ストレス性非炎症性大腸透過性亢進改善剤の評価又は選択方法
【課題】ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法の提供。
【解決手段】マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【解決手段】マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸は、消化器系の下流に位置し、発酵・吸収機能、運動機能、知覚機能、防御機能を有している。なかでも、防御機能は、有害な腸内細菌代謝産物を生体内から排出する重要な機能であるが、近年、ストレスや食生活の乱れが原因と考えられる機能異常、すなわち大腸透過性の亢進が認められている。
大腸の管腔内には、２次胆汁酸、インドール、スカトール、クレゾール、ヒスタミン等の様々な有害物質が存在している。大腸透過性が亢進すると、これらの有害物質が、粘膜上皮及び全身組織に接近可能となる。
【０００３】
ストレス性の大腸透過性亢進と具体的な疾患との関係は明かではないが、例えば、クローン病患者では、消化管の透過性が亢進していることが報告されている（非特許文献１）。
また、腸内有害物質の２次胆汁酸、インドールは、腫瘍形成に関与しているとの報告がある（非特許文献２、３）。また、ラットにおいて、２次胆汁酸の一つであるデオキシコール酸は、結腸の炎症を促進させることが報告されている（非特許文献４）。
従って、ストレスにより発生する大腸透過性亢進に対する予防・治療剤として、有効性が高くかつ、安全性の高い薬剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、マスト細胞（肥満細胞）は粘膜下組織や皮膚などの結合組織、粘膜内に存在する造血幹細胞由来の細胞で、細胞内にヒスタミンやセロトニン等の炎症性ケミカルメディエーターを含む顆粒を持つ。これらの顆粒が免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）とそれに対する抗原刺激やｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ刺激等で放出されると、血管透過性の亢進、局所への免疫細胞の集積と活性化、発熱などの一連の生体防御反応が惹起され、体内に侵入した異物が排除される。一方、その無秩序な活性化は、喘息、アレルギーをはじめとする様々な疾患の一因と考えられている。このようにマスト細胞は、炎症や免疫反応などの生体防御機構に重要な役割を持つ細胞である。
【０００５】
マスト細胞を安定化させるｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与により、急性の強いストレス負荷後３日後に起こる大腸透過性亢進が改善されることが報告されている。しかし、この報告では、ストレス負荷後３日後に起こる大腸透過性亢進は炎症を伴うものであると考えており、炎症性の大腸透過性亢進が改善されたと見ることができる（非特許文献５）。
このように、マスト細胞と、ストレス負荷後数時間後に起こる炎症を伴わない大腸透過性亢進との関連性についてはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ．１９９３；３４１：１４３７−１４３９
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８１；４１：３７５９−３７６０
【非特許文献３】Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００５；２７：１３９１−１３９９
【非特許文献４】Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．２００６；１２：２７８−２９３
【非特許文献５】Ｇｕｔ．２００６；５５：６５５−６６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ストレスが大腸機能に与える影響について検討したところ、大腸内のマスト細胞がストレス負荷後数時間後に起こる炎症を伴わない大腸透過性亢進に関与していることを見出した。そしてさらに検討した結果、マスト細胞の安定化作用を指標として、ストレス負荷後数時間後に起こる非炎症性の大腸透過性亢進を予防・改善できる物質の評価又は選択が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
また、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、各種物質の、ストレス負荷による非炎症性大腸透過性亢進に対する効果をより正確に評価することができ、優れたストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の選択が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ストレス性非炎症性大腸透過性亢進は、身体的あるいは精神的に与えられたストレスによってストレス負荷後数時間後に惹起される非炎症性の大腸透過性亢進であり、ストレス付加後数日後に惹起される炎症を伴う透過性亢進とは区別される概念である。
ここで、潰瘍性大腸炎等粘膜の炎症を伴う腸炎では、タイトジャンクションの障害、上皮の損傷が起こり、透過性が亢進することが知られている（Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ ２００９；１５：１００−１１３．）。一方で、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ＩＢＳ）、機能性下痢等、消化管に炎症等の器質的な異常が認められないにもかかわらず、腹痛あるいは腹部不快感と便秘・下痢等の便通異常が関連しながら一定期間持続する下部消化管の機能的疾患がある。該疾患は、ストレスの関与が大きいと考えられており、ストレスが増悪させることも報告されている（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄ．２００４；９５：４４３−４５０．、Ｇｕｔ ２００４；５３：１１０２−１１０８．、Ｃｕｒｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｐ．２００４；６：２１０−２１５．）。また、このＩＢＳ患者においても、消化管の透過性が亢進していることが報告されている（Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００４；２０：１３１７−１３２２．）。従って、これらのことから、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進は、炎症性の透過性亢進と異なったメカニズムによるものであると考えられる。
【００１２】
これに対し、本発明者は、マスト細胞が欠損したモデルラットであるＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓラットではストレス負荷による大腸機能異常が認められず、大腸透過性が亢進されないこと、さらに、マスト細胞安定化剤であるｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅの投与によりストレス負荷後数時間後に生じる非炎症性の大腸透過性亢進が改善されたことから、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進にマスト細胞が関与している可能性を見出した。すなわち、マスト細胞の安定化とストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の改善には正の相関関係があることが判明した。
従って、各種物質のストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果をマスト細胞の安定化作用を指標として評価でき、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を選択できると考えられる。
【００１３】
本発明方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことも、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。
