【課題】相当する生物活性を一部分保持しつつも改善された安定性を有する糖タンパク質ホルモン類似体を含む薬学組成物の提供。
【解決手段】α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する、ヒト絨毛性ゴナドトロピンｈＣＧ、ヒト黄体形成ホルモンｈＬＨ、ヒト卵胞刺激ホルモンｈＦＳＨ、ヒト甲状腺刺激ホルモンｈＴＳＨ、およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される糖タンパク質ホルモンであって、上記ホルモンのアミノ酸配列が修飾されることにより、α−サブユニットとβ−サブユニットの各システイン間にジスルフィド結合を創製し、上記２つのシステインは上記ホルモンの天然システイン残基位置の間に露出されて、相当する天然システインの最も外側のシステインユニットの外側には露出されず、安定性の改良のために、相当する天然糖タンパク質ホルモンレセプターに対する生物活性の一部を保持する上記ホルモンを含む、薬学組成物の提供。

【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、糖タンパク質ホルモン類の類似体類、ならびにそれらの調製および用途に関する。より具体的には、本発明は、糖タンパク質ホルモン類をジスルフィド結合架橋した類似体類ならびにそれらの調製および用途に関する。
【０００２】
関連技術の説明
糖タンパク質ホルモン類には、コリオゴナドトロピンとしても知られている絨毛性ゴナドトロピン(chorionic gonadotropin)（ＣＧ）、ルトロピンとしても知られている黄体形成ホルモン(luteinizing hormone) （ＬＨ）、ホリトロピンとして知られている卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone)（ＦＳＨ）、およびチロトロピンとしても知られている甲状腺刺激ホルモン(thyroid stimulatinghormone)（ＴＳＨ）が含まれる。ヒトからのそれらは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）、および、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）として知られている。これらのホルモンは、生殖腺および甲状腺の機能に重要な役割を果たしている（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１：Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。ＣＧおよびＬＨはＬＨレセプター類と結合してそれらを刺激し、ＦＳＨはＦＳＨレセプター類と結合してそれらを刺激し、また、ＴＳＨはＴＳＨレセプター類と結合しそれらを刺激する。ＣＧは、主に、霊長類を含む数少ない哺乳動物の胎盤によって大量に生成されるホルモンである。霊長類からのＣＧのβ−サブユニットのアミノ酸配列は、通常、ＬＨのそれらとは異なる。ウマもまたＣＧを生成するが、ウマのＣＨは、ウマのＬＨと同一のアミノ酸配列を持つ（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９１）。
【０００３】
Ｐｉｅｒｃｅら（１９８１）によって論評されているように、糖タンパク質ホルモンは、α−およびβ−サブユニットからなるヘテロダイマーである。ヘテロダイマーは共有結合しておらず、ホルモンを酸または尿素で処理することによって、それらのサブユニットを解離させることができる（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１）。大部分のより高等な脊椎動物は、α−サブユニットをコードする遺伝子を一つだけ含んでおり（Ｆｉｄｄｅｓら、１９８４）；同じα−サブユニットが、通常、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、および、存在するならＣＧ、のβ−サブユニットと結合する。にもかかわらず、翻訳後のタンパク質のプロセシング、とりわけ、グリコシル化（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、１９８８）が、ＬＨ、ＦＳＨ，ＴＳＨおよびＣＧのα−サブユニットの組成の違いの一因となりうる。ホルモン間のアミノ酸配列の差異の大部分は、ホルモン−特異的β−サブユニットによる（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１）。これらは別々の遺伝子から生成される（Ｆｉｄｄｅｓら、１９８４；Ｂｏら、１９９２）。
【０００４】
ほとんど例外なく（Ｂｌｉｔｈｅら、１９９１）、α−β−ヘテロダイマーは、いずれかの遊離のサブユニットより非常に高いホルモン活性を持つ（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１）。天然発生のα−およびβ−サブユニットは、α，α−ホモダイマーまたはβ、β−ホモダイマーを形成するより、α、β−ヘテロダイマーを形成しやすい。事実、哺乳動物細胞内でｈＣＧのα−サブユニットおよびβ−サブユニット遺伝子が一緒に発現すると、α，β−ヘテロダイマー、α−サブユニットモノマー、およびβ−サブユニットモノマーが形成される。もしあるにしても、ごく微量のα，α−ホモダイマーまたはβ，β−ホモダイマーが作成されるか、または、細胞から分泌される。
【０００５】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の高分解能Ｘ線結晶構造解析は、２つの研究室によって報告されている（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４；Ｗｕら、１９９４）。これらの構造から、生来のジスルフィド結合パターン（Ｍｉｓｅら、１９８０および１９８１）は不適切であり、ホルモンはタンパク質のシステインノット（cysteine knot）ファミリーの一員である（Ｓｕｎら、１９９５）ことが、わかった。全ての糖タンパク質ホルモン内のシステインの相対位置は類似しているので、それらは、ｈＣＧで認められるシステインノット)構造を持つらしい。
【０００６】
脊椎動物の糖タパク質ホルモンのα−サブユニット内のシステイン残基の位置は、類似している（図１Ａおよび１Ｂ）。ｈＣＧのα−サブユニットをモデルとして用いると、システインノットは、α−サブユニットの２、３、５、７、８および９番目のシステインによって形成されるらしい。これは３つの大きなα−サブユニットループを作り出す（図１Ａおよび１Ｂ）。ループ１は、２番目と３番目のシステインの間のアミノ酸配列であり；ループ２は、α−サブユニットの５番目と７番目のシステインの間のアミノ酸配列であり；そして、ループ３は、７番目と８番目のシステインの間のアミノ酸配列である。脊椎動物の糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニット内のシステイン残基の位置も、類似している（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１）。モデルとしてｈＣＧ β−サブユニットを用いると システインノットは、１、４、５、６、８および９番目のシステインによって形成されることがわかる。これは３つの大きなβ−サブユニットループを作り出す（図２Ａおよび２Ｂ）。ループ１は、１番目と４番目のシステインの間のアミノ酸配列であり；ループ２は５番目と６番目のシステインの間の配列であり；そして、ループ３は、６番目と８番目のシステインの間の配列である。α−サブユニットの部分をその他のα−サブユニットの相同部分と置き換える、または、β−サブユニットの部分をその他のβ−サブユニットの相同部分と置き換えると、個々の糖タンパク質ホルモンのサブユニットの機能性キメラを調製することができる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１；Ｍｏｙｌｅら、１９９０；Ｍｏｙｌｅら、１９９４；Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９５；Ｍｏｙｌｅら、１９９５；Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９７）。糖タンパク質ホルモンサブユニット内の構造エレメントの一般図を図１Ｃに示しており、アミノ酸残基によるヒトの糖タンパク質ホルモンサブユニットとの関連性を、以下の表１Ａに示している。
【０００７】
【表１】

