発される転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は極めて無効な標的となるように修飾され、ＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列の構築。
形質転換植物においてＴＹＬＣＳＶ Ｒｅｐ−２１０タンパク質の長期間持続する発現を達成するために、本発明の方法を使用して、感染性ウイルスによって誘発される転写後遺伝子抑制の標的にならないか又は極めて無効な標的であるＲｅｐ−２１０タンパク質をコードすることができる合成ポリヌクレオチド配列が作製された。
【０１５６】
さらに、以下の条件が続く：
- 合成ポリヌクレオチド配列は、Ｃ４タンパク質をコードすることはできず、Ｒｅｐ−１３０（配列番号８；配列番号９）について記述したように、位置２３１及び２３３に図８に示されたのと同じ突然変異を持つ；
- 導入された突然変異は全てサイレントである、すなわち、合成ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質生成物は、野生型ウイルス配列によりコードされているタンパク質生成物と一致する；
- 突然変異はトマト遺伝子におけるコドン使用頻度にしたがって導入された；特に、可能な限り、トマトにおいてより高頻度に使用されているコドンを選択した；
- 導入した突然変異は、ポリアデニル化又はスプライシングシグナル、潜在変異などのような特別な機能を持つ配列の形成の可能性を排除するために全てチェックした。
【０１５７】
上記基準に従って、Ｒｅｐ−２１０をコードする二つの合成配列が設計された（図１６Ａ及びＢ，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５）。
【０１５８】
合成Ｒｅｐ−２１０サイレンシングマイナスＢ遺伝子（配列番号４）の配列に５’の非翻訳リーダー配列及び３’の終結コドンを加えた。
【０１５９】
特に、５’−３’方向に非翻訳リーダー配列、Ｒｅｐ−２１０をコードする合成配列（図１６Ｂ；配列番号４，配列番号５）及び終結コドンを含むポリヌクレオチド配列は、“ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ”修正作用を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、オリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ ａｎｄ Ｌａｕｒｅｎｃｅ， １９９２； Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）から始まるＰＣＲにより組み立てられた。
【０１６０】
合成遺伝子を次いでＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ ３５Ｓの転写終結配列の転写制御の下にｐＪＩＴ６０プラスミド中にクローニングし、ｐＪＴ６０Ｓｙｎを作製した。次いで、ｐＪＴ６０ＳｙｎプラスミドからＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩによる制限により、５’−３’方向に；３５Ｓプロモーター、Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子、３５Ｓターミネーターを含むカセットを取り出し、バイナリープラスミドｐＢＩＮ１９発生ｐＴＯＭ１０２ＳｙｎのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローニングした。
【０１６１】
実施例１０：Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子によるウイルス複製の阻害の評価。
ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎで形質転換されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を使用するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアグロ浸潤により、合成遺伝子によりコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質の正しい発現をチェックした。ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）で形質転換された株Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を陽性対照として使用し、一方陰性対照としてバイナリープラスミドｐＢＩＮ１９で形質転換された株Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２を使用した。ウエスタンブロット分析（図１７）は合成遺伝子によりコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質の発現を示す。
【０１６２】
ｐＴＯＭ１０２ＳｙｎによってコードされたＲｅｐ−２１０タンパク質のＴＹＬＣＳＶ複製を阻害する能力を評価するために、一過性の共アグロ浸潤アッセイを行った。ａ）ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミド；ｂ）ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）プラスミド；ｃ）ｐＢＩＮ１９バイナリープラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２株と共にＴＹＬＣＳＶ感染性クローン（ｐＴＯＭ６）を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１／ｐＣＨ３２株で、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉を共アグロ浸潤した。浸潤後７２時間の共アグロ浸潤組織から抽出した総核酸のサザン分析によりＴＹＬＣＳＶ複製を評価した。この分析により、合成遺伝子（ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎ）及び野生型遺伝子ｐＴＯＭ１０２（Ｃ４−）により発現されるＲｅｐ−２１０タンパク質は、同様にＴＹＬＣＳＶ複製を阻害することが示された（図１８）。