本発明において、マスト細胞の安定化作用は、例えばマスト細胞の脱顆粒の程度を測定することで評価できる。脱顆粒の程度の測定は、特に制限はなく、常法に従って、例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性又はプロテアーゼ活性を測定するか、マスト細胞から放出されるケミカルメディエーター量を測定することにより行うことができる。ここで、ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンＤ２、ロイコトリエンＢ４等が挙げられ、特に、簡便に測定できるという点から、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定又は、ヒスタミン若しくはセロトニン量の測定が好ましい。
【００１４】
本発明方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う場合は、具体的には以下の工程Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００１５】
本発明において、マスト細胞としては、例えば、培養細胞株であるラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）、血液や組織から直接分離したもの等が挙げられる。マスト細胞は、培養細胞株、正常細胞の他、造血幹細胞等から分化誘導したものであってもよい。
また、腸管組織としては、哺乳動物由来の十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、マスト細胞又は腸管組織と被験物質及び脱顆粒促進剤との接触は、例えば、細胞又は組織が載置された培養液に、被験物質及び脱顆粒促進剤を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。脱顆粒促進剤は、先に被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させて適宜インキュベートした後、接触させるのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させた後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに脱顆粒促進剤と接触させるのが好ましい。
被験物質及び脱顆粒促進剤の接触後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに、培養上清を回収しマスト細胞の脱顆粒の程度を測定するのが好ましい。
【００１７】
マスト細胞の播種時の濃度は、評価可能な濃度であれば特に限定されない。マスト細胞の播種時の濃度は、２４ｗｅｌｌプレートを使用した場合、０．５×１０3〜３．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、特に０．５×１０4〜１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましい。また、腸管組織の量は、評価可能な量であれば特に限定されない。
【００１８】
被験物質としては、特に限定されず、例えば動植物抽出物、化合物、化学物質等を用いることができる。被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に０．０００１〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。
【００１９】
また、脱顆粒促進剤としては、顆粒放出を促すものであれば特に制限されないが、例えば、抗原（ジニトロフェノール等）、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ等が挙げられる。脱顆粒促進剤の添加濃度は抗原（ジニトロフェノール等）:０．０１〜５０００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０ :０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ:０．０１〜１００００μＭとするのが好ましく、特に抗原（ジニトロフェノール等）:０．１〜５００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０:０．１〜１００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ:０．１〜１０００μＭとするのが好ましい。
【００２０】
マスト細胞を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
腸管組織を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。これらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
【００２１】
本発明において、マスト細胞の脱顆粒の程度は、培養後上清を回収し、常法に従って、β−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量等を測定することによって測定できる。例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、酵素反応により発色する基質を用いた酵素反応を行うことにより行うことができる。また、ヒスタミン、セロトニンなどのケミカルメディエーターの測定は、ｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｒｏｍｅｔｒｉｃ法（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９５９；１２７：１８２−１８６）、或いはＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応により行うことができる。
【００２２】
本発明方法をｉｎ ｖｉｖｏで行う場合、
具体的には以下の工程Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００２３】
本発明方法に用いられる非ヒト哺乳動物としては、性別、月齢を問わず、いかなる種類の動物でもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ又はサルを挙げることができるが、入手が容易であり、取り扱い易いラットやマウスなどのげっ歯類が好ましい。
【００２４】
当該非ヒト哺乳動物への被験物質及び脱顆粒促進剤の投与方法としては、例えば、経口投与、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等が挙げられるが、簡便さや侵襲性が低いなどの点から、経口投与する方法が好ましい。
【００２５】
被験物質の投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。また、脱顆粒促進剤の投与量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は通常１回であるが、間隔をあけて数回に分けて投与してもよい。脱顆粒促進剤は、非ヒト哺乳動物へ被験物質を投与後、適宜飼育した後投与するのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。脱顆粒促進剤の投与は、被験物質を投与後１０〜２４０分とするのが好ましく、特に３０〜１２０分とするのが好ましい。
【００２６】
次いで、被験物質及び脱顆粒促進剤の投与１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分後に、非ヒト哺乳動物から腹腔細胞或いは腸管組織を採取し、培養液或いは緩衝液中に１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分、インキュベートした後、回収した上清中に含まれるβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定できる。脱顆粒の程度の測定方法としては、上記と同様の方法が挙げられる。また、非ヒト哺乳動物から採取した血液中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定することもできる（Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；６４：４５−５２）。