【０００８】
そのシステインノットに加え、β−サブユニットは、また、第二のα−サブユニットループの周りに取り巻く、シートベルトと呼ばれる配列を含む（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４）。シートベルトは、サブユニットシステインノット内の最後の残基である９番目のシステインに始まり、１０、１１および１２番目のシステインを含む。それは、１２番目のシステイン（即ち、シートベルトのカルボキシ末端）と３番目のシステイン（即ち、第一のβ−サブユニットループ）の間に形成されたジスルフィド結合により、第一のβ−サブユニットループに掛けられる。
【０００９】
シートベルトは、ＬＨレセプターとＦＳＨレセプターを識別するｈＣＧの能力に（主要ではないにしろ）有意の影響を持つ、ｈＣＧのβ−サブユニットの一部分である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１；Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。ｈＦＳＨに認められるシートベルト配列を持つｈＣＧシートベルトアミノ酸配列の全体または部分を置き換えると、その結果得られたホルモン類似体のレセプター結合特異性が変化した。通常、ｈＣＧは、ＦＳＨレセプターまたはＴＳＨレセプターより、１００倍以上、ＬＨレセプターと結合しやすい。しかしながら、ｈＣＧシートベルト残基１０１ー１０９（即ち、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）がそれらのｈＦＳＨでの同等物（即ち、Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）と置換されたＣＦ９４−１１７およびＣＦ１０１−１０９の様なｈＣＧ類似体は、ｈＣＧより、ＦＳＨレセプターに結合しやすかった（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。さらに、シートベルト組成を細工することによって、様々な程度のＬＨ活性およびＦＳＨ活性を持つｈＣＧの類似体を調製することが可能である（Ｍｏｙｌｅら、１９９４；Ｈａｎら、１９９６）。これらは、雄および雌の繁殖性を強める可能性のある重要な治療用途を持つ。
【００１０】
糖タンパク質ホルモンのサブユニット内部のジスルフィド結合は、全部ではないにしろその大部分が、生物学的活性に重要である。個々のシステインをその他のアミノ酸、特にアラニン、で置き換えた研究から、システインノットおよびシートベルトの全てのジスルフィド結合は、ヘテロダイマーのフォールディングに重要であることがわかった（Ｓｕｇａｎｕｍａら、１９８９；Ｂｅｄｏｗｓら、１９９３；Ｆｕｒｈａｓｈｉら、１９９４）。ヒトα−サブユニットのシステイン７−３１と５９−８７の間、およびｈＣＧ β−サブユニットのシステイン２３−７２の間の残ったジスルフィド結合は、ヘテロダイマーの形成にも、また、ホルモン活性にも、重要ではない。
【００１１】
今までのところ、糖タンパク質ホルモンとそのレセプターの相互作用を描いた高解析能結晶構造はまだない。ホルモンレセプター複合体の構造を説明するために、いくつかのモデルを構築する努力がなされた。これらの大多数は、ｈＣＧおよびリボヌクレアーゼインヒビター、糖タンパク質ホルモンレセプターの細胞外ドメインの構造と類似するであろうタンパク質の結晶構造を基にしている。レセプターと接触するホルモン残基を同定するための試みのほとんどは、レセプター結合を減少に導く化学的、酵素的、または遺伝子的変異の影響に基づいている。残念なことに、結合の減少は特異的接触の阻害またはホルモン立体構造の変化により起こる可能性があったため（Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９７７）、これらの変化による影響は、解釈が不可能ではないにしろ、難しい。このことは、この分野での考慮すべき不一致を導き（Ｒｅｍｙら、１９９６；Ｂｅｒｇｅｒら、１９９６）、何人かの研究者はレセプター複合体中のホルモンの方向を決定することは不可能であると、結論づけている（Ｂｌｏｗｍｉｃｋら、１９９６）。
【００１２】
レセプター複合体内のホルモンの方向を決定するためのその他の研究方法は、レセプターと接触していないホルモン領域を同定することである。これらは、ホルモンがレセプターと結合した後も露出状態で残っており、そして／または、ホルモン−レセプター相互作用を破壊することなく変化させることができる。これらのｈＣＧの結晶構造上での位置を決定する（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４；Ｗｕら、１９９４）と、ｈＣＧがＬＨレセプターと相互作用するであろう方法の仮説モデルを立てることができる（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。この研究は、第二のα−サブユニットループおよび第一および第三のβ−サブユニットループによって形成されたホルモンの溝(groove)が、主にレセプターの接触に必要とされることを、示唆した（Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９５）。また、このことは、何故、両方のサブユニットが最も強いホルモン−レセプターの結合に必要であるかを説明するであろう（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１）。この結論を支持するデータは、次の数節で議論されている。しかしながら、この分野のその他の研究者の全てではないにしろその大部分が、ここに記載されたモデルに気付いている（即ち、彼らは主要なレセプター結合部位がホルモンの溝によって形成されているというモデルについて記載された文献を引用している）にもかかわらず、ホルモンの方向付けが非常に異なるというモデルを支持していることは、注目すべきである。
【００１３】
レセプターと接しているとは考えられないｈＣＧ α−サブユニットの多くの部分は、ＬＨレセプターとの結合を崩壊させることなく置き換えることができる。ｈＣＧがＬＨレセプターと結合していても、モノクローナル抗体によっても認識されるので、これらの領域のいくつかはホルモン−レセプター複合体内で露出していることが明らかである（Ｍｏｙｌｅら、１９９０：Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９５；Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。例えば、ヒトおよびウシのα−サブユニットは、非常に異なったアミノ酸配列を持つが、ウシのα−サブユニットとｈＣＧのβ−サブユニットを含むヘテロダイマーは、ラットおよびヒトのＬＨレセプターと良く結合する（Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９７）。これらのヘテロダイマーは、ｈＣＧのα−サブユニットのループ１および３上のエピトープを認識する大部分のモノクローナル抗体によって容易に識別される（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。これらの所見は、ヒトおよびウシのα−サブユニットループ１と３が異なることを示し、ホルモンのこの領域は、キーとなる必須のレセプターとの接触を形成しないことを示唆している。
【００１４】
α−サブユニットの一部分がヒトまたはウシのタンパク質のいずれかから誘導されたｈＣＧ類似体を認識するモノクローナル抗体の能力を比較することによって、抗体の結合に加わるキーとなるα−サブユニットの残基を同定することができた（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。また、ｈＣＧのα−サブユニット上のエピトープを認識するいくつかのモノクローナル抗体は、トリプシン消化によって調製されたα−サブユニットのフラグメントおよび第二のα−サブユニットループの大部分が欠損したα−サブユニットのフラグメントと結合した（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４；Ｗｕら、１９９４；Ｂｉｒｋｅｎら、１９８６）。また、この所見を用いて、これらの抗体の結合部位を決定および／または確認した（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。α−サブユニットのエピトープを認識し、Ａ１０５およびＡ４０７と呼ばれる、２つのモノクローナル抗体（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）は、ホルモンがＬＨレセプターと複合した場合、ｈＣＧと結合した。このように、これらの抗体によって認識されるα−サブユニット残基は、ＬＨレセプターとは接触しないらしい（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。α−サブユニットの残りの部分には、第二のα−サブユニットループおよびタンパク質のＣ−末端が含まれる。α−サブユニットのこのように保存性の高い部分の内の残基のいくつかは、レセプターとの接触にかかわるであろう。
【００１５】
また、ＬＨレセプターと接触しているとは考えられないｈＣＧ β−サブユニットの多くの部分は、ＬＨレセプター結合を崩壊させることなく突然変異誘発によって置き換えることができる。これには、ｈＣＧ β−サブユニットのループ２が含まれる。ｈＣＧ β−サブユニットのループ２の残基をｈＦＳＨ β−サブユニットのループ２に通常認められるそれらと置き換えたｈＣＧ類似体は、ＣＦ３９−５８と命名され（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１）、ＦＳＨを認識するが、β−サブユニットのループ２内のｈＣＧ残基は認識しないモノクローナル抗体によって、容易に認識された。このことから、第二のサブユニットループの構造がこの類似体内とｈＣＧ内では異なっていることが、示された。それにも関わらず、このβ−サブユニット類似体はα−サブユニットと結合して、ｈＣＧと良く似たＬＨレセプターと相互作用するα，β−サブユニットを形成する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１）。このように、もしあるにせよ、ｈＣＧの第二のβ−サブユニットループ内の残基はほとんど、重要な直接的ＬＨレセプター接触を作らないと考えられる。同様に、ｈＦＳＨの第二のβ−サブユニットループも、ＦＳＨレセプターと接触しているとは考えられない。β−サブユニットの１０番目のシステインとＣ−末端の間、または残基９４−１１４の間の残基を該当するｈＦＳＨの残基と置き換えた、ｈＣＧ β−サブユニットの類似体について、報告されている。これらの類似体は、ＣＦ９４−１１７（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１）、およびＣＦＣ９４−１１４（Ｗａｎｇら、１９９４）と名付けられた。それらは第二のβ−サブユニットループ内のｈＣＧの全体配列を含んでいるにも関わらず、両方とも、ＬＨレセプターよりもずっと良くＦＳＨレセプターと結合する。ｈＣＧの第二のβ−サブユニットループは、ＬＨまたはＦＳＨレセプターのいずれかと結合するホルモンの能力に最小限の影響しか持たないらしいと考えられるので、それがＬＨまたはＦＳＨのレセプターとの重要な高アフィニティー接触に預かることは、ありそうにないと考えられる。さらに、ｈＣＧの第二のβ−サブユニットループは、第一および第三のα−サブユニットループ、レセプターに接触するとは考えられないα−サブユニットの部分の近くに位置する。このように、第一および第三のα−サブユニットループおよび第二のβ−サブユニットループ内の残基を含む、ｈＣＧの領域全体がレセプターとは接触できないように思える。後に議論されるであろうが、ホルモンのこの部分は、レセプターの細胞外ドメインの馬蹄型によって作り出される空洞内に突き出していると考えられる（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。
【００１６】
また、高親和性のレセプター接触にかかわらないｈＣＧのβ−サブユニットの残基は、ホルモンがＬＨレセプターと結合した後も、モノクローナル抗体で認識することができる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１；Ｍｏｙｌｅら、１９９０；Ｍｏｙｌｅら、１９９４；Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９５）。これらには、Ｂ１０５、Ｂ１０８、Ｂ１１１およびＢ１１２のような抗体によって認められるα−サブユニットインターフェイスから最も遠く離れたループ１および３内に認められるｈＣＧのβ−サブユニットの部分が含まれる。このような抗体は、ｈＣＧがＬＨレセプターと複合する場合も、ｈＣＧと結合し（Ｍｏｙｌｅら、１９９０；Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９５）、このことは、β−サブユニットのループ１および３のこれらの部分がレセプター接触に必須ではないことを示している。その他の研究から、ホルモンがＬＨレセプタオーと結合する能力を排除することなく、ｈＣＧ β−サブユニットのＮ−末端と１番目のシステインの間、および１２番目のシステインとＣ−末端の間の残基を除去することが可能であることが、示された（Ｈｕａｎｇら、１９９３）。β−サブユニットの残余部分には、シートベルトが含まれる。これらの残基はほとんど、ＬＨまたはＦＳＨレセプターとの高親和性結合に必要な接触に必須であるとは考えられない。例えば、１１番目と１２番目のシステイン間のシートベルト内の残基を変化させても、ＬＨレセプターとの結合への影響は、もしあったとしても最小である（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。１０番目と１１番目のシステインの間の残基の変化がＦＳＨレセプター結合に影響を与えることは５倍より少ない（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。さらに、ウマのＬＨ（ｅＥＬＨ）およびウマのＣＧ（ｅＣＧ）のシートベルト内の残基の大部分はＦＳＨとは異なる（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９１）が、それにもかかわらず、これらのホルモンは、ラットのＦＳＨレセプターと良く結合する。事実、精製されたｅＬＨは、インビトロでは、ｈＦＳＨと同様にラットのＦＳＨレセプターと、少なくとも３０％結合する（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。まだ評価されずに残っているｈＣＧ β−サブユニットの部分には、α−サブユニットインターフェイスに最も近いループ１および３の表面が含まれる。従って、これらはレセプターと接触するホルモンの部分であると考えられる。また、α−サブユニットの部分は、ｈＣＧがＬＨレセプターと結合している場合も、モノクローナル抗体によって認識される。これらには、抗体Ａ１０５およびＡ４０７によって認識される残基が含まれる（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。
【００１７】
レセプターと相互作用する糖タンパク質ホルモンの領域を同定するためのその他の戦略には、一つ以上のレセプターを認識するホルモン類似体を用いることが含まれる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１；Ｍｏｙｌｅら、１９９４；Ｈａｎら、１９９６；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７）。ｈＣＧのβ−サブユニットシートベルトをｈＦＳＨ内に認められるそれと変えることによって、簡単に、ＦＳＨおよびＴＳＨレセプターと結合するｈＣＧ類似体を調製することができる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７）。この類似体は、ＴＳＨに特異的な残基を含まないが、ＴＳＨと同じ最大レベルにＴＳＨ応答を刺激する能力を持つ。いくつかのこれらの多機能性類似体の活性を比較することによって、シートベルト残基の大部分および第二のβ−サブユニットループのほぼ全体が、キーとなる必須の高親和性レセプター接触を形成するとは考えられないと、結論づけることができる。
【００１８】
ＬＨ，ＦＳＨまたはＴＳＨレセプターの結晶構造は報告されていない。しかしながら、いくつかの糖タンパク質ホルモンレセプターのアミノ酸配列は既知である（Ｍｏｙｌｅら、１９９４；ＭｃＦａｒｌａｎｄら、１９８９；Ｌｏｏｓｅｆｅｌｔら、１９８９；Ｓｅｇａｌｏｆｆら、１９９０；Ｓｐｒｅｎｇｅｌら、１９９０；Ｂｒａｕｎら、１９９１；Ｎａｇａｙａｍａら、１９９１；Ｎａｇａｙａｍａら、１９８９；Ｊｉａら、１９９１）。これらのタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを持つと考えられる。膜貫通または細胞内ドメインなしで（Ｂｒａｕｎら、１９９１；Ｊｉら、１９９１；Ｘｉｅら、１９９０；Ｍｏｙｌｅら、１９９１）、または他の膜貫通ドメインと連結して（Ｍｏｙｌｅら、１９９１）発現させると、細胞外ドメインが、そのリガンドに対するレセプター親和性の大部分を構築することが分かる。これらのタンパク質の細胞外ドメインは、ロイシンを多く含む繰り返しファミリーに属するタンパク質のメンバーであり、膜貫通ドメインは、原形質膜に及ぶ７つの疎水性へリックスを持つと考えられる（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、１９８９）。リボヌクレアーゼインヒビターの結晶構造が、ロイシンを多く含む繰り返しタンパク質の一つのモデル構造として決定され、馬蹄型を持つことが分かった（Ｋｏｂｅら、１９９３および１９９５）。この知見から、ＬＨ、ＦＳＨ、およびＴＳＨのレセプターの細胞外ドメインは、馬蹄型であることが示唆された（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。ｈＣＧおよびｈＦＳＨの結合特異性を調節するＬＨおよびＦＳＨレセプターの細胞外ドメインの一部が、ＬＨ／ＦＳＨレセプターキメラを用いることによって同定された（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。ＬＨレセプターおよびリガンド結合特異性に応答するＬＨレセプターの部分と最も良く接触すると考えられるｈＣＧの部分を考慮することによって、ＬＨレセプターと相互作用しシグナル導入を引き出すこのホルモンの能力を説明するモデルを開発した（Ｍｏｙｌｅら、１９９５）。このモデルでは、第二のα−サブユニットループと第一および第三のβ−サブユニットループの間の溝は、馬蹄型の中央に近いレセプター細胞外ドメインの縁と接触している（Ｍｏｙｏｌｅら、１９９５）。ホルモンの残りの部分は、アームと馬蹄型の間の空間に投げ出されている。ホルモンがレセプターと結合し、この空間内に投げ出されると、シグナル導入に必要な細胞外ドメインの立体構造が安定化される。これは、細胞表面上での適正なレセプター発現に必要な、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間の特異的接触によって、膜貫通ドメインに導かれる（Ｍｏｙｌｅら、１９９１）。このモデルは、シグナル導入に影響を与えるオリゴ糖の能力についても説明している（Ｍｏｙｌｅら、１９７５；Ｍａｔｚｕｋら、１９８９）。モデルはこれらのデータを説明することができるが、一方で、ｈＣＧの異なる部分がレセプターと相互作用する別のモデルも提案されている（Ｊｉａｎｇら、１９９５）。従って、糖タンパク質ホルモンがどのようにそれらのレセプターと相互作用するかは、未だ明らかではない。
【００１９】
また、ホルモンレセプター相互作用に関してのこの見解は、キーとなるレセプター接触には関係しないと考えられてきたｈＣＧ領域を認識するいくつかのモノクローナル抗体によってｈＣＧ結合が阻害されることを説明している。早くから議論されてきたように、これらには、α−サブユニットのループ１および３、ならびにβ−サブユニットのループ２によって形成されたホルモンの表面が含まれる。モデルでは、これらの領域は、レセプター細胞外ドメインのＮ−末端とＣ−末端の間の空間に突き出している。これらの部位へ抗体が結合すると、ホルモンのこの空間への侵入を防御する。
【００２０】
大部分の脊椎動物種の糖タンパク質ホルモン内でのシステインの位置の類似性（Ｐｉｅｒｃｅら、１９９１）から、それらもｈＣＧのようにフォールディングされているのではないかと考えられる。また、糖タンパク質ホルモンのレセプター構造は、それらの細胞外ドメインのロイシンを多く含む繰り返し、およびそれらの膜貫通ドメイン内の多数の保存残基の類似性より、極めて似通っていると考えられる（Ｍｏｙｌｅら、１９９４；Ｂｒａｕｎら、１９９１；Ｎａｇａｙａｍａら、１９９１）。従って、ＬＨレセプターとのｈＣＧの相互作用をうまく説明できる任意のモデルは、また、その他の糖タンパク質ホルモンがそれらのレセプターと結合する能力をも、予想するであろうと考えられる。シートベルトがリガンド−レセプター相互作用の特異性に影響を与えうる一つの方法は、ホルモンサブユニットの相対位置を変化させることであろう（Ｃｏｓｏｗｓｋｙら、１９９７）。これにより、第二α−サブユニットループと第一および第三のβ−サブユニットループとの間のグローブの形が変わるであろう。ホルモンおよびレセプター内の阻害因子が不適切なリガンド−レセプター相互作用を防御する原因であるという提案がなされた（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。それ故、シートベルトの効果は、ホルモンの形を変え、馬蹄型の中央部分内にフィットするそれの能力を減少させることであろう。
【００２１】
糖タンパク質ホルモンは、いくつかの医療用途を持つ。ＦＳＨは、雌の排卵誘導の準備として卵胞の発達を誘導するために用いられる（ｇａｌｗａｙら、１９９０；Ｓｈｏｈａｍら、１９９１；Ｇａｓｔら、１９９５；Ｏｌｉｖｅら、１９９５）。また、ＬＨおよびｈＣＧは、発達を開始した卵胞の排卵を誘導するために用いられる。ＦＳＨ、ＬＨおよびｈＣＧは、雄の精巣機能を誘導するために用いられる。実在するホルモンを用いて、雄および雌の生殖腺、および甲状腺の機能を刺激することができるが、この用途へホルモンを実際に適用するには、それらホルモンがヘテロダイマーである必要がある。これらは、下垂体（即ち、ＬＨおよびＦＳＨ）、血清（ウマの絨毛性ゴナドトロピン）、または妊娠女性の尿（ｈＣＧ）あるいは閉経後の女性の尿（ｈＬＨおよびｈＦＳＨの混合物）から単離することができる。また、活性なヘテロダイマーは、癌（Ｃｏｌｅら、１９８１）またはα−およびβ−サブユニットをコードするｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡでトランスフェクトされたそれら（Ｒｅｄｄｙら、１９８５）のいくつかを含む、α−およびβ−サブユニットの両方を発現する細胞培養基から単離できる。事実、後者は、治療上有効な糖タンパク質の重要な源である。糖タンパク質ホルモンのうちオリゴ糖がシグナル導入を引き出すそれらの能力に影響を与えることが分かった（Ｍｏｙｌｅら、１９７５；Ｍａｔｚｕｋら、１９８９）ため、活性なヘテロダイマーの調製および合成は、真核生物細胞内で行うのが最良であろう。これらの細胞は、オリゴ糖に高マンノースオリゴ糖を加え、そしてある場合には、それらをプロセシングして天然のホルモンに認められるオリゴ糖複合体を与える能力を持つ（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、１９８８）。しかし、真核生物細胞は、糖タンパク質を様々にプロセスする事ができるので、糖タンパク質ホルモンの合成は、時には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）から誘導したような哺乳動物細胞系内で行われる。ホルモンを非哺乳動物の真核生物細胞内で作ることもできるが、オリゴ糖鎖の潜在的抗原性は、それらの医療への利用を制限する。
【００２２】
また、ヘテロダイマーホルモンは、受胎能を制限するために用いることのできる抗血清を作り出す免疫原としても用いることができる（Ｓｉｎｇｈら、１９８９；Ｐａｌら、１９９０；Ｔａｌｗａｒら、１９８６；Ｔａｌｗａｒら、１９９２；Ｍｏｕｄｇａｌら、１９７１および１９７２；Ｍｏｕｄｇａｌ、１９７６：Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９０；Ｍｏｕｄｇａｌら、１９７８）。ヒトの妊娠を維持することへのｈＣＧの重要な役割により、ｈＣＧに対する免疫応答の発達は、避妊の手段として有用であり、ｈＣＧを基本にした避妊薬ワクチンを考案する実質的努力がなされた。しかしながら、原理的には、ホルモンに対する抗体を用いて、受胎能を促進することもまた可能であった。例えば、ＬＨレベルは、多嚢胞性卵巣疾病の女性では過剰であると考えられる。従って、循環性ＬＨ活性を減少させるが排除しないであろう方法の開発が、受胎能の回復に有益であろう。
【００２３】
糖タンパク質ホルモンの代謝については、ほどんど分かっていない。ホルモンの半減期は、それらのオリゴ糖の含有量（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、１９８８）、特にそれらの末端の糖残基に影響されることが知られている。最も安定なホルモンは、この位置に最も高いシアル酸含有量を持つそれらである（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９１；Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、１９９２；Ｆｉｅｔｅら、１９９１；Ｓｍｉｔｈら、１９９３；Ｒｏｓａら、１９８４）。しかしながら、遊離したホルモンサブユニットは、それらがヘテロダイマーと同一のオリゴ糖を持っていたとしても、明らかにより短い循環半減期を持つことが知られているため、オリゴ糖が、完全に、ホルモンの安定性の原因となるわけではない（Ｗｅｈｍａｎｎら、１９８４；Ｋａｒｄａｎａら、１９９１）。事実、ホルモンは、サブユニットを解離に導くタンパク質分解によって不活性化されうるという提案がなされた（Ｋａｒｄａｎａら、１９９１；Ｂｉｒｋｅｎら、１９９１；Ｃｏｌｅら、１９９１：Ｃｏｌｅら、１９９３）。ニックを持つｈＣＧは、ｈＣＧより非常に速くその不活性サブユニットに解離した（Ｃｏｌｅら、１９９３）。従って、サブユニット解離を防ぐかまたは減少させることのできる方法が、ホルモン効力を強化するであろうと期待される。
【００２４】
糖タンパク質ホルモンサブユニットは、熱処理、極端なｐＨ、および尿素を含む変性条件化で、急速に解離する（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１；Ｃｏｌｅら、１９９３）。この理由により、大部分の糖タンパク質ホルモン調製物は、凍結乾燥粉末として保存される。ヘテロダイマーの安定性を強化する方法は、ホルモン調製物を保存し、水溶液に分散させることを可能にする。このことは、ホルモン希釈物を別々に輸送し、末端ユーザーがさらなるホルモン再構築段階を行う、必要性を除去するであろう。
【００２５】
それらのサブユニットを架橋することによってホルモンを安定化させるために、様々な試みがなされてきた。化学的架橋方法が用いられてきた（Ｗｅａｒｅら、１９７９および１９７９）；が、このような方法は、活性を減少に導く。また、β−およびα−サブユニットを一緒に遺伝子融合して一本鎖のホルモンを作り出すことも可能である。このような分子は、ヘテロダイマーより安定であり、高い生物学的活性を持つ（Ｓｕｇａｈａｒａら、１９９５）；が、天然型分子からは大きく異なる。
【００２６】
タンパク質を架橋するその他の方法は、ジスルフィド結合によってそれらを束縛することであろう。この戦略は、システインノットスーパーファミリーのその他のタンパク質を、自然に安定化させ（Ｓｕｎら、１９９５）、たぶんシートベルトを起こさせるであろう。さらに、タンパク質へのジスルフィド結合の追加は、タンパク質内での内部のひずみを増加させない限り、それらの安定性を強化することができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、１９８７；Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、１９８９）。ジスルフィド結合により糖タンパク質ヘテロダイマーを安定化させる効果は、カナダ特許ＣＡ２１８８５０８に報告されている。また、そのようなサブユニット内ジスルフィド結合を示唆するＨａｎら（１９９６）のコメントがあるが、この参考文献は、そのようなジスルフィド結合の導入は、ホルモンの活性を減少させるであろうと報告している。このようなヘテロダイマーは、様々なジスルフィド結合を持つ複合タンパク質であるため、この報告は、もっともらしい。これらへのシステインの付加は、フォールディングを崩壊させ、無機能性タンパク質を生ずる結果となる可能性を持つ。さらに、その他のシステインノットタンパク質のサブユニット構成は、糖タンパク質ホルモンのそれとは、実質的に異なるため、糖タンパク質ホルモンを安定化するであろうジスルフィド結合の位置予想に基づいて、その他のシステインノットタンパク質に用いることができるとは考えられない（Ｓｕｎら、１９９５）。
【００２７】
本明細書中のいかなる文書の引用も、そのような文書の従来技術、または本出願のどの請求の範囲の特許要件への考慮すべき要素との関連性の承認を意図したものではない。いかなる文献の内容またはデータによるいかなる供述も、出願時に出願人に入手できた情報に基づいており、そのような供述の正確性についての承認をなすものではない。
【００２８】
発明の要約
従って、本発明の目的は、上で論議したようなこの技術分野での欠陥を打ち消すことにある。本発明の糖タンパク質ホルモン類似体は、相当する糖タンパク質の生物活性を少なくとも一部分保持しつつも、改善された安定性を提供している。好ましくは、本発明の類似体は、該当するホルモンのその天然のレセプターに対するアフィニティーを少なくとも２５％、保持している。本発明のこのような類似体は、適正に設計された位置に据えられたサブユニット内ジスルフィド結合が、α−またはβ−サブユニットの片方または両方の残基を修飾することによって作り出され、ホルモン構造上へのサブユニット内架橋による影響の可能性を最小にするので、従来技術の糖タンパク質ホルモン類似体以上の改善を提供する。
【００２９】
そのように改良された糖タンパク質ホルモン類似体は、好ましくは、サブユニット内架橋を天然のジスルフィド結合に含まれる存在する（天然の）システインの２つの残基内に据えなければならず、相当する天然のサブユニットの一番外側のシステインの外側に据えてはならないと言ったような原則に、適合していることが、本発明者によって発見された。サブユニット内ジスルフィドを持つ従来技術の糖タンパク質ホルモン類似体はいずれも、この原則に適合していない。
【００３０】
本発明のもう一つの態様は、α−サブユニットのシステインノットとβ−サブユニットのシステインノットの間にサブユニット内ジスルフィド架橋結合を持つ糖タンパク質ホルモン類似体を準備することである。このことは、糖タンパク質ホルモンの混乱を最小にし、そうすることによって、安定性が改善される一方で、相当する天然ホルモンが保持するゴナドトロピンレセプターを刺激する活性を実質上保持する事が可能になる。また、この特徴は、従来技術には開示または示唆されていない。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、α−サブユニットのループ３内に位置するシステイン残基とβ−サブユニットのループ２内に位置するシステインとの間、またはα−サブユニットのループ１とβ−サブユニットのループ２の間の、サブユニット内ジスルフィド架橋結合を持つ糖タンパク質ホルモン類似体を供給することである。また、このことは、糖タンパク質ホルモンの混乱を制限し、安定性が改善される一方で相当する天然ホルモンが保持するゴナドトロピンレセプターを刺激する活性の一部分を残すことを可能にする。また、この特徴も従来技術には開示または示唆されていない。
【００３２】
医薬組成物として調製する場合、本発明の類似体は、不妊を治療するために、または受胎能を制限する必要性のある患者の受胎能を制限するために、用いることができる。本発明の類似体のヘテロダイマーは、液体の医薬調合物として輸送および貯蔵しても安定である。
【００３３】
さらに、本発明は、糖タンパク質ホルモン類似体のα−およびβ−サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターを発現することのできる、組換えＤＮＡ分子を提供する。また、そのような組換えＤＮＡ分子を形質転換した真核生物宿主細胞は、本発明の類似体を調製する方法に提供され、用いられる。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明による糖タンパク質ホルモンの類似体は、ＣＡ２１８８５０８およびＨａｎら（１９９６）に記載された一般の教示以上の改良を示す。サブユニット内ジスルフィド結合は、糖タンパク質ホルモンヘテロダイマーのα−サブユニットおよびβ−サブユニットを安定化する。改良された類似体は、ホルモンの三次元構造の混乱を具体的に減少させるように設計され、それによって、ダイマーがインビボで形成され、形成されたダイマーが天然のレセプターと親和性を持ち、そして、それへのアゴニスト活性を持つ可能性がより大きくなるであろう。
【００３５】
本明細書中に用いられている用語「類似体」または「類似体類」は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）、およびその機能性ムテインから選択された糖タンパク質ホルモンであって、それらのα−およびβ−サブユニットのアミノ酸配列を修飾して、個々のサブユニット内に遊離のシステインを作り、サブユニット内ジスルフィド結合を形成し、それによって、ヘテロダイマーを安定化した、前記の糖タンパク質ホルモンを意味するつもりである。
【００３６】
また、本明細書中に用いられている、用語「変異タンパク質（mutein）」または「変異タンパク質類（muteins）」は、糖タンパク質ホルモンｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＴＳＨであって、修飾されてはいるがサブユニット内ジスルフィド結合を作り出すようには修飾されてはいず、そして、これらムテインが機能的であるとはっきり描かれていようが無かろうが、実質上（少なくとも８０％）、それらの機能的生物学的活性、例えば、レセプター親和性およびホルモン効能、抗体認識、を残している、または、キメラ糖タンパク質ホルモンで起こるであろう、異なる糖タンパク質ホルモンに関するそれらの親和性または特異性を増加する。
【００３７】
糖タンパク質ホルモンのムテインを生成するために、タンパク質を任意のこの技術分野で認知されている手段によって修飾することができる。便宜上、修飾は、「変異タンパク質」と呼ばれるであろう修飾されたタンパク質をコードする修飾遺伝子の適当な宿主細胞内で発現によって到達できる修飾と、「誘導体」と呼ばれるであろうそうではない修飾に分けられる。
【００３８】
通常、誘導体は、最初にリード分子を合成して次いでそれが誘導体化されるが、また、誘導体を直接調製することもできる。しかしながら、用語「誘導体」では、リード分子の修飾によって誘導体を得ることが技術的に実行可能であることは、たとえそれが生成の好ましい方法でないとしても、疑いえない
タンパク質の修飾を、以下のように分類することができる；
有望−−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を強化する。
中立−−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を強化も減少もさせない。
非有望−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を減少させるが、必ずしも除外しない。
不活性化−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を除外する。
寛容−−−これらの修飾は、有望、中立または非有望であるが、不活性化はしない。
【００３９】
タンパク質は１つ以上の用途を持つことができるため、修飾は、一つの用途には有望であるが、第二の用途には非有望であり、第三の用途には中立であり、そして第四の用途には不活性である可能性もある。
【００４０】
一般には、タンパク質の適合性への修飾の影響は、タンパク質のアミノ酸組成、分子量、または物理的性質のみに依存する影響よりむしろ、タンパク質の具体的構造に多かれ少なかれ特異的である用途について議論されるであろう。
【００４１】
タンパク質は、一つ以上の以下の目的を含む、様々な理由で、修飾されるであろう；
・放射能標識、酵素標識、および蛍光標識した誘導体の例のように、分子をより検出しやすくする；
・熱、光、酸化剤、還元剤および酵素のような、特定の物理的、化学的、生物学的作因に関して、分子をより安定にする；
・例えば、その投与を容易にするために、分子を興味ある溶媒により溶けやすくする、または、例えば、その沈殿を容易にするために、またはその他の分子の捕獲へのその利用を可能にするために、溶けにくくする；
・例えば、アミノ酸側鎖上に保護基を置いて、分子が関与することのできる反応の形態を制限する、または、逆に、例えば、実質的なカップリング反応を促進するために分子上に反応基を置いて、可能な反応を拡大する；
・分子の免疫原を少なく（または多く）する；
・患者に投与した場合、分子が特定の器官または組織に残留する時間を増加（あるいは減少）させる、または特定の器官または組織内へのその到着を早める（または遅らせる）；
・一つ以上のその生物学的または免疫学的活性を強化（あるいは減少）する、例えば、レセプターへのその親和性を増加あるいは減少させる、またはその特異性を変える；または
・前の活性を補う新しい活性を授ける（例えば、抗癌抗体に毒素をくっつける）；または
・分子の望ましくない副作用を阻害する。
【００４２】
タンパク質の大多数の残基は、ある程度、変異に寛容であることができる。変異は、一つまたは複数の置換、挿入または欠失の形を取ることができる、好ましくは、分子の末端に、または表面のループあるいはドメイン間の境界に、挿入または欠失を、指示する。
【００４３】
末端への挿入に関しては、好ましい最大の言葉はないが、より適切には、「付加」または「融合」と呼ばれる。一つのタンパク質をその他のタンパク質に融合して発現を容易にすること、または、その構成成分が持つ生物学的活性を合わせ持つ融合タンパク質を提供することは、日常的である。たとえ、融合タンパク質それ自身が活性を欠落していても、融合タンパク質は前駆体として有用であり、切断されて活性タンパク質を遊離することができる。
【００４４】
末端の欠失に関しては、より適切には「先端切除（truncation）」と呼ばれ、修飾の目的は重要である。その免疫学的特性にのみ興味がある場合、タンパク質を広範囲にわたって切除することは、日常的に行われている。タンパク質から５アミノ酸ほどの小ささのエピトープを取り出し、それを用いてそれ自身によるＴ細胞応答を引き出す、または、それ自身のコピーあるいは免疫原性キャリヤーに結合させてＢ細胞応答を引き出す、こともできる。保持されねばならない生物活性がある場合、先端切除上の制限は、より厳格になるであろう。
【００４５】
好ましくは、置換ならびに任意の内部欠損および挿入を考慮すると、変異は、元来のタンパク質とその配列で、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、同一である。
【００４６】
タンパク質は、以下の変異をより寛容に受け入れるであろう；
（ａ） 挿入または欠損よりむしろ置換であり、；
（ｂ） 内部より末端、または、内部であればループあるいはドメイン間リンカーの、挿入または欠損であり、；
（ｃ） 内部残基よりむしろ表面残基に影響を与え；
（ｄ） 結合部位から遠い分子の部分に影響を与え；
（ｅ） 一つのアミノ酸を、大きさ、チャージ、および／または疎水性の類似したもう一つのアミノ酸に置換し；そして
（ｆ） 興味あるタンパク質が属する同族タンパク質のファミリー中で実質上変化に晒されている部位にある。機能性変異体を設計するために、このような要件を用いることができる。
【００４７】
好ましくはフレームワーク残基について、より好ましくは全体の鎖について、修飾されたタンパク質の予想されたまたは実験により決定された３Ｄ構造が、もとのタンパク質の予想されたまたは実験により決定された３Ｄ構造からの平均平方根偏差(root-mean-squaredeviation)が、好ましくは５Åより小さく、より好ましくは３Åより小さく、さらにより好ましくは２Åより小さく、最も好ましくは１Åより小さい、主鎖（Ｃα−炭素）コンフォメーションを持つ。
【００４８】
タンパク質の３−Ｄ構造の決定は、タンパク質を有用な目的で、または少なくとも修飾による不活性化を避けるように、修飾しようとするための重要なガイダンスを提供することができる。もし、全３−Ｄ構造が既知であれば、当業者は、どの残基が表面上にあり、そしてどの残基が内部にあるか、どの残基が外側に向いた側鎖を持つか、どの残基が共に密接にパックされているか、そしてどの残基がそうでないか、鎖はどこがフレキシブルか、そしてどこが束縛されているか、どの残基が二次構造内にあるか、鎖のフォールディングの結果としてどの残基が接近するか、そしてどの残基が水素結合および塩橋の形で相互作用することができるか、が分かる。
【００４９】
表面残基の変異は、内部残基の変異より許容されやすい。後者の位置での変異は、タンパク質を変性させ、その結合活性のすべてに影響を与えることによって、タンパク質をより不安定にする可能性が大きい。表面残基の変異は、結合活性に全く影響を与ええないか、またはある活性には影響するが他の活性には影響を与えない。少なくとも、それらはタンパク質を変性させるとは考えられない。
【００５０】
完全なタンパク質の３−Ｄ構造を決定する主な方法は、Ｘ−線結晶学的およびＮＭＲ分光法であり、そして高分解能Ｘ線回折データを得るための主なハードルは、結晶化の段階である。ｈＣＧの高分解能結晶構造は、２つの研究室から入手でき（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４；Ｗｕら、１９９４）、ｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＴＳＨのモデルとして提供される。
【００５１】
より小さいタンパク質、好ましくは２０ｋＤａより小さい場合、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法でも、また、３Ｄ−構造を解明することができる。ＮＭＲを構造決定に用いることについては、ＭｃＩｎｔｏｓｈら（１９８７）を参照のこと。また、ＮＭＲは、より大きいタンパク質の構造についての部分情報を提供することもできる。特に興味あるより大きいタンパク質の領域を、組換えＤＮＡ技術または調節されたタンパク質分解のいずれかによって、分けて作りだし、次いで、ＮＭＲによって研究することができる。
【００５２】
様々なスペクトルの変化は、あるアミノ酸の周りのチャージの変化を伴う。アミノ酸トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンおよびヒスチジンがより極性の少ない環境にシフトするならば、λｍａｘおよびεが増加する。このように、残基が極性溶媒中のこれらのアミノ酸の一つについてより高く、次いで同溶媒中の遊離のアミノ酸についてより高いならば、残基は、非極性アミノ酸によって覆われ、周りを取り囲まれているはずである。また、タンパク質のスペクトルが溶媒極性内の変化に対して感受性であるならば、疑問のアミノ酸は、表面上にあるはずである。アミノ酸について、もう一つの例を示すと、滴定されうる基（例えば、チロシンのＯＨ、ヒスチジンのイミダゾール、およびシステインのＳＨ）がチャージしているならば、λｍａｘおよびεは常に増加する。それ故、具体的変化をｐＨ変化と相互に関連させることによって、滴定されうる基が表面上にあるかまたは埋もれているかを推定することができる。深いクレバス内の残基は、異なる平均直径を持つ分子の溶媒で結果を比較することによって、それらが完全に表面上にあるか、または完全に埋もれているかを識別することができる。
【００５３】
特定の残基の位置の決定に用いられる傍ら、これら分光法技術は、Ｘ線およびＮＭＲ分析の曖昧さを解決する手助けとなることができる。
アミノ酸−特異的化学親和性標識を用いて、実際に露出しいる残基を探し出すことができる。それらは表面上に出現していると考えられるため、最も有用な標識は、チャージした残基と反応するそれらであると考えられる。サンプル標識には、以下の物が含まれる；
アミノ酸 アフィニティ−ラベル
Ａｓｐ、Ｇｌｕ ジアゾ化合物（非イオン化ＡＡ）
またはエポキシド（イオン化ＡＡ）
Ｌｙｓ ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、酢酸、
スクシン酸、マレイン酸およびシトラコン酸の無水物
Ａｒｇ シクロヘキサンジオン、ヒドラジン
【００５４】
次いで、標識および非標識のタンパク質を、別々に、ブロム化シアン、ペプシン、パパイン、キモトリプシン、トリプシンまたはヨードソ安息香酸のような、断片化試薬に、かける。標識したタンパク質の分解の結果えられるペプチドを、天然タンパク質から誘導されたそれらと、二次元電気泳動を用いて、比較する。移動度が変化したペプチドを配列分析し、修飾されたアミノ酸を決定する。
【００５５】
Ａｄａｃｈｉら（１９８９）は、Ａｒｇ−およびＬｙｓ−特異的試薬を用いて、ＥＣ−ＳＯＤの触媒活性およびヘパリン結合活性の両方についてこれらの残基の役割を調査した。彼らは、これらの残基を修飾すると、結果として、これらの活性が減少することを発見したが、彼らは、どの残基が修飾されたかを識別しようとはしなかった。
【００５６】
また、表面残基は、光に晒した場合、反応性の高い中間体、例えばニトレンおよびカルベン、を形成する光アフィニティー標識によって同定することもできる。これらの種はＣ−Ｈ結合内に挿入でき、それ故、任意の接近しやすいアミノ酸と反応することができる。この理由により、光アフィニティー標識を用いて、膜の地形について研究した。いくつかのタンパク質は、膜の周辺に位置し、その他はそれになくてはならない。
【００５７】
非特異的標識化試薬のもう一つの例は、トリチウムである。フォールディングされたタンパク質を、（水素をトリチル化した水で変換することによって）トリチル化し、変性させ、そしてフラグメント化し、フラグメントの配列を決定し、（放射活性のある）トリチウムの存在について試験した。
【００５８】
また、このような標識化法はすべて、どの残基が、表面上にあることに加えて、
結合部位の部分であるかを決定するために、用いることもできる。遊離のタンパク質が標識された場合にえられる標識の配置を、複合タンパク質が標識された場合に得られる標識の配置と比較する。複合体では、結合相手が結合タンパク質の結合部位残基をふさぐので、結合部位残基は、遊離タンパク質内では標識され、複合タンパク質内では標識されないはずである。
【００５９】
一般的に、類似した配列および機能を持つタンパク質族内では、表面残基は、内部残基より変化しやすい。表面残基は、タンパク質の全体コンフォメーションの維持に必要なその他の残基との相互作用に含まれないらしいので、このことはもっともらしい。
【００６０】
タンパク質の表面残基を同定する最も確実な方法は、Ｘ線回折によってタンパク質の３−Ｄ構造を決定することである。不完全な３Ｄ構造でさえ、変異の設計に有用である。高い移動度を持つ残基は、平均の結晶学的熱因子がより高いことによって証明されるので、不安定化する変異を最も受けにくいそれらである。Ａｌｂｅｒら、１９８７、を参照のこと。
【００６１】
多くのアミノ酸の置換を、逆影響を与えずに、表面位置に作り出すことができるが、内部位置での置換は、ひどく不安定化される傾向にある。相同タンパク質のファミリー内では、大多数の保存された残基は、機能性アミノ酸は別にして、埋もれた残基である。
【００６２】
タンパク質フォールディングによるエネルギーの遊離、およびこれによるタンパク質安定性への主な一因は、内部に疎水性側鎖を埋め、それによって溶媒からそれらを保護することから来る。パッキング密度は、典型的に高い。一般的には、コア残基の容量を変える変異を許すタンパク質の能力は、コア残基全体の容量の純変化に、そして個々の残基の容量変化の大きさに、依存する。言い換えれば、一つのコア位置の容量の増加は、もう一つのコア位置の容量の減少を補うことができる。好ましくは、全コア残基容量の純変化は、１０％より多くなく、より好ましくは、５％より多くない。Ｌｉｍら、１９８９；Ｌｉｍら、１９９２：を参照のこと。
【００６３】
反対証拠がないので、内部残基と同定された残基はすべて、単一のコアの一部分であると仮定することができる。しかしながら、もしタンパク質がフォールディングされ、いくつかの別個のコアが形成される見込みがあるならば、上記の容量保存のルールは、個々のコアに分けて適用すべきである。
【００６４】
埋没したタンパク質コアの構造は、もし存在するならば、埋没した、個々のアミノ酸の傾向のみでなく、タンパク質内でそのアミノ酸が発生する全体頻度にも依存する。最も一般的な埋没残基は、高い方から低い方への順番で、Ｖａｌ、Ｇｌｙ。Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＩｌｅおよびＳｅｒである。
【００６５】
Ｌｉｍら（１９９２）は、タンパク質コア内の一つの疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｖａｌ）を親水性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）で置換すると、タンパク質の完全なフォールディングが阻害され、生物学的活性が破壊されると報告している。
【００６６】
埋没したＣｙｓ（−Ｓ−Ｓ−形）、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＴｒｐは、７０％より多くが、相同タンパク質内では変化していないように見える。それ故、これらの残基が興味あるタンパク質内の埋没する位置にあるならば、それらを変化させずに残すことが好ましい。多分、それらの保存は、以下のように説明可能である；Ｃｙｓ（ジスルフィド結合）、Ａｓｐ（チャージしているが硬い側鎖）、Ｇｌｙ（鎖のフレキシビリティー）、Ｈｉｓ（生理学的ｐＨでチャージした状態とチャージしていない状態の両方の状態がえられる）Ｐｒｏ（独特の鎖の幾何異性）、およびＴｒｐ（最も大きい側鎖）。
【００６７】
その他の残基は、Ｍｅｔを除いて、埋没している場合、４０−６０％チャージしないまま残るようである（Ｍｅｔは２６％のみがチャージされていないが、２５％がＬｅｕによって置換されているようである）。
【００６８】
以下の埋没した残基の置換の可能性は、１０％を越える。
Ａla→Ｖal、Ｇlu→Ｇln、Ｐhe→Ｌeu、Ｉle→Ｌeu、Ｉle→Ｖal、
Ｌys→Ａrg、Ｌeu→Ｉle、Ｌeu→Ｖal、Ｍet→Ｌeu、Ｍet→Ｖal、
Ａsn→Ａsp、Ａsn→Ｓer、Ａrg→Ｌys、Ａrg→Ｇln、Ｓer→Ａla、
Ｔhr→Ｓer、Ｖal→Ｉle、Ｖal→Ｌeu、Ｔyr→Ｐhe、Ｃys(-SH)→Ａla、
さらなるこれらの置換は、５−１０％の範囲の可能性を持つ。
【００６９】
Ａla→Ｓer、Ａsp→Ａsn、Ｇlu→Ａrg、Ｇlu→Ｖal、Ｐhe→Ｉle、
Ｐhe→Ｖal、Ｐhe→Ｔyr、Ｈis→Ｖal、Ｌeu→Ｐhe、Ｍet→Ａla、
Ｍet→Ｉle、Ｇln→Ｇlu、Ｇln→Ｈis、Ｇln→Ｍet、Ｓer→Ｇly、
Ｓer→Ｔhr、Ｔhr→Ｖal、Ｖal→Ａla、Ｔrp→Ｐhe、Ｔyr→Ｌeu、
Ｃys(-SH)→Ｓer、
Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎら（１９９２）、表５を参照のこと。
【００７０】
最も矛盾しない変換群は、（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ）、および（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ）であろう。しかしながら、ＡｌａとＶａｌは、かなり無差別であるように見える。
【００７１】
それ故、一般的には、変異し埋没した残基を少しでも除外することが好ましい。しかしながら、仮にそれらが変異するならば、コアの容量の全体的変化が制限されるべきであり、最も好ましくは、変異は、一つの残基を典型的な置換の可能性がゼロ、より好ましくは少なくとも５％を、最も好ましくは少なくとも１０％、を越えるもう一つの残基で置換することに制限すべきである。埋没したＣｙｓ（−Ｓ−Ｓ）、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＴｒｐの変異は、避けるべきであり、その他の証拠によって正当化されることはない。最も安全なコア変異は、一つの疎水性アミノ酸をもう一つの疎水性アミノ酸に変換すること、およびＡｒｇをＬｙｓに変換すること（またはその逆）である。
【００７２】
それにもかかわらず、内部残基の良識ある変異を、タンパク質安定性を改良するために用いることもできる。そのような変異は、天然構造と矛盾しないさらなる安定化相互作用（水素結合、イオンペア）を導入するか、または、より小さいアミノ酸をより大きいアミノ酸で、あるいは直線側鎖を分子鎖あるいは芳香族側鎖で置き換えることによって、近くにある相互作用する基の移動性を減少させることができる。Ａｌｂｅｒら（１９８７）を参照のこと。
【００７３】
より重要なことは、上記した糖タンパク質ホルモン内の残基への修飾の概念に加えて、糖タンパク質ホルモンレセプターへの結合に晒されるかまたは晒されない、そしてホルモンレセプター相互作用、即ちレセプターアフィニティーおよびホルモン機能、を崩壊させない、糖タンパク質ホルモン（特にｈＣＧ）の領域についての考慮すべき量の入手可能な情報が存在する。安全に修飾することのできる残基および領域に関するそのような入手可能な情報は、「関連技術」の節の記述、または本明細書のその他の場所、に紹介されている。従って、ここに示されたような、そして、化学文献から入手できるような、豊富な構造および機能データから、糖タンパク質ホルモンの機能を崩壊させないそれらのアミノ酸配列の修飾を作り出すことは、当業者らには周知である。
【００７４】
さらに、糖タンパク質ホルモンの機能的変異は、糖タンパク質ホルモンの一つ以上の残基または領域、即ちβ−サブユニットシートベルトを、例えばレセプター結合特異性を変化させることのできる、もう一つの糖タンパク質ホルモンからの相当する残基（類）または領域（類）によって置換する、キメラ糖タンパク質ホルモンを包含するつもりである。レセプター結合特異性等に影響する残基類および領域類のいくつかの例を、本明細書中で検討されている。
【００７５】
さらに、糖タンパク質ホルモンの変異タンパク質は、α−およびβ−サブユニットを一本鎖として翻訳し、そのヘテロダイマーコンフォメーションに正しくフォールディングされる、一本鎖糖タンパク質ホルモンを包含するつもりである。
【００７６】
ジスルフィド結合を形成する可能性を持つ残基を同定するために用いることのできる方法を、以下に概略する。以下の実施例に示されるように、すべてのジスルフィド結合が、ｈＣＧのヘテロダイマーを安定化するわけではなく、その類似体類がそれらの全生物学的可能性を保持しているわけでもない。しかしながら、システインノット間のサブユニット内ジスルフィド結合の導入は、ホルモンの可能性を崩壊させることなくタンパク質の安定性を増加させる能力を持つ。
【００７７】
本発明のジスルフィド結合架橋糖タンパク質ホルモン類似体は、架橋して一つ以上のサブユニット内ジスルフィド結合を形成することのできる個々のサブユニット内に遊離のシステインを作り出すことによって、調製することができる。このことは、一つ以上のアミノ酸のコドンをシステインのコドンで置き換えることによって、または存在するジスルフィド結合のシステイン残基のコドンを任意のその他のアミノ酸のコドンで置き換えることによって、成し遂げることができる。しかしながら、そのような置換のすべてが、サブユニット内ジスルフィド結合を作り出すと期待されるわけではない。類似体設計で考慮すべき二つの因子を以下に説明する。
【００７８】
１） 大多数の有益なジスルフィド架橋糖タンパク質ホルモン類似体は、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨまたはｈＴＳＨのそれと類似した構造を持つと考えられる。従って、ジスルフィドは、タンパク質の全体的コンフォーメーションをはなはだしく歪めてはならない。表１Ｂは、ｈＣＧのα−サブユニット内の選択されたアミノ酸残基のＣαおよびＣβ炭素原子（カラムの個々のペアの左側のカラム）とｈＣＧ β−サブユニットの一つ以上の近くの残基（カラムの個々のペアの右側のカラム）の間のおおよその距離を示しており、この表のデータから、タンパク質コンフォメーションに最少の破壊的影響しか持たないと考えられるジスルフィドの位置を、予想することができる。これらの値は、任意のいくつかの周知の広く公的に入手できる、少し名前を挙げると、Ｓｙｂｙｌ、Ｉｎｓｉｇｈｔ、ＲａｓｍｏｌおよびＫｉｎｅｍａｇｅを含む、分子モデルパッケージによって、ｈＣＧの結晶構造から計算することができる。表１Ｂに示されたそれらを除く、ｈＣＧのα−サブユニット内のアミノ酸残基と、ｈＣＧ β−サブユニットの一つ以上の近くの残基の間の距離は、公表されたｈＣＧ結晶構造のデータから、容易に計算することができる（Ｌａｐｔｈｏｒｎら、１９９４；Ｗｕら、１９９４）。
【００７９】
【表２】