【０１６３】
実施例１１：Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の作製。
Ｒｅｐ−２１０の合成遺伝子を発現する形質転換Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を得るために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの円盤状に切った葉を、ｐＴＯＭ１０２Ｓｙｎプラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ ４４０４株を使用して形質転換し、そして記述（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６）のようにカナマイシン耐性植物を再生した。
【０１６４】
一次形質転換体を、ウエスタンブロット分析によりＲｅｐ−２１０タンパク質の発現について分析した。中程度のレベルのＲｅｐ−２１０を蓄積した４つの一次形質転換体、５０６，５０８，５１７及び５３７系統をその他の試験のために選択した。図１９は５０６，５０８Ａ及び５０８Ｂ植物から抽出したタンパク質のウエスタン分析を示す。
【０１６５】
実施例１２：Ｒｅｐ−２１０合成遺伝子のために形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における耐性の安定性。
形質転換植物により生産されるＲｅｐ−２１０の量とＴＹＬＣＳＶに対する耐性の間に正相関があることを、著者らは既に示した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｂｒｕｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。Ｒｅｐ−２１０タンパク質を中程度のレベルに蓄積するｐＴＯＭ１０２構築で形質転換した形質転換植物は、非形質転換植物と同様にウイルス感染に対して感受性である（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９６及び未発表データ）。これらの植物において低レベルのＲｅｐ−２１０タンパク質はウイルスの複製を完全に阻害するには不十分であるので、早期にウイルス誘発転写後抑制が確立して耐性喪失の原因となるＲｅｐ−２１０タンパク質蓄積の劇的減少を生じてしまう。
【０１６６】
合成遺伝子によりコードされるＲｅｐ−２１０タンパク質がウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的でないか又は無効の標的であり、したがってウイルス感染を経時的に制御するか否かを評価するために、Ｒｅｐ−２１０の類似する量を発現する系統１０２．２２形質転換植物（Ｒ３）及び系統５０６形質転換植物（Ｒ０）（図２０、０ ｗｐｉ）をＴＹＬＣＳＶでアグロ接種し、ＴＹＬＣＳＶの蓄積を１週間隔でドットブロットにより分析した。予想されるように（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、中程度のレベルのＲｅｐ−２１０タンパク質を蓄積する形質転換Ｒ３系統１０２．２２植物（図２１、５〜８）は、非形質転換植物（図２１、１〜４）と同様に感受性である。ドットブロット分析により示されるように（図１２、９〜１２）、合成構築（Ｒ０系統５０６）による形質転換植物はウイルス感染に対して抵抗性であり、限定された量のウイルスを蓄積したのみである。興味あることに、ウイルスが有効に転写後抑制を行えないために、合成遺伝子、Ｒｅｐ−２１０は接種後５週間でもまだ蓄積し（図２０、５ ｗｐｉ）、経時的にＴＹＬＣＳＶ複製を阻害した（図２１、９〜１２）。
【０１６７】
この実施例に記述した結果は、病原体由来ポリペプチド配列が感染するウイルスによる転写後遺伝子抑制の標的とならないか又は無効の標的になるように適切に選択されるか又は修飾され場合には、病原体由来ポリヌクレオチド配列からなる導入遺伝子を植物中に発現させることにより、ジェミニウイルスに対する長期間持続する耐性を得ることが可能であることを示している。
【０１６８】
実施例１３：ＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質をコードし、感染するウイルスにより誘発される転写後分解の標的とならないか又は極めて無効な標的となるように修飾された合成ポリヌクレオチド配列の構築。
上に報告したように、種間交配トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｘ Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）におけるＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質の形質転換発現はウイルス感染に対する部分耐性を付与する（Ｋｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。またこの場合に、キャプシドタンパク質の発現に仲介される耐性は長期間持続しない。
【０１６９】
形質転換植物によるＴＹＬＣＳＶキャプシドタンパク質（ＣＰ）の安定した発現を得るために、ＣＰをコードすることができ、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の無効な標的を生じる合成ポリヌクレオチド配列が作製された。
【０１７０】