【００２７】
ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価は、被験物質と接触させたマスト細胞における脱顆粒の程度を、被験物質に接触させない対照群（対照細胞又は組織）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
【００２８】
また、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物から採取した腹腔細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を、被験物質を投与しない対照群（対照動物）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
評価に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して評価することが好ましい。
【００２９】
このようにして評価又は選択された物質は、ストレスによる非炎症性大腸透過性亢進を予防及び／又は改善するための医薬、食品等に有効成分として配合して使用するための素材となり得る。
【実施例】
【００３０】
実施例１
＜ストレスが血中成分に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（げっ歯類飼育繁殖用、日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように４群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。２群は自由摂食下で、２群は絶食下で２０時間飼育した。
自由摂食群、絶食群各１群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した（部分拘束ストレス、ストレス群）。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。対照群は、自由摂食群、絶食群各１群をイソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
ストレス負荷終了直後、麻酔下で腹部大動脈より全採血し、血中ヒスタミン、セロトニン、（ＥＬＩＳＡ法：Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ＥＬＩＳＡ；ＤＲＧ）、ＣＲＦ量（ＥＬＩＳＡ法：Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＣＲＦ−ＨＳ＿ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、矢内原研究所）、血中サイトカイン量（ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１３，ＴＮＦ−α）（マイクロビーズアレイ: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をそれぞれ定量した。
【００３１】
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝３匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。ストレス負荷終了直後、麻酔下にて腹部大動脈からの全採血により安楽死させた後、結腸7区画（盲結腸移行部より１ｃｍ下流から１ｃｍ長に７分割）を摘出後、各区画を０．５ ｍＬ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ/Ｒｉｎｇｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ(６０μＭ)中で６０分間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により結腸組織からのヒスタミン放出量を定量した。
【００３２】
２．結果
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１３量が絶食時、非絶食時共に高い傾向であった（表１）。絶食時の血中ＩＬ−１，ＩＬ−２量は、ストレス負荷群で低い傾向であった。その他のサイトカイン及びＣＲＦ量は、両群で差がなかった。
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ヒスタミン量（表２）は有意に高く、血中セロトニン量は増加傾向であったが有意差はなかった（表２）。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ刺激による摘出結腸からのヒスタミン放出量が有意に高かった（表３）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
実施例２
＜ストレスが大腸透過性に与える影響解析＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝１２匹/群）した。ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置後、直ちに大腸透過性を既報の方法（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９４；２９：３８−４６．）を参考に評価した。すなわち、イソフルラン吸入麻酔下、両端を結紮した結腸管腔内にエバンスブルー（ＥＢ）／ＰＢＳ（１ｍＬ）を注入した。１時間後、血液、近位結腸、遠位結腸を採取した。結腸２ｃｍ長を６ｍＭ ＮＡＣ／ＰＢＳで洗浄後（３回）、４ｍＬホルムアミドに２４時間浸漬し、結腸粘膜内のＥＢ量を測定した（Ｏ．Ｄ．５９５ｎｍ）。対照群は、イソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、同様の処置を行い、大腸の透過性を評価した。
【００３７】
一方、２０時間絶食させた雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（１０−１２週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本ＳＬＣ）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝７−８匹/群、平均体重２４０ｇ）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、上記と同様の処置を行い、それぞれ大腸の透過性を評価した。
【００３８】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に多かった（表４）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に多かった（表５）。このストレス負荷による遠位結腸の透過性の亢進は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった（表５）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔまたはＦｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
実施例３
＜ストレス性非炎症性大腸透過性亢進に対するマスト細胞安定化剤の影響＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝１１−１２匹/群）した。
マスト細胞安定化剤投与群は、イソフルラン吸入麻酔下、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ，メチルセルロース溶液に懸濁）を胃内投与（５ｍｇ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。対照群には、メチルセルロース０．５ ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、実施例２と同様の方法で大腸透過性を評価した。