【００８０】
個々のβ−サブユニット残基と関連する括弧内に示した個々の対の値の左側の値は、そのβ−サブユニット残基のＣα炭素原子と左側のカラムの相当するα−サブユニット残基との間の距離を示している。括弧内に示す個々のペアの値の右側の値は、これらの残基のＣβ炭素原子の間の相当する距離を示している。原則として、システインでのこれらのペア残基の置換は、別の妨害システインがどちらかのサブユニットに存在しない限り、サブユニット内ジスルフィド結合の形成を許すであろう。システインのすべてのペアがサブユニット内ジスルフィドの形成に等しい可能性を持つわけではない。ヘテロダイマーコンフォメーションに最少の影響しか持たないと予想されるサブユニット内ジスルフィドの形成は、それらの成分であるシステインの側鎖原子の方向によって影響をうけるであろう。ジスルフィドの配置に望ましく好ましい位置は、Ｃβ炭素原子間の距離が、それらのＣα炭素原子間の距離より小さい、アミノ酸ペアを含むであろう。サブユニット内ジスルフィド結合の配置の最も望ましく好ましい位置は、ＣαおよびＣβの炭素間の距離が、天然発生ジスルフィドのそれらと類似している（即ち、それぞれ、約５．０−６．５Åおよび約３．５−４．２Å）、それらである。
【００８１】
このように、Ｃα炭素原子間距離が４−８Åと遠く、そしてＣβ炭素原子間距離が１−２Åの近さのサブユニット内システインペアを作り出す置換は、タンパク質構造全体に最少の影響しか持たないジスルフィドを形成する、および／または、２つ以上のサブユニット内架橋を促進する、最良の機会をもつと予想されるであろう。事実、実施例に示すように、本発明では、この規則による実際的方法を用いて、それらの免疫学的性質およびホルモン的性質の多くを保持しているいくつかのジスルフィド架橋ｈＣＧ類似体を作り出すことに成功した。
【００８２】
２） 大多数の活性なジスルフィド架橋糖タンパク質ホルモン類似体は、レセプター結合あるいはシグナル導入に必要でない部位に、および／またはホルモンの活性なコンフォメーションの安定化に必要でない部分に、架橋を含むと予想される。糖タンパク質ホルモン内には、そのような生物学的活性に必要でないことが分かっている残基が、多数存在する。これらには、システインノットのＮ−末端の大多数の残基（即ち、天然型α−サブユニット内の第二のシステインおよび天然型β−サブユニット内の第一のシステイン）が含まれる。例えば、このようなＦＳＨ β−サブユニットの残基（Ａｓｎ１、Ｓｅｒ２）を、それらのｈＣＧのカウンターパート（Ｓｅｒ１、Ｌｙｓ２、Ｇｌｕ３、Ｐｒｏ４、Ｌｅｕ５、Ａｒｇ６、Ｐｒｏ７、Ａｒｇ８）で置き換えた、高効能のｈＦＳＨ類似体が調製された。このように、ｈＣＧ α−サブユニットのＧｌｎ５およびβ−サブユニットのＡｒｇ８をシステインで置き換えることによって作り出された分子のこの領域内のジスルフィドは、ジスルフィド架橋ヘテロダイマーのＬＨ活性を排除するは考えられない。同様に、ｈＦＳＨ α−サブユニットのＧｌｎ５とβ−サブユニットのＳｅｒ２をシステインで置き換えることによって作り出されたジスルフィドは、ジスルフィド架橋ヘテロダイマーのＦＳＨ活性を排除するとは考えられない。α−サブユニットのＣｙｓ３１をＡｌａまたはＳｅｒに変えることによって、そしてｈＣＧ β−サブユニットのＡｒｇ６をＣｙｓで置き換えるか、またはＦＳＨ α−サブユニットのＮ−末端にＣｙｓを付加することによって、ジスルフィドをｈＣＧまたはｈＦＳＨのα−およびβ−サブユニットのＮ−末端領域内に作ることができる、と期待される。このジスルフィドが、いずれかのホルモン類似体の活性を破壊するとは考えられない。
【００８３】
ｈＣＧの結晶構造から、ｈＣＧのそれぞれのサブユニットはシステインノットを構成していることが分かった。このように、それぞれのサブユニットは、α１、α２、α３およびβ１、β２、β３と呼ばれる３つのループを含んでいる。さらに、β−サブユニットは、ヘテロダイマーを保護し、そしてその唯一のレセプターと結合する能力を持つコンフォメーションにそれを安定化する、α２を取り巻くシートベルトとして知られている２０のさらなるアミノ酸を持つ。ルトロピン、ホリトロピンおよびチロトロピン内のシステインの位置から、これら３つの分子はすべて同様の全体のフォールディングパターンを持ち、そして、ｈＣＧの結晶構造はサブユニット内ジスルフィドを導入するための適当な案内となるであろうことが、示唆される。しかしながら、ＦＳＨおよびＴＳＨの構造は決定されておらず、ｈＣＧのそれから推定できるのみである。個々のサブユニットのシステインノットの結晶構造は、それぞれが高い類似性を持つことを示している。これは、それらの３つの構成成分のジスルフィド結合によって強く束縛されていることによる。このように、システインノット内の残基およびこれに隣接する残基は、個々のホルモン内で類似したコンフォメーションを持っていると予想される。さらに、３種類のホルモンのすべてで、ループβ１およびβ３内の類似した位置に、システインが存在する。これらはｈＣＧ内でジスルフィドを形成し、全糖タンパク質ホルモン内でもジスルフィドを形成すると予想される。このようなジスルフィドおよびｈＣＧのこのようなループ内の骨格原子内および間の多数の水素結合から、β１およびβ３のコンフォメーションは３種類のホルモンのすべてで非常に類似しているであろうと、思われる。また、ループα１およびα３は、いくつかの水素結合を含み、分子のこの部分もまた、３種類のホルモンのすべてで類似しているであろうと、考えられる。この見解は、遊離のα−サブユニットのＮＭＲ構造から、α１およびα３がヘテロダイマー内にない場合でも類似のコンフォメーションを持つことが分かる（ＤｅＢｅｅｒら、１９９６）、という所見によって支持される。３種類のホルモン全体の残りの部分もまた、ｈＣＧのそのコンフォーメーションと確かに類似してはいるが、それらは、ここで検討した分子の部分と同程度に、ｈＣＧの構造と密接に関連している訳ではないらしい。例えば、β２は、比較的少数の内部水素結合を含んでいるのみである、および／または、α１およびα３と接触している。β２はｈＣＧ内では強く束縛されているとは考えられないので、その構造がその他のホルモン内のそれと完全に同一であるであろうと確信する理由はどこにもない。事実、ＴＳＨ内のループβ２は、ｈＣＧまたはｈＦＳＨ内のそれより、２アミノ酸残基分大きい。α２のＮ−およびＣ−末端は、過剰な水素結合接触にかかわっており、α２のＣ−末端の一部分もまたβ１と接触している。このように、α２のこのような部分は、大多数のホルモンで類似しているであろう。しかしながら、α２の中央部分は、３種類のホルモンで充分に保持されているとは言えないタンパク質領域である、シートベルトとのみ接触している。α−サブユニットのＮＭＲ構造は、α２がひどく無秩序であることを示したが、この所見から、ｈＣＧでのホルモンのこの部分は、β１、β３およびシートベルトの間でサンドイッチ状態にあるため、ヘテロダイマー状態内でのみ良く秩序が保たれた構造を持つと考えられる。シートベルト内の差異から、特にシステインノットの近くに位置しないそれらの部分である、α２のコンフォメーションが変化すると考えられるであろう。
【００８４】
ホルモン構造へのシートベルトの影響への見識は、ルトロピンおよびホリトロピンレセプターと結合する能力を持つｈＣＧ類似体を研究するための免疫プローブを用いて、本発明者によって得られた。これらのデータは、シートベルトの組成がホルモンのコンフォメーションを変えることができることを、示唆している。類似したデータもまた、ホルモンのコンフォメーションがレセプターによって影響を受けることを、示唆している。例えば、結合部位が部分的に決定されているモノクローナル抗体（Ｍｏｙｌｅら、１９９０；Ｍｏｙｌｅら、１９９５）を用いて、二価性ｈＣＧ類似体（ＣＦ１０１−１０９）のコンフォメーションを、それが遊離している場合、および、それがＬＨおよびＦＳＨレセプターに結合している場合について、研究した。ＣＦ１０１−１０９は、ｈＣＧシートベルト残基１０１−１０９をｈＦＳＨのシートベルト残基９５−１０３で置き換えることによって、調製された（Ｍｏｙｌｅら、１９９４）。モノクローナル抗体によって認識されるＣＦ１０１−１０９の能力は、シートベルト内のＦＳＨ残基の存在が２つのサブユニット間の相互作用を変化させることを、示した。従って、ｈＦＳＨではなくｈＣＧのα−サブユニットのＮ−末端の残基を含む配座エピトープに対する抗体であるＡ４０７は、そのエピトープが変異の部位から遠い場合でさえ、ＣＦ１０１−１０７へのアフィニティーが著しく減少した（表１Ｃ）。ホルモン構造へのレセプターの影響は、それがＬＨレセプターと結合した場合にはＡ４０７がＣＦ１０１−１０７を認識し、ＦＳＨレセプターと結合した場合には認識しない、という事実によって、認められた（表１Ｄ）。その他の抗体で、その全体がα１および／あるいはα２内に、またはβ１および／あるいはβ３内に位置するエピトープを認識する前記抗体は、それがレセプターと結びついた場合でさえ、ＣＦ１０１−１０９を認識した。
【００８５】
ひとまとめにして考えると、このような知見から、ホルモン内のサブユニットの位置は同一ではなく、それらのレセプターとの相互作用によって影響を受けることが、示唆される。それ故、本発明者は、ｈＣＧのシステイン構造から得られた可能性のあるシステイン置換の相対位置および方向を考慮することに加えて、また、ｈＣＧの結晶構造がホリトロピンおよびチロトロピンの構造および／またはホルモンレセプター複合体内のホルモンのコンフォメーションを示すであろうと言う、可能性を考慮しなくてはならない。ｈＣＧのそれらと最も同一であると考えられるホルモンの部分、およびレセプター相互作用の間に最も変わらないと考えられるホルモンの部分には、システインノット内の残基の内または近くのそれらが含まれる。
【００８６】
【表３】

【００８７】
【表４】

【００８８】
システインノット間の領域は、ジスルフィド結合を工学的に作成する最も魅力ある部位の一つであり、サブユニット内ジスルフィド結合の好ましい部位でもある。個々のサブユニットのシステインノットは、３つのジスルフィドによって安定化され、それを分子の最も固定した部分の一つにする。本発明者の研究室から得られた結果は、ｈＣＧ β−サブユニットの残基Ｔｙｒ３７を変化しても、ホルモン活性への影響は比較的少ないことを、示している。従って、本発明者は、この部位のシステインの存在がホルモン活性を変えるとは思わない。カナダ特許ＣＡ２１８８５０８には、α−およびβ−サブユニットのシステインノット間のサブユニット内ジスルフィドがゴナドトロピンヘテロダイマーを安定化し、ホルモン活性を保持しているであろうとは、開示されていない。本実施例に示したように、これを成し遂げることのできる一つの方法は、α−サブユニット残基Ｃｙｓ７をＡｌａまたはＳｅｒで置換してＣｙｓ７−Ｃｙｓ３１サブユニット内ジスルフィドを破壊すること、およびｈＣＧ β−サブユニットＴｙｒ３７をＣｙｓで置換することである。生成したｈＣＧの架橋類似体は、高いＬＨ活性を持っていた。同様に、もう一つの非制限の実施例では、ｈＣＧ β−サブユニットのアミノ酸残基１０１−１１４をそれらのｈＦＳＨの同等物（即ち、β−サブユニット残基９５−１０８）で置き換えたｈＣＧ／ｈＦＳＨキメラである、ＣＦＣ１０１−１１４架橋類似体を調製することができた。ＣＦＣ１０１−１１４は、ＬＨおよびＦＳＨレセプターの両方と結合し、その両方を活性化する。また、ジスルフィド架橋した類似体も、ＬＨおよびＦＳＨレセプターの両方と結合し、そして活性化する能力を持っていた。後者の知見は、このジスルフィドがＦＳＨレセプター活性を妨げないことを示しており、このことは、また、ｈＦＳＨの類似のジスルフィドもそのホルモン活性を破壊しないであろうという可能性を高くする。ジスルフィド架橋されたｈＦＳＨの調製は、Ｃｙｓ７をＡｌａに変換したα−サブユニットｃＤＮＡと、Ｔｙｒ３１をＣｙｓに変換したｈＦＳＨ β−サブユニットｃＤＮＡを同時発現させることによって成し遂げられた。また、システインノット間のジスルフィド結合も、好まし実施態様として、αループ２とβシートベルトの間、またはα−Ｎ−末端とβ−Ｎ−末端との間の様な、どこかもう一つのサブユニット内ジスルフィド結合と共に起こすことができる。さらに、α−サブユニットとβ−サブユニットのＣｙｓノット間に形成されたジスルフィド結合は、PEG化（PEGylation）に有用に用いることのできるＮ−末端近くの残基、即ち、αＣｙｓ７Ｓｅｒ、をフリーアップするであろう。
【００８９】
また、α−サブユニットとβ−サブユニットのシステインノット間に位置するサブユニット内ジスルフィド結合も、天然のジスルフィド結合の内に含まれ、大部分のＮ−末端またはＣ−末端の天然型システイン（関連する天然型サブユニットの最も外側のシステインユニット）の外側でない、実在する（天然型）システイン（即ちＮ−末端またはＣ−末端）の２つの残基内での両方の架橋位置を置き換えることによる、サブユニット内架橋によるホルモン構造への影響の可能性を最少にする一般法則に適合する。カナダ特許ＣＡ２１８８５０８に開示され教授されたサブユニット内ジスルフィドは、いずれもこの一般法則に適合しない。
【００９０】
また、上記の一般法則に従わないα−サブユニットのループ１または３とβ−サブユニットのループ２の間のジスルフィドによって架橋されたホルモン類似体も、ホスモン活性を保持していると予想される。これらの領域は、アミノ酸置換による従順性が高い。従って、ヒトｈＣＧまたはｈＦＳＨのα−サブユニットをウシのα−サブユニットで置き換えても、ウシとヒトのα−サブユニットがこの領域内で有意に異なっている場合でさえ、通常、ホルモン活性を排除しない。同様に、β−サブユニットループ２内のｈＦＳＨ残基とｈＣＧ残基の大規模置換はいずれの場合も、どちらのホルモン活性をも除外しなかった。従って、この領域内のジスルフィドが、ルトロピンまたはホリトロピンのいずれの生物学的活性をも崩壊させるとは考えられない。これらのジスルフィドには、α−サブユニットのＧｌｎ２７およびｈＣＧあるいはｈＬＨのβ−サブユニットのＶａｌ４４またはｈＦＳＨのβ−サブユニットのＶａｌ３８をＣｙｓに変換することによって作り出されるそれらが含まれる。また、それらには、α−サブユニットのＶａｌ７６およびｈＣＧのβ−サブユニットのＶａｌ４４またはｈＦＳＨ β−サブユニットのＶａｌ３８をＣｙｓに変換することによって調製されたジスルフィドが含まれる。実質的活性を保持すると考えられるもう一つのサブユニット内ジスルフィド架橋類似体は、α−サブユニット残基Ｌｙｓ７５およびｈＣＧあるいはｈＬＨ β−サブユニット残基Ｇｌｎ４６またはｈＦＳＨ β−サブユニット残基Ｌｙｓ４０をＣｙｓに変換させた類似体である。しかしながら、後者の類似体は、ｈＣＧまたはｈＦＳＨのいずれかより正のチャージが少なく、従って、そのＬＨまたはＦＳＨの全体活性は低いであろう。さらに、ルトロピンおよびホリトロピンのその他の領域内へのサブユニット内ジスルフィドの挿入も可能であろう。このようなジスルフィドのいくつかには、β−サブユニットシートベルト（即ちｈＣＧ β−サブユニットＡｓｐ９９のＣｙｓによる置換によって作り出される）およびα−サブユニットループ２（即ちα−サブユニットＬｙｓ５１のＣｙｓでの置換により作り出される）内の残基が含まれる。このジスルフィドは、ｈＣＧのＬＨ活性ならびに二機能性類似体ＣＦＣ１０１−１０４のＬＨおよびＦＳＨ活性を、有意に減少させた。ジスルフィド結合を作り出すことを期待してシステインに変異させることのできる、ｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＴＳＨ内残基の位置は、表２−４に示したように、これらのタンパク質内でのα−およびβ−サブユニット残基の「等価」な位置から決定することができる。
【００９１】
【表５】