本発明の方法を使用して、ウイルス誘発転写後遺伝子抑制の標的とならないか又は極めて無効な標的となる必要条件を充たすように、合成ポリヌクレオチド配列は設計された。
【０１７１】
さらに、以下の条件が続く：
- 導入された突然変異は全てサイレントである、すなわち、合成ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質生成物は、野生型ウイルス配列によりコードされているタンパク質生成物と全く一致する；
- 導入された突然変異はトマト遺伝子におけるコドン使用頻度を考慮する；特に、可能な限り、トマトにおいてより高頻度に使用されているコドンを選択した；
- 導入した突然変異は、ポリアデニル化シグナル又はスプライシングシグナル、潜在変異などのような特別な機能を持つ配列の形成の可能性を排除するために全てチェックした。
【０１７２】
上記の条件にしたがって、ＣＰをコードする合成配列は設計された（配列番号１２）（図２２、ＴＹＬＣＳＶ ＣＰ サイレンシングマイナス、配列番号６，配列番号７）。
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
該ポリヌクレオチド配列はウイルスの転写後抑制の標的でないか又は無効の標的であること、及び
ａ）それに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して９０％以下のヌクレオチドレベルの相同性；
ｂ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して、１７ヌクレオチド以下の転写されたＲＮＡにおける連続相同性；
ｃ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して、３０ヌクレオチドを超えない１置換を含む配列の最大長
を有することが特徴であり、
該ポリヌクレオチド配列はそれにより形質転換された植物、組織又は植物細胞にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が８０％以下である請求項１に記載の配列。
【請求項３】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が７０％以下である請求項１に記載の配列。
【請求項４】
ジェミニウイルスの遺伝子配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が８ヌクレオチド以下である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項５】
ジェミニウイルスの遺伝子配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が５ヌクレオチド以下である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項６】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が２０ヌクレオチドを超えない先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項７】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が９ヌクレオチドを超えない先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項８】
先行する請求項にそれぞれ記載され、それに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの対応するゲノム配列に関してヌクレオチドレベルで異なるようにポリヌクレオチド配列が突然変異しているか又はジェミニウイルスから選択された野生型配列である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項９】
ジェミニウイルスがＭａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ及びＴｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ及びその単離株の種からなる群から選択される先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項１０】
Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ種がＴＹＬＣＣＮＶ， ＴＹＬＣＧＶ， ＴＹＬＣＭａｌＶ， ＴＹＬＣＳＶ， ＴＹＬＣＴＨＶ， ＴＹＬＣＶ， ＡＣＭＶ， ＢＧＭＶ， ＣａＬＣｕＶ， ＴｏＣＭｏＶ， ＴＧＭＶ， ＴｏＧＭｏＶ， ＴｏＭＨＶ， ＴｏＭｏＴＶ， ＴｏＭｏＶ， ＴｏＲＭＶ， ＴｏＳＬＣＶ， ＴｏＳＲＶ， ワタ葉巻（ＣＬＣｒＶ， ＣＬＣｕＡＶ， ＣｌＣｕＧＶ， ＣＬＣｕＫＶ， ＣＬＣｕＭＶ， ＣＬＣｕＲＶ），東アフリカキャッサバモザイク（ＥＡＣＭＣＶ， ＥＡＣＭＭＶ， ＥＡＣＭＶ， ＥＡＣＭＺＶ），ジャガイモ黄化モザイク（ＰＹＭＰＶ， ＰＹＭＴＶ， ＰＹＭＶ）， カボチャ葉巻（ＳＬＣＣＮＶ， ＳＬＣＶ， ＳＬＣＹＶ），サツマイモ葉巻（ＳＰＬＣＧＶ， ＳＰＬＣＶ）， タバコ葉巻（ＴｂＬＣＪＶ， ＴｂＬＣＫｏＶ， ＴｂＬＣＹＮＶ， ＴｂＬＣＺＶ）、トマト葉巻（ＴｏＬＣＢＶ， ＴｏＬＣＢＤＶ， ＴｏＬＣＧＶ， ＴｏＬＣＫＶ， ＴｏＬＣＬＶ， ＴｏＬＣＭＶ， ＴｏＬＣＮＤＶ， ＴｏＬＣＳＬＶ， ＴｏＬＣＴＷＶ， ＴｏＬＣＶＶ， ＴｏＬＣＶ），及びそれらの単離株からなる群から選択される請求項９に記載の配列。
【請求項１１】
Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ属に属す種がＷＤＶ， ＭＳＶ， ＳＳＶ， ＢＹＤＶ， ＴＹＤＶ， ＢＣＴＶ及びその単離株からなる群から選択される請求項９に記載の配列。
【請求項１２】