【００４２】
２．結果
Ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与ラットでは、対照群（メチルセルロース投与）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に少なかった(表６)。
以上より、ストレスによって引き起こされる非炎症性大腸透過性亢進がマスト細胞の安定化によって改善されることが確認された。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊ｐ＜０．０５）。
【００４３】
【表６】
【００４４】
以上の結果より、マスト細胞の安定化がストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の改善に奇与しているものと考えられた。
【００４５】
実施例４
＜マスト細胞安定化剤のスクリーニング＞
１．方法
ラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖させた後、２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を７×１０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝４）となるように播き、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０（０〜５０μg／ｍＬ フェノールレッド、血清、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地）で１５分間インキュベートした。
また、同様に、ＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）を含むＲＰＭＩ培地で室温で３０分間インキュベートした後、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）＋５０μｇ／ｍＬ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質不含）で室温で１５分間インキュベートした。
各ｗｅｌｌより培養上清を３０μＬずつ、次に各ｗｅｌｌに５００μＬの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えて細胞を溶解させ３０μＬずつを採取した。これにβ−ヘキソサミニダーゼの基質である２ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含む０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３０μＬを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１５０μＬ １Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９．０）で停止後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞内外のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ分泌（脱顆粒）（Ｏ．Ｄ．上清/(Ｏ．Ｄ．上清＋Ｏ．Ｄ．細胞溶解液)×１００(％)）を算出した。
【００４６】
２．結果
ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０は濃度依存的に脱顆粒を促進した（表７）。ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅは濃度依存的に脱顆粒を抑制した（表８）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸は、消化器系の下流に位置し、発酵・吸収機能、運動機能、知覚機能、防御機能を有している。なかでも、防御機能は、有害な腸内細菌代謝産物を生体内から排出する重要な機能であるが、近年、ストレスや食生活の乱れが原因と考えられる機能異常、すなわち大腸透過性の亢進が認められている。
大腸の管腔内には、２次胆汁酸、インドール、スカトール、クレゾール、ヒスタミン等の様々な有害物質が存在している。大腸透過性が亢進すると、これらの有害物質が、粘膜上皮及び全身組織に接近可能となる。
【０００３】
ストレス性の大腸透過性亢進と具体的な疾患との関係は明かではないが、例えば、クローン病患者では、消化管の透過性が亢進していることが報告されている（非特許文献１）。
また、腸内有害物質の２次胆汁酸、インドールは、腫瘍形成に関与しているとの報告がある（非特許文献２、３）。また、ラットにおいて、２次胆汁酸の一つであるデオキシコール酸は、結腸の炎症を促進させることが報告されている（非特許文献４）。
従って、ストレスにより発生する大腸透過性亢進に対する予防・治療剤として、有効性が高くかつ、安全性の高い薬剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、マスト細胞（肥満細胞）は粘膜下組織や皮膚などの結合組織、粘膜内に存在する造血幹細胞由来の細胞で、細胞内にヒスタミンやセロトニン等の炎症性ケミカルメディエーターを含む顆粒を持つ。これらの顆粒が免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）とそれに対する抗原刺激やｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ刺激等で放出されると、血管透過性の亢進、局所への免疫細胞の集積と活性化、発熱などの一連の生体防御反応が惹起され、体内に侵入した異物が排除される。一方、その無秩序な活性化は、喘息、アレルギーをはじめとする様々な疾患の一因と考えられている。このようにマスト細胞は、炎症や免疫反応などの生体防御機構に重要な役割を持つ細胞である。
【０００５】
マスト細胞を安定化させるｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与により、急性の強いストレス負荷後３日後に起こる大腸透過性亢進が改善されることが報告されている。しかし、この報告では、ストレス負荷後３日後に起こる大腸透過性亢進は炎症を伴うものであると考えており、炎症性の大腸透過性亢進が改善されたと見ることができる（非特許文献５）。
このように、マスト細胞と、ストレス負荷後数時間後に起こる炎症を伴わない大腸透過性亢進との関連性についてはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ．１９９３；３４１：１４３７−１４３９
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８１；４１：３７５９−３７６０
【非特許文献３】Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００５；２７：１３９１−１３９９
【非特許文献４】Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．２００６；１２：２７８−２９３
【非特許文献５】Ｇｕｔ．２００６；５５：６５５−６６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ストレスが大腸機能に与える影響について検討したところ、大腸内のマスト細胞がストレス負荷後数時間後に起こる炎症を伴わない大腸透過性亢進に関与していることを見出した。そしてさらに検討した結果、マスト細胞の安定化作用を指標として、ストレス負荷後数時間後に起こる非炎症性の大腸透過性亢進を予防・改善できる物質の評価又は選択が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
また、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、各種物質の、ストレス負荷による非炎症性大腸透過性亢進に対する効果をより正確に評価することができ、優れたストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の選択が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ストレス性非炎症性大腸透過性亢進は、身体的あるいは精神的に与えられたストレスによってストレス負荷後数時間後に惹起される非炎症性の大腸透過性亢進であり、ストレス付加後数日後に惹起される炎症を伴う透過性亢進とは区別される概念である。