【００９２】
表２の情報を用いて、ヒトの個々のホルモンβ−サブユニット内で「等価」の位置を占める残基を予測することができる。結晶構造は、ｈＣＧのみ入手できる。しかしながら、すべての糖タンパク質ホルモン、特にサブユニット内ジスルフィド、のアミノ酸配列の類似性が高いことから、すべてのホルモンは良く似た形を持つであろうと予測される。また、すべてのヘテロダイマーのコンフォメーション全体がｈＣＧのそれと良く似ているという結論も、キメラを誘導するために用いられたそれらの始原領域内に認められるエピトープを保持しているｈＣＧ／ｈＦＳＨ、ｈＣＧ／ｈＬＨおよびｈＣＧ／ｈＴＳＨキメラを調製することができるという所見によって、支持される。このように、この表に定義されたような等価な残基の置換は、作成され特徴を調べられたそれらと類似した性質を持つサブユニット内ジスルフィド結合を導くであろう、と予想される。「等価」な位置を、縦軸に定義する。従って、ｈＦＳＨ β−サブユニット内でのシステイン３は、ｈＣＧ β−サブユニットのシステイン９と等価である。
【００９３】
【表６】

【００９４】
表３内の情報を用いると、個々のホルモンのα−サブユニット内での「等価」な位置を占める残基を予測することが出来る。ｈＣＧの結晶構造は、報告されている唯一の結晶構造である。すべての糖タンパク質ホルモン、特にサブユニット内ジスルフィド、のアミノ酸配列の類似性の高さにより、すべての種のホルモンは良く似た形を持つであろうと予測される。また、この考えは、キメラで認められるそれらの始原領域内に認められるエピトープを保持しているヒト／ウシα−サブユニットキメラを調製することができるという知見によって指示される。従って、この表に定義されたような等価な残基の置換は、作成されその特徴を調べられたそれらと良く似た性質を持つサブユニット内ジスルフィド結合を導くであろうと予想される。
【００９５】
【表７】

【００９６】
表４の情報を用いると、個々の脊椎動物のβ−サブユニット内で「等価」な位置を示す残基を予測することができる。
本発明の実施例では、ＬＨ、ＴＳＨおよび／またはＴＳＨレセプターに結合する能力を持つ糖タンパク質ホルモンおよびその類似体内にジスルフィド結合を導入する方法を教示する。サブユニット内ジスルフィド結合が存在すると、有意のＦＳＨおよびＴＳＨ活性を持つ、ｈＣＧおよびｈＣＧ類似体の安定性が強化された。従って、サブユニット内ジスルフィドの付加は、また、このホルモン族内のその他の構成ホルモンおよび関連する類似体を安定化する、と予測されるであろう。レセプター結合またはレセプター結合特異性に含まれないホルモン部位に位置する場合、そのジスルフィドは、ホルモン機能を妨げない。事実、いくつかのサブユニット内ジスルフィドは、ホルモン類似体の機能を強化する。一つを除いて（Ｂｌｉｔｈｅら、１９９１）、ホルモンサブユニットは、ほとんど内分泌活性を持たない。このように、ヘテロダイマーを安定化する方法は、これらのホルモンの生物活性を延長すると考えられ、それらの治療効果を強化すると予想させる。
【００９７】
本発明によるヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンの安定性を改善する方法は、それぞれのサブユニット内に遊離のシステインを作り出すために置換することのできる残基を同定することが含まれ、この遊離のシステインは、ホルモンタンパク質の全体的コンフォメーションを歪めることなく、ヘテロダイマーの安定性を改善するであろうサブユニット内ジスルフィド結合を形成する可能性が高い。個々のサブユニット内に遊離システインを作り出すための残基の置換は、α−およびβ−サブユニットのヌクレオチド配列内の相当するコドンを置換することによって遺伝子レベルで成し遂げることができる。プロモーター配列と機能するように連結されたα−およびβ−サブユニットをコードする修飾されたヌクレオチド配列を持つ組換えＤＮＡ分子で形質転換され、修飾された糖タンパク質ホルモンを発現する能力を持つ、宿主細胞を培養し、そして本発明では類似体と呼ばれる、修飾された糖タンパク質ホルモンを発現させる。次に、発現した糖タンパク質ホルモン類似体を回収し、そして糖タンパク質ホルモン精製技術として、この技術分野で周知の技術に従って、精製する。
【００９８】
遺伝子レベルで、本発明の糖タンパク質ホルモン類似体は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９７）、第８章、クローン化ＤＮＡの変異誘発、に記載されているような、この技術分野で周知の任意の適当な部位特異的変異誘発によって、作り出される。 このＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの出版物は、ここに参照として採用されるが、組換えＤＮＡ技術の一般原則について述べた標準参考書の一例である。
【００９９】
組換えＤＮＡ分子内に含まれるような糖タンパク質ホルモン類似体のα−およびβ−サブユニットをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内で類似体を発現する能力を持つ適当な発現ベクター内に挿入することができる。糖タンパク質ホルモン類似体を発現する能力を持たせるために、発現ベクターは、糖タンパク質ホルモン類似体の遺伝子発現および生成を許すような方法で、サブユニットをコードするＤＮＡに連結した転写および翻訳調節情報を含む特異的ヌクレオチド配列を持たねばならない。第一に、遺伝子が転写されるために、それは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されうるプロモーターによって先導されなくてはならず、それにポリメラーゼが結合し、転写プロセスを開始する。
【０１００】
ＤＮＡは、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含むならば、ポリペプチドを「発現する能力がある」と言われ、そのような配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能するように連結」されている。機能しうる連結とは、制御ＤＮＡ配列および発現することが求められるＤＮＡ配列を、遺伝子発現を可能にするような方法で結合する、連結である。一般に、遺伝子発現に必要な調節領域には、ＲＮＡに転写した場合に、タンパク質合成開始のシグナルとなる、プロモーター領域ならびにＤＮＡ配列が含まれる。哺乳動物および昆虫の細胞系での高レベルタンパク質発現に共通に用いられる様々なプロモーターが存在する。
【０１０１】
本発明の類似体のα−およびβ−サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子、および機能するように連結させた転写および翻訳調節シグナルを、宿主細胞内でサブユニットを一時的に発現するか、または宿主細胞染色体内に所望の遺伝子配列を組み込む能力を持つかのいずれかの、ベクターまたはベクター類内に挿入することが出来る。染色体内に導入されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を選択する能力を持たせるために、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つ以上のマーカーが用いられる。マーカーは、独立栄養宿主に、生命破壊(biocide) 耐性、例えば抗生物質に対する耐性、または銅のような重金属、またはその類似物を、原栄養体のために提供することができる。選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列と直接連結するか、または同時トランスフェクションによって同一細胞内に導入することができる。また、さらなる要素がｍＲＮＡの最適な合成に必要とされるであろう。これらの要素は、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナル、を含むことができる。そのような要素を採用するｃＤＮＡ発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａ（１９８３）に記載されたそれらが含まれる。
【０１０２】
真核生物宿主細胞内にトランスフェクトされた場合に、所望のタンパク質を高レベルで一時的に発現する能力を持つ発現ベクターは、この技術分野では周知であり、通常、公的に入手できるか、または分子生物供給者から市販されている（例えば、プラスミドｐｃＤＭＢはＩｎｂｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手でき；ｐＳＶＬはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手でき；ｐＣＩはＰｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できる；等）。ひとたび、構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製したならば、発現ベクターを適当な宿主細胞内に、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等のような、任意の様々な適当な手段によって、導入することができる。
【０１０３】
真核生物宿主細胞は、正しいフォールディング、正しいジスルフィド結合形成、更には、正しい部位でのグリコシル化を含めたタンパク質分子への翻訳後修飾を与えるという理由から、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、サル（ＣＯＳ細胞）、マウスおよびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞でありうる。しかしながら、昆虫細胞、例えば、バキュロウイルスは、ポリペプチドを過剰生産することができるし、グリコシル化を含めた翻訳後ペプチド修飾も行なうことができる。ＣＯＳ、ＣＨＯおよび昆虫細胞での異所性発現は、当該技術分野において周知であり、Ausubel ら（1987-1997），項目16.9-16.14 で与えられたような、バキュロウイルスベクターを用いた昆虫細胞でのおよび哺乳動物細胞でのタンパク質の発現に関するプロトコルを適当に用いることができる。糖タンパク質ホルモン類似体のα−およびβ−サブユニットを発現する形質転換された宿主細胞を培養して、その類似体を生産することができる。
【０１０４】
糖タンパク質ホルモン類似体のα−およびβ−サブユニットを発現する形質転換された宿主細胞を培養して、その糖タンパク質ホルモン類似体を生産させた後、これを、糖タンパク質ホルモンについて一般的なおよび周知の精製技術によって回収し且つ精製することができる。生産される糖タンパク質ホルモンの量は、実施例１で記載のサンドイッチ免疫検定法などの方法によって定量することができる。更に、実施例１で記載の放射性リガンドレセプターおよびシグナル伝達（レセプターに結合してサイクリックＡＭＰ蓄積応答を引起こす能力を測定する）検定のような、本発明の糖タンパク質ホルモン類似体のレセプター親和性および生物学的活性を測定する検定は、過度の実験を伴うことなく容易に行なうことができる。
【０１０５】
本発明による糖タンパク質ホルモン類似体には、いくつかの治療的用途がある。ｈＦＳＨの類似体は、雌の排卵誘発のための製剤中で、卵胞を発育させるのに用いられるはずである。ｈＬＨおよびｈＣＧの類似体は、発育を開始した卵胞を誘導するのに用いられるはずである。これら類似体は、雄の精巣機能を誘導するのにも用いられるはずである。更に、本発明による糖タンパク質ホルモン類似体は、受胎能を制限する抗血清を生じさせる免疫原、例えば、避妊ワクチンとして用いることもできる。逆に、それら糖タンパク質ホルモン類似体へのアンタゴニスト類似体または抗体は、多嚢胞性卵巣疾患のある女性で過剰のｈＬＨレベルが認められる場合などに、受胎能を促進するのに用いることもできると考えられる。
【０１０６】
本発明による類似体の場合のような、向上した安定性を有する糖タンパク質ホルモン類似体は、生物学的活性および機能、例えば、糖タンパク質ホルモンレセプターへの親和性およびホルモン効力も維持していて、極めて有用である。本発明による類似体は、特定の治療目的に有用であるのみならず、これら類似体は、液剤中でのおよび高温への機能的安定性、尿素などのタンパク質変性剤による変性に対する耐性等の優れた性質も与える。これら安定性により、本発明の類似体は、向上した in vivo 半減期を有すると考えられる。
【０１０７】
本発明の糖タンパク質ホルモン類似体は、それらを必要としている患者に、その予定された目的を達成するいずれかの手段によって投与することができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、鼻腔内が含まれるがこれらに制限されるわけではない多数の異なった非経口経路、経口、経皮または口腔経路によることができる。非経口投与は、巨丸剤注入でありうるしまたは経時の緩やかな灌流によることができる。
【０１０８】
アミロイドまたはアミロイド様沈渣に関係した状態を予防する、抑制するまたは治療する典型的な計画は、数か月間〜数年間まで含めた一定期間にわたる１回または多数回量での有効量の投与を含む。
【０１０９】
投与される用量は、受容者の年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば、同時治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性状に依るであろうことは理解される。それぞれの治療に必要な全用量を、多数回量でまたは１回量で投与してよい。“有効量”とは、予定された目的を達成できる糖タンパク質ホルモン類似体の濃度を意味する。このような濃度は、当業者が常套法で決定することができる。
【０１１０】
非経口投与用製剤には、滅菌水性または非水性の液剤、懸濁剤および乳剤が含まれ、これは、当該技術分野において知られている添加剤または賦形剤を含有してよい。
本発明の糖タンパク質ホルモン類似体を含む医薬組成物には、それら類似体が、その予定された目的を達成する有効な量で含有されている組成物全てが含まれる。更に、それら医薬組成物は、薬学的に用いることができる製剤中に、活性化合物の処理を容易にする賦形剤および添加剤を含む適当な薬学的に許容しうる担体を含有してよい。適当な薬学的に許容しうるビヒクルは、当該技術分野において周知であり、例えば、この分野で標準的な参考書である、Alfonso Gennaro 監修，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.（イーストン，ＰＡ，1990年）で記載されている。薬学的に許容しうるビヒクルは、糖タンパク質ホルモン類似体の投与方式、溶解度および安定性によって常套法で選択することができる。例えば、静脈内投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水性液剤が含まれうる。
【０１１１】
非経口投与に適した製剤には、水溶性の形の活性化合物、例えば、水溶性塩の水性液剤が含まれる。更に、適当な油状注射用懸濁剤としての活性化合物の懸濁液を投与することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドか含まれる。その懸濁液の粘度を増加させる物質を含有しうる水性注射用懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む。場合により、その懸濁剤は、安定化剤も含有してよい。
【０１１２】
ここに、本発明を大まかに記載してきたが、これは、本発明を説明するものとして与えられ且つ制限するものではない次の実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろう。
【０１１３】
実施例１：システインノット間のサブユニット内ジスルフィド結合によって安定化したｈＣＧ：ｈＣＧ（α３１−β３７）
ジスルフィド結合によるサブユニット内架橋の判定基準によれば、表１Ｂのデータは、フリーのシステインがα−サブユニット残基３１に生じるならば、そしてβ−サブユニットＴｙｒ３７がシステインで置き換えられるならば、システインノット間のサブユニット内ジスルフィド結合によって安定化したｈＣＧの類似体を製造することは可能であろうということを示唆した。これは、Ｔｙｒ３７がシステインで置き換えられたｈＣＧ β−サブユニットの類似体、およびＣｙｓ７がＳｅｒで置き換えられたヒトα−サブユニットの類似体を製造することによって行なわれた。この後者の変化は、アミノ酸Ｃｙｓ７とＣｙｓ３１との間のα−サブユニットで通常見出されるジスルフィドを破壊して、残基３７に導入されたβ−サブユニットシステインとのジスルフィド結合を形成するのに利用可能な残基３１にフリーのα−サブユニットシステインを残した。これらサブユニット構築物それぞれが、培養された哺乳動物細胞中で発現された場合、残基３１のα−サブユニットおよび残基３７のβ−サブユニットのシステインは、サブユニット内ジスルフィド結合を形成した。
【０１１４】
そのジスルフィド結合の形成は、ヘテロダイマーの安定性を劇的に増加させた。ｈＣＧとは異なり、架橋したヘテロダイマーは、尿素の存在下または低ｐＨで解離しなかった。しかしながら、大部分のモノクローナル抗体によって認識され、ＬＨレセプターに結合し、そしてシグナル伝達を引起こすｈＣＧ（α３１−β３７）の能力は、ｈＣＧの能力と同様であった。このことにより、ジスルフィド結合の存在はホルモン機能を破壊しなかったことが示された。
【０１１５】
α−サブユニット中のＣｙｓ７のコドンのセリンのコドンへの変更は、Campbell ら（1991）で記載されているおよびｈＣＧ α−サブユニットｃＤＮＡを含有する発現ベクター（ｐＫＢＭ−ｈＣＧα）で行なわれた。そのｐＫＢＭベクターは、ポリリンカーがＸｈｏＩ部位を含有するもので置き換えられているｐＵＣベクター（Yanisch-Perron ら，1985年）の誘導体であり、これが、ｐＫＭＢと発現ベクターｐＳＶＬ（Pharmacia，ピスカタウェイ，ＮＪ）との間にｃＤＮＡインサートを転移させた。たった一つのα−サブユニット遺伝子が存在することから、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＴＳＨのα−サブユニットのｃＤＮＡは同じコドンを含有し、この発現ベクターを、以後、ｐＫＢＭ−αと称する。図４０で示されるように、ｐＫＢＭ−αは、α−サブユニットコーディング配列の５′に独特のＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位およびアミノ酸９−１１のコドンの近くに独特のＢｓｍＩエンドヌクレアーゼ制限部位を含有する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（オリゴ４２５およびオリゴ８４７，表５）は、この部分を保留し（bracket）、Ｃｙｓ７のコドンをＳｅｒに変更し、そして変異構築物の識別を容易にするのに用いうる新規エントヌクレアーゼ制限部位（ＢｓｐＥＩ）を生じるように設計された。
【０１１６】
【表８】

【０１１７】
これらプライマーおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧα（Campbell ら，1991年）を鋳型として用いたＰＣＲの生産物を、当該技術分野において周知の手順（Maniatis ら，1989年）を用いて、ＸｈｏＩおよびＢｓｍＩで消化し、ｐＫＢＭ−αの独特のＸｈｏＩ−ＢｓｍＩ部位中にサブクローン化した。
【０１１８】
ＢｓｐＥＩエンドヌクレアーゼ制限部位を含有する組換え体プラスミドの配列は、ＰＣＲに基づく変異誘発によって変更された部分で、ジデオキシ法（Maniatis ら，1989年）によって決定した。このベクター（ｐＫＢＭ−αＣ７Ｓ）は、図３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしていた。修飾α−サブユニットｃＤＮＡを、ｐＫＢＭベクターからＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ消化によって取出し、ｐＳＶＬのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化してｐＳＶＬ−αＣ７Ｓを生じたが、この手順はαＣ７ＳをＣＯＳ−７細胞中で発現させた。それらコーディング配列を、このおよび関連の構築物のサブクローニングを容易にするように修飾された、Promega（マディソン，ＷＩ）から入手したもう一つの発現ベクター（ｐＣＩ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位中にも挿入した。ｐＣＩの修飾は、そのＢａｍＨＩ部位を取出し、そのポリリンカー（すなわち、制限部位ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ）を、次のエンドヌクレアーゼ制限部位：ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩを有する新規ポリリンカーで置き換えることを行なった。これは、ｐＫＢＭかまたはｐＳＶＬから所望のコーディング領域を含有するＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを取出し、それを、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＣＩに連結することによって、ｐＫＢＭおよびｐＳＶＬに基づくベクターからの構築物をｐＣＩに基づくベクター中にサブクローン化することを可能にした。ｐＣＩに基づくベクターの更に別の意味は、本明細書中において、上記の修飾ｐＣＩベクターを意味するものである。ｐＳＶＬからｐＣＩへのα−サブユニットコーディング領域の転移は、ｐＣＩ−αおよびｐＣＩ−αＣ７Ｓをそれぞれ生じ、培養された細胞中での発現を促進するように行なわれた。
【０１１９】
Ｃｙｓ７とＣｙｓ３１との間にジスルフィドを形成する能力を欠いたα−サブユニット類似体を製造するのに、システインの代わりにセリンの置換を用いる必要はない。アラニンは、この結合を破壊するのに用いられてきたが（Furuhashi ら，1994年）、Ｃｙｓ７を任意の他のアミノ酸で置き換えることは、Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ３１ジスルフィド結合も破壊するであろうと考えられる。
【０１２０】
Ｔｙｒ３７のコドンをＣｙｓのコドンで置き換えるためのｈＣＧ β−サブユニットコーディング配列の修飾は、ｐＫＢＭ−ｈＣＧβ′（Campbell ら，1991年）と称されるｐＵＣに基づくベクター中に包含されたｈＣＧ β−サブユニットｃＤＮＡ中のカセット変異誘発によって行なわれた。この構築物は、アミノ酸３５−３６および４５−４６のコドンに独特のＮｇｏＭＩおよびＰｓｔＩ制限部位を含有する。変異体コドンは、ＮｇｏＭＩ部位とＰｓｔＩ部位との間のＤＮＡの短片を、オリゴ８４５およびオリゴ８７４（表５）をアニーリングすることによって生じたカセットで置き換えることによって導入された。これは、変異を含有したプラスミドの識別を容易にするのに用いうるＰｍｌＩエンドヌクレアーゼ制限部位も導入した。
【０１２１】
このカセットのｐＫＢＭ−ｈＣＧβ′（Campbell ら，1991年）中へのサブクローニングは、当該技術分野において周知の標準法（Maniatis ら，1989年）によって行なわれ、変異した部分の所望の配列は、ジデオキシ配列決定法によって確認された。ｐＫＢＭは発現ベクターではないので、それをｐＳＶＬ中にサブクローン化して、このβ−サブユニット構築物が哺乳動物細胞中で発現されうるようにした。これは、ｐＫＢＭ−ｈＣＧβ′のＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩでの消化によって得られた小片を用い、そしてそれを、ｐＳＶＬのＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩでの消化後に残っている大きいフラグメントと連結して、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃと称される発現ベクターを生じることによって行なわれた。ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′およびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃによってコードされたアミノ酸を図４で示す。これらは、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ部位で修飾ｐＣＩベクター中にもサブクローン化された。
【０１２２】
これらコーディング配列の製造は、商業的に入手可能な器具を用いる標準的なＤＮＡ合成法によっても行なうことができると考えられる。これらの方法を用いて、上記のように（Campbell ら，1992年）互いに連結することができる長いオリゴヌクレオチドを製造することができる。配列をコードしているＤＮＡも、合成オリゴヌクレオチドの構築および合成ｃＤＮＡ遺伝子の製造を専門とするいくつかの会社の一つから購入しうることは注目されるべきである。これらには、Midland Certified Reagent Company，ミッドランド，テキサスおよび Genosys Biotechnologies,Inc.，ザ・ウッドランズ，テキサスが含まれる。これらサブユニットの発現は、ｐＳＶＬ（Pharmacia，ピスカタウェイ，ＮＪ）またはｐＣＩ（Promega，マディソン，ＷＩ）などのいくつかの商業的に入手可能なベクターのいずれかを用い、記載された（Campbell ら，1991年）および当該技術分野において一般的である方法と類似した方法を用いて、培養された哺乳動物細胞（すなわち、ＣＯＳ−７細胞）中で行なうこともできる。
【０１２３】
ＣＯＳ−７細胞中でのｐＳＶＬ−αおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′、ｐＳＶＬ−αＣ７ＳおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃ、ｐＣＩ−αおよびｐＣＩ−ｈＣＧβ′、およびｐＣＩ−αＣ７ＳおよびｐＣＩ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃの同時発現は、当該技術分野において周知であり且つ記載されている（Campbell ら，1991年）常套法によって行なわれた。ＣＯＳ−７細胞中へのトランスフェクションは、記載されたような標準的なリン酸カルシウム沈降法（Kriegler, 1990年）によって行なわれた。ＣＯＳ−７細胞は、ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤから入手した。トランスフェクションの翌日、細胞培地を除去し、その培地を血清不含ＤＭＥＭ培地と交換した。それら細胞を更に３日間インキュベートして、分泌生産物を培地中に蓄積させた。次に、その培地を遠心分離して、細胞破片および他の沈殿物を除去し、その上澄みを透析バッグに移し、そのバッグを吸湿性粉末床（Aquacide，Calbiochem，ラ・ホヤ，ＣＡ）の上に置くことによって高分子量成分を濃縮した。
【０１２４】
培地中に分泌されたｈＣＧおよび架橋ｈＣＧは、捕獲および検出それぞれのための抗体Ａ１１３および^１２５Ｉ−Ｂ１０５、および標準として用いられる尿から精製されたｈＣＧを用いるサンドイッチ免疫検定（Moyle ら，1982年）を用いて定量した。この検定では、抗ｈＣＧ α−サブユニット抗体Ａ１１３（０．０５ｍｌ中に１μｇ）を、微量滴定プレートの表面に３７℃で１時間吸着させた。非吸着抗体を除去し、それぞれのウェルを、０．９％ＮａＣｌおよびウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含有した溶液と一緒にインキュベートして、残っているタンパク質吸着部位をブロックした。３日間トランスフェクションされた細胞からの培地のアリコート（０．０５ｍｌ）をそれらウェルに加え、ｈＣＧまたは架橋ｈＣＧ類似体を、吸着した抗体に３７℃で１時間結合させた。結合していないホルモンまたはホルモン類似体を除去し、それらウェルを０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、捕獲された被検体を、下記のように製造された放射性ヨウ素化抗ｈＣＧ β−サブユニット抗体^１２５Ｉ−Ｂ１０５と反応させた。ｈＣＧまたは架橋ｈＣＧ類似体に結合しなかった^１２５Ｉ−Ｂ１０５を吸引し、微量滴定ウェルの表面に結合した放射性標識を、γ−計数計を用いて測定した。この検定は、０．１ｎｇのｈＣＧを容易に検出した。この検定のためにこれら特定の抗体を用いる必要はなく、同様に用いることができる商業的に入手可能な抗体がいくつかある。大部分の抗ｈＣＧ α−サブユニット抗体、および１０^８Ｍ^−１より大きいｈＣＧおよびフリーのｈＣＧ βサブユニットへの親和性を有するいずれかの抗ｈＣＧ β−サブユニット抗体が充分であろう。後者には、Pierce，３７４７ノース・メリディアン・ロード（North Meridian Road），ロックフォード，ＩＬからのＺＭＣＧ１３およびＺＭＣＧ７が含まれるであろう。
【０１２５】
抗体、ｈＣＧおよびｈＦＳＨの放射性ヨウ素化は、Pierce Chemical Co，ロックフォード，ＩＬから入手した Iodo Gen を用いて行なわれた。この手順では、５０ミリリットルのアセトン中の１．５マイクログラムの Iodo Gen を、約０．７５ｍｌの流体を入れることができる小型ガラス試験管に加え、アセトンを蒸発させた。これにより、試験管の底を覆った Iodo Gen 残留物が残った。その後、１０マイクログラムのＢ１０５を加え、その試験管をプラスチックキャップで密封し、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中に２５０〜５００μＣｉのＮａ^１２５Ｉを含有する５マイクロリットルを、マイクロシリンジでキャップを介してその溶液を注入することによって加えた。２３秒後、０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の０．９％ＮａＣｌ溶液０．１ｍｌを加え、その混合物を吸引し、BioGel Ｐ６ＤＧ（BioRad，リッチモンド，ＣＡ）の２ｍｌカラム上に充填した。フリーのヨウ素およびヨウ素化タンパク質を、ゲル濾過によって分離した。ヨウ素化に用いられたＮａ^１２５Ｉの量は、放射性ヨウ素化後にタンパク質がその機能を保持する能力によって異なった。抗体およびｈＣＧは、通常、５０μＣＩ／μｇの比活性まで放射性ヨウ素化されたが、ｈＦＳＨは、通常、１０〜２５μＣｉ／μｇの比活性まで放射性ヨウ素化された。
【０１２６】
表６は、変異が架橋ｈＣＧ類似体の形成を破壊しなかったことを示している。ｐＳＶＬ含有コーディング配列かまたはｐＣＩコーディング配列でトランスフェクションされた細胞は、同様の量の架橋類似体およびｈＣＧを生産した。
【０１２７】
【表９】