遺伝子配列がジェミニウイルスに属すＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１， Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１からなる群から選択される請求項１に記載の配列。
【請求項１３】
Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子配列が請求項１０及び１１により定義されたジェミニウイルス由来である請求項１２に記載の配列。
【請求項１４】
ジェミニウイルスアミノ酸配列がそのタンパク質を発現した植物にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる病原体由来タンパク質である請求項１に記載の配列。
【請求項１５】
タンパク質がキャプシドタンパク質、複製関連ウイルスタンパク質（Ｒｅｐ）、遺伝子Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１によりコードされるタンパク質からなる群から選択される請求項１４に記載の配列。
【請求項１６】
植物、組織又はその細胞がトマト、コショウ、タバコ、カボチャ、マニオック、サツマイモ、ワタ、メロン、ジャガイモ、ダイズ、ワイン、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、マメ、ビートからなる群に属す請求項１に記載の配列。
【請求項１７】
該ポリヌクレオチド配列はウイルスの転写後抑制の標的でないか又は無効の標的であり、それに対して耐性が要求されているジェミニウイルスの配列に関して１００％に等しい相同性を有し、元の配列に関してｓｉＲＮＡ集団中に少なく表現されるように適切に短縮されていることが特徴であるジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
５’−３’方向に：
ａ）該植物又は組織又は形質転換細胞においてプロモーターとして作用するポリヌクレオチド配列；
ｂ）コード領域の５’位に存在する非翻訳ポリヌクレオチド配列；
ｃ）請求項１から１７によって定義されるようなポリヌクレオチド配列、そのフラグメント又は変異体；
ｄ）該ポリヌクレオチド配列に関して３’に存在し、転写ターミネーターとして作用する配列
を含む異種ポリヌクレオチド配列からなる構築。
【請求項１９】
請求項１８により定義されるような構築からなる発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１から１７により定義されるようなポリヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む形質転換植物、組織又はその植物細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の植物及び植物組織の子孫。
【請求項２２】
請求項１から１７により定義されるようなポリヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む種子。
【請求項２３】
以下の方法：
ａ）ジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるアミノ酸配列をコードするウイルス遺伝子配列の同定又は選択；
ｂ）ジェミニウイルスに感染することにより誘発される転写後抑制の無効な標的になるようにウイルス遺伝子配列を突然変異誘起又は選抜；
ｃ）請求項１８により定義された構築を使用してステップｂ）において突然変異した又は選抜されたジェミニウイルス遺伝子配列を植物、植物組織又はその細胞内に挿入、
を含むジェミニウイルスに対する長期間持続する耐性を持つ形質転換植物、植物組織又はその細胞を作製する方法。
【請求項２４】
突然変異誘起によりそれに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が９０％以下に維持され、ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して転写ＲＮＡにおける連続相同性が１７ヌクレオチド以下であるように分布し、そしてジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が３０ヌクレオチドを超えない請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が８０％以下に維持されている請求項２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が７０％以下に維持されている請求項２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける連続相同性が８ヌクレオチド以下に維持されている請求項２３から２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける連続相同性が５ヌクレオチド以下に維持されている請求項２３から２７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が２０ヌクレオチドを超えない請求項２３から２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が９ヌクレオチドを超えない請求項２３から２９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
突然変異誘起がサイレント点突然変異又は欠失及び／又は挿入及び／または置換からなる請求項２３から３０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３２】