ここで、潰瘍性大腸炎等粘膜の炎症を伴う腸炎では、タイトジャンクションの障害、上皮の損傷が起こり、透過性が亢進することが知られている（Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ ２００９；１５：１００−１１３．）。一方で、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ＩＢＳ）、機能性下痢等、消化管に炎症等の器質的な異常が認められないにもかかわらず、腹痛あるいは腹部不快感と便秘・下痢等の便通異常が関連しながら一定期間持続する下部消化管の機能的疾患がある。該疾患は、ストレスの関与が大きいと考えられており、ストレスが増悪させることも報告されている（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄ．２００４；９５：４４３−４５０．、Ｇｕｔ ２００４；５３：１１０２−１１０８．、Ｃｕｒｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｐ．２００４；６：２１０−２１５．）。また、このＩＢＳ患者においても、消化管の透過性が亢進していることが報告されている（Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００４；２０：１３１７−１３２２．）。従って、これらのことから、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進は、炎症性の透過性亢進と異なったメカニズムによるものであると考えられる。
【００１２】
これに対し、本発明者は、マスト細胞が欠損したモデルラットであるＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓラットではストレス負荷による大腸機能異常が認められず、大腸透過性が亢進されないこと、さらに、マスト細胞安定化剤であるｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅの投与によりストレス負荷後数時間後に生じる非炎症性の大腸透過性亢進が改善されたことから、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進にマスト細胞が関与している可能性を見出した。すなわち、マスト細胞の安定化とストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の改善には正の相関関係があることが判明した。
従って、各種物質のストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果をマスト細胞の安定化作用を指標として評価でき、ストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤を選択できると考えられる。
【００１３】
本発明方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことも、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。
本発明において、マスト細胞の安定化作用は、例えばマスト細胞の脱顆粒の程度を測定することで評価できる。脱顆粒の程度の測定は、特に制限はなく、常法に従って、例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性又はプロテアーゼ活性を測定するか、マスト細胞から放出されるケミカルメディエーター量を測定することにより行うことができる。ここで、ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンＤ２、ロイコトリエンＢ４等が挙げられ、特に、簡便に測定できるという点から、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定又は、ヒスタミン若しくはセロトニン量の測定が好ましい。
【００１４】
本発明方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う場合は、具体的には以下の工程Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００１５】
本発明において、マスト細胞としては、例えば、培養細胞株であるラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）、血液や組織から直接分離したもの等が挙げられる。マスト細胞は、培養細胞株、正常細胞の他、造血幹細胞等から分化誘導したものであってもよい。
また、腸管組織としては、哺乳動物由来の十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、マスト細胞又は腸管組織と被験物質及び脱顆粒促進剤との接触は、例えば、細胞又は組織が載置された培養液に、被験物質及び脱顆粒促進剤を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。脱顆粒促進剤は、先に被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させて適宜インキュベートした後、接触させるのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させた後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに脱顆粒促進剤と接触させるのが好ましい。
被験物質及び脱顆粒促進剤の接触後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに、培養上清を回収しマスト細胞の脱顆粒の程度を測定するのが好ましい。
【００１７】
マスト細胞の播種時の濃度は、評価可能な濃度であれば特に限定されない。マスト細胞の播種時の濃度は、２４ｗｅｌｌプレートを使用した場合、０．５×１０3〜３．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、特に０．５×１０4〜１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましい。また、腸管組織の量は、評価可能な量であれば特に限定されない。
【００１８】
被験物質としては、特に限定されず、例えば動植物抽出物、化合物、化学物質等を用いることができる。被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に０．０００１〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。
【００１９】
また、脱顆粒促進剤としては、顆粒放出を促すものであれば特に制限されないが、例えば、抗原（ジニトロフェノール等）、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ等が挙げられる。脱顆粒促進剤の添加濃度は抗原（ジニトロフェノール等）:０．０１〜５０００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０ :０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ:０．０１〜１００００μＭとするのが好ましく、特に抗原（ジニトロフェノール等）:０．１〜５００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０:０．１〜１００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ:０．１〜１０００μＭとするのが好ましい。
【００２０】
マスト細胞を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