【０１２８】
ｈＣＧおよびｈＣＧ（α３１−β３７）は、サンドイッチ免疫検定において、捕獲のためのα−サブユニットに対する抗体（Ａ１１３）および検出のためのβ−サブユニットに対する放射性ヨウ素化抗体（Ｂ１０５）を用いてｈＣＧ標準に相対して測定された。
【０１２９】
抗体Ａ１１３およびＢ１０５は、それらが、変異部位から遠く離れていると考えられるホルモンの部分を認識したので（Cosowsky ら，1995年；Moyle ら，1995年）、サンドイッチ免疫検定において架橋ｈＣＧ類似体の生産を確認するのに用いられた。ｈＣＧ（α３１−β３７）類似体は、Ｃ７Ｓ変異の部位（Moyle ら，1995年）であるα−サブユニットのＮ末端の一部分を含むことが分っているエピトープを認識する抗体であるＡ４０７（図５）に、ｈＣＧのように結合することはなかった。抗体Ａ４０７は、Dr.Robert E.Canfield，Columbia University，ニューヨーク，ＮＹから入手した。しかしながら、Ａ４０７は、ｈＣＧ−レセプター複合体を認識することが分っているので（Moyle ら，1995年）、ホルモンコンホメーションのこの小さな変化が、架橋ｈＣＧ類似体の生物学的活性の妨げになるとは考えられなかった。
【０１３０】
ｈＣＧ（α３１−β３７）および他の架橋類似体の生物学的活性を、放射性リガンドレセプター検定およびシグナル伝達検定で監視した。これらは、ＬＨレセプターｃＤＮＡをコードしている遺伝子でトランスフェクションされていて、したがって、機能性ＬＨレセプターを表面上で発現するＣＨＯ細胞を用いた。ＣＨＯ細胞は、ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤから入手した。ラットＬＨレセプターｃＤＮＡは、ラット卵巣ライブラリーから、記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応（Bernard ら，1990年）を用いて得られた。これらＬＨレセプター発現性細胞を便宜上用いたことおよび放射性リガンド受容体検定は、ＬＨレセプターを発現する他の組織で行なうことができるということは注目されるべきである。これらには、成体ラット精巣のホモジネート、または妊娠馬血清ゴナドトロピンおよびｈＣＧ（両方とも、Sigma，セント・ルイス，ＭＯから入手可能）を注射された性的に未成熟なラットから得られた卵巣のホモジネートが含まれる。ｈＣＧを高親和性で結合できる卵巣製剤を製造するには、雌の２１日令ラットに、５０ｉ．ｕ．の妊娠馬血清ゴナドトロピンを皮下注射するであろう。約６５時間後、それらに、２５ｉ．ｕ．のｈＣＧを皮下注射するであろう。数日後、それらを屠殺するであろうが、それらの卵巣をホモジナイズし、卵巣の２０分の１に相当するそのホモジネートのアリコートを、それぞれの検定試験管に用いた。ラットＬＨレセプターを発現する細胞は、初めに記載されたように製造できるしまたは New England Nuclear，ボストン，ＭＡから購入することができるトレーサーである放射性ヨウ素化ｈＣＧを結合する。それらは、Sigma Co.，セント・ルイス，ＭＯから購入できるホルモンである未標識ｈＣＧも結合する。ＬＨレセプター発現性ＣＨＯ細胞は、３７℃で１０〜３０分間のｈＣＧ処理に反応して、サイクリックＡＭＰも合成する。生産されるサイクリックＡＭＰは、サイクリックＡＭＰに特異的であり且つ記載されている（Brookder ら，1979年）ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した。
【０１３１】
ｈＣＧのα−およびβ−サブユニットシステインノットの残基間のサブユニット内ジスルフィドの付加は、ＬＨレセプターに結合するまたはサイクリックＡＭＰ蓄積反応を引起こす架橋ヘテロダイマーの能力を破壊しなかった。したがって、ｈＣＧもｈＣＧ３（α３１−β３７）も、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への^１２５Ｉ−ｈＣＧの結合を阻止することができた（図６）。ｈＣＧおよびｈＣＧ（α３１−β３７）は両方とも、これら同じ細胞中でサイクリックＡＭＰ蓄積を引起こすこともできた（図７）。これにより、サブユニット内ジスルフィド結合の存在は、ｈＣＧの機能活性全体を破壊しなかったことが示された。
【０１３２】
サブユニット内ジスルフィド結合の存在は、ｈＣＧを破壊する酸、尿素および熱での処理にｈＣＧ３（α３１−β３７）が耐えうるようにした。これは、図８および９のデータから理解できる。図８は、捕獲用のＡ１１３および検出用の^１２５Ｉ−Ｂ１１２を用いるサンドイッチ免疫検定で監視されたヘテロダイマーの安定性に関する高温の影響を示している。Ｂ１０５およびＢ１１２が、ｈＣＧ（α３１−β３７）のα−かまたはβ−サブユニットの変異から遠く離れた部位である第三β−サブユニットループ（Moyl ら，1990年；Cosowsky ら，1995年）の折り返し点に近い残基を包含する重複エピトープに結合することに注目されたい。この検定では、ｈＣＧおよびｈＣＧ（α３１−β３７）に、最大２０分までのいろいろな間隔で８５℃の温度を施した。ｈＣＧの活性は、７〜８分までにほとんど破壊されたが、架橋類似体の活性の少なくとも７５％は、２０分のインキュベーション後に残った（図８）。このサンドイッチ免疫検定はダイマー特異的であるので、ｈＣＧ活性の減少は、サブユニット内ジスルフィド結合の存在によって妨げられる過程であるサブユニットの解離のためであると考えられた。
【０１３３】
高濃度の尿素中でのゴナドトロピンのインキュベーションは、サブユニット解離を促進することが周知である（Pierce ら，1981年）。したがって、ｈＣＧを８Ｍ尿素の存在下でインキュベートした場合、それは解離してそのサブユニットになり、その現象は、ウェスタンブロッティングで容易に検出された（図９）。ｈＣＧ α−およびβ−サブユニットをコードしている遺伝子でトランスフェクションされた哺乳動物細胞は、しばしば、培地中にフリーのβ−サブユニットもαβ−ヘテロダイマーも分泌する。これらは、α−サブユニット特異的およびβ−サブユニット抗体を用いるサンドイッチ免疫検定によって容易に区別できる。αβ−ヘテロダイマーおよびフリーのβ−サブユニットは、ウェスタンブロットにおいてそれらの寸法で区別することもできる。したがって、ｈＣＧおよびフリーのβ−サブユニットをポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離後、それらをウェスタンブロットで検出することによって培地中のそれらの相対量を監視することは可能である。これは、図９で示されるようにｈＣＧおよびフリーのβ−サブユニットを結合する放射性ヨウ素化モノクローナル抗体の使用によって容易にされる。ｈＣＧ α−およびβ−サブユニット両方を発現する細胞からの培地の分析は、ヘテロダイマー（上方バンド）およびフリーのβ−サブユニット（下方バンド）両方の存在を示した。培地の８Ｍ尿素での処理は、ヘテロダイマーをそのサブユニットに解離させた。その結果、上方バンドは消失した。尿素は、ジスルフィド架橋したヘテロダイマーであるｈＣＧ（α３１−β３７）のそのサブユニットへの解離を促進しなかったので、ヘテロダイマーに該当するバンドはそのまま残った（図９）。
【０１３４】
実施例２：システインノットのα−およびβ−サブユニット間に位置するサブユニット内ジスルフィドによって安定化した多機能性糖タンパク質ホルモン類似体
シートベルト（seat-belt）は、ｈＣＧのレセプター結合活性に影響を与えることが周知である（Campbell ら，1991年；Moyle ら，1994年；Han ら，1996年）。ｈＣＧ β−サブユニットアミノ酸残基１０１−１０９の、それらのｈＦＳＨ対向部分（counterparts）（すなわち、ｈＦＳＨ β−サブユニット残基９５−１０３）での置換は、類似体のＬＨ活性を与えることなくＦＳＨ活性の劇的な増加をもたらした（Moyle ら，1994年；Han ら，1996年）。実際に、この置換は、ｈＴＳＨで特異的に見出されるいずれの残基も導入しなかったとしても、ｈＣＧのＴＳＨ活性も増加させた（Campbell ら，1997年）。関連の多機能類似体の活性へのサブユニット内ジスルフィドの影響を研究することにより、特定のジスルフィドが、ルトロピン、ホリトロピンおよびチロトロピンの活性にどのように影響するかが示された。この実施例は、システインノット間のサブユニット内ジスルフィドが、ｈＣＧの類似体（ＣＦＣ１０１−１１４）のＬＨおよびＦＳＨ活性にどのように影響したかを詳しく説明し、ここにおいて、ｈＣＧ β−サブユニット残基１０１−１１４は、それらのｈＦＳＨ対向部分（すなわち、ｈＦＳＨ β−サブユニット残基９５−１０８）で置き換えられていた。
【０１３５】
ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）の発現は、αＣ７ＳおよびＣＦＣβ′１０１−１１４Ｙ３７Ｃをコードしているベクターで細胞をトランスフェクションすることを必要とした。αサブユニットの修飾は、実施例１で記載されている。ＣＦＣ１０１−１１４β′Ｙ３７Ｃを製造するのに用いられたＣＦＣ１０１−１１４β−サブユニット前駆体のＤＮＡ配列は、連続して順に連結されたｈＣＧ β−サブユニット残基１−１００、ｈＦＳＨ β−サブユニット残基９５−１０８およびｈＣＧ β−サブユニット残基１１５−１４５をコードしていた。それは、２種類のｈＣＧ／ｈＦＳＨ β−サブユニットキメラのコーディング配列をそれらの共通のＳｓｔII部位で一緒にすることによって製造されている（図４１〜４３）。ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′のシグナル配列および残基１−１０３のコドンを含有するｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１０６β′のＸｈｏＩ−ＳｓｔIIフラグメントを、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１１４β′のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント中にサブクローン化した。これは、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′中で見出されるｈＦＳＨ β−サブユニット残基８８−９４のコドンを、それらのｈＣＧ β−サブユニット同族体（すなわち、残基９４−１００）で置き換え、ＢｇｌII部位を導入した。これらコーディングベクターはそれぞれ、次に記載されるように、分子の３′半分のコドンを修飾することによってｈＣＧ β−サブユニットｃＤＮＡから誘導されている。
【０１３６】
ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１１４β′は、連続して順に連結されたｈＣＧ β−サブユニット残基１−９３、ｈＦＳＨ β−サブユニット残基８８−１００およびｈＣＧ β−サブユニット残基１０７−１４５をコードしたベクターであるｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１０６β′のＰＣＲ変異誘発によって製造された。ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１１４β′を製造する場合の第一工程は、ＳＯＥing ＰＣＲ変異誘発（Ho ら，1989年）によってｐＳＶＬ−ＣＦＣβ′９４−１０６を製造することであった。プライマーとしてのオリゴ５０８およびオリゴ３６８（表５）および鋳型としてのｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′（Campbell ら，1991年）を用いるＰＣＲ反応は、ＣＦＣ９４−１０６ β−サブユニットコドン１０１−１４５、ｈＣＧ β−サブユニット終止コドン、３′非翻訳領域、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位、およびそのＢａｍＨＩ部位の３′のｐＳＶＬベクター配列の部分を含有する生産物を生じた。オリゴ５１０およびオリゴ３６５（表５）を用いる第二のＰＣＲ反応は、ＸｈｏＩ部位の５′のｐＳＶＬ配列、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ（Campbell ら，1991年）の５′非翻訳領域、ｈＣＧ β−サブユニットシグナル配列の２０コドン、およびＣＦＣ９４−１０６ β−サブユニットコドン１−１０７を含有する生産物を生じた。ＣＦＣ９４−１０６β−サブユニットコドン１０１−１０７を含有するこれらＰＣＲ産物の部分は相補的であったが、これは、“ＳＯＥing ＰＣＲ”中のオーバーラップ伸長の必要条件である。これら２種類のＰＣＲ産物を、オリゴ３６３およびオリゴ３６４（表５）と混合し、第三のＰＣＲ反応で増幅させて、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を５′および３′末端付近にそれぞれ有するＣＦＣ９４−１０６β−サブユニットの完全長さ配列をコードしたＰＣＲ産物を生じた。このＰＣＲ産物は、残基１０２−１０４のコドンにＳｓｔII部位も含有していて、これを、ｐＳＶＬのＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ部位中にクローン化して、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１０６β′を生成した。そのコーディング領域の配列は、ジデオキシ配列決定法によって確認した。
【０１３７】
ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１１４β′β−サブユニットを製造する場合の最終工程は、オリゴ５９６およびオリゴ３６８（表５）プライマーおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′鋳型を用いるＰＣＲを行なって、ＳｓｔIIおよびＢａｍＨＩ部位をそれぞれ５′および３′末端付近に有する生産物を生成した。これら酵素で消化された場合、それは、ｈＦＳＨ β−サブユニット残基９７−１０８のコドンおよびｈＣＧ β−サブユニットコドン１１５−１４５をその順序で含有するＤＮＡフラグメントを生じた。これを、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１０６β′の独特のＳｓｔII−ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化してｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１１４β′を生成し、そしてＰＣＲ中に増幅された配列の部分をジデオキシ配列決定法によって確認した。
【０１３８】
ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１０６β′の製造は、残基１１４のところで切断されたｈＣＧ β−サブユニット類似体をコードし且つＧｌｙ１０２のコドンの代わりにバリンのコドンを含有するｐＢＭ１３５と称されるベクターを用いて開始した。ｐＢＭ１３５は、オリゴ４３５およびオリゴ４３６（表５）をアニーリングし、３′末端を酵素的にフィルインして、ＰｖｕIIおよびＳｓｔＩ部位を含有する二本鎖カセットを生じることによって製造された。そのカセットは、終止コドンの３′であった。このカセットは、ｈＣＧ β−サブユニット残基８７−１０１、バリン、およびｈＣＧ β−サブユニット残基１０３−１１４をその順序でコードし、ＢｇｌIIの制限部位をコドン９４−９５に含有していた。それを、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′のＰｖｕII−ＳｓｔＩ部位中にサブクローン化し、そのＰｖｕIIおよびＳｓｔＩ部位間の配列をジデオキシ配列決定法によって確認した。ｐＢＭ１３５は、オリゴ５６２およびオリゴ３６５（表５）を用いるＰＣＲ反応において鋳型として用いられて、ＸｈｏＩおよびＳｓｔＩで消化された場合、ｈＣＧ β−サブユニットｃＤＮＡ非翻訳領域およびシグナル配列、ｈＣＧ β−サブユニットコドン１−１００、およびｈＦＳＨ β−サブユニットコドン９５−９８をその順序で有するＰＣＲ産物を生じた。このＰＣＲ産物を、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ９４−１０６β′のＸｈｏＩ−ＳｓｔＩ部位中にクローン化してｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１０６β′を製造し、その配列をジデオキシ配列決定法によって確認した。
【０１３９】
このアプローチを用いてｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′を生成することは明らかに不可欠ではなかった。これら工程は、歴史的理由で用いられた。種々の中間体ベクターが、他の実験中に製造されており、ＣＦＣ−１０１−１１４β′をコードしているベクターの製造に利用可能であった。
【０１４０】
プラスミドｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′Ｙ３７Ｃは、Ｙ３７Ｃ変異をコードしたｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃの５′“半分”と、ｈＦＳＨ β−サブユニットアミノ酸９５−１０８をコードしたｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′の３′“半分”とを一緒にすることによって製造された。これは、ＸｈｏＩおよびＢｓｕ３６Ｉでの消化によって得られたｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃの小片を、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′の同酵素での消化によって生じた大片に連結することによって行なわれた。これは、ＣＦＣ１０１−１１４β′のシグナル配列およびアミノ酸１−５４のコドンをｈＣＧβ′Ｙ３７Ｃのコドンで置き換えたが、これは、Ｔｙｒのシステインでの置換を引起こした変化である。初めに記載された修飾ｐＣＩ構築物のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位中へのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのサブクローニングは、ｐＣＩ−ＣＦＣ１０１−１１４β′Ｙ３７Ｃと称される構築物をもたらした。ＣＦＣ１０１−１１４β′およびＣＦＣ′１０１−１１４β′Ｙ３７Ｃのアミノ酸配列を図１０に記載する。
【０１４１】
ＣＦＣ１０１−１１４およびＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）の製造は、実施例１で記載の方法を用いて、ＣＯＳ−７細胞中でｐＳＶＬ−αおよびｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β；ｐＳＶＬ−αＣ７ＳおよびｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４βＹ３７Ｃ；ｐＣＩ−αおよびｐＣＩ−ＣＦＣ１０１−１１４β；およびｐＣＩ−αＣ７ＳおよびｐＣＩ−ＣＦＣ１０１−１１４βＹ３７Ｃを同時発現させることによって行なわれた。濃縮培地中のＣＦＣ１０１−１１４および架橋ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）は、捕獲用の抗体Ａ１１３および検出用の^１２５Ｉ−Ｂ１０５かまたは^１２５Ｉ−Ｂ１１２を、標準として用いられた尿素から精製されたｈＣＧと一緒に用いるサンドイッチ免疫検定（Moyle ら，1982年）を用いて定量した。前と同様、この検定にこれら特定の抗体を用いる必要はなく、充分に作業すると期待される商業的に入手可能な抗体が利用可能であるということは注目されるべきである。ｈＦＳＨにも高親和性を有するＡ１１３などの大部分の抗ｈＣＧ α−サブユニット抗体、またはｈＣＧに高親和性を有する抗ｈＦＳＨ α−サブユニット抗体は、この検定で用いることができる。しかながら、これら類似体は、ＦＳＨ活性に大きな影響を与えるシートベルト領域の部分にｈＦＳＨ残基（すなわち、１１番目と１２番目のβ−サブユニットシステインの間のアミノ酸残基（Moyle ら，1994年））を含有するので、ＣＦＣ１０１−１１４の類似体は、全ての抗ｈＣＧ α−サブユニット抗体によって認識されない。これは、ｈＣＧを結合するがｈＦＳＨを結合しない抗体であるＡ４０７（図１１）について理解することができる。したがって、Ａ４０７がｈＣＧを結合した場合、その、ＣＦＣ１０１−１１４および架橋ＣＦＣ１０１−１１４類似体を結合する能力ははるかに小さかった。Ａ４０７は、ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）を結合する能力も低かった。
【０１４２】
ＣＦＣ１０１−１１４類似体は、ＦＳＨ残基で占められた領域に近いβ−サブユニット中の残基を認識するものを除くｈＣＧおよびフリーのｈＣＧ βサブユニットに１０^８Ｍ^−１より大きい親和性を有する大部分の抗ｈＣＧ β−サブユニット抗体によって検出することができる。したがって、ＣＦＣ１０１−１１４および類似体は、ｈＣＧ残基１０８−１１４によって大きく影響されることが分っている抗体であるＢ１１１によっては認識されなかった（Cosowsky ら，1995年）。それにもかかわらず、ｈＣＧ、ｈＬＨ、フリーのｈＣＧ β−サブユニットおよびフリーのｈＬＨ β−サブユニットを認識するＢ１０５などの大部分の抗体をこの検定で用いることができる。更に、ｈＣＧおよびフリーのｈＣＧ β−サブユニットを認識するＢ１１２などの多数の抗体も、この検定で用いることができる。Ｂ１０５／Ｂ１１２エピトープ領域は、マウスのｈＣＧの最も抗原性の領域の一つであり、この領域に対する抗体は、実施例１で記載のように商業的に入手可能である。
【０１４３】
ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）中のジスルフィド架橋の存在は、その熱安定性をＣＦＣ１０１−１１４に相対して増加させた（図１２）。サンドイッチ免疫検定は、ｈＣＧおよびＣＦＣ１０１−１１４の活性が、８５℃でそれぞれ７．５分および１５分加熱することによってほぼ破壊されたことを示した。しかしながら、同温度で２０分後に、実質的な量のＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）が残った。これは、ジスルフィドの存在が、この類似体の安定性を増加させたことを示した。１１番目と１２番目のβ−サブユニットの間にＦＳＨ残基を有するこのおよび他の類似体は、ＦＳＨおよびＴＳＨ両方の活性を有するので（Campbell ら，1997年）、このジスルフィド結合は、ＦＳＨおよびＴＳＨの安定性も増加させると考えられる。
【０１４４】
ＣＦＣ１０１−１１４は、ＬＨレセプターでシグナル伝達を刺激することがありうる。ＣＦＣ１０１−１１４のシステインノット間のα３１−β３７サブユニット内ジスルフィドの付加は、この検定においてその活性を低下させなかった（図１３）。したがって、ＣＦＣ１０１−１１４およびＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）は両方とも、ＬＨレセプターを発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を用いる検定においてサイクリックＡＭＰ蓄積を刺激するほぼ同様の高い能力を有した。したがって、このジスルフィド結合の存在は、ルトロピン活性を有する分子の活性に影響を与えるとは考えられない。この結合のこれら分子を安定化させる能力は、有用な治療的性質をルトロピンに与えると考えられる。
【０１４５】
ＣＦＣ１０１−１１４のアミノ酸配列は、ｈＦＳＨよりもｈＣＧの配列にはるかに近いが、ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）は、この検定においてほとんど活性がないことが知られているホルモンであるｈＣＧよりもはるかに大きいＦＳＨ活性を有する。ＣＦＣ１０１−１１４のシステインノット間のα３１−β３７サブユニット内ジスルフィド結合の付加は、ＦＳＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞中でサイクリックＡＭＰ蓄積を刺激するその能力に僅かしか影響を与えなかった（図１４）。したがって、このジスルフィド結合の存在は、ホリトロピン活性を有する分子の活性に不利な影響を与えるとは考えられないので、これら分子を安定化させるこの結合の能力は、有用な治療的性質をホリトロピンに与えると考えられる。
【０１４６】
実施例３：シートベルトとα−サブユニットループ２との間のサブユニット内ジスルフィドによって安定化したｈＣＧ
ｈＣＧのα−およびβ−サブユニット中の残基のＣαとＣβ炭素原子の間の距離は（表１Ｂ）、それらサブユニットが１個またはそれ以上のジスルフィド結合によって拘束された多数の他の追加のダイマーを製造することが可能であろうということを示唆している。α−サブユニット残基３１とβ−サブユニット残基３７との間のｈＣＧおよびＣＦＣ１０１−１１４の架橋は、得られた類似体の安定性を有意に増大させ、それらの生物学的活性に最小限の影響を与えた。レセプター結合に影響を与えることが前もって示された分子の一部分へのジスルフィド架橋の導入が、その安定性および活性を変化させるかどうか突きとめるために、ジスルフィド結合をｈＣＧおよびＣＦＣ１０１−１１４中のα−サブユニットループ２とシートベルトとの間に遺伝子操作した。これら実験は、糖タンパク質ホルモンのこの領域中へのジスルフィドの導入が、それらの安定性を増加させたことを示した。しかしながら、ジスルフィドを生じるのに必要とされた置換は、レセプターと相互作用し且つシグナル伝達を引起こすそれらの能力に影響を与えた。これは、レセプター相互作用またはレセプター特異性に関与しないホルモンの部分へのジスルフィド結合の導入が、高内分泌活性を維持するのに好ましいことを示した。どちらの種類のジスルフィド架橋類似体も、それらの免疫学的活性を保持していたので、そのジスルフィドの位置は、免疫原を設計する場合にあまり重要でないかもしれない。このジスルフィドのシグナル伝達への影響は、ホルモンアンタゴニストまたは免疫原を開発するのに有用でありうる。
【０１４７】
α−サブユニットループ２とシートベルトとの間のサブユニット内ジスルフィドによって安定化されたｈＣＧ類似体を製造するために、α−サブユニットループ２のＬｙｓ５１およびβ−サブユニットシートベルトのＡｓｐ９９をシステインで置き換えた。そのα−サブユニットの変化は、前に記載されていない既存のベクターのカセット変異誘発を伴った。したがって、これら中間体ベクターの構築をここで記載する（図４４）。
【０１４８】
International Biotechnologies,Inc.（ニューヘブン，ＣＴ）から購入したクローニングベクターであるｐＩＢＩ３１のポリリンカーを、制限酵素部位を含有するポリリンカーＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ−ＰａｃＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで置き換えて、ｐＲＭ１０２と称されるベクターを製造した。ｐＫＢＭ−αをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＲＭ１０２のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローン化してｐＲＭ１１６を生じ、それによって、その５′非翻訳リーダー配列と、ｐＫＢＭ−αのクローニング中に導入された望ましくない５′ＸｂａＩ部位を除去した。したがって、ｐＲＭ１１６中の唯一のＸｂａＩ部位は、α−サブユニットアミノ酸３４−３５のコドンに対応した。ｐＲＭ１１６のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、オリゴ７５８およびオリゴ７６０（表５）を用いるα−サブユニットｃＤＮＡのＰＣＲによって生成されたベクターのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントで置き換えて、ｐＲＭ１１７を生じた。これにより、α−サブユニットｃＤＮＡ中で見出された３′非翻訳領域が除去されたが、これは、この領域の望ましくないＰｓｔＩ制限部位を除去する方法でもある。ｐＲＭ１１７中に残っている唯一のＰｓｔＩ部位は、残基８３−８５のコドンに位置した。オリゴ７３０およびオリゴ８３９（表５）を用いるα−サブユニットｃＤＮＡのＰＣＲから得られた生産物をｐＲＭ１１７のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ部位中にクローニングすることにより、ｐＭＢ５０７が得られた。これは、α−サブユニットコーディング配列中のコドン４２−４３および５４−５５それぞれにＢｇｌIIおよびＳｐｅＩ部位を導入した。ｐＭＢ５０７のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＶＬのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングすることにより、ｐＭＢ５１２が得られた。ＢｇｌIIとＳｐｅＩ部位との間のｐＭＢ５１２のフラグメントを、オリゴ８７７およびオリゴ８７８（表５）で置き換えて、ｐＭＢ５６１を生じた。最後に、ｐＭＢ５１２のＢｇｌII−ＳｐｅＩフラグメントを、オリゴ９２１およびオリゴ９２２（表５）をアニーリングすることによって製造されたカセットで置き換えて、ｐＳＶＬ−αＫ５１Ｃを生じた（図１５）。この戦略は、ｐＳＶＬ−αＫ５１Ｃを製造するのに不可欠ではないと考えられるが、他の実験中に生成された種々のベクター中間体の利用可能性による歴史的理由だけで用いられた。
【０１４９】
β−サブユニット類似体ｈＣＧβ′Ｄ９９Ｃは、鋳型としてのｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′およびプライマーとしてのオリゴ３６８およびオリゴ９２５（表５）を用いるＰＣＲ変異誘発によって製造した。オリゴ３６８は、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位の３′のｐＳＶＬ中の部位に相補的な逆プライマーである。オリゴ９２５は、所望の変異を含有し、ＢｇｌII部位も生じる。そのＰＣＲ産物をＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′のＢｇｌII−ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化した。これは、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β′からｈＦＳＨコドンを除去し、Ａｓｐ９９をシステインに変更した（図１５）。
【０１５０】
プラスミドｐＳＶＬ−αＫ５１ＣおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ′Ｄ９９Ｃを、実例１で記載のようにＣＯＳ−７細胞中で同時発現させた。ｈＣＧおよびｈＣＧ（α５１−β９９）は、サンドイッチ免疫検定において、捕獲用のα−サブユニットに対する抗体（Ａ１１３）および検出用のβ−サブユニットに対する放射性ヨウ素化抗体（Ｂ１０５）を用いてｈＣＧ標準に相対して測定された。この検定にこれら特定の抗体を用いることは不可欠ではない。ヘテロダイマー中のｈＣＧ α−サブユニットを認識するほとんど全ての抗体、およびｈＣＧおよびそのフリーのβ−サブユニットを１０^８Ｍ^−１より大きい親和性で認識するいずれのβ−サブユニット抗体も、この検定で用いることができる。トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞によるこのｈＣＧおよびｈＣＧ（α５１−β９９）の生産は、Ａ１１３／^１２５ＩＢ１０５またはＡ１１３／^１２５ＩＢ１１２サンドイッチ免疫検定によって容易に検出される細胞培地中の架橋タンパク質類似体の蓄積をもたらし、ジスルフィドを導入するのに必要な変異がサブユニット組合せを妨げなかったことが示された。
【０１５１】
【表１０】