干渉ｓｉＲＮＡの集団において野生型タンパク質をコードする配列に関して少なく表現されそして該短縮タンパク質がジェミニウイルスに対する耐性を付与する能力を維持している該遺伝子配列の最小領域が同定されるまではステップｂ）における突然変異誘起がステップａ）のウイルス遺伝子配列の５’又は３’領域の欠失からなる請求項２３から３１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３３】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子がＴＹＬＣＳＶ遺伝子である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
アミノ酸配列がウイルスの野生型タンパク質に関して短縮タンパク質である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号８の配列である請求項３２から３５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３７】
短縮タンパク質がＲｅｐ−１３０（配列番号９の配列）である請求項３２から３６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３８】
ジェミニウイルスに対する耐性を付与し、そして転写後抑制の標的とならないか又は無効な標的になる同一物によりコードされるアミノ酸配列の能力を維持するためにステップｂ）の突然変異誘起がステップａ）のウイルス遺伝子配列のサイレント点突然変異からなる請求項２３から３１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３９】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＶ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子がＴＹＬＣＳＶ遺伝子である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号８の配列である請求項３８から４０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４２】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＴＹＬＣＳＶのＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１である請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号２の配列又は配列番号４の配列である請求項４２に記載の方法。
【請求項１】
該ポリヌクレオチド配列はウイルスの転写後抑制の標的でないか又は無効の標的であること、及び
ａ）それに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して９０％以下のヌクレオチドレベルの相同性；
ｂ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して、１７ヌクレオチド以下の転写されたＲＮＡにおける連続相同性；
ｃ）ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して、３０ヌクレオチドを超えない１置換を含む配列の最大長
を有することが特徴であり、
該ポリヌクレオチド配列はそれにより形質転換された植物、組織又は植物細胞にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が８０％以下である請求項１に記載の配列。
【請求項３】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が７０％以下である請求項１に記載の配列。
【請求項４】
ジェミニウイルスの遺伝子配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が８ヌクレオチド以下である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項５】
ジェミニウイルスの遺伝子配列に関して転写されたＲＮＡにおける連続相同性が５ヌクレオチド以下である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項６】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が２０ヌクレオチドを超えない先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項７】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が９ヌクレオチドを超えない先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項８】
先行する請求項にそれぞれ記載され、それに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの対応するゲノム配列に関してヌクレオチドレベルで異なるようにポリヌクレオチド配列が突然変異しているか又はジェミニウイルスから選択された野生型配列である先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項９】
ジェミニウイルスがＭａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ及びＴｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ及びその単離株の種からなる群から選択される先行する請求項のそれぞれに記載の配列。
【請求項１０】
Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ種がＴＹＬＣＣＮＶ， ＴＹＬＣＧＶ， ＴＹＬＣＭａｌＶ， ＴＹＬＣＳＶ， ＴＹＬＣＴＨＶ， ＴＹＬＣＶ， ＡＣＭＶ， ＢＧＭＶ， ＣａＬＣｕＶ， ＴｏＣＭｏＶ， ＴＧＭＶ， ＴｏＧＭｏＶ， ＴｏＭＨＶ， ＴｏＭｏＴＶ， ＴｏＭｏＶ， ＴｏＲＭＶ， ＴｏＳＬＣＶ， ＴｏＳＲＶ， ワタ葉巻（ＣＬＣｒＶ， ＣＬＣｕＡＶ， ＣｌＣｕＧＶ， ＣＬＣｕＫＶ， ＣＬＣｕＭＶ， ＣＬＣｕＲＶ），東アフリカキャッサバモザイク（ＥＡＣＭＣＶ， ＥＡＣＭＭＶ， ＥＡＣＭＶ， ＥＡＣＭＺＶ），ジャガイモ黄化モザイク（ＰＹＭＰＶ， ＰＹＭＴＶ， ＰＹＭＶ）， カボチャ葉巻（ＳＬＣＣＮＶ， ＳＬＣＶ， ＳＬＣＹＶ），サツマイモ葉巻（ＳＰＬＣＧＶ， ＳＰＬＣＶ）， タバコ葉巻（ＴｂＬＣＪＶ， ＴｂＬＣＫｏＶ， ＴｂＬＣＹＮＶ， ＴｂＬＣＺＶ）、トマト葉巻（ＴｏＬＣＢＶ， ＴｏＬＣＢＤＶ， ＴｏＬＣＧＶ， ＴｏＬＣＫＶ， ＴｏＬＣＬＶ， ＴｏＬＣＭＶ， ＴｏＬＣＮＤＶ， ＴｏＬＣＳＬＶ， ＴｏＬＣＴＷＶ， ＴｏＬＣＶＶ， ＴｏＬＣＶ），及びそれらの単離株からなる群から選択される請求項９に記載の配列。
【請求項１１】
Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ， Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ， Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ属に属す種がＷＤＶ， ＭＳＶ， ＳＳＶ， ＢＹＤＶ， ＴＹＤＶ， ＢＣＴＶ及びその単離株からなる群から選択される請求項９に記載の配列。
【請求項１２】
遺伝子配列がジェミニウイルスに属すＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１， Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１からなる群から選択される請求項１に記載の配列。
【請求項１３】
Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子配列が請求項１０及び１１により定義されたジェミニウイルス由来である請求項１２に記載の配列。
【請求項１４】
ジェミニウイルスアミノ酸配列がそのタンパク質を発現した植物にジェミニウイルスに対する耐性を付与することができる病原体由来タンパク質である請求項１に記載の配列。
【請求項１５】
タンパク質がキャプシドタンパク質、複製関連ウイルスタンパク質（Ｒｅｐ）、遺伝子Ｃ２／ＡＬ２／ＡＣ２， Ｃ３／ＡＬ３／ＡＣ３， Ｃ４／ＡＬ４／ＡＣ４， Ｖ２／ＡＲ２／ＡＶ２， ＢＣ１／ＢＬ１及びＢＶ１／ＢＲ１によりコードされるタンパク質からなる群から選択される請求項１４に記載の配列。
【請求項１６】
植物、組織又はその細胞がトマト、コショウ、タバコ、カボチャ、マニオック、サツマイモ、ワタ、メロン、ジャガイモ、ダイズ、ワイン、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、マメ、ビートからなる群に属す請求項１に記載の配列。
【請求項１７】
該ポリヌクレオチド配列はウイルスの転写後抑制の標的でないか又は無効の標的であり、それに対して耐性が要求されているジェミニウイルスの配列に関して１００％に等しい相同性を有し、元の配列に関してｓｉＲＮＡ集団中に少なく表現されるように適切に短縮されていることが特徴であるジェミニウイルス由来アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
５’−３’方向に：
ａ）該植物又は組織又は形質転換細胞においてプロモーターとして作用するポリヌクレオチド配列；
ｂ）コード領域の５’位に存在する非翻訳ポリヌクレオチド配列；
ｃ）請求項１から１７によって定義されるようなポリヌクレオチド配列、そのフラグメント又は変異体；
ｄ）該ポリヌクレオチド配列に関して３’に存在し、転写ターミネーターとして作用する配列
を含む異種ポリヌクレオチド配列からなる構築。
【請求項１９】
請求項１８により定義されるような構築からなる発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１から１７により定義されるようなポリヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む形質転換植物、組織又はその植物細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の植物及び植物組織の子孫。
【請求項２２】
請求項１から１７により定義されるようなポリヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む種子。
【請求項２３】
以下の方法：
ａ）ジェミニウイルスに対する耐性を付与することができるアミノ酸配列をコードするウイルス遺伝子配列の同定又は選択；
ｂ）ジェミニウイルスに感染することにより誘発される転写後抑制の無効な標的になるようにウイルス遺伝子配列を突然変異誘起又は選抜；
ｃ）請求項１８により定義された構築を使用してステップｂ）において突然変異した又は選抜されたジェミニウイルス遺伝子配列を植物、植物組織又はその細胞内に挿入、
を含むジェミニウイルスに対する長期間持続する耐性を持つ形質転換植物、植物組織又はその細胞を作製する方法。
【請求項２４】
突然変異誘起によりそれに対する耐性が要求されているジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が９０％以下に維持され、ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して転写ＲＮＡにおける連続相同性が１７ヌクレオチド以下であるように分布し、そしてジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が３０ヌクレオチドを超えない請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が８０％以下に維持されている請求項２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける相同性が７０％以下に維持されている請求項２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける連続相同性が８ヌクレオチド以下に維持されている請求項２３から２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