腸管組織を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。これらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
【００２１】
本発明において、マスト細胞の脱顆粒の程度は、培養後上清を回収し、常法に従って、β−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量等を測定することによって測定できる。例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、酵素反応により発色する基質を用いた酵素反応を行うことにより行うことができる。また、ヒスタミン、セロトニンなどのケミカルメディエーターの測定は、ｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｒｏｍｅｔｒｉｃ法（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９５９；１２７：１８２−１８６）、或いはＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応により行うことができる。
【００２２】
本発明方法をｉｎ ｖｉｖｏで行う場合、
具体的には以下の工程Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００２３】
本発明方法に用いられる非ヒト哺乳動物としては、性別、月齢を問わず、いかなる種類の動物でもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ又はサルを挙げることができるが、入手が容易であり、取り扱い易いラットやマウスなどのげっ歯類が好ましい。
【００２４】
当該非ヒト哺乳動物への被験物質及び脱顆粒促進剤の投与方法としては、例えば、経口投与、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等が挙げられるが、簡便さや侵襲性が低いなどの点から、経口投与する方法が好ましい。
【００２５】
被験物質の投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。また、脱顆粒促進剤の投与量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は通常１回であるが、間隔をあけて数回に分けて投与してもよい。脱顆粒促進剤は、非ヒト哺乳動物へ被験物質を投与後、適宜飼育した後投与するのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。脱顆粒促進剤の投与は、被験物質を投与後１０〜２４０分とするのが好ましく、特に３０〜１２０分とするのが好ましい。
【００２６】
次いで、被験物質及び脱顆粒促進剤の投与１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分後に、非ヒト哺乳動物から腹腔細胞或いは腸管組織を採取し、培養液或いは緩衝液中に１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分、インキュベートした後、回収した上清中に含まれるβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定できる。脱顆粒の程度の測定方法としては、上記と同様の方法が挙げられる。また、非ヒト哺乳動物から採取した血液中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定することもできる（Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；６４：４５−５２）。
【００２７】
ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価は、被験物質と接触させたマスト細胞における脱顆粒の程度を、被験物質に接触させない対照群（対照細胞又は組織）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
【００２８】
また、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物から採取した腹腔細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を、被験物質を投与しない対照群（対照動物）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
評価に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して評価することが好ましい。
【００２９】
このようにして評価又は選択された物質は、ストレスによる非炎症性大腸透過性亢進を予防及び／又は改善するための医薬、食品等に有効成分として配合して使用するための素材となり得る。
【実施例】
【００３０】
実施例１
＜ストレスが血中成分に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（げっ歯類飼育繁殖用、日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように４群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。２群は自由摂食下で、２群は絶食下で２０時間飼育した。
自由摂食群、絶食群各１群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した（部分拘束ストレス、ストレス群）。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。対照群は、自由摂食群、絶食群各１群をイソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
ストレス負荷終了直後、麻酔下で腹部大動脈より全採血し、血中ヒスタミン、セロトニン、（ＥＬＩＳＡ法：Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ＥＬＩＳＡ；ＤＲＧ）、ＣＲＦ量（ＥＬＩＳＡ法：Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＣＲＦ−ＨＳ＿ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、矢内原研究所）、血中サイトカイン量（ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１３，ＴＮＦ−α）（マイクロビーズアレイ: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をそれぞれ定量した。
【００３１】
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝３匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。ストレス負荷終了直後、麻酔下にて腹部大動脈からの全採血により安楽死させた後、結腸7区画（盲結腸移行部より１ｃｍ下流から１ｃｍ長に７分割）を摘出後、各区画を０．５ ｍＬ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ/Ｒｉｎｇｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ(６０μＭ)中で６０分間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により結腸組織からのヒスタミン放出量を定量した。
【００３２】
２．結果
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１３量が絶食時、非絶食時共に高い傾向であった（表１）。絶食時の血中ＩＬ−１，ＩＬ−２量は、ストレス負荷群で低い傾向であった。その他のサイトカイン及びＣＲＦ量は、両群で差がなかった。