【０１５２】
ｈＣＧ（α５１−β９９）の生物学的活性は、実施例１で概説された方法を用いてＬＨレセプター結合検定およびシグナル伝達検定で測定した。ｈＣＧ（α５１−β９９）は、ｈＣＧの力価の僅か５〜１０％ではあるが、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への^１２５Ｉ−ｈＣＧの結合を阻止することができた（図１６）。ジスルフィド結合によって引起こされたＬＨレセプターへの親和性の低下は、（１）α−サブユニット残基Ｌｙｓ５１のシステインによる置換（すなわち、荷電アミノ酸の中性アミノ酸による置換）、（２）β−サブユニット残基Ａｓｐ９９のシステインによる置換（すなわち、陰電荷アミノ酸の中性アミノ酸による置換）、または（３）二つのサブユニット間の共有結合の存在によって加えられる束縛のためでありえた。Ａｓｐ９９の修飾は、ｈＣＧのＬＨ活性を低下させるまたは消失させることが示されている（Chen ら，1991年）。非修飾β−サブユニットおよびＬｙｓ５１がシステインに変更されたα−サブユニットを含有するｈＣＧ類似体（ｈＣＧ（αＫ５１Ｃ−β））、および非修飾α−サブユニットおよびＡｓｐ９９がシステインに変更されたβ−サブユニットを含有するｈＣＧ類似体（ｈＣＧ（α−βＤ９９Ｃ））のＬＨレセプター結合活性を、ｈＣＧおよびｈＣＧ（α５１−β９９）の活性と比較することにより、システイン置換の影響をジスルフィド結合の影響から区別することが可能であった（図１７）。これら分析は、α−サブユニットＬｙｓ５１のシステインでの置換が、ＬＨレセプターへの^１２５Ｉ−ｈＣＧ結合を阻止する類似体の能力に関して実質的な阻害効果を有することを示した。ｈＣＧ（α５１−β９９）およびｈＣＧ（α−β９９）の活性は同様であり、β−サブユニットＡｓｐ９９のシステインでの置換が、ｈＣＧ（α５１−β９９）の低下したＬＨレセプター結合活性の大部分の原因であることが示された。Ｌｙｓ５１のアラニンへの変更も、ｈＣＧの活性を低下させた（図１８）。
【０１５３】
シグナル伝達（サイクリックＡＭＰ蓄積）を刺激するこれらｈＣＧ類似体の能力も調べた。α−サブユニット残基Ｌｙｓ５１をシステインかまたはアラニンで置き換えることにより、サイクリックＡＭＰ蓄積を刺激するホルモンの能力はほぼ完全に失われた（図１９および２０）。ｈＣＧ（α５１−β９９）を生じるための両サブユニットへのシステインの付加は、α−サブユニットＬｙｓ５１に代わる一つのシステイン置換だけを含有する類似体に相対して有意の量の活性を回復した（図１９）。β−サブユニット残基のＡｓｐ９９のシステインだけでの置換は、ＬＨレセプターシグナル伝達への影響がはるかに少なかった。これにより、ジスルフィドは、ｈＣＧ類似体の相対効率を低下させることが示唆されたが、これは、アンタゴニストの設計において有用でありうる性質である。
【０１５４】
シートベルトとα−サブユニットループ２との間のサブユニット内ジスルフィドの存在は、ｈＣＧの熱安定性を増加させた（図８）。それは、それらサブユニットを８Ｍ尿素の存在下でも解離させなかった（図９）。これら知見により、糖タンパク質ホルモンの安定性へのサブユニット内ジスルフィド結合の有益な作用が確認される。
【０１５５】
実施例４：シートベルトとα−サブユニットループ２の間のサブユニット内ジスルフィドにより安定化された二機能性糖タンパク質ホルモン類似体
３つ全ての主要な糖タンパク質ホルモンレセプターに相互作用する能力を有する糖タンパク質ホルモン類似体であるＣＦＣ１０１−１１４のシートベルトとα−サブユニットの間に、ジスルフィド結合を創製した。これは、ＬＨとＦＳＨのレセプターとの相互作用に対する該タンパク質のこの領域の相対的な影響の特性決定を可能にした。
【０１５６】
ＣＦＣ１０１−１１４β’（α５１−β９９）の生産に必要なβ−サブユニット発現ベクター（即ち、ｐＳＶＬ−ＣＦ１０１−１１４β’Ｄ９９Ｃ）を、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β’のカセット変異導入により製造した。このベクターは、アミノ酸９５−９６のコドン内にＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、そしてアミノ酸１０２−１０４のコドン内にＳｓｔＩＩ部位を含む。ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β’をＢｇｌＩＩとＳｓｔＩＩにより消化して、オリゴ９２４とオリゴ９２３をアニールすることにより得られた合成オリゴヌクレオチドカセットで、小さい方の断片を置き換えることにより、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β’Ｄ９９Ｃを製造した（表５）。これは、組換えクローンを選択するために使用されるＢｓｒＧＩ部位も導入した。その結果のベクターであるｐＳＶＬ−ＣＦ１０１−１１４β’Ｄ９９Ｃ内の変化した塩基の配列は、ジデオキシ配列決定法により確認された。このベクターによりコードされるＣＦＣ１０１−１１４β’（α５１−β９９）のアミノ酸配列を図２１に示す。
【０１５７】
ｐＳＶＬ−αＫ５１ＣとｐＳＶＬ−ＣＧＣ１０１−１１４β’Ｄ９９ＣのＣＯＳ−７細胞からの同時発現を実施例１に記載されたとおりに実施した。ダイマーは、捕獲のためのＡ１１３、検出のための放射性ヨウ素化Ｂ１１２、および標準物として精製された尿ｈＣＧを用いて、サンドイッチ免疫アッセイにおいて測定した。他の類似体の場合におけるとおり、培養培地中でＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）を検出するためにこれらの特定の抗体を用いる必要はないはずである。ｈＣＧおよびｈＦＳＨの両方に結合可能なほとんどのα−サブユニット抗体を捕獲のために使用できた。ＦＳＨに変化させた配列を含む残基を認識するものを除いた、ｈＣＧおよびβ−サブユニットに結合可能なほとんどの抗体は、検出のために使用できた。使用できなかった抗体の例はＢ１１１である（Ｃｏｓｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ，１９９５）。
【０１５８】
ｈＣＧ中のα−サブユニットのＮ末端部分上の決定基を認識するα−サブユニットモノクローナル抗体、Ａ４０７はＣＦＣ１０１−１１４をほとんど認識せず、ｈＣＧに結合する（図５）。これは、レセプター結合特異性の制御に関与するかもしれない糖タンパク質ホルモンα−およびβ−サブユニットの全体の相互作用に対するシートベルトの影響によったと考えられた。α−サブユニットの残基５１とβ−サブユニットの残基９９の間のジスルフィドの追加は、その結果の類似体がＡ４０７により認識可能となることを可能にしなかった（図１１）。
【０１５９】
他のジスルフィド架橋結合された類似体と同様に、ＣＦＣ１０１−１１４（α５５−β９９）が、温度変性アッセイにおいてその起源の前駆体（即ち、ＣＦＣ１０１−１１４とｈＣＧ）よりも安定であることもわかった（図１２）。事実、α−サブユニットの残基５１とβ−サブユニットの残基９９の間のジスルフィドの存在は、α−サブユニットの残基３１とβ−サブユニットの残基３７の間のジスルフィドよりも、タンパク質の安定性を増強したらしかった。
【０１６０】
ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）のシートベルトとα−サブユニットの間のジスルフィド結合の存在はＬＨレセプターへ結合するその能力を低下させた（図２２）。即ち、ＣＦＣ１０１−１１４放射性標識ｈＣＧのＬＨレセプターへの結合を阻害することにおいてＣＦＣ１０１−１１４はほとんど組換えｈＣＧほどの効果を有したが、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）は約１００倍低い活性であった。個々のサブユニット変異とジスルフィド結合の相対的な重要性を、ＣＦＣ１０１−１１４，ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９），ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β），ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ａ−β），およびＣＦＣ１０１−１１４（α−βＤ９９Ｃ）の活性を監視することにより比較した。この比較は、α−サブユニットＬｙｓ５１のシステインまたはアラニンそれ自体による置換はレセプター結合に実質上の阻害性の影響を有した（図２２および２３）。即ち、ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）の活性はＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）の活性に比例する。ｈＣＧのＬＨ活性に対するその作用とは異なり、ＣＦＣ１０１−１１４β−サブユニットのＡｓｐ９９のシステインへの置換はＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）がＬＨレセプターに結合する能力の低下の一部にすぎないことを説明した。にもかかわらず、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）はＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）よりも実質上高い活性であり、Ｌｙｓ５１に代えてのα−サブユニット中のシステインの存在により説明できない作用であった。
【０１６１】
ＣＦＣ１０１−１１４のシグナル形質導入活性に対するシートベルトα−サブユニットジスルフィド結合の影響を決定するためにも、研究を実施した。ＣＦＣ１０１−１１４はＬＨレセプターにおけるシグナル形質導入を刺激する能力がｈＣＧに比べてほんのわずかに低かった（図２４）。しかしながら、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）はジスルフィド架橋類似体であるが、試験されたもっとも高い濃度でのみ活性であった。初期に論じられた研究の確証において、これは第一に、α−サブユニットのＬｙｓ５１からシステインへの変化のために、β−サブユニットのＡｓｐ９９のみがシステインに変換された場合の（即ち、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９））類似体が実質上活性を保持したかららしかった。結合アッセイにおける場合のように、ジスルフィドがシステインまたはアラニンによるα−サブユニットＬｙｓ５１の置換により引き起こされる活性の損失のいくらかを埋め合わせることができた場合、サブユニット内のジスルフィド結合はいくらかのシグナル形質導入を回復した（図２４）。
【０１６２】
ＣＦＣ１０１−１１４はＦＳＨアッセイにおいて実質上活性を有した。しかしながら、シートベルトα−サブユニットループ２ジスルフィド架橋を創製するために必要なシステイン置換はそのＬＨ活性よりもＣＦＣ１０１−１１４のＦＳＨ活性に対して大きな作用を有し（図２６、２７および２８）、そしてジスルフィド結合自体の影響を識別することはできなかった。即ち、α−サブユニットのＬｙｓ５１またはβ−サブユニットのＡｓｐ９９が変化した類似体はそれらのＦＳＨ活性のほとんどを損失した。β−サブユニットＡｓｐ９９の変異がＬＨ活性よりもＦＳＨ活性に強い影響を有したとの発見は、ＬＨとＦＳＨ活性におけるシートベルトの役割に関する以前の観察を支持する（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ，１９９３）。これらの報告は、ＬＨレセプター結合に影響するシートベルトの領域がアミノ酸９４−９６近辺であり、ＦＳＨレセプター結合に影響する領域がアミノ酸１０１−１０９近辺であることを示唆する。
【０１６３】
実施例５：実施例１および３からのジスルフィドによるｈＣＧ安定化
糖タンパク質への複数のジスルフィドの導入がそれらの生物活性に如何に影響するかを調べるため、実施例１および３に示したジスルフィドを含むｈＣＧ類似体を作成した。これらの類似体は、実施例１および３に記載された発現ベクターの一部を交換することにより製造した。ｐＣＩ−α（Ｃ７Ｓ，Ｋ５１Ｃ）は、ｐＳＶＬ−αＣ７ＳとｐＳＶＬ−αＫ５１ＣのＢｓｍＩ消化により製造し、各消化において生成される小さい断片と大きい断片をアガロース電気泳動により分離して、ｐＳＶＬ−αＣ７Ｓからの大きな断片をｐＳＶＬ−αＫ５１Ｃからの小さな断片に連結した。その結果の構築物をＸｈｏＩとＢａｍＨＩにより消化して、修飾されたリンカーであって実施例１に記載されたｐＣＩ中に連結した。ｐＣＩ−ｈＣＧβ’（Ｙ３１Ｃ，Ｄ９９Ｃ）は、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’Ｄ９９ＣとｐＣＩ−ｈＣＧβ’Ｙ３７ＣのＡｏｃＩ（Ｂｓｕ３６Ｉのイソシゾマー）とＢａｍＨＩによる消化により製造し、小さい断片と大きい断片をアガロース電気泳動により分離して、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’Ｄ９９Ｃ由来の小さな断片をｐＣＩ−ｈＣＧβ’Ｙ３７Ｃ由来の大きな断片に連結した。これらのベクターによりコードされる類似体の配列を図３１に記載する。
【０１６４】
ｐＣＩ−α（Ｃ７Ｓ，Ｋ５１Ｃ）とｐＣＩ−ｈＣＧβ’（Ｙ３１Ｃ，Ｄ９９Ｃ）を、実施例１に記載されたとおりにＣＯＳ−７細胞中で同時発現させた。培養媒体中に分泌されたタンパク質を濃縮してサンドイッチイムノアッセイにおいて監視したが、これも、放射性ヨウ素Ｂ１１２をＢ１０５に代えて用いた以外は実施例１に記載されたとおりであった。複数のジスルフィド結合の存在は糖タンパク質ホルモンがフォールディングされることあるいは培養媒体中の類似体の存在により示されるとおり細胞から分泌されることを妨害しなかった（表８）。ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−β９９）を、捕獲のためにα−サブユニットに対する抗体（Ａ１１３）を用いたｈＣＧ標準物並びに検出のためにβ−サブユニットに対する放射性標識抗体（Ｂ１１２）に関してサンドイッチイムノアッセイにおいて測定した。該類似体は抗体Ａ４０７によりうまく認識されなく、α−サブユニットのＮ末端近傍の変異の重要な結果である。該タンパク質のこの領域はホルモン活性に必要ないため、このエピトープの欠損はほとんど重要ではないらしい。図３１の上記のケースの文字は、ジスルフィド結合を形成するために導入された変異の位置を意味する。
【０１６５】
【表１１】

【０１６６】
ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−β９９）中の２つのジスルフィド結合の存在は、温度変性アッセイにおいてｈＣＧよりもその安定性を増大させた（図８）。さらに、ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−β９９）は、尿素変性においてｈＣＧよりも安定であった（図９）。これは、１より多いジスルフィド結合の存在は該分子を不安定化しなかったことを示唆した。
【０１６７】
ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−β９９）はＬＨに結合することができたし、サイクリックＡＭＰ蓄積を刺激することができた（図３０および３１）。これらのアッセイにおけるその活性はｈＣＧ（α５１−β９９）と同様であったことから、再び、α−サブユニット残基３１とβ−サブユニット残基３７の間のサブユニット内ジスルフィド結合がレセプター結合あるいはシグナル形質導入に対して、あるとしても、ほとんど有害な影響を有さないことを示す。即ち、α３１−β３７システイン内部のノット部位はエンドクリン活性が望まれる場合に糖タンパク質を安定化するために、ジスルフィド結合を工作するのに好ましいはずである。
【０１６８】
実施例６：そのα−およびβ−サブユニット間のシステイン内部ノットジスルフィドにより安定化されたｈＦＳＨの類似体
ｈＣＧとＣＦＣ１０１−１１４がそれらのＬＡおよび／またはＦＳＨ活性を破壊することなくそれらのシステインノット間のサブユニット内ジスルフィドにより安定化されたとの発見は、この領域がホルモン活性に必要ないことを強く示唆する。即ち、ＦＳＨへの同様なジスルフィドの工作は増大した安定性と強力なＦＳＨ活性を有するＦＳＨ類似体をもたらすはずであると期待される。この類似体はｈＣＧおよびｈＦＳＨα−サブユニットを認識する抗体例えばＡ１１３を結合することも期待される。該変異部位から離れたｈＦＳＨβ−サブユニットループ１および／または３の領域を認識する抗体、例えばＢ６０２を結合することも期待される。
【０１６９】
α−サブユニット残基３１とβ−サブユニット残基３１の間を架橋したｈＦＳＨ類似体を製造するのに必要なひとつのα−サブユニット類似体の配列を図３に記載する。この類似体を製造するのにも有用であるべき低極性のαサブユニット（αＣ７Ａ）のアミノ酸配列を図３２に示す。αＣ７ＡまたはαＣ７Ｓとシステイン内部ノットジスルフィドを形成することが期待されるｈＦＳＨのβＹ３１Ｃのアミノ酸配列も図３２に示す。これらのタンパク質をコードするベクターを製造するために必要な核酸配列は、図３３に示された遺伝コードを用いて当業者によりヒトα−サブユニットおよびｈＦＳＨβ−サブユニットから製造できる。これらの配列も、実施例１に掲載された供給者の一つから購入できる。
【０１７０】
一時的あるいは安定にαＣ７ＳとｈＦＳＨβＹ３１ＣあるいはαＣ７ＡとｈＦＳＨβＹ３１Ｃの発現を推進することができるベクターは、例えば実施例１において言及されたような当業界において公知のあらゆる手段により、ＣＯＳ−７または他の真核細胞に導入されるはずである。生成されたタンパク質は、サンドイッチイムノアッセイにおいて、ｈＦＳＨを標準物として、およびα−サブユニットのＮ末端から離れたｈＦＳＨエピトープを認識する捕獲用抗体並びにβ−サブユニットのループ１および／または３中の部位におけるｈＦＳＨのエピトープを認識する検出用抗体を用いることにより測定されるはずである。
【０１７１】
ｈＦＳＨの架橋類似体は、実施例１における架橋ｈＣＧ類似体に関して実施されたとおりに、温度または尿素変性アッセイにおいてｈＦＳＨよりも安定であることが期待されるはずである。この架橋されたＦＳＨ類似体は、ヒトＦＳＨレセプターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に関して放射性標識ｈＦＳＨと競合することも期待されるはずである。これらの細胞においてサイクリックＡＭＰの蓄積を刺激することも期待されるはずである。インビトロアッセイは、完全にグリコシル化された糖タンパク質ホルモンのインビボの生物活性をうまく予測することができる。糖タンパク質ホルモン類似体を架橋するために導入されるはずの変異が、組換え糖タンパク質ホルモンに比べてそれら全体のグリコシレーションパターンを変更することは予測されないので、架橋されたＦＳＨ類似体もインビボにて活性であることが期待されるはずである。
【０１７２】
実施例７：α−およびβ−サブユニットのＮ末端部分の間のジスルフィドにより安定化されたｈＣＧの類似体
実施例１−４は、糖タンパク質ホルモンおよびそれらの類似体のサブユニット間の単一のサブユニット内ジスルフィド結合がそれらの安定性を増大させうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合、レセプター結合特異性に重要であるかまたはタンパク質を不適切なコンフォメーションに歪める残基を含まないならば、該分子のレセプター結合およびシグナル形質導入活性に対するジスルフィド結合の作用は小さくなることも示す。α−およびβ−サブユニットの両者のＮ末端部分は、実質上ホルモン活性を破壊することなく変更されうることから、該タンパク質のこの部分は鍵となるレセプター接触には関与しないことを示唆する。よって、表１Ｂにおいて有望であることが示された部位における糖タンパク質ホルモンのＮ末端のジスルフィド結合の導入は、それらの生物活性を憂慮すべき程破壊することなくそれらを安定化することになると期待される。
【０１７３】
表１Ｂは、各々をシステイン残基による置換がジスルフィド架橋類似体の形成を導くように、α−サブユニットのＧｌｎ５とｈＣＧβ−サブユニットのＡｒｇ８が好ましく位置することを示す。この類似体はｈＣＧに比して増強された安定性を有し、そしてＬＨレセプターに結合して刺激する能力を保持することが期待されるはずである。
【０１７４】
この類似体を発現するのに有用なベクターを製造するのに必要なアミノ酸配列を図３４Ａと図３４Ｂに示す。
【０１７５】
実施例８：α−およびβ−サブユニットのＮ末端部分の間のジスルフィドにより安定化されたｈＦＳＨの類似体
前記のとおり、実施例１−４は、糖タンパク質とそれらの類似体のサブユニット間のサブユニット内部ジスルフィド結合がそれらの安定性を高めうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合またはレセプター結合特異性に重要な残基を含まないならば、ジスルフィド結合とシグナル形質導入へのジスルフィド結合の作用も示す。よって、本発明によれば、ｈＦＳＨのＮ末端のジスルフィド結合の導入がそれを安定化させて有用な治療用の特性を有することになる類似体を導く。
【０１７６】
α−サブユニットのＧｌｎ５とβ−サブユニットのＡｒｇ８の好ましい位置を示す表１Ｂ内のデータおよびｈＣＧとｈＦＳＨ内の「均等」残基を示す表２内のデータに基づくと、α−サブユニットのＧｌｎ５とβ−サブユニットのＡｒｇ８のシステイン残基による置換は、ジスルフィド架橋されたｈＦＳＨ類似体を創製することが期待されるはずである。これらの類似体は、ｈＦＳＨに比して増強された安定性を有し、そしてＦＳＨレセプターに結合して刺激する能力を保持することが期待されるはずである。この類似体を発現するのに有用なベクターを製造するために必要なアミノ酸配列を図３５に示す。
【０１７７】
実施例９：α−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン内部ノットジスルフィドあるいはα−サブユニットとβ−サブユニットのＮ末端部分の間のサブユニット内部ジスルフィドにより安定化されたｈＬＨの類似体
もっとも密接に関連したヒトルトロピンはｈＣＧとｈＬＨである。即ち、活性なジスルフィド架橋ｈＣＧ類似体を製造するのに必要な変異は活性なジスルフィド架橋ｈＬＨ類似体の製造にも有用なはずであることが期待されるはずである。ｈＬＨは安定性の低いゴナドトロピンであり、そしてサブユニット内部ジスルフィドが顕著にｈＬＨの安定性を増大させることも予測される。システイン内部ノットジスルフィド架橋ｈＬＨおよびそのＮ末端近傍において架橋されたｈＬＨを製造するのに必要なβ−サブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ図３６と図３７に示す。
【０１７８】
実施例１０： ｈＴＳＨβＹ３０Ｃ、α−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン内部ノットジスルフィドあるいはα−サブユニットとβ−サブユニットのＮ末端部分の間のサブユニット内部ジスルフィドにより安定化されたｈＴＳＨの類似体を製造するために有用なことが予測されるβ−サブユニット類似体
前記のとおり、実施例１−４は、糖タンパク質ホルモンとそれらの類似体のサブユニットの間のサブユニット内部ジスルフィド結合がそれらの安定性を高めうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合またはレセプター結合特異性に重要な残基を含まないならば、ジスルフィド結合とシグナル形質導入へのジスルフィド結合の作用も示す。よって、ｈＴＳＨのα−およびβ−サブユニットのシステインノット内あるいはｈＴＳＨのα−およびβ−サブユニットのＮ末端内の残基間のジスルフィド結合の導入がヘテロダイマーを安定化して、放射線切除治療前に甲状腺を刺激する等の有用な治療特性を有することになる類似体を導く。
【０１７９】
α−サブユニットのＣｙｓ７１とβ−サブユニットのＴｙｒ３７の好ましい位置を示す表１Ｂ内のデータおよびｈＣＧとｈＴＳＨ内の「均等」残基を示す表２内のデータに基づくと、αＣ７ＳまたはαＣ７ＡおよびＴｙｒ３０がシステイン残基で置換されたｈＴＳＨのβ−サブユニット類似体を発現する細胞がジスルフィド架橋ｈＴＳＨ類似体を創製することが期待されるはずである。同様に、α−サブユニットのＧｌｎ５とｈＣＧのβ−サブユニットのＡｒｇ８の好ましい位置を示す表１Ｂのデータ並びにｈＣＧおよびｈＴＳＨ内の「均等な」残基を示す表２にデータに基づくと、α−サブユニットＧｌｎ５とｈＴＳＨのβ−サブユニットＰｈｅｌのシステイン残基による置換はジスルフィド架橋ｈＴＳＨ類似体を創製することが期待されるはずである。これらの類似体はｈＴＳＨに比して増強された安定性を有することが期待されるはずであり、そしてＴＳＨレセプターに結合して刺激する能力を保持するはずである。
【０１８０】
これらの類似体を発現するのに有用なベクターを製造するのに必要なアミノ酸配列は図３８および３９に示される。
【０１８１】
実施例１１：ジスルフィド架橋ホルモンアンタゴニストの製造
糖タンパク質ホルモンの脱グリコシル化が生物学上のシグナルを引き出すそれらの能力を低下させることはよく知られている（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，１９７５；Ｍａｔｚｕｋ ｅｔ ａｌ，１９８９）。しかしながら、それらの不安定性のために、脱グリコシル化されたホルモンは治療上有用でない。遺伝上脱グリコシル化されたホルモンへのジスルフィド架橋の導入はホルモンアンタゴニストとしてのそれらの利用性を高めることになると期待される。ＬＨまたはｈＣＧのアンタゴニストは、前生殖能力（profertility）および抗生殖能力（antifertility）の用途の両方を有するはずである。即ち、不適切に高いＬＨレベルを有するために不妊の女性に投与した場合、ＬＨアンタゴニストは受胎能を増強するはずである。妊娠初期の段階であった女性に投与した場合、ｈＣＧアンタゴニストは妊娠を停止させるはずである。二機能性ＬＨ／ＦＳＨ分子のアンタゴニスト例えばＣＦＣ１０１−１１４あるいはＣＦＣ１０１−１０９（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，１９９４）も有用なはずである。そのようなアンタゴニストの一時的な使用は不適切な卵巣機能を停止させるために使用することができ、それにより、月経周期のリセットを導く。これは、有力な前生殖効果を有するはずである。初期妊娠におけるそのようなアンタゴニストの使用は、プロゲステロンおよびエストラジオール両者の生産を抑圧して妊娠を停止させることが期待されるはずである。
【０１８２】
サブユニット内ジスルフィド架橋を導入するほかに、架橋されたアンタゴニストの製造は、記載されてきたかまたは表１Ｂを参照して生産できた類似体のα−サブユニット上またはα−並びにβ−サブユニット上におけるＮ結合グリコシレーションの変化を含む。これは、糖タンパク質ホルモンのα−並びにβ−サブユニットに見いだされる配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを変化させることを含み、Ａｓｎを別のアミノ酸で置換するか、ＳｅｒまたはＴｈｒを他のアミノ酸に変化させるか、またはＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒの間のアミノ酸（Ｘと表される）をプロリンに変化させるかのいずれかである。
【０１８３】
実施例１２：
親のホルモンよりも安定なことが期待されるゴナドトロピンの別のジスルフィド架橋類似体を表９−１５に示す。これらは、実施例１−５に示されたとおりに、α−サブユニットおよびβ−サブユニットを発現できるベクターによる細胞の同時トランスフェクトにより製造されるはずである。
【０１８４】
【表１２】