突然変異誘起によりジェミニウイルスの遺伝子配列に関してヌクレオチドレベルにおける連続相同性が５ヌクレオチド以下に維持されている請求項２３から２７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が２０ヌクレオチドを超えない請求項２３から２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
ジェミニウイルスの対応する遺伝子配列に関して１置換を含む配列の最大長が９ヌクレオチドを超えない請求項２３から２９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
突然変異誘起がサイレント点突然変異又は欠失及び／又は挿入及び／または置換からなる請求項２３から３０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３２】
干渉ｓｉＲＮＡの集団において野生型タンパク質をコードする配列に関して少なく表現されそして該短縮タンパク質がジェミニウイルスに対する耐性を付与する能力を維持している該遺伝子配列の最小領域が同定されるまではステップｂ）における突然変異誘起がステップａ）のウイルス遺伝子配列の５’又は３’領域の欠失からなる請求項２３から３１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３３】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ１／ＡＬ１／ＡＣ１遺伝子がＴＹＬＣＳＶ遺伝子である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
アミノ酸配列がウイルスの野生型タンパク質に関して短縮タンパク質である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号８の配列である請求項３２から３５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３７】
短縮タンパク質がＲｅｐ−１３０（配列番号９の配列）である請求項３２から３６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３８】
ジェミニウイルスに対する耐性を付与し、そして転写後抑制の標的とならないか又は無効な標的になる同一物によりコードされるアミノ酸配列の能力を維持するためにステップｂ）の突然変異誘起がステップａ）のウイルス遺伝子配列のサイレント点突然変異からなる請求項２３から３１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３９】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＶ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｖ１／ＡＲ１／ＡＶ１（ＣＰ）遺伝子がＴＹＬＣＳＶ遺伝子である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号８の配列である請求項３８から４０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４２】
ステップａ）のウイルス遺伝子配列がＴＹＬＣＳＶのＣ１／ＡＬ１／ＡＣ１である請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
転写後抑制の標的にされないか又は無効な標的にされるウイルス遺伝子配列が配列番号２の配列又は配列番号４の配列である請求項４２に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２９１９８（Ｐ２００７−５２９１９８Ａ）
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３１０２６（Ｐ２００６−５３１０２６）
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００４／０００２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７９８
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０５４２８７３２）エネア − エンテ ペル レ ヌオヴェ テクノロジー、 レネルジア エ ラムビエンテ (1)
【出願人】（５９１０９５３６２）コンシグリオ・ナツィオナーレ・デレ・リチェルケ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＩＧＬＩＯ ＮＡＺＩＯＮＡＬＥ ＤＥＬＬＥ ＲＩＣＥＲＣＨＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００４／０００２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７９８
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０５４２８７３２）エネア − エンテ ペル レ ヌオヴェ テクノロジー、 レネルジア エ ラムビエンテ (1)
【出願人】（５９１０９５３６２）コンシグリオ・ナツィオナーレ・デレ・リチェルケ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＩＧＬＩＯ ＮＡＺＩＯＮＡＬＥ ＤＥＬＬＥ ＲＩＣＥＲＣＨＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]