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ヒスタミン量（表２）は有意に高く、血中セロトニン量は増加傾向であったが有意差はなかった（表２）。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ刺激による摘出結腸からのヒスタミン放出量が有意に高かった（表３）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
実施例２
＜ストレスが大腸透過性に与える影響解析＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝１２匹/群）した。ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置後、直ちに大腸透過性を既報の方法（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９４；２９：３８−４６．）を参考に評価した。すなわち、イソフルラン吸入麻酔下、両端を結紮した結腸管腔内にエバンスブルー（ＥＢ）／ＰＢＳ（１ｍＬ）を注入した。１時間後、血液、近位結腸、遠位結腸を採取した。結腸２ｃｍ長を６ｍＭ ＮＡＣ／ＰＢＳで洗浄後（３回）、４ｍＬホルムアミドに２４時間浸漬し、結腸粘膜内のＥＢ量を測定した（Ｏ．Ｄ．５９５ｎｍ）。対照群は、イソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、同様の処置を行い、大腸の透過性を評価した。
【００３７】
一方、２０時間絶食させた雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（１０−１２週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本ＳＬＣ）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝７−８匹/群、平均体重２４０ｇ）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、上記と同様の処置を行い、それぞれ大腸の透過性を評価した。
【００３８】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に多かった（表４）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に多かった（表５）。このストレス負荷による遠位結腸の透過性の亢進は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった（表５）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔまたはＦｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
実施例３
＜ストレス性非炎症性大腸透過性亢進に対するマスト細胞安定化剤の影響＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝１１−１２匹/群）した。
マスト細胞安定化剤投与群は、イソフルラン吸入麻酔下、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ，メチルセルロース溶液に懸濁）を胃内投与（５ｍｇ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。対照群には、メチルセルロース０．５ ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、実施例２と同様の方法で大腸透過性を評価した。
【００４２】
２．結果
Ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与ラットでは、対照群（メチルセルロース投与）に比べて、結腸管腔内に投与したＥＢの遠位結腸組織への移行量が有意に少なかった(表６)。
以上より、ストレスによって引き起こされる非炎症性大腸透過性亢進がマスト細胞の安定化によって改善されることが確認された。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊ｐ＜０．０５）。
【００４３】
【表６】
【００４４】
以上の結果より、マスト細胞の安定化がストレス性の非炎症性大腸透過性亢進の改善に奇与しているものと考えられた。
【００４５】
実施例４
＜マスト細胞安定化剤のスクリーニング＞
１．方法
ラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖させた後、２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を７×１０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝４）となるように播き、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０（０〜５０μg／ｍＬ フェノールレッド、血清、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地）で１５分間インキュベートした。
また、同様に、ＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）を含むＲＰＭＩ培地で室温で３０分間インキュベートした後、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）＋５０μｇ／ｍＬ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質不含）で室温で１５分間インキュベートした。
各ｗｅｌｌより培養上清を３０μＬずつ、次に各ｗｅｌｌに５００μＬの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えて細胞を溶解させ３０μＬずつを採取した。これにβ−ヘキソサミニダーゼの基質である２ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含む０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３０μＬを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１５０μＬ １Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９．０）で停止後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞内外のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ分泌（脱顆粒）（Ｏ．Ｄ．上清/(Ｏ．Ｄ．上清＋Ｏ．Ｄ．細胞溶解液)×１００(％)）を算出した。
【００４６】
２．結果
ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０は濃度依存的に脱顆粒を促進した（表７）。ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅは濃度依存的に脱顆粒を抑制した（表８）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項３】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項１】
マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項３】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性非炎症性大腸透過性亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【公開番号】特開２０１２−８５５５３（Ｐ２０１２−８５５５３Ａ）
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３３４６５（Ｐ２０１０−２３３４６５）
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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