【０１８５】
【表１３】

【０１８６】
【表１４】

【０１８７】
【表１５】

【０１８８】
【表１６】

【０１８９】
【表１７】

【０１９０】
【表１８】

【０１９１】
実施例１３：β−サブユニットループ２とα−サブユニットループ３の間にジスルフィドを含むｈＣＧ類似体
このジスルフィドを創製する残基は高い親和性のレセプター接触に関与しないと提案されているｈＣＧの領域中にある（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，１９９５）。ｈＣＧの第２のβ−サブユニットループも第３のβ−サブユニットループもルトロピン活性に必要なく、そして両者が欠損したｈＣＧの活性類似体を作成することができる（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，１９９８）。さらに、β−サブユニットループ２がそのｈＦＳＨ同等物で置換された、完全に活性のｈＣＧの類似体を製造した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１）。即ち、該タンパク質のこれらの部分の間のサブユニット内ジスルフィドの追加がその生物活性を破壊するとは本発明者らにより予測されなかった。この類似体はｈＣＧのα−およびβ−サブユニットをコードするベクターを修飾してそれらを哺乳類細胞中で同時発現することにより製造されるはずである。α−サブユニット構築物は、表９に示すαＶ７６Ｃと呼ぶアミノ酸配列を有するタンパク質をコードした。この構築物は、オリゴヌクレオチド１１３１と１１３２をプライマーとして（表５）そしてｐＭＢ５８９を鋳型として用いることによりＰＣＲ変異導入により製造された。プラスミドｐＭＢ５８９は、Ａｓｎ５２のコドンがアスパラギン酸に変化し、並びにＡｒｇ４２とＳｅｒ４３のコドンがサイレントなＢｇｌＩＩ部位を創製するように修飾された、ヒトα−サブユニットの類似体をコードする、ｐＣＩ’中の構築物である。
【０１９２】
ｐＭＢ５８９は、ｐＭＢ５３２由来のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ挿入物をｐＣＩ’ベクターのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローン化することにより作成し、そしてｐＢＭ５３２は前記構築物ｐＭＢ５０７から、オリゴヌクレオチド８５０と８５１をプライマーとして（表５）そしてｐＭＢ５０７を鋳型として用いるＰＣＲにより作成した。該ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＳｐｅＩにより消化して、ｐＭＢ５０７のＢｇｌＩＩ部位およびＳｐｅＩ部位にサブクローン化し、そして配列決定することによりｐＭＢ５３２を提供した。
【０１９３】
該ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩとＰｓｔＩにより消化して、挿入物をｐＭＢ５０７のＢｇｌＩＩ部位とＰｓｔＩ部位にクローン化して、ｐＭＢ９１０を創製した。陽性クローンは、上記構築物に導入された追加のＤｒａＩ部位の存在により同定された。ｐＭＢ９１０のＤＮＡ配列をジデオキシ法により確認した後、完全なα−サブユニット類似体をコードしたＤＮＡ断片をｐＭＢ９１０からＸｈｏＩとＢａｍＨＩの消化により取り出して、ｐＣＩ’ベクターのＸｈｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位にサブクローン化することによりｐＭＢ９２６を創製した。ｐＭＢ９２６はαＶ７６Ｃをコードする。
【０１９４】
αＶ７６ＣのｈＣＧのβ−サブユニットパートナーを創製するために、ｈＣＧβ’Ｖ４４Ｃをコードするベクターを製造した。これは、ｐＭＢ９２６と同じ細胞中で発現させた場合に、αＶ７６Ｃとジスルフィド架橋ヘテロダイマーを形成することが期待される。オリゴヌクレオチド１１３３と１１３４（表５）を合成して、ｐＫＭＢ−β’のＮｇｏＭＩ−ＰｓｔＩ部位に連結することによりｐＭＢ９０９を創製した。ｐＭＢ９０９からのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＣＩ’に移すことによりｐＭＢ９４１を創製した。ｐＭＢ９４１によりコードされるｈＣＧβＶ４４Ｃのアミノ酸配列を表１１に示す。
【０１９５】
実施例１４：β−サブユニットループ２とα−サブユニットループ３の間にジスルフィドを含むｈＦＳＨ類似体
ｈＣＧとｈＦＳＨのβ−サブユニットのアミノ酸配列の類似性、特にシステイン（表４）に基づき、両方のタンパク質は同様の構造を有すると予測される。ｈＣＧのβ−サブユニットループ２中のＶａｌ４４とα−サブユニットループ３中のＶａｌ７６の相対的な位置は、これらの残基のシステインへの変化がβ−サブユニットループ２とα−サブユニットループ３の間にサブユニット内ジスルフィドを創製するはずであることを示唆した。Ｖａｌ３８は、ｈＣＧのβ−サブユニットのＶａｌ４４のように、ｈＦＳＨのβ−サブユニット中で同様な位置を占める。よって、ｈＦＳＨβＶａｌ３８のシステインへの変化およびその結果の構築物の間にＶ７６Ｃを伴う発現は、ジスルフィド架橋ヘテロダイマーをもたらすと考えられた。ｈＦＳＨのβ−サブユニット中のＶａｌ３８をシステインに変化させるために、本発明者は、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ制限部位間に非翻訳３’および５’末端を持たないｈＦＳＨβｃＤＮＡコーディング配列を含む構築物であるｐＭＢ６０３を用いて開始した。ｐＭＢ６０３のＢｓｔＸＩとＰｐｕＭＩ部位の間の小さなＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチド１１５４と１１５５（表５）をアニールすることにより製造されたオリゴヌクレオチドカセットで置き換えた。
【０１９６】
ｐＭＢ９２０と呼ぶその結果の構築物を、ＢｓｔＸＩ部位の欠損並びにＰｐｕＭＩ部位の存在に関してスクリーンした。ＤＮＡ配列決定により所望の変化の存在を確認した後、ｐＭＢ９２０を、ＣＯＳ−７細胞へ、αＶ７６Ｃの発現を推進するベクターであるｐＭＢ９２６と同時トランスフェクトした。該細胞は培地中にヘテロダイマーを分泌し、捕獲用の抗α−サブユニットモノクローナル抗体Ａ１１３と放射性標識抗ｈＦＳＨのβ−サブユニットモノクローナル抗体Ｂ６０２を用いたサンドイッチイムノアッセイにおいて容易に検出した。ｐＭＢ９２０によりコードされるｈＦＳＨβ３８Ｃのアミノ酸配列を表１０に示す。αＶ７６ＣとｈＦＳＨβＶ３８Ｃからなるヘテロダイマーは、ヒトＦＳＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞中でサイクリックＡＭＰの蓄積を刺激した。
【０１９７】
実施例１５：各サブユニット間並びにシステインノット間にジスルフィドを含むｈＣＧ類似体
サブユニット内部ジスルフィドに関与することができる遊離チオールを創製するように各々のサブユニットを修飾することにより、前のジスルフィド架橋ヘテロダイマーを製造した。ここでは、ｈＣＧのβ−サブユニットのみを修飾することによりジスルフィド架橋ｈＣＧ類似体を製造できることを示す。ｈＣＧの結晶構造は、α−サブユニットＣｙｓ３１がβ−サブユニットＴｙｒ３７の近傍に位置して、両方の鎖の側鎖が互いの方に向かっていることを示した。この観察は、以前に、ｈＣＧのα−サブユニット残基３１とβ−サブユニット残基３７の間にサブユニット内ジスルフィド結合を挿入するのに用いられた。ｈＣＧの結晶構造は、α−サブユニット残基Ｃｙｓ７がｈＣＧのβ−サブユニット残基Ａｒｇ６の近傍に位置していることも示す。事実、α−サブユニット残基Ａｒｇ６と３７は、Ａｒｇ６とＴｙｒ３７を変換するように、αＣｙｓ７−αＣｙｓ３１とβＣｙｓ６−βＣｙｓ−３７のサブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマー、αＣｙｓ７−βＣｙｓ６とαＣｙｓ３１−βＣｙｓ３７のサブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマー、あるいはαＣｙｓ７−βＣｙｓ３７とαＣｙｓ３１−βＣｙｓ６サブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマーの形成を促進するかもしれない。コンピューターシミュレーションは、これらのジスルフィド結合の各々が不都合な株を用いずにタンパク質上に形成できたことを示した。複数のジスルフィドの形成は、異なる半減期を有する異性体またはアイソフォームの群を創製するのに有用であるべきである。これらは、特に生物反応が「ジャンプスタート」することを要求される場合に、新規な治療用用途を有するかもしれない。これらを用いる際は、ホルモン応答を開始するために類似体の大きな巨丸剤を投与するはずである。架橋されなかったヘテロダイマーの画分は、架橋したヘテロダイマーの画分よりも早くクリアされることが期待される。結果として、多量の初期注射は応答を開始するのに十分であるが、その活性は応答を維持するために長期間保持される低レベルに散在する。この類似体は、ＰＥＧ化類似体の製造のための中間体として機能することも期待される。システイン残基は唯一の反応性を有し、そしてタンパク質表面上に遊離システインを負荷することがしばしば望まれる。しかしながら、システインの反応性のために、この種のタンパク質は創製するのが難しくなりうる。α−サブユニットＣｙｓ７−Ｃｙｓ３１ジスルフィドが遊離システインを創製する状態に容易に低下されることは知られている。β−サブユニットにおける残基６と３７の間へのシステインの導入は、同様な種類のジスルフィドを創製することが予測される。これらのジスルフィド中のシステインは該タンパク質中の他のシステインよりも活性であることが予測され、特に、それらがジスルフィド交換を促進する位置にあるからである。即ち、本発明者は、残基Ｃｙｓ３７において存在するα−サブユニットシステインとβ−サブユニット残基Ｃｙｓ６において付加されたシステインに、該タンパク質を修飾するはずの試薬を反応させることが可能であると予測する。これらは、該タンパク質をＰＥＧ化できて、その生物半減期を安定化させることができるものを含むことができた。このプロセスにおいて「自由にされた（freed）」システインは、該タンパク質を安定化するはずのサブユニット内ジスルフィドを形成するはずである。この類似体の製造は、ｈＣＧβ’Ｙ３７Ｃとして知られる類似体に第２システインを付加することを必要とした。
【０１９８】
オリゴヌクレオチド１１６１と１１６３（表５）をプライマーとして、そしてｐＣＩ’−ｈＣＧβ’を鋳型として用いるＯＣＲ変異導入により、類似体ｈＣＧβ’をコードする構築物であるｐＭＢ９４０を製造した。オリゴヌクレオチド１１６１はｐＣＩ’ベクター中に位置する配列をはずれて開始し（prime off sequences）、オリゴヌクレオチド１１６３は変異をコードする。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＢａｎＩで消化して、ｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’Ｙ３７Ｃから得たＢａｎＩ−ＢａｍＨＩ断片と連結してｐＣＩ’の大きなＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＭＢ９４１を創製した。ｐＭＢ９４１のコーディング配列のＤＮＡ配列は、ジデオキシ法により確認した。ｐＭＢ９４１は如何に示すアミノ酸配列をコードする：
ｈＣＧβ’Ｒ６Ｃ，Ｙ３７Ｃ：
【０１９９】
【化１】

【０２００】
ｐＭＢ９４０とｐＳＶ２ＮｅｏをＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトして、毒性薬剤Ｇ４１８に対するその耐性により、安定なラインを選択した。培地から回収したタンパク質は、捕獲用の抗α−サブユニットモノクローナル抗体Ａ１１３と検出用の放射性標識抗β−サブユニットモノクローナル抗体Ｂ１１２を用いたサンドイッチイムノアッセイを用いて定量した。このアッセイは、捕獲用培地中にヘテロダイマーの存在を確認した。該ヘテロダイマーの生物活性は、ラットのＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞を用いてサイクリックＡＭＰ蓄積アッセイにおいて測定した。このアッセイの結果を図４６に示す。
【０２０１】
実施例１６：各サブユニットのＮ末端間およびシステインノット間にジスルフィドを含むｈＦＳＨ類似体
前に述べたとおり、複数のジスルフィドの形成は異なる半減期を有するタンパク質の群を創製するのに有用かもしれない。同様な類似体は、濾胞の発生を刺激するための改良されたアプローチを申し出る。サブユニット内ジスルフィドを含まないでかつ架橋されなかったヘテロダイマーの画分は、サブユニット内架橋を含むヘテロダイマーの画分よりも早くクリアされるべきである。結果として、多量の初期注射は応答を開始するのに十分であるが、その活性は長期間保持される低レベルに散在する。これは、濾胞期の間に観察されるＦＳＨ刺激の種類をより密接に模倣するはずであり、そして過剰刺激のチャンスを減じるかもしれない。ｈＦＳＨのβ−サブユニットのＮ末端へのシステインの付加あるいはｈＦＳＨのβ−サブユニットのＮ末端へのｈＣＧのβ−サブユニットアミノ末端の付加はヘテロダイマーおよびサブユニット内架橋の形成を促進するはずであると予測される。実施例１５中の類似体のそれに類似のヘテロダイマーを形成することが期待されるｈＦＳＨのβ−サブユニットは如何に示すアミノ酸配列を有すはずである：
ｈＦＳＨ’βＲ−２Ｃ，Ｙ３１Ｃ：
【０２０２】
【化２】

【０２０３】
実施例１７：実施例１５における類似体と類似のジスルフィド配置を含む有力なｈＦＳＨ活性を有するｈＣＧ類似体
β−サブユニットアミノ酸９４−１１０がそれらのｈＦＳＨ同等物で置換されたｈＣＧ類似体は高いＦＳＨ活性を有する。ｈＣＧのβ−サブユニット残基１０１−１０９に代えてｈＦＳＨのβ−サブユニット残基９５−１０３を含み、そしてβ−サブユニット６と３７においてシステインを含むｈＣＧとｈＦＳＨのキメラは、実施例１５におけるものと同様なジスルフィド配置を形成すると予測される。これらは、高いＦＳＨ活性を有することも期待される。そのような類似体の一つのβ−サブユニットのアミノ酸配列は以下である：
ＣＦＣ９４−１１７βＲ６Ｃ，Ｙ３７Ｃ：
【０２０４】
【化３】

【０２０５】
本発明を今完全に記載することにより、広範囲の均等なパラメーター、濃度、および条件内で、本発明の精神および範囲から逸脱する事なく、そして「過度な実験を必要とせずに同等なものが実施されうることは当業者により理解されることになる。
【０２０６】
本発明は、その特定の態様に関連して記載されてきたが、さらに修飾可能であることは理解されることになる。この出願は、一般的に発明の原理に従い、そして発明が属する分野における公知または習慣的実施の範囲内に生ずるような、そして請求の範囲に従うとおりに前記本質的特徴に適用してよいような、本開示からの変更を含む、発明のあらゆる変更、使用または適合を包含することを意図する。
【０２０７】
雑誌の文献またはアブストラクト、公表されたかまたは対応する米国あるいは他の国の出願または外国の特許出願、発行された米国または外国の特許、またはその他の文献を含む、本明細書にて引用の全ての文献は、引用された文献中に提示された全データ、表、図面およびテキストを含めて引用に本明細書に編入される。さらに、本明細書にて引用された文献の範囲内の引用文献の全内容も、引用により本明細書に編入される。
【０２０８】
公知の方法の工程、慣用の方法の工程、公知の方法または慣用の方法に対する言及は、いかなる方法においても、本発明のあらゆる側面、記載または態様が開示されるか、教示されるか、あるいは関連分野において示唆されるとの承認ではない。特定の態様に関する前の記載は、当業界の範囲の知識を適用することにより（本明細書にて引用された文献を含む）、過度な実験無しに、本発明の一般的概念を逸脱することなく、様々な応用のためにそのような特定の態様を容易に修飾および／または適合させることが可能であるとの発明の一般的性質をそうして完全に明らかにすることになる。よって、そのような適合および修飾は本明細書にの教示およびガイダンスに基づき、開示された態様の均等物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の言葉づかいまたは用語は、記載の目的であって限定ではなく、本明細書の言葉づかいまたは用語は当業者により本明細書の教示およびガイダンスの見地から、当業者の一人の知識と共同して解釈されるべきであると理解される。
【０２０９】
【表１９】

【０２１０】
【表２０】

【０２１１】
【表２１】

【０２１２】
【表２２】

【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ｈＣＧのα−サブユニットの構造（図１Ａ）を、単一文字コードで示したそのアミノ酸配列１２ー７（図１Ｂ）および糖タンパク質ホルモンサブユニット内の構造エレメントの一般的略図（図１Ｃ）と共に、示している。図１Ａに認められるように、システインノットは、サブユニットを３つの大きいループに分ける。ループ１および３を、上部に示す。黒色の線はアミノ酸骨格のＣαを指し、灰色の線は、ジスルフィド結合を指すことに注目されたい。図１Ｂの線は、ジスルフィド結合を示している。表１Ａに列挙したような糖タンパク質ホルモンサブユニットの構造エレメントを、略図の形で図１Ｃに示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ｈＣＧのβ−サブユニットの構造（図２Ａ）を、一文字コードでのそのアミノ酸配列（図２Ｂ）と共に、示している。図２Ａに認められるように、システインノットは、β−サブユニットを３つの大きいループに分ける。ループ２を、上に示す。図右側の小さいループは、シートベルトである。この領域内の正および負にチャージした残基は、それぞれ、ＬＨおよびＴＳＨ活性に重要である。小シートベルトループから下方のβ−サブユニットの残りの部分のβ−サブユニットループ１にこの小さいループを連結する残基は、ＦＳＨおよびＴＳＨレセプターの結合に主に影響する。黒色の線はアミノ酸骨格のＣαを指し、灰色の線は、ジスルフィド結合を指すことに注目されたい。図２Ｂの線は、ジスルフィド結合を示している。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、プラスミドｐＳＶＬ−α、ｐＣＩ−α、ｐＳＶＬ−αＣ７ＳおよびｐＣ７−αＣ７Ｓによってコードされる、α（図３Ａ）およびαＣ７Ｓ（図７Ｂ）の翻訳されたアミノ酸配列を示している。個々の翻訳タンパク質は、同一リーダー配列を持つので、両方共、同一様式でプロセシングされて、９２アミノ酸からなり、ＡＰＤで始まるＮ−末端アミノ酸配列を持つ、タンパク質を作り出すと期待される。この図およびその他の図中に用いられている文字コードは：Ａ、アラニン（Ａｌａ）；Ｃ、システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ、グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ、イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ、リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ、ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ、メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ、アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ、プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ、グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ、アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ、セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ、スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ、バリン（Ｖａｌ）；Ｗ、トリプトファン（Ｔｒｐ）；および、Ｙ、チロシン（Ｔｙｒ）：である。Ｃ７Ｓで示された大文字は、セリンにより置換されたＣｙｓ７の位置を示している。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、プラスミドｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’およびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’Ｃ７Ｓによってコードされた、ｈＣＧβ’（図４Ａ）およびｈＣＧβ’Ｙ３７Ｃ（図４Ｂ）の翻訳されたアミノ酸配列を示している。それぞれは、同一のリーダー配列をもつので、両方とも、同じ様式でプロセシングされ、１４５アミノ酸からなり、ＳＫＥで始まるＮ−末端アミノ酸配列をもつ、タンパク質を作り出すと、予想される。大文字は、システインに変異したＴｙｒ３７の位置を示す。
【図５】図５は、α−サブユニットモノクローナル抗体Ａ１１３およびＡ４０７の結合時における、α−サブユニット内のＣ７Ｓ変異による影響を示している。細胞構造内で調製された組み換えｈＣＧ（ｒｈＣＧ）および下に示した類似体（それぞれ２本の棒グラフで示し、その構造は実施例中に記載されている）を、捕獲抗体としてＢ１１２、そして、検出抗体として１２５Ｉで標識したＡ１１３またはＡ４０７のいずれかを用いたサンドイッチイムノアッセイにかけた。Ｂ１１２は、β−サブユニットのループ３の残基に含まれるエピトープを認識し；Ａ１１３は、α−サブユニットのループ１内の残基に含まれるエピトープを認識し；そして、Ａ４０７はα−サブユニットのＮ−末端およびα−サブユニットのループ１の異なる部分内の残基に含まれるエピトープを認識する。Ａ４０７およびＡ１１３のエピトープは、両方とも同時にｈＣＧと結合することができるので、重複していない。個々の対の右側の棒グラフは、Ｂ１１２／Ａ４０７アッセイを示す。左側の棒グラフーは、Ｂ１１２／Ａ１１３アッセイを示す。ここで認められるように、Ｃ７Ｓの変異は、Ａ１１３の結合よりＡ４０７の結合により大きい影響を持っていた。
【図６】図６は、ｈＣＧ（α３１−β３７）のＬＨレセプターへの結合について示している。この図では、細胞培養で調製されたｒｈＣＧの能力について説明している（上向き三角）。ｈＣＧを尿から精製する（四角）か、または、ｈＣＧ（α３１−β３７）を細胞培養より調製し（下向き三角）、ＬＨレセプターを発現する２００，０００のＣＨＯ細胞への ^１２５Ｉ−ｈＣＧの結合を阻害した。縦座標の値は、インキュベーション終了時に細胞に結合した放射能標識されたｈＣＧの量を示している。このアッセイは、ｈＣＧ（α３１−β３７）が、ｈＣＧと同様にＬＨレセプターに結合することを示している。
【図７】図７は、ｈＣＧ（α３１−β３７）のＬＨレセプターシグナル導入活性を示しており、ｒｈＣＧおよびｈＣＧ（α３１−β３７）がＬＨレセプターを発現する２００，０００のＣＨＯ細胞内へのサイクリックＡＭＰの蓄積を促進することを説明している。ホルモン刺激に応じたサクリックＡＭＰの生産は、シグナル導入の広く認識されたパラメーターである。このアッセイでは、ｈＣＧ（α３１−β３７）が、ｈＣＧと同様にサイクリックＡＭＰの蓄積を刺激することが示された。
【図８】図８は、ｈＣＧおよびサブユニット内ジスルフィド結合を含むｈＣＧ類似体の熱安定性を示している。類似した量のｈＣＧおよびその類似体を、横座標に示す時間、８５゜Ｃにインキュベートした。サンプルを冷却し、抗−ｈＣＧ α−サブユニット抗体Ａ１１３（捕獲用）および ^１２５Ｉで標識した抗−ｈＣＧ β−サブユニット抗体Ｂ１１２（検出用）を用いたサンドイッチイムノアッセイにかけ、残ったヘテロダイマーの量を定量した。縦座標の値は、加熱前の開始時のｈＣＧ量と比較した、このアッセイで残った活性の量を示している。このアッセイは、８５゜ＣではｈＣＧが急速に破壊されるのに対して、架橋された類似体は、少なくとも２０分間その活性を保持していたことを示している。
【図９】図９は、尿素解離に対するｈＣＧおよび架橋類似体の安定性を示している。個々の列の上部に、同定したｒｈＣＧおよび架橋ｈＣＧ類似体への８Ｍ尿素の影響を、示している。８Ｍ尿素でｈＣＧを処理すると、そのサブユニットの解離が促進されることが良く知られており、本明細書でもその知見が確認された。認められるように、８Ｍ尿素で架橋した類似体を処理しても、ヘテロダイマーに相当する結合を失う結果となる、サブユニット解離は促進されなかった。ヘテロダイマーおよび遊離β−サブユニットの位置を図の左側に示している。未処理のおよび尿素処理したサンプルを電気泳動した後、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース上に電気ブロットし、ニトロセルロース表面上の残りの非特異的タンパク質部位をブロックし、そしてダイマーおよび遊離のβ−サブユニットを、 ^１２５Ｉ標識したＢ１０５を用いて検出した。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、プラスミドｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４βおよびｐＳＶＬＣＦＣ１０１−１１４βＹ３７ＣによってコードされたＣＦＣ１０１−１１４β’（図１０Ａ）およびＣＦＣ１０１−１１４β’Ｙ３７Ｃ（図１０Ｂ）の翻訳されたアミノ酸配列を、一文字アミノ酸コードで示している。それぞれは、同一のリーダー配列を持つので、両者は同様にプロセスされ、ＳＫＥで始まるＮ−末端アミノ酸配列を持つ１４５アミノ酸からなるタンパク質を作り出す、と予想される。大文字の位置は、システインに変異したＴｙｒ３７の位置を示している。下線で示した配列は、ｈＦＳＨ β−サブユニットから誘導されている。残基Ａｒｇ９５−Ｓｅｒ９５のコドンは、ＢｇｌII部位を形成し、Ｖａｌ１０２−Ａｒｇ１０３−Ｇｌｙ１０４のコドンは、ＳｓｔII部位を形成する。
【図１１】図１１は、二機能性ｈＣＧ／ｈＦＳＨキメラ類似体へのα−サブユニットモノクローナル抗体Ａ１１３−Ａ４０７の結合に関するα３１−β３７およびα５１−β９９のジスルフィドの影響を示している。ｈＣＧおよびＣＦＣ１０１−１１４類似体（それぞれ対の棒グラフの下に示し、その構造を実施例に記載している）を、捕獲用抗体としてＢ１１２を、検出用抗体として ^１２５Ｉ標識したＡ１１３またはＡ４０７のいずれかを用いたサンドイッチイムノアッセイにかけた。Ｂ１１２は、β−サブユニットのループ３内の残基に含まれるエピトープを認識し；Ａ１１３は、α−サブユニットのループ１内の残基に含まれるエピトープを認識し；そして、Ａ４０７は、α−サブユニットのＮ−末端およびα−サブユニットのループ１の異なる部分内の残基に含まれるエピトープを認識する。Ａ４０７およびＡ１１３に関するエピトープは、両方とも同時にｈＣＧに結合できるため、重複はしていない。それぞれの対の右の棒グラフは、Ｂ１１２／Ａ４０７アッセイを示している。左の棒グラフは、Ｂ１１２／Ａ１１３アッセイを指す。本明細書中に認められるように、α３１−β３７のジスルフィドもα５１−β９９のジスルフィドも、ＣＦＣ１０１−１１４へのＡ４０７の結合活性を回復しなかった。
【図１２】図１２は、ｈＣＧ、ＣＦＣ１０１−１１４、および、サブユニット内ジスルフィド結合を含むＣＦＣ１０１−１１４類似体の熱安定性を示している。ｈＣＧ、ＣＦＣ１０１−１１４およびＣＦＣ１０１−１１４類似体を、横座標に示す時間、８５゜Ｃにインキュベートした。サンプルを冷却し、抗−ｈＣＧ α−サブユニット抗体Ａ１１３（捕獲用）および ^１２５Ｉで標識した抗−ｈＣＧ β−サブユニット抗体Ｂ１１２（検出用）を用いてサンドイッチイムノアッセイにかけ、残ったヘテロダイマーの量を定量した。縦座標の値は、加熱前の開始時のｈＣＧ量と比較した、このアッセイで残った活性の量を示している。このアッセイは、ｈＣＧおよびＣＦＣ１０１−１１４が８５゜Ｃで急速に崩壊するのに対して、架橋された類似体は、実質的に少なくとも２０分間活性が保持された。
【図１３】図１３は、ＬＨレセプターを発現する細胞内のサイクリック−ＡＭＰの蓄積を刺激する、ｈＣＧ、ＣＦＣ１０１−１１４、およびＣＦＣ１０１−１１４類似体の能力を示す。この図は、ＬＨレセプターのシグナル導入を刺激する能力を比較するために設計されたアッセイで、ＣＦＣ１０１−１４４（α３１−β３７）の能力（黒三角）が、少なくともＣＦＣ１０１−１１４の能力（白丸）を同程度であることを説明している。また、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）もまたシグナル導入を刺激したが、その能力は、ＣＦＣ１０１−１１４またはＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）の能力より低かった。従って、α３１−β９９ジスルフィドを調製するに必要な変異と比較して、α３１−β３７ジスルフィドを調製するに必要な変異は、シグナル導入に影響を与えなかった。シートベルトは、レセプター結合特異性に影響を与えることが良く知られている。従って、この図のデータは、レセプター接触または結合特異性にかかわらないと考えられるホルモン領域内へのジスルフィド導入は、レセプター結合またはシグナル導入に最少の影響しか与えないであろうと言う考えを指示する。従って、レセプターと接触しない、および／またはレセプター結合の特異性を構築しないホルモンの領域は、ジスルフィド結合架橋ヘテロダイマーを調製するための好ましい部位となる。
【図１４】図１４は、ＦＳＨレセプターを発現する細胞内へのサイクリック−ＡＭＰの蓄積を刺激する、ｈＦＳＨ、ＣＦＣ１０１−１１４、およびＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）の能力を示している。この図は、ＦＳＨレセプターシグナル導入を刺激する能力を比較するために設計されたアッセイでは、ＣＦＣ１０１−１１４（α３１−β３７）（黒三角）への応答最大の半値は、ＣＦＣ１０１−１１４（白丸）のそれと類似していることを示している。従って、α５１−β９９ジスルフィドの調製に必要な変異に対して、α３１−β３７ジスルフィドを調製するのに必要な変異は、ＦＳＨ−誘導シグナル導入に最少の影響しか持たなかった。シートベルトは、レセプター結合特異性に影響を与えることが良く知られている。従って、この図のデータは、レセプター接触または結合特異性にかかわらないと考えられるホルモン領域内へのジスルフィド導入は、ＦＳＨのレセプター結合またはシグナル導入に最少の影響しか持たないであろうと言う考えを指示する。従って、レセプターと接触しない、および／またはレセプター結合の特異性を構築しないホルモンの領域は、ジスルフィド結合架橋ヘテロダイマーを調製するための好ましい部位であろう。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、プラスミドｐＳＶＬ−αＫ５１ＣおよびｐＳＶＬ−ｈＣＧβ’Ｄ９９Ｃによってコードされた、αＫＳＩＣ（図１５Ａ）およびｈＣＧβＤ９９Ｃ（図１５Ｂ）の翻訳されたアミノ酸配列を示している。タンパク質の基になる個々のｈＣＧ α−サブユニットおよびタンパク質の基になる個々のｈＣＧ β−サブユニットは、ｈＣＧのα−およびβ−サブユニットと同一のシグナルペプチドを持つので、それらは、同じ方式でプロセシングされると予想される。従って、αＫ５１Ｃは、Ｎ−末端配列ＡＰＤを含む９２のアミノ酸残基を含むと予想され、ｈＣＧβ’Ｄ９９Ｃは、Ｎ−末端配列ＳＫＥを含む１４５アミノ酸残基を含むと予想される。本明細書中に用いた一文字アミノ酸コードは、図３Ａおよび３Ｂの説明で定義している。大文字は、サブユニット内ジスルフィド結合を形成するために作られた変異の位置を示している。
【図１６】図１６は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への放射能標識ｈＣＧの結合を阻害する、ｈＣＧの能力を実線の丸で、ｈＣＧ（α５１−β９９）の能力を破線の上向き三角で、比較提示している。
【図１７】図１７は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への放射能標識ｈＣＧの結合を阻害する、ｈＣＧの能力を実線の四角で、ｈＣＧ（α−βＤ９９Ｃ）を破線の下向き三角で、ｈＣＧ（α５１−β９９）を破線の上向き三角で；そしてｈＣＧ（αＫ５１ｃ−β）を破線の菱形で、比較提示している。
【図１８】図１８は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞との結合について、放射能標識したｈＣＧと競合する、ｈＣＧの能力を実線の丸で、ｈＣＧ（αＫ５１Ａ−β）を破線の下向き三角で、比較提示している。
【図１９】図１９は、ｈＣＧのＬＨレセプターシグナル導入活性を実線の丸で、ｈＣＧ（α５１−β９９）のそれを破線の白の四角で、ｈＣＧ（α−βＤ９９Ｃ）を破線の上向き三角で；ｈＣＧ（αＫ５１Ｃ−β）を破線の丸で、比較提示している。
【図２０】図２０は、ｈＣＧのＬＨレセプターシグナル導入活性を実線の丸で；そしてｈＣＧ（αＫ５１Ａ−β）を破線の白四角で、比較提示している。
【図２１】図２１は、プラスミドｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β’Ｄ９９Ｃによってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示している。この翻訳されたタンパク質は、ｈＣＧ β−サブユニットと同じシグナル配列を持つので、同じ様式でプロセシングされ、Ｎ−末端アミノ酸配列ＳＫＥを持つ１４５アミノ酸からなる分泌タンパク質に導かれると予想される。大文字は、ジスルフィド結合を誘導するために作られた変異の位置を示す。
【図２２】図２２は、ＬＨレセプターと結合するｈＣＧの比活性を実線で、ＣＦＣ１０１−１１４のそれを破線の上向き三角で、ＣＦＣ１０１−１１４（α５１−β９９）を破線の下向き三角で、ＣＦＣ１０１−１１４（α−βＤ９９Ｃ）を破線の黒の菱形で、そしてＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）を破線の白の菱形で、比較提示している。
【図２３】図２３は、ＬＨレセプターと結合するｒｈＣＧの比活性を実線の四角で；ＣＦＣ１０１−１１４のそれを破線の上向き三角で；ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ａ−β）を破線の丸で、比較提示している。
【図２４】図２４は、ｈＣＧのＬＨレセプターシグナル導入の比活性を実線の黒丸で；ＣＦＣ１０１−１１４を破線の白四角で；ＣＦＣ１０１−１１４（α−βＤ９９Ｃ）を破線の菱形で；ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−βＤ９９Ｃ）を独立した点×で；そしてＣＲＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）を横座標に最も接近した線で；比較提示している。
【図２５】図２５は、ｒｈＣＧのＬＨレセプターシグナル導入活性を実線の丸で；そして、ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ａ−β）を破線の上向き三角で；比較提示している。
【図２６】図２６は、ｈＦＳＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への ^１２５Ｉ−ｈＦＳＨの結合を阻害する、ｈＦＳＨの能力を実線の丸で；ＣＦＣ１０１−１１４を破線の四角で；ＣＦＣ１０１−１１４（α−βＤ９９Ｃ）を破線の上向き三角で；ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−βＤ９９Ｃ）を実線の下向き三角で；ＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）を実線の白のシンボルで、比較提示している。
【図２７】図２７は、ｈＦＳＨレセプターを持つＣＨＯ細胞へのシグナル導入を刺激する、ｈＦＳＨの能力を実線の丸で、ＣＦＣ１０１−１１４を破線の白のシンボルで、比較提示している。ＣＦＣ１０１（α５１−β９９）、ＣＦＣ１０１−１１４（α−βＤ９９Ｃ）およびＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ｃ−β）のシグナル導入活性は、用いた類似体の濃度では低すぎて検出できなかった。
【図２８】図２８は、ｈＦＳＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞内へのシグナル導入を刺激する、ｈＦＳＨの能力を実線の丸で、ＣＦＣ１０１−１１４のそれを破線の白四角で、そしてＣＦＣ１０１−１１４（αＫ５１Ａ−β）を破線の上向き三角で、比較提示している。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、αＣ７Ｓ、Ｋ５１Ｃ（図２９Ａ）およびｈＣＧβ’Ｙ３７Ｃ、Ｄ９９Ｃ（図２９Ｂ）のアミノ酸配列を、小文字の一文字アミノ酸コードで、示している。Ｃｙｓ７と置き換えた図２９Ａのセリン、およびＴｙｒ３７およびＡｓｐ９９と置き換えた図２９Ｂのシステインを、大文字で示している。
【図３０】図３０は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞への ^１２５Ｉ−ｈＣＧの結合を阻害する、ｈＣＧの能力を実線の白のシンボルで、ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−β９９）を破線の黒のシンボルで、示している。
【図３１】図３１は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞内へのシグナル導入を刺激する、ｈＣＧの能力を実線の下向き三角で、ｈＣＧ（α３１−β３７、α５１−９９）を実線の丸で、示している。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨ、およびα−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン間ノットジスルフィドによって安定化されたｈＴＳＨ類似体の調製に有益であると予想されるα−サブユニット類似体である、αＣ２７Ａのアミノ酸配列（図３２Ａ）、ならびに、α−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン間ノットジスルフィドによって安定化されたｈＦＳＨの調製に有効であると予想させるβ−サブユニット類似体である、ｈＦＳＨβＹ３１Ｃのアミノ酸配列（図３２Ｂ）を示している。 この図では、α−サブユニット類似体およびｈＦＳＨ β−サブユニット類似体のアミノ酸配列を、小文字の一文字アミノ酸コードで、示している。α−サブユニット内のＣｙｓ７のアラニンによる置換は、αＣ７Ａアミノ酸配列内に大文字で示しているが、実施例１および２で説明したようなＣｙｓ７のセリンによる置換と同じ影響を持つと予想されるであろう。また、ｈＦＳＨβＹ３１Ｃ配列内の３１位のシステイン残基の存在も大文字で示されている。このＦＳＨ β−サブユニット類似体およびαＣ７ＡまたはαＣ７Ｓとして以前同定されたα−サブユニット類似体を発現する細胞は、ＦＳＨ活性を持つジスルフィド架橋されたヘテロダイマータンパク質を分泌すると期待されるであろう。ｈＦＳＨβＹ３１Ｃのこのシグナル配列は、ｈＦＳＨ β−サブユニットのそれと同一であり、それ故、ｈＦＳＨ β−サブユニットと同様にプロセシングされると期待される。従って、そのＮ−末端配列は、ＮＳＣであろう。
【図３３】図３３は、糖タンパク質ホルモン類似体を調製する遺伝子コードを示している。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨ、ならびに、α−サブユニットとβ−サブユニットのＮ−末端部分の間をサブユニット内ジスルフィドによって安定化したｈＴＳＨ類似体、の調製に有用であると期待されるα−サブユニット類似体である、αＱ５Ｃのアミノ酸配列（図３４Ａ）、ならびに、α−サブユニットとβ−サブユニットのＮ−末端部分の間をサブユニット内ジスルフィドによって安定化したｈＣＧ類似体の調製に有用であると期待されるβ−サブユニット類似体である、ｈＣＧβＲ８Ｃのアミノ酸配列（図３４ｂ）を、示している。この図は、α−サブユニット類似体およびｈＣＧ β−サブユニット類似体の類似体のコード配列を示しており、これらは、同時発現した場合、ＬＨ活性を持つジスルフィド架橋ホルモン類似体を形成すると期待されるであろう。タンパク質のアミノ酸配列およびそれらのシグナル配列を、一文字コードで示している。大文字は、サブユニット内ジスルフィドを形成するのに必要な変異の位置を示している。
【図３５】図３５は、α−サブユニットとβ−サブユニットのＮ−末端部分の間のサブユニット内ジスルフィドによって安定化したｈＦＳＨ類似体を調製するために有用であると期待されるｈＦＳＨ β−サブユニット類似体であり、Ｓｅｒ２がシステインに変換された、ｈＦＳＨβ５２Ｃのアミノ酸配列を示している。αＱ５Ｃ（前記）およびｈＦＳＨβＳ２Ｃを同時発現する細胞は、実質的なＦＳＨ活性を持つジスルフィド架橋ヘテロダイマーを生成すると期待されるであろう。
【図３６】図３６は、α−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン間ノットジスルフィドによって安定化されたｈＬＨ類似体を調製するために有用であると期待されるβ−サブユニット類似体である、ｈＬＨβＹ３７Ｃのアミノ酸配列を、小文字の一文字アミノ酸コードで、示している。３７位のシステイン残基の存在を、大文字で示している。以前、αＣ７ＳまたはαＣ７Ａとして同定された、このＬＨ β−サブユニット類似体およびα−サブユニット類似体を発現する細胞は、ＬＨ活性を持つジスルフィド架橋ヘテロダイマータンパク質を分泌すると期待されるであろう。ｈＬＨβＹ３１Ｃのこのシグナル配列は、ｈＬＨ β−サブユニットのそれと同一であり、それ故、ｈＬＨ β−サブユニットと同様にプロセシングされると予想される。従って、そのＮ−末端配列は、ＳＲＥであろう。
【図３７】図３７は、α−サブユニットとβ−サブユニットのＮ−末端部分の間のサブユニット内ジスルフィドによって安定化されるｈＬＨ類似体の調製に有用であると予想されるβ−サブユニット類似体であり、Ｔｒｐ８がシステインに変換されている、る、ｈＬＨβＷ８Ｃのアミノ酸配列を示している。αＱ５Ｃ（前記）およびｈＬＨβＷ８Ｃを同時発現する細胞は、実質的にＬＨ活性を持つジスルフィド架橋したヘテロダイマーを生成すると期待されるであろう。
【図３８】図３８は、α−サブユニットとβ−サブユニットの間のシステイン間ノットジスルフィドによって安定化されるｈＴＳＨ類似体の調製に有用であると期待されるβ−サブユニット類似体である、ｈＴＳＨβＹ３０Ｃのアミノ酸配列を、小文字の一文字アミノ酸コードで示している。３０位のシステイン残基の存在を大文字で示している。このＴＳＨ β−サブユニット類似体および以前にαＣ７ｓまたはαＣ７Ａとして同定されたα−サブユニット類似体を発現する細胞は、ＴＳＨ活性を持つジスルフィド架橋ヘテロダイマータンパク質を分泌すると期待されるであろう。ｈＴＳＨβＹ３１Ｃのシグナル配列は、ｈＴＳＨ β−サブユニットのそれと同一であり、それ故、ｈＴＳＨ β−サブユニットと同様にプロセシングされると予想される。従って、そのＮ−末端配列は、ＦＣＩであろう。
【図３９】図３９は、α−サブユニットとβ−サブユニットのＮ−末端部分の間のサブユニット内ジスルフィドによって安定化されるｈＴＳＨ類似体の調製に有用であろうと期待されるβ−サブユニット類似体であり、Ｐｈｅ１をシステインに変換した、ｈＴＳＨβＦ１Ｃのアミノ酸配列を示している。αＱ５Ｃ（前記）およびｈＴＳＨβＦ１Ｃを同時発現する細胞は、実質的なＴＳＨ活性を持つジスルフィドヘテロダイマーを生成すると予想されるであろう。
【図４０】図４０は、αＣ７Ｓコドンの構築について、略図で示している。
【図４１】図４１は、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１１４β’の構築について、略図で示している。
【図４２】図４２は、ｐＳＶＬ−ＣＶＣ９４−１１４β’の構築について、略図で示している。
【図４３】図４３は、ｐＳＶＬ−ＣＦＣ１０１−１０６β’の構築について、略図で示している。
【図４４】図４４は、ｐＳＶＬ−αＫ５１Ｃの構築について、略図で示している。
【図４５】図４５は、ヒトＦＳＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞内のサイクリック−ＡＭＰの蓄積を刺激する、ｈＦＳＨとその類似体、αＶ７６Ｃ＋ｈＦＳＨβＶ３８Ｃ、の能力を示している。
【図４６】図４６は、ＬＨレセプターを発現するＣＨＯ細胞内のサイクリック−ＡＭＰの蓄積を刺激する、ｈＣＧとその類似体、α＋ｈＣＧβＲ６Ｃ、Ｙ３７Ｃ、の能力を示している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、ヒト黄体形成ホルモン(ｈＬＨ)、ヒト卵胞刺激ホルモン(ｈＦＳＨ)、ヒト甲状腺刺激ホルモン(ｈＴＳＨ)、およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される糖タンパク質ホルモンであって、上記糖タンパク質ホルモンのサブユニットのアミノ酸配列が修飾されることにより、α−サブユニットのシステインノット内に位置するシステイン残基とβ−サブユニットのシステインノット内に位置するシステイン残基の間にサブユニット間ジスルフィド結合を創製し、安定性の改良のために、相当する天然糖タンパク質ホルモンレセプターに対しての生物活性の少なくとも一部を保持する上記糖タンパク質ホルモン。
【請求項２】
サブユニット間ジスルフィド結合が天然システイン残基と修飾されてシステイン残基になる残基の間である、請求項１記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項３】
サブユニット間ジスルフィド結合がα−サブユニットの天然システイン残基と修飾されてシステイン残基になるβ−サブユニットの残基の間である、請求項２記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項４】
β−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Ｔｙｒ３７をシステインで置換することにより、α−サブユニットの天然Ｃｙｓ３１残基と修飾されてシステイン残基になるβ−サブユニットの残基３７の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する、請求項３記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項５】
ｈＣＧの類似体、ｈＬＨの類似体、およびそれらの機能性変異タンパク質からなる群から選択される、請求項４記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項６】
ｈＦＳＨのβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Ｔｙｒ３７をシステインで置換することにより、α−サブユニットの天然Ｃｙｓ３１残基と修飾されてシステイン残基になるｈＦＳＨのβ−サブユニットの残基３１の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する、請求項３記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項７】
ｈＴＳＨのβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Ｔｙｒ３０をシステインで置換することにより、α−サブユニットの天然Ｃｙｓ３１残基と修飾されてシステイン残基になるｈＴＳＨのβ−サブユニットの残基３０の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する、請求項３記載の糖タンパク質ホルモン。
【請求項８】
α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、ヒト黄体形成ホルモン(ｈＬＨ)、ヒト卵胞刺激ホルモン(ｈＦＳＨ)、ヒト甲状腺刺激ホルモン(ｈＴＳＨ)、およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される糖タンパク質ホルモンであって、上記糖タンパク質ホルモンのサブユニットのアミノ酸配列が修飾されることにより、α−サブユニットのループ３とβ−サブユニットのループ２の間にサブユニット間ジスルフィド結合を創製し、安定性の改良のために、相当する天然糖タンパク質ホルモンレセプターに対しての生物活性の少なくとも一部を保持する上記糖タンパク質ホルモン。
【請求項９】
α−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、Ｖａ１７６をシステインで置換し、そしてｈＦＳＨβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、Ｖａ１３８をシステインで置換することにより、α−サブユニットの残基７６とｈＦＳＨβ−サブユニットの残基の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する、請求項８記載の糖タンパク質ホルモン。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【公開番号】特開２００７−１６０４０（Ｐ２００７−１６０４０Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２２５８１（Ｐ２００６−２２２５８１）
【出願日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【分割の表示】特願平１１−５０５０００の分割
【原出願日】平成１０年６月２５日（１９９８．６．２５）
【出願人】（５９５１５８４０７）アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＲＳ　Ｈｏｌｄｉｎｇ　Ｎ．Ｖ．
【Ｆターム（参考